Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение белка нуклеокапсида вируса гепатита С с помощью моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение белка нуклеокапсида вируса гепатита С с помощью моноклональных антител"



о, /?■>

На правах рукописи

ПЕТРАКОВА Наталья Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ

БЕЛКА НУКЛЕОКАПСИДА ВИРУСА ГЕПАТИТА С С ПОМОЩЬЮ МО!ЮКЛ(ШАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

специальность 03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-1997

Работа выполнена в лаборатории химии вирусных нуклеиновых кислот и белков и лаборатории клеточной инженерии НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, профессор В.Д.Смирнов

доктор биологических наук, профессор А.А.Кущ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук, профессор В.А.Шибнев

кандидат биологических наук В.А.Гольдов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН

■ЙЙ-

Защита диссертации состоится 1997 г. в.^часов на

заседании специализированного совета Д.001.20.01 при НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН по адресу : 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН.

Автореферат разослан "¿С" К-ОЯ&рЯ^1997г.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор медицинских наук Н.П.К о с я к о в а

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Вирус гепатита С является возбудителем широко распространенного заболевания человека с высокой вероятностью хронизации и малигнизации, характеризуется малыми размерами, низкими темпами размножения и узким спектром видовой и тканевой тропности. Вместе с тем до настоящего времени отсутствовали общепризнанные надежные модельные клеточные системы in vitro для репликации вируса, а те клеточные модели, о которых появились публикации в последнее время, не приобрели широкого распространения. Это определяет малую доступность вирусных белков и их недостаточную изученность.

Гуморальный иммунный ответ, его динамика и структура, хотя и находятся в стадии активного изучения, пока во многом остаются невыясненными. Большая часть работ по вирусу гепатита С (ВГС или HCV) посвящена вопросам эпидемиологии и диагностики инфекции. На молекулярном уровне проводится изучение нуклеотидных последовательностей генов структурных и неструктурных белков. Исследования на уровне белков касаются главным образом совершенствования диагностики и проводятся с использованием синтетических аналогов (пептидов и рекомбинантных полипептидов) основных белков ВГС. Одним из эффективных экспериментальных инструментов для изучения вирусных белков являются моноклональные антитела (МКА). МКА к основным белкам ВГС получены в нескольких лабораториях; они используются в основном для изучения локализации антигенов ВГС в клетках печени больных гепатитом С. Сведения об эпитопной специфичности и топологии антигенных детерминант противоречивы. В то же время они необходимы для решения как ряда фундаментальных проблем молекулярной биологии ВГС, так и задач практического здравоохранения, связанных с гепатитом С. Это указывает на актуальность темы диссертационной работы.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование иммунного ответа на белок нуклеокапсида вируса гепатита С и изучение антигенных свойств этого белка ВГС с помощью МКА.

Для достижения этой цели ставились следующие задачи:

- экспрессировать в E.coli рекомбинантные ДНК, кодирующие иммунологически активные участки HCcAg;

- разработать схему очистки и концентрирования рекомбинантного белка HCcAg;

- разработать способ иммуноферментного выявления антител к вирусу гепатита С, основанный на использовании полученного рекомбинантного HCcAg и гибридных белков, содержащих фрагменты кор-белка ВГС в качестве антигена, сорбируемого на твердой фазе;

- получить гибрвдомные линии, стабильно продуцирующие высокоаффинные МКА, направленные к HCcAg;

- изучить свойства МКА и определить их зпитопную специфичность;

-установить возможность использования МКА для обнаружения

рекомбинантного кор-антигена;

-исследовать взаимодействие МКА с нативным кор-белком в плазмах крови ВГС-позитивных доноров.

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы разработаны методы получения и очистки рекомбинантного полипептида - внутреннего белка кор вируса гепатита С, экспрессированного в E.coli и содержащего 1-150 а.о.

Экспрессированы в E.coli 7 гибридных белков, содержащих антигенно и иммуногенно активные фрагменты HCcAg.

Получен антигенно активный препарат HCcAg, степень чистоты которого позволяет использовать его для выявления антител к ВГС в сыворотках больных гепатитом С и инфицированных ВГС лиц. Доказана эффективность использования

рекомбинантного кор-белка как компонента иммуноферментных тест-систем дл выявления антител к ВГС.

Получена панель высокоаффинных МКА, специфичных по отношению четырем неперекрывающимся эпитопам № и С-концевых участков HCcAg.

Показана способность полученных МКА опознавать антигенные детерминант] нативного НСй^.

Разработан чувствительный метод выявления рекомбинантного и нативног кор-белка ВГС при помощи "сэндвич"-варианта ИФА с использованием МК/ Полученные результаты могут быть использованы при лиагностике гепатита С, а так» в клинической практике при прогнозе развития вирусного гепатита С и оценк патогенеза заболевания.

Направленность и ценность работы. Выполняя диссертационную работу, м] преследовали цели как фундаментального, так и прикладного характера. К первом направлению можно отнести получение панели высокоаффинных моноклональны антител, специфичных по отношению к индивидуальным неперекрывающимс эпитопам И- и С-концевых участков нуклеокапсидного белка вируса гепатита С Данные антитела способны опознавать антигенные детерминанты нативного НСсА£.

Метод выявления нативного белка позволяет анализировать вирусный бело) находящийся в составе различных морфологических форм вируса гепатита ( содержащихся в плазме. Это является важным аспектом в клинической практике пр прогнозе развития вирусного гепатита С.

Практическая ценность данной работы состоит в получении рекомбинантны белков, содержащих антигенно активные фрагменты, препараты которых могут бьп использованы при выявлении антител к ВГС в составе диагностических тест-систем.

Основные положения, выносимые па защиту.

1. Разработанные методы получения и очистки рекомбинантного полипептида внутреннего белка кор вируса гепатита С (1-150 а.о.) обеспечивают выдепеш очищенного и концентрированного белка в препаративных количествах.

2. На основе очищенного рекомбинантного кор-белка создан иммуноферментны тест, позволяющий обнаруживать антитела к ВГС с высокой чувствительностью специфичностью.

3. Получена панель высокоаффинных МКА, способных опознавать четьц неперекрывающихся антигенных детерминанты кор-белка, две из которых находятся у Ы-конце, а две других - на С-конце НСсАе, что было установлено с применением сем гибридных белков, содержащих фрагменты белка нуклеокапсида ВГС : 19-31 а.о., а.о., 1-80 а.о., 1-160 а.о., 55-72 а.о., 33-56 а.о., 58-84 а.о.

4. Предложенный"сэндвич"-вариант ИФА с использованием четырех МК различной специфичности позволяет выявлять нативный белок нуклеокапсида ВГС плазмах инфицированных ВГС лиц.

Апробация работы. Результаты работы представлены на IX международно симпозиуме по вирусным гепатитам и заболеваниям печени (1996 г., Рим), на международном конгрессе по вирусологии (1996 г., Иерусалим), на IV Российскс национальном конгрессе "Человек и лекарство" (1997г., Москва), на II Российскс научно-практической конференции с международным участием "Гепатиты В, С, Б и б проблемы диагностики, лечения и профилактики" (1997г., Москва). Результаты работ доложены и обсуждены на совместной конференции отдела молекулярной вирусолоп и Совета по предварительной экспертизе диссертаций НИИ вирусолоп им.Д.И.Ивановского РАМН 19 июня 1997 г.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литератур] экспериментальной части, результатов и их обсуждения и выводов. Объ«

диссертационной работы составляет Jif^страниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы ^ таблицами, J.2- рисунками. Список литературы включаету^^ наименований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Получение рекомбинантных белков и исследование их антигенных и иммунногенных

свойств.

1.1. Разработка методов очистки рекомбинаитного HCcAg.

Ранее Худяковым Ю.Е. и соавт. [Khudyakov et al., 1993] была сконструирована плазмида pTSCö 178-7, содержащая синтетический полноразмерный ген HCcAg под контролем промотора 10-го гена фага Т7. Белок, кодируемый этой плазмидой, имел молекулярную массу 27 кД и взаимодействовал в ИФА и иммуноблоттинге с сыворотками больных вирусным гепатитом С.

Однако эта плазмида оказалась нестабильной, а уровень экспрессии белка -низким. Поэтому Худяковым Ю.Е. было произведено переклонирование данного синтетического гена вместе с промотором в ранее хорошо изученный вектор pCL471 [Калинина и др., 1995]. В результате белок HCcAg в полученной плазмиде pFC105-302 был закодирован в гибриде с ß-галактозидазой, присоединенной к С-концу HCcAg, а сам HCcAg был укорочен до 150 N-концевых аминокислот. Полученной плазмидой были трансформированы клетки E.coli, штамм BL21(DE3).

Первоначальный этап работы посвящался отработке условий экспрессии HCcAg, кодированного в составе плазмиды pFC105-302, в прокариотической системе. Эффективность экспрессии целевого белка HCcAg в E.coli оценивали по относительной интенсивности соответствующих зон при электрофорезе. Показано, что максимальное количество рекомбинаитного белка экспрессировалось при концентрации индуктора экспрессии IPTG, равной 1шМ, а оптимальное время индукции экспрессии составляло 3 часа.

Известно, что некоторые рекомбинантные белки, соответствующие сердцевинным белкам вирусов (например, HBcAg), способны формировать соге-подобные структуры в бактериях-продуцентах. В связи с этим представлялось интересным выяснить, не формируются ли подобные структуры и в случае синтеза рекомбинаитного кор-антигена вируса гепатита С. Для этого были проведены эксперименты по определению константы седиментации предполагаемых структур в лизатах бактерий E.coli, содержащих плазмиду pFC 105-302. Ультрацентрифугирование проводили на ультрацентрифуге Beckman, в роторе SW27, при 24000 rpm, при температуре +4°С, 18 часов в градиенте плотности сахарозы (20%-60%). Анализ фракций этого градиента осуществляли при помощи электронной микроскопии. Однако, в результате такого анализа нам не удалось зафиксировать наличие кор-подобных структур. Было выявлено, что белок способен на неспецифическую агрегацию, при этом сами агрегаты (т.н. "тельца включения") находятся на дне улырацентрифужной пробирки с сахарозным градиентом. Действительно, при анализе различных фракций грубого лизата удалось установить, что гибрид HCcAg-ß-галактозидаза в обычном осветленном лизате выпадает в осадок и образует т.н. "тельца включения". Анализ "телец включения" в иммуноблоте с сыворотками пациентов, позитивных на антитела к ВГС, позволил установить, что основная масса белка, несущего антигенные детерминанты HCcAg, обнаруживается в двух полипептидах: с молекулярной массой 26 kD и 136 kD. По-видимому, белок 136 kD соответствует рекомбинантному белку-гибриду HCcAg-ß-галактозидаза, а белок 26 kD является продуктом разрезания исходного рекомбинанта с С-конца молекулы бактериальными протеазами. Необходимо отметить, что при электрофорезе

интенсивность полосы 26 kD во много раз превосходит интенсивность зоны 136 kD, что свидетельствует о практически полном протеолизе исходного рекомбинантного белка. Кроме минорной зоны 136 kDa наблюдается ещё несколько минорных полос различной молекулярной массы. При длительном хранении их относительное количество увеличивается.

Было установлено, что полученный рекомбинантный кор-белок нерастворим в обычных условиях лизиса. В связи с этим были проведены эксперименты по изучению растворимости белка 26 кД в растворах различных денатурирующих агентов и детергентов. Определяли растворимость белка в растворах додецилсульфата натрия, ß-меркаптоэтанола, твина-20. В результате было выявлено, что в растворе 6,5 M мочевины на K-фосфатном буфере (pH 7,0) белок 26 kD переходит в растворимое состояние и способен связываться с катионообменником - целлюлозой Р-Н. Для элюции белка 26 kD с колонки использовали градиент от 0,1 до 0,7 M NaCl в том же буфере. Фракции элюата подвергали анализу с помощью электрофореза и иммуноблота, а также ИФА. Пик белка приходился на концентрацию NaCl 0,4 M. Чистота полученного препарата составляла по данным электрофореза в ПААГ около 70%, а концентрация белка в пиковых фракциях по данным спектрофотометрии - от 0,5 до 7 мг/мл. Выход целевого белка составлял 10 мг HCcAg с 1 л культуры.

1.2. Изучение антигенпых и иммуногенных свойств рекомбинантного кор-белка ВГС и его взаимодействия с сыворотками ВГС-инфидированных лиц.

Для изучения иммуногенных свойств рекомбинантного белка были проведены эксперименты по иммунизации лабораторных животных. Опыты проводили на кроликах-самцах массой около 3 кг. Животным трижды с интервалом в 2 недели вводили внутрикожно вдоль позвоночника по 1 мг очищенного белка в концентрации 1-2 мг/мл с полным адъювантом Фрейнда (1:1) при первой иммунизации и неполным адъювантом (1:1) при второй и третьей иммунизациях. На 10-й день после третьей иммунизации вводили внутривенно 1 мл раствора белка в той же концентрации (бустер). Кровь для исследований отбирали через 11-12 дней после введения бустерной дозы. В сыворотках животных при исследовании их в ИФА и иммуноблоте показано наличие высокого уровня специфичных по отношению к HCcAg антител (титр 1:10000 в ИФА). Эти данные доказывают высокую иммуногенность полученного препарата белка 26 kD.

Антигенность белка 26 kD была проанализирована методами ИФА и иммуноблота как с панелью человеческих сывороток, так и с сыворотками проиммунизированных кроликов. Данные иммуноблота показали, что белок 26 kD обладает значительной антигенностью в отношении и тех, и других сывороток.

Результаты взаимодействия белка 26 kD в ИФА с анти-ВГС-специфическими человеческими сыворотками рассматривались в сравнении с данными иммуноблоттинга для этих сывороток с соответствующим пептидом (с22), синтетическим антигеном ВГС из коммерческой тест-системы RIBA-III (Chiron Corp., USA) (Таблица 1).

Таблица 1. Взаимодействие кор-белка 26 кБ и синтетического антигена С-22 с панелью сывороток крови больных гепатитом С и здоровых доноров.

Антиген/тест- Позитивные Сомнительные Негативные

система сыворотки сыворотки сыворотки

рекомбинантный

HCcAg/ИФА 35 0 4

синтетический

пептид С-22/ 34 2 3

RIBA-III

Анализ данных таблицы 1 показывает, что чувствительность и специфичность лабораторного теста, который был основан на использовании белка 26 kD в качестве антигена, сравнимы с таковыми коммерческой тест-системы. Так, по результатам RIBA-III из 39 изученных сывороток были отобраны 34 позитивных сыворотки от больных гепатитом С, 3 негативных от здоровых доноров и 2 сомнительных сыворотки от пациентов с клиническими проявлениями гепатита С. При постановке ИФА для тех же сывороток в соответствии с cut off=2,5 все 34 позитивных по RIBA-III сыворотки были позитивны и в ИФА. Все сыворотки, негативные по RIBA-III, оказались негативны и в ИФА. Из 2 сывороток, сомнительных в условиях RIBA-III, одна была позитивной в ИФА, а другая оказалась негативной.

Чувствительность и специфичность тест-системы, созданной на основе полученного нами белка, были подтверждены при исследовании образцов сывороток крови больных с различными вирусными гепатитами [М.О.Фаворов и др., 1993]. Исследованы 166 сывороток от больных вирусными гепатитами А, В и ни А, ни В. Анти-кор-антитела выявлены у 1 (1,7%) пациента с гепатитом А, у 1 (1,9%) - с гепатитом В и у 45 (80%) с гепатитом ни А, ни В. С целью дополнительной проверки чувствительности и специфичности разработанной тест-системы проведено сравнение результатов анализа 221 сыворотки крови лиц из группы риска в разработанной тест-системе и в тест-системе фирмы "Ortho" (USA) второго поколения. 91 сыворотка была подвержена сравнительному изучению в тест-системе фирмы "Abbott" (USA) второго поколения. Совпадение результатов получено в 92,9% случаев в первом исследовании и в 96,7% - во втором.

На следующем этапе была изучена способность полученного препарата выявлять aHTH-HCcAg-aHTurena в сыворотках доноров в экспресс-варианте разработанного лабораторного теста. Эксперименты проводились с использованием 10 сывороток от больных и инфицированных лиц. Сравнивали средние значения оптической плотности, полученные в результате анализа одних и тех же сывороток при длительной (60 минут) и короткой (20 минут) инкубации.В этих же опытах варьировали время инкубации с конъюгатом. Анализ данных показал, что сокращение сроков инкубации сывороток, а также конъюгата в 3-4 раза приводит к снижению отношения сигнал/фон менее, чем в 2 раза. При этом указанное соотношение остается весьма высоким, превышая фоновые значения в 5-6 раз. В результате оптимизации всех условий можно было четко дифференцировать положительные сыворотки от отрицательных, сокращая время инкубации с исследуемыми образцами сывороток до 20 мин., а время инкубации с античеловеческим конъюгатом - до 15 мин. (Таблица 2). Итак, при наличии заранее заготовленной твердой фазы вся процедура тестирования может занимать менее 1 часа.

Таблица 2. Изменение соотношения сигнал-фон (P/N) при обычном и экспресс-

Время инкубации с конъюгатом Время инкубации с сыворотками

20 мин. 40 мин. 60 мин.

60 мин. 11,9 10 10,5

15 мин. 5,1 6,3 5,9

Таким образом, сравнительная оценка ряда схем очистки и концентрирования рекомбинатного HCcAg позволила разработать методы максимального его накопления и выделения очищенного препарата, о чем ранее сообщалось лишь в одной работе и для более короткой последовательности (1-115 а.к.) HCcAg [Seki et al., 1995]. Использование нами полипелтида протяженностью 150 а.о. увеличивает эффективность обнаружения анти-ВГС, так как имеются данные об антигенной активности С-концевой области (120-190 а.к.) этого белка [Akatsuka et al., 1993]. Полученные при иммунизации кроликов данные свидетельствуют о высокой иммуногенности белка и восстановлении антигенных детерминант в денатурированном белке при его ренатурации. Это указывает на возможность использования полученного рекомбинантного кор-белка вируса гепатита С как компонента для создания диагностических тест-систем, а также для изучения структуры иммунного ответа на антиген при различных формах гепатита С. Нами показана и возможность экспресс-диагностики, позволяющая получить результаты в течение одного часа. Очищенный препарат рекомбинантного HCcAg прошел апробацию в 1-ой Московской городской клинической инфекционной больнице и с успехом используется в качестве антигена в диагностической тест-системе, выпускаемой НПО "Диагностические системы"(Н.Новгород).

1.3. Получение рекомбииантных фрагментов кор-белка : экспрессия иммунологичсски активных участков кор-белка ВГС в E.coli, реактивность по отношению к анти-ВГС сывороткам.

