Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений и создание биотехнологической платформы продукции фармацевтических белков

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений и создание биотехнологической платформы продукции фармацевтических белков"

005057621

КОМАРОВА Татьяна Валерьевна

Исследование роли транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений и создание биотехнологической платформы продукции фармацевтических белков

03.01.03—Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 8 АПР 2013

На правах рукописи

Москва - 2013

005057621

Работа выполнена в отделе химии и биохимии нуклеопротеидов НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Дорохов Юрий Леонидович

Официальные оппоненты:

Урываев Леовид Викторович, доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, Федеральное государственное бюджетное учреждение "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского" Минздравсоцразвития России, профессор.

Завриев Сергей Кнриакович, доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, профессор.

Дейпеко Елена Викторовна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, профессор.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук.

Защита состоится 28 марта 2013 года в 11 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" по адресу: 119234 Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан 25 февраля 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

_І

И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Произрастая в агробиоценозах, растения постоянно испытывают давление внешних факторов окружающей среды, как биотической, так и абиотической природы. Повреждающее воздействие ветра, осадков или фитофагов нарушают целостность покровных тканей растения, открывая путь для проникновения внутрь различных патогенов. Растения в ответ на вторжение вирусов и бактерий синтезируют макромолекулы (РНК и белки), транспортируемые в различные ткани и органы. Существует три уровня движения макромолекул по растению: (а) ядерно-цитоплазматический транспорт, включающий перемещение РНК из ядра в цитоплазму и движение белков, синтезированных в цитоплазме, в ядро; (б) межклеточное перемещение РНК и белка (ближний транспорт); (в) дальний транспорт по сосудистой системе растения белков и РНК, в том числе вирусных нуклеопротеидов. Вирусы и бактерии различаются между собой в способности эксплуатировать эти три уровня транспорта. Вирусы растений, большая часть из которых цитоплазматические РНК-содержащие вирусы, активно используют ближний и дальний транспорт для переноса генетического материала по растению. Бактерии, как внеклеточные патогены, не нуждаются в транспорте генетического материала по растению, однако при колонизации используют ядерно-цитоплазматический транспорт, вводя белковые факторы вирулентности в хозяйское ядро для его «переформатирования». Современное представление о вирусном и бактериальном патогенезе предполагает возможность конкурентных взаимоотношений между макромолекулами хозяина и патогена на уровне транспорта. Однако экспериментальных данных на этот счет недостаточно, что определяет актуальность исследования роли транспорта макромолекул в иммунитете растений.

При рассмотрении ядерно-цитоплазматического транспорта макромолекул в растении следует иметь в виду, что растения в ответ на внешнее воздействие и атаку патогена проявляют серию защитных реакций, включающих повышенную транскрипцию некодирующих и кодирующих участков генома, вовлеченных в адаптивные реакции растений. Ядро растительной клетки структурно и функционально отделено от цитоплазмы, поэтому ядерно-цитоплазматический экспорт РНК через ядерную пору играет фундаментальную роль в регуляции генома. В последние годы установлена важная роль коротких некодирующих РНК (кнРНК) в иммунитете растений и в проявлении защитных реакций в ответ на вирусную и/или бактериальную инфекцию. В частности показана связь между вирулентностью вирусов и уровнем накопления в цитоплазме кнРНК (Ваггш е/ а1., 2007, 2011). Более того, установлено, что суперэкспрессия кнРНК и увеличение их содержания в цитоплазме стимулирует репродукцию вируса табачной мозаики (ВТМ) фогокЬоу е( а!., 2006). Молекулярные механизмы этих явлений неясны и требуют дополнительных экспериментов для выяснения роли ядерного экспорта РНК в реакциях растений на бактериальную и вирусную атаку. Этим определяется необходимость создания экспериментальной модели экспорта мРНК, а также коротких

некодирующих РНК из ядра растительной клетки. На подобной модели можно охарактеризовать молекулярные механизмы конкуренции РНК за экспорт из ядра в цитоплазму и изучить участие ядерного транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений.

На втором уровне транспорта клеточных макромолекул, когда через плазмодесмы происходит перенос клеточных белков, например, транскрипционных факторов хозяина и кодирующих их мРНК, также может происходить конкуренция с вирулентными факторами патогенов, а именно, с вирусными транспортными белками (ТЕ) и эффекторными молекулами бактерий. Вероятность такой конкуренции до сих пор не исследовалась, прежде всего, из-за отсутствия адекватной экспериментальной модели, позволяющей изучать роль межклеточного транспорта в бактериальном и вирусном патогенезе в условиях, максимально приближенных к природным. В интактном растении табака только молодые (0,5-3,0 см) верхние быстрорастущие листья, являющиеся акцепторами (sink) фотоассимилятов, характеризуются наличием «открытых» плазмодесм и интенсивным межклеточным транспортом. Эти листья, однако, не представляют собой природных «ворот» инфекции и малопригодны для экспериментального заражения. С другой стороны, зрелые крупные (10-20 см) листья табака, являющиеся донорами (source) фотоассимилята и обычно использующиеся для экспериментального заражения ВТМ и бактериями, такими как Ralstonia solanacearum и Agrobacterium tumefaciens, содержат плазмодесмы, которые «закрыты» для крупных макромолекул. Пропускная способность плазмодесм «5оигсе»-листьев увеличивается при вирусной инфекции, например, с помощью транспортного белка вируса. Оптимальной экспериментальной системой могли бы быть растения, у которых плазмодесмы «sourcew-листьев «открываются» при воздействии газообразного вещества, не повреждающего листья и не вносящего в систему фактор травмы. Вообще, летучие органические вещества, которые могут играть роль сигналов коммуникации между растениями, известны достаточно давно. Среди них идентифицирован метанол, который образуются в реакции деметилирования пектина ферментом клеточной стенки табака, пектинметилэстеразой (ПМЭ). В нашей лаборатории этот фермент впервые был идентифицирован в качестве рецептора транспортного белка ВТМ (Dorokhov et al, 1999).

Использование разработанной экспериментальной системы контролируемого межклеточного транспорта позволит проверить выдвинутую ранее гипотезу относительно участия ПМЭ и метанола в регуляции межклеточного транспорта и патогенезе растений (Дорохов, 2007). Кроме того, именно в условиях данной системы появляется возможность исследования роли ПМЭ и метанола как факторов мобилизации растительного сообщества в ответ на травму и проникновение вирусного или бактериального патогена

В последние годы биотехнология рассматривает растения в первую очередь в качестве некоего «ферментера» рекомбинантных фармацевтических молекул, включая ферменты, вакцины и антитела. Поэтому другим направлением нашего исследования является выявление молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия растения и вируса в искусственных условиях растения-биофабрики. Наиболее эффективными оказались системы

продукции, основанные на введении вирусного вектора, кодирующего целевой белок, с помощью бактерии Agrobacterium tumefaciens в клетки растения Nicotiana benthamiana. Этот подход позволяет получить временную экспрессию гена целевого белка с высоким выходом конечного продукта и в короткие сроки (до 7 дней). Таким образом, мы рассматриваем возможность практического применения выявленных закономерностей переноса макромолекул хозяина и патогена в клетке и между клетками. Выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе таких систем экспрессии, также представляется актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является расшифровка молекулярных механизмов участия ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений, а также создание на их основе биотехнологической платформы продукции фармацевтических белков.

Для достижения вышеописанной цели поставлены следующие задачи:

1. Создать экспериментальную модель экспорта РНК из ядра растительной клетки.

2. Изучить молекулярные механизмы и создать концепцию участия ядерного транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений.

3. Разработать экспериментальную модель модификации межклеточного транспорта макромолекул в листьях растений с использованием газообразного метанола.

4. Исследовать молекулярные механизмы и роль транспорта макромолекул в иммунитете растений и создать концепцию конкуренции макромолекул хозяина и патогена на уровне ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта за общие рецепторы или белки переносчики.

5. Разработать биотехнологические основы эффективной продукции вакцин и антител в растении.

Научная новизна и практическая значимость работы

В результате проделанной работы нами создана модельная система для изучения способности кнРНК и коротких мРНК, индуцируемых стрессовыми воздействиями, подавлять ядерный экспорт хозяйской мРНК и мРНК зеленого флуоресцирующего белка, GFP. Создан набор генетических конструкций для синтеза РНК, направляемых ДНК-зависимой-РНК-полимеразой (Pol) I, II и III в растительной клетке. При ко-агроинфильтрации листьев N.benthamiana генетическими конструкциями, обеспечивающими синтез кнРНК клеточной Pol

II, совместно с конструкций, кодирующей GFP, наблюдалось значительное снижение уровня экспрессии последнего, в то время как кнРНК, синтез которых направляется в клетке Pol I или

III, не оказывали влияние на экспрессию гена GFP. Степень ингибирования экспрессии гена GFP, а также клеточного гена BiP напрямую зависела от длины некодирующего транскрипта и «силы» промотора. Показано также, что короткие транслируемые транскрипты, или короткие мРНК (кмРНК), также способны конкурировать за ядерный экспорт с другими более длинными мРНК. Гипотеза о том, что кнРНК и кмРНК могут блокировать ядерно-цитоплазматический

транспорт мРНК, участвующих в антивирусной защите клетки, подтверждена экспериментально. Показано, что при доставке в клетки растения плазмид, кодирующих короткие РНК, совместно с векторами, направляющими синтез РНК ВТМ или Х-вируса картофеля (ХВК), наблюдается значительное повышение эффективности репродукции вируса.

Предложены две схемы, «песочные часы» и «генные ворота», отражающие механизмы конкуренции между молекулами кнРНК/кмРНК и мРНК при прохождении ими ядерной поры.

Для исследования роли второго уровня транспорта в растении, движения макромолекул из клетки в клетку, разработана экспериментальная модель регулируемого межклеточного транспорта в листьях табака, когда после воздействия газообразного метанола на интактное растение, плазмодесмы его листьев «открываются». Эта модель позволяет изучать участие межклеточного транспорта в реакции растений на травму, вторжение вируса и бактериальных патогенов. Показано, что механическое повреждение листьев растения приводит к активному синтезу ПМЭ de novo, сопровождаемого повышением уровня образования и выделения в атмосферу метанола. Газообразный метанол или пары, испускаемые поврежденным растением, вызывают у соседних интактных растений устойчивость к бактериальным патогенам, R. solanacearum и A. tumefaciens. Были выявлены гены, индуцируемые метанолом (methanol-inducible genes, МИГ), большинство из которых связано с защитой растения и межклеточным транспортом. Среди них ген р-1,3-глюканазы (BG), ген NCAPP (non-cell-autonomous pathway protein) и ранее не идентифицированный ген, MIG-21. Эксперименты с ВТМ и вектором, кодирующим две тандемные копии GFP и используемым в качестве индикатора межклеточного транспорта, показали, что BG, MIG-21 и NCAPP вызывают увеличение пропускной способности плазмодесм, приводящее к повышению эффективности перемещения вирусной РНК из клетки в клетку. Показано, что газообразный метанол или пары, испускаемые травмированным растением, повышают эффективность репродукции ВТМ в соседних растениях. Был сделан вывод, что метанол, выделяемый поврежденными тканями, индуцирует повышение экспрессии генов межклеточной коммуникации (BG, MIG-21 и NCAPP) в соседних растениях и приводит к более активному транспорту в нем РНК ВТМ. Выявлено участие ПМЭ и метанола в блокаде ядерно-цитоплазматического транспорта. Создана модель, согласно которой бактериальные белки, содержащие сигнал ядерной локализации (nuclear localization signal, NLS), конкурируют с ТБ ВТМ за NCAPP, играющий роль рецептора и переносчика хозяйских и вирусных транспортных белков.

Выявленные закономерности ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта в растении позволили разработать биотехнологическую платформу продукции вакцин и антител. Создан новый вирусный вектор на основе генома X вируса картофеля, а также впервые создана эффективная система транзиентной экспрессии в растительной клетке на основе транскрипционной кассеты РНК-полимеразы I. Разработан метод продукции в растении гуманизированного моноклонального антитела трастузумаб, применяемого в лечении рака молочной железы; определены параметры конструирования вакцинных наночастиц на основе

вирионов ВТМ. Кроме того доказана биологическая безопасность Agrobacterium tumefaciens для млекопитающих: эта бактерия при экспериментальной бактериемии не вызывает трансформацию клеток органов мыши.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании ученого совета НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ 18 июня 2012 года. Материалы работы докладывались на международных конференциях: на конференциях Plant-based Vaccines and Antibodies (проводятся раз в два года) 2007-2011 гг., на всех конгрессах FEBS с 2008 по 2012 гг, на конгрессах FESPB 2008 и 2010 гг.

Публикации. По результатам работы подготовлено 22 публикации в рецензируемых научных изданиях, в том числе 2 главы в монографиях, 1 обзорная статья в международном периодическом издании Expert Review of Vaccines. Авторские права в биотехнологических разработках Т.В.Комаровой защищены 5 патентами. Основные результаты и теоретические обобщения опубликованы в ведущих российских и международных журналах [Acta Naturae, Биохимия (Москва), FEBS Journal, Plant Molecular Biology, PLoS One, PLoS Pathogens, Tuberculosis,Virology].

Структура работы и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Имеющиеся данные относительно роли транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе оставляют неизученными целый ряд вопросов. Приступая к работе, мы придерживались следующей гипотезы: в ответ на стрессовые воздействия в растительной клетке повышается уровень транскрипционной активности, в результате чего возможно возникновение конкуренции между кнРНК и клеточными мРНК за экспорт из ядра в цитоплазму. Мы предположили, что поскольку короткие РНК могут синтезироваться в ядре с более высокой эффективностью, а, следовательно, в ббльшем количестве, чем относительно длинные интронированные пре-мРНК, то произойдет вытеснение мРНК из экспорта, и какая-то доля мРНК останется в ядре, не достигнув цитоплазмы. При такой конкуренции в проигрыше окажутся, прежде всего, длинные мРНК, например мРНК белков, участвующих в защитной реакции умолкания генов, дайсер (англ. Dicer) и аргонавт (англ. Argonaute), дайна которых превышает 6 тысяч оснований. Снижение эффективности экспорта таких мРНК в цитоплазму вызовет дефицит белков, участвующих в сайленсинге, т.е. в специфической деградации РНК патогена. Недостаток в клетке молекул дайсера или аргонавта послужит причиной повышения стабильности и уровня накопления вируса. Если применить эти соображения к бактериальной инфекции, то избыточный синтез кнРНК на раннем этапе заражения может блокировать экспорт

Pol ІРК-(СААА)„

Рис. 4. Синтезируемые Pol 11 кнРНК снижают уровень экспрессии 3SS-GFP. А. Экспрессия GFP на 3 день после агроинфильтрации 35S-GFP и конструкций, кодирующих (GAAA)|6 в составе транскрипционных кассет Pol I, Pol II и Pol III. Контроль: ко-инфильтрация 35S-GFP с pBinl9. Визуализация зон экспрессии GFP при помощи УФ-света. Б. Флуориметрический анализ количества GFP в зонах листа, представленных на панели А. Контроль принят за 100 относительных единиц флуоресценции1. Данные получены в 5-S независимых экспериментах".

На следующем этапе мы исследовали вопрос, существует ли конкуренция между мРНК и молекулами кнРНК, синтез которых направляется Pol TRNA-, Pol II35S- и Pol IIIlRNA. Для этого мы использовали транскрипт гена GFP в качестве индикатора экспорта мРНК и набор генетических конструкций, содержащих последовательность (G A A A) is в составе транскрипционных кассет Pol I, Pol II и Pol III. Мы показали, что в отличие от Pol IrRNA-(GAAA),s и Pol III,rna-(GAAA)i6, ко-агроинъекция листьев 35S-GFP и Pol II35S-(GAAA)k; приводила к подавлению экспрессии GFP (Рис. 4А). Как видно из гистограммы (Рис. 4Б), эффективность накопления GFP падает в 210 раз (в зависимости от количества GAAA-повторов) по сравнению с контролем, что указывает на возможную конкуренцию РНК GFP и (GAAA)„, синтезированных Pol И, за экспорт из ядра. В пользу этого предположения свидетельствовуют наши результаты, указывающие на то, что экспрессия GFP и экспорт мРНК GFP не подавлялись в случае синтеза (GAAA)k; непосредственно в цитоплазме с субгеномного промотора вирусного вектора на основе ХВК (данные не представлены). Наблюдаемый нами феномен не связан с конкуренцией промоторов Pol II35S за полимеразу Pol II. В пользу этого заключения свидетельствуют две группы данных. Во-первых, введение интрона в ген GFP (GFPi) повышает уровень экспрессии этого гена, несмотря на присутствие в клетке Pol II35S-(GAAA)i6 или Pol II35S-(MS2-H)4 (данные не представлены). Эти результаты указывают на важную роль сплайсинга, но не на конкуренцию промоторов.

1 Здесь и далее интенсивность флуоресценции представлена в относительных единицах.

2 Здесь и далее планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.

Для максимального приближения к природной ситуации желательно наличие модельной системы, в которой изменение (активизация) межклеточного транспорта, а именно, расширение плазмодесм, может вызываться при воздействии некоего газообразного вещества, не повреждающего листья и не вносящего в систему фактор травмы.

Ранее в нашей лаборатории было показано участие ПМЭ в контроле межклеточного транспорта вирусной РНК (Dorokhov et al„ 2006) и высказана гипотеза об участии в этом процессе газообразного продукта реакции, осуществляемой ПМЭ, метанола (Дорохов, 2007). Здесь мы описываем создание системы, в которой газообразный метанол, испускаемый травмированным растением, воздействует на соседнее интактное растение, вызывая в нем изменение межклеточного транспорта. Работа по созданию системы была проведена в два этапа. Первый этап - разработка метода количественного измерения газообразного метанола, испускаемого травмированным растением. На втором этапе мы определили состав газов и количественные параметры эмиссии метанола интактным и травмированным растением.

5.1. Разработка метода количественного измерения газообразного метанола, испускаемого травмированным растением. Определение количества газообразного метанола представляется технически сложной задачей. Метанол - полярная молекула, хорошо растворимая в воде, и это свойство создает проблемы при измерении концентрации метанола в газовой фазе существующими приборами. Во-первых, метанол сорбируется в водном конденсате в трубках на пути к детектору. Во-вторых, удаляется вместе с водой в случае наличия ловушки для дегидратации перед газовой хроматографией (GC). Кроме того применение GC-MS осложняется тем, что молекулярная масса метанола 32, как и для О2, следовые количества которого всегда присутствуют в газовой смеси. Использование электронной ионизации (EI) для MS не является оптимальным для анализа метанола, т.к. требуется предварительное концентрирование, подразумевающее использование сорбентов и элюцию органическими растворителями (например, диэтиловым эфиром). В случае дорогостоящей химической (протонной) ионизации (PTR-MS) в предварительном концентрировании нет необходимости, однако проблема сорбции метанола в конденсате не снимается. Мы разработали собственный менее затратный способ оценки количества газообразного метанола, выделяемого листьями растений. Перепробовав несколько агентов-ловушек (декан, октан, гексан, ацетонитрил), мы остановились на воде, отличающейся высокой эффективностью сорбции газообразного метанола, а также безвредностью для растений. Таким образом, была решена проблема оценки малых количеств метанола в газовой фазе, т.к. при адсорбции в воде проходило естественное концентрирование, кроме того, измерение концентрации метанола в растворе не вызывает в настоящее время технических затруднений. Мы измеряли метанол, выделяемый растением, в двух системах: закрытой (Рис. 18А) и проточной (Рис. 18Б).

IwHI.IV»

: В№М>1.3

/ h ¿г

GC

Б

С,С

Рис. 18. Система для оценки количества газообразного метанола в среде. А Закрытая система представляет собой герметичный сосуд с внесенной каплей воды, в которой после инкубации в течение заданного времени определяется концентрация метанола. Б. Проточная система состоит из сосуда с образцом, через который постоянно проходит воздух с определенной скоростью, и водяной ловушки, в которой сорбируется метанол из проточного воздуха. После инкубации в течение заданного времени жидкость из водяной ловушки анализируется с помощью газовой хроматографии (вС) на наличие метанола, определяется его концентрация.

В первом случае лист растения помещали в герметичный сосуд объемом 150 мл, куда вносили каплю воды (300 мкл). Газообразный метанол, выделяемый листом, переходил в водную фазу капли. Согласно закону Генри через некоторое время наступало равновесие между газообразным и растворенным в воде метанолом. По содержанию метанола в воде можно было уверенно судить о его содержании в воздухе. Во втором варианте, проточной системе, инкубация листа проводилась в сосуде, через который с постоянной скоростью проходил воздух, после камеры с листом пропускаемый через водяную ловушку, где и сорбировался газообразный метанол. Затем в содержимом водяной ловушки определялась концентрация метанола.

« 25

си контроль

а поврежденный

Рис. 19. Измерение количества газообразного метанола,

выделяемого повревденным

листом, в закрытой системе. Листья N. benthamiana (0,5-0,7 г) были повреждены при помощи обработки целлитом и помещены в герметично закрытый сосуд. Через 30-, 60- и 180 мин измерялось содержание метанола в капле воды.

30

60

Время, мин

180

Для проведения точных измерений, во-первых, учитывалась температура окружающей среды, а во-вторых, были построены калибровочные кривые, которые получали в соответствующих реконструкционных модельных экспериментах, как для закрытой емкости, так и проточной системы. Для этого в систему на дно сосуда вносили известное количество

метилсалицилат и метилжасмонат, не детектируются. Присутствие цис-З-гексен-1-ола в смеси с метанолом осложняет интерпретацию результатов, особенно в связи с обнаружением способности цис-З-гексен-1-ола индуцировать в растении эмиссию метанола (Рис. 22). Используя проточную систему (Рис. 22А), мы определили количество метанола, который выделяется растением, инкубируемым в присутствии паров цис-З-гексен-1-ола (Рис. 22Б).

метанол

РМЕ

трансген

поврежден ный лист

цис-З-гексен-1-ол

контроль

РМЕ

трансген

поврежден ный лист

Рис. 21. Количество выделяемого растением метанола и цис-З-гексен-1-ола Измерения проводились в закрытой системе для интактного, поврежденного и трансгенного по ПМЭ листьев N. 1аЬасит после инкубации в течение 3 часов. Н.д. - не детектируется.

а.»

5 •

5 в

н 6

ОС

0.17 0.85

цис-З-гексен-1-ол, ЦТ

Рис. 22. Цис-З-гексен-1-ол индуцирует эмиссию метанола листьями. А. Проточная система, в которой входящий воздух пропускается через камеру с различными количествами цис-З-гексен-1-ола. йС, газовая хроматография. Б. Количество метанола, выделяемое листьями в ответ на обработку цис-З-гексен-1-олом.

Следовательно, необходимо было создать условия, при которых цис-З-гексен-1-ол удаляется из газовой смеси, выделяемой поврежденными тканями, либо метанол является единственным ЛОС. В качестве модельной системы в этом случае мы использовали растение ШсоЧапа ЬлЪасит, трансгенное по ПМЭ. Оно характеризуется тем, что выделяет в атмосферу повышенное количество метанола по сравнению с интактным растением, однако, в отличие от

поврежденного, не эмитирует цие-З-гекеен-1-ол (Рис. 21). Мы использовали табак, трансгенный по ПМЭ, наряду с поврежденными растениями для дальнейших исследований.

Таким образом, нами определены параметры и дизайн системы, позволяющей исследовать иммунитет интактного неповрежденного растения, обработанного газообразным метанолом.

5.3 . Идентификация в растении генов чувствительных к метанолу. Для того чтобы более полно охарактеризовать систему, а также изучить механизмы воздействия метанола на иммунитет растения, мы использовали библиотеку кДНК растений N. ЬеШкатгапа, полученную с помощью прямой и обратной супрессионной вычитающей гибридизацией (СВГ), до и после обработки растений парами метанола. В результате мы выявили 359 дифференциально-экспрессирующихся клонов кДНК, из которых 320 - это транскрипционно-активные гены листьев, обработанных метанолом. Для дальнейшего анализа мы использовали только гены, экспрессия которых усиливается при действии метанола. Большинство генов (167 генов), чувствительных к метанолу, попадают в разряд стресс-индуцируемых. Активность выявленных СВГ МИГов была подтверждена «псевдонозерном».

Для дальнейшего анализа мы отобрали 5 генов, наиболее чувствительных к воздействию метанола (Табл. 2). Среди них ранее неидентифицированный ген, кодирующий белок с молекулярной массой около 21 кДа. Мы назвали его метанол-индуцируемым геном-21 (МЮ-21) (ЕМВЬ ОепВапк ОШ28961) (Табл. 2, Рис. 23).

Таблица 2. Гены, индуцируемые метанолом, отобранные по результатам супрессионной вычитающей гибридизации для дальнейшего анализа.

МИГи N. benthamiana кол-во клонов Функция МИГа

Р-1,3-глюканаза (BG) 51 Межклеточный транспорт, регуляция пропускной способности плазмодесм

Ингибитор протеазы II (PI-II) 24 Противогрибная и антибактериальная защита

Метанол-индуцируемый ген 21 (MIG-21) 22 Межклеточный транспорт, регуляция пропускной способности плазмодесм4

Ингибитор ПМЭ (PMEi) 7 Противогрибная и антибактериальная защита

Non-cell autonomous pathway protein (NCAPP) 3 Межклеточный транспорт

4 Предположительно

МАЗЬОСНКРАОНАРЗТЪСОКТТТУТСЫКАЫЫЕННЗ ЕАОКМКОМТОКМУНН —5 О РЗНЫНОЗАСНСТКТООГААСНСТКТООЗААСНСТКТООЗАА5НКТКТООТ-ЮО АСНСТЗАЫСТКТОЬ5УАСНСТКТООЗАА5НСТКТООТАСНСТЗАТАТНАК-150 АССКККЕСЗГМНКМКООМКЗККЫКЫКОСЗСЗОСЗОЗЗЗЗЗЗЗОЕЗОЫЕЫС-2 00

СКТКЫНСЭС -2 0 9

Рис. 23. Аминокислотная последовательность ранее неидентифицированного белка МЮ-21 из КЬеШНатшпа. Подчеркнуты повторяющиеся аминокислотные участки.

С помощью количественного ПЦР в реальном времени мы подтвердили, что уровень накопления мРНК отобранных нами генов зависит от концентрации (Табл. 3) и времени воздействия метанола (Рис. 24).

Таблица 3. Изменение уровня накопления мРНК МИГов в ответ на метанол.5

Кол-во внесенного метанола (мг) Содержание метанола6 (рг/г листа) Относительное количество мРНК МИГов МЬепіИатіапа

ва ЫСАРР МЮ-21 РМЕІ РМЕ РІ-ІІ

40 17,5 118.7±4.01 9.89±2.67 3.60±0.80 1.92±0.63 1.03±0.33 1.32±0.42

160 70,0 398.53±12.93 48.84±5.19 17.51±2.60 9.7ІІІ.31 1.54±0.47 7.11±0.68

0 1.1±0.1 1.00±0.25 1.00±0.26 1.00±0.2б 1.00±0.39 1.00±0.32 1.00±0.33

Збч ■ 12 ч

г

Рис. 24. Повышение уровня накопления МИГов в ответ на обработку N. ЬепЧтт'шпа метанолом. Проводилась

инкубация целых растений в 20-л эксикаторе, в который было внесено 160 мг метанола, в течение 6, 12 или 24 часов. Контроль -интактное растение, принят за 1. По оси У шкала логарифмическая.

Ген ПМЭ очевидно не чувствителен к метанолу, поскольку его активность при действии метанола на лист изменялась незначительно (Табл. 3), в то время как уровень накопления мРНК гена ЫСАРР увеличивался почти в 50 раз после 18-ч инкубации в атмосфере с повышенным

содержанием метанола.

5 Инкубация растения с метанолом проводилась в течение 18 часов в герметично закрытом 20-л эксикаторе. В первой колонке указано количество метанола, вносимого в этот объем.

с' Содержание метанола в эксикаторе на момент окончания инкубации растения с метанолом (первая и вторая строки) или интактного растения (третья строка).

подобный белок (PR-4), липоксигеназа (LOX), фенилаланин-аммоний-лиаза (PAL) и фарнезилпирофосфат синтаза (FPS). Мы исследовали изменение экспрессии перечисленных генов в ответ на воздействие метанола и показали (Рис. 28), что уровень накопления мРНК LOX, PR-3, PR-4, FPS и PAL в растении, обработанном метанолом, увеличивается незначительно. Обработка цис-З-гексен-1-олом стимулировала транскрипцию FPS гена, в то время как этилен, метилсалицилат и метилжасмонат повышали активность, главным образом, генов PAL и PR-4. Мы заключили, что МИГи являются специфическими генами, индукция которых осуществляется только под воздействием газообразного метанола.

6. Исследование участия метанола в межклеточном транспорте растений.

Повышение транскрипционной активности МИГов, вовлеченных в межклеточный транспорт (BG, NCAPP), позволяет предполагать, что в растении, находившемся под воздействием газообразного метанола, повышена пропускная способность плазмодесм и активизирован межклеточный транспорт макромолекул. Для характеристики состояния межклеточного транспорта в листьях растений, обработанных метанолом, мы использовали репортерные макромолекулы, с помощью которых оценивали пропускную способность плазмодесм. Мы выбрали белковую молекулу, тандем GFP (2xGFP) (мол.масса 27х2=54кДа), которая в норме не может переходить из одной клетки в другую через плазмодесмы зрелого листа, поскольку их пропускная способность ограничивается белковыми молекулами до 47 кДа (Crawford and Zambryski, 2000). Переход 2xGFP из одной клетки в другую свидетельствует об «открытом» состоянии плазмодесм, когда их пропускная способность повышается. Итак, для мониторинга межклеточного транспорта мы выбрали наблюдение за 2xGFP. Плазмида, кодирующая 2xGFP, вводилась в клетки при помощи агроинъекции (Stonebloom et ai, 2009). Чтобы наблюдать одиночные сайты агроинфекции, мы вводили в лист разведенные (ODcoo-O.Ol) бактериальные суспензии. Растения подвергали воздействию паров метанола, а затем через 30 часов после агроинъекции подсчитывали кластеры светящихся клеток с помощью флуоресцентного светового микроскопа.

Число светящихся эпидермальных клеток, окружающих клетку, в которую была введена ДНК IxGFP, обеспечивает количественную характеристику межклеточного транспорта. Когда плазмодесмы «закрыты», видны одиночные светящиеся клетки (Рис. 29А, верх). Когда плазмодесмы «открыты», флуоресцентный сигнал распределен между двух- или трех-клеточными кластерами (Рис. 29А, низ). В контрольном растении около 6% сигналов распределено между 2-3-клеточными кластерами (Рис. 29Б). Эти наблюдения согласуются с имеющимися данными по перемещению 2xGFP в растительной ткани (Crawford and Zambryski, 2000). Когда исследовали растения, обработанные метанолом, то отмечали усиление межклеточного транспорта, т.е. более чем 20% флуоресцентных сигналов было распределено между 2-3-клеточными кластерами. Важно, что в контрольных листьях только 1% сигналов обнаруживался в 3-клеточных кластерах, а после обработки метанолом их доля поднималась до 7%. Оценка достоверности с помощью двухвыборочного критерия Стьюдента подтвердила

Аналогичный результат получен и при инкубации растения-ресивера в атмосфере с повышенным содержанием паров метанола.

Рис. 35. Метанол повышает чувствительность растения к ВТМ. Схематическое изображение эксперимента: растение-ресивер в течение 18 часов инкубировалось в проточной системе, воздух к ресиверу непрерывно поступал из эксикатора с поврежденным растением, после чего растение-ресивер заражалось ВТМ (сверху). Оценка уровня накопления РНК ВТМ в ресивере (N.benthamiana) через 48 ч и 72 ч после заражения. Количество РНК ВТМ, детектируемое через час, принято за 1. 120# - относительно количество РНК ВТМ в системно-зараженном верхнем листе через 5 суток после инфекции (снизу).

На следующем этапе мы использовали проточную систему (Рис. 35, верх). Результаты, представленные на диаграмме рисунка 35 (низ) после статистического анализа, подтверждают вывод, сделанный выше: растение, предварительно инкубированное с поврежденным растением или химически чистым метанолом, приобретает повышенную чувствительность к ВТМ.

Мы заключили, что метанол, выделяемый поврежденным растением, способен вызвать в соседнем растении синтез МИГов, «раскрытие» плазмодесм, и, как следствие, увеличение репродукции ВТМ.

8. Активизация межклеточного транспорта в растении связана с развитием антибактериальной устойчивости.

8.1. Индукция антибактериальной устойчивости в листьях, обработанных газообразным метанолом и цис-З-гексен-1-олом в закрытой системе. Современные представления о молекулярных механизмах бактериального патогенеза отмечают важную роль транспорта бактериальных факторов вирулентности из цитоплазмы клетки в ее ядро для обеспечения бактериальной колонизации (Deslandes and Rivas, 2012). Исходя из нашей гипотезы о связи ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта, мы предположили, что метанол,

18чнххубіцняв про точно к eue теме

—у ___

Энкпер І

Л

V..............J

Ресивер

w

HF

j заражение

□ контроль

g ресивер

48 72 121

Время после инокуляции БТМ, ч

(столбик №1). Хотя ЯМЭ-трансген оказывал менее выраженное действие на размножении R. зо1апасеагит в ресивере, однако оно представляется статистически значимым, и степень ингибирования коррелирует с уровнем эмиссии метанола (Рис. 21).

8.3. Индукция антибактериальной устойчивости в листьях растений, обработанных газообразным метанолом в проточной системе. Для окончательного доказательства роли метанола, как передаваемого по воздуху сигнала, мы воспользовались проточной системой (Рис. 39А), которая подразумевает постоянное поступление воздуха от ЯМЭ-трансгена или поврежденного растения в эксикатор с интактным растением-ресивером. После подобной обработки растение-ресивер удаляли из эксикатора и вводили в него суспензию R. ¡о!апасеагшп. Результаты, представленные на диаграмме рисунка 39Б, показывают, что растение-ресивер, получавшее воздух из эксикатора с растением-эмиттером, ЯМЭ-трансгеном или поврежденным растением, приобретало антибактериальную устойчивость. Статистический анализ подтверждает этот вывод. Интересно, что в соответствии с нашими ожиданиями, поврежденный ЯМЭ-трансген (по сравнению с интактным ЯЛ/Э-трансгеном) в качестве эмиттера вызывал более выраженную устойчивость растения-ресивера (столбик №4).

8.4. Влияние метанола на число фокусов экспрессии йРР в листьях, агроинъецированных вирусным вектором крВТМ:йРР. Антибактериальный эффект метанола проявляется также на растениях, инфицированных А. Ште/ас1епз. Это отчетливо было видно в опытах, описанных выше, когда растения агроинъецировали вирусным вектором крВТМ^^Р (Рис. 30). Показано, что число светящихся локусов в листьях, падает в листьях растений, обработанных метанолом (Рис. 40). Таким образом, метанол вызывает устойчивость как к бактерии R. воШпасеагит, так и А. Ште/аЫет.

1 § з

к Ц; о и

в §

** * т

обработка метанолом

Рис. 40. Оценка количества фокусов экспрессии ОГР

в листьях Ы.ЬеЫИат^апа, инкубированных с газообразным метанолом перед агроинфильтрацией крВТМ^Л3 по сравнению с растением, не подвергавшимся воздействию метанола.

В целом, мы заключаем, что метанол является тем передаваемым по воздуху сигналом, который вызывает в растениях (а) устойчивость к бактериям и (б) повышение пропускной способности плазмодесм, а также (в) активизацию межклеточного транспорта макромолекул.

инфицированию растений тыквы (Mauk et al., 2010). Таким образом, человек на полях, засеянных монокультурой, возделывал ее, повреждая растения, т.е. создавал благоприятные условия для распространения вирусных инфекций в условиях сниженного давления экологических факторов сдерживания популяции переносчиков.

В большинстве случаев, вирус, как внутриклеточный паразит, не вызывает гибели растения-хозяина, а бактериальная инфекция зачастую приводит к отмиранию тканей и смерти растения. Кроме того, факторы вирулентности бактерий могут имитировать какие-либо клеточные белки, «обманывая» защитные системы растения. Таким образом, наибольшую потенциальную опасность для растения представляют именно бактериальные патогены, вероятно поэтому в первую очередь необходимо создание условий, максимально препятствующих именно бактериальной колонизации растения.

С другой стороны, растения могли получить эволюционное преимущество благодаря бактериальной и вирусной инфекции, однако в этом случае патоген не должен приводить к гибели растения. И действительно, подтвержден факт горизонтального переноса генов (ГПГ) в случае бактерии Agrobacterium rhizogenes, вызывающей разрастание тканей хозяина, но не гибель. Однако, наибольшее количество обнаруженных случаев ГПГ связано С вирусами (Talianova et al., 2011). Т.е. благодаря патогенам и в значительной степени вирусам, происходило повышение генетического разнообразия растений (Murad et al., 2004), в том числе приводящее к приобретению устойчивости (Bertsch et al., 2009).

10. Исследование роли метанола и NCAPP в модификации ядерно-цитоплазматического транспорта клетки.

Приступая к исследованию вопроса, как активизация межклеточного транспорта в листе может препятствовать бактериальной колонизации растения, мы учитывали три обстоятельства. Первое, имеется тесная связь между ядерно-цитоплазматическим и межклеточным транспортом транскрипционных факторов, например таких как KNOTTED 1 (KN1) и SHORT-ROOT (SHR) (Gallagher and Benfey, 2009). Второе, для успешной колонизации листа бактерии необходимо ввести в ядро клетки хозяина белки, выполняющие функцию транскрипционных факторов, в том числе белки III и IV типа секреции, например, РорР2 R.solanacearum и Vir-белки A.tumefaciens (Deslandes et al, 2003). Третье, ранее в нашей лаборатории было показано, что ПМЭ способна блокировать ядерно-цитоплазматический транспорт белков, таких как фактор умолкания генов дайсер DCL1 (Dorokhov et al, 2006).

На первом этапе исследования мы изучили способность газообразного метанола, являющегося продуктом реакции деметилирования пектина ПМЭ, вызывать блокаду ядерного импорта белков. Для этой цели мы создали генноинженерные конструкции, кодирующие GFP, слитый с сигналом ядерной локализации. Первый вариант, GFP:NLSpTa моделировал клеточный ядерный белок и представлял собой GFP, слитый с сигналом ядерной локализации (NLS) протимозина альфа. Второй вариант, GFP:NLSPopP2, служил моделью бактериального вирулентного фактора и представлял собой GFP, слитый с NLS белка РорР2 R. solanacearum III

На следующем этапе мы исследовали способность NCAPP в качестве одного из МИГов взаимодействовать с GFP:NLSpTa или GFP:NLSPopP2 и блокировать их доставку ядро. Мы ожидали, что в соответствии с данными лаборатории Лукаса (Lee et al., 2003), первооткрывателя NCAPP, этот белок может взаимодействовать с NLS транскрипционных факторов и блокировать их доставку ядро.

Таблица 5. Газообразный метанол вызывает нарушение импорта ядерных белков.

Конструкция Инкубация с метанолом % клеток с цитоплазматической локализацией GFP

GFP:NLSpT" нет 32,14±7,34

да 83,6±12,40

GFP:NLSPopP2 нет 16,25±2,53

да 57,50±5,92

Таблица 6 показывает, что в соответствии с нашими данными (ОогокЬоу е1 ей., 2006), введение в клетку конструкции, кодирующей предшественник ПМЭ (ргоРМЕ), вызывает подавление импорта в ядро ОРР:ЫЬ8рТа и ОРР:ЫЬ8РорР2. ЫСАРР также эффективно препятствует ядерному импорту модельных белков: число клеток с цитоплазматической флуоресценцией возрастает более, чем в два раза. Важно отметить, что стабильность химерных ОРР в клетке в присутствии ЫСАРР или ргоРМЕ не изменяется (Рис. 43).

Таблица 6. ПМЭ и NCAPP вызывают нарушение импорта ядерных белков.

Конструкция Ко-инъекция % клеток с цитоплазматической локализацией GFP

GFP:NLSpT° нет 15,50±1,34

NCAPP 41,30±1,31

ргоРМЕ 93,80±0,60

GFP:NLSPopP2 нет 16,25±2,53

NCAPP 57,50±5,92

ргоРМЕ 43,20±1,40

Результаты в пользу гипотетической функции NCAPP как рецептора клеточных транспортных белков (Lee et al., 2003), позволили нам предположить участие NCAPP в качестве их переносчика. Следует ожидать, что GFP:NLSpTl в присутствии NCAPP может перемещаться в соседние клетки, т.е. NCAPP может переносить GFP:NLSpT" из клетки синтеза в соседние, в результате чего число светящихся клеток увеличивается. Действительно, мы обнаружили в листьях N. benthamiana, агроинъецированных GFP.NLSpTa, что количество клеток, содержащих GFP-NLS, увеличивается в два раза в присутствии NCAPP (Рис. 44).

процессам ядерного сплайсинга, через которые проходит соответствующая РНК при доставке генетического материала агроинъекцией. В этом случае удаление присутствующих в РНК ВТМ криптических интронов, узнаваемых системой сплайсинга, приводит к потере инфекционности вирусной РНК. В нашей работе исследована возможность создания векторной системы, эксплуатирующей транскрипцию РНК-полимеразой I и не требующей сплайсинга. Для этого кДНК крВТМ была поставлена под контроль промотора рибосомной РНК (Pol IrRNA), ген белка оболочки замещен геном, кодирующим GFP и, таким образом, получен вектор Pol IrRNA-KpBTM-GFP. Нами показано, что при агроинъекции листьев полученным вектором наблюдается продукция GFP. Это происходит, по-видимому, при участии матрицы крВТМ-GFP, не содержащей кэпа, поскольку в природе РНК-полимераза I участвует в синтезе некэпированной рРНК. Уровень синтеза GFP низок, но возрастает в 100 раз при коинъекции векторами, кодирующими метилтрансферазу крВТМ и супрессор сайленсинга вируса кустистой карликовости томатов. Таким образом, создана транзиентная система экспрессии в растении на основе вирусного вектора под контролем промотора генов рРНК.

11.1.2. Интрон-содержащий вектор на основе генома крВТМ. Другим способом модификации вирусного генома для повышения эффективности выхода из ядра соответствующей РНК является удаление последовательностей, узнаваемых системой сплайсинга как критические интроны, и введение природных интронов. Аналитическая работа по выявлению критических интронов в последовательности генома крВТМ, внесение необходимых мутации, а также введение природных интронов из генов растений была осуществлена в группе Ю.Глеба (Giritch et al., 2006). На основе ранее созданного в нашей лаборатории вектора KpBTM.GFP (Dorokhov et al., 2006) и интрон-содержащего провектора pICH17388 (5-концевая часть которого включает в себя последовательность репликазы и ТБ крВТМ) (Giritch et al., 2006) был сконструирован новый вирусный вектор, имеющий 8 интронов в гене репликазы - KpBTM(n):GFP. В дальнейшем этот вектор использовался как в экспериментах по изучению ядерно-цитоплазматического транспорта РНК, так и для продукции терапевтических белков (антител и химерных вирусных частиц) в растении.

11.2. Технологическая платформа продукции фармацевтических препаратов в растении.

Растение, как фабрика рекомбинантных фармацевтических продуктов, помимо отсутствия у него патогенных для человека вирусов, привлекает низкой себестоимостью продуцируемого белка и способностью растений синтезировать ферменты, вакцины и антитела. В данном разделе работы на примере продукции антираковых антител создана эффективная система экспрессии фармацевтических белков в растении. Впервые разработана система продукции в растении антитуберкулезных вакцинных белков. Созданы эффективные системы повышения продукции белка, основанные на использовании кнРНК. А главное, созданы (а) вирусные наночастицы с экспонированными на их поверхности вакцинными эпитопами онкогена HER2/neu; (б) антитела против фактора роста эндотелия сосудов, позволяющее блокировать рост опухоли за счет подавления ее васкуляризации; (в) антитела против онкогена

НЕИ2/пеи для лечения рака молочной железы и продемонстрирована их более высокая противоопухолевая активность по сравнению с коммерческими препаратами. Использование результатов данной работы должно привести к благоприятным микро- и макроэкономическим эффектам, таким как, совершенствование технологий в фармацевтической индустрии; потенциальное импортозамещение препаратов из наиболее дорогостоящего сегмента лекарственных и диагностических средств; снижение себестоимости продукции. Доказана биологическая безопасность АЛите/ааею для млекопитающих: при экспериментальной бактериемии А. ште/аЫею не вызывает трансформацию клеток органов мыши.

ВЫВОДЫ

1. Разработана экспериментальная модель экспорта РНК из ядра растительной клетки, позволяющая исследовать перемещение в цитоплазму молекул коротких некодирующих РНК, синтезированных в ядре ДНК-зависимыми РНК-полимеразами I, II и III.

2. С помощью разработанной системы, был открыт новый механизм конкуренции за ядерный экспорт между кнРНК и кмРНК, с одной стороны, и другими более длинными мРНК, с другой стороны, характеризующийся следующими свойствами:

а) экспорт из ядра в цитоплазму молекул РНК, синтезируемых в ядре РНК-полимеразой I, II или III, самостоятелен и не зависит друг от друга;

б) конкуренция приводит к подавлению синтеза в цитоплазме репортерного белка вРР и клеточного белка В1Р;

в) ингибирование экспрессии мРНК не связано с конкуренцией промоторов Ро! Н3" за РНК-полимеразу II, но напрямую зависит от длины транскрипта и «силы» транскрипционного промотора;

г) молекулы кнРНК, синтез которых в ядре направляется РНК-полимеразами I или III, не оказывают влияния на экспрессию мРНК;

д) синтез в ядре кнРНК или кмРНК создает благоприятные условия для репродукции в цитоплазме вирусного вектора.

3. Разработана концепция конкуренции макромолекул на этапе ядерного транспорта в бактериальном и вирусном патогенезе растений.

4. Создана новая экспериментальная функциональная модель межклеточного транспорта, основанная на открытии важной роли метанола в жизни растений и его участии в:

а) контроле генов, регулирующих устойчивость растений к абиотическим и биотическим факторам;

б) передаче сигнала от растения к растению, приводящего к мобилизации защитных реакций растения;

в) межклеточном транспорте макромолекул;

г) создании условий, благоприятных для репродукции вирусов;

д) создании условий, препятствующих бактериальной колонизации.

5. Изучены молекулярные механизмы и определена роль транспорта макромолекул в иммунитете растений, создана концепция конкуренции макромолекул хозяина и патогена на уровне ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта за общие рецепторы и/или белки переносчики.

6. Разработана технологическая основа эффективной продукции вакцин и антител в растении, основанная на выявленных закономерностях ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта макромолекул в растении.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Комарова Т.В., Шеваль Е.В., Поздышев Д.В., Колесникова B.C., Дорохов Ю.Л. Интенсивный синтез зеленого флуоресцирующего белка ведет к формированию Y-тел включения в растительной клетке. // Биохимия. 2012. Т. 77. С. 742-749.

2. Комарова Т.В., Шварц A.M., Макаров А.А., Дорохов Ю.Л. (2012) Новый вирусный вектор, эксплуатирующий транскрипцию РНК-полимеразой I. // Биохимия. 2012. Т. 77. С. 649-656.

3. Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Petrunia I.V., Frolova O.Y., Pozdyshev D.V. and Gleba Y.Y. Airborne signals from a wounded leaf facilitate viral spreading and induce antibacterial resistance in neighboring plants. // PLoS Pathogens. 2012. V. 8. el002640.

4. Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Petrunia I.V., Kosorukov V.S., Zinovkin R.A., Shindyapina A.V., Frolova O.Y., and Gleba Y.Y. Methanol may function as a cross-kingdom signal. // PLoS One. 2012. V. 7. e36122.

5. Pozdyshev D.V., Komarova T.V., Petrunia I.V., Dorokhov Y.L. Plant wounding influences on neighboring plant immunity. // FEBS Journal. 2012. V. 279 (Suppl 1). P. 73.

6. Тюлькина Л.Г., Скурэт E.B., Фролова O.B., Комарова Т.В., Каргер Е.М., Атабеков И.Г.. Новый вирусный вектор для суперпродукции эпитопов вакцинных белков в растениях. // ACTA NATURAE. 2011. Т. 3. С. 32-42.

7. Petrunia I.V., Komarova T.V., Dorokhov Y.L. Methanol emission by wounded plant enhances mice attraction: behavioral and gene-expression analysis. // FEBS Journal. 2011. V. 278 (Suppl 1). P. 146.

8. Komarova T.V., Kosorukov V.S., Frolova O.Y., Petrunia I.V., Skrypnik K.A., Gleba Y.Y., Dorokhov Y.L. Plant-made trastuzumab (herceptin) inhibits her2/neu+ cell proliferation and retards tumor growth. // PLoS One. 2011. V. 6. el7541.

9. Makarov A„ Komarova Т., Shwartz A., Dorokhov Y. RNA polymerase I directed synthesis and expression of polycistronic viral RNA. // FEBS Journal. 2010. V. 277 (Suppl 1). P. 229.

10. Komarova T.V., Schwartz A.M., Frolova O.Y., Zvereva A.S., Gleba Y.Y., Cytovsky V., Dorokhov Y.L. Pol II-directed short RNAs suppress the nuclear export of mRNA. // Plant Mol Biol. 2010. V. 74. P. 591-603.

11. Frolova O.Y., Petrunia I.V., Komarova T.V., Kosorukov V.S., Sheval E.V., Gleba Y.Y., Dorokhov Y.L. Trastuzumab-binding peptide display by Tobacco mosaic virus. //. Virology. 2010V. 407. P. 7-13.

12. Komarova T.V., Baschieri S., Donini M., Marusic C., Benvenuto E., Dorokhov Y.L. Transient expression systems for plant-derived biopharmaceuticals. // Expert Rev Vaccines. 2010. V. 9. 859-876.

13. Komarova T.V., Sheval E.V., Dorokhov Y.L. Uncontrolled protein overexpression leads to plant cell autophagy. // FEBS Journal. 2009. V. 276 (Suppl 1). P. 206.

14. Petrunia I.V., Frolova O.Y., Komarova T.V., Dorokhov Y.L. Plant as a factory for breast cancer antigen production. // FEBS Journal. 2009. V. 276 (Suppl 1). P. 70.

15. Зверева А.С., Петровская Л.Е., Родина А.В., Иванов П.И., Фролова О.Ю., Шингарова Л.Н., Комарова Т.В., Дорохов Ю.Л., Долгих ДА., Кирпичников М.П., Атабеков И.Г. Продукция в растениях биологически активных миелоцитокинов человека ZZ Биохимия. 2009. Т. 74. С. 14591468.

16. Komarova T.V., Dorokhov Y.L. RNA-polymerase II-derived non-coding RNAs suppress mRNA export and abolish antiviral protection in plants. ZZ FEBS Journal. 2008. V. 275 (Suppl 1). P. 70.

17. Shwartz A.M., Komarova T.V., Skulachev M.V. Destabilization of messenger KNA with long 3'UTR in plants. ZZ FEBS Journal. 2008. V. 275 (Suppl 1). P. 464.

18. Petmnia I.V., Frolova O.Y., Komarova T.V., Kiselev S.L., Citovsky V., and Dorokhov Y.L. Agrobacterium tumefaciens caused bacteraemia does not lead to GFP gene expression in mouse organs. ZZ PLoS One. 2008. V. 3. e2352.

19. Шварц A.M., Комарова T.B., Скулачев M.B., Зверева А.С., Дорохов Ю.Л., Атабеков И.Г. Стабильность мРНК в растениях зависит от длины З'-нетранслируемой области. ZZ Биохимия. 2007. Т. 72. С. 260-269.

20. Dorokhov Yu.L, Frolova O.Yu., Sheveleva A.A, Komarova T V., Zvereva A.S., Ivanov P.A., Atabekov J.G. Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves. ZZ Tuberculosis (Edinb.). 2007. V. 87. P. 218-224.

Монографии и главы в книгах

1. Komarova T.V., Petrunia I.V., Dorokhov Y.L. Vaccine peptide display on recombinant TMV particles. ZZ Plant-derived Vaccines: Technologies & Applications. Future Medicine Ltd. 2011. eBook ISBN: 978-1-78084-092-5

2. Komarova T.V., Citovsky V., Dorokhov Y.L. Pectin methylesterase enhances Tomato bushy stunt virus P19 RNA silencing suppressor effects. ZZ RNAi technology, eds: R.K. Gaur, Y. Gafni, P.Sharma and V.K.Gupta. CRC Press, FL, USA. 2011. P. 125-137.

Патенты и патентные заявки

1. Дорохов Ю.Л., Комарова Т.В., Фролова О.Ю. Антитело против фактора роста эндотелия сосудов и способ продукции антитела в растении. ZZ 2011. Патент РФ № 2412251.

2. Дорохов Ю.Л., Комарова Т.В., Косоруков B.C. Антитело, специфически взаимодействующее с онкобелком I IER2Zneu. ZZ 2011. Патент РФ №2425840.

3. Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Frolova O.Y., Petrunia I.V., Uryvaev L.V., Alkhovsky S.A., Samokhvalov E.I. Method of producing nucleoprotein nanoparticles. II2010. W02010039056

4. Dorokhov Y.L., Komarova T.V. Method for overproducing anti-HER2ZNeu oncogene antibodies in plant. ZZ 2009. WO 2009048354.

5. Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Atabekov J.G. Method of hyperproduction of target protein in a plant. ZZ 2008. W02008063093.

Подписано в печать: 21.02.2013

Заказ № 8177 Тираж - 150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Комарова, Татьяна Валерьевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии

имени А.Н.Белозерского

На правах рукописи

05201350571

КОМАРОВА Татьяна Валерьевна

Исследование роли транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений и создание биотехнологической платформы продукции фармацевтических белков

03.01.03-Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Дорохов Ю. Л.

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ.....................................................................................1

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................8

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................12

1. Бактериальная инфекция и иммунитет растений............................12

1.1. Модель зигзага, объясняющая взаимоотношение растения и патогена......................................................................................................12

1.2. Репертуар эффекторов и индукция ETI...........................................16

1.3. Состояние растения-нехозяина по отношению к патогену..........19

1.4. Ко-эволюция R-генов хозяина и эффекторов возбудителя.............20

2. Роль устьиц в бактериальном патогенезе...........................................21

3. «Переформатирование» ядра хозяйской клетки как неотъемлемая составляющая процесса бактериальной колонизации растения.......25

3.1. Трансформация растительной клетки ДНК Agrobacterium с помощью системы IV типа секреции.......................................................26

3.2. Бактериальные белки, модифицирующие экспрессию генома клеток растения, и система III типа секреции......................................30

3.2.1. Нуклеомодулгшы Xanthomonas.....................................................30

3.2.2. Эффекторы Pseudomonas syringae.............................................31

3.2.3. Белки T3SS Pantoea........................................................................33

3.3. Бактериальные ферменты, изменяющие экспрессию генов клеток хозяина за счет влияния на посттрансляционную модификацию........33

4. Роль плазмодесм в развитии бактериальной инфекции..................35

4.1. Строение плазмодесм.........................................................................35

4.2. Плазмодесма как поле битвы растения и бактерии.......................40

5. Роль летучих органических соединений растения в развитии вирусной инфекции.....................................................................................44

5.1. JIOC как продукты метаболических путей растения....................46

5.2. Роль повреоіедения в эмиссии ЛОС и вирусной инфекции растений .......................................................................................................................50

5.3. Праймирование растений, вызванное ЛОС, и его роль в вирусной инфекции......................................................................................................54

5.4. ЛОС и переносчики вирусов................................................................59

5.4.1. Неперсистентные вирусы............................................................60

5.4.2. Персистентные вирусы................................................................63

У

6. Система транзиентной экспрессии - патогены растений для целей

биотехнологии...............................................................................................65

6.1. Агроинъекция и бинарные векторы...................................................66

6.2. Иереплгщирующиеся векторы............................................................68

6.3. Реплицирующиеся векторы................................................................70

6.3.1. Тобамовирусы................................................................................70

6.3.2. Пошексвирусы................................................................................72

6.3.3. Потивирусы...................................................................................73

6.3.4. Бромовирусы..................................................................................74

6.3.5. Комовирусы....................................................................................76

6.3.6. Система MagnlCON.....................................................................77

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...............................................................79

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.....................97

1. Экспериментальная модель экспорта кнРНК из ядра растительной клетки...................................................................................98

2. Эффект, оказываемый кнРНК на репродукцию фитовирусов..107

3. Влияние кмРНК на репродукцию геномной РНК вируса растений.......................................................................................................110

4. Модель экспорта мРНК из ядра цитоплазму.................................112

5.1. Разработка метода количественного измерения газообразного метанола, испускаемого травмированным растением.......................120

5.2. Определение количественных параметров эмиссии метанола и

состава газов, испускаемых травмированным растением.................122

5.3 . Идентификация в растении генов чувствительных к метанолу 125

6. Исследование участия метанола в межклеточном транспорте растений.......................................................................................................132

7. Метанол вызывает повышение репродукции ВТМ в растении 135

8. Активизация межклеточного транспорта в растении связана с развитием антибактериальной устойчивости......................................140

8.1. Индукция антибактериальной устойчивости в листьях, обработанных газообразным метанолом и г(ис-3-гексен-1-олом в закрытой системе....................................................................................140

8.2. Исследование роли метанола в развитии системной устойчивости растения к бактерии R. solanacearum на модели табака, трансгенного по ПМЭ.......................................................................................................142

8.3. Индукция антибактериальной устойчивости в листьях растений, обработанных газообразным метанолом в проточной системе.......144

8.4. Влияние метанола на число фокусов экспрессии GFP в листьях, агроинъецированных вирусным вектором KpBTM.GFP.......................146

9. Концепция участия межклеточного транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений................................147

10. Исследование роли метанола и NCAPP в модификации ядерно-цитоплазматического транспорта клетки............................................154

11. Биотехнологические основы эффективной продукции вакцин и антител в растении.....................................................................................160

11.2. Вектор на основе транскрнщионной кассеты РНК-полимеразы 1. .....................................................................................................................161

11.1. Разработка систем продукции вакцинных белков в растениях.163

11.2. Технологическая платформа продукции фармаі{евтических

препаратов в растении............................................................................166

ВЫВОДЫ.........................................................................................177

БЛАГОДАРНОСТИ.........................................................................179

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...........................180

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Avr - ген/белок авирулентности BG - р-1,3-глюканаза

CDK - calcium-dependent kinase, кальций-зависимая киназа dpi - дней после инъекции

ETI - effector-triggered immunity, вызываемый эффекторами иммунитет

ETS - effector-triggered susceptibility, чувствительность, вызванная эффектором

FPS - фарнезил пирофосфат-синтаза

GC - gas chromatography, газовая хроматография

GFP - green fluorescent protein, зеленый флуоресцирующий белок

HR - hypersensitive response, гиперчувствительный ответ

IgG - иммуноглобулин класса G

1RES - internal ribosome entry site, область внутренней посадки рибосом LOX - липоксигеназа

LRR - leucine-rich repeat, лейцин-богатый повтор

МАМР - микроб-ассоциированные молекулярные паттерны

МАРК - mitogen-activated kinase, митоген-активируемая киназа

МТ - метилтрансферазный домен репликазы

NB - nucleotide-binding, нуклеотид-связывающий домен белка

NCAP - non-cell authonomous protein, неклеточный автономный белок

NCAPP - non-cell authonomous pathway protein, рецептор неклеточного автономного белка

NLS - nuclear localization signal, сигнал ядерной локализации PAL