Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генотипирование вируса африканской чумы лошадей различных серотипов

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Генотипирование вируса африканской чумы лошадей различных серотипов"

На правах рукописи

Титов Илья Андреевич

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ ЛОШАДЕЙ РАЗЛИЧНЫХ СЕРОТИПОВ

03.02.02 Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 г СЕН 2013

005532879

Покров-2013

005532879

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМРоссельхозакадемии).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор,

зав. лаборатории Биофизики

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Цыбанов Содном Жамьянович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

зав. лаборатории Биотехнологии

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Юрков Сергей Григорьевич

доктор ветеринарных наук, профессор,

зам. директора ФГУ ЦНМВЛ Белоусов Василий Иванович

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии), г. Москва.

Защита диссертации состоится «11» октября 2013 г. в 10— часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская область, г. Покров, Тел./факс: 8 (49243) 6-21-25.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « 29 » августа 2013 г., размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.nl и на официальном сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, Балашова

кандидат биологических наук Елена Алексеевна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Африканская чума лошадей (африканская чума однокопытных) (АЧЛ) - вирусная болезнь, протекающая остро и подостро, характеризуется лихорадкой, отеками подкожной клетчатки и кровоизлияниями во внутренних органах. Болезнь относится к группе трансмиссивных инфекций, передается кровососущими насекомыми, носит сезонный характер, проявляясь в теплое, влажное время года (Сюрин В.Н. и др.1991). Экономический ущерб от этой инфекции слагается из падежа животных и затрат, связанных с проведением противоэпизоотических мероприятий (Сюрин В. Н. и др. 1991).

По современной классификации возбудитель африканской чумы лошадей принадлежит к роду Orbivirus семейства Reoviridae.

Наличие сегментированного генома предопределяет появление реассортантов, что, в свою очередь, может привести к возникновению вариантов вируса с новыми биологическими свойствами. На данный момент известно о 9 серотипах вируса АЧЛ.

В настоящее время в мире сохраняется неблагоприятная эпизоотическая ситуация по АЧЛ. В период с 1999 г. до 2011 г. в странах Африки (ЮАР, Нигерия, Намибия, Свазиленд, Лесото, Зимбабве) ежегодно регистрировались вспышки АЧЛ. Последние вспышки были зарегистрированы в Испании и Португалии в 1989 г., в Алжире и Марокко (1989-1991 гг.), в Эфиопии (2003г.), в Сенегале (2007 г.) и в Южной Африке (2008-2009 гг.). Вспышка АЧЛ, произошедшая в Сенегале в 2007 г., была вызвана 2,7 и 9 серотипами вируса. Она длилась 4 месяца, нанеся ущерб в 1,4 миллиона евро (Akakpo A.J., Diouf N. et al. 2007). В настоящее время в странах Африки циркулируют 2,3, 7 и 9 серотипы ВАЧЛ (www.oie.int).

По данным Росстата за 2012 год в нашей стране насчитывается 1378,5 тысяч лошадей, из которых сельскохозяйственным предприятиям принадлежит 358,8 тысяч голов, что составляет 26% от общей численности: фермерским хозяйствам - 289,2 тысяч (21%) и частным владельцам - 730,4 тысяч (53%). Из данных статистики видно, что наибольшее число лошадей принадлежит частным лицам, что связано с увеличением популярности конного спорта среди

населения. В последние годы возрастает импорт лошадей из неблагополучных по A4JI регионов, таких, как страны Аравийского полуострова и Африки.

В связи риском заноса данного заболевания в ходе торгово-экономических взаимоотношений с неблагополучными по A4JI странами, важным вопросом является своевременное выявление зараженных животных. Поэтому, разработка быстрых, специфичных и чувствительных методов выявления больных A4JI животных является актуальной проблемой.

1.2 Степень разработанности проблемы

Для диагностики АЧЛ широко применяют серологические методы: метод флюоресцирующих антител, реакцию диффузной преципитации, реакцию нейтрализации, реакцию связывания комплемента, реакцию задержки гемагтлютинации, метод флюоресцирующих антител (Сюрин В.Н. и др. 1979). В 90-е годы был разработан ряд тест-систем, основанных на методе ПЦР с электрофорезной детекцией (S. Zientara; С. Sailleauet. al.1995). В последние годы для детекции генома вируса АЧЛ испанскими и французскими учёными (М. Agüero, C.Gomez-Tejedor, et al. 2008), (B.Rodriguez-Sanches, J.Fernandez-Pineiro, et al. 2008) были разработаны ОТ-ПЦР в режиме реального времени с праймерами, комплементарными различным сегментам генома. Для определения серотиповой принадлежности вируса АЧЛ в 2000 году была разработана двухраундная серотипоспецифическая ПЦР с электрофорезной детекцией продуктов амплификации (С. Sailleau, C.Hamblin, et al. 2000). В настоящее время испанскими учёными (М. Agüero, К. Тепа) разработаны 3 серотипоспецифические тест — системы на основе ПЦР режиме реального времени, позволяющие в ходе одной реакции выявлять 2,4,9; 3,5,7 и 1,6,8 серотипы.

Отечественными учеными были предложены серологические методы выявления антигена вируса АЧЛ (Сюрин В.Н. и др.1991). В 2004 г., Д.В. Колбасовым, И.М. Калабековым были разработаны наборы препаратов на основе ПЦР с электрофорезной детекцией.

В настоящее время в Российской Федерации отсутствуют средства быстрого определения серотиповой принадлежности изолятов и штаммов вируса АЧЛ.

1.3 Цель и задачи исследования

Основная цель исследований заключалась в разработке средств генотипирования вируса АЧЛ различных серотипов на основе амплификации и секвенирования участков различных сегментов генома.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. На основе анализа нуклеотидных последовательностей различных сегментов генома вируса африканской чумы лошадей подобрать специфические праймеры и ДНК- зонд для идентификации возбудителя.

2. Провести экспериментальное заражение животного, восприимчивого к вирусу АЧЛ, с целью получения клинического и патологического материала, а также изучения характера течения инфекционного процесса.

3. Оценить возможность применения разработанной тест-системы для выявления различных серотипов вируса АЧЛ в материалах от экспериментально зараженных животных и в вируссодержащих образцах с целью последующего генотипирования.

4. Определить первичные нуклеотидные последовательности участков различных сегментов генома вируса АЧЛ для паспортизации штаммов, хранящихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

5. Подтвердить молекулярно-генетическими методами серотиповую принадлежность штаммов вируса АЧЛ, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

1.4 Научная новизна результатов исследований

Впервые в Российской Федерации определены нуклеотидные последовательности 2, 7 и 10 сегментов генома шести штаммов вируса африканской чумы лошадей, имеющихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии и проведен их филогенетический анализ.

Впервые в Российской Федерации разработана диагностическая ОТ-ПЦР на участок пятого сегмента генома с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени для идентификации вируса АЧЛ девяти серотипов.

Экспериментально воспроизведена африканская чума лошадей на восприимчивом животном, зараженном вирулентным штаммом "Уттар-Прадеш".

Впервые в Российской Федерации молекулярно-генетическими методами идентифицирован вирус A4JI, штамм "Уттар-Прадеш" в патологическом материале от экспериментально заражённого восприимчивого животного.

В международной базе данных NCBI были депонированы последовательности 7 и 10 сегментов вирулентного штамма "Уттар-Прадеш".

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Разработаны «Методические рекомендации по выявлению РНК вируса

африканской чумы лошадей методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарём Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. 15.08.2013 г.

Полученные нуклеотидные последовательности 2, 7 и 10 сегментов генома использованы для характеристики штаммов вируса A4JI, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

1.6 Степень достоверности и апробация результатов работы

Степень достоверности результатов проведённых исследований

подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Акт комиссионных испытаний утверждён директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Статистическая обработка включала расчёты средних арифметических значений, коэффициентов вариации, филогенетический анализ последовательностей с помощью программы BioEdit 7.0, вычисления эволюционных дистанций с помощью программы Mega 5.05. Научные положения, выводы и практические предложения диссертационной работы аргументировано отражают содержание диссертации.

Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2009-2013 гг. на базе лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров.

Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на Международной научно-практической конференции молодых учёных "Достижения молодых учёных в ветеринарную практику" (декабрь 2010г., г. Владимир); BTV/AHSV workshop - 2010 в Испании; BTV/AHSV workshop -

2012 в Великобритании, а также на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии в период с 2009 по 2012 гг.

1.7 Публикации научных исследований

По теме диссертационной работы опубликовано 4 научные работы, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

1.8 Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная тест-система на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени пригодна для идентификации генома вируса африканской чумы лошадей в пробах крови и патологического материала.

2. Экспериментальное заражение лошади вирусом A4JI (штамм 9 серотипа "Уттар-Прадеш") вызывает острое течение болезни.

3.Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участков 2,7,10 сегментов генома музейных штаммов вируса A4JI позволяет определить серотиповую принадлежность исследованных штаммов.

1.9 Объём и структура работы

Диссертационная работа изложена на 98 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы включает 122 источника, из них 7 отечественных, 110 зарубежных и 5интернет-ресурсов. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 17 рисунками.

Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2009-2013 гг. на базе лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров.

1.10 Личный вклад соискателя

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Автору принадлежит ведущая роль в планировании и выполнении основных экспериментов и обобщении полученных результатов. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали: к.б.н. Малоголовкин A.C., научный сотрудник Бурмакина Г.С., а также сотрудники Научно-экспериментального отдела ГНУ ВНИИВВиМ

Россельхозакадемии.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы 2.1.1 Вирусы

В работе нами были использованы следующие культуральные материалы вируса африканской чумы лошадей, полученные из лаборатории Музейных

штаммов (Таблица 1).

Таблица 1 - Перечень использованных в работе штаммов вирусов

№ пробы Характеристика биоматериала

1 Лиофилизированный культуральный вирусный материал вакцинного штамма 1-го серотипа "А-501", инфекционная активность 6,0 lg ТЦЩо/см3

2 Лиофилизированный вирусный материал вакцинного штамма 2-го серотипа "OD", инфекционная активность 6,25 lg МЛД5о/0,02мл.

3 Лиофилизированный вирусный материал вакцинного штамма 3-го серотипа "Z", инфекционная активность 7,3 lg МЛД5о/0,02мл.

4 Лиофилизированный вирусный материал вакцинного штамма 4-го серотипа "VRY", инфекционная активность 6,0 lg МЛД5о/0,02мл.

5 Лиофилизированный вирусный материал вакцинного штамма 5-го серотипа "VH", инфекционная активность 7,2 lg МЛД5о/0,02мл.

6 Лиофилизированный культуральный вирусный материал вакцинного штамма 6-го серотипа "114", инфекционная активность 5,5 lg ТЦД5(/см3

7 Лиофилизированный вирусный материал вакцинного штамма 7-го серотипа "Karen", инфекционная активность 7,0 lg МЛД5о/0,02мл.

8 Лиофилизированный культуральный вирусный материал вакцинного штамма 8-го серотипа "№ 452", инфекционная активность 5,25 lg ТЦД^см3

9 Лиофилизированный культуральный вирусный материал вакцинного штамма 9-го серотипа "18/60-100", инфекционная активность 5,0 lg ТЦД50/СМ3

10 Культуральный вирус АЧЛ штамм 9 серотипа "Уттар-Прадеш" 5,5 lg TLm50/cMJ на культуре клеток почки африканской зелёной мартышки CV-1

11 культуральный вирус ЭГБО 1 серотип, штамм Нью-Джерси, 6,0 lg ЦПД50/СМ3

12 культуральный вирус блютанга 16 серотип, RSArnr/16 (AJ585137) референтный штамм, 5,0 lg ЦПД50/СМ3

13 культуральный вирус блютанга 22 серотип, RSAmr/22 (AJ585143) референтный штамм, 5,5 lg ЦПД50/СМ3

2.1.2 Образцы патологического материала

- образцы сердца, лёгких, селезёнки, лимфоузлов, печени и почек от лошади (мерин английской упряжной породы), зараженного изолятом вируса АЧЛ "Уттар-Прадеш" 9-го серотипа;

- кровь, отобранная на разных стадиях инфекционного процесса от лошади (мерин английской упряжной породы), зараженного изолятом вируса A4JI "Уттар-Прадеш" 9-го серотипа;

- 10% суспензия головного мозга 2-3 дневных мышей, зараженных различными серотипами A4JI.

2.1.4 Животные

- мерин английской упряжной породы, возраст 6 лет.

Клинически здоровых животных получали из сектора подготовки подопытных животных ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. До начала экспериментов за клиническим состоянием животных наблюдали в течение 7 дней. Кормление осуществляли в соответствии с рекомендуемыми рационами.

2.2 Методы

2.2.1 Подбор праймеров и зондов

Подбор праймеров и зондов проводили с помощью сравнения и анализа полных нуклеотидных последовательностей и фрагментов различных генов штаммов и изолятов вируса A4JI, опубликованных в базе данных GenBank электронного ресурса NCBI с помощью программы BioEdit 7.0.1 и Oligo 6.0.

2.2.2 Выделение нуклеиновых кислот

Для выделения нуклеиновых кислот из проб цельной крови, суспензий органов использовали методику нуклеосорбции на силикагеле, гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформенную экстракцию и коммерческий реагент Trizol LS («Invitrogen», США).

2.2.3 Проведение ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза

Для амплификации различных ПЦР-продуктов с целью последующего секвенирования различных участков генома вируса A4JI использовали олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие полноразмерные сегменты 7(1179 п.о.) и 10 (758 п.о.), а также участок 2 сегмента различной длины (от 152 до 353 п.о.).

Смесь для обратной транскрипции: прямой и обратный праймеры (10 пмоль) - 1,0 мкл, dNTP (10 шМ) - 0,2мкл, 5х буфер для ОТ («Амплисенс», Россия) - 5 мкл, ревертаза - 50 ед., РНК (исследуемый образец) - 9мкл, деионизированная вода - до 20 мкл. Смесь для амплификации: смесь праймеров (10 рМ каждого) - 2,0 мкл, MgCl2 (25 мМ) - 0,5 мкл, dNTPs (10 шМ) - 0,2мкл, 5Х ПЦР буфер Blue («Амплисенс», Россия) - 5 мкл, Taq ДНК-полимераза - 0,75 ед., кДНК (исследуемый образец) - 9мкл, деионизированная вода - до 25 мкл.

2.2.4 Анализ ПЦР-продуктов

Результаты исследования учитывали путем анализа продуктов

амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в 2 % агарозном геле с добавлением бромида этидия.

2.2.5 Проведение ОТ-ПЦР в режиме реального времени

Для проведения ОТ-ПЦР-РВ использовали смесь: 5 мкл 5х ПЦР - буфера («Амплисенс», Россия); 0,2mkjic1NTPs (10 mM); MgCl2(25 мМ) - 0,5мкл, 1 мкл каждого праймера (10 рМ), 0,3 мкл зонда (10 рМ), 0,75 ед. Taq-полимеразы, 9мкл исследуемой нуклеиновой кислоты, объем реакционной смеси доводили до 25 мкл деионизированной водой.

2.2.6 Нуклеотидиое секвенирование

Выделение специфических продуктов амплификации из агарозного геля осуществляли коммерческим набором для выделения нуклеиновых кислот «АхуРгер DNA Gel Extraction Kit» («Axygen», США).

Определение нуклеотидной последовательности фрагментов кДНК вируса A4JI осуществляли с помощью набора «BigDye v. 3.1. Terminator» («Applied Biosystems», США) на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems Genetic Analyzer 3130 («Applied Biosystems», США) согласно рекомендациям изготовителя.

2.2.7 Компьютерный анализ и сравнение нуклеотидных последовательностей фрагментов генома вируса A4JI, построение филогенетических дендрограмм

Для выравнивания и анализа последовательностей использовали программы BioEdit 7.0.1. Построение филогенетических деревьев проводили с помощью алгоритма NJ (в том числе с добавлением метода численного ресэмплинга «бутстреп») в реализации пакета MEGA, версия 3.1.

2.2.8 Молекулярное клонирование продуктов ПЦР

Клонирование очищенных ПЦР-продуктов осуществляли в соответствии

с инструкцией фирмы-изготовителя с использованием наборов «PCR Cloning Kit» («Qiagen», Германия) и «pGEM-T Easy cloning kit» («Promega», США). Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli осуществляли с использованием наборов «Plasmid Minikit» («Qiagen», Германия), «GeneJET Plasmid Miniprep Kit» («Fermentas», Латвия).

2.2.9. Заражение культур клеток, мышей, чувствительных животных

Для заражения восприимчивого животного (лошади) применяли вируссодержащий материал вируса A4JI 9 серотипа штамм "Уттар-Прадеш" (5,51g ТЦЦ50/см3 на культуре клеток почки африканской зелёной мартышки CV-1), полученный из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. При заражении использованы методы внутривенной и подкожной инокуляции культурального вируса в дозе 1000 ЛДзо/см3. Пред

заражением и на 3,5,7 сутки после заражения проводили отбор проб крови для исследования с применением ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Разработка тест-системы для выявления генома вируса африканской чумы лошадей методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени

Разработка тест-системы для выявления генома вируса A4JI методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (далее - тест-система «АЧЛ/ОТ-ПЦР РВ/5») была обусловлена необходимостью быстрого выявления генома вируса африканской чумы лошадей в культуральных образцах, образцах крови и патологического материала. Для этого были выбраны праймеры и зонд, фланкирующие высококонсервативный участок пятого сегмента генома вируса A4JI длиной 176 п.о.

Для подбора праймеров и зонда был проведён анализ имеющихся в базе данных Genbank (NCBI) последовательностей 5 сегмента генома вируса АЧЛ. Данный сегмент имеет консервативные последовательности среди различных серотипов АЧЛ, но при этом отличается от 5 сегмента генома близкородственных вирусов (КЛО, ЭГБО). Анализ последовательностей 5 сегмента проводили с помощью программы BioEdit 7.0.1, подбор праймеров осуществляли программой Oligo 6.0. Для детекции РНК вируса АЧЛ использовали зонд, несущий флуорофор FAM, а результаты учитывали по каналу Green.

В ходе анализа нуклеотидных последовательностей 5 сегмента генома вируса АЧЛ, были подобраны следующие праймеры и зонд:

FW5'AGTATCGCTTCCTTAACG 3'; RW5'GGATTGTGTCAAGCAGAG3' ;Z5'(FAM)TTTACATCTGATGCGGACAGC(BHQ1)3'

В результате проведенных исследований были подобраны условия синтеза кДНК, оптимальный состав реакционной смеси и температурные условия для амплификации.

Синтез К-ДНК на матрице двухцепочечной РНК осуществляли по следующей методике. Реакционная смесь для обратной транскрипции состояла из 1,0 мкл прямой и обратный праймеры (10 пмоль), 0,2мкл -dNTP (10 шМ), 5 мкл- 5х буфер для ОТ («Амплисенс», Россия), ММЬУревертаза («Амплисенс», Россия) - 50 ед., 9 мкл- РНК (исследуемый образец), деионизированная вода -до 20 мкл. Смесь инкубировали в термостате при 42°С в течении 30 минут.

Смесь для амплификации состояла: из 5 мкл 5х ПЦР - буфера («Амплисенс», Россия); 0,2MKndNTPs (10 mM); 0,5мкл - MgCl2 (25 мМ); по 1 мкл каждого праймера (10 рМ); 0,3мкл ДНК-зонда (10 рМ); 0,75 ед. Taq-полимеразы; 9 мкл исследуемой нуклеиновой кислоты; далее объем

реакционной смеси доводили до 25 мкл деионизированной водой. Температурные условия амплификации: первый цикл - 95 °С - 2 мин.; 5 циклов 94 °С - 10 сек, 57 °С - 20 с,72 °С - 15 с (Цикл повторить - 5раз); Цитирование 2

- 94°С - Юс, 56°С - 15с - детекция по FAM/Green, 72°С - Юс (Цикл повторить

- 35 раз).

Образцы патматериала были параллельно исследованы с помощью ПЦР с электрофорезной детекцией продуктов амплификации.

Для определения аналитической специфичности тест-системы «A4J1/OT-ПЦР РВ/5» были исследованы следующие образцы (таблица 2).

Таблица 2 -Перечень материалов, использованных для валидации тест-системы « A4 Л/ОТ-ПЦР РВ/5 » п = 3

№ пробы Характеристика биоматериала Результат в ОТ-ПЦР

в режиме реального времени в электро форез- ном варианте

1 Лиофилизированный культуральный вирусный материал вакцинного нгтамма 1-го серотипа "А-501", инфекционная активность 6,0 ^ ТЦЦ50/СМ3, культура клеток СУ-1 + +

2 Лиофилизированный вирусный материал вакцинного штамма 2-го серотипа "СЮ", инфекционная активность 6,25МЛД5о/0,02мл, освежён интрацеребральным пассированием на 2-3 дневных мышах + +

3 Лиофилизированный вирусный материал вакцинного штамма 3-го серотипа "Ъ", инфекционная активность 7,3 ^ МЛД5о/0,02мл, освежён интрацеребральным пассированием на 2-3 дневных мышах + +

4 Лиофилизированный вирусный материал вакцинного штамма 4-го серотипа "УЯУ", инфекционная активность 6,0 ^ МЛД5о/0,02мл, освежён интрацеребральным пассированием на 2-3 дневных мышах + +

5 Лиофилизированный вирусный материал вакцинного штамма 5-го серотипа "УН", инфекционная активность 7,2МЛД5о/0,02мл, освежён интрацеребральным пассированием на 2-3 дневных мышах + +

Продолжение таблицы 2

№ пробы Характеристика биоматериала Результат в ОТ-ПЦР

в режиме реального времени в электро форез- ном варианте

6 Лиофилизированный культуральный вирусный материал вакцинного штамма 6-го серотипа "114", инфекционная активность 5,5 lg ТЦД5о/см3, культура клеток CV-1 + +

7 Лиофилизированный вирусный материал вакцинного штамма 7-го серотипа "Karen", инфекционная активность 7,0 lg МЛД5о/0,02мл, освежён интрацеребральным пассированием на 2-3 дневных мышах + +

8 Лиофилизированный культуральный вирусный материал вакцинного штамма 8-го серотипа "№452", инфекционная активность 5,25 lg ТЦ Д50/см3, культура клеток CV-1 + +

9 Лиофилизированный культуральный вирусный материал вакцинного штамма 9-го серотипа "18/60-100", инфекционная активность 5,0 lg ТЦЦ50/СМ3, культура клеток CV-1 + +

10 10%ная осветлённая суспензия лёгких экспериментально-зараженного животного (АЧЛ 9 серотип, штамм "Уттар-Прадеш") + +

11 10%ная осветлённая суспензия селезёнки экспериментально-зараженного животного (АЧЛ 9 серотип, штамм "Уттар-Прадеш") + +

12 10%ная осветлённая суспензия сердца экспериментально-зараженного животного (АЧЛ 9 серотип, штамм "Уттар-Прадеш") + +

13 кровь от ингактного животного (лошадь) - -

14 культуральный вирус ЭГБО 1 серотип, штамм "Нью-Джерси", 6,0 lg ЦПД;о/см3 - -

15 культуральный вирус блютанга 16 серотип, RSArrrr/16 (AJ585137) референтный штамм, 5,0 lg ЦПДя/см3 - -

16 культуральный вирус блютанга 22 серотип, RSArrrr/22 (AJ585143) референтный штамм, 5,5 lg ЦПД50/СМ3 - -

17 10%ная суспензия селезёнки от естественно заражённого инфекционной анемией лошадей животного. - -

18 интактная культура клеток CV-1 - -

19 интактная суспензия мозга 2-3 дневных мышей. - -

Примечание:"+" -положительный результат,"-"-отрицательный результат

В результате проведенных исследований было установлено, что амплификация специфического фрагмента наблюдалась только в образцах, содержащих РНК вируса АЧЛ. Таким образом, подобранные праймеры и зонд обладали специфичностью, исключали перекрестные реакции с РНК гетерологичных вирусов.

Одним из важнейших показателей, позволяющих определить качество разработанной тест-системы является аналитическая чувствительность, которая была определена относительно инфекционной активности вируса. Для ее определения использовали серию десятикратных разведений на стабилизированной ЭДТА крови лошади вируса африканской чумы лошадей 1 серотипа (штамм "А-501", инфекционная активность 6,0 lg ТЦД5о/см ) (рисунок 1).

0.3S

о.за

0.2S

jo.is о.ю о .os

OjOO

Рисунок 1 - Кривые накопления флуоресцентного сигнала по каналу Green, анализ образцов I серотипа с использованием тест-системы «АЧЛ/ОТ-ПЦР РВ/5»: 1-6 -разведения от 1:10' до 1:10®

Рассчитанное значение аналитической чувствительности тест-системы «АЧЛ/ОТ-ПЦР РВ/5» составило 1,0 lg ТЦД50/см3.

Для создания универсального положительного контроля для ОТ-ПЦР-РВ была сконструирована рекомбинантная конструкция, несущая последовательность фрагмента 5 сегмента штамма "А-501" , длинной 176 п.о.

В ходе комиссионных испытаний определены: аналитическая специфичность, аналитическая чувствительность и воспроизводимость результатов данной тест-системы.

Для определения аналитической специфичности тест-системы «АЧЛ/ОТ-ПЦР РВ/5», провели шифрование проб. Применение испытуемой тест-системы «АЧЛ/ОТ-ПЦР РВ/5» позволило выявить 12 из 12 образцов, заведомо содержащих РНК вируса африканской чумы лошадей. Ложноположительные результаты при исследовании заведомо отрицательных образцов отсутствовали.

Аналитическую чувствительность тест-системы «АЧЛ/ОТ-ПЦР РВ/5» определяли путем исследования образцов стабилизированной ЭДТА крови лошади, контаминированной вирусом африканской чумы лошадей 1 серотипа (титр вируса 6,0 lg ТЦДзо/см3).

Повторяемость результатов для тест-системы «АЧЛ/ОТ-ПЦР РВ/5» была определена при исследовании двумя сотрудниками лаборатории Биофизики препаратов нуклеиновых кислот, выделенных из шифрованных образцов с помощью этой тест-системы в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Обоими сотрудниками было выявлено 12 из 12 образцов, заведомо содержащих РНК вируса африканской чумы лошадей.

Все рассчитанные показатели свидетельствуют о возможности использования данной тест-системы для применения в лабораторной диагностике вируса АЧЛ.

3.2 Экспериментальное воспроизведение АЧЛ

Для тестирования разработанной тест-системы для выявления генома вируса АЧЛ в различных образцах инфицированных животных было проведено экспериментальное заражение лошади вирулентным штаммом вируса АЧЛ. Для этой цели использовали 6-летнего мерина гнедой масти английской упряжной породы, массой тела 400 кг. Для заражения применяли вируссодержащий материал вируса АЧЛ 9 серотипа штамм "Уттар-Прадеш" (5,5 lg ТЦД50/см3 на культуре клеток почки африканской зелёной мартышки CV-1), полученный из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

При заражении животного были использованы методы внутривенной и подкожной инокуляции культурального вируса в дозе 1000 ЛД50/см3. Перед заражением и на 3, 5, 7 сутки после заражения проводили отбор проб крови для исследования методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. После заражения животное ежедневно обследовали и проводили термометрию. Патоморфологические изменения изучали с помощью полного патологоанатомического вскрытия с фоторегистрацией. Далее пробы органов и тканей (образцы лёгких, сердца, селезёнки, печени, почек, головного мозга и фибрина), отобранных при вскрытии животного, исследовали молекулярно-генетическими методами.

3.2.1 Клинические признаки болезни

На 4-е сутки после заражения температура тела животного повысилась до 38,5 °С, наблюдалось угнетённое состояние, реакция на внешние раздражители ослаблена. Ухудшился аппетит, дыхание было тяжёлое, неравномерное, число дыхательных движений составляло 18-25 в минуту, волосяной покров поблекший, взъерошенный. Видимые слизистые оболочки глаз, ротовой полости и ануса - бледно-розового цвета.

На 6-е сутки у животного температура возросла до 40,3 °С. При пальпации в области гортани и подгрудка регистрировали незначительные флюктуирующие припухлости. На 7-е сутки температура снизилась до 39,7 °С,

аппетит отсутствовал, вплоть до полного отказа от корма, актов дефекации не наблюдали. Отмечали тяжёлое, неравномерное, учащённое дыхание. Слизистые оболочки глаз, ротовой полости и ануса - красно-синюшные, с желтоватым оттенком. На 8-е сутки после заражения мерин пал.

При проведении патоморфологического вскрытия наблюдали характерные для острого течения АЧЛ признаки: пенистые истечения из носовой полости (рисунок 2); дегенерация мышечной ткани, в том числе и сердца (рисунок 3); инфильтрация пенистой жидкости в лёгких (рисунок 4); грудная полость наполнена красноватым транссудатом (рисунок 5).

Рисунок 2 - Пенистые истечения из носовой Рисунок 3 - Инфильтрация пенистой полости жидкости в лёгких

Рисунок 4 - Инфильтрация легочной плевры Рисунок 5 - Сердечная мышца цвета

"варёного мяса", кровоизлияния по ходу коронарных сосудов 3.2.2 Молекулярно-генетические исследования

При исследовании проб крови, взятой на 3 и 5 сутки после заражения, а также крови и экссудата, отобранных из грудной полости посмертно методом ОТ-ПЦР определили наличие фрагментов генома вируса АЧЛ. Аналогично положительный результат получили при исследовании образцов всех

внутренних органов - печени, почек, лёгких, сердца и селезёнки, кроме проб мозга и фибрина (таблица 2).

Таблица 2 - Результаты исследования образцов крови и патматериала методами ОТ-ПЦР в режиме реального времени и ОТ-ПЦР с электрофорезной детекцией__п= 3

Образцы Значение а в ОТ-ПЦР в режиме реального времени Результат ОТ-ПЦР с электрофорезной детекцией

Образцы крови

Кровь на 3 сутки 33,34 положительно отрицательно

Кровь на 5 сутки 24,11 положительно положительно

Кровь на 7 сутки 21,08 положительно положительно

Пробы патологического материала

Сердца 21,98 положительно положительно

Кровяного сгустка 25,19 положительно положительно

Селезёнки 16,97 положительно положительно

Лёгкого 18,79 положительно положительно

Глубокого шейного лимфоузла 27,19 положительно положительно

Заглоточного лимфоузла 24,82 положительно положительно

Головного мозга отрицательно отрицательно

Фибрина из гортани отрицательно отрицательно

Фибрина из лёгких отрицательно отрицательно

Печени 19,61 положительно положительно

Почки 25,20 положительно положительно

Экссудата из грудной полости 26,89 положительно отрицательно

При исследовании методом ПЦР проб крови от здоровых лошадей, а также близкородственных вирусов (эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей, катаральная лихорадка овец) был получен отрицательный результат.

Для подтверждения полученных положительных результатов нами было проведено выделение вируса на культуре клеток СУ-1. С этой целью была использована проба крови, взятая на 7-е сутки после заражения. Титр инфекционного вируса (штамм "Уттар-Прадеш") в пробах крови лошади составил 5,0 ^ ТЦД50/мл.

Результаты экспериментального заражения лошади показали, что динамика развития клинических признаков болезни и комплекса патоморфологических изменений внутренних органов у зараженного животного характерны для острой формы течения АЧЛ. Полученные данные аналогичны таковым, описанным в научных источниках зарубежными учёными.

Для определения молекулярно-генетических характеристик вирулентного штамма "Уттар-Прадеш" было проведено нуклеотидное секвенирование участков 2 , 7, 10-го сегментов генома вируса АЧЛ, размерами от 152 до 353 п.о. (2), 1179 п.о.(7), 758 п.о.(Ю).

В результате проведенных исследований было установлено, что полученные нуклеотидные последовательности 2, 7 и 10-го сегментов имеют 99% гомологии с последовательностями этих сегментов вируса A4JI 9-го серотипа. (U90337.1 — African horse sickness virus 9 segment 7 structural protein VP7 gene). Филогенетический анализ полученных последовательностей 2, 7 и 10 сегментов генома показал, что штамм "Уттар-Прадеш" относится к 9 серотипу вируса A4J1.

З.ЗФилогенетическиП анализ различных изолятов вируса АЧЛ и подтверждение их серотиповой принадлежности

С целью подтверждения серотиповой принадлежности штаммов вируса АЧЛ, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, было решено провести секвенирование 2,7 и 10 сегментов генома. Для проведения филогенетических исследований из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии был взят ряд штаммов, различных годов закладки, принадлежащих к различным серотипам вируса АЧЛ (таблица 3).

Таблица 3 - Перечень штаммов вируса АЧЛ, имеющихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, использованных в работе

Номер Название Год закладки Титр вируса

830 "А-501" 04.04.2007 6,0 lg ТЦЦ50/мл.

831 "OD" 16.06.2000 6,251йМЛД50/0,02мл.

835 "114" 04.10.2007 5,5 lg ТЦД50/МЛ.

836 "Karen" 10.05.2001 7,2 lgMJIfl50/0,02Mii.

452 "452" 18.01.2007 5,25 lg ТЦЦ50/МЛ.

837 "18/60-100" 13.04.2007 5,0 lg ТЦД50/МЛ.

1148 "Уттар-Прадеш" 13.02.1981 5,5 lg ТЦЦ50/МЛ.

Стратегия генотипирования музейных штаммов вируса АЧЛ включала в себя секвенирование фрагментов 2, 7 и 10 сегментов генома. Второй сегмент кодирует главный протективный антиген, определяющий серотиповую принадлежность вируса АЧЛ. Наиболее вариабельные участки 2 и 10 сегментов в геноме вируса АЧЛ широко применяются для филогенетического анализа различных штаммов и изолятов вируса АЧЛ (S. Zientara, С. Sailleau et al. 2000; M.Quan et al.1997). Для секвенирования были использованы полноразмерный 7 сегмент (1179 п.о.), 10 сегмент (758 п.о.) и участки 2 сегмента различной длины. Для амплификации полноразмерных участков 7 сегмента были использованы праймеры, предложенные (S. Zientara, С. Sailleau, S. Moulay, A.Wade-Evans, С. Cruciere 1995).

По данным (M. Quan, P. G. Howell 2008) при проведении филогенетического анализа изолятов на основании исследования полноразмерных последовательностей 10 сегмента вирусной РНК все 9 серотипов вируса A4JI можно разделить на три группы (а,р и у). При этом некоторые серотипы могут входить только в одну группу (6,8 и 9 серотипы — а группа, 3 и 7 серотипы - Р группа, 2 серотип - у группа), в то время, как вирусы относящиеся к 1,4 и 5 серотипам могут находиться как в а, так иву группах. На основании филогенетического анализа изолятов вируса A4JI, выделенных в период с 2004 по 2006 гг. в Western Саре (Южная Африка), (M.Van Niekerk et al., 2003; L.A. Martin et al., 1998; C. Sailleau et al. 1997) было подтверждено существование трёх филогенетических групп (а, р и у). Однако 8 серотип находится исключительно в а группе, по данным (М. Van Niekerk et al. 2003) - в a и P группах, а по данным (L.A. Martin et al. 1998) - исключительно в у группе. Несмотря на это, не следует забывать о явлении реассортации, характерном для вирусов с сегментированным геномом.

10 сегмент является вторым по вариабельности после сегмента, кодирующего VP2. Для амплификации К-ДНК полноразмерных участков 10 сегмента генома A4JI были использованы праймеры, предложенные (M. Quan, P. G. Howell 2008).

С целью подтверждения принадлежности исследуемых штаммов к вирусу A4JI было проведено нуклеотидное секвенирование высококонсервативного 7 сегмента генома. На основании данных секвенирования наличие вируса A4JI в исследуемом материале подтвердилось. Однако полученные последовательности 7 сегмента не позволяют сделать предположение о серотиповой принадлежности исследуемых штаммов. Для этого было необходимо получение последовательностей 2 и 10 сегментов, являющихся наиболее вариабельными в геноме вируса A4JI (рисунок 6, рисунок 7).

Б0 94

Р'

-Г1

100L

100

8_2004_ZM_DVTD_E16004 NS3 (S10) 2004_WP_DVTD_E08604 NS3 (S10)

■ 9st 10s 18/60-100

■ 9st 10s Uttar-Pradesh 9_2004_GP_DVTD_E09304 NS3 (S10)

4_2004_GP_DVTO_E09104 NS3 (S10)

L 5_2005_GP_DVTD_E06805 NS3 (S10)

4 strain HS39/97 nonstructural protein

6 strain MS6/98 nonstructural protein

6_2005_KZ_DVTD_E04405 NS3 (S10)

-8 strain HS7/98 nonstructural protein

8 strain HS2/98 nonstructural protein 9_2004_GP_DVTD_E21204 NS3 (S10) 4_2004_GP_DVTD_E16904_2 NS3 99 L 4_2006_GP_DVTD_E10206 NS3 (S10) ggj 7_2005_KZ_DVTD_E 12505 NS3 (S10) I 7_2004_GP_DVTD_E20004 NS3 (S10) 7st 10s Karen

X

A-rpynna

96|_Г4

99L4

J

100 I—■

3_2004_WP_DVTD_E26104 NS3 (S10; 9513_2005_KZ_DVTD_E12605 NS3 (S10) 10011_2005_GP_DVrD_E03505 NS3 (S10) L 2_2004_GP_DVTD_E14904 NS3 (S10) j— 1_2004_WP_DVTD_E03404 NS3 (S10) I— ■ 8st 10s 452

97.2 non-structural protein (NS3) gene, < Ш 2st 10s OD

A 1st A-501 S10 1975 ▲ 6st 114 10s 1975

■ 1st 10s A-501

■ 6st 10s 114 J

B-rpynna

55

G-rpynna

100 л

Рисунок 6 - Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе полноразмерных участков 10 сегмента генома вируса A4J1 с указанием их групповой принадлежности (M.Quan, P. G. Howell, 2008)

Из представленной дендрограммы видно, что в группу а входит штамм 9 серотипа ("18/60-100"), в группу Р - 7 серотипа ("Karen"), в группу у - 1 серотипа ("А-501"), 2 серотипа ("OD") и 8 серотипа ("452"), что соответствует данным литературы. Однако, нахождение штамма "114" 6 серотипа в у-группе

необычно, так как согласно данным литературы, изоляты 6 серотипа должны находиться исключительно в а-группе.

1VP2 gene

1 major outer capsid protein VP2 (VP2) gene 1 strain HS29/62 VP2 gene A 1st A-501 1975 VP2 A. 6st{1) 114 1Э75 VP2 ■ 1st A-501 VP2

2st OD VP2

100| rHS 02/117 slnK,ura' protein VP2 9ene 531— 2 major outer capsid protein VP2 (VP2) gene - 8 segment 2 major outer capsid protein VP2

10018 major outer capsid protein VP2 (VP2) gene - 4 genomic RNA, segment 2 encoding outer capsid protein (VP2) 4-specific antigen (VP2) 4 major outer capsid protein VP2 gene 4 segment 2 major outer capsid protein VP2 97.3 outer capsid protein gene

1 gene for outer capsid protein VP2 3 segment 2 major outer capsid protein VP2

99

ЙЗ 1

Ji

- 7 major outer capsid protein VP2 (VP2) gene 17st Karen VP2

100i-

931A 6st(6) 1141975 VP2 "^■6st114VP2

-6 segment 2 major outer capsid protein VP2

-5 major outer capsid protein VP2 (VP2) gene

- 9 segment 2 majcr outer capsid protein VP2 I 9 major outer capsid protein VP2 gene

19 st Uttar Pradesh VP2

I 9st 18/60-100 VP2

r 3 IT

541— I

0.05

Рисунок - 7 Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе участков последовательности 2 сегмента генома вируса АЧЛ

В целях проведения более точного филогенетического анализа исследуемых штаммов вируса АЧЛ, было проведено секвенирование участков 2 сегмента генома вирусов АЧЛ, принадлежащих к различным серотипам. Для наработки ампликонов участка 2 сегмента использовали двухраундную ОТ-ПЦР, предложенную (С. Sailleau, S. Zientara et al. 2000). По данным литературы, данный метод позволяет с высокой точностью отнести исследуемый штамм вируса АЧЛ к одному из девяти серотипов, его результаты сопоставимы с результатами реакции нейтрализации. Кроме того, данный метод рекомендован МЭБ (OIE Terrestrial Manual 2012), как быстрый и эффективный способ определения серотипа вируса африканской чумы лошадей.

На основании филогенетического анализа участков 2 сегмента генома вируса АЧЛ была установлена высокая степень гомологии по исследованному участку с имеющимися в Genbank последовательностями штаммов с известными серотипами. Исходя из этого, можно сделать вывод о подтверждении серотиповой принадлежности музейных штаммов: -штамм "А-501" - к 1 серотипу, штамм "OD"-ko 2 серотипу, - штамм "114" - к 6 серотипу, штамм "Karen" - к 7 серотипу, штамм "18/60-100" и вирулентный шт. "Утгар-Прадеш" - к 9 серотипу.

Так как серотипоспецифические праймеры на участок 2 сегмента генома вируса АЧЛ для определения 8 серотипа фланкировали участок, отличающийся по расположению от остальных, возникла необходимость в построении для него отдельной дендрограммы. Принадлежность штамма "452" к 8 серотипу подтвердилась при анализе участка последовательности 2 сегмента его генома при помощи программы BLAST. Штамм "452" на 98% сходен со штаммом EU303131.1 African horse sickness virus 8 isolate VAHS8-2.

Серотиповая принадлежность музейных штаммов 2 (штамм "OD"), 6 (штамм "114"), 7 (штамм "Karen"), 8 (штамм "452") и 9 ("18/60-100" и "Утгар Прадеш") серотипов подтвердилась, однако в серотипоспецифической ПЦР штамм 6 серотипа "114" даёт специфический продукт с праймерами на 1 и 6 серотипы (рисунок 7).

На основании этих данных можно предположить наличие в исследуемом материале вируса АЧЛ 1 серотипа, либо реассортанта по 2 сегменту генома, однако данный вопрос требует дополнительного изучения.

Таким образом, было установлено, что филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей полноразмерного 10 сегмента и участка 2 сегмента позволяет получить данные, подтверждающие серотиповую принадлежность исследуемых изолятов вируса АЧЛ.

4 ВЫВОДЫ

1. Разработана тест-система для выявления генома вируса африканской чумы лошадей методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющая выявлять до 1,0 lg ТЦДзо/см3 РНК вируса АЧЛ.

2. При экспериментальном заражении лошади вирусом АЧЛ (штамм 9 серотипа "Уттар-Прадеш") регистрировали острую форму течения болезни, о чём свидетельствует наблюдаемая клиническая и патологическая картины, а также выявление генома вируса АЧЛ с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

3. Доказана возможность использования разработанных тест-систем для лабораторной диагностики вируса африканской чумы лошадей у экспериментально-зараженной лошади и в вируссодержащих образцах. Геном вируса АЧЛ был выявлен в образцах крови, селезёнки, печени, сердца, почек и других внутренних органов.

4. Установлена первичная структура участков 2, 7 и 10 сегментов генома вируса АЧЛ для создания банка нуклеотидных последовательностей штаммов, хранящихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Нуклеотидные последовательности участков 7,10 сегментов вируса АЧЛ штамма "Уттар-Прадеш" депонированы в международную базу данных GenBank (VP7-KC904541;NS3-KC904542).

5. На основании филогенетического анализа последовательностей 2,7 и 10 сегментов генома изолятов вируса АЧЛ ("А-501", "OD", "114", "Karen", "№452", "18/60-100", "Уттар-Прадеш") установлена их гомология с аналогичными последовательностями штаммов, имеющихся в Genbank (NCBI) соответствующих серотипов, на основании чего сделан вывод о их принадлежности к данным серотипам.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

«Методические рекомендации по выявлению РНК вируса африканской чумы лошадей методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарём Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. 15.08.2013г., предлагаются для использования в научно-исследовательских лабораториях, занимающихся генодиагностикой.

В схему лабораторной диагностики вируса АЧЛ рекомендуется включить тест-систему «АЧЛ/ОТ-ПЦР РВ/5» для выявления генома вируса АЧЛ методом ОТ-ПЦР, отбирать пробы крови, селезёнки, лёгких, печени и сердца.

Для паспортизации штаммов вируса АЧЛ предлагается средство генотипирования изолятов на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК.

Полученные нуклеотидные последовательности 2, 7 и 10 сегментов генома использованы для характеристики штаммов вируса A4JI, депонированных в музее вирусных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

6 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бакулов, И.А. Африканская чума лошадей/ И.А. Бакулов // Эпизоотологиясмикробиологией.-М.,1972.-С.363-366.

2.Бурдов, А.Н. Африканская чума лошадей/ // Инфекционные и инвазионные болезни лошадей.- М.:Колос,1976.-С. 52-61.

3. Сюрин, В.Н. Ветеринарная вирусология.-2-e изд., перераб. и доп./ В.Н. Сюрин, Р.В.Белоусова, Н.В. Фомина. - М.: Агропромиздат,1991. -С.431.

4. Application of the polymerase chain reaction to the detection of African horse sickness viruses / S. Zientara, C. Sailleau, S. Moulay, A. Wade-Evans, C. Cruciere // J. Virol. Meth.- 1995. -Vol. 53. -P. 47-54.

5.Epidemiolojy of African horse-sickness in Senegal: importance of the epizootic of 2007У Akakpo A. J., Diouf N., Ndiaye O., WombouToukam C., Ly C., Mankor A., Etter E.// EU Workshop on Laboratory Diagnosis of Bluetongue virus and African Horse Sickness 2010, Madrid.

6. Identification and differentiation of the nine African horse sickness virus serotypes by RT-PCR amplification of the serotype specific genome segment 2 -2000/ C. Sailleau, C. Hamblin, J. T .Paweska, S. Zientara// J. Gen. Virol. - 2000. -Vol. 81.-P. 831-837.

7. Koekemoer, J.J. Development of probes for typing African horse sickness virus isolates using a complete set of cloned VP2-genes /J.J. Koekemoer // J.Vir.Meth. - 2000. - Vol.88.-P.135-144.

8. Molecular epidemiology of the African horse sickness virus S10 gene. -2008/ M. Quan, M. Vuuren, P. J. Howell, D. Groenewald, A. J. Guthrie // J. Gen. Virol. - 2008. - Vol. 89. -P.l 159-1168.

9. Novel gel-based and real-time PCR assays for the improved detection of African horse sickness virus. -2008/ B. Rodriguez-Sanchez, J. Fernandez-Pinero, C. Saileau, S. Zientara, S. Belak, M. Arias, J. M. Sanchez-Vizcaino // J. Vir. Meth.-2008.-Vol.151.-P. 87-94.

10.Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horsesickness virus/ M. Aguero, C. Gomez-Tejedor, M. Angeles Cubillo, C. Rubio, E. Romero , A. Jimenez-Clavero// J. Vet. Diagn. Invest. -2008.-Vol.20. -P.325-328.

11. Sailleau, C. Nucleotide sequence comparison of the segments S10 of the nine African horse sickness virus serotypes / C. Sailleau, S. Moulay, S. Zientara // Arch. Virol. - 1997. - Vol.142. -P. 965-978.

12. Variation in the NS3 gene and protein in South African isolates of bluetongue and equine encephalosis viruses. / M .Van Niekerk, M. Freeman, J.T. Paweska, P.G. Howell, A.J. Guthrie, A.C. Polgieter, V. Van Staden, H. Huismans // J. Gen. Virol. - 2003. -Vol. 84. - P. 581-590.

13. WAHID Interface/ OIE [электронный ресурс].-Режим flocTvnawww.oie.int.

- WAHID Interface.

7 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Африканская чума лошадей: воспроизведение болезни / И.А. Титов,

A.В. Луницин, А.Ю. Чичикин, С.П. Живодёров, А.В. Николаев, Н.В. Малоголовкина, Е.Н. Глухарёва, С.Ж. Цыбанов., Д.В. Колбасов, Е.В. Аронова,

B.В. Пронин, Г.В. Корнева // Ветеринария. -2011. -№8. -С. 23-25.

2.Индикация вируса африканской чумы лошадей методом ПЦР / И.А.Титов, А.С. Малоголовкин, А.Ю. Чичикин, С.Ж. Цыбанов, А.В. Луницин, Д.В. Колбасов // Молекулярная диагностика 2010: материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием.

- М.,2010.-Т.2. -С.185-188.

3. Detection of African horse sickness virus inexperimental infected animal by real-time RT-PCR/ I.A. Titov, S. P. Zhivoderov, A. S. Malogolovkin, A.V. Lunitsin, S. J. Tsybanov, D.V. Kolbasov // 6ht Annual Meeting Epizone «Viruses on the move» 12-14 June 2012.- Brighton, 2012.

4. Experimental infection of African horse sickness in vaccinated and unvaccinated horses. I.A. Titov., S.P. Zhyvoderov, S.G. Tsybanov, A.V. Lunicin, A.S. Malogolovkin // EU Workshop on Laboratory Diagnosis of Bluetongue virus and African Horse Sickness, 2010.- Madrid, 2010.

8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АЧЛ-вирус африканской чумы лошадей; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; кДНК - комплементарная ДНК;

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция со стадией обратной транскрипции;

ОТ-ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени со стадией обратной транскрипции; п.о. - пар оснований; ПЦР - полимеразная цепная реакция; РНК - рибонуклеиновая кислота; Шт. - штамм;

(И^ТТРб - дезоксинуклеотидтрифосфаты

27К

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМРоссельхозакадемии, г. Покров Владимирской области. Тираж 80 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Титов, Илья Андреевич, Покров

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

04201362391

На правах рукописи

Титов Илья Андреевич

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ ЛОШАДЕЙ РАЗЛИЧНЫХ СЕРОТИПОВ

03.02.02 ВИРУСОЛОГИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Цыбанов Содном Жамьянович

ПОКРОВ- 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ..............................................................................................................................2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................................................5

1 ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................6

1.1 Актуальность темы......................................................................................................................6

1.2 Степень разработанности проблемы............................................................................7

1.3 Цель и задачи исследования................................................................................................8

1.4 Научная новизна результатов исследований......................................................8

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы......................................9

1.6 Степень достоверности и апробация результатов работы......................9

1.7 Публикации научных исследований..........................................................................10

1.8 Основные положения, выносимые на защиту....................................................10

1.9 Объём и структура работы..................................................................................................10

1.10 Личный вклад соискателя......................................................................................................11

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................12

2.1 Характеристика вируса АЧЛ..............................................................................................12

2.1.1 Морфология вириона АЧЛ..................................................................................................12

2.1.2 Компоненты вириона АЧЛ..................................................................................................13

2.1.3 Механизм вирусной репликации....................................................................................13

2.1.4 Структурная организация генома и полипептидный состав вируса 16

2.1.5 Устойчивость к физико-химическим воздействиям......................................18

2.1.6 Антигенные свойства вируса АЧЛ..............................................................................19

2.2 Восприимчивые к АЧЛ животные................................................................................19

2.3 Природные очаги и роль переносчиков при вспышках АЧЛ................20

2.4 Клиническая картина АЧЛ..................................................................................................24

2.5 Эпизоотическая ситуация по АЧЛ в мире..............................................................25

2.6 Диагностика АЧЛ..........................................................................................................................28

2.6.1 Выделение вируса из проб патологического материала..........................28

2.6.2 Индикация вируса при помощи реакции связывания комплимента 28

2.6.3 Индикация вируса АЧЛ при помощи реакции диффузной преципитации....................................................................................................................................29

2.6.4 Типизация вируса. Реакция нейтрализации..........................................................29

2.6.5 Реакция задержки гемагглютинации..........................................................................30

2.7 Применение ПЦР в индикации вируса АЧЛ........................................................30

2.8 Филогенетический анализ вируса АЧЛ молекулярно-генетическими методами........................................................................................................34

2.9 Заключение по обзору литературы..............................................................................38

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................................................40

3.1 Материалы..........................................................................................................................................40

3.1.1 Вирусы....................................................................................................................................................40

3.1.2 Культуры клеток............................................................................................................................41

3.1.3 Образцы патологического материала........................................................................41

3.1.4 Животные............................................................................................................................................42

3.1.5 Плазмиды и бактериальные штаммы........................................................................42

3.1.6 Реактивы..............................................................................................................................................42

3.1.7 Лабораторное оборудование............................................................................................43

3.2 МЕТОДЫ..........................................................................................................................................44

3.2.1 Подбор праймеров и зондов............................................................................................44

3.2.2 Выделение нуклеиновых кислот..........................................45

3.2.3 Проведение ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза........................................................................................................46

3.2.4 Анализ ПЦР-продуктов........................................................................................................47

3.2.5 Проведение ОТ-ПЦР в режиме реального времени....................................48

3.2.6 Нуклеотидное секвенирование......................................................................................49

3.2.7 Компьютерный анализ и сравнение нуклеотидных последовательностей фрагментов генома вируса АЧЛ, построение филогенетических дендрограмм..................................................49

3.2.8 Молекулярное клонирование продуктов ПЦР................................................50

3.2.9 Заражение культур клеток, мышей, чувствительных животных 50

3.3 Статистическая обработка результатов диссертации................................51

4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............................................................................52

4.1 Разработка ОТ-ПЦР в режиме реального времени......................................52

4.1.1 Дизайн специфических праймеров и зонда, использованных в тест-системе....................................................................................................................................52

4.1.2 Оптимизация условий постановки ОТ-ПЦР в режиме реального времени................................................................................................................................................53

4.1.3 Определение чувствительности и специфичности ОТ-ПЦР в режиме реального времени................................................................................................56

4.2 Экспериментальное воспроизведение АЧЛ........................................................61

4.2.1 Клинические признаки болезни....................................................................................62

4.2.2 Молекулярно-генетические исследования..........................................................66

4.3 Филогенетический анализ различных штаммов вируса АЧЛ и

определение их серотиповой принадлежности..................................................68

4.3.1 Филогенетический анализ 7 и 10 сегментов генома вируса АЧЛ 70

4.3.2 Филогенетический анализ 2 сегмента генома вируса АЧЛ....................74

5 ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................................................................................80

6 ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................86

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..........................................................................87

8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................88

9 ПРИЛОЖЕНИЯ..............................................................................................................................99

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.к. - аминокислота

A4JI - Африканская чума лошадей

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГТЦ -гуанидинтиоционат

ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ - дезоксинуклеотид трифосфаты

дцРНК - двухцепочечная РНК

кДа - килодальтон

кДНК - комплементарная ДНК

KJIO - катаральная лихорадка овец

мкл - микролитр

н.о. - нуклеотидное основание

НТО - нетранслируемая область

ОТ - обратная транскрипция

ОТ-ПЦР - обратно - транскриптазная ПЦР

оцДНК - одноцепочечная ДНК

п.о. - пар оснований

ПААГ - полиакриламидный гель

пикоМ - пикомоль

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени

РНК- рибонуклеиновая кислота

тыс.п.о. - тысяч пар оснований

ТЕ - трис-ЭДТА буфер

Трис - трис (гидроксиметил) аминометан

ЭГБО - эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей

ЭДТА - этилендиаминотетроацетат

С. -Culcoides

HRM - High Resolution Melting Point

1 Введение

1.1 Актуальность темы. Африканская чума лошадей (африканская чума однокопытных) (A4JI) - вирусная болезнь, протекающая остро и подостро, характеризуется лихорадкой, отеками подкожной клетчатки и кровоизлияниями во внутренних органах. Болезнь относится к группе трансмиссивных инфекций, передается кровососущими насекомыми, носит сезонный характер, проявляясь в теплое, влажное время года (Сюрин В.Н. и др.1991). Экономический ущерб от этой инфекции слагается из падежа животных и затрат, связанных с проведением противоэпизоотических мероприятий (Сюрин В. Н. и др. 1991).

По современной классификации возбудитель африканской чумы лошадей принадлежит к роду Orbivirus семейства Reoviridae. Наличие сегментированного генома предопределяет появление реассортантов, что, в свою очередь, может привести к возникновению вариантов вируса с новыми биологическими свойствами. На данный момент известно о 9 серотипах A4JI.

В настоящее время в мире сохраняется неблагоприятная эпизоотическая ситуация по A4J1. В период с 1999 г. до 2011 г. в странах Африки (ЮАР, Нигерия, Намибия, Свазиленд, Лесото, Зимбабве) ежегодно регистрировались вспышки A4J1. Вспышки A4JI были зарегистрированы в Испании и Португалии в 1989 году, в Алжире и Марокко (1989-1991 гг.), в Эфиопии (2003 г.), в Сенегале (2007 г.) и в Южной Африке (2008-2009 гг.). Вспышка АЧЛ, произошедшая в Сенегале в 2007 г., была вызвана 2, 7 и 9 серотипами вируса. Она длилась 4 месяца, нанеся ущерб в 1,4 миллиона евро (Akakpo A.J., Diouf N.et al. 2007). Последняя вспышка была зарегистрирована в ЮАР в мае 2013 года. В настоящее время в странах Африки циркулируют 2, 3, 7 и 9 серотипы АЧЛ (www.oie.int.).

По данным Росстата за 2009 год в нашей стране насчитывается 1354 тысячи лошадей, из которых сельскохозяйственным предприятиям принадлежит 417 тысяч голов, что составляет 30,8% от общей численности: фермерским хозяйствам - 177 тысяч (13,1%) и частным владельцам - 760 тысяч

(56,1%). Из данных статистики видно, что наибольшее число лошадей принадлежит частным лицам, что связано с увеличением популярности конного спорта среди населения. В последние годы возрастает импорт лошадей из неблагополучных по A4J1 регионов, таких, как страны Аравийского полуострова и Африки, что актуализирует проблему контроля данной болезни и требует совершенствования средств и методов экспресс-диагностики A4JI.

1.2 Степень разработанности проблемы.

Для диагностики A4J1 широко применяют серологические методы:метод флюоресцирующих антител, реакцию диффузной преципитации, реакцию нейтрализации, реакцию связывания комплемента, реакцию задержки гемагглютинации (Сюрин В.Н. и др. 1991). В 90-е годы был разработан ряд тест-систем, основанных на методе ПЦР с электрофорезной детекцией (Zientara S.,Sailleau C.et al. 1995). В последние годы для детекции генома вируса АЧЛ испанскими и французскими учёными (Agüero М., Gomez-Tejedor C.et al. 2008), (Rodriguez-Sanches В., Fernandez-PineiroJ.et al. 2008) были разработаны OT-ПЦР в режиме реального времени с праймерами, комплементарными различным сегментам генома. Для определения серотиповой принадлежности вируса АЧЛ в 2000 году была разработана двухраундная серотипоспецифическая ПЦР с электрофорезной детекцией продуктов амплификации (Sailleau С., Hamblin С., et. al. 2000). В настоящее время испанскими учёными AgueroM., Tena К. разработаны 3 серотипоспецифические тест - системы на основе ПЦР режиме реального времени, позволяющие в ходе одной реакции выявлять 2,4,9; 3,5,7 и 1,6,8 серотипы.

Отечественными учеными были предложены серологические методы выявления антигена вируса АЧЛ (Сюрин В.Н. и др. 1991). В 2004 г., Д.В. Колбасовым, И.М. Калабековым были разработаны наборы препаратов на основе ПЦР с электрофорезной детекцией.

В настоящее время в Российской Федерации отсутствуют средства быстрого определения серотиповой принадлежности изолятов и штаммоввируса АЧЛ.

1.3 Цель и задачи исследования

Основная цель исследований заключалась в разработке средств генотипирования вируса африканской чумы лошадей различных серотипов на основе амплификации и секвенирования участков различных сегментов генома.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. На основе анализа нуклеотидных последовательностей различных сегментов генома вируса африканской чумы лошадей подобрать специфические праймеры и ДНК- зонд для идентификации возбудителя.

2. Провести экспериментальное заражение животного, восприимчивого к вирусу АЧЛ, с целью получения клинического и патологического материала, а также изучения характера течения инфекционного процесса.

3. Оценить возможность применения разработанной тест-системы для выявления различных серотипов вируса АЧЛ в материалах от экспериментально зараженных животных и в вируссодержащих образцах с целью последующего генотипирования.

4. Определить первичные нуклеотидные последовательности участков различных сегментов генома вируса АЧЛ для паспортизации штаммов, хранящихся в лаборатории музейных штаммов и изолятов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

5. Подтвердить молекулярно-генетическими методами серотиповую принадлежность штаммов вируса АЧЛ, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

1.4 Научная новизна результатов исследований

Впервые в Российской Федерации определены нуклеотидные

последовательности 2, 7 и 10 сегментов генома шести штаммов вируса африканской чумы лошадей, имеющихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии и проведен их филогенетический анализ.

Впервые в Российской Федерации разработана диагностическая ОТ-ПЦР на участок пятого сегмента генома с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени для идентификации вируса A4JI девяти серотипов.

Экспериментально воспроизведена африканская чума лошадей на восприимчивом животном, зараженном вирулентным штаммом "Уттар-Прадеш".

Впервые в Российской Федерации молекулярно-генетическими методами идентифицирован вирус A4J1 в патологическом материале от экспеиментально заражённого штаммом "Уттар-Прадеш" восприимчивого животного.

В международной базе данных NCBI были депонированы последовательности 7 и 10 сегментов вирулентного штамма "Уттар-Прадеш".

1.5Теоретическая и практическая значимость работы

Разработаны «Методические рекомендации по выявлению РНК вируса африканской чумы лошадей методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарём Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. 15.08.2013 г.

Полученные нуклеотидные последовательности 2, 7 и 10 сегментов генома использованы для характеристики штаммов вируса A4J1, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

1.6Степень достоверности и апробация результатов работы

Степень достоверности результатов проведённых исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Акт комиссионных испытаний утверждён директором института. Статистическая обработка включала расчёты средних арифметических значений, коэффициентов вариации, филогенетический анализ

последовательностей с помощью программы BioEdit 7.0, вычисления эволюционных дистанций с помощью программы Mega 5.05. Научные положения, выводы и практические предложения диссертационной работы аргументировано отражают содержание диссертации.

Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2009-2013 гг. на базе лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров.

Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на Международной научно-практической конфренции молодых учёных "Достижения молодых учёных в ветеринарную практику" (декабрь 2010г., г. Владимир); BTV/AHSV workshop - 2010 в Испании; BTV/AHSV workshop -2012 в Великобритании, а также на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИВВиМ Россельхозакадемии в период с 2009 по 2012 гг.

1.7 Публикации научных исследований

По теме диссертационной работы опубликовано 4 научные работы, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

1.8 Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная тест-система на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени пригодна для идентификации генома вируса африканской чумы лошадей в пробах крови и патологического материала.

2. Экспериментальное заражение лошади вирусом A4JI (штамм 9 серотипа "Уттар-Прадеш") вызывает острое течение болезни.

3.Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участков 2,7,10 сегментов генома музейных штаммов вируса A4J1 позволяет определить серотиповую принадлежность исследованных штаммов.

1.9 Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 98 стр. машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и

методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы включает 122 источника, из них 7 отечественных, 110 зарубежный и 5 интернет-ресурсов. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 17 рисунками.

Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2009-2013 гг. на базе лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров.

1.10 Личный вклад соискателя

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Автору принадлежит ведущая роль в планировании и выполнении