Ранее д.б.н. Смирновым В.Д., к.х.н. Газиной Е.В. и Хилем П.П. были получены семь рекомбинангных конструкций, в которых были проклонированы в плазмидном векторе рЕХ2 различные по протяженности синтетические олигонуклеотиды из состава гена HCcAg. Рекомбинантные белки, содержащие последовательности HCcAg, экспрессировались нами в E.coli с генноинженерных конструкций в виде гибридов с р-галактозидазой под контролен PR-промотора фага лямбда : I - pEXHCl (содержит участок 19-31 аминокислотные остатки HCcAg); II - рЕХНС2 (1-25); III -рЕХНСЗ (180); IV - рЕХНС4 (1-80); V - рЕХНС5 (55-72); VI - рЕХНСб (33-56); VII - pEX2N167A (58-84). Был проведен анализ тотального клеточного белка. Результатами гель-электрофореза в денатурирующих условиях подтвд>ждено наличие белков предполагаемого размера (от 116 до 130 kD). Показано наличие требуемого размера для всех конструкций и отличие в размерах для белков с большими вставками (конструкции III и IV), что соответствует ожидаемым результатам. Для подбора условий максимальной экспрессии была проанализирована продукция белка при изменении времени индукции - от 2 до 18 часов.

В результате было выявлено, что при увеличении времени индукции выше 4 часов не наблюдается роста относительного количества интересующих белков. Кроме того, наблюдается деградация рассматриваемых белков.

Следующей задачей было выделение гибридных белков. Поскольку гибриды ¡5-галактозидазы с С-концевой вставкой нерастворимы в обычных буферных растворах, используемых для лизиса бактерий, мы использовали это качество для их очистки. Для выделения было применено ультразвуковое деструктурирование с последующим осаждением клеточного дебриса. При этом гибридные белки находились в осадке вместе с клеточным дебрисом. После этого нам удалось растворить выделяемые белки в 8М мочевине, переведя интересующие белки в раствор и очистив их от примесных белков. Чистота полученных таким образом препаратов по данным электрофореза в ПААГ сосгавляег 50%.

Был проведен анализ специфичности и антигенной активности белков посредством иммуноблоттинга с сыворотками крови четырех больных хроническим гепатитом С. Результаты анализа следующие : для всех четырех проверенных иммуноблоттингом сывороток крови лиц, больных гепатитом С, был зарегистрирован

высокий уровень взаимодействия с конструкциями I, II, III и IV. Не было от мечено заметного взаимодействия с конструкцией V. Уровень взаимодействия с конструкциями VI и VII был ниже, чем с конструкциями I-IV. Большое количество дополнительных полос на дорожках, соответствующих конструкциям I-IV, может свидетельствовать о протеолитическом расщеплении гибридных конструкций в ходе экспрессии, лизиса и очистки белков.

Эти данные позволили заключить, что полипептиды-фрагменты кор-белка ВГС, полученные в ходе выполнения работы, могут быть использованы для анализа антител к ВГС.

2. Получение гибрндомных клеточпых линий, продуцирующих МКА к рекомбинантному кор-белку ВГС и изучение свойств полученных МКА.

2.1. Иммунизация, гибридизация клеток и скрининг гибрндомных культур.

С целью получения гибрндомных клеточных линий, продуцирующих МКА, была проведена серия экспериментов по иммунизации животных и гибридизации клеток. В результате проведения иммунизации мышей BALB/c максимальная активность антител к рекомбинантному HCcAg в мышиных гипериммунных сыворотках характеризовалась титром в тИФА 2х!СК Это позволило приступить к опытам по слиянию клеток селезенки иммунных животных с клетками миеломы.

Первичный скрининг продукции антител клетками гибридных клонов, полученных в результате 3 слияний (более 200 клонов) проводили параллельно в 3-х вариантах тИФА с разными антигенами : рекомбинантным HCcAg, р-галактозидазой и лизатом E.coli. Установлено, что 46 (28,6%) из продуцирующих антитела клонов реагировали исключительно с рекомбинантным HCcAg при отсутствии реакции с бактериальными белками. Часть клонов (85, или 52,8%) продуцировала антитела, взаимодействовавшие с р-галактозидазой или с белками кишечной палочки; небольшое количество клонов (30, или 18,6%) продуцировало антитела, активно взаимодействовавшие со всеми тремя антигенами.

Часть продуцирующих клонов при дальнейшем пассировании прекратила рост и погибла, некоторые гибридные клоны оказались нестабильными по изучавшемуся свойству. В результате многократного анализа в ИФА было установлено, что стабильность сохранили 8 клонов, которые были подвергнуты повторному клонированию. Асцитные жидкости были получены от всех 8 гибрндомных культур. Продукция МКА гибридомными клетками повышалась при их культивировании in vivo в брюшной полости мышей BALB/c. Титры специфических антител в асцитных жидкостях увеличивались в 2000-6000 раз по сравнению с титрами в культуральной жидкости в реакции тИФА (Таблица 3).

Результаты изучения свойств окончательно отобранных 4 клонов, проявивших максимальную активность при взаимодействии с рекомбинантным HCcAg, представлены в таблице 3.

2.2. Активность МКА в реакции тИФА.

Взаимодействие полученных МКА с рекомбинантными белками было изучено в реакции тИФА. В качестве отрицательного контроля был использован лизат штамма бактериальных клеток, не несущих плазмиду. Об активности МКА в реакции тИФА судили по титру антител как в культуральных, так и в асцитных жидкостях. Данные таблицы 3 показывают, что наибольшей активностью обладали МКА 27.

2.3. Субтнпировяние иммуноглобулинов, продуцируемых гибридомными клетками.

Определение класса и субкласса тяжелых цепей и типа легких цепей в составе молекулы иммуноглобулинов (Ig), синтезируемых гибридомными клеточными

линиями, показало, что все полученные МКА принадлежат к иммуноглобулинам класса 1$0 и все, кроме МКА а, относятся к субклассу 1. МКА а относятся к субклассу 2. Было также определено, что молекулы всех синтезируемых моноклональных ^ содержат легкую цепь типа каппа.

Таблица 3. Свойства МКА к рекомбинантному кор-белку ВГС.

Шифр МКА Класс ^ и тип легкой цепи Активность взаимо рекомбинантным (предельные действия МКА с HCcAg в тИФА разведения) Константа аффинности, М-1

в культуральных жидкостях в асцитических жидкостях

DA С1, к ю-« 6*10»

а С2Ъ, к 3*Ю-3 ю-6 2*10'

27 01, к з*ю-3 5*10-6 3,6*109

37 01, к 10-з Ю"5 4,3*108

2.4. Определение константы аффинности МКА.

Константы связывания МКА с рекомбинантным HCcAg определяли в тИФА, измеряя количество связывающихся с антигеном МКА в ходе их возрастающих разведений, с последующей обработкой результатов по методу Скэтчарда. График строили в координатах: у - [МКАСПяз.]/[МКАсВоб.] и х - [МКАсвяз], который представляет собой прямую линию с наклоном пк, где п - валентность МКА, равная 2 (для ^в), к - константа связывания. Результаты анализа показали, что у всех клонов имеется достаточно большое сродство к антигену. Наибольшей аффинностью обладают МКА Д4, тогда как антитела клона 37 проявляют наименьшую аффинность (Таблица 3).

2.5. Определение специфичности МКА.

Так как скрининг МКА проводился только одним методом - тИФА, представлялось необходимым установить специфичность полученных МКА другими методами анализа. Одним из таких методов был иммуноблот. Электрофорезу подвергали очищенный рекомбинантный НО^ и лизат клеток Е.соН, экспрессирукмцих полноразмерный полипептид НСсАё с плазмиды рТБС6178-7. Для контроля использовали препарат того же штамма бактерий, не несущих плазмиду.

При изучении взаимодействия четырех МКА с препаратом очищенного рекомбинантного HCcAg (1-150 а.о.) показано, что все клоны реагируют с белками с М.м. 26 Ш (мажорная полоса), а также с белками с М.м. около 18 кБ (полоса меньшей интенсивности). При анализе полос с препаратом полноразмерного НСсА£ установлено, что МКА опознают полипептид НСсА£, локализованный в области около 28 кО (мажорная полоса), а также в области 23 кД. Дополнительные минорные полосы отражают, по-видимому, взаимодействие МКА с продуктами процессинга или протеолиза рекомбинантных белков. МКА не реагировали с белками контрольного

препарата E.coli. Аналогичная картина наблюдалась и при исследовании в иммуноблоттинге сывороток от больных ВГС и доноров, позитивных на анти-ВГС антитела. При иммунном проявлении стрипов МКА другой специфичности (к поверхностному антигену вируса гепатита В) и сывороткой от здоровых доноров не наблюдалось взаимодействия ни с одним антигеном. В противоположность этому, те клоны, которые реагировали в ИФА с ß-галактозидазой и белками E.coli, забракованные нами при первичном скрининге гибридом (например, МКА 6, МКА 22, МКА 46), взаимодействовали с белками бактерий, не содержащих плазмиду.

При получении моноклональных антител к рекомбинантному HCcAg обратило на себя внимание то, что, несмотря на высокую степень очистки препарата рекомбинантного HCcAg, достаточно большое количество клонов реагировало с примесными белками - ß-галактозидазой и белками E.coli, что свидетельствует о высокой антигенной активности этих белков. Скрининг клонов параллельно на 3 антигенах позволил отобрать лишь те гибридомы, которые продуцируют МКА к полипептидной последовательности HCcAg. Направленность МКА к антигенным детерминантам нуклеокапсида подтверждена методом иммуноблоттинга с полноразмерным рекомбинантным HCcAg (pTSCö 178-7:1-190 а.о.).

Для определения эпитопной специфичности МКА были использованы рекомбинантные белки - продукты экспрессии рекомбинантных ДНК, содержащих различные последовательности из состава HCcAg, описанные в разделе 1.3. Картирование проводилось тремя различными методами : тИФА, иммунодота и конкурентного ИФА. Последний использовался в двух вариантах.

При анализе специфичности МКА в тИФА при сорбции на твердую фазу рекомбинантных белков выявлены следующие взаимодействия : МКА Д4 и G7 реагировали только с рекомбинантным белком IV (1-160 а.о.), МКА 27 и 37 - с этим же белком и с рекомбинантом III (1-80 а.о.), причем реакция в обоих случаях была интенсивной (ОП больше 2,5).

L_

I й м

5

V

7i й

ß- fjMA*f05WAA5A

рнс lH

, JIU-SAT E.toE-i

А Б &

Рисунок 1. Определение эпитопной специфичности МКА с использованием рекомбинантных белков - фрагментов HCcAg методом иммунодота. 1-У11 - рекомбинантные белки-фрагменты HCcAg, А - МКА Д4, Б - МКА 27, В - МКА ЖАК-23 (aнти-HBsAg)

Методом иммунодота, чувствительность которого в нашей модификации составляла 1,5 нг рекомбинантного белка, получены следующие результаты : отчетливую окраску пятен давали МКА Д4 и G7 с белком IV, МКА 27 и 37 - с белками IV и III. Все клоны реагировали с рекомбинантным HCcAg и не взаимодействовали с бактериальными белками, в т.ч. с изолированной ß-галактозидазой (Рисунок 1).

Полученные нами рекомбинантные белки были использованы в качестве конкурирующих антигенов при взаимодействии МКА с рекомбинантным HCcAg (Таблица 4). Добавление рекомбинантного HCcAg вызывало почти полное блокирование связывания всех МКА с гомологичным антигеном в ИФА (90% и выше). Взаимодействие клона Д4 и G7 с рекомбинантным HCcAg активно ингибировалось рекомбинантным полипептидом IV, а МКА 27 и 37 - этим же белком и белком III, при этом ингибирование носило четкий дозо-зависимый характер.

Таблица 4 .Конкуренция между рекомбинантным HCcAg и его фрагментами за связывание МКА в тИФА.

Конкурирующие антигены* МКА

D4 G7 27 37

Рекомбинантный HCcAg (1-150 а.о.) 94*+ 95 94 93

Рекомбинантные белки-фрагменты HCcoreAg : IV (1-160 а.о.) 70 75 85 85

III (1-80 а.о.) 22 18 94 65

II (1-25 а.о.) 25 21 18 14

I (19-31 а.о.) 13 10 10 17

VI (33-56 а.о.) 0 0 5 0

V (55-72 а.о.) 20 0 15 9

VII (58-84 а.о.) 0 0 0 0

ß-галактозидаза 0 0 0 0

* Данные приведены для белков в концентрации 500 мкг/мл. ** Степень конкуренции выражена в %

Исходя из этих данных, можно с большой долей уверенности предположить, что МКА Д4 и G7 взаимодействуют с антигенной детерминантой, расположенной между 80 и 150 а.о. HCcAg, тогда как МКА 27 и 37 - с антигенной детерминантой, локализованной на участке 1-80 а.о. Более детального антигенного картирования провести не удалось, так как во всех случаях эффективно взаимодействовали с МКА лишь длинные, протяженные фрагменты, более короткие (от 13 до 27 а.о.) не проявляли активности. Одним из объяснений этого может служить вероятная экранированность антигенных сайтов нуклеокапсида последовательностями р-

галактозидазы - белка слияния. С аналогичной трудностью сталкивались и другие исследователи [Cerino et al., 1993; Nasoff et al., 1991].

MKA были изучены в реципрокном блокирующем анализе, в ходе которого попарно исследовалась способность каждого из МКА связываться срекомбинантным HCcAg в присутствии другого МКА (Таблица 5). Связывание меченых МКА (конъюгатов) блокировалось соответствующими немечеными гомологичными МКА практически полностью - до 100%. Взаимоотношения между гетерологичными МКА проявлялись в двух формах: частичное несимметричное блокирование (между МКА 27 и 37) и отсутствие конкуренции (между остальными MICA). Незначительное одностороннее подавление связывания конъюгата МКА 37 с рекомбинантным HCcAg клоном 27 может свидетельствовать либо о близкой локализации эпитопов, комплементарных этим MICA, либо быть следствием более низкой аффинности МКА 37.

Таблица 5. Конкурентный анализ МКА с рекомбинантным HCcAg в тИФА*.

Немеченые МКА Конъюгаты МКА

D4 27 37

D4 +++ - -

G7 - - -

27 - +++ +

37 - - +++

* +++ 75-100 % ингибированш;

+ 30-50 % ингибированш; менее 30 % ингибированш.

Таким образом, установлено, что полученные МКА опознают 4 индивидуальных эпитопа нуклеокапсида, два из которых локализованы на участке 1-80 а.о. (МКА 27 и 37), третий и четвертый - 80-150 а.о. (МКА Д4 и G7). Следует отметить, что по данным разных авторов наибольшее число антигенных сайтов приходится на 70 N-концевых а.о. HCcAg [Nasoff et al., 1991; Serino et al., 1993], однако появляются сообщения об антигенной активности и других участков этого белка, например а.о. 101-118 [Salberg et al., 1992], 133-142, 165-174 [Akatsuka et al., 1993]. Таким образом, результаты настоящей работы подтверждают сведения о наличии иммунодоминантных эпитопов не только на N-конце HCcAg, но и в С-концевой области нуклеокапсидного белка ВГС.

2.6. Конструирование "сэцдвич"-ИФА для выявления кор-белка ВГС.

На следующем этапе была изучена способность полученных нами МКА выявлять рекомбинантный HCcAg в двойном антительном моноклональном сэндвиче в ИФА. Проверенные сочетания МКА (в виде сорбированных на подложке и конъюгатов) выявляли различные количества рекомбинантного HCcAg. В результате оптимизации всех условий ИФА были получены следующие результаты (таблица 6). Из всех вариантов наибольшей чувствительностью (до 1 нг/мл) обладает сочетание из МКА Д4, сорбированных на подложку, и конъюгата МКА 27. Сэндвичи, составленные из гомологичных МКА, оказались малочувствительными (не менее 100 нг/мл), что и следовало ожидать, исходя из мономерной структуры рекомбинантного HCcAg. Смесь

МКА на твердой фазе также не дала выигрыша в чувствительности. Аналогичная низкая чувствительность (50 нг/мл и более) получена при сенсибилизации лунок поликлональными антителами - иммуноглобулинами, выделенными из гипериммунной сыворотки мышей, иммунизированных рекомбинантным HCcAg, и из сыворотки пациента, позитивного на антитела к ВГС. Титры этих антител в тИФА с рекомбинантным HCcAg составляли соответственно 2х10-6 и 3x10 3. Различные сочетания из поликлональных антител и МКА в качестве компонентов сэндвича не повышали чувствительности анализа.

Таблица б.Чувствительность выявления рекомбинантного НСсА£ методом двойного антительного сэндвича в тИФА*.

Конъюгаты антител

Антитела на твердой фазе D4 27 37 поликлональные анти-ВГС из сыворотки инфицированного (Ig)

MKAD4 100* 1 12 60

MKAG7 30 5 н.и. 120

МКА 27 6 100 25 50

МКА 37 12 12 250 н.и.

СМЕСЬ МКА 6 4 12 н.и.

Гипериммунная мышиная сыворотка к рекомбинантному HCcAg (Ig) 150 75 200 н.и.

Поликлональные антитела из сыворотки инфицированного ВГС (Ig) 100 50 200 150

* приведены концентрации рекомбинантного HCcAg в нг/мл, н.и. - не исследовали.

3. Изучение взаимодействия МКА с нативным HCcAg.

Известно, что в ряде случаев моноклональные антитела, полученные против рекомбинантных белков и синтетических пептидов, содержащих различные последовательности белков ВГС, не опознают нативные вирусные антигены [Gonzales -Peralta et al., 1994; Sansonno et al., 1993; Yap et al., 1994]. Следующий раздел работы был посвящен выяснению вопроса о том, способны ли полученные нами МКА против рекомбинантного белка core опознавать антигенные детерминанты нативного нуклеопротеида. Для этого были отобраны донорские плазмы, ссропозитивные по антителам к HCcAg.

3.1. Плазмы доноров.

Плазмы (п=34) были получены со станции переливания крови при Институте гематологии, Москва, от добровольных доноров. Из них 27 плазм получены от доноров, позитивных на антитела к ВГС (Ortho HCV 3,0 ELISA Test System) 7 плазм -от анти-ВГС-негативных доноров.

Эксперименты были выполнены на двух индивидуальных образцах плазмы и двух пулах по 4-5 образцов в каждом. В качестве отрицательного контроля служили донорские плазмы, свободные от анти-ВГС-антител (7 образцов). Плазмы осветляли (4000 rpm, 15мин.), ультрацентрифугировали (30000 трш, 3 часа, 4°С ротор Ti45) а осадки собирали и анализировали на присутствие кор-белка, о котором судили по антигенной активности в ИФА. Результаты ИФА оценивались в виде отношения поглощений сигнал/фон (Рисунок 2).

0MKAD4 ЭМКА: D4+37+G7 □ МКА: D4+37+G7+27

12

1.2.

21592

пул1 пул 2 пулЗ 16208

Рисунок 2. Выявление нативного HCcAg в плазмах с помощью "сэндвич"-ИФА с различными комбинациями МКА, сорбированных на твердую фазу.

Сначала для обнаружения кор-белка был выбран двусайтовый "сэндвич", показавший наивысшую чувствительность при анализе рекомбинантного HCcAg (I-150 а.о.) : МКА D4 на твердой фазе и конъюгат МКА 27. Однако наши дальнейшие эксперименты показали, что чувствительность выявления нативного core увеличивалась в 2-5 раз при сорбции на твердую фазу смеси МКА D4, 37 и G7. При добавлении в смесь МКА 27 чувствительность становилась максимальной. Это говорит о различии между конформационной структурой нативного соге-антигена, присутствующего в плазмах, и его генно-инженерного аналога. Замена вторых антител' - конъюгата МКА 27 - на другие конъюгаты или их сочетания не увеличивала чувствительности анализа (Таблица 7).

Таблица 7. Детекция рекомбинантного и нативного HCcAg в "сэндвич"-ИФА при сочетании различных АТ на твердой фазе и в виде конъюгата.

Сочетания AT на твердой фазе и в виде конъюгатов

Анализируемый материал Ig кролика 1 27* Ig кролика 1 D4* G7 г ig человека* D4 4-ig человека* G7-+27* G7->D4* D4->-27* D4+G7+37 i IT D4+G7+37+27 427* D4+G7+37+27 X IT* D4*

рекомбина нтный HCcAg, нг/мл 20 >30 30 15 5 30 1 7.5 15 15

пул 1, P/N 1 1 1.6 1.6 1 1 2.9 5.1 15.4 12.7

пул 2, P/N 1 1 3.3 1.4 1.5 1 2.0 2.8 11.8 9.1

кролика - поликпональные антитела кролика, иммунизированного рекомбинантным HCcAg. человека - поликпональные антитела донора, инфицированного ВГС. * - антитела конъюгированные с пероксидазой хрена (ПХ). 27, 37,07, Б4 - МКА.

Пулы 1,2- пулы плазм крови доноров, инфицированных ВГС.

3.2. Разрушение иммунных комплексов

Осадки, полученные при ультрацентрифугировании, содержат как вирионы, так и анти-ВГС-антитела, которые могут препятствовать обнаружению кор-белка. Мы опробовали более чем 20 способов разрушения иммунных комплексов и выявления кор-белка. Было изучено действие различных веществ, способствующих нарушению белок-белковых взаимодействий : детергенты, денатурирующие агенты, растворы с высокими либо низкими значениями рН, хаотропные агенты, а также различные их комбинации. Антигенная активность до и после обработки измерялась одновременно на трех образцах : рекомбинантный белок НСсА£, пул осадков от 12 серопозитивных по анти-ВГС-антителам донорских плазм и пул осадков от 7 анти-ВГС-отрицательных плазм в качестве негативного контроля.

Анализ полученных данных показал, что самая высокая чувствительность детекции нативного кор-белка ВГС в плазмах достигалась после обработки осадков раствором высокой ионной силы (2,5 М КВг) в комбинации с неионным детергентом Т\уееп-80 в концентрации 0,5%.

3.3. Выявление антигенной активности нативного кор-белка ВГС в индивидуальных плазмах.

27 анти-ВГС-положительных и 7 анти-ВГС-отрицательных плазм были протестированы на антительную активность против рекомбинантного HCcAg в непрямом ИФА. В тех же образцах было определено содержание РНК ВГС в ЯТ-РСЯ и в некоторых из них был также определен генотип ВГС. Эксперименты по изучению РНК ВГС были проведены к.б.н. Самохваловым Е.И. После ультрацентрифугирования плазм изучалась антигенная активность кор-белка. Содержание нативного кор-белка в осадках оценивалось по калибровочной кривой титрования рекомбинантного НСсАд, для которого была показана линейная зависимость между оптической плотностью в ИФА и концентрацией белка в пределах от 1 до 130нг/мл.

Материал плазм крови одновременно изучался в трех вариантах : необработанные осадки; осадки, обработанные только Т\уееп-80; осадки, обработанные КВг в комбинации с Т\л,ееп-80. Затем было измерено содержание кор-белка в пересчете на I мл плазмы.

В качестве отрицательных использовали плазмы, давшие негативные результаты при их тестировании на содержание антител против рекомбинантного HCcAg, РНК и кор-антигенную активность.

Изучение анти-ВГС-позитивных плазм с помощью описанного выше методического подхода позволило разделить исследуемые образцы на несколько условных групп (Таблица 8).

I-кор-белок и РНК ВГС не обнаружены.

II - ВГС-РНК положительные, кор-белок не обнаружен.

Остальные плазмы оказались положительными по РНК ВГС и по кор-антигену. Но кор-антиген определялся в осадках этих плазм после различных обработок.

III - кор-антигенная активность обнаруживалась в этой группе после обработки с помощью раствора детергента Т\уееп-80. Можно предположить, что в этой группе плазм ВГС представлен в основном вирионами.

IV - в четвертой группе кор-антигенная активность также обнаруживалась после обработки детергентом. После разрушения иммунных комплексов обнаруживалось большее количество белка. Эти данные показывают, что вирионы и иммунные комплексы социркулируют в этих плазмах.

V - в пяти плазмах следующей группы положительный сигнал был обнаружен в ИФА только после обработки осадка КВг и Тадееп-80. Это показывает, что ВГС циркулирует в этих плазмах в виде иммунных комплексов со специфическими антителами.

VI - в шестой группе плазм не требовалась обработка КВг или детергентом для обнаружения кор-антигеиа. Это свидетельствует о том, что в этих плазмах присутствовали изолированные нуклеокапсиды ВГС.

VII - Наконец, изолированные нуклеокапсиды циркулировали в плазмах и этой группы. В то же время там присутствовали и иммунные комплексы. Это предположение основано на том, что после обработки осадка КВг и Tween-80 количество обнаруженного кор-антигена возросло.

Максимальное количество кор-белка, обнаруженное в образце, составляло 850 пг/мл плазмы (плазма из группы VII), минимальное - 5 пг/мл (плазма из группы III).

Таблица 8. Детекция кор-антигенной активности ВГС и РНК ВГС в положительных по

анти-ВГС-антителам плазмах

Группы № Титр РНК Концентрация кор в осадке в Концен

плазм плазмы анти- ВГС ИФА (нг/мл) после обработки трация

HCcAg- (RT- кор в

антител PCR), необраб- Tween-80 КВг+ плазме

(ю-з) генотип отанный Tween-80 (пг/мл)

I 1-6 1,6 - 0* 0* 0* 0**

II 22822 3,2 + (1Ь) 0 0 0 0

22817 12,0 + (1Ь) 0 0 0 0

III 16249 1,0 +(3а) 0 16 0 160

20841 0,8 + 0 2 0 10

17083 1,0 + 0 1 0 5

IV 32839 1,0 +(3а) 0 3 4 40

46066 12,0 + (1Ь) 0 15 25 250

14893 12,0 + (1Ь) 0 21 30 300

V 39794 1,0 + 0 0 5 25

22811 3,2 + (1Ь) 0 0 8 80

162083 3,2 + (1Ь) 0 0 30 150

32789 6,4 + (1Ь) 0 0 45 450

39635 3,2 + 0 0 90 450

VI 20300 1,0 + 10 11 0 330

15197 0,8 + (1Ь) 14 10 0 140

35341 12,0 + 15 12 0 150

30000 6,4 + (1Ь) 27 21 9 270

VII 22722 3,2 + (1Ь) 5 5 8 80

12594 3,2 + 10 12 28 280

21892 3,2 + (1Ь) 32 30 53 790

50000 12,0 + (1Ь) 43 45 85 850

<1нг/мл соте в осадке <5пг/мл core в плазме

Применение разработанного нами подхода дало возможность выявить кор в 5 плазмах доноров и повысить количество обнаруженного кор-белка еще в 7 образцах.

Чувствительность нашего анализа составляла 5 пг кор-белка на мл плазмы. Мы не смогли выявить кор-антигеннуго активность в двух плазмах, позитивных на ВГС-РНК. Можно предположить, что либо в крови этих доноров не было экспрессии вирусной РНК, либо концентрация кор-антигена в их плазмах незначительна : менее 1 нг/мл в осадке и менее 5 пг/мл цельной плазмы. Следует отметить, что не все авторы отмечают корреляцию между обнаружением ВГС РНК с помощью ЯТ-РСИ и выявлением кор-антигена в плазмах, в печени [ОопгаЬг-РегаКа й а!., 1994] и в

мононуклеарных клетках периферической крови анти-ВГС-позитивных лиц. Максимальная концентрация кор-белка, выявленная нами, составляла 850 пг/мл. Эта концентрация белка хорошо согласуется с данными ТакаИавЫ й а!., 1992 (670 пг/мл) и ОэЬНа й а1., 1996 (889 пг/мл).

Полученные экспериментальные данные позволяют высказать предположения относительно морфологии форм вирусных частиц, циркулирующих в крови серопозитивных по ВГС доноров : цельные вирионы, "голые" нуклеокапсиды или иммунные комплексы этих частиц ВГС. Данные литературы об относительном количестве этих форм в сыворотках пациентов с разными стадиями заболевания и бессимптомных носителей противоречивы. Есть указания на то, что преимущественная циркуляция ВГС в виде вирионов в основном встречается у хронических больных с нормальным уровнем ферментов, у бессимптомных носителей, а также у острых больных в латентном периоде. Для выявления корреляции между содержанием кор-антигена в плазме, типом циркулирующих частиц ВГС и патогенезом инфекции требуются дальнейшие исследования.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы получения и очистки рекомбинантного полипептида -внутреннего белка кор вируса гепатита С (1-150 а.о.), экспрессированного в Е.соП. Высокая продукция белка нуклеокапсида (10 мг/л культуры) позволяет получать очищенный и концентрированный белок в препаративных количествах.

2. Разработан способ иммуноферментного выявления антител к вирусу гепатита С, основанный на использовании полученного рекомбинантного HCcAg. Показаны высокая чувствительность и специфичность разработанного теста.

3. Получена панель МКА, взаимодействующих с рекомбинантным белком нуклеокапсида протяженностью 1-150 а.о. и с полноразмерным белком (1-190 а.о.). . Установлена высокая (Ю-8 - Ю-9 М) аффинность МКА и их способность опознавать антигенные детерминанты нативного HCcAg.

4. Для определения эпитопной специфичности МКА экспрессированы 7 гибридных белков, содержащих фрагменты белка нуклеокапсида ВГС : 19-31 а.о., 1-25 а.о., 1-80 а.о., 1-160 а.о., 55-72 а.о., 33-56 а.о., 58-84 а.о. . С помощью этих белков установлена специфичность моноклональных антител в отношении четырех неперекрывающихся антигенных детерминант кор-белка, две из которых находятся на К-концевой, а две других - на С-концевой части HCcAg.

5. Предложен протокол обработки вируссодержащего материала, позволяющий выявлять нативный белок нуклеокапсида ВГС в плазмах инфицированных ВГС лиц в "сэндвич"-варианте ИФА с помощью четырех МКА различной специфичности.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Application of monoclonal anti-HCcAg antibodies for detection of HCcAg in plasma of patients and persons infected with Hepatitis С virus (HCV). O.V.Masalova, S.N.Atanadze, T.I.Kalinina, N.V.Petrakova, V.D.Smirnov, H.A.Fields, Yu.E.Khudyakov, A.A.Kushch. Proceedings of IX-th Triennial international symposium on viral Hepatitis and liver disease, Rome, Italy, 21-25 April, 1996. Abstract C-130.

2. Detection of HCcAg in plasma of persons infected with Hepatitis С virus (HCV) using monoclonal anti- HCcAg antibodies. O.V.Masalova, S.N.Atanadze, T.I.Kalinina,

N.V.Petrakova, V.D.Smirnov, A.A.Kushch, et al. Proceedings of X-th International Congress of virology, Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996. Abstract W31-2.

3. Иммунохимические свойства и специфичность моноклональных антител в отношении N- и С-концевых участков рекомбинантного белка нуклеокапсида вируса гепатита С (HCcAg). О.В.Масалова, С.Н.Атанадзе, Т.И.Калинина, Н.В.Петракова, В.Д.Смирнов, Ю.Е.Худяков, А.А.Кущ. Журнал "Вопросы вирусологии", - 1996.- №3, стр. 150-153.

4. Выявление белков вируса гепатита С у больных с помощью моноклональных антител. А.А.Кущ, А.С.Логинов, О.В.Масалова, С.Н.Атанадзе, Т.И.Калинина, Н.В.Петракова, В.Д.Смирнов, В.Д.Ткачев. Материалы IV-ro Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 8-12 апреля 1997.

5. Выявление антигенов вируса гепатита С в материалах от больных с помощью моноклональных антител. А.А.Кущ, О.В.Масалова, С.Н.Атанадзе, Е.ИЛакина, Н.В.Петракова, В-Д.Смирнов, Е.И.Самохвалов, В.Д.Ткачев, А.С.Логинов, Д.К.Львов. Материалы II Российской научно-практической конференции с международным участием "Гепатиты В, С, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, 14-16 октября 1997.

6. Получение и очистка рекомбинантного полипептида, содержащего антигенные детерминанты сердцевинного белка вируса гепатита С. Н.В.Петракова, Т.И.Калинина, Ю.Е.Худяков, Е.В.Газина, В.Д.Смирнов. Журнал "Вопросы вирусологии", - 1997.-№5, стр.208-212.