Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Специфичность взаимодействия вирусных макромолекул при репродукции ортомиксовирусов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Специфичность взаимодействия вирусных макромолекул при репродукции ортомиксовирусов"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ имени Д.И.ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи

УД{ 616:98:578.832.1 - 022.14078: 578.832: 578.1 : 577.112. 853

КОМАРОВ Юрий Сергеевич

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ШРУСНЫХ МАКРОМОЛЕКУЛ ПРИ РЕПРОДУКЦИИ ОРТОМИКСОВИРУСОВ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1988

Работа выполнена в Институте вирусологии имени Д.И.Ивановского АМН СССР.

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор

Н.В.Каверин •

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

Ведущее учревдение - Московский научно-исследовательский Институт вирусных препаратов АМН СССР.

на заседании специализ: ^ ., ститута вирусо-

логии им.Д.И.Ивановского АМН СССР (Москва, 123098, ул.Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии.

В.М.Зайдес

доктор биологических наук, М.Э.Тальянский

Защита состоится

часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат медицинских наук

А.М.Жуковский

"■; . 3

- ВВЕДЕНИЕ

'Актуальность проблемы. В последние годы достигнуты существенные успехи в исследовании механизмов репродукции вирусов. Одним из наименее изученных остается вопрос о специфичности межмолекулярных взаимодействий, лежащих в основе вирусспецифических процессов в зараженной клетке. Одним из путей познания этой проблемы является исследование фенотипического смешивания между вкусами с разной степенью родства, и, соответственно, разной степенью гомологии аминокислотных последовательностей в вирусных белках. Исследование фенотипического смешивания актуально и в чисто вирусологическом аспекте, поскольку разные типы смешанной инфекции широко распространены и во многих случаях являются обязательным условием течения вирусной инфекции (размножение дефектных ретровирусов, дельта-агент, репликация ДИ-частиц). Фенотипическое смешивание между вариантами в популя-дии циркулирующего вируса является также важным аспектом репродукции зирусов в природе. Между тем до настоящего времени фенотипическое :мешивание изучалось преимущественно в аспекте, формирования смешанных шпопротеидных оболочек, содержащих пепломеры разных вирусов. Смеши-¡ание по белкам внутренних структур вириона, а также, в особенности, юрмирование смешанных пепломеров, почти совершенно не изучены, 'астоящая работа призвана восполнить этот пробел, чем и обусловлена е актуальность.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение спе-ифичности взаимодействия макромолекул при сборке субвирусных струк-ур в условиях смешанной вирусной инфекции. Была исследована специ-ичность сборки тримеров гемагглютинина (НА) в условиях смешанной эиппозной инфекции, а также специфичность молекулярного узнавания злков при сборке вирусных рибонуклеопротеидов.

Для достижения этой цели ставились следующие задачи:

- выявить в зараженных двумя вирусами гриппа клетках смешанные тримеры НА, содержащие мономерные молекулы НА обоих вирусов;

- выяснить степень корреляции между формированием смешанных тримеров и гомологией аминокислотной последовательности белка гемаг-глютинина вирусов-партнеров, известной по данным литературы;

- установить в популяции клеток, смешанно зараженных вирусами гриппа разных типов, присутствие рибонуклеопротеидов (РНП), фенотипически смешанных по белку N Р.

Научная новизна. В результате работы были получены следующие основные данные.

В лизате клеток, зараженных двумя вирусами гриппа, принадлежащими к одному подтипу НЗ, при определенных множественностях заражения можно выявить структуры, имеющие характеристики гетеротримеров НА, содержащих мономеры НА обоих вирусов-партнеров, использованных для смешанной инфекции. Такие же результаты были получены и при смешанной инфекции, вызванной вирусами, относящимися к подтипам Н2 и Н5, а также Н1 и Н2. Таким образом, нам впервые удалось показать формирование смешанных поверхностных пепломеров в условиях смешанной инфекции.

В случае комбинации Н1-НЗ и НЗ-Н7 нам не удалось обнаружить присутствия смешанных тримеров НА. На участке малой субъединицы гемаг-глютинина, соответствующем "длинной" о(.-спирали (позиции 74-123),в местах контакта мономеров в тримере у гемагглютининов этих подтипов имеются значительные различия (неконсервативные замены аминокислот). Таким образом, сравнивая аминокислотные последовательности мономеров НА штаммов, входящих в использованную для смешанной инфекции пару, мы обнаружили прямую корреляцию между гомологией контактирующих

аминокислотных остатков участка 74-123 НА2 и способностью формировать гетеротримеры.

При двойной гетеротипической инфекции, вызванной вкусами гриппа А и С, не происходит встраивания белков ЫР обоих вирусов в состав РНП, которое имеет место при смешанной инфекции, вызванной вирусами гриппа А и В, что коррелирует с низкой гомологией последовательности аминокислот в белках Л/Р вирусов гриппа А и С.

Теоретическая значимость и практическая ценность. Работа имеет преимущественно теоретическое значение. Значимость работы определяется тем, что в ней впервые была исследована возможность вхождения мономерных молекул гемагглготинина разных вирусов гриппа в один тример, выявлена ведущая роль "длинной" о<.-спирали НА2 (аминокислотные остатки 74-123) в специфичности распознавания молекул НА в ходе их сборки в тример и получены данные о степени гомологии контактирующих остатков, допускающей сборку гетеротримеров. Полученные данные являются также функциональным подтверждением близости подтипов Н2 и Н5 (а также Н1 и Н2), и относительной отдаленности от них (и друг от друга) подтипов НЗ и Н7. Ранее такие заключения делались только на основании исследований структуры генов и белков соответствующих подтипов, но не на основании их функционального поведения в ходе сборки субвирусных структур. В работе также показано значение гомологии аминокислотной последовательности белков Л/Р для их специфического распознавания при сборке вирусных нуклеопротеидов.

Положения, выносимые на защиту.

- смешанные тримеры (гетеротримеры) гемагглютинина вируса гриппа, содержащие в своем составе мономерную цепь, принадлежащую гетерологичному штамму, образуются при смешанной инфекции, вызванной штаммами, принадлежащими к одному подтипу, или к разным подтипам,

имеющим значительную степень гомологии последовательности аминокислот;

- гетеротримеры не образуются при инфекции, вызванной вирусами отдаленных подтипов (сочетания HI и НЗ или НЗ и Н7), у которых в "длинных" с<-спиралях субъединиц НА2 имеются значительные различия (неконсервативные замены аминокислот) в позициях, по которым ^-опирали контактируют в тримере ;

- фенотипически сметанные рибонуклеопротеидо, содержащие белки ЫР обоих вирусов, образуются при смешанной инфекции, вызванной вирусами гриппа А и В, но не при инфекции, вызванной вирусами гриппа

А и С, что коррелирует с гомологией последовательности аминокислот белков NP вирусов разных типов.

Апробация работы и публикации. Апробация диссертации проходила в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского I июня 1988 года. Основное содержание диссертации отражено в 4-х опубликованных научных работах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, включая 3 таблицы и II рисунков, состоит из введения, обзора литературы (4 главы), собственных исследований (3 главы), обсуждения результатов, выводов и цитируемой литературы (240 источников, из них 27 отечественных авторов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы, клетки и анализ вирусопецифических полипептидов.

В представленной работе были использованы следующие штаммы вирусов гриппа: A/WSA//33 (HIA/I), А/СССР/90/77 (HIA/I), А/Япония/ 305/57 (H2/V2), А/утка/Украина/1/63 (H3/V8), А/Аичи/2/68 (H3/V2), А/Англия/42/72 (H3/V2), А/крачка/Шная Африка/61 (Н5А/3), A/FPV/

Росток/3 (Н7/УI), А/тюлень/Массачузетс/1/80 (Н7Л/7), Ъ/Ьее /40, С/КауСоя /47, С/СССР/0303/77, С/Москва/79,Х-И

В качестве вируссодержащего материала использовали аллантоис-ную жидкость зараженных куриных эмбрионов, хранившуюся при -70°С. Эксперименты осуществляли на перевиваемой культуре фибробластов куриного эмбриона (ФЭК). Концентрат суспензии клеточных культур получали из лаборатории культуры тканей Института вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР. Для метки вирусных белков в культуральную среду в разные сроки после заражения вносили (^^О-гидролизат хлореллы (740 КБк/мл). Длительность инкубации с мечеными аминокислотами определялась целью эксперимента и варьировала от 3 до 12 часов. Вирусные белки анализировали путем проведения электрофореза в полиа1фила-мидном геле (ПААГ) при концентрации акриламида 12 или 15% в системе Лэммли с незначительными модификациями {ЫеиЬоЦ , 1986). Метод радиоиммунопреципитации

Монослой меченных зараженных клеток лизировали в зависимости от эксперимента буфером (1КТ) (в случае анализа нуклеокапсидов) или буфером (НТТДЦ) (в случае анализа гетеротримеров). Состав ТКТ: 05М КС1, 0,05 М трис-НС? рН 7,5 ; 1% тритон Х-ЮО. Состав НТТДЦ: 0,15 М ЫаС1 , 0,02 М трис-НС рН 7,4; 1% тритон Х-100, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия. Лизаты центрифугировали при 12000 об/мин. Затем аликвоту лизата смешивали -с антителами (либо мо-ноклональными, либо моноспецифическими), Смесь антител и клеточного лизата инкубировали в ледяной бане при 0°С в'течение 30 минут. Для осаждения иммунных комплексов в реакционную смесь прибавляли суспензию формалинизированного 5£. <ШЙви $ , содержащего протеин А {"Рап50йВ1П , СаЫ 'юсИет ), отмытого и суспендированного в буфере ТЭНА (0,05 М трис-НСI рН 8,0; 0,001 М ЭДТА, 0,15 М ЫоС[ ,

0,25% бычьего сывороточного альбумина). "PcmsoR&iп » с ассоциированным иммунным комплексом три раза отмывали в буфере ТЭНА. Рарру шение иммунного комплекса осуществляли путем кипячения в течение трех минут в диссоциирующем буфере для электрофореза в ПААГ. "Рап-SORBm " осаждали при низкоскоростном центрифугировании. Надоса-дочная жидкость служила материалом для анализа в электрофорезе в ПААГ.

Анализ клеточных лизатов ультрацентрифугированием в градиенте плотности концентрации сахарозы

Лизаты после осветления низкоскоростным центрифугированием наслаивали на градиент концентрации сахарозы 5-25% с подушкой из 60% сахарозы. Градиент готовили на буфере НГГДЦ. После центрифугирования 16 часов при 25°С в роторе SW 65 при 33000 об/мин собирали фракции объемом 0,4 мл с помощью перистальтического насоса. Характеристика антисывороток и моноклональных антител

Поликлональная моноспецифическая сыворотка кроликов была получена против белка NP вируса гриппа A./PR /8/34 (HI/VI), титр сыворотки 1:64 в тесте радиальной иммунодиффузии против очищенного препарата белка NP в концентрации 7,5 мг/мл. Очистку осуществляли по методике, описанной ранее М.В.Соколовой и др. (1983). Поликлональная моноспецифическая гипериммунная антисыворотка, полученная против изолированного НА А/Порт Чалмерс/1/73 (H3/V2), была любезно предоставлена В.Э.Березиным (Институт Вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР). Моноклональные антитела (мАт) против АДэразилия/ 11/78 (HI/VI), реагирующие с НА А/СССР/90/77 (HI/VI) (НС2, НС22, HCI70), против А/Аичи/2/68 (H3/V2) (НСЗ, HC2I, HC3I, HCI52) и против А/Япония/305/57 (H2/V2) (HCI8, HC4I, НС75) были получены от доктора Д.Д.Скейла (Национальный Институт медицинских исследований

Милл Хилл, Лондон) и любезно предоставлены С.С.Ямниковой, так же как мАт В6,Р22, Е5 против А/утка/Украина/1/63 (НЗЛ/8).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Формирование смешанных тримеров гемагглютинина при двойной гриппозной инфекции, вызванной вирусами, принадлежащими к одному подтипу.

Поверхностный "шип" гемагглютинина вируса гриппа состоит из трех идентичных мономеров. В составе полноценного (инфекционного) ви-риона кавдый мономер расщеплен протеазами на две субъединицы. К настоящему времени известна полная аминокислотная последовательность НА для многих штаммов. Рентгеноструктурным анализом установлена трехмерная структура тримера гемагглютинина штамма А/Аичи/2/68 (НЗЛ/2).

В 1986 году появились сообщения, касающиеся изучения процесса. сборки зрелой молекулы НА (Бе1Н!пд еЬ аС , 1986, ОореСстЫ 1986). Тем не менее, несмотря на явный прогресс в этой области, некоторые проблемы далеки от решения. Остается неясным, в частности, сколь высока степень специфичности белок-белковых взаимодействий, происходящих при сборке тримеров. Одним из подходов к этой проблеме является исследование возможности сборки тримера НА из мономеров, принадлежащих двум разным вирусам, при инфицировании клетки смесью этих вирусов. В случае такой сборки можно было бы исследовать ее специфичность, то есть зависимость ее от степени гомологии НА заражающих штаммов. Для анализа возможности формирования смешанных пер-ломеров при заражении клетки близкородственными вирусами (в нашем случае - вирусами гриппа) необходим был метод, который позволил бы выявить присутствие гетерологичного мономера в смешанном пепломере, то есть, в данном случае, в тримере гемагглютинина вируса гриппа.

Такую задачу можно решить, применяя сочетание иммунологических методов с техникой разделения полипептидов. Для этого мы применяли методический подход с использованием радиоиммунопреципитации с последующим анализом иммунопреципитатов в электрофорезе в ПЛАТ. Клетки, зараженные двумя штаммами вируса'гриппа и меченые ^-аминокислотами, лизировали буфером, содержащим детергенты. Лизат использовали для иммунопреципитации, и преципитат анализировали в полиакриламид-ном геле. Для совместного заражения были подобраны штаммы вирусов, имеющих разную подвижность молекул НА в ПААГ, а для иммунопреципитации использовали моноклональные антитела, реагирующие с гемагглюти-нами лишь одного из двух вирусов, примененных для совместного заражения.

Использованные нами процедуры длительной метки и лизиса зараженных клеток смесью детергентов обеспечивают присутствие НА в лиза-те преимущественно в форме индивидуальных тримеров, а не в виде "розеток". На это указывает результат центрифугирования лизата зараженных клеток в градиенте плотности сахарозы, содержащем те же концентрации детергентов, что и лизат, с последующим анализом материала каждой фракции посредством электрофореза в ПААГ. Гемагглютинин обнаруживался только во фракциях, седиментирующих в зоне 95 , то есть с коэффициентом седиментации, характерным для тримера НА вируса гриппа; у дна градиента, на "подушке", где должны бьши бы располагаться "розетки", НА не обнаруживался. Следует отметить, что и в "легкой" зоне градиента полоса НА не выявляется в геле, что указывает на отсутствие сколько-нибудь заметных количеств мономерного Ш в клеточном лизате ; по всей видимости, это отсутствие есть результат длительного времени метки (от 2 до 6 часов после заражения). Это позволяет основной массе НА войти в состав тримеров: известно,

что среднее время включения мономера НА в тример составляет 7,5 минут (Gething etat, 1986).

В опытах по изучению формирования смешанных тримеров вирусами, принадлежащими к одному и тому же подтипу, мы использовали В1фусы А/утка/Украина/1/63 (H3/V8) и А/Англия/42/72 (H3/V3), НА которых имеет разную подвижность в ПААГ. Для подбора подходящих моноклональ-ных антител нами была поставлена радиоиммунопреципитация с рядом моноклонов к НА вирусов А/уткаДкраина/1/63 (моноклоны HCI4, НС56, НС64) и к НА вирусов А/Аичи/2/68 (НСЗ, HC3I, НС63, HCI52). В ходе предварительных экспериментов было установлено, что только HCI52 реагирует с НА А/Англия/42/72, но не реагирует с НА А/утка/Украина/ 1/63. При совместном заражении клеток вирусами А/уткаДкраина/1/63 и А/Англия/42/72 в соотношении 1:4 на автографе геля после электрофореза экстрактов клеток выявляются полосы НА обоих вирусов (рис.I дор.4). В иммунопреципитате лизата смешанно зараженных клеток тоже обнаруживались полосы обоих НА, тогда как в иммунопреципитате лизата смеси раздельно зараженных клеток обнаруживался только НА А/Англия/42/72. В иммунопреципитате лизата клеток, зараженных А/Англия/ 42/72, выявляли, естественно, только НА этого вируса, тогда как из лизата клеток, зараженных А/утка/Украина/1/63, антитело НС152.не преципитировало меченого материала, в соответствии с результатами предварительных экспериментов. Результат опыта указывал на присутствие в лизате смешанно зараженных клеток стабильных структур, содержащих мономеры НА обоих вирусов, формирующихся до разрушения нлеток (то есть прижизненных, образованных в ходе инфекции), не разрушающихся при обработке смесью детергентов. Структура эта, по всей видимости, не содержит клеточных компонентов, поскольку в автографах иммунопреципитатов отсутствуют какие-либо полосы, которые можно было

Рис. I.

ПААГ - электрофорез иммунопреципитатов, полученных при реакции моноклонального антитела с лизатом клеток, зараженных совместно или раздельно вирусами гриппа А/уткаДкраина/1/63 (НЗ/У8) и А/Англия/42/72 (НЗ/У2). Дорожки 1,3,5,7 - лизаты клеток меченых 14С -аминокислотами. Дорожки 2,4,6,8 - иммунопреципитаты, полученные при реакции клеточных лизатов с моноклональным антителом НС152. Дорожки 1,2 - клетки заражены А/Англия/42/72 ; дорожки 3,4 - клетки заражены совместно вирусами А/Англия/42/72 и А/уткаДкраина/1/63 ; дорожки 5,6 - клетки заражены раздельно вирусом А/Англия/42/72 и вирусом А/утка/Украина/1/63 и смешаны перед лизисом ; дорожки 7,8 -клетки заражены вирусом А/утка/Украина/1/63.

бы отождествить с клеточными белками. Наиболее вероятными претендентами на роль таких структур являются тримеры НА, содержащие мономеры двух разных вирусов.

Представленные результаты позволяют полагать, что при совместном заражении клеток двумя штаммами вируса гриппа, принадлежащими к

одному и тому же подтипу, формируются структуры, содержащие мономеры НА обоих вирусов, причем эти структуры не содержат клеточных белков и не являются агрегатами тримеров, образующимися после лизиса (розетками). Полученные нами данные можно достаточно уверенно трактовать как указание на эффективное формирование смешанных тримеров при довойной инфекции, вызванной двумя штаммами вируса гриппа одного подтипа. Отсюда вытекают два следствия: во-первых, поскольку НА разных вирусов транслируются с разных мРНК и, следовательно, формируются в разных полирибосомах, получетные результаты указывают на формирование тримеров такими мономерами, которые синтезированы в разных полирибосомах ; во-вторых, результаты указывают, что различия между НА в пределах одного подтипа не влияют (или мало влияют) на те особенности трехмерной структуры полипептида, которые важны для формирования тримеров.

2. Сборка тримеров гемагглютинина при совместном заражении клеток штаммами вирусов, принадлежащих к разным подтипам.

В этой части работы было предпринято изучение образования смешанных гетеротримеров НА при двойной инфекции, вызванной вирусами гриппа А, гемагглютинины которых относятся к разным подтипам. Для исследования были выбраны следующие комбинации подтипов гемагглютинина: Н2-Н5, HI-H3, HI-H2, НЗ-Н7. При двойной инфекции клеток ФЭК, вызванной вирусами гриппа А/ирачка/Йжная Африка/61 (H5/V2) и А/Япо-ния/305/57 (H2/V2) при трех разных соотношениях доз заражения в лизатах смешанно зараженных клеток присутствовали полипептиды обоих вирусов-партнеров. Для выявления смешанных тримеров НА были применены мАт против НА А/Япония/305/57 (HCI8, HC4I, НС75), не взаимодействующие с НА Н5. Антитела к НА А/Япония/305/57 в экстрактах совместно инфицированных клеток образовывали преципитат со структурами,

состоящими из мономеров НА обоих вирусов: на это указывает присутствие в иммунопреципитате полос HAI и НА2, которые могут принадлежать лишь вирусу А/крачка/Южная Африка/61, гемагглютинин которого частично подвергается внутриклеточному расщеплению на субъединицы, но не вирусу А/Япония/305/57, антитела против которого были использованы для преципитации. В то же время в контрольной пробе, содержа-! щей лизат смеси раздельно зараженных клеток мАТ преципитируют только НА подтипа Н2. Полученный результат указывал на возможность формирования смешанных структур, содержащих разные мономеры НА (то есть по всей видимости, гетеротримеров НА) не только при заражении клетки

вирусами одного подтипа, но и при совместной инфекции, вызванной

ля

вирусами разных подтипов. ПредставУбю интерес выяснить, относится ли это к любым подтипам гемагглютинина вируса гриппа А, и если нет, то сколь близкими должны быть подтипы, чтобы формирование смешанных тримеров оказалось возможным.

Подтипы Н2 и Н5 расположены очень близко на филогенетическом дереве генов НА (AiR BÍ a¿ , 1981). Подтипы Н2 и HI также являются близкородственными, но имеют меньшую гомологию первичной последовательности, чем Н2 и Н5. Для опытов по смешанному заражению вирусами, принадлежащими к подтипам HI и Н2, мы выбрали А/СССР/90/77 (HI N I) и А/Япония/305/57 (H2/V2), белки НА которых имеют разную подвижность при анализе посредством электрофореза в ПААГ. Инфицирование клеток при разных соотношениях доз заражения (А/Япония/305/57 : А/СССР/90/ 77 = 1:2, 1:4, 1:8) приводит к накоплению гемагглютининов обоих штаммов. В составе иммунопреципитата лизата смешанно зараженных клеток с помощью мАт к штамму А/СССР/90/77 нам удалось выявить присутствие мономерной цепочки НА, принадлежащей гетерологичному вирусу.

При этом количество гетерологичного НА близко к количеству гомологичного. Это подтверждает, что преципитируемые структуры, по всей видимости, действительно являются тримерами. В случае ко-преципитации за счет образования "розеток" или ассоциации НА с клеточными структурами соотношения в преципитате должны были бы отражать соотношения в лизате. В случае же, если преципитируются индивидуальные тримеры, и если антитела реагируют с мономером, представленным в меньшем количестве, то в случае включения такого мономера только в гетеротримеры соотношение НА в преципитате должно составлять 1:2, а в случае не исключительного, не преимущественного или во всяком случае активного включения в гетеротримеры, количество мономеров обоих вирусов может быть в преципитате приблизительно равным, что и имеет место.

Таким образом, соотношение полос в иммунопреципитате указывает, что преципитируклцие структуры являются специфическими комплексами, в которых соотношение индивидуальных мономеров не пропорционально их соотношению в лизате. Это еще раз подтверждает идентификацию пре-ципитируемых структур как индивидуальных тримеров (а не "розеток"). Тем не менее, все же представлялось желательным получить более убедительные доказательства того, что преципитируемые структуры действительно являются тримерами. С этой целью мы фракционировали лизат клеток путем центрифугирования в градиенте сахарозы в присутствии детергентов. Материал из градиента, имеющий коэффициент седиментации 95 , использовали в реакции иммунопреципитации с последующим анализом иммунопреципитата в ПААГ. Соотношение множественностей заражения составляло А/СССР/90/77: А/Япония/305/57 =1:2. Полученный результат подтвердил данные, полученные при иммунопреципитации материала из лизата: мАт против вируса А/СССР/90Д7 преципитировало не

только гомологичный НА, но и материал, мигрирующий при электрофорезе как НА А/Япония/305/57. Таким образом, совокупность полученных данных определенно указывает на формирование смешанных тримеров НА при двойной инфекции, вызванной вирусами, принадлежащими к подтипам Н1 и Н2.

Совершенно иной результат был получен для комбинации Н1-НЗ. В этом случае использовали штаммы А/СССР/90/77 (Н1/У1) и А/Англия/42/ 72 (НЗА/2). Было использовано мАт Е12Н1, реагирующее с НА А/СССР/90/77, и моноспецифичеокая гипериммунная поликлональная антисыворотка против НА А/Порт Чалмерс/1/73, дающая реакцию иммунопреципитации с НА А/Англия/42/72. В реакции иммунопреципитации лизата смешанно зараженных клеток с мАт Е12Н1 преципитировался только гомологичный НА А/СССР/90/77, хотя НА вируса А/Англия/42/72 присутствовал в лизате клеток в значительном количестве. В опыте с антисывороткой против НА А/Порт Чалмерс/1/73 антисыворотка преципитировала из лизата только гомологичный НА вируса А/Англия/42/72. Таким образом, формирование смешанных тримеров выявить (рис.2 дор.7) не удается. Аналогичные результаты были получены с парой вирусов, принадлежащих к подтипам НЗ и Н7. Были использованы вирусы А/тюлень/Массачузетс/1/80 (Н7/У7) и Х-31 (НЗ/У2) (реассертант, имеющий ген НА вируса А/Аичи/2/68). Белки НА этих штаммов обладают разной электрофоретической подвижностью. Смесь мАт НС152, НС31, НС21, НСЗ, реагирующих с НА вируса Х-31, не выявила наличия гетерологичного НА в иммунопреципитате из лизата смешанно зараженных клеток. Как и при реакции с лизатом клеток, зараженных только гомологичным вирусом, выявлялись лишь НА Х-31. Сходные результаты были получены с комбинацией двух других штаммов, тоже принадлежащих к подтипам НЗ и Н7 : Х-31 и А/ГР V /Росток/34 (Н7Л/Г). В иммунопреципитате лизата совместно инфицированных клеток мы обна-

Рис. 2. Анализ иммунопреципитатов, полученных при реакции моноспецифической сыворотки к гемагглютинину НЗ с лизатами клеток, зараженных раздельно и смешанно вирусом А/СССР/90/77 (HI/VI) и А/Англия/42/72 (H3/V2).

о

Дорожки 1,2,3,4 - зараженные клетки, дрожки 5,6,7,8 - иммуно-преципитаты. Дорожки 1,6 - клетки заражены вирусом А/Англия/ 42/72, дорожки 2,5 - клетки заражены вирусом А/СССР/90/77, дорожки 3,8 - клетки заражены раздельно обоими вирусами.и смешаны перед лизисом, дорожки 4,7 - клетки заражены совместно обоими вирусами.

ружили полосу только в положении неразрезанного НА, тогда как HAI и НА2 A/FPIVPoctok/34. имеющиеся в лизате смешанно зараженных клеток, не выявлялись в иммунопреципитате. Отсутствие полос гетерологичных НА для пары НЗ-Н7 (как и для пары HI-H3) говорит об отсутствии

или крайне неэффективном формировании гетеротримеров или, если они формируются, о их нестабильности.

В соответствии с пространственной моделью НА вируса А/Аичи/2/ 68 (НЗN2), полученной методом рентгеноструктурного анализа НА представляется в виде двух характерных структур - стебля и глобулы ( Wiiey et ai , 1981). Глобула образована . субъединицей HAI, а стебель - HAI и НА2, Стебли мономеров сплетены в единый ствол в результате контакта "длинных" о<-спиралей. При этом должны возникать взаимодействия между прилегающими к оси тримера аминокислотными остатками разных мономеров. В зрелом тримере НА вируса А/Аичи/2/68 ствол стабилизирован взаимодействием гидрофобных аминокислотных остатков Иле77, Лей80, Вал84, Лей91, Тир94, Лей98, Лей99, ЛейЮ2. В тримере контактируют (прилегают к "длинной" оси тримера) Тре87, Лиз88, Асн95, Глю105, ГисЮб, АснЮЭ, Асн112, СерИЗ,. АснИб, Глю120, Арг123. Все перечисленные остатки входят в состав "длинной" <<-спирали субъединицы НА2.

Полагают, что при сборке тримера НА первым актом является гидрофобное взаимодействие С-концевых участков НА2~субъединиц мономеров, затем ассоциируются домены, ответственные за построение ствола тримера, в частности, "длинные" с<-спирали ( Соре tcind et а С 1986). Рассматривая участок 74-123 НА2 ("длинную" о<-спираль) штамма А/утка/Украина/1/63 и штамма А/&5емфис/Ю2/72, очень близкого к А/Анг-лия/42/72, нетрудно заметить, что между ними имеется только одно отличие в положении 106, где у А/Мемфис/102/72 находится остаток гис-тидина, а у А/утка/Украина/1/63 остаток лизина. Замена носит консервативный характер. Остальные остатки совпадают на всем протяжении участка 74-123. Общая степень гомологии между субъединицами НА2 А/Япония/305/57 (Н2А/2) и А/крачка/Юкная Африка/61 (H5/V3) составля-

ет 66%. При рассмотрении первичной структуры в области "длинных" с<-спиралей НА2 видно, что в позиции 77лейцин заменен на изолейцин, в позиции 84-метионин на лейцин. Обе замены - консервативные ; различающиеся остатки близки как по заряду, так и по гидрофобности. В другой инфекционной паре, А/СССР/90/77 (HI/VI) и А/Япония/305/57 (Н2А/2), степень сходства между НА2 составляет 80%. Между последовательностями НА этих штаммов имеется 7 различий в позициях контактирующих в стволе тримера аминокислот в области 74-123: Мет77-Лей, Вал84-Мет, Асп85-Глу, Иле91-Вал, ЛейЮ2-Мет, Глу120-Асн, Лиз123-Арг. Все Замены консервативны. Если учитывать только неконсервативные замены в контактирующих аминокислотах этого фрагмента, то для пар НЗ-НЗ, Н2-Н5, HI-H2 наблюдается 100% гомология, то есть неконсервативные замены отсутствуют в ключевых для сборки позициях. При сопоставлении последовательностей HI-H3 и НЗ-Н7 обнаруживаются неконсервативные замены контактирующих (или соседних с ними) аминокислот. Различия в основном касаются зараженных и гидрофильных остатков. У подтипа HI (а также Н2 и Н5) в положении Иб-лизин, тогда как у НЗ и Н7-аспарагин. Остатки Асн114 и Асп117 заменены у НЗ и Н7 на Глю114 и Лиз117, то есть у НЗ и Н7 остатки могут в позициях 114 и 117 образовывать внутримолекулярную солевую связь. Подтип НЗ содержит Тре87 и Лиз88: обе эти аминокислоты у других подтипов заменены либо на большие гидрофобные, либо на незаряженные остатки. Подтип Н7 содержит Тре84 и Лиз85, тогда как у других подтипов позиция 84 занята большим гидрофобным остатком, а позиция 85 - отрицательно заряженным (Глю или Асп). Эти консервативные замены, ведущие к резкому изменению заряда или степени гидрофобности, позволяют объяснить наблюдавшееся в наших опытах отсутствие гетеротримеров в клетках, коинфици-рованных вирусами подтипов HI и НЗ или НЗ и Н7. Таким образом,

Сопоставление взаимодействующих аминокислотных остатков в о<-спирали 77-123 НА2 для исследованных подтипов вируса гриппа*

Подтип I Ilh-амм | Аминокислоты (позиции в НА2 А/Аичи/2/68)

|77 |80 |84 | 85 187 |88 |91 194 |95 198 199 1102| 10611091 112| 113J И4| И6| 11711201123

H7 А/тншень/Масс/80 I (à) ш Ш © /Ш Ш1 Y N L L ® H D D S E N К E R

A/FPÜ/Poctok/34 I L ш ш ф ш Ш Y N L L ® H D D S E N К E R

H3 А/Аичи/2/68 I L U Е Т К L Y N L L L H D D S E N к E R

А/утка/Украина/63 I L U Е Т К L Y N L L L ® D D S E H к E R

А/Меыфис/102/72 I L U Е Т К L Y H L L L H D D S .E H к E R

Hl А/СССР/90/77 (5) L U (D) Ш Ш (D .Y N L L L (D D D S N К N Е К

H2 А/Япония/305/57 (С) L ® Е Ш Ш ® Y N L L Ы ® D D S të? ® £Ш Г ©

H5 А/Цыпл/Пенн/83 I L © Е /д ш © Y N L L M ® D D S Ш © D R

») Последовательность НА2 А/Англия/42/72 неизвестна, вместо нее взята последовательность А/Меыфис/72. По той же причине вместо А/крачка/Южная Африка/61 взята последовательность А/цыпленок/Пенсильвания/83. Консервативные замены в сравнении с А/Аичи/2/68 отмечены О . неконсервативные О Пщследовательности аминркислот взяты из работ Naeve et al.(1980); Porter et al. (1980); Verhoeyen et al.(1980); Fang et al.(1981); Sleigh et al(1980); Сопсаппоп et al.(1984); Gething et al.(1980);

продемонстрированное в наших опытах отсутствие гетеротримеров при определенных комбинациях подтипов коррелирует с наличием неконсервативных замен в позициях аминокислотных остатков "длинной" «< -спирали, прилегающих к оси примера (или соседних с ними). Полученные нами результаты позволяют думать, что сборка гетеротримера происходит в том случае, если замены контактирующих остатков в этой области носят консервативный характер.

3. Полипептидный состав нуклеокапсидов, формирующихся при двойной гетеротипической инфекции, вызванной вирусами гриппа А и С.

Как известно, в семейство ортомиксовируеов, !фоме вирусов гриппа А и В входит еще вирус гриппа С, который по ряду морфологических признаков имеет существенное отличие по сравнению с вирусами гриппа А и В. Первичная структура белков NP некоторых штаммов вируса гриппа А, В и С известна (Nokada et а£л 1984). Гомология между белками NP вирусов гриппа А и В довольно высока - 37,4% (для штаммов K/viSN/ЪЪ и ВД»ее/40), тогда как между вирусами гриппа А и С она составляет лишь 13,6%. Однако в аминокислотной последовательности белка NP вируса гриппа С имеется довольно протяженный участок аминокислот (339-427), гомология которого в отношении колине-арного участка белка NP вируса гриппа А - 24,7%, а в сайтах 346-355 и 416-427 гомология очень высока - около 50 и 60$, соответственно. Для вирусов гриппа А и В показано формирование фенотипически смешанных по белку NP вирусных рибонуклеопротеидов при двойной инфекции (SkCyc/nskatja et al 1985). Представляло интерес выяснить, образуются ли фенотипически смешанные по белку NP нуклеокапсиды при заражении клетки вирусами гриппа А и С. Такие данные позволили бы судить о степени гомологии первичной структуры, необходимой для белок-белкового распознавания при сборке нуклеокапсидов вируса гриппа. Основ-

ным методом для выявления фенотипически смешанных РНП была, как и при анализе смешанных тримеров гемагглютинина, реакция радиоиммуно-преципитации с последующим анализом преципитатов в ПААГ. Требования к компонентам анализа близки к таковым для опытов с НА.

При последовательном смешанном заражении клеток ФЭК вирусами А/и/5лУЗЗ и С/СССР/0303/77 в клетках накапливались вирусспецифичес-кие полипептиды обоих вирусов. Далее клетки лизировали и проводили с лизатами иммунопреципитацию. В реакции использовали моноспецифическую сыворотку, полученную против белка А/Я вируса гриппа А. В иммунопреципитатах обнаруживался только белок N9 вируса гриппа А при всех испытанных соотношениях вирусов гриппа А и С (4:1, 2:1, 1:1), так же как и в иммунопреципитатах лизатов клеток, зараженных только вирусом гриппа А. В контроле, содержащем смесь лизатов раздельно инфицированных клеток, в осадке также содержался только белок /УЯ вируса гриппа А. Из лизата клеток, зараженных вирусом гриппа С, сыворотка к белкувируса гриппа А ничего не преципитировала. Полученные данные позволяют сделать вывод об отсутствии фенотипически смешанных по белкуЫР рибонуклеопротеидов при совместном заражении клеток (ФЭК) вирусами гриппа А и С. Как было показано в предьщущих исследованиях (Зк^опзкоуо <?/ с/ 1985), формирование смешанных НШ происходит при смешанной инфекции вирусами гриппа А и В. Это, однако, было показано в опытах на клетках ЩСК; на клетках ФЭК такие эксперименты не проводились. Поэтому возникал вопрос, не является ли отсутствие смешанных РНП в опытах с вирусами гриппа А и С результатом использования разных клеточных культур. В связи с этим представлялось необходимым провести опыты с вирусами гриппа А и В в той же культуре, в которой проводилась работа с вирусами гриппа А и С, то есть в клетках ФЭК. С этой целью клетки ФЭК заражали смесью

вирусов гриппа А и В при множественности заражения 40 ЭВД^/клетка. При смешанной инфекции клеток ФЭК вирусами гриппа А и В в иымунопре-ципитатах, полученных с использованием антисыворотки против белка ЫР вируса гриппа А, содержались белки ЫР обоих вирусов. Из смеси контрольной пробы (смеси лизатов, образованной из раздельно зараженных клеток) антисыворотка осаждала только РНП, содержащий белок ЫР гомологичного вируса. Отсюда можно заключить, что в клетках ФЭК, при совместной инфекции их вирусами гриппа А и В происходит образование НИ, в состав которого входят белки ЫР обоих вирусов, как это было показано ранее для клеток ВДСК.

Представленные данные позволяют полагать, что в клетках ФЭК при смешанной инфекции, цпущей о условиях достаточно интенсивного синтеза белков ЫР обоих инфицирующих вирусов, может происходить формирование фенотипически смешанных нуклеокапсидов, содержащих белки ЫР вирусов гриппа А и В, но не происходит формирование смешанных ВД1, содержащих белки ЫР вирусов гриппа А и С. Таким образом, при формировании смешанных РНП при двойном заражении клеток вирусами гриппа А и В происходит узнавание молекул белков (и включение их в единую структуру РНП) в силу сходства та первичной и, по Есей ввдимости, третичной структуры. Что касается вирусов гриппа А и С, у которых общая гомология невелика, при возможности выбора для построения М1 между белками ЫР вируса гриппа А и С всегда выбирается и принимает участие в формировании нуклеокапсвдов только гомологичный белок ЫР .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в настоящей работе результаты указывают на различную степень специфичности белок-белкового распознавания при разных типах

сборки вирусспецифических структур. Известно, что степень специфичности может быть весьма низкой: например, при включении готовых пеп-ломеров в оболочку вириона или в соответствующий участок клеточной мембраны перед почкованием. Полученные нами данные показывают, что при сборке такой упорядоченной структуры, как ШП вируса гриппа, требования к степени соответствия стерической структуры белка, необходимой для включения его в нуклеокапсидный сегмент, намного вше. Для белков NP вирусов гриппа А и В еще возможно включение в одну и ту же структуру НШ, а для вирусов гриппа А и С, имеющих лишь весьма ограниченную гомологию первичной структуры, такое включение невозможно или резко затруднено. Наконец, при формировании тримеров НА предъявляются весьма высокие требования к структуре той части молекулы, которая входит в тримере в тесный контакт с двумя другими мономерными молекулами (то есть к структуре "длинной" ot -спирали НА2). Как показывают наши данные, здесь допустимы лишь консервативные замены; даже немногочисленные неконсервативные замены запрещают образование гетеротрнмеров.

В Ы ВО Д Ы

1. Впервые обнаружено формирование гетеротримеров гемагглютини-на вируса гриппа, содержащих в своем составе мономерную цепь, принадлежащую гетерологичному штамму.

2. Мономеры, формирующие тример гемагглютинина, могут транслироваться с разных молекул мРНК, то есть синтезироваться на разных полирибосомах.

3. Гетеротримеры образуются при смешанной инфекции, вызванной вирусами разных подтипов« имеющих значительную степень гомологии аминокислотной последовательности, но не образуются при инфекции, вызванной вирусами отдаленных подтипов (HI-H3 ; НЗ-Н?).

4. Решающая роль при сборке гетеротримеров НА принадлежит, участку 74-123 НА2 ("длинной" <=<-спирали). Если в позициях, по которым "длинные" о<-спирали контактируют в тримере, имеются неконсервативные замены, то формирования стабильных смешанных тримеров не происходит (смешанные тримеры между сочетаниями подтипов Н1 и НЗ или НЗ-и Н7). Если в позициях контакта аминокислотные остатки идентичны, или если аминокислоты в этих позициях сходны по заряду и гидрофоб-ности, то есть замены консервативны, происходит образование гетеротримеров (сочетания подтипов Н2 и Н5 или Н1 и Н2).

5. При смешанной инфекции, вызванной вкусами гриппа А и С, фор мируются в клетках только гомологичные рибонуклеопротеиды, то есть гетерологичный белок Л/Р не включается в состав рибонуклеопротеида. В той же клеточной системе вирусы гриппа А и В при. двойной инфекции формируют фенотипичесни смешанные рибонуклеопротеиды. Способность к формированию смешанных рибонуклеопротеидов коррелирует с гомологией первичной структуры белка МР .

СПИСОК научных публикаций по теме диссертации:

1. Комаров Ю.С., Говоркова Е.И. Исследование фенотипического смешивания нуклеокапсидов при двойной гриппозной инфекции. Сб.работ молодых ученых ч.П. "Молекулярная биология вирусов гриппа и гепатита", Москва, 1985, с.92-102.

2. Комаров Ю.С., Склянская Е.И., Говоркова Е.И, Я)сно М.А., Каверин Н.В. Сравнительный анализ нуклеокапсидов в клетках при двойной гетеротипической инфекции. "(Молекулярная генетика, микробиология и вирусология", 1986, №8, с.35-37.

3. Склянская Е.И., Комаров Ю.С., Ямникова С.С., Каверин Н.В. Формирование смешанных тримеров гемагглютинина при двойной инфекции, вызванной- штаммами вируса.гриппа, принадлежащими к. одному подтипу. "Молекулярная генетика, микробиология и вирусология",1987,№3,с.II-14.

SJclyanak«^«. E.I.,Sliie- M.,Kom«x»T Yu.S.jX&oiilkova. S.S.,Karelin N.V. Formation of mixwd hemagglutinin trioers in tha, oouxse: «f double infeotloB with influenza viruses belonging to different aubtypea."Vlrua research" /1988/ v.IO #. 2/3 pp.153-164.

iepMeTHH$oDMaiiHflt 3aK.I05I. tbd.TOO. S 40260 ot 18.08.88 r.