Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование методов индикации генома вируса африканской чумы свиней в объектах ветеринарного надзора

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов индикации генома вируса африканской чумы свиней в объектах ветеринарного надзора"

Па правах рукописи

Газаев Исмаил Хизирович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИНДИКАЦИИ ГЕНОМА ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ В ОБЪЕКТАХ ВЕТЕРИНАРНОГО НАДЗОРА

03.02.02 Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 1 ДЬК 2011

Покров-2011

005004698

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).

Научный руководитель

доктор биологических наук,

профессор Содном Жамьянович Цыбанов

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник (ФГБОУ ВПО М ГАВМиБ)

Елена Игоревна Ярыгина

доктор ветеринарных наук,

профессор Анатолий Тимофеевич Кушнир

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

Защита диссертации состоится «23» декабря 2011 г. в «10-» часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская область, г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел./факс: (09243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «18» ноября 2011 г. и размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии wmv.vniiwim.ru

Ученый секретарь диссертационного совета

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, ^ £д Балашова

кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы

Африканская чума свиней (АЧС) - контагиозная, септическая болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и высокой летальностью, сверхострым, острым, подострым и хроническим течением. К АЧС восприимчивы домашние и дикие свиньи независимо от породы и возраста. Выжившие животные пожизненно остаются вирусоносителями [Коваленко Я. Р., 1965; Бакулов И. А., 1969; Сюрин В. Н., 1972].

Занос возбудителя АЧС в благополучные страны рассматривается специалистами как социальная и экономическая катастрофа. Это связано с огромным экономическим ущербом, причиняемым эпизоотиями данной болезни. [Бакулов И. А., 1969; Moreno М., 1978].

В официальных средствах массовой информации весной 2007 г. появились сведения о массовой гибели домашних свиней в Грузии. 7 июня 2007 г. референс -лаборатория МЭБ (Пирбрайт, Великобритания) поставила диагноз - АЧС. В результате последующих мониторинговых исследований, проведенных в 20072008 гг. на территории Чеченской республики РФ, в 21 случае выделен вирус АЧС от павших и отстрелянных диких свиней. Во второй половине 2008 г. развитие эпизоотического процесса АЧС характеризовалось новым этапом - заносом вируса на территорию Республики Северная Осетия - Алания и вовлечению в эпизоотическую цепь домашних свиней [Куриннов В. В., 2010].

В последующие годы вспышки болезни регистрировали еще в 17 субъектах Российской Федерации: республиках Кабардино-Балкария, Калмыкия, Дагестан, Ингушетия, Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской, Волгоградской, Астраханской, Ленинградской, Нижегородской, Оренбургской, Архангельской, Мурманской, Тверской, Курской и Воронежской областях [http://www.fsvps.rul.

При анализе путей заноса вируса АЧС в благополучные регионы установлено, что основными путями и факторами передачи вируса АЧС являются контаминированные пищевые отходы и мясопродукты от инфицированных свиней.

Мясо и мясопродукты, как правило, поступают на реализацию в замороженном или охлажденном виде и, если животное было убито в инкубационный период болезни, то вирус АЧС может сохраняться в мясопродуктах длительное время и представлять большую опасность в распространении болезни.

В диагностике инфекционных болезней животных, на сегодняшний день, нашли широкое применение серологические методы (ИФА, РПИФ) и методы на основе анализа генома (ПЦР с электрофорезной детекцией, ПЦР в реальном времени), поскольку они позволяют анализировать в краткие сроки одновременно большое количество проб и применять приборные методы учета реакции [Вишняков И.Ф., 1992; Цыбанов С.Ж., 1995; Agüero М., 2003].

Проведение соответствующих мероприятий по ликвидации очагов болезни в наиболее сжатые сроки возможно только при своевременной постановке диагноза и контроле продуктов свиноводства, которые могут содержать вирус АЧС и транспортироваться на различные расстояния, в том числе и для торговли. Это обуславливает необходимость разработки и внедрения в ветеринарную практику новых высокочувствительных и специфичных методов индикации вируса АЧС, как в пробах органов инфицированных животных, так и в объектах ветеринарного надзора.

Поэтому актуальной задачей является разработка и усовершенствование методов индикации генома вируса АЧС в объектах ветеринарного надзора и внедрение их в практику исследований, а так же изучение сохранности вируса АЧС во внешней среде и продуктах животного происхождения.

1.2 Степень разработанности проблемы

Steiger Y. и Ackermann М. в 1992 г. был предложен гнездовой вариант ПЦР для выявления ДНК вируса АЧС, который по чувствительности был сравним с выделением вируса на культуре клеток. Agüero М. et al. (2003) разработали однораундовую ПЦР с последующей рестрикцией эндонуклеазой BsmAI для подтверждения специфичности реакции. В РФ метод выявления ДНК вируса АЧС на основе ПЦР с электрофорезной детекцией был разработан в 1995 г. Цыбановым С. Ж. Но недостатком ее применения в диагностике является возможность

контаминации продуктами реакции и получение, вследствие этого, ложноположительных результатов. Преимущества ПЦР в реальном времени заключаются в уменьшении риска контаминации реакции ампликонами, сокращение времени анализа и трудозатрат, а так же объективностью учета и интерпретации результатов реакции, т.к. они производятся с помощью программного обеспечении прибора.

Среди отечественных ученых проблему устойчивости вируса АЧС изучали Коваленко Я. Р. (1965), Миколайчук C.B. (1992), однако данные по индикации ДНК вируса АЧС в продуктах свиноводства и объектах ветеринарного надзора отсутствуют.

1.3 Цель и задачи исследования

Целью исследования являлась разработка и усовершенствование методов индикации генома вируса АЧС в объектах ветеринарного надзора, а так же изучение сохраняемости вируса АЧС в продуктах животного происхождения.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать и усовершенствовать тест-систему на основе ПЦР в реальном времени для обнаружения ДНК вируса АЧС в различных вируссодержащих образцах, оценить ее чувствительность и специфичность.

2. Изучить сохраняемость вируса АЧС в продуктах убоя и пробах органов инфицированных животных.

3. Провести мониторинг АЧС на территории РФ и дать молекулярно-генетическую характеристику изолятов вируса АЧС, выделенных в период 2008 -2011 гг.

4. Определить наличие генома вируса АЧС в иксодовых клещах, собранных на территории Южного федерального округа.

1.4 Научная новизна результатов исследования

1. Впервые в России на основании амплификации пяти вариабельных участков генома (B602L, KP86R, J268L, BtSj и ген I196L) дана молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ в период 2008-2011гг.

2. Впервые в России изучена сохраняемость вируса АЧС (штамм «Ставрополь 2009») в продуктах убоя и пробах органов инфицированных свиней при разных температурах хранения.

3. Разработан и усовершенствован метод выявления ДНК вируса АЧС на основе ПЦР в реальном времени с внутренним контрольным образцом.

1.5 Практическая значимость работы

1. На основе результатов исследований разработаны «Методические рекомендации по дифференциации штаммов вируса африканской чумы свиней методом ПЦР», которые рассмотрены на секции Биотехнологии Отделения ветеринарной медицины РАСХН (29.10.2009 г.) и утверждены академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. (24.12.2009 г.).

2. Разработаны «Методические положения по выявлению генома вируса АЧС в образцах биологического материала и объектах ветеринарного надзора», которые рассмотрены на секции Инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН (27.04.2011 г.) и утверждены академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. (10.11.2011 г.).

3. «Методические положения по проведению пассивного и активного мониторинга африканской чумы свиней», которые рассмотрены на секции Инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН (23.09.2011 г.) и утверждены академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. (10.U.2011 г.).

4. Изготовлено и поставлено в ветеринарные лаборатории страны свыше 500 наборов для выявления генома вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени.

5. С помощью разработанных методов ПЦР в период 2009-2011 гг. исследовано более 59 тыс. проб патологического материала, отобранных от животных с подозрением на АЧС, из которых была выявлена 541 положительная проба.

6. С использованием метода ПЦР и последующим нуклеотидным секвенированием проведено генотипирование семи изолятов вируса АЧС,

выявленных в различных регионах РФ в период 2008 - 2011 гг.

1.6 Апробация работы

Основные результаты исследований, выполненных по теме диссертационной работы, заслушаны и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2009-2011 гг.).

Материалы диссертации доложены на: заседании Круглого Стола по АЧС (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии г. Покров, 2009 г.), П-ой Международной научно-практической конференции УГСХА (Ульяновск 2010 г.), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии г. Покров, 2011 г.), Международном семинаре «Workshop on laboratory diagnosis of african and classical swine fever» (Словения, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011 г.).

1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В соответствии с формулой специальность 03.02.02 Вирусология, охватывает проблемы разработки мер и средств предупреждения, диагностики и лечения вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследования - генной инженерии, изучение генетических и негенетических взаимодействий между вирусами, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработку мер предупреждения, диагностики и лечения вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе проведены исследования по усовершенствованию методов ПЦР диагностики АЧС посредством разработки генно-инженерных конструкций и применению усовершенствованных тест-систем в лабораторной диагностике болезни, а так же исследования по изучению стабильности вируса АЧС в продуктах переработки свинины.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 4, 5, 8, 10.

1.8 Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.9 Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы, методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 40 отечественных и 116 иностранных источников; дополнена приложениями. Диссертация содержит 18 таблиц и 14 рисунков. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость,

1.10 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Усовершенствованная тест-система для выявления ДНК вируса АЧС на основе ПЦР в реальном времени с внутренним контрольным образцом, позволяющая выявлять геном вируса АЧС с аналитической чувствительностью до 0,5 lg ГАЕ so/см3 в одном образце.

2. Сохраняемость вируса АЧС (штамм Ставрополь 2009) в мясе и шпике при разных температурах хранения.

3. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ в период 2008-2011 гг., на основании амплификации пяти вариабельных участков генома (B602L, KP86R, J268L, BtSj и ген I196L).

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: к.в.н. | Ю.Ф. КалантаенксГ] (выделение вируса АЧС в культуре клеток костного мозга свиней (ККМС)), к.б.н. A.C. Малоголовкин (освоение методики клонирования, разработка ВКО), к.б.н. И.М. Калабеков (освоение методики ПЦР, секвенирования), к.б.н. A.A. Елсукова (освоение методики генотипирования).

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

2.1.1 Вирус. В работе использовали штаммы вируса АЧС из коллекции ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии и изоляты, выделенные из полевых образцов на территории Российской Федерации в период с 2008 по 2011 гг., ДНК вируса АЧС, выделенная из проб органов, полученных от павших или подозреваемых (вынужденно убитых) в заражении домашних и диких свиней.

Для экспериментального заражения животных использовали штамм «Ставрополь 2009» вируса АЧС, который депонирован в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2.1.2 Животные. Подсвинки крупной белой породы 2-4 месячного возраста живой массой 30-40 кг из сектора подготовки подопытных животных ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2.1.3 Культуры клеток. Первичная культура клеток костного мозга свиней (ККМС) и лейкоцитов свиней (JIC) 1-2-х суточная, выращенная в пластиковых культуральных сосудах или чашках Карреля.

2.1.4 Бактериальный штамм и плазмида. В качестве вектора для клонирования использовали многокопийную плазмиду pTZ57R/T (Fermentas) и компетентные клетки E.coli DH5á (Promega).

2.2 Методы

2.2.1 Подготовка органов для выделения вируса. Органы и ткани павших и вынужденно убитых от АЧС свиней измельчали, растирали со стерильным песком в фарфоровой ступке и готовили на физиологическом растворе 10,0 % суспензию, которую осветляли низкоскоростным центрифугированием. Надосадок использовали для заражения культуры ККМС и свиней.

2.2.2 Выделение вируса. Выделение вируса проводили в культуре ККМС в течение 1 -3 последовательных пассажей. Для заражения культур клеток использовали 10,0% суспензию органов, которую инкубировали при (37,0±0,5) °С до появления феномена гемадсорбции или лизиса клеток в течение 7 суток.

2.2.3 Экспериментальное заражение животных. Свиней заражали внутримышечным введением вируссодержащей культуральной жидкости в объеме 1,0 мл в среднюю треть шеи в дозе 5,0 lg ГАЕ50. На разных стадиях заболевания

животных убивали и для дальнейших исследований отбирали пробы внутренних органов, мышечной ткани и мышечно жировую прослойку (шпик).

2.2.4 Отбор проб объектов ветеринарного надзора. Отбор проб объектов ветеринарного надзора проводили согласно «Методическим положениям по выявлению генома вируса АЧС в образцах биологического материала и объектах ветеринарного надзора», утвержденным академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М (10.11.2011 г.).

2.2.5 Выделение и очистка нуклеиновых кислот. Выделение ДНК из проб патологических материалов, шпика, крови, сыворотки, инфицированных культур клеток, мочи, фекалий, мазков, смывов и клещей проводили с использованием метода нуклеосорбции [Boom et.al., 1990].

2.2.6 Постановка ПЦР в реальном времени для выявления ДНК вируса АЧС. ПЦР в реальном времени проводили в реакционной смеси объёмом 25 мкл, содержащей 10 мкл деионизированной воды, 5 мкл 5*ПЦР буфера, 2 мкл 25 мМ MgCl2, по 1 мкл прямого и обратного праймеров (10 пмоль), 0,5 мкл зонда (5 пмоль), 0,5 мкл dNTPs (10 пмоль), 0,25 ед. Taq полимеразы, 5 мкл исследуемой ДНК.

2.2.7 Клонирование ПЦР - фрагмента в плазмидном векторе.

Клонирование ПЦР-фрагмента в области мультиклонировочного сайта плазмиды pTZ57R/T (Fermentas) проводили согласно инструкции производителя. Скрининг рекомбинантных клонов проводили по стандартной методике.

2.2.8 Нуклеотидное секвенирование и филогенетический анализ изолятов вируса АЧС. Выделение специфических продуктов амплификации из реакционной смеси осуществляли с помощью коммерческого набора для выделения нуклеиновых кислот «DNA purification kit» (Fermentas, Латвия) с последующей реамплификацией фрагментов при помощи компонентов «BigDye v. 3.1. Terminator» (Applied Biosystems, США).

2.2.9 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей. Специфичность праймеров подтверждали с использованием поисковой системы BLAST. Для анализа нуклеотидных последовательностей и построения рекомбинантных конструкций использовали программу Clone.

2.2.10 Статистическая обработка результатов исследований. Полученные результаты подвергали статистической обработке общепринятыми методами, используемыми в биологии [Лакин Г.Ф., 1990].

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Разработка и усовершенствование тест-системы для выявления генома вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени По сравнению с классическим вариантом ПЦР с электрофорезной детекцией, при которой существует риск получения ложноположительных результатов из-за возможности перекрёстной контаминации образцов, ПЦР в реальном времени позволяет проводить приборный учет результатов и существенно сокращает время исследований. Кроме того, с помощью ПЦР в реальном времени с использованием стандартов можно проводить количественный анализ ДНК вируса АЧС, определяя число копий ДНК в исследуемом материале.

Для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени проведен расчет олигонуклеотидных праймеров и гибридизационного зонда TaqMan, комплементарного консервативной области гена B646L, кодирующего основной капсидный белок р72 (табл.1).

Таблица 1

Последовательность праймеров и зонда для амплификации фрагмента гена р72 вируса АЧС длиной 250 п.о.

Наименование Последовательность

Прямой ASF 5'- CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA -3'

Обратный ASR 5'- ACGGCTGATCTTGTGGTATC -3'

3ohäASZ [FAM] - CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG -[ВН1]

На первом этапе, оптимизацию параметров реакции проводили на двух приборах: Rotor Gene 6000 и IQ5 («Corbett Research» Австралия, «Biorad» США).

Результаты амплификации учитывали путем анализа кривых флуоресценции, отображенных на экране во время (в реальном времени) и после завершения реакции, а также документированием с помощью программного обеспечения прибора. Флуоресценцию измеряли при 58°С по каналу Green (FAM) (Рис. 1).

Рис. 1. Результат анализа кривых флуоресценции

Результат учитывали только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля выделения ДНК.

Оценку аналитической специфичности ПЦР в реальном времени проводили с использованием ДНК, выделенной из гетерологичных вирусов (вирус оспы овец, болезни Ауески, классической чумы свиней), а так же из органов (селезёнка, печень, лимфоузлы) интактных подсвинков.

В качестве положительных проб использовали вируссодержащий материал, присутствие вируса в котором было подтверждено ранее с помощью ПЦР в формате электрофорезной детекции и выделением в культуре клеток костного мозга свиней.

В ходе проведенных исследований положительный результат (сигнал в виде кривой накопления, превышающей пороговую линию) получили только в образцах, содержащих ДНК вируса АЧС. При тестировании ДНК, выделенной от интактных животных, а так же гетерологичных вирусов, неспецифических продуктов реакции не наблюдали (Рис. 2).

5 10 15 20 25 30 35

СуЛ

Рис. 2. Определение специфичности метода ПЦР в реальном времени. Аналитическую чувствительность ПЦР в реальном времени и количественное

содержание ДНК вируса АЧС в исследуемых образцах определяли с помощью

ДНК-стандартов. В качестве стандартов использовали рекомбинантную плазмиду

с встроенным участком гена В646Ь размером 250 п.о. Предельное разведение при

котором регистрировали положительный сигнал содержало 19000 копий

плазмиды/мл (19 копий плазмиды/мкл), что составляло 95 геномных эквивалентов

вируса АЧС в реакционной смеси (Рис. 3).

5 10 1 5 20 25 30 35

Рис. 3. Определение чувствительности метода ПЦР в реальном времени. Полученные стандарты ДНК использовали для количественной оценки

содержания геномных эквивалентов вируса АЧС в пробах крови и

патологического материала. С этой целью образцы, давшие положительный

результат при постановке ПЦР в реальном времени, тестировали относительно

плазмидных стандартов, тем самым количественно определяя содержание копий

ДНК вируса АЧС в исследуемых образцах.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана тест-система на основе ПЦР в реальном времени, которая с высокой чувствительностью и специфичностью позволяет обнаруживать геном вируса АЧС и определять его количество в исследуемых образцах.

3.2 Разработка метода ПЦР в реальном времени для обнаружения ДНК вируса АЧС с использованием внутреннего контрольного образца (ВКО)

Для контроля этапов выделения нуклеиновых кислот и амплификации разработан внутренний контрольный образец, представляющий собой рекомбинантную плазмиду на основе вектора pTZ57R/T, несущую вставку специфической последовательности генома цирковируса свиней 2-типа. Фланкируемый праймерами CIR-1 и CIR-2 участок гена капсидного белка размером 349 п.о. содержал мишень для гибридизационного зонда CIR-Z, меченного флуоресцентным красителем Су5.

Учёт результатов проводили по анализу кривых накопления флуоресцентного сигнала по каналам GREEN и RED при 60°С.

Для контроля экстракции ДНК из исследуемых образцов использовали ВКО, добавляемый к каждой пробе на этапе выделения ДНК. Воспроизводимость результатов ПЦР в реальном времени с ВКО определяли постановкой реакции в пяти параллелях с используемыми образцами (табл. 2).

Таблица 2

Воспроизводимость результатов ПЦР в реальном времени с ВКО

п=5.

Образцы Среднее Cq Ст. откл Cq CV%

Навоз 26,16 0,19 0,7

Цельная кровь 26,02 0,41 1,5

Суспензия клещей 27,62 0,27 0,9

Моча 26,56 0,24 0,9

Суспензия комбикорма 18,82 0,39 2,0

Сыворотка 20,33 0,25 1,2

Стандартное отклонение Сц для различных образцов составляло 0,19-0,41. Наибольший коэффициент вариации (СУ %) наблюдали при постановке ПЦР с образцами комбикорма - 2,0 по сравнению со значениями 0,7-0,9 для других образцов, что свидетельствовало о наличии ингибиторов в анализируемых пробах.

Оптимизацию ПЦР в режиме реального времени для детекции ДНК вируса АЧС и ВКО проводили, добавляя к исследуемым образцам рекомбинатную плазмиду со вставкой участка гена вируса АЧС в количестве 19><1010копий/мкл. На основании полученных данных аналитическая чувствительность тест-системы ПЦР в реальном времени была идентичной и составила 95 копий на реакцию.

3.3 Экспериментальное заражение животных вирусом АЧС С целью определения возможности выявления генома вируса АЧС в пробах органов от инфицированных свиней, а так же в различных объектах ветеринарного надзора проведено экспериментальное заражение трех клинически здоровых подсвинков крупной белой породы 4 месячного возраста живой массой 30-40 кг вирусом АЧС штамм «Ставрополь 2009» в дозе 5,0 ^ ГАЕ50.

У животных в динамике отбирали кровь и убивали на 2, 4, 6, сутки, отбирали пробы мышечной ткани, шпика, кожи и внутренних органов. Кроме того, в динамике от каждого животного отбирали мазки из ротовой, носовой полостей, смывы с кожного покрова животного, пробы навоза и мочи (табл. 3).

Таблица 3

Результаты выявления генома вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени

п=6

Пробы Свиньи

№ 1 | № 2 | № 3

Дни после заражения

2 2 4 2 4 6

Мышечная ткань + * + * * +

Шпик + * + * * +

Кожа + * + * * +

Внутренние органы + * + * * +

Кровь + + + + + +

Мазки с ротовой полости - - + - + +

Мазки с носовой полости - - + - + +

Смывы с тела животного - - - - - -

Навоз - - - - - -

Моча - - - - - +

Примечания: «+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат, «*» - не исследовали

В результате исследований показано, что в пробах внутренних органов, мышечной ткани, шпике, коже и крови геном вируса АЧС выявляли, начиная со 2-го дня после заражения, в пробах мазков с ротовой и носовой полостей с 4-го дня.

В пробах мочи геном вируса АЧС выявляли на 6 день после заражения. В пробах навоза и смывах с тела животного геном вируса АЧС не выявляли.

3.4 Сохраняемость вируса АЧС в продуктах свиного происхождения, хранящихся при разных температурных режимах

С целью изучения сохраняемости вируса АЧС у животных, зараженных вирусом АЧС штамм «Ставрополь 2009» в дозе 5,0 ^ ГАЕ50, отбирали пробы мышечной ткани и шпика.

Для изучения влияния температуры на инактивацию вируса АЧС в пищевых продуктах приготовленные пробы распределяли для дальнейшего хранения при различных температурных режимах: 22^27°С; 4-6°С; минус 18+20°С.

Выделение вируса АЧС проводили в сформированном монослое первичных культур клеток косного мозга свиней (табл. 4).

Таблица 4

Выявление вируса АЧС штамм «Ставрополь 2009» в мясе и шпике.

п=3

Наименование проб Температура хранения

22-27°С 4+6°С Минус 18-20°С

Сроки выявления (дни) Титры вируса 08 ГАЕ 5о\ СМ3) Сроки выявления (дни) Титры вируса (1§ГАЕ 50\ СМ3) Сроки выявления (дни) Титры вируса 08 ГАЕ 5о\ СМ3)

Мясо 16 1.5 84* 2.0 118* 2.5-3.0

Мясо (солонина) 16 2.0 84* 2.5 118* 2.5-3.0

Шпик 16 1.5 84* 2.0 118* 2.5-3.0

Шпик соленый 16 1.5-2.0 84* 2.0-2.5 118* 2.5-3.0

Шпик копченый 16 1.5-2.0 84* 2.0-2.5 118* 2.5-3.0

Примечание: *- срок наблюдения

Установлено, что вирус АЧС штамм «Ставрополь 2009» выявляется в пробах мяса и шпика при 22^27°С в течение 16 дней в титрах 1,5- 2,0 ^ ГАЕ 50/см3, однако на 20 день вирус не обнаруживался. При температуре 4-Н>°С в исследуемых образцах вирус выявляли в течение 84 дней в титрах 2,0-2,5 ^ ГАЕ 50/см3 (срок наблюдения), и при температуре минус 18^20°С, в течение 118 дней в титрах 2,53,0 ^ ГАЕ 50/см3 (срок наблюдения).

3.5 Влияние сроков хранения проб при различных температурных режимах на возможность выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном

времени

Для изучения влияния различных температурных режимов на возможность выявления ДНК вируса АЧС из проб биоматериала от экспериментально зараженных животных вирусом АЧС отбирали пробы крови, мышечной ткани, шпика, кожи и внутренних органов.

Полученные пробы мяса и шпика подвергали сухой засолке, а так же проводили имитацию условий холодного копчения. Образцы помещали на длительное хранение при температурах: 22^27°С; 4^6°С; минус 18^20°С. Срок наблюдения составлял 9 месяцев. Каждые 14-28 дней пробы исследовали на возможность выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени с использованием внутреннего контроля (табл. 5).

Таблица 5

Результаты выявления ДНК вируса АЧС в пробах, хранившихся при различных

температурах

п=6

Сроки выявления генома вируса АЧС методом ПЦР в

Наименование проб реальном времени при разных температурах хранения

22 -К27°С 4-6°С минус 18- 20°С

Дни исследования

28 56 70 84 90 56 112 214 242 270* 56 112 242 270»

Мясо + + - - - + + + + - + + + +

Мясо (солонина) + + + + - + + + + + + + + +

Шпик + - - - - + + + + - + + + +

Шпик соленый + + + + - + + + + + + + + +

Шпик копченый + + - - - + + + - + + + +

Селезенка + + + - - + + + + + + + + +

Печень + - - - - + + + - - + + + +

Легкое + + + - - + + + + - + + + +

Почка + - - - - + + + - - + + + +

Сердце + + + - - + + + + - + + + +

Лимфоузлы + + + - - + + + + - + + + +

Кровь + + + - - + + + + + + + + +

Примечания: «+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат, *- срок наблюдения

При исследовании образцов, хранившихся при температуре 22^-27 °С, геном вируса АЧС в пробах мяса (солонина) и соленого шпика выявляли на протяжении

84 дней; в пробах легких, сердца, селезенке, лимфоузлах и в крови - на протяжении 70 дней, в пробах мяса и копченого шпика - 56 дней, в пробах шпика, печени и почках - 28 дней.

При хранении вируссодержащего материала при температуре 4^6 °С геном вируса АЧС выявляли на протяжении 270 дней в пробах мяса (солонина), соленого шпика, селезенки и в крови. В пробах легких, шпика, сердца и лимфоузлах - в течение 242 дней, в пробах мяса, копченого шпика, печени и почках - 214 дней.

При хранении вируссодержащего материала при температуре минус 18^-20 °С геном вируса АЧС выявляли на протяжении 270 дней во всех испытуемых пробах (срок исследования). Таким образом, при хранении вируссодержащего материала при температуре минус 18-5-20°С геном вируса АЧС возможно выявлять, по меньшей мере, в течение 9 месяцев.

3.6 Мониторинг африканской чумы свиней В связи с заносом и распространением африканской чумы свиней на территории РФ с 2007 г. в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии проводился лабораторный мониторинг среди домашних и диких свиней.

Наиболее вероятными группами риска по АЧС считали диких и домашних свиней в хозяйствах со свободным выгулом в республиках Северного Кавказа, которые имеют общую границу и тесные экономические и связи с Абхазией, Южной Осетией и Грузией. Таким образом, основной зоной наблюдения стали республики Северного Кавказа (Чечня, Ингушетия, Кабардино-Балкария, Карачаево-Черкесия, Адыгея, Северная Осетия - Алания, Дагестан), Краснодарский и Ставропольский края и области Южного федерального округа (Ростовская, Волгоградская, Астраханская) (табл. 6).

Таблица 6

Результаты мониторинговых исследований на АЧС в РФ в период 2009-2011 гг.

Федеральные Округа Кол-во областей Свиней (всего) В том числе: Положительные

всего В том числе обследовано/ пунктов. домашних диких клещей домашн их диких

Центральный 17 197 25902 21204 4698 2 39 1

Северо-Западный 9 80 2931 1871 1060 5 34 0

Южный и СевероКавказский 14 130 20264 17012 3252 4126 326 129

Приволжский 14 127 8864 7670 1194 33 12 0

Уральский 3 3 20 19 1 0 0 0

Сибирский 12 13 839 825 14 0 0 0

Дальневосточный 7 13 236 218 18 0 0 0

Всего: 76 563 59056 48819 10237 4166 411 130

Всего в период с 2009 по 2011 гг. с использованием тест-систем для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР с электрофоретической детекцией и ПЦР в реальном времени исследовано 59056 проб патологического материала. От домашних свиней 48819 проб, от диких кабанов 10237 проб, а также 4166 проб клещей, отобранных в семи федеральных округах РФ. Всего выявлена 541 положительная проба, из них 411 проб от домашних свиней и 130 проб от диких кабанов. Данные ПЦР подтверждены результатами секвенирования, прямой иммунофлуоресценции и биопробы.

3.7 Мониторинг клещей, обитающих на территории Южного федерального округа С целью определения роли клещей в передаче вируса АЧС в период с 10.05.2010 г. по 18.05.2010 г. был организован сбор клещей на территории Сочинского госзаказника Краснодарского края и на территории республики Абхазия, ранее неблагополучных по АЧС. На территории Сочинского госзаказника было собрано два вида иксодовых клещей, (Ixodes ricinus и Haemaphysalis concina), на территории республики Абхазия было собрано три вида иксодовых клещей (Ixodes ricinus, Haemaphysalis concina и Rhipicephalus sangvineus). Общее количество собранных клещей составило 1395.

В ходе исследования суспензий, приготовленных из 1395 проб иксодовых клещей, методом ПЦР с электрофоретической детекцией и ПЦР в реальном времени с внутренним контрольным образцом геном вируса АЧС не выявили.

3.8 Филогенетический анализ изолятов, выделенных при вспышках африканской чумы свиней в Российской Федерации в 2008-2011 гг.

Для генотипирования и проведения филогенетического анализа изолятов, выделенных при вспышках АЧС в Российской Федерации, было отобрано 7 изолятов вируса АЧС, выделенных от домашних свиней и диких кабанов на территории РФ в 2008-2011 гг.

Генотипирование изолятов вируса АЧС проводили согласно методике, рекомендованной референс-лабораторией в Испании (Вальдеолмос). С этой целью секвенировали С-концевую область гена, кодирующую капсидный белок р72.

Проведенными ранее исследованиями И.М. Калабековым, Д.В. Колбасовым, A.A. Елсуковой и др., 2010, установлено, что изоляты, выделенные на территории РФ, принадлежат ко II генотипу вируса АЧС. К этому же генотипу относятся африканские изоляты (Замбия, Мозамбик, Мадагаскар) и изоляты, выделенные на территории Грузии, Армении и Азербайджана в 2007 г. Кроме того, было показано, что отечественные изоляты не имеют различий по длине фрагментов 4 вариабельных участков генома.

С целью более детального анализа геномов отечественных изолятов был выбран другой участок - ген I196L, который расположен в правой вариабельной области генома вируса АЧС.

В результате амлификации участка гена I196L изоляты, выделенные в разное время в различных регионах РФ (Северная Осетия - Алания - 2008, Ставрополь - 2009, Кабардино - Балкария - 2010, Ростов - 2010, Нижний Новгород - 2011, Ленинград - 2011, Краснодар - 2011), имели одинаковый размер ПЦР-продукта около 500 п.о. (рис. 4).

Рисунок 4. Электрофореграмма результатов амплификации гена 1196Ь.

Треки: М - маркер молекулярного веса; 1- изолят, Северная Осетия - Алания - 2008; 2- изолят, Ставрополь - 2009; 3- изолят, Кабардино-Балкария - 2010; 4- изолят, Ростов -2010; 5- изолят, Нижний Новгород-2011; 6- изолят, Ленинград-2011; 7- изолят, Краснодар - 2011; 8- отрицательный контроль.

Поскольку фрагменты при одинаковой длине могли иметь различный нуклеотидный состав нами было дополнительно проведено секвенирование полученных фрагментов. На основании его результатов показано, что нуклеотидные последовательности гена 1196Ь оказались идентичными для всех анализируемых изолятов, выделенных в разное время в разных субъектах Российской Федерации. Результаты проведенных исследований, основанные на анализе четырех вариабельных участков генома вируса АЧС - В602Ь, КР86Я, В18], •1268Ь [Елсукова А.А., 2010] и гена 1196Ь, свидетельствуют о едином происхождении изолятов, циркулирующих на территории РФ, и отсутствии (в данных участках генома вируса АЧС) каких-либо изменений.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана и оптимизирована методика выявления генома вируса АЧС на основе ПЦР в реальном времени с использованием внутреннего контрольного образца (ВКО), которая позволяет выявлять геном вируса АЧС в объектах ветеринарного надзора (мясо, шпик, клещи, комбикорм) с аналитической чувствительностью 0,5 1£ ГАЕ 50/см3 или 95 копий ДНК на реакцию.

2. Установлена длительная сохраняемость вируса АЧС штамм «Ставрополь 2009» в мясе и шпике: при температуре 22-^27°С в течение 16 дней в титрах 1,5-2,0

ГАЕ 50/см3, при температуре 4-Иэ°С в течение 84 дней в титрах 2,0-2,5 ГАЕ

so/см3 и при температуре минус 18^20°С в течение 118 дней в титрах 2,5-3,0 lg ГАЕ 5о/см3 (срок наблюдения).

3. При исследовании проб крови, мышечной ткани и органов от экспериментально зараженных вирусом АЧС животных, хранящихся при разных температурных режимах, установлено, что метод ПЦР в реальном времени с внутренним контролем позволяет выявлять ДНК вируса АЧС в сроки от 28 до 270 дней в зависимости от температуры хранения проб.

4. В ходе мониторинговых исследований в период 2009-2011 гг. методом стандартной ПЦР и ПЦР в реальном времени исследовано 59056 проб от домашних и диких свиней, при этом в 541 пробе вьивлен геном вируса АЧС. Данные ПЦР подтверждены результатами секвенирования, прямой иммунофлуоресценции и биопробы.

5. При исследовании методом стандартной ПЦР и ПЦР в реальном времени 1395 проб иксодовых клещей трех видов, (Ixodes ricinus, Haemaphysalis concina и Rhipicephalus sangvineus), собранных на территории Краснодарского края и республики Абхазия, геном вируса АЧС не выявлен.

6. С использованием методов ПЦР проведено генотипирование семи изолятов вируса АЧС, выделенных в различных регионах РФ в период 2008-2011 гг. На основании анализа пяти вариабельных участков генома B602L, KP86R, BtSj, J268L и гена I196L вируса АЧС установлено, что все изоляты относятся ко II генотипу вируса АЧС, не имеют каких-либо изменений в данных участках генома, что свидетельствует о едином происхождении изолятов, циркулирующих на территории РФ.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для использования в практике предложены:

1. «Тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени» (зарегистрирована Россельхознадзором 30.08.2010 (ПВР-1-5.0/02619)) используется в региональных ветеринарных диагностических лабораториях.

2. «Методические рекомендации по дифференциации штаммов вируса африканской чумы свиней методом ПЦР», рассмотренные на секции Биотехнологии Отделения ветеринарной медицины РАСХН (29.10.2009) и

утвержденные академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. (24.12.2009 г.), предлагаются в практику в специализированных лабораториях.

3. «Методические положения по выявлению генома вируса АЧС в образцах биологического материала и объектах ветеринарного надзора», рассмотренные на секции Инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН (27.04.2011 г.) и утвержденные академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. (10.11.2011 г.), рекомендуются для использования в ветеринарных лабораториях.

4. «Методические положения по проведению пассивного и активного мониторинга африканской чумы свиней», рассмотренные на секции Инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН (23.09.2011) и утвержденные академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. (10.11.2011 г.), предназначены для сотрудников ветеринарных лабораторий.

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Африканская чума свиней - главная проблема для свиноводства России / В. В. Куриннов, Д. В. Колбасов, С. Ж. Цыбанов [и др.] // Жизнь без опасностей.- 2010.-№3. - С. 82-87.

2. Бакулов, И.А. Африканская чума свиней / И.А. Бакулов. - М.: Колос, 1969.- С. 267-290.

3. Вишняков, И.Ф. Перспективы использования методов анализа генома для диагностики особо опасных болезней животных / С.Ж. Цыбанов., И.Ф. Вишняков // Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России / ВНИИЭВ. - М, 1999.- Т.1. - С. 130-133.

4. Диагностика африканской чумы свиней. I. Реакция гемадсорбции и задержки гемадсорбции при АЧС / И.Ф. Вишняков, Н.И. Митин, А.Н. Курносов. [и др.] // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы научной конференции / ВНИИВВиМ, РАСХН,- Покров, 1992.- 4.1.- С. 57-62.

5. Елсукова A.A. Генотипирование изолятов вируса африканской чумы свиней: канд.биол.наук: 03.02.02 / Елсукова Александра Андреевна.-Покров, 2010.- С. 72-

6. Коваленко, Я. Р. Африканская чума свиней / Я. Р. Коваленко.- М.: Колос, 1965.118 с.

7. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф; Лакин .- М., 1990. - 352 с.

8. Изучение дезинфицирующих свойств препарата А-24 (теотропина) при африканской чуме свиней / С.В. Миколайчук, Э.В. Рудобельский, М.М. Зубаиров, А.Л. Семенихин, А.А. Коломыцев, В.В. Куриннов, В.М. Балышев, Ф.А. Бадаев // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы науч. конф,- Ч.1.- Покров, 1992,- С.71.

9. Сюрин, В.Н. Африканская чума свиней / В.Н. Сюрин //Лабораторная диагностика вирусных болезней животных.- М.: Колос, 1972. - С. 416-417.

10. Выявление вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) / С.Ж Цыбанов, И.Ф. Вишняков, Л.Я. Цыбанова // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: тезисы докл. Всероссийской науч.-практ. конф. / ВНИИЗЖ. - Владимир,- 1995. - С.26-27.

11. Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of african swine fever virus in clinical samples / M. Aguero., J. Fernandez., L. Romero [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2003. -Vol. 41, №9.-P. 4431-4434.

12. Moreno, M. Inhibition of african swine fever virus + replication by phosphonoacetics acid / M. Moreno, A. L. Carrascola // J. Gen. Virol.- 1978.- Vol. 39, № 2,- P. 253-258.

13. Rapid and biologically safe diagnosis of african swine fever virus infection by using polymerase chain reaction / Y. Steiger, M. Ackermann, C. Mettraux [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1992. - Vol. 30, №1. - P. 1-8.

14. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R Boom, С J Sol, M. M.

Salimans [et.al.] // J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol. 28, № 3. - P. 495-503.

15. Эпизоотическая ситуация по АЧС [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fsvps.ru . - загл. с экрана.

7. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Газаев, И.Х. Клещи как переносчики АЧС / И.Х. Газаев // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы

конференции молодых ученых/ ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. - Покров, 2009,- С.23-27.

2. Анализ вариабельного участка генома вируса АЧС (гена KP86R) музейных штаммов и изолятов, полученных на территории РФ/ A.A. Елсукова, А.Г. Шендрик, И.Х. Газаев, И.М. Калабеков, С.Ж. Цыбанов // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Международная научно-практическая конференция, посвященная 40-летию института. - Щелково, 2009,-С. 323-327.

3. Елсукова, A.A. Анализ гипервариабелыюго участка генома вируса АЧС (гена B602L) музейных штаммов и изолятов, полученных на территории РФ/ A.A. Елсукова, И.Х. Газаев // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: конференция молодых ученых / ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. - Покров, 2009. - С. 72-76.

4. Выявление ДНК вируса африканской чумы свиней в продуктах животноводства / И.Х. Газаев, И.П. Синдрякова, A.A. Елсукова, А.Г. Шендрик, С.Ж. Цыбанов // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: II-ая Международная научно-практическая конференция / УГСХА,- Ульяновск, 2010. - С. 23-25.

5. Применение метода ПЦР в режиме реального времени для выявления вируса африканской чумы свиней / И.Х. Газаев, A.A. Елсукова, И.П. Синдрякова, С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов // МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА - 2010: 7 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием.-М.,2010,- С. 83-85.

6. Применение внутреннего контроля к ПЦР тест-системе для обнаружения генома вируса африканской чумы свиней./ И.Х. Газаев, A.C. Малоголовкин, И.П. Синдрякова, А.Г. Шендрик, С.Ж. Цыбанов // МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА - 2010: 7 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием.- М., 2010.- С. 85-88.

7. Филогенетический анализ авирулентных штаммов вируса АЧС, депонированных в музее ГНУ ВНИИВВИМ / A.A. Елсукова, И.Х. Газаев, И.М. Калабеков, С.Ж. Цыбанов. // Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины

продовольственной безопасности российской федерации: Международная научно - практическая конференция / ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.- Покров, 2011.- С. 87-91.

8. Выявление ДНК вируса африканской чумы свиней в клещах / И.П. Синдрякова, И.Х. Газаев, И.М. Калабеков, А.Г. Шендрик, С.Ж. Цыбанов // Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности российской федерации: Международная научно - практическая конференция / ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,- Покров, 2011.- С. 92-94.

9. Конструирование положительного контроля (ПК) к тест - системе для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени. / И.Х. Газаев, A.A. Елсукова, A.C. Малоголовкин, С.Ж. Цыбанов // Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: Международная научно-практическая конференция / УГСХА.- Ульяновск, 2011.- С. 75-77.

10. Сравнительный анализ изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ в 2008-2011 гг. По гену I196L. / A.A. Елсукова, A.C. Малоголовкин, И.Х. Газаев, С.Ж. Цыбанов '// Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: Международная научно-практическая конференция / УГСХА.-Ульяновск, 2011,- С. 88-90.

11. Выявление вируса АЧС в продуктах свиного происхождения / Д.В. Колбасов, С.Ж. Цыбанов, A.C. Малоголовкин, И.Х. Газаев, C.B. Миколайчук Ветеринария,- 2011,- №10,- С. 54-56.

12. Detection of ASFV by nested real-time PCR/ LH. Gazaev, A.A. Elsukova, I.M. Kalabekov, S.J. Tsibanov // 5th Annual meeting Epizone 2011.- P. 45.

13. Identification of ASFV in pork products / LH. Gazaev, A.A. Elsukova, A.S. Malogolovkin, S.J. Tsibanov, D.V. Kolbasov // Workshop on laboratory diagnosis of african and classical swine fever Lipica.- Slovenia, 2011. - P. 6-7.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Газаев, Исмаил Хизирович

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Актуальность темы.

1.2 Степень разработанности проблемы

1.3 Цель и задачи исследований.

1.4 Научная новизна результатов исследований.

1.5 Практическая значимость работы.

1.6 Апробация работы

1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности

1.8 Публикации.

1.9 Объем и структура диссертации.

1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Характеристика вируса АЧС.

2.2 Эпизоотическая ситуация по АЧС в мире и РФ.

2.3 Пути распространения вируса АЧС.

2.4 Сохраняемость вируса АЧС.

2.5 Патогенез и клинические проявления болезни.

2.6 Лабораторная диагностика АЧС.

2.7 Генотипирование вируса АЧС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование методов индикации генома вируса африканской чумы свиней в объектах ветеринарного надзора"

1.1 Актуальность темы

Африканская чума свиней (АЧС) — контагиозная, склонная к природной очаговости, как правило, остро протекающая септическая болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и высокой летальностью, сверхострым, острым, подострым и хроническим течением. Болеют домашние и дикие свиньи независимо от породы и возраста. Выжившие животные пожизненно остаются вирусоносителями [Коваленко Я. Р., 1965; Бакулов И. А., 1969; СюринВ. Н., 1972].

Занос возбудителя АЧС в благополучные страны рассматривается специалистами как социальная и экономическая катастрофа. Это связано с огромным экономическим ущербом, причиняемым эпизоотиями данной болезни. Ученые рассматривают АЧС как угрозу для существования видов семейства Suidae [Бакулов И. А., 1969; Moreno М., 1978].

Долгое время считалось, что АЧС, как нозологическая форма болезни, присуща только странам Африки. Однако с появлением африканской чумы свиней в странах Европы - Португалии и Испании в 1957 и 1960 гг. - к этой проблеме было приковано внимание многих стран Европы и Америки.

В официальных средствах массовой информации весной 2007 г. появились сведения о массовой гибели домашних свиней в Грузии. 7 июня 2007 г. референс - лаборатория МЭБ (Пирбрайт, Великобритания) поставила диагноз - АЧС. В результате последующих мониторинговых исследований, проведенных в 2007-2008 гг. на территории Чеченской республики РФ, в 21 случае выделен вирус АЧС от павших и отстрелянных диких свиней. Во второй половине 2008 г. развитие эпизоотического процесса АЧС характеризовалось новым этапом - заносом вируса АЧС на территорию Республики Северная Осетия - Алания и вовлечению в эпизоотическую цепь домашних свиней [Куриннов В. В., 2010].

В последующие годы вспышки болезни регистрировали еще в 17 субъектах Российской Федерации: республиках Кабардино-Балкария, Калмыкия, Дагестан, Ингушетия, Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской, Волгоградской, Астраханской, Ленинградской, Нижегородской, Оренбургской, Архангельской, Мурманской, Тверской, Курской и Воронежской областях [http://www.fsvps.ru].

При анализе путей заноса вируса АЧС в благополучные регионы установлено, что основными путями и факторами передачи вируса АЧС являются контаминированные пищевые отходы и мясопродукты от инфицированных свиней.

Мясо и мясопродукты, как правило, поступают на реализацию в замороженном или охлажденном виде, и если животное было убито в инкубационный период болезни, то вирус АЧС может сохраняться в мясопродуктах длительное время и представлять большую опасность в распространении болезни.

В диагностике инфекционных болезней животных на сегодняшний день нашли широкое применение серологические методы (ИФА, РПИФ) и методы на основе анализа генома (ПЦР с электрофоретичекой детекцией, ПЦР в реальном времени), поскольку они позволяют анализировать в краткие сроки одновременно большое количество проб и применять приборные методы учета реакции [Вишняков И.Ф., 1992; Цыбанов С.Ж., 1995; Agüero М., 2003].

ПЦР с электрофоретической детекцией является практичным, чувствительным и специфичным методом для выявления генома вируса АЧС в крови и органах. Но недостатком ее применения в диагностике является возможность контаминации продуктами реакции и возникновение вследствие этого ложноположительных результатов. Также из-за наличия ингибиторов в пробах некоторых объектов ветеринарного надзора, при проведении полимеразной цепной реакции можно получить ложноотрицательные результаты [Agüero М., 2003].

Проведение соответствующих мероприятий по ликвидации очагов болезни в наиболее сжатые сроки возможно только при своевременной постановке диагноза и контроле продуктов свиноводства, которые могут содержать вирус АЧС и транспортироваться на различные расстояния, в том числе и для торговли. Это обуславливает необходимость разработки и внедрения в ветеринарную практику новых высокочувствительных и специфичных методов индикации вируса африканской чумы свиней, как в пробах органов инфицированных животных, так и в объектах ветеринарного надзора.

Поэтому актуальной задачей является разработка и усовершенствование методов индикации генома вируса АЧС в объектах ветеринарного надзора и внедрение их в практику исследований, а так же изучение сохраняемости вируса АЧС во внешней среде и продуктах животного происхождения.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Газаев, Исмаил Хизирович

6. выводы

1. Разработана и оптимизирована методика выявления генома вируса АЧС на основе ПЦР в реальном времени с использованием внутреннего контрольного образца (ВКО), которая позволяет выявлять геном вируса АЧС в объектах ветеринарного надзора (мясо, шпик, клещи, комбикорм) с аналитической чувствительностью 0,5 lg ГАЕ 50/см или 95 копий ДНК на реакцию.

2. Установлена длительная сохраняемость вируса АЧС штамм «Ставрополь 2009» в мясе и шпике: при температуре 22+27°С в течение 16 дней в титрах 1,5-2,0 lg ГАЕ 50/см3, при температуре 4+6°С в течение 84 дней в титрах 2,0-2,5 lg ГАЕ 50/см3 и при температуре минус 18-К20°С в о течение 118 дней в титрах 2,5-3,0 lg ГАЕ 50/см (срок наблюдения).

3. При исследовании проб крови, мышечной ткани и органов от экспериментально зараженных вирусом АЧС животных, хранящихся при разных температурных режимах, установлено, что метод ПЦР в реальном времени с внутренним контролем позволяет выявлять ДНК вируса АЧС в сроки от 28 до 270 дней в зависимости от температуры хранения проб.

4. В ходе мониторинговых исследований в период 2009-2011 гг. методом стандартной ПЦР и ПЦР в реальном времени исследовано 59056 проб от домашних и диких свиней, при этом в 541 пробе выявлен геном вируса АЧС. Данные ПЦР подтверждены результатами секвенирования, прямой иммунофлуоресценции и биопробы.

5. При исследовании методом стандартной ПЦР и ПЦР в реальном времени 1395 проб иксодовых клещей трех видов, {Ixodes ricinus, Haemaphysalis concina и Rhipicephalus sanguineus), собранных на территории Краснодарского края и республики Абхазия, геном вируса АЧС не выявлен.

6. С использованием методов ПЦР проведено генотипирование семи изолятов вируса АЧС, выделенных в различных регионах РФ в период

2008-2011 гг. На основании анализа пяти вариабельных участков генома В602Ь, КР86Я, 1268Ь и гена 1196Ь вируса АЧС установлено, что все изоляты относятся ко II генотипу вируса АЧС, не имеют каких-либо изменений в данных участках генома, что свидетельствует о едином происхождении изолятов, циркулирующих на территории РФ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны, утверждены и рекомендуются в практику научно-исследовательских и диагностических учреждений следующие разработанные методики:

1. «Тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени» (зарегистрирована Россельхознадзором 30.08.2010 (ПВР-1-5.0/02619)) используется в региональных ветеринарных диагностических лабораториях.

2. «Методические рекомендации по дифференциации штаммов вируса африканской чумы свиней методом ПЦР», рассмотренные на секции Биотехнологии Отделения ветеринарной медицины РАСХН (29.10.2009) и утвержденные академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. (24.12.2009 г.) предлагаются в практику в специализированных лабораториях.

3. «Методические положения по выявлению генома вируса АЧС в образцах биологического материала и объектах ветеринарного надзора» рассмотренные на секции Инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН (27.04.2011) и утвержденные академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. (10.11.2011 г.) рекомендуются для использования в ветеринарных лабораториях.

4. «Методические положения по проведению пассивного и активного мониторинга африканской чумы свиней» рассмотренные на секции Инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН (23.09.2011) и утвержденные академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. (10.11.2011 г.) предназначены для сотрудников ветеринарных лабораторий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Газаев, Исмаил Хизирович, Покров

1. Африканская чума свиней / И. Болоцкий, А. Васильев, В. Семенцов, С. Пруцаков // Свиноферма. 2008. № 9. - С. 43-46.

2. Африканская чума свиней главная проблема для свиноводства России / В. В. Куриннов, Д. В. Колбасов, С. Ж. Цыбанов и др. // Жизнь без опасностей. - 2010. - №3. - С. 82-87.

3. Бакулов, И.А. Африканская чума свиней / И.А. Бакулов. М.: Колос, 1969. - С. 267-290.

4. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. М.: ВНИТИБП, 1998. - 928 с.

5. Вишняков, И.Ф. Диагностика африканской чумы свиней. IV Метод иммуноферментного анализа / И.Ф. Вишняков, Л.Я. Цыбанова, Г.М.

6. Карпов // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы научной конференции / ВНИИВВиМ, РАСХН-Покров, 1992. 4.1. - С. 68-70.

7. Вишняков, И.Ф. Перспективы использования методов анализа генома для диагностики особо опасных болезней животных / И.Ф. Вишняков, С.Ж. Цыбанов // Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России / ВНИИЭВ. М., 1999. -Т.1. - С. 130-133.

8. Диагностика африканской чумы свиней реакцией гемадсорбции в культурах лейкоцитов / H.H. Крюков, В.Н. Сюрин, 3.JI. Зорина, Б.Р. Сурин //Ветеринария. 1965. - № 10. - С. 19-22.

9. Елсукова A.A. Генотипирование изолятов вируса африканской чумы свиней: канд.биол.наук: 03.02.02 / Елсукова Александра Андреевна. -Покров, 2010. С. 72-96

10. Иванов, A.B. Инфекционные болезни свиней. М., 2006. - С. 5-8.

11. Катастрофа для свиноводческой отрасли // Ветеринария сельскохозяйственных животных. М. - 2009. -№3. -С. 2-5.

12. Коваленко, Я. Р. Африканская чума свиней / Я. Р. Коваленко. М.: Колос, 1965.- 118 с.

13. Коваленко, Я. Р. Африканская чума свиней / Я. Р. Коваленко. М.: Колос, 1972. - 200 с.

14. Козлова, Д.И. Современные проблемы африканской чумы свиней / Д.И. Козлова, В.А. Бесхлебнов. М.: ВНИИТЭИС, 1980. - 57 с.

15. Колонцов A.A. Иммунные реакции и механизмы при заражении африканской чумой свиней / A.A. Колонцов, В.В. Макаров // Сельскохозяйственная биология. Сер. Биология животных. -1993. -№ 4. -С. 12-19.

16. Колонцов, A.A. Вирус африканской чумы свиней: достижения последнего десятилетия 20 века / A.A. Колонцов // Молекул, генетика, микробиология и вирусология. 2001. - № 2. - С. 3-8.

17. Колонцов, A.A. Полипептиды вируса африканской чумы свиней / A.A. Колонцов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -1990.-№ 6. -С. 3-7.

18. Колонцов, A.A. Полипептиды р14 и р 31 вируса африканской чумы свиней ранние белки, локализованные на мембране инфицированной клетки / A.A. Колонцов, A.B. Устин, Н.Г. Шубина // Вопросы вирусологии. -1992. -№3. - С.165-168.

19. Кузнецов, В.А. Технология переработки мяса и других продуктов убоя животных / В.А. Кузнецов, Я.П. Шлипаков. М. -1971. -С.91-98.

20. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М, 1990. - 352 с.

21. Ликвидация африканской чумы свиней в Республике Абхазия / В. Н. Герасимов, С. А. Кукушкин, А. В. Мищенко и др. // Ветеринария. 2008. - № 3. - С. 19-24.

22. Макаров, В.В. Реакции вируса африканской чумы свиней с антителами и причины отсутствия нейтрализации / В.В. Макаров, М.С. Малахова, H.A. Власов // Доклады ВАСХНИЛ. 1991. - №12. - С.27-31.

23. Малоголовкин, A.C. Биологические и генетические характеристики цирковирусов свиней: дис. канд.биол.наук: 03.00.06/03.00.23 / Малоголовкин Александр Сергеевич. -Покров,2009. С. 68 - 71.

24. Руководство по индикации особо опасных болезней сельскохозяйственных животных в объектах ветеринарного надзора и окружающей среды / H.A. Лагуткин, В.Н. Смирнов, В.В. Куриннов, С.Ж. Цыбанов и др. / ВНИИВВиМ, РАСХН. М.: 2000. - 75 с.

25. Самуйленко, А .Я. Инфекционная патология животных. В 2 т./ под ред. А.Я. Самуйленко и др.. М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. -Т. 1. - 910 с.

26. Селянинов, Ю.О. Вирус африканской чумы свиней: физическое картирование генома штаммов / Ю.О. Селянинов, В.М. Балышев, С.Ж. Цыбанов // Вестник РАСХН. 2000. - № 5. - С.75-77.

27. Селянинов, Ю.О. Физическое картирование генома вируса африканской чумы свиней / Ю.О. Селянинов, Е.К. Сенечкина // Доклады РАСХН. 1995. - № 2. -С.37-39.

28. Середа, А.Д. Идентификация изолятоспецифического гликополипептида вируса африканской чумы свиней / А.Д. Середа, В.В. Макаров // Ветеринария. -1992. -№1. -С.22-24.

29. Сюрин, В.Н. Африканская чума свиней // Лабораторная диагностика вирусных болезней животных. М.: Колос, 1972. - 416 с.

30. Филогенетический анализ полевых изолятов вируса африканской чумы свиней / И.М. Калабеков, К. Галлардо, А.А. Елсукова и др. // Ветеринария. -2010. №5. - С.31-33.

31. Юбхашини, Э. Африканская чума свиней в республике Маврикий / Э. Юбхашини // Ветеринарный консультант. 2008. - №22. -С. 10-12.

32. A BIR motif containing gene of african swine fever virus, 4CL, is nonessential for growth in vitro and viral virulence / J.G. Neilan Z. Lu, G.F. Kutish et al. // Virology. 1997. - Vol. 230, № 2. - P.252-264.

33. A conserved african swine fever virus I kappa В homolog, 5EL, is nonessential for growth in vitro and virulence in domestic swine / J.G. Neilan, Z. Lu, G.F. Kutish et al. // Virology. 1997. - Vol. 235, № 2. - P.377-385.

34. A conserved african swine fever virus right variable region gene, II1L, is non-essential for growth in vitro and virulence in domestic swine / S.B.

35. Kleiboeker, G.F. Kutish, J.G. Neilan et al. // J. Gen. Virol. 1998. - Vol. 79, №5.-P.l 189-1195.

36. A nonessential african swine fever virus gene UK is a significant virulence determinant in domestic swine // Zsak L., Caler E., Lu Z. et al. // J. Virol. -1998. Vol. 72, № 2. - P. 1028-1035.

37. A reliable enzyme linked immunosorbent assay for african swine fever using the major structural protein as antigenic reagent / E. Tabares, M. Fernandez, E. Salvador-Temprano et al. // Arch. Virol. 1981. - Vol. 70. -P.297-300.

38. A set of African swine fever virus tandem repeats shares similarities with Sar-like sequences / F. Almazan, J.R. Murguia, J.M. Rodriguez et al. // J. Gen. Virol. 1995. - Vol. 36. - P. 729-740.

39. A solid-phase enzyme linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies, for the detection of african swine fever virus antigens and antibodies / M.I. Vidal, M. Stiene, J. Henkel et al. // J. Virol. Methods. 1997. - Vol. 66, №2.-P. 211-218.

40. A structural DNA binding protein of african swine fever virus with similarity to bacterial histone-like proteins / M.V. Borca, P.M. Irusta, G.F. Kutish et al. // Arch. Virol. 1996. - Vol. 141, № 2. - P. 301-313.

41. African swine fever / M. Agüero, R. Blasco, P. Wilkinson, E. Vinuela // Virology. 1990. - Vol.176. - P. - 195-204.

42. African swine fever diagnosis. Role of the new tests / M. Arias, M. Pastor, J.M. Escribano et al. // Proc. Workshop Coordinat. Agricult. Res. Lisbon, 1993. - P.185-189.

43. African swine fever virus DNA: deletions and additions during adaptation to growth in monkey kidney cells / E.Tabare's, I. Olivares, G. Santurde, M. J. Garcia, E. Martin, M. E. Carnero // Arch. Virol. 1987. - Vol. 97. - P. 333-346.

44. African swine fever virus encodes two genes which share significant homology with the two largest subunits of DNA-dependent RNA polymerases /

45. RJ. Yanez, M. Boursnell, M.L. Nogal et al. // Nucleic Acids Res. 1993. -Vol. 21, №10. - P. 2423-2427.

46. African swine fever virus gene jl3L encodes a 25-27 k Da virion protein with variable numbers of amino acid repeats / H. Sun, S.C. Jacobs, G.L. Smith et al. // J. Gen. Virol. 1995. - Vol. 76, № 5. - P. 1117-1127.

47. African swine fever virus infection in the argasid host, Ornithodoros porcinus porcinus / S.B. Kleiboeker, T.G. Burrage, G.A. Scoles et al. // J. Virol. 1998. - Vol. 72, № 3. - P. 1711 -1724.

48. African swine fever virus replication in the midgut epithelium is required for infection of Ornithodoros ticks / S.B. Kleiboeker, G.A. Scoles, T.G. Burrage et al. // J. Virol. 1999. - Vol. 73, № 10. - P. 8587-8598.

49. Amino acid sequence and structural properties of protein pl2, an african swine fever virus attachment protein / A. Alcami, A. Angulo, G. Lopez-Otin et al. // J. Virol. 1992. - Vol. 66. - P.60 - 68.

50. Amino acid tandem repeats within a late viral gene define the central variable region of African swine fever virus / P.M. Irusta, M.V. Borca, G.F. Kutish et al. // J. Virology. 1996- Vol. 220. - P. 20-27.

51. An african swine fever virus ERV1-ALR homologue, 9GL, affects virion maturation and viral growth in macrophages and viral virulence in swine / T. Lewis, L. Zsak, T.G. Burrage et al. // J. Virol. 2000. - Vol. 74, № 3. -P.1275-1285.

52. An african swine fever virus gene with similarity to the proto-oncogene bcl-2 and the Epstein-Barr virus gene BHRF1 / J.G. Neilan, Z. Lu, C.L. Afonso et al. // J. Virol. 1993. - Vol. 67. - P. 4391-4394.

53. An african swine fever virus gene with similarity to the T-lymphocyte surface antigen CD2 mediates hemadsorption / M.V. Borca, G.F. Kutish, C.L. Afonso et al. // Virology. 1994. - Vol. 199, № 2. - P.463-468.

54. An african swine fever virus virulence-associated gene NL-S with similarity to the herpes simplex virus ICP34.5 gene / L. Zsak, Z. Lu, G.F. Kutish et al. // J. Virol. 1996. - Vol. 70, № 12. - P. 8865-8871.

55. Analysis of the complete nucleotide sequence of african swine fever virus / R.J. Yanez, J.M. Rodriguez, M.L. Nogal et al. // Virology. 1995. - Vol. 208, № 1. - P.249-278.

56. Anon, F. African swine fever // Rep. Comm. dis. 81th Meeting of USA UA Minneapolis. Minn. 1977. - №18. - P. 21.

57. Anon, F. Fiebre porcine africane en Cuba. // Rep. Comm. Habana. -1971.- P.40-42.

58. Anon, F. Rapport sur la peste porcine africane en Espagne. Madrid, 1978.

59. Apoptosis: a mechanism of cell killing and lymphoid organ impairment during acute african swine fever virus infection / F. Ramiro-Ibanez, A. Ortega, A. Brun et al. // J. Gen. Virol. 1996. - Vol. 77, № 9. - P. 2209-2219.

60. Asfarviridae. Virus Taxonomy / L. K. Dixon, J. M. Escribano, C. Martins, D. L. Rock et al. // Eighth Report of the ICTV, 2005. P. 135-143.

61. Bellani, L. Nouva fase della lotta contro la Peste suina Africana / L. Bellani // Zooprofilassi. 1967. Vol. 26, N 5- 6. P. 274-277.

62. Black, D.N. Purification and physicochemical characteristics of african swine fever virus // J. Gen. Virol. 1976. - Vol. 32. - P. 509-518.

63. Boldrini, G. La peste suina africana in Europa. Una situazione di emergenza che si aggrava / G. Boldrini, // Vet. Ital. 1967. Vol. 18, № 3-4. - P. 238-261.

64. Boinas, F.S. Transmission of african swine fever virus / African swine fever / F.S. Boinas // Proc. Workshop Coordinat. Agricult. Res. 1993. - P. 211222.

65. Caballero, R.G. Application of pRPEL2 plasmid to detect african swine fever virus by DNA-DNA hybridization / R.G. Caballero, E. Tabares // Arch. Virol. 1986. - № 87. - P. 119-125.

66. Camacho, A. Protein p22 of african swine fever virus: an early structural protein that is incorporated into the membrane of infected cells / A. Camacho, E. Vinuela // Virology. 1991. - № 181.-P. 251-257.

67. Castagnoli, B. Rilivi sul facolaio di peste suina africana verifi-catosi nella provincia di Bolzano / B. Castagnoli // Att. Soc. Ital. Sci. Vet. - 1971. - Vol. 28.-P. 510-513.

68. Characterization and molecular basis of heterogeneity of the African swine fever virus envelope protein p54 / F. Rodriguez , C. Alcaraz, A. Eiras, R.J. Yanez et al. // J. Virol. 1994- Vol. 68. - P. 7244-7252.

69. Characterization of p30, a highly antigenic membrane and secreted protein of african swine fever virus / C.L. Afonso, C. Alcaraz, A. Brun et al. // Virology. 1992. - Vol. 189, № 1. - P.368-373.

70. Characterization of pathogenic and non-pathogenic african swine fever virus isolates from Ornithodoros erraticus inhabiting pig premises in Portugal / F.S. Boinas, G.H. Hutchings, L.K. Dixon et al. // J. Gen. Virol. 2004. - № 85. - P. 77-87.

71. Co-circulation of two genetically distinct viruses in an outbreak of African swine fever in Mozambique: no evidence for individual co-infection / A.D. Bastos, M.L. Penrith, F.Macome et al. // Vet. Microbiol. 2004. - Vol. 103, № 3-4.- P. 169-182.

72. Costa, J. V. African swine fever virus, Molecular biology of iridoviruses / J. V. Costa // Kluwer Academic Publishers. Norwell, Mass, 1990. - P. 247270.

73. De Boer, C.J. Immunology of african swine fever / C.J. De Boer, J.C. Pan, W.R. Hess // J. Amer. Vet. Med. Ass. 1972. - Vol. 160, № 4. - P. 528-532.

74. De Tray, D.E. African swine fever / D.E. De Tray // Advances in Veterinary Science. -1963. № 8. - P. 299-333.

75. Deletion of a CD2-like gene, 8-DR, from african swine fever virus affects viral infection in domestic swine / M.V. Borca, C. Carrillo, L. Zsak et al. // J. Virol. 1998. - Vol. 72, № 4. - P.81-89.

76. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5' to 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase / P. Holland, R. Abramson, R. Watson et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - № 88. -P. 7276-7280.

77. Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification control for the detection of african swine fever virus / D.P. King, S.M. Reid, G.H. Hutchings et al. // J. Virol. Methods. 2003. - Vol. 107, № 1. - P.53-61.

78. Dixon, L.K. The structure and function of the african swine fever genome / L.K. Dixon // Rev. Sci. tech. Off. int. Epiz. 1986. - Vol. 5, № 2. - P. 469-475.

79. Donaldson, A.I. The survival of some air borne animal viruses in relation to relative 82 humidity / A.I. Donaldson, N.P. Ferris // Veterinary Microbiology.- 1976. №1. P.413-420.

80. De Kock, G. Swine fever in South Africa / G. De Kock, E. M. Robinson, J. Keppel // Onderstepoort J. Vet. Sci. Ind. 1940. - Vol. 14, N 1-2. - P. 31-93.

81. Enjuanes, L. Isolation and properties of the DNA of african swine fever virus / L. Enjuanes, A.L. Carrascosa, E. Vinuela // J. Gen. Virol. 1976. - № 32.- P. 479-492.

82. Family Asfarviridae / L.K. Dixon, J.V. Costa, J.M. Escribano, D.L. Rock, E. Vinuela, P.J. Wilkinson et al. // Virus taxonomy: Seventh Report of the1.ternational Committee on Taxonomy of Viruses. Summers Academic Press, San Diego, 2000. P. 159-165.

83. General morphology and capsid fine structure of african swine fever virus particles // J.L. Carrascosa, J.M. Carazo, A.L. Carrascosa et al. // Virology. -1984.-Vol. 132.-P. 160-172.

84. Genetic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa / C.I. Boshoff,A.D. Bastos, L.J. Gerber, W.Vosloo // Vet Microbiol. 2007. - Vol. 121 - P.45-55.

85. Genotyping field strains of african swine fever virus by partial p72 gene characterization / A.D. Bastos, M.L. Penrith, C. Cruciere et al. // Arch Virol. -2003. Vol. 148, № 4. - P.693-706.

86. Gierloff, B. Europaeisk og afrikansk swine pest / B. Gierloff // Nord. Vet. Med. 1963. - Vol. 15, № 5. - P. 365-394.

87. Greig, A. The localization of african swine fever virus in the tick Ornithodoros moubata porcinus / A. Greig // Arch. ges. Virusforsch. 1972. -Vol. 39, № 1 -3.-P. 240-247.

88. Hairpin loop structure of african swine fever virus DNA / A. Gonzalez, A. Talavera, J.M. Almendral et al. // Nucleic Acids Res. 1986 - № 14. - P. 68356844.

89. Hammond, R. Arecent case of african swine fever in Kenya, East Africa / R. Hammond, D. E. De Tray // J. Amer. vet. Med. Assoc. 1955. - Vol. 126- P. 389-391.

90. Heuschule, W.P. Isolation of african swine fever from a giant forest hog / W.P. Heuschule, L. Coggins // Bull. epiz. diseases Afr. 1965. - Vol. 13, № 3. -P. 255-262.

91. Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of african swine fever virus in clinical samples / M. Aguero, J. Fernandez, L.Romero et al. // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41, № 9. - P. 4431-4434.

92. Intra-genotypic resolution of African swine fever viruses from an East African domestic pig cycle: a combined p72-CVR approach / B.A. Lubisi, A.D. Bastos, R.M. Dwarka, W. Vosloo // Virus Genes. 2007. - Vol. 35, № 3. - P. -729-735.

93. Kinetics of African swine fever virus infection in Ornithodoros erraticus ticks / P. Afonso, J. Rebecca, L. K. Dixon // Journal of General Virology. -2006.-P.-63-71.

94. Kleiboeker, S.B. Pathogenesis of african swine fever virus in Ornithodoros ticks / S.B. Kleiboeker, G.A. Scoles // Anim. Health Res. Rev. 2001. - № 2. -P. 121-128.

95. Lucas, A. Classification of african swine fever virus / A. Lucas, R. Carnero, M. Bresso / C. R. Acad. Sci. 1968. - Vol. 266, № 17. - P. 1800-1801.

96. MacDiarmid, S.C. The importation into New Zealand of meat and meat products: A review of the risks to animal health / S.C. MacDiarmid// FAO Animal Health, Manual. 1991. -№11.- P. 37-40.

97. Manual of standards for diagnostic tests and vaccines, 4th edition / OIE. 2000. 590 p.

98. Mapping and sequence of the gene coding for protein p72, the major capsid protein of african swine fever virus / C. Lopez-Otin, J.M. Freije, F. Parra et al. // Virology. 1990. - Vol. 175. - P. 477-484.

99. Mapping and sequence of the gene encoding protein pi7, a major african swine fever virus structural protein / C. Simon-Mateo, J.M. Freije, G. Andres et al. // Virology. 1995. - Vol. 206. - P. 1140-1144.

100. Maurer, F. Pathology of african swine fever-comparison with Hog cholera / F. Maurer, R. J. Griesemer, T. Jones. Amer. J. Vet. Res. 1958. - Vol. 19, № 72. -P. 517-539.

101. McDaniel, H. A. African swine fever / H. A. McDaniel // In Diseases of Swine, 5th edition, Iowa State University Press, Ames, 1980. P. 300-308.

102. Molecular epidemiology of African swine fever in East Africa / B.A. Lubisi, A.D. Bastos, R.M. Dwarka, W. Vosloo // Arch.Virol. -2005. Vol. 150. -P. 2439-2452.

103. Montgomery, R.E. On a form of swine fever occurring in British East Africa (Kenya Colony) / R.E. Montgomery // J. Comp. Pathol. 1921. - Vol. 34. -P. 159-191.

104. Moreno, M. Inhibition of african swine fever virus + replication by phosphonoacetics acid / M. Moreno, A. L. Carrascola // J. gen. Virol. 1978. -Vol. 39, № 2. - P. 253-258.

105. Morrison, T.B. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification / T.B. Morrison, J.J. Weis, C.T. Wittwer // BioTechniques. 1998. - № 24. - P.954-958.

106. Nucleotide sequence and variability of the inverted terminal repetitions of african swine fever virus DNA / I. De la Vega, A. Gonzalez, R. Blasco et al. // Virology. 1994. - Vol. 201, № 1. - P. 152-156.

107. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization / K.J. Livak, S.J. Flood, J. Marmaro et al. // PCR Methods Appl. 1995. -№4. -P.357-362.

108. Ortin, J. Cross-links in the DNA of african swine fever virus / J. Ortin, L. Enjuanes, E. Vinuela // J. Virol. 1979. - № 31. - P.579-583.

109. Oura, C.A. African swine fever: a disease characterized by apoptosis / C.A. Oura, P.P. Powell, R.M. Parkhouse // J. Gen. Virol. 1998. - Vol. 79, № 6. - P. 1427-1438.

110. Pan, I.C. African swine fever: application of immunoelectroosmophoresis for the detection of antibody / I.C. Pan, C.J. De Boer, W.R. Hess // Can. J. Comp. Med. 1972. - Vol. 36. - P. 309-316.

111. Phologane, S.B. Intra- and inter-genotypic size variation in the central variable region of the 9RL open reading frame of diverse African swine fever viruses / S.B. Phologane, A.D. Bastos, M.L. Penrith // Virus Genes. 2005. -Vol. 31, №3.-P. 357-360.

112. Pierce, M.A. Distribution and ecology of Ornithodoros moubataporcinus Walton (Acarina) in animal burrows in East Africa / M.A. Pierce // Bull. Entomol. Res. 1974. - Vol. 64. - P. 605-619.

113. Pini, A. African swine fever; an epizootiological review with special reference to the South African situation / A. Pini, D. Hurter // J. S. Afr. vet. Assn. 1975. - Vol. 46, № 3. - P. 227-232.

114. Plowright, W. Evidence for the type of nucleic acid in african swine fever virus / W. Plowright, F. Brown, J. Parker // Arch. ges. Virusforsch. 1966. -Vol. 19, №3.-P. 289-304.

115. Plowright, W. The stability of african swine fever virus with particular reference to heat and pH inactivation / W. Plowright, J. Parker // Arch. ges. Virusforsch. 1967. - Vol. 21, № 3/4, - P. 382-402.

116. Plowright, W. Vector transmission of african swine fever virus / W. Plowright // Hog cholera, classical swine fever and african swine fever / Commission of the European Communities. EUR 5904 EN. 1977. - P. 575587.

117. Proteins specified by African swine fever virus. II. Analysis of proteins in infected cells and antigenic properties / E. Tabarés, J. Martinez, F. Ruiz Gonzalvo, C. Sánchez-Botija // Arch Virol. 1980. - Vol.66, № 2. - P. 119-132.

118. Rapid and biologically safe diagnosis of african swine fever virus infection by using polymerase chain reaction / Y. Steiger, M. Ackermann, C. Mettraux et al. // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30, №1. - P. 1-8.

119. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom, C. J. Sol, M. M. Salimans et.al. // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28, № 3. - P. 495-503.

120. Read, S.J. Lightcycler multiplex PCR for the laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system / S.J. Read, J.L. Mitchell, C.G. Fink // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 3056-3059.

121. Rennie, L. Effects of infection of the tick Ornithodoros moubata with african swine fever virus / L. Rennie, P.J. Wilkinson, P.S. Mellor // Med. Vet. Entomol. 2000. - Vol. 14, №4. - P. 355-360.

122. Rennie, L. Transovarial transmission of african swine fever virus in the argasid tick Ornithodoros moubata / L. Rennie, P.J. Wilkinson, P.S. Mellor // Med. Vet. Entomol. 2001. - Vol. 15, № 2. - P. 140-146.

123. Salas, M. African swine fever virus (Asfarviridae) / M. Salas // Encyclopedia of Virology, 2-nd edn. Vol. 1. 1999. - P. 30-38.

124. Sanchez-Botija, C. Estudio sobre la peste porcina africana en España / C. Sanchez-Botija //Bull. off. internal epiz. 1962. - Vol. 58. - P. 707-727.

125. Sanchez-Botija, C. La peste porcine africaine en Espagne / C. Sanchez-Botija // Bull. off. internat. epiz. 1961. - Vol. 56, № 1-2. - P. 148-175.

126. Sanchez-Botija, C. Laboratory manual for diagnosis on african swine fever / C. Sanchez-Botija, A. Ordas. Madrid, 1977. - P. 133-136.

127. Sanchez-Vizcaino, J.M. African swine fever diagnosis / J.M. Sanchez-Vizcaino // African Swine Fever / Becker Y. (ed.). Boston: Martinus Nijhoff, USA, 1987.-P. 63-71.

128. Serological and immunohistochemical study of african swine fever in wild boar in Spain / J. Perez, A.I. Fernandez, M.A. Sierra et al. // Vet.Rec. 1998. -Vol.143, № 5.-P.136-139.

129. Smith, J. The United States Department of agriculture emergency animal disease prepareones program / J. Smith // Wildlife dis. 1976. - P. 115-120.

130. Terminal and internal inverted repetitions in african swine fever virus DNA / J.M. Sogo, J.M. Almendral, A. Talavera et al. // Virology. 1984. - Vol. 133. -P. 271-275.

131. Terpstra, C. Differential diagnosis between african swine fever and hog cholera / C. Terpstra // African Swine Fever / Becker Y. (Ed.). Boston; Dordrecht: Martinus Nijhoff Publ. - 1987. - P. 73-80.

132. Terpstra, C. Laboratory diagnostics of african swine fever in ASF-free and ASF-endemic countries / C. Terpstra // African swine fever / Galo A. (Ed.), Proc. Workshop for coordination of agricultural research. Lisbon, 1993. - P. 161-167.

133. The african swine fever virus thymidine kinase gene is required for efficient replication in swine macrophages and for virulence in swine / D.M. Moore, L. Zsak, J.G. Neilan et al. // J. Virol. 1998. - Vol. 72, № 12. -P.10310-10315.

134. The morfological characteristics of african swine fever virus and its resemblance to tipula iridescent vims / J.D. Almeida, D. June, A. P. Waterson, W. Plowright // Arch. Ges. Virusforsch. 1967. Vol. 20, № 3. - P. 392-396.

135. Thomson, G.R. The epidemiology of african swine fever: the role of free-living hosts in Africa / G.R. Thomson // Onderstepoort J. Vet. Res. 1985. -Vol. 52.-P. 201-209.

136. Two putative african swine fever virus helicases similar to yeast 'DEAH' pre-mRNA processing proteins and vaccinia virus AT Pases D11L and D6R / RJ.Yanez, J.M. Rodriguez, M. Boursnell et al. // Gene. 1993. - Vol. 134, № 2. - P.161-174.

137. Variable and constant regions in african swine fever virus DNA / R.Blasco, M. Aguero, J.M. Almendral et al. // Virology. -1989. № 168. - P. 330-338.

138. Variable regions on the genome of Malawi isolates of African swine fever virus / K.J. Sumption, G.H. Hutchings, P.J. Wilkinson, L.K. Dixon // J. Gen. Virol. 1990. -Vol. - 71. - P. 2331-2340.

139. Wesley, R.D. Genome relatedness among african swine fever virus isolates by restriction endonuclease analysis / R.D. Wesley, A.E. Tuthill // Prev. Vet. Med. 1984. - № 2. - P. 53-62.

140. Wilkinson, P.J. Transmission of the african swine fever virus / P.J. Wilkinson // Prev. Vet. Med. 1984. - № 2. - P. 71.

141. Yanez, R.J. African swine fever virus encodes a DNA ligase / R.J. Yanez, E. Vinuela//Virology. 1993. - Vol.193, № 1. - P.531-536.

142. Zsak, L. Preclinical Diagnosis of African Swine Fever in Contact-Exposed Swine by a Real-Time PCR Assay / L. Zsak, M. Borca // journal of clinical microbiology. 2005. - P. 112-119.

143. Эпизоотическая ситуация по АЧС электронный ресурс. Режим доступа: http://www.fsvps.ru . - загл. с экрана.