Генотипирование изолятов вируса африканской чумы свиней

Елсукова, Александра Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генотипирование изолятов вируса африканской чумы свиней
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Генотипирование изолятов вируса африканской чумы свиней"

УДК: 619:616.98:578.842.1:577.21 004613822

ЕЛСУКОВА АЛЕКСАНДРА АНДРЕЕВНА

Генотипирование изолятов вируса африканской чумы свиней

03.02.02 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Цыбанов С.Ж.

2 5 НОЯ 2010

Покров, 2010

004613822

Работа

выполнена

в Государственном научном учреждении

Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).

Научный руководитель

доктор биологических наук,

профессор Цыбанов С.Ж.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Селянинов Ю.О.

(Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, г. Москва)

Ведущая организация - ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Защита диссертации состоится «25» ноября 2010 г. в «11-30» часов на заседании диссертационного совета при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел/факс: (49243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан «21» октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии

профессор

(ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров)

доктор биологических наук

Ярыгина Е.И.

кандидат биологических наук

Е.А. Балашова

1. ОБЩАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Африканская чума свиней (АЧС) — особо опасная болезнь свиней вирусной этиологии, характеризующаяся лихорадкой, геморрагическим диатезом, воспалительными и некродистрофическими изменениями паренхиматозных органов [Сюрин, 1998].

Средства специфической профилактики при АЧС не разработаны, и поэтому мероприятия по борьбе с АЧС основаны на быстрой диагностике болезни, уничтожении всех свиней в эпизоотическом очаге и проведении жестких ветеринарно-санитарных мер в первой и второй угрожаемых зонах.

Изоляты вируса АЧС, выделенные в различных географических зонах мира, а также полученные экспериментально, различаются по вирулентным, культуральным и антигенным свойствам. На основании реакции задержки гемадсорбции (РЗГА) имеющиеся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ штаммы вируса АЧС были разделены на восемь серотипов [Вишняков и др., 1995]. Антигенная гетерогенность вируса АЧС подтверждалась результатами перекрестного заражения свиней, выживших после переболевания или введения атгенуированных штаммов [Балышев и др., 1999]. В то же время негемадсорбирующие изоляты не могли быть классифицированы в РЗГА, в связи с чем их относили в группу нетипированных изолятов [Вишняков и др., 1995].

В настоящее время наряду с изучением фенотипических признаков для классификации и определения родства микроорганизмов используют методы анализа генома, которые позволяют дифференцировать все штаммы и изоляты патогенов, в том числе и вируса АЧС. В результате генотипирования, проведенного Bastos et al, 2003, установлено, что семейство Asfarviridae представлено 22 генотипами. Данные о генотиповой

принадлежности штаммов вируса АЧС из коллекции ГНУ ВНИИВВиМ отсутствуют.

На сегодняшний день в России создалась напряженная обстановка л африканской чуме среди свиней. На территорию нашей страны АЧС бьи занесена в ноябре 2007 г., заболевание диагностировали у кабанов Шатойском районе Республики Чечня. В последующие годы вспышки болезн регистрировали еще в 12 субъектах России: Республиках Северная Осети; Алания, Кабардино-Балкария, Калмыкия, Дагестан, Ингушети Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской, Волгоградско] Астраханской, Ленинградской, Оренбургской областях.

Для постановки диагноза на АЧС используют методы заражеш иммунных к классической чуме свиней (КЧС) свиней, реакцию гемадсорбци] прямой и непрямой иммунофлуоресценции, иммуноферментного анали: [Вишняков, 1992]. Кроме того, в диагностике инфекционных болезней наше широкое применение методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР поскольку они позволяют исследовать пробы из любых клинических образце и патологического материала, даже доставленных с нарушениям температурного режима транспортировки, анализировать одновремеш десятки и сотни проб и применять приборные методы учета реакции. В эте связи разработка тест-систем на основе ПЦР в режиме реального времени до идентификации изолятов вируса АЧС, внедрение их в практику рутиннь исследований, а также разработка методов классификации вируса АЧС I основе анализа его генома, позволяющих проводить генотипирование вирус проследить его генетическую эволюцию и географическое происхождеш является актуальной.

Цель и задачи исследования

Основной целью исследований являлась разработка методов идентификации вируса АЧС, генотипирование выделенных на территории

РФ изолятов и определение их филогенетических взаимоотношений с изолятами зарубежного происхождения.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Усовершенствовать метод выявления ДНК вируса АЧС на основе ПЦР с электрофоретической детекцией.

2. Разработать тест-систему на основе ПЦР в режиме реального времени для идентификации изолятов вируса АЧС.

3. Провести мониторинг АЧС на территории РФ с целью формирования банка ДНК изолятов вируса АЧС и изучить основные биологические свойства изолятов вируса, выделенных на территории Российской Федерации.

4. Определить нуклеотидные последовательности С-концевой области гена В646Ь, кодирующего основной капсидный белок р72, изучить филогенетические взаимоотношения изолятов вируса АЧС, выделенных в Российской Федерации в 2007-2010 гг., с изолятами и штаммами АЧС, выявленными в Европе и Африке.

5. Оценить пригодность метода анализа полиморфизма длин амплифицированных фрагментов вариабельных участков генома для генотипирования изолятов и штаммов вируса АЧС.

Научная новизна работы

Впервые в России разработан комплекс методов для выявления и дифференциации изолятов и штаммов вируса АЧС на основе различных вариантов ПЦР (ПЦР в формате электрофорезной детекции, ПЦР в режиме реального времени, амплификация вариабельных участков генома).

выделенных на территории РФ во время вспышек заболевания в течение 2007-2010 гг. изолятов вируса АЧС ко второй геногруппе.

Определено филогенетическое положение 22 вирулентных и авирулентных штаммов вируса АЧС, депонированных в музее ГНУ ВНИИВВиМ, относящихся к I, II, III, IV, V, VII и VIII серотипам.

Практическая значимость результатов исследования

Разработанная методика идентификации генома вируса АЧС методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени позволяет в течение 2 часов выявить геном вируса АЧС с чувствительностью 0,5-1,0 lg ГАЕ50/см3 в образце.

С использованием разработанных методов проведено генотипирование восьми изолятов вируса АЧС, выявленных в различных регионах РФ в период с 2007-2010 гг., и 22 штаммов вируса, депонированных в музее ГНУ ВНИИВВиМ.

С помощью разработанных методов ПЦР в период с 2007-2010 гг. исследовано более 39 тыс. проб из патологического материала с подозрением на АЧС, из них выявлено 150 положительных проб.

Результаты экспериментальной работы использованы при разработке методических рекомендаций по выявлению ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени и дифференциации штаммов вируса африканской чумы свиней методом ПЦР.

Вышеперечисленные документы одобрены ученым советом, утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Росельхозакадемии, а также рассмотрены и одобрены секцией Биотехнологии Отделения ветеринарной медицины РАСХН. Тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени утверждена Россельхознадзором 30.08.2010 (ПВР-1-5.0/02619).

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:

1. Разработана тест-система для идентификации генома вируса АЧС методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени, позволяющая

быстро и надежно выявлять вирус АЧС с аналитической чувствительностью до 0,5 ГАЕ50/см3 в одном образце.

2. Определено филогенетическое положение 22 штаммов вируса, депонированных в музее ГНУ ВНИИВВиМ, и изолятов, выделенных на территории России с 2007 по 2010 гг., на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена B646L, кодирующего белок р72 вируса АЧС.

3. На основании амплификации четырех вариабельных участков генома (B602L, KP86R, J268L, BtSj) дана молекулярно-генетическая характеристика тридцати штаммов и отечественных изолятов вируса АЧС, депонированных в музее ГНУ ВНИИВВиМ.

Апробация и публикация результатов

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ (2008-2010 гг.).

Материалы диссертации доложены на конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины», посвященной 50-летию ВНИИВВиМ (г. Покров, 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 40-летию ВНИТИБП (г. Щелково, 2009г.), международной конференции Epizone «Crossing boarders»(Typu™, май 2009 г.).

Отдельные разделы диссертации выполнены по гранту молодых ученых на проведение научных исследований по приоритетным направлениям развития науки, технологий и техники Владимирской области.

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария», включенном в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Личный вклад

Малоголовкин (освоение методики секвенирования нуклеиновых кислот), к.б.н., А.Г. Шендрик (освоение методики ПЦР в реальном времени), микробиолог лаб. «Иммунология» Казакова A.C. (освоение методов конструирования рекомбинантных молекул), заведующий лабораторией «Музейных штаммов» Балышева В.М. (изучение биологических свойств вируса АЧС).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах, иллюстрирована 14 таблицами и 20 рисунками. Список литературы включает 148 источников, из которых 117 - иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирус: Для проведения исследований были использованы следующие штаммы вируса АЧС: I серотип - Л-57, Л-50, ЛЦ-ПП, Катанга, Катанга/105; II серотип - К-49, КК-203, КК-262, Нджасси-77(НВЛ), Сильва-1; III серотип - М-78, МК-200; IV серотип - ФК-32/135, П-60, СТП-1, ППА, 691/88; V серотип - ТСП-80; VII серотип - Уганда, VIII серотип - Родезия; а также нетипированный изолят Бартлетт.

Все перечисленные штаммы и изоляты получены из музея ГНУ ВНИИВВиМ.

Кроме того, в работе использована ДНК, выделенная из проб органов, полученных от павших или подозреваемых (вынужденно убитых) в заражении домашних и диких свиней. Пробы для исследования поступили из Республик Чечня, Абхазия, Южной Осетия, Армения, Северная Осетия-Алания, Краснодарского и Ставропольского края, Ростовской и Оренбургской областей во время вспышек заболевания в ЮФО в период с 2007-2010 гг. Патматериапом для выделения вируса служили селезенка, костный мозг, печень, лимфоузлы и цельная кровь. От диких свиней, как правило, для исследований использовали также трубчатые кости, в которых в случае аутолиза мягких тканей сохраняется ДНК вируса АЧС.

В качестве отрицательных контролен использовали пробы органов, взятых от павших свиней, инфицированных вирусом КЧС (штамм Ши-Мынь), вирусом болезни Ауески (штамм БУК), вирусом осповакцины (штамм ЛИВП), а также от здоровых подсвинков.

Животные. Клинически здоровые подсвинки крупной белой породы 24 месячного возраста, живой массой 20-40 кг, полученные из сектора подготовки животных института. Кормление и содержание свиней проводили в соответствии с нормами и требованиями, предусмотренными для животных различных возрастных групп.

Культуры клеток. Первичная культура клеток костного мозга свиней (ККМС) или лейкоцитов свиней (ЛС), 1-2-х суточная, выращенная в пластиковых культуральных сосудах или чашках Карреля.

Бактериальный штамм и плазмида. Для трансформации использовали компетентные клетки авирулентного штамма E.coli DH5á (Promega), а в качестве вектора для клонирования - многокопийную плазмиду pTZ57R (Fermentas).

Подготовка органов для выделения вируса. Органы и ткани измельчали, растирали со стерильным песком и готовили на физрастворе (10,0-20,0)% суспензию, которую центрифугировали. Надосадок использовали для заражения культуры клеток и свиней.

Выделение вируса. Выделение вируса проводили в культуре ККМС в течение 1-5 последовательных пассажей. Культуру клеток заражали 20,0% суспензией органов (цельным материалом, 10*' и 10"2 разведениями) и инкубировали при (37,0±0,5)°С до появления феномена гемадсорбции или лизиса клеток в течение 7 суток. При отсутствии таковых дополнительно проводили еще 3-4 пассажа в этой культуре клеток.

Для постановки биопробы, свиней заражали 20%-ной суспензией тканей и органов в объеме 1,0 см3 внутримышечно в области средней трети шеи. Для получения вируссодержащей крови животных, находящихся в

атональном состоянии, обескровливали и вируссодержащую

кровь дефибринировали.

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей. Специфичность праймеров подтверждали с использованием поисковой системы BLAST. Для анализа нуклеотидных последовательностей и построения рекомбинантных конструкций использовали программу Clone.

Выделение и очистка нуклеиновых кислот. Выделение тотальной ДНК из патологических материалов, цельной крови и инфицированных культур клеток проводили по модифицированной методике Boom et al. (1991). Для стабилизации цельной крови использовали антикоагулянт (ЭДТА или ацетат калия).

Идентификация генома вируса АЧС методом полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией. ПЦР проводили в реакционной смеси объёмом 25 мкл, содержащей 5 мкл 10-кратного буфера для амплификации, по 0,25 мкл каждого дНТФ (с исходной концентрацией 10 пмоль), по 1 мкл каждого праймера (с исходной концентрацией 10 пмоль), 2 ед. Taq-ДНК-полимеразы, 5 мкл раствора ДНК. Поверх реакционной смеси наслаивали 30 мкл лёгкого минерального масла для предотвращения испарения. Температурный режим реакции включал 5-минутную денатурацию при температуре 95°С, за которой следовали 40 циклов, включающих 1 мин при 95 °С, 1 мин при 68°С и 1 мин при 72°С, и финальная 10-мин элонгация при 72°С.

Для идентификации генома вируса АЧС амплифицировали консервативный участок гена, кодирующего белок р72, с помощью пары праймеров p72F [5'-tgt gcg egg ate ctg cat ccc agg gga taa aat g-3'] и p72R [5'-aaa att ctc egg act aat cct ttt gcg atg caa gct-3'].

Электрофорез продуктов ПЦР. Электрофорез проводили при напряжении 15 В/см длины геля в течение 20 минут. Результаты

электрофореза учитывали на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Документирование полученных результатов проводили с помощью гель-документирующей системы GelDoc (BioRad, США).

Нуклеотидное секвенирование и филогенетический анализ изолятов вируса АЧС. Секвенирование проводили на автоматическом анализаторе Applied Biosystems Genetic Analyzer 3130 с использованием наборов для секвенирования Big Dye terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Усовершенствование метода выявления ДНК вируса АЧС на основе ПЦР с электрофоретической детекцией 3.1.1. Оптимизация условий проведения ПЦР в формате электрофорезной детекции В связи с увеличивающимся потоком проб в ходе мониторинга африканской чумы свиней в Российской Федерации было необходимо повысить производительность метода идентификации генома вируса АЧС методом ПЦР с электрофоретической детекцией. Для оптимизации ПЦР проведены эксперименты по определению оптимальных концентраций MgCl2 и праймеров в реакционной смеси, а так же температурного и временного режима. В результате проведённых экспериментов установлено, что оптимальная реакционная смесь объёмом 25 мкл имеет следующий состав: 20 мМ Трис-HCl, pH 8,5; 3 мМ MgCl2; 200 мкМ каждого из четырёх дНТФ; по ЮпМ каждого прайм ера; 1 ед. Taq- полимеразы и 5 мкл раствора ДНК.

Оптимальный температурный режим для проведении реакции на приборах «Терцик» и «Gradient Palm Cycler»: 94°С - 3 мин (1 цикл); 94°С - 20 сек, 68°С - 30 сек, 72°С - 45 сек (30 циклов); 72°С - 3 мин (1 цикл).

Время полного анализа 96 образцов при использовании ПЦР в формате электрофорезной детекции составил - 4 часа: выделение ДНК из исследуемого материала (кровь или органы) - 1час, приготовление ПЦР-смеси и постановка реакции - 30 минут, продолжительность амплификации -2 часа, элекгрофорезная детекция - 30 минут.

3.1.2 Конструирование рекомбинантной плазмиды, несушей последовательность консервативной области гена р72 вируса АЧС

Конструирование рекомбинантной плазмиды, несущей последовательность консервативной области гена B646L вируса АЧС, было вызвано необходимостью создания положительного кошроля амплификации (ПК ПЦР). Кроме того, использование такой конструкции позволило оценить аналитическую чувствительность тест-системы. Для клонирования использовали ПЦР-продукт участка гена, кодирующего белок Vp72 вируса АЧС, размером 485 п.о. Лигирование проводили по поли-Т-концам в области Multi cloning site (MCS) плазмиды pTZ57R. В последующем, лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli.

Была оценена возможность применения рекомбинантной плазмиды в качестве положительного контроля в тест-системе для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР. В качестве матрицы использовали необработанную и обработанную рестриктазой EcoR I плазмиду. При постановке реакции с применением нерестрицированной плазмидной ДНК и дальнейшем анализе продуктов ПЦР в электрофорезе выявляли дополнительную полосу на уровне 3400 п.о. Рестрицированная и переосажденная этанолом с ацетатом натрия при постановке ПЦР неспецифических фрагментов на уровне 3400 п.о. не давала. Поэтому, в последующем, в качестве матрицы использовали обработанную рестриктазой рекомбинантную плазмиду. Сконструированная плазмида успешно применяется в качестве ПК ПЦР. В виду своего небольшого размера, она

высоко устойчива при хранении и использовании, приготовление ее безопасно, т.к. исключена работа с вирусным агентом.

3.2 Разработка тест-системы для выявления генома вируса АЧС методом ПЦР в формате реального времени Разработка тест- системы для выявления генома вируса АЧС в формате реального времени обусловлена необходимостью сокращения времени анализа и трудозатрат. Кроме того, использование этого метода значительно уменьшает риск контаминации компонентов реакции ампликонами. Нами выполнен расчет видоспецифических праймеров и зонда к консервативной области генома и оптимизированы условия проведения реакции (состав ПЦР-смеси и температурный режим реакции, оценка специфичности и чувствительности тест-системы).

На основании анализа нуклеотидных последовательностей высококонсервативной области гена B646L, кодирующего основной капсидный белок р72, для амплификации выбран участок размером 262 п.о.

Оптимальный состав ПЦР смеси объёма 25 мкл содержал 5 мкл 5-кратного ПЦР буфера, содержащего 5 мМ MgCl2, по 1 мкл каждого праймера (с концентрацией 10 пмоль), по 1 мкл каждого из четырех трифосфатов (с исходной концентрацией 10 пмоль), 0,25 ед. Taq полимеразы, 5 мкл исследуемой ДНК. Отработку температурного режима амплификации проводили для двух приборов: Rotor Gene 6000 и IQ5. Оптимальный температурный режим и количество циклов для обоих этих приборов: 95°С - 3 минуты (1 цикл); 94°С - 10 сек, 65°С - 20 сек, 72°С - 13 сек (15 циклов); 94°С - 10 сек, 65°С - 20 сек-детекция, 72°С -13 сек

(35 циклов). Флуоресценцию измеряли при 65°С по каналу FAM.

Учёт результатов по анализу кривых накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM проводили с помощью программного обеспечения используемого прибора.

Положительными считали образцы, для которых определено значение порогового цикла (С*) в соответствующей графе таблицы результатов, после установления пороговой линии. Образцы, для которых не определено значение (Л (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), - считались отрицательными. Специфичность метода оценивали тестированием заведомо положительных и заведомо отрицательных по АЧС проб. В качестве положительных проб использовали органный вируссодержащий материал, присутствие вируса в котором было подтверждено ранее с помощью ПЦР в формате электрофорезной детекции и выделением в культуре клеток. Ожидаемый результат при проведении анализа всех этих проб с использованием ПЦР в режиме реального времени совпал с фактическим. Значение О при этом колебалось от 14 до 18. Чувствительность метода оценивали путем приготовления серии десятикратных разведений ДНК и последующей амплификации. Положительный сигнал регистрировали в разведениях ДНК до 10"6.

Разработанная тест-система утверждена Россельхознадзором и используется во ВНИИВВиМ при проведении мониторинговых исследований.

3.3 Мониторинг африканской чумы свиней

В связи с продолжающимся распространением АЧС на территории нашей страны, проведены диагностические исследования проб органов от павших и убитых свиней при вспышках АЧС в республиках Абхазия, Армения, Южная Осетия и Чеченской Республике (РФ) в 2007-2010 гг. и мониторинговые лабораторные исследования проб органов от свиней и кабанов в восьми федеральных округах РФ. Для обнаружения генома вируса АЧС доставленные нарочным пробы исследовали параллельно в реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) и ПЦР. С целью выделения вирусов

использовали культуру клеток костного мозга (для изоляции вируса АЧС) и РК-15 (для изоляции вируса КЧС) (табл. 1).

Наиболее вероятными группами риска по АЧС считали диких и домашних свиней в хозяйствах со свободным выгулом в республиках Кавказа, которые имеют общую границу и тесные экономические и другие связи с Абхазией, Южной Осетией и Грузией. Таким образом, основной зоной наблюдения стали республики Северного Кавказа (Чечня, Ингушетия, Кабардино-Балкария, Северная Осетия, Дагестан), Краснодарский и Ставропольский края и области Южного федерального округа (Ростовская, Волгоградская).

Таблица 1.

Мониторинг африканской чумы свиней на территории РФ.

№ п/п Федеральный Округ Кол-во ров/пунктов Кол-во обследованных свиней Кол-во положит, проб

ДОМ дик всего дом ДИК всего

1 Центральный ФО 390/2207 15410 1259 17870 нет нет нет

2 Северо-Западный ФО 35/46 609 255 1080 7 нет 7

3 Южный и СевероКавказский ФО 98/329 12318 2061 14379 109 32 141

4 Приволжский ФО 127/781 4072 387 4459 2 нет 2

5 Уральский ФО 32/42 39 0 39 нет нет нет

6 Сибирский ФО 13/30 1296 14 1306 нет нет нет

7 Дальневосточный ФО 13/16 100 7 107 нет нет нет

ИТОГО по РФ 708/3451 33844 3983 39240 118 32 150

3.4 Исследование основных биологических свойств изолятов вируса африканской чумы свиней, циркулирующего в популяциях домашних и диких свиней на территории Российской Федерации.

Выделение и паспортизацию штаммов вируса АЧС проводили совместно с сотрудниками лабораторий «Диагностика» и «Музейных штаммов». Для паспортизации депонированных в музей ГНУ ВНИИВВиМ изолятов использовали выделение вируса в культуре клеток, методы прямой иммунофлуоресценции, а также биопробу на иммунных против КЧС свиньях. Затем изучали биологические свойства изолятов с определением культуральных свойств, его типовой принадлежности в РЗГА и иммунопробе на свиньях, вирулентности. Паспортизированные штаммы закладывали в музей микроорганизмов института в лиофилизированном состоянии. При оценке вирулентности выделенных изолятов вируса АЧС на свиньях установлено, что все они при внутримышечном заражении в объеме 1 мл вызывают гибель подсвинков с признаками острой формы течения болезни с характерными клиническими симптомами. В результате серологического типирования 8-ми изолятов все они были отнесены к восьмому серотипу.

3.5. Определение генотипа и филогенетических связей изолятов, выделенных при вспышках африканской чумы свиней в Российской Федерации с изолятами вируса африканского и европейского происхождения.

Стратегия генотипирования изолятов вируса АЧС включала в себя секвенирование С-концевой области гена, кодирующего мажорный капсидный белок р72. Данный участок используется для определения генотипа изолятов вируса АЧС согласно методике, разработанной Bastos et al., которая является стандартной методикой генотипирования, рекомендованной референс-лабораторией в Испании (Вальдеолмос).

Нами проведено секвенирование участка гена B646L, кодирующего белок р72, размером 478 п.о. и были определены нуклеотидные последовательности для каждого из исследуемых отечественных изолятов и штаммов, депонированных в музее ГНУ ВНИИВВиМ. При проведении сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей ДНК с использованием программы Clustal W (version 1.4.) и Bioedit 6.0 установлено, что нуклеотидные последовательности секвенированного участка всех восьми анализируемых изолятов, выделенных в период с 2007-2010 гг. в разных субъектах Российской Федерации, идентичны друг другу, но в тоже время отличаются от нуклеотидных последовательностей данного участка гена для музейных штаммов.

Филогенетические взаимоотношения исследуемых изолятов и штаммов вируса, а также изолятов вируса АЧС из стран Европы, Африки и Латинской Америки, представляющие все 22 генотипа вируса, известных в настоящее время (получены из базы данных GeneBank), анализировали с помощью программы Mega/UPGMA method (version 3.6а 2.1) с 1000 повторов.

Результатом проведенного компьютерного анализа всех вышеперечисленных последовательностей стало сконструированное нами в программе Mega филогенетическое дерево (рис.1).

Выравнивание нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ показали, что изоляты, выделенные на территории России, принадлежат ко второму генотипу (рис.1). К этому же генотипу относятся африканские изоляты из Мозамбика и Мадагаскара, а также изоляты, выделенные на территории Грузии, Армении и Азербайджана в 2007 году.

Рисунок 1. Дендрограмма, построенная на основании данных гомологии нуклеотидных последовательностей фрагмента В646Ь музейных штаммов и изолятов вируса АЧС, выделенных на территории России (выделены исследуемые изоляты).

Музейные штаммы, использованные нами для филогенетического анализа, были отнесены к четырем различным генотипам, результаты представлены в табл.2. Кроме того, представленные данные свидетельствуют о том, что серотиповая и генотиповая принадлежности штаммов не совпадают, например, штаммы I, II, IV серотипов относятся к I генотипу, в то время как штаммы V, VII серотипов и нетипированный изолят Бартлетт относятся к одному и тому же X генотипу.

Таблица 2.

Серотиповая и генотиповая характеристики исследуемых штаммов.

Штамм/ino л ят Вирулентные свойства Страна Серотип Генотип

JI-57 вирулентный Португалия

Л-50 авирулентный Португалия

ЛЦПП авирулентный Португалия I

Катанга авирулентный Португалия

Катанга/105 авирулентный Португалия

К-49 вирулентный Конго

КК-262 авирулентный Конго

КК-203 авирулентный Конго II I

Нджасси-77 (НВЛ) авирулентный Конго

Сильва-1 вирулентный Ангола

ППА вирулентный Испания

691/88 вирулентный Швейцария

СТП-1 вирулентный Сан-Томе и Принсипи IV

ФК-32/135 авирулентный Франция

М-78 вирулентный Мозамбик III V

МК-200 авирулентный Мозамбик

ТСП-80 вирулентный Танзания V

Уганда вирулентный Уганда VII X

Бартлетт вирулентный Кения Н/т

Отечественные изоляты вирулентный Российская Федерация VIII II

Родезия вирулентный Замбия и Зимбабве VIII VIII

3.6. Оценка возможности использования метода анализа полиморфизма длин амплифицированных фрагментов вариабельных участков генома для генотипирования штаммов и изолятов вируса АЧС

Первый из проанализированных нами участков - ген В602Ь. Данный ген - наиболее вариабельный участок генома вируса АЧС и содержит повторы длиной 12 п.н., кодирующие 4 аминокислоты. Он локализован в центре генома в центральной вариабельной области генома. В данной области локализованы повторяющиеся аминокислотные тетрамеры, варьирующие по числу и составу у различных изолятов вируса АЧС. Белок рВ602Ь, кодируемый соответствующим геном, участвует в корректировке правильности образования вторичных и третичных структур основного капсидного белка р72 и является поздним неструктурным белком, который в отличие от белка р72, исключен из процесса репликации вируса. Подавление синтеза данного белка приводит к ингибированию протеолитической обработки двух капсидных полипептидов и снижению концентрации основного капсидного белка р72. Таким образом, белок В602Ь необходим для образования икосаэдрического капсида вируса.

Для амплификации данного участка была синтезирована пара праймеров ОИг9Ь-Р (З'АТСТССТСАССАСТОТТАААТСССЗ', сайт 8463584659) и О^Ь-Я (5,ТСТТСАТОСТСАААСТСССТАТАССТЗ', сайт 8502785004).

В результате ПЦР на матрицах ДНК различных штаммов вируса АЧС, относящихся к разным генотипам, синтезировались ампликоны, варьирующие по размеру от 190-500 п.о. Для всех отечественных изолятов получены фрагменты одинакового размера, 190 п.о. Результаты ПЦР представлены в табл.3.

Анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов данного участка генома позволяет провести дифференциацию штаммов внутри каждого из генотипов.

Таблица 3.

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов и изолятов вируса

АЧС.

Штамм/изолят Генотип Серотип Размер продукта по вариабельным

по р72 участкам (п.о.)

В602Ь КР86И 3268Ь

Л57 I 210 250 1500 700

Л50 I 210 250 - 700

ЛЦ-ПП I 490 250 - -

Катанга I 490 250 1500 -

Катанга/105 I - 250 1500 -

СТП-1 IV 360 320 1000 620

П-60 IV 360 320 1000 -

ФК-32 I IV 400 320 1000 -

ФК-135 IV 400 320 1000 -

КК 262 II 360 250 1200 -

КК203 II 280 250 1200 -

К49 II 260 250 1100 700

Нджасси-77 (НВЛ) II 230 250 1370 700

Сильва 1 II 220 250 - -

691/88 IV 490 320 950 -

ППА IV 360 320 900 650

М78 V III 310 - 1150 620

МК200 500 - 1100 620

ТСП 80 V 280/350 - 1200 -

Бартлетг X Не типироваи 110 - 1100 -

Уганда VII 150 - 1000 -

Родезия VIII VIII 300 - 1150 -

Отечественные изоляты II VIII 190 - 1300 600

Примечание: - - ПЦР продукт отсутствует

Второй участок - ген КР86Я, локализованный в левой вариабельной области, кодирует одноименный трансмембранный белок. Ген имеет копию на правом конце генома- БР86Ь.

Для амплификации данного участка использовали пару праймеров КР86Я-Р ^ТГТСССТГСАТСААСАААТАТАСААААЗ', сайт 1699-1725) и КР86Я-Я (5'ТСТТАТАСАТАТСТСТГСТСАТАСОЗ', сайт 2045-2021).

В результате ПЦР с праймерами на данный участок генома, все исследуемые штаммы были разделены на три группы: группа штаммов 1 и 2

серотипа (длина ПЦР-продукта - 250 п.о); группа штаммов 4 серотипа (длина ПЦР-продукта - 320 п.о.); группа штаммов восточноафриканского происхождения и отечественных изолятов (ПЦР-продукт отсутствует). Результаты ПЦР представлены в табл.3.

Следующий вариабельный участок генома вируса АЧС, использованный в нашем исследовании - ген Л268Ь, который является членом мультигенного семейства МйР 300.

Для амплификации данного участка использовали пару праймеров Л6$Ъ-¥ (5'ССТТСАСТСаТСТССАТОАТСААААЗ', сайт 10535-10559) и 1268Ь-Я (5'ССТАААТСАТААААССОАТТАСАТСЗ', сайт 11599-11575).

В результате ПЦР на матрицах ДНК различных штаммов вируса АЧС синтезировались фрагменты, варьирующие по размеру от 900-1500, на матрицах некоторых штаммов фрагмент не образовался. В результате амплификации ДНК отечественных изолятов образовывался фрагмент размером 1300 п.н. Результаты ПЦР представлены в табл.3.

Последний межгенный участок использованный в нашей работе, расположен между генами Е146Ь и Е199Ь и содержит от 8 до 38 копий 17-нуклеотидного повтора.

Для амплификации данного участка использовали пару праймеров Ма1-Р1 (5'ССААСАСААТССТТАТАСАСААСАСАЗ', сайт 148754-148773) и Ма1-Ш (5,ТАТТСТСССТСТОТАААСТССаССТЗ', сайт 122879-122894).

В результате ПЦР с данной парой праймеров искомый фрагмент также образовывался не у всех исследованных образцов, при этом его размер не зависел от биологических свойств того или иного штамма. Для всех отечественных изолятов был получен одинаковый фрагмент размером 600 п.о. (табл.3.)

Поскольку в результате ПЦР на матрицах ДНК всех изолятов вируса, выделенных на территории РФ, синтезировались ампликоны одинакового размера по всем вариабельным участкам, мы можем сделать вывод о циркуляции одного и того же изолята на территории нашей страны.

Таким образом, анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов генов B602L, KP86R, J268L и межгенного участка BtSj позволяет дифференцировать исследованные вирулентные и авирулентные штаммы и изоляты как внутри генотипа, так и внутри I, И, III, IV, V, VII и VIII серотипов, кроме штаммов ФК-32 и ФК-135.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана тест-система для идентификации генома вируса АЧС методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени, позволяющая выявлять ДНК вируса АЧС с аналитической чувствительностью до 0,51,0 lg ГАЕ50/см3 в образце.

2. В ходе мониторинговых исследований из 39240 проб от домашних и диких свиней, отобранных в восьми федеральных округах РФ, в 150 пробах обнаружена ДНК вируса АЧС. 98% положительных проб (141) выявлены в Северо-Кавказском и Южном федеральных округах. В Северо-Западном ФО выявлено 7 положительных проб, в Уральском — 2. Данные ПЦР подтверждены результатами биопробы и прямой иммунофлуоресценции.

3. Все изоляты вируса АЧС, выделенные на территории РФ, относятся к 8-му серотипу, обладают высокой вирулентностью и вызывают заболевание с характерными клиническими и патоморфологическими признаками.

4. На основе анализа нуклеотидной последовательности фрагмента гена р72 и полиморфизма длин амплифицированных фрагментов вариабельных участков генома установлено, что изоляты вируса АЧС, выделенные в Северо-Кавказском, Южном, Северо-Западном и Уральском федеральных округах РФ, а также Абхазии и Южной Осетии, относятся ко II генотипу и не отличаются между собой.

5. Филогенетический анализ фрагмента гена р72 позволил установить принадлежность 22 штаммов из коллекции ВНИИВВиМ к четырем генотипам: Сильва-1, JI-57, JI-50, ЛЦ-ПП, ФК-32, ФК-135, Нждасси-77, К-49 и его дериваты КК-203 и КК-262, ППА, 691/88, Катанга, Катанга/105, СТП-1, П-60 - к I; М-78, МК-200 - к V; Родезия - к VIII; а Уганда, ТСП-80, Бартлетт - к X генотипам.

6. Анализ полиморфизма длин амплифицированных

фрагментов четырех вариабельных участков генома вируса АЧС (B602L, KP86R, J268L, BtSj) позволяет дифференцировать исследованные вирулентные и авирулентные штаммы и изоляты внутри I, II, III, IV, V, VII и VIII серотипов, кроме штаммов ФК-32 и ФК-135.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны, утверждены и рекомендуются в практику научно-исследовательских учреждений следующие разработанные методики:

1. «Методические рекомендации по дифференциации штаммов вируса африканской чумы свиней методом ПЦР», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ 17.10.2009 и одобренные секцией Биотехнологии Отделения ветеринарной медицины РАСХН (29.10.2009).

2. «Методические указания по идентификации генома вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени», утвержденные Россельхознадзором 30.08.2010 (ПВР-1-5.0/02619).

7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Анализ вариабельного участка генома вируса АЧС (гена KP86R) музейных штаммов и изолятов, полученных на территории РФ/ A.A. Елсукова, А.Г. Шендрик, И.Х. Газаев, И.М. Калабеков, С.Ж. Цыбанов // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Материалы междунар. науч.-практ. конф., посвященной 40-летию института. - Щелково, 2009,- С. 323327.

2. Елсукова, A.A. Анализ гипервариабельного участка генома вируса АЧС (гена B602L) музейных штаммов и изолятов, полученных на территории РФ/ A.A. Елсукова, И.Х. Газаев // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конф. молодых ученых ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакацемии. - Покров, 2009. - С. 72-76.

3. Елсукова, А.А. Рекомбинантная плазмида PTZ57R/ASFVP72E/CL.3-1 как положительный контроль в диагностической тест-системе для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции / А.А. Елсукова, А.С. Казакова // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конф. молодых ученых ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. - Покров, 2009. - С. 76-79.

4. Филогенетический анализ полевых изолятов вируса африканской чумы свиней / И.М. Калабеков, К. Галлардо, А.А. Елсукова, Е. Мартин, Д.В. Колбасов, С.Ж. Цыбанов, А.Г. Шендрик, М. Ариас //Ветеринария.-2010,- №5. -С.31-33.

5. African swine fever in Caucasus/ D. Kolbasov, S. Tcybanov, V. Kurinnov, I Kalabekov, A. Elsukova, A. Shendrik// 31*1 Annual meeting Epizone «Crossing borders».- Antalia, 2009.- P. 182.

6. Detection of porcine circovirus type 2 and African swine fever virus by PCR and RealTime PCR/A. Elsukova, A. Malogolovkin, S. Tcybanov, D. Kolbasov// Revista Romana de Medicina veterinara.- 2009.-Vol.19, №2.-P. 126-132.

7. Genetic characterization of Caucasus African swine fever isolates/ C.Gallardo, I. Kalabekov, A. Soler, A. Elsukova, E. Martin, S. Tcybanov, D. Kolbasov, M.Arias// 3th Annual meeting Epizone «Crossing borders».- Antalia, 2009,- P. 159.

8. Molecular genetic characteristics of ASF virus strains and isolates using analysis of KP86R and B602L genes variable sites./ D. Kolbasov, A. Elsukova, A. Malogolovkin and. S. Tsybanov //4^ Annual meeting Epizone «Bridges to the Future».- Saint Malo, 2010.-P.164.

9. Phylogenetic analysis of AFSV strains and isolates./ D.Kolbasov, S.Tcybanov, V. Balyshev, A. Malogolovkin, I. Kalabekov, A. Elsukova // 4t'1 Annual meeting Epizone «Bridges to the Future».- Saint Malo, 2010. - P. 190.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области

Тираж 80 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Елсукова, Александра Андреевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Эпизоотическаясшуацияпо АЙС.

2.2. Характеристика вириона.

2.3. Геном вируса АЧС.

2.4. Лабораторная диагностика АЧС

2.5. Методы типирования изолятов вируса АЧС.

2.5.1. Серологическая дифференциация вируса АЧС.

2.5.2. Физическое картирование генома вируса АЧС с помощью рестрикционного анализа.

2.5.3. Генотипирование изолятов вируса АЧС на основе амплификации вариабельных участков генома.

2.5.3.1. Метод частичного секвенирования амплифицированного фрагмента гена, кодирующего белок р72.

2.5.3.2. Метод анализа полиморфизма длин амплифицированных фрагментов вариабельных участков генома вируса АЧС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генотипирование изолятов вируса африканской чумы свиней"

Изоляты вируса АЧС, выделенные в различных географических зонах мира, а также полученные экспериментально, различаются по вирулентным, культуральным и антигенным свойствам. На основании реакции задержки гемадсорбции (РЗГА) имеющиеся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ штаммы вируса АЧС были разделены на восемь серотипов [Вишняков и др., 1995]. Антигенная гетерогенность вируса АЧС подтверждалась результатами перекрестного заражения свиней, выживших после переболевания или введения аттенуированных штаммов [Балышев и др:, 1999]. В то же время негемадсорбирующие изоляты не могли быть классифицированы в РЗГА, в связи с чем их относили в группу нетипированных изолятов [Вишняков и др., 1995].

На сегодняшний день в России создалась напряженная обстановка по африканской чуме среди свиней. На территорию нашей страны АЧС была занесена в ноябре 2007 г., заболевание диагностировали у кабанов в Шатойском районе Республики Чечня. В последующие годы вспышки болезни регистрировали еще в 12 субъектах России: Республиках Северная Осетия-Алания, Кабардино-Балкария, Калмыкия, Дагестан, Ингушетия, Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской, Волгоградской, Астраханской, Ленинградской, Оренбургской областях.

Для постановки диагноза на АЧС используют методы заражения иммунных к классической чуме свиней (КЧС) свиней, реакцию гемадсорбции, прямой и непрямой иммунофлуоресценции, иммуноферментного анализа [Вишняков, 1992]. Кроме того, в диагностике инфекционных болезней нашли широкое применение методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), поскольку они позволяют исследовать пробы из любых клинических образцов и патологического материала, даже доставленных с нарушениями температурного режима транспортировки, анализировать одновременно десятки и сотни проб и применять приборные методы учета реакции. В этой связи разработка тест-систем на основе ПЦР в режиме реального времени для идентификации изолятов вируса АЧС, внедрение их в практику рутинных исследований, а также разработка методов классификации вируса АЧС на основе анализа его генома, позволяющих проводить генотипирование вируса, проследить его генетическую эволюцию и географическое происхождение является актуальной.

Цели и задачи исследования

Основной целью исследований являлась разработка методов идентификации вируса АЧС, генотипирование выделенных на территории РФ изолятов и определение их филогенетических взаимоотношений с изолятами зарубежного происхождения. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Усовершенствовать метод выявления ДНК вируса АЧС на основе ПЦР с электрофоретической детекцией.

2. Разработать тест-систему на основе ПЦР в режиме реального времени для идентификации изолятов вируса АЧС.

4. Определить нуклеотидные последовательности С-концевой области гена B646L, кодирующего основной капсидный белок р72, изучить филогенетические взаимоотношения изолятов вируса АЧС, выделенных в Российской Федерации в 2007-2010 гг., с изолятами и штаммами АЧС, выявленных в Европе и Африке.

Научная новизна Впервые в России разработан комплекс методов для выявления и дифференциации изолятов и штаммов вируса АЧС на основе различных вариантов ПЦР (ПЦР в формате электрофорезной детекции, ПЦР в режиме реального времени, амплификация вариабельных участков генома).

На основании определения нуклеотидных последовательностей С-концевой области гена, кодирующего основной капсидный белок р72, и последующего филогенетического анализа показана принадлежность выделенных на территории РФ во время вспышек заболевания в течение 2007-2010 гг. изолятов вируса АЧС ко второй геногруппе.

Определено филогенетическое положение 22 вирулентных и авирулентных штаммов вируса - АЧС, депонированных в музее ГНУ ВНИИВВиМ, относящихся к I, II, III, IV, V, VII и VIII серотипам.

Практическая значимость работы

С использованием разработанных методов проведено генотипирование 8 изолятов вируса АЧС, выявленных в различных регионах РФ в период с 2007-2010 гг., и 22 штаммов вируса, депонированных в музее ГНУ ВНИИВВиМ.

Результаты экспериментальной работы использованы при разработке следующих документов:

- «Методические рекомендации по дифференциации штаммов вируса африканской чумы свиней методом ПЦР» (2009 г.);

- «Методические рекомендации по выявлению ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени» (2009 г.)

1. Разработана тест-система для идентификации генома вируса АЧС методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени, позволяющая быстро и надежно выявлять вирус АЧС с аналитической чувствительностью до 0,5 ГАЕ50/см в одном образце.

2. Определено филогенетическое положение 22 штаммов вируса, депонированных в музее ГНУ ВНИИВВиМ, и изолятов, выделенных на территории России с 2007 по 2010 гг., определенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена B646L, кодирующего белок р72 вируса.АЧС.

3. На основании амплификации четырех вариабельных участков генома (B602L, KP86R, J268L, BtSj) дана молекулярно-генетическая характеристика 30 штаммов и отечественных изолятов вируса АЧС, депонированных в музее ГНУ ВНИИВВиМ.

Апробация работы

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Личный вклад

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: к.б.н. A.C. Малоголовкин (освоение методики секвенирования), к.б.н., А.Г. Шендрик (освоение методики постановки ПЦР в реальном времени), микробиолог лаборатории «Иммунология» A.C. Казакова (освоение методов конструирования рекомбинантных молекул), заведующий лабораторией «Музейных штаммов» Балышева В.М. (изучение биологических свойств вируса АЧС). t

I i

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Эпизоотическая ситуация по АЧС

Африканская чума свиней (АЧС) — контагиозная, как правило, остро протекающая болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и высокой летальностью [Сюрин, 1998].

АЧС — это инфекционная болезнь только домашних и диких свиней, вызывается вирусом, который поражает 100% животных всех пород и возрастов [Ветеринария 3/2009].

АЧС относится к группе трансграничных инфекций животных, определенных ФАО как болезни, которые оказывают существенное влияние на экономику, торговлю и продовольственную безопасность значительного количества стран, могут легко распространиться из одной страны в другую и достигать эпидемических масштабов. [Э.Юбхашини, 2008].

До середины прошлого века нозоареал АЧС ограничивался африканским континентом, где регулярно имели место вспышки инфекции, обусловленные наличием природных очагов, а заболевание домашних свиней происходило после их контакта с дикими кабанами - вирусоносителями или при инвазии стада гематофагами. В 1957 году заболевание из Анголы было занесено в Португалию. В 1960 году заболевание возникло повторно и распространилось на территорию Испании. Эти страны оставались эндемичными по АЧС на протяжении более 30 лет.

В последующем на острове Сардиния сформировался вторичный природный очаг заболевания, существующий и поныне, где у животных преобладают стертые формы болезни.

Африканская чума свиней в настоящее время зарегистрирована в 24 странах мира, в том числе и в России.

В марте—апреле 2007 г. в Грузии зарегистрированы случаи массового заболевания свиней и их гибель. Референтная лаборатория МЭБ в Пирбрайте (Великобритания) 06.06.07 г. провела исследования патматериала от свиней из Грузии. Оказалось, что болезнь была вызвана экзотическим возбудителем — вирусом АЧС.

После лабораторного подтверждения диагноза грузинская сторона нотифицировала 55 очагов заболевания АЧС, 8 вспышек в апреле 2007 г., где пало 12 984 голов, с локализацией неблагополучных пунктов в западной части Грузии (Самегрелло, Ланчхути).

В МЭБ нотифицировано 13 вспышек АЧС в Армении, в том числе шесть за август 2007 г., две за сентябрь, еще пять новых очагов было зарегистрировано в октябре. Представленные в отчетах сведения свидетельствуют о 100% летальности заболевших в очагах инфекции (указанное число случаев заболевания равнялось числу павших животных -773 головы).

В конце января 2008 года в МЭБ был передан отчет об установлении заболевания на территории Азербайджана, диагноз был подтвержден лабораторными исследованиями (методом ПНР) в Республиканской ветлаборатории. Вспышка заболевания была зарегистрирована в населенном пункте Нидж Габалинского района, в котором насчитывалось около 600 подсобных индивидуальных хозяйств, где содержалось 4832 головы свиней. В очаге погибло 98 голов, и было уничтожено все оставшееся поголовье (4734 гол).

В ноябре 2007г. возбудитель АЧС был обнаружен в патматериале, отобранном от диких кабанов в Шатойском районе Чеченской Республики. В январе, а затем в апреле-мае 2008 г. были вновь получены положительные результаты на АЧС при лабораторной диагностике проб, отобранных от павших и отстреленных диких кабанов из данной республики

В июле 2008 г. заболевание диагностировано в Оренбургской области. Животные, больные чумой, выявлены в поселке Черноречье. Осенью 2008 г. обострилась эпизоотическая ситуация по заболеванию свиней африканской чумой в Южном федеральном округе Российской Федерации. Новые случаи заболевания домашних свиней АЧС выявлены в Краснодарском и

Ставропольском краях, Республике Северная Осетия — Алания [В.Герасимов,2009].

К африканской чуме восприимчивы домашние и дикие свиньи, независимо от возраста.

У диких африканских свиней (бородавочники, кустарниковые и гигантские лесные) болезнь протекает бессимптомно. Источником возбудителя инфекции служат больные и переболевшие свиньи. Вирусоносительство у отдельных животных длится до двух лет и более. Из организма животных вирус выделяется со всеми секретами и экскретами. В естественных условиях заражение легко происходит при совместном содержании больных свиней со здоровыми, главным образом алиментарным путем. Заражение возможно также аэрогенным путем, через поврежденную кожу и при укусе зараженными клещами. Факторами передачи возбудителя АЧС являются различные инфицированные объекты внешней среды (транспорт, предметы ухода, фураж, вода, навоз и др.) Особую опасность представляют продукты убоя зараженных свиней и образующиеся при их переработке пищевые и боенские отходы. Механическими переносчиками вируса могут быть люди, а также различные домашние и дикие животные, птицы, грызуны, насекомые (мухи, вши).

Основным резервуаром возбудителя болезни в Африке служат дикие свиньи, а в неблагополучных странах Европы и Америки - домашние свиньи и дикие кабаны, в популяции которых осуществляется циркуляция вируса.

Резервуаром и переносчиком вируса в странах, стационарно-неблагополучных по африканской чуме свиней, являются аргасовые клещи рода Ornithodoros (O.moubata — в Африке, O.erraticus — в Европе), которые заражаются от инфицированных животных [А.Р. Basto, 2006; И.Болоцкий, 2009]. Эти клещи являются общими паразитами как для диких и домашних свиней, так и для многих других позвоночных животных. Важной особенностью всех видов клещей рода Ornithodoros является большая продолжительность их жизни, которая составляет в среднем 10-12 лет, а в отдельных случаях достигает 25 лет. Кроме того, эти клещи способны к многолетнему голоданию и сохранению возбудителей ряда болезней [Greig А. , 1972; Sanchez-Botija С. 1962; L. Zsak, 2005]. В организме клещей вирус может сохраняться многие годы и передаваться потомству трансовариально[А. Р. Basto,2006].

Клинические признаки и патологоанатомические изменения при АЧС сходны с таковыми при КЧС. АЧС проявляется в виде интенсивной геморрагической септицемии - в высшей степени контагиозной, быстро протекающей болезни, вызывающей гибель всех контаминированных животных. В естественных условиях инкубационный период длится 5-7 дн, в эксперименте срок его варьировал в зависимости от штамма и дозы вируса. Различают сверхострое, острое, подострое, хроническое и латентное течение болезни. Чаще наблюдают сверхострое и острое течение[Сюрин, 1998; L. Zsak, М. V. Вогса, 2005].

В стационарно-неблагополучных странах установлены случаи хронического течения болезни. При сверхостром течении болезни у животных внезапно повышается температура, а на 2—3 сутки они погибают. При остром течении высокая температура удерживается 3—4 дня, количество лейкоцитов на 3—4 день лихорадки снижается до 40—50% от исходного.

Смертность при сверхостром и остром течении болезни лостигает 98— 100%, при хроническом — 50—60%. В процессе развития болезни, обычно при повышении температуры и в результате поражения эпителия и сосудов почек, моча приобретает кислую реакцию (pH 5,6—4,6) и в ней появляется белок (0.01-0,8%) [Сюрин, 1998].

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Елсукова, Александра Андреевна

6. ВЫВОДЫ.

-J

1,0 lg ГАЕ50/см в образце.

5. Филогенетический анализ фрагмента гена р72 позволил установить принадлежность 22 штаммов из коллекции ВНИИВВиМ к четырем генотипам: Сильва-1, Л-57, Л-50, ЛЦ-ПП, ФК-32, ФК-135, Нждасси-77, К-49 и его дериваты КК-203 и КК-262, ППА, 691/88, Катанга, Катанга/105, СТП-1, П-60 - к I; М-78, МК-200 - к V; Родезия - к VIII; а Уганда, ТСП-80, Бартлетт - к X генотипам.

6. Анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов четырех вариабельных участков генома вируса АЧС (B602L, KP86R, J268L, BtSj) позволяет дифференцировать исследованные вирулентные и авирулентные штаммы и изоляты внутри I, II, III, IV, V, VII и VIII серотипов, кроме штаммов ФК-32 и ФК-135.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1.«Методические рекомендации по дифференциации штаммов вируса африканской чумы свиней методом ПЦР», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ 17.10.2009 и рассмотренные на секции Биотехнологии Отделения ветеринарной медицины РАСХН (29.10.2009).

2. «Методические рекомендации по идентификации генома вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени», утвержденные Россельхознадзором 30.08.2010 (ПВР-1-5.0/02619).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Елсукова, Александра Андреевна, Покров

1. Африканская чума свиней/ И. Болоцкий, А. Васильев, В. Семенцов, С. Пруцаков// Ветеринария сельскохозяйственных животных.- 2009.-№3.-С. 6-10

2. Бакулов, И.А. Африканская чума свиней/ И.А. Бакулов // Эпизоотология/ под ред. Р.Ф. Сосова. М.: Колос, 1969. - С. 287-290.

3. Бакулов, И.А. Проблемы современной эволюции африканской чумы свиней/И.А. Бакулов, В.В. Макаров // Вестник с/х науки. 1990. - № 12.-С. 122-128.

4. Биологические свойства вируса африканской чумы , свиней, выделенных в российской Федерации/В.М. Балышев, В.В. Куриннов, С.Ж. Цыбанов, Ю.Ф. Калантаенко, Д.В. Колбасов, В.В. Пронин, Г.К. Корнева//Ветеринария.-2010.-№7.- С. 25-28.

5. География АЧС и типовая гетерогенность возбудителя болезни / В.М. Балышев, A.B. Книзе, С.Ж . Цыбанов // Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе: тезисы докладов МВА им. К.И. Скрябина. М.,- 1999. - С.92-94.

6. Идентификация вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции/ В.О. Копытов, Л.Я. Цыбанова, Ю.О. Селянинов, С.Ж. Цыбанов // Генодиагностика инфекционных заболеваний: Сб. тезисов Всероссийской науч.-практ. конф.-М.,-2002.-С. 341-343.

7. Катастрофа для свиноводческой отрасли//Ветеринария сельскохозяйственных животных. -М.- 2009.-№3.-С. 2-5.

8. Коваленко, Я.Р. Африканская чума свиней. М.: Колос, 1972. - 200 с.

9. Колонцов, A.A. Локализация мажорных полипептидов вируса АЧС и вирусассоциированных ферментов в структуре вирионов/А.А. Колонцов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-1995.-№3.-С. 34-38

10. Ликвидация Африканской чумы свиней в республике Абхазия/ В. Герасимов, С. Кукушкин, А. Мищенко, В. Никифоров//Ветеринария сельскохозяйственных животных.-2009.- 3.-С.11-16.

11. Селянинов, Ю.О. Вирус африканской чумы свиней: физическое картирование генома штаммов/ Ю.О. Селянинов, В.М. Балышев, С.Ж. Цыбанов // Вестник РАСХН.- 2000.- № 5.- С.75-76.

12. Селянинов, Ю.О. Сравнительный анализ геномов двух штаммов вируса АЧС с различными иммунобиологическими свойствами/ Ю.О.

13. Селянинов, B.C. Перзашкевич, В.М. Балышев // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: материалы конф., посвященной 40-летию ВНИИВВиМ. -Покров, 1998.-С.60-61.

14. Селянинов, Ю.О. Физическое картирование генома вируса африканской чумы свиней/ Ю.О. Селянинов, Е.К. Сенечкина // Доклады РАСХН.- 1995.- № 2.- С.37-39.

15. Сингер, М., Берг П. Гены и геномы: в 2-х томах / М. Сингер, П. Берг; пер. с англ. Т.С. Ильиной, Ю.М. Романовой. М.: Мир, 1998. - Т. 1. -373 с.

16. Вирусные болезни животных/ В.Н. Сюрин, А .Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина//-М., ВНИТИБП. 1998. - 928 с.

17. Херрингтон, С. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / авт.пер. с англ. A.A. Лушниковой, Л.И. Новиковой, П.А. Сломинского -М.: Мир, 1999.-558 с.

18. Чумак, Р.М.Таксономическая принадлежность вируса АЧС/ P.M. Чумак // Тезисы докладов, научной конференции ВНИИВВиМ по вопросам ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. РАСХН- Покров, 1992. С. 32-34.

19. Юбхашини, Э. Африканская чума свиней в республике Маврикий/Э. Юбхашини//Ветеринарный консультант.- 2008.- №22.-С. 10-12.

20. A set of African Swine Fever Tandem repeats shares similarities with SAR-like sequences/ F.Almazan, J.R.Mirguia, J.M.Rodriguez, de la Vega, E.Vinuela//Journal of General Virology.-1995.-№ 76.-P. 729-740.

21. African swine fever virus encodes a gene with extensive homology to type II DNA topoisomerases/ S. A. Baylis, A. H. Banham, S Vydelingum,L. K. Dixon, G. L. Smith//J. Mol. Biol. 1992. - Vol. 228, №3. - P. 1003-1010.

22. African swine fever virus encodes a serine protein kinase which is packaged into virions/ S. A. Baylis, A. H. Banham, S. Vydelingum, L. K.Dixon, G. L. Smith// J. Virol. 1993. - Vol.67, № 8. - P. 4549-4556.

23. African swine fever virus gene jl3L encodes a 25-27 kDa virion protein with variable numbers of amino acid repeats/ H. Sun, , S. C. Jacobs, G. L. Smith, L. K. Dixon, R. M. E. Parkhouse// J. Gen. Virol. 1995. - Vol.76, № 5.-P. 1117-1127.

24. African swine fever virus genome content and variability/ L.K Dixon, S.A Baylis, S. Vydeingum, S.R.F Twigg, J.M Hammond, P.M Hingamp, C Bristown, P.J. Wilkinson, G.L. Smith // Arch. Virol. 1993. - № 7. - P. 185-199.

25. African swine fever virus infection of the bushpig (Potamochoerus porcus) and it's significance in the epidemiology of the disease./E.C. Anderson, G.H. Hutchings, N. Mukarati, P.J. Wilkinson //Veterinary Microbiology.-Vol. 62.-P.1-15.

26. African swine fever virus multigene family 360 and 530 genes affect host interferon response/ C. L. Afonso, M. E. Piccone, K. M. Zaffuto, J. Neilan, G. F. Kutish, Z. Lu, C. A. Balinsky, T. R Gibb, T. J. Bean//J Virol.-2004.-Vol.78.-P. 1858-1864.

27. African swine fever virus multigene family 360 and 530 genes are novel macrophage host range determinants / L.Zsak, Z.Lu, T. G.Burrage, J. G.Neilan, G. F. Kutish, D. M. Moore, D. L. Rock // J. Virol. 2001. -Vol.75.- P. 3066-3076.

28. African swine fever virus structural protein p72 contains a conformational neutralizing epitope/ M.V. Borca, P. Irusta, C. Carrillo, C.L. Afonso, T. Burrage, D.L. Rock // Virology. 1994. - Vol. 201, № 2. - P. 413-418. - v. 58. - P. 707-727

29. Amino acid tandem repeats within a late viral gene define the central variable region of African swine fever virus/ P.M. Irusta, M.V. Borca, G.F. Kutish, Z. Lu, E. Caler, C. Carrillo, D.L. Rock/ Virology.- 1996.- Vol. 220, № 1.-P.20-27.

30. Amino acid tandem repeats within a late viral gene define the central variable region of African swine fever virus/P.M. Irusta, M.V. Borca, G.F. Kutish, Z. Lu, E. Caler, C. Carrillo, D.L. Rock//Virology.- 1996.- Vol. 220.-P.20-27.

31. Analysis of the complete nucleotide-sequence ofAfrican swine fever virus / R.J. Yanez, J.M. Rodriguez, M.L. Nogal, L. Yuste, C. Enriquez, J.F. Rodriguez, E. Vinuela//Virology.- 1995.- Vol. 208.-P.249-278.

32. Arias, M. African swine fever diagnosis. Role of the new tests/ M. Arias, M. Pastor, J.M. Escribano// Proc. Workshop Coordinat. Agricult. Res.-Lisbon, 1993.- P.185-189.

33. Baroudy, B.M. Incomplete base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain/ B.M. Baroudy, S. Venkatesan, B. Moss //Cell.-1982.-№28.-P. 315-324.

34. Basto, A.P. Kinetics of African swine fever virus infection in Ornithodoros erraticus ticks/A.P. Basto, R.J. Nix, L.K. Dixon//Journal of General Virology.-2006.-Vol. 87.-P. 1863-1871

35. Black, D.N. Purification and physicochemical characteristics of african swine fever virus/ D.N. Black, F. Brown // J. Gen. Virol. 1976. - Vol. 32. -P. 509-518.

36. Blasco, R. Sequence and evolutionary relationships of african swine fever virus thymidine kinase / R.Blasco, C.Lopez-Otin, M. Munoz // Virology. -1995. Vol. 178.-P. 301-304.

37. Brookes, S.M. Characterization of african swine fever virion proteins j5R and jl3L: immuno-localization in virus particles and assembly sites/ S.M. Brookes, H. Sun, L.K. Dixon // J. Gen. Virol. 1998. - Vol.79, № 5. - P. 1179-1188.

38. Brun, A. African swine fever virus gene A179L, a viral homologue of bcl-2, protects cells from programmed cell death/ A. Brun, C. Rivas, M. Esteban // Virology. 1996. - Vol. 225, № 1. -P.227-230.

39. Caballero, R.G. Application of pRPEL2 plasmid to detect african swine fever virus by DNA-DNA hybridization/ R.G. Caballero, E.Tabares // Arch. Virol. 1986. - Vol. 87. - P. 119-125.

40. Caballero, R.G. Application of pRPEL2 plasmid to detect african swine fever virus by DNA-DNA hybridization/ R.G. Caballero, E. Tabares // Arch. Virol. 1986. - № 87. - P. 119-125.

41. Characterization of p30, a highly antigenic membrane and secreted protein of african swine fever virus/ C. L. Afonso, , C. Alcaraz, A. Brun, M. D. Sussman, D. V. Onislc, J. M. Escribano, and D. L. Rock// Virology. 1992. -Vol. 189, №. - P. 368-373.

42. Comparison of a radioimmunoprecipitation assay to immunoblotting and ELISA for detection of antibody to an african swine fever virus/ C.I.

43. Alcaraz, M. De Diego, M.J. Pastor, J.M. Escribano// J. Vet. Diagn. Invest. -1990.-№2.-P. 191-196.

44. Comparison of the genome sequences of nonpathogenic and pathogenic African swine fever virus isolates/D.A. G. Chapman, V. Tcherepanov, C. Upton, L.K. Dixon// Journal of General Virology.-2008.- Vol. 89.-P. 397408.

45. Compton, P. Annual report of the Institute for Animal Health/ P. Compton.-Berks, UK, 1996.-P.140.

46. Compton, P. Annual report of the Institute for Animal Health/ P. Compton.-Berks, UK, 1994.-P.132

47. De la Vega, I. Genetic-variation and multigene families in African swine fever virus/ I.de la Vega, E.Vinuela, R. Blasco// Virology.- 1990.-№ 179.234-246.

48. Detection of African Swine Fever by a biotinylated DNA probe: assay on cell cultures and field samples/ F. Petit, C. Boucraut-Baraton, R. Py, F. Benozet, D.P. Picavet //Ann.Rech.Vet.- 1991,- Vol 22, №2.-P. 201-209.

49. Dixon, L.K. Genetic diversity of African swine fever isolates from Malawi/ L.K. Dixon, P. Wilkinson IIJ. Gen. Virol.- 1988.- Vol.69.- P. 2981 -2993.

50. Dixon, L.K. Genetic diversity of African swine fever virus isolates from soft ticks (Ornithodoros moubata) inhabiting burrows in Zambia/ L.K. Dixon, P.J. Wilkinson//J. gen. Virol.- 1988.- Vol.69.-P.2981-2993.

51. Dixon, L.K. Molecular cloning and restriciton enzyme mapping of an African swine fever virus isolate from Malawi/ L.K. Dixon//J. Gen. Virol.-1988.-Vol. 69.-P. 1683-1694.

52. Donaldson, A.I. The survival of some airborne animal viruses in relation to relative humidity/ A.I. Donaldson, N.P. Ferris// Vet Microbiol 1976.-№1.-P. 413 -420.

53. Duarte, M. M. D. Bases moleculares da virulence ehemadsorbcao nos isolados Nacionas Lisboa 60 e Lisboa 68 do Virus Da Peste Suina Africana. M.M.D. Duarte// PhD thesis.-2000.

54. Duplicated genes within the variable right end of the genome of a pathogenic isolate of African swine fever virus/ S.Vydelingum, S.A. Baylis, C. Bristow, G.L. Smith, L.K. Dixon// Journal of General Virology.-1993 .-Vol.74.-P.2125-2130.

55. Ekue, N.F. Analysis of the genomes of African swine fever virus isolates from Cameroon/N.F. Ekue, P.J. Wilkinson//Revue Elev. Med. vet. Pays trop.-1999.- Vol. 52, № 3-4.-P. 195-201.

56. Ekue, N.F.Comparison of genomes of African swine fever virus isolates from Cameroon, other African countries and Europe/ N.F. Ekue, P.J.

57. Wilkinson ., -Revue Elev. Med. Vet. Pays Trop.- 2000.- Vol. 53, № 3 : 229236.

58. Genetic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa (1973-1999)/ C.I. Boshoff, A.D. Bastos, L.J. Gerber, W.Vosloo //Vet.Microbiol.- 2007 .- Vol. 31.-P.45-55.

59. Genome relatedness among African swine fever virus field isolates by restriction endonuclease analysis/ R.D.Wesley, A.E.Tuthill// Prev. Vet. Med.- 1984.- Vol. 2.-P. 53-62.

60. Greig, A. The localization of african swine fever virus in the tick Ornithodoros moubata porcinus / A. Greig // Arch. ges. Virusforsch. 1972.- Vol. 39, № 1 3. - P. 240-247.

61. Hairpin loop structure of African swine fever virus-DNA/ A.Gonzalez, A.Talavera, J. M. Almendral, E.Vinuela//Nucleic Acids Res.- 1986.- № 14.-P. 6835-6844.

62. Haresnape, J.M. The distribution of ticks of the Ornithodoros moubata complex (Ixodoidea: Argasidae) in Malawi and its relation to African swine fever epizootiology/ J.M.Haresnape, F.D. J. Manu// Hyg.- 1986.- Vol.96.-P.535-544.

63. Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of african swine fever virus in clinical samples/ M. Aguero, J. Fernandez, L. Romero, C. Sanchez Mascaraque, M. Arias, J. M. Sanchez-Vizcaino// J. Clin. Microbiol. 2003.- Vol. 41, № 9. P. 4431 - 4434.

64. Holland, P. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5' to 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase/ P. Holland, R. Abramson, R. Watson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88. - P. 7276-7280.

65. Inhibition of apoptosis by the african swine fever virus bcl-2 homologue: role of the BH1 domain/ Y. Revilla, A. Cebrian, E. Baixeras, C. Martinez, E.Vinuela, M. L. Salas// Virology. 1997. - Vol. 228, № 2. - P. 400-404.

66. Intra-genotypic resolution of African swine fever viruses from an East African domestic pig cycle: a combined p72-CVR approach /B. A. Lubisi , A.D.S. Bastos, R.M. Dwarka., W.Vosloo// Virus Genes.-2007.- Vol. 35.-P.729-735.

67. Kleiboeker, S.B. A conserved african swine fever virus right variable region gene, II1L, is non-essential for growth in vitro and virulence in domestic swine/ S.B. Kleiboeker, G.F. Kutish, J.G. Neilan // J. Gen. Virol. 1998. -Vol. 79, №5.-P. 1189-1195.

68. Lewis, T. An african swine fever virus ERV1-ALR homologue, 9GL, affects virion maturation and viral growth in macrophages and viral virulence in swine/ T. Lewis, L.Zsalc, T.G. Burrage // J. Virol. 2000. -Vol.74, №3.-P. 1275-1285.

69. Livak, K.J. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acidhybridization/ K.J. Livak, S.J. Flood, J. Marmaro // PCR Methods Appl. -1995.-Vol. 4.-P. 357-362.

70. Lucas, A. Classification of african swine fever virus/ A. Lucas, R. Carnero, M.Bresso // C. R. Acad. Sci. 1968. - Vol. 266, № 17. - P. 1800-1801

71. Malmquist, W.A. Haemadsorption and cytopathic effect produced by African swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures./ W.A.Malmquist, D.Hay// Am. J. Vet. Res.-1960.- Vol. 21.-P.104-108.

72. Malmquist, W.A. Serologic and immunologic studies with African swine fever virus/ W.A. Malmquist// American Journal of Veterinary Research.-Vol. 24.-P. 450-459.

73. Manual of standards for diagnostic tests and vaccines, 4th edition.-Paris, 2000.-950 p.

74. Maurer, F.D. The pathology of african swine fever. A comparison with hog cholera/ F.D. Maurer, R.A. Griesemer, T.C. Jones // Am. J. Vet. Res. -1958.-Vol. 19.-P. 517-539

75. Molecular epidemiology of African swine fever in East Africa/B.A. Lubisi, A.D.S. Bastos, R.M. Dwarka, W. Vosloo// Arch.Virol.-2005.- Vol. 150.-P. 2439-2452.

76. Molecular epidemiology of African swine fever virus studied by analysis of four variable genome regions/R. J. Nix, C. Gallardo, G. Hutchings, E. Blanco, L. K. Dixon// Arch Virol.- 2006.- Vol. 151, № 12.-P.2475-2494.

77. Moore, D.M. The african swine fever virus thymidine kinase gene is required for efficient replication in swine macrophages and for virulence in swine/ D.M. Moore , L. Zsak, J.G. Neilan // J. Virol. 1998. - Vol.72, № 12. -P. 10310-10315.

78. Morrison, T.B. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification/T.B.Morrison, J.J.Weis, C.T.Wittwer// BioTechniques. 1998. - Vol. 24. - P. 954-958.

79. Multigene families in african swine fever virus: Family 110/ J. M. Almendral, F. Almazan, R. Blasco, E. VinuelaII J. Virol. 1990. - Vol. 64. -P. 2064-2072.

80. Neilan, J.G. A conserved african swine fever virus I kappa B homolog, 5EL, is nonessential for growth in vitro and virulence in domestic swine/ J.G. Neilan, Z. Lu, G.F. Kutish // Virology. 1997. - Vol.235, № 2. - P. 377-385.

81. Neilan, J.G. An african swine fever virus gene with similarity to the proto-oncogene bcl-2 and the Epstein-Barr virus gene BHRF1/ J.G. Neilan, Z. Lu, C.L. Afonso // J. Virol. 1993. - Vol. 67. - P. 4391-4394.

82. Novel swine virulence determinant in the left variable region of the african swine fever virus genome/ J. G. Neilan, L. Zsak, Z. Lu, G. F. Kutish, C. L. Afonso, D. L. RockII J. Virol. 2002. - Vol.76, № 7. - P. 3095-3104.

83. Oliveros, M. Characterization of an african swine fever virus 20-kDa DNA polymerase involved in DNA repair/ M. Oliveros, R.J. Yanez, M.L Salas // J. Biol. Chem. 1997. - Vol.272, № 49. - P. 30899-30910.

84. Pan, I.C. African swine fever: application of immunoelectroosmophoresis for the detection of antibody/ I.C. Pan, C.J. De Boer, W.R. Hess // Can. J. Comp. Med. 1972. - Vol. 36. - P. 309-316.

85. Phologane, S.B. Intra- and Inter-Genotypic Size Variation in the Central Variable Region of the 9RL Open Reading Frame of Diverse African Swine Fever Viruses/ S.B. Phologane, A.D.S. Bastos, M.-L. Penrith //Virus Genes .- 2005.-№31.-P.357.

86. Pires, S. Sequence and organization of the left multigene family 110 region of the Vero-adapted L60V strain of African swine fever virus/ S. Pires, G. Ribeiro, J. Costa//V.Virus Genes. Vol.15.-P. 271-274.

87. Plowright, W. Evidence for the type of nucleic acid in african swine fever virus/ W.Plowright, F.Brown, J.Parker// Arch. ges. Virusforsch-1966. Vol. 19, № 3. - P. 289-304.

88. Plowright, W. The stability of African swine fever virus with particular reference to heat and pH inactivation/ W.Plowright, J.Parker// Arch Ges Virusforsch .-1967,- Vol. 21, № 3.-P. 383-402.

89. Preclinical Diagnosis of African Swine Fever in Contact-Exposed Swine by a Real-Time PCR Assay/ L. Zsak, M. V.Borca, G. R.Risatti,

90. A.Zsak, R. A.French, G. F.Kutish, J. G.Neilan, J. D.Callahan, W. M.Nelson, D. L. Rock //Journal Of Clinical Microbiology.-2005.-№1.- P. 112-119

91. Proteins specified by african swine fever virus. II. Analysis of proteins in infected cells and antigenic properties/E. Tabares, J. Martinez, F. Ruiz Gonzalvo, C. Sanchez-Botija // Arch. Virol. 1980. - № 66. - P. 119-132.

92. Rapid and biologically safe diagnosis of african swine fever virus infection by using polymerase chain reaction/ Y. Steiger, M. Ackermann, C. Mettraux, U. Kihm. // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30, № 1. - P. 1-8.

93. Rapid and simple method for purification of nucleic acids/ R. Boom, C.J. Sol, M.M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M.E. Wertheim-Van Dillen, J. Van Der Noordaa// Clin Microbiol.-1990.- Vol. 28.-P. 495-503.

94. Read, S.J. Lightcycler multiplex PCR for the laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system/ S.J. Read, J.L.Mitchell, C.G. Fink // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 30563059.

95. Rodriguez, C.I. African swine fever virus IAP-like protein induces the activation of nuclear factor kappa B/ C.L Rodriguez, M.L. Nogal, A.L. Carrascosa // J. Virol. 2002. - Vol.76, № 8. - P. 3936-3942.

96. Rodriguez, J.M. Intermediate class of mRNAs in african swine fever virus/ J.M. Rodriguez, M.L. Salas, E. Vinuela // J. Virol. 1996. - Vol. 70. -P. 8584-8589.

97. Rojo, G. Migration of mitochondria to viral assembly sites in african swine fever virus-infected cells/ G. Rojo, M. Chamorro, M.L. Salas // J.Virol. 1998.-Vol.72, № 9. - P.7583-7588.

98. Sanchez-Botija C. Estudio sobre la peste porcina africana en Espana/ C. Sanchez-Botija//Bull. off. internat. epiz. 19 p.

99. Sanchez-Botija, C. Laboratory manual for diagnosis on african swine fever/ C Sanchez-Botija, A. Ordas.-Madrid.-1977.

100. Sanchez-Vizcaino, J.M. African swine fever diagnosis // African Swine Fever / Becker Y. (ed.). Boston: Martinus Nijhoff, 1987. - P. 63-71.

101. Schnitzler, P. Identification of the gene encoding the major capsid protein of fish lymphocystis disease virus/ P. Schnitzler., G.Darai // J. Gen. Virol. 1993. - Vol. 74. - P. 2143-2150.

102. Serodiagnosis of african swine fever using the recombinant protein p30 expressed in insect larvae/ M. G. Barderas, A.Wigdorovitz, F. Merelo, F. Beitia, C. Alonso, M. V. Borca, J. M. Escribano // J. Virol. Methods. -2000.-Vol. 89.-P. 129-136.

103. Sun, H. Characterization of the african swine fever virion protein jl8L/ H. Sun, J. Jenson, L.K. Dixon // J. Gen. Virol. 1996. - Vol. 77, № 5. -P. 941-946.

104. Tabares, E. A reliable enzyme linked immunosorbent assay for african swine fever using the major structural protein as antigenic reagent/ E. Tabares, M. Fernandez, E. Salvador-Temprano // Arch. Virol. 1981. - Vol. 70.-P. 297-300.

105. Terminal and internal inverted repetitions in African swine fever virus DNA./J.M. Sogo, J.M. Almendral, A.Talavera, E.Vinuela //Virol.-1984.-Vol.l33.-P.271-275.

106. Terpstra, C. Differential diagnosis between african swine fever and hog cholera // African Swine Fever Boston: Martinus Nijhoff Publ., 1987. -P. 73-80.

107. Terpstra, C. Laboratory diagnostics of african swine fever in ASF-free and ASF-endemic countries/ C. Terpstra // African swine fever: Proc.

108. Workshop for coordination of agricultural research. — Lisbon, 1993. P. 161-167.

109. The african swine fever virus IAP homolog is a late structural polypeptide/ M. R. Chacon, F. Almazan, M. L. Nogal, E Vinuela, J. F. Rodriguez// J. Virol. 1995.- Vol. 214, № 2. - P.670-674.

110. The african swine fever virus prenyltransferase is an integral membrane trans-geranylgeranyl-diphosphate synthase/ A. Alejo, R. J. Yanez, J. M. Rodriguez, E Vinuela, M. L. Salas// J. Biol. Chem. 1999. -Vol. 274, №25.-P. 18033-18039.

111. The host response to African swine fever virus/ R. C. Wardley, S. G.Norley, C. V.Martins, M. J. P.Lawman// Progress in Medical Virology.-1987.-Vol. 34.-P. 180-192.

112. Thompson, G.R. The epidemiology of African swine fever:The role of free-living hosts in Africa./G.R.Thompson// Ondenterpoort Vet. Res.-1985.-Vol. 52.-P.201-209.

113. Three african swine fever virus genes encoding proteins with homology to putative helicases of vaccinia virus/ S.A. Baylis, S.R.F.Twigg, S.Vydelingum, L.K.Dixon, G.L.Smith// J. Gen. Virol. 1993a. - Vol.74. -P. 1969-1974.

114. Transcriptional analysis of multigene family 110 of african swine fever virus/ F. Almazan, J. M. Rodriguez, G. Andres, R. Perez, E. Vinuela, J. F. Rodriguez// J. Virol. 1992. - Vol. 66. - P. 6655-6667.

115. Transcriptional mapping of a late gene coding for the pl2 attachment protein of african swine fever virus/ F. Almazan, J.M. Rodriguez, A. Angulo, E. Vinuela, J. F. Rodriguez// J. Virol. 1993. - Vol. 67. - P. 553556.

116. Tulman, E. R. Novel virulence and host range genes of African swine fever virus./ E. R.Tulman, D. L.Rock// Curr Opin Microbiol 2001.-№4.-P. 456-461.

117. Two novel multigene families, 530 and 300, in the terminal variable regions of african swine fever virus genome/ T.Yozawa, G. F.Kutish, C. L Afonso, Z.Lu, D. L. Rock// Virology. 1994. - Vol. 202, № 2. - P. 9971002.

118. Variable and constant regions in african swine fever virus DNA / R. Blasco, M. Aguero, J. M. Almendral, E.Vinuela// Virology. 1989. - № 168.-P. 330-338.

119. Variable regions on the genome of Malawi isolates of African swine fever virus/ K.J. Sumption, G.H. Hutchings, P.J. Wilkinson, L.K. Dixon//Gen. Virol.- 1990.- Vol. 71.-P. 2331 -2340.

120. Variable regions on the genome of the Malawi isolate of African swine fever virus/ K.J. Sumption, G.H. Hutchings, P.J. Wilkinson, L.K. Dixon//J. gen. Virol.- 1990.-№71.-P.2331-2340.

121. Vigario, JD. Antigenic relationships among strain of African swine fever./ J.D. Vigario, A.M. Terrinha, J.F. Moura Nunes //Arch Ges Virusforsch.- 1974,-Vol. 45.-P.272-277.

122. Vinuela, E. African swine fever virus / E.Vinuela// Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1985. - № 116.-P. 151-170.

123. Vinuela, E. African swine fever virus/E. Vinuela // African swine fever. 1987. - P. 31-49.

124. Virus taxonomy: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Family Asfarviridae/ L.K.Dixon, J.V. Costa, J.M.Escribano, D.L.Rock, E.Vinuela, P.J. Wilkinson., S.M. Van

125. Regenmortel, C.M.Fauquet, D.H.L Bishop., E.B Carestens., M.K Estes., M.H.V. Lemon, J.Maniloff, M.A.Mayo, D.J.McGeoch, C.R.Pringle, R.B.F.A.Wickner, C.M.Murphy, D.H.Lauquet, S.A Bishop., A.W.Ghabrial,

126. G.P. Jarvis, M.D. Martelli.- Summers Academic Press.- San Diego,2000.-P. 159-165.

127. Wambura, P.N. Molecular Diagnosis and Epidemiology of African Swine Fever Outbreaks in Tanzania/P.N. Wambura, J.Masambu,

128. H.Msami/Veterinary Research communications.- 2006.-№30.-P.667-672.

129. Yanez ,R.J. African swine fever virus encodes a DNA ligase / R.J. Yanez, E. Vinuela//Virology. 1993. - Vol.193, № 1. -P.531-536.

130. Yanez, R.J. Two putative african swine fever virus helicases similar to yeast 'DEAH' pre-mRNA processing proteins and vaccinia virus ATPases D11L and D6R / R.J. Yanez, J.M. Rodriguez, M. Boursnell // Gene. 1993. -Vol.134, №2.-P. 161-174.

131. Yu, M. Strong sequence conservation of African swine fever virus p72 protein provides the molecular basis for its antigenic stability/C.J. Morrissy, H.A.Westbury//Arch. Virol.- 1996.-Vol. 141.-P.1795-1802.

132. Zsak, L. A nonessential african swine fever virus gene UK is a significant virulence determinant in domestic swine/ L. Zsak, E. Caler, Z. Lu // J. Virol. 1998. - Vol. 72, № 2. - P. 1028-1035.

Информация о работе

Елсукова, Александра Андреевна
кандидата биологических наук
Покров, 2010
ВАК 03.02.02

Диссертация

Генотипирование изолятов вируса африканской чумы свиней - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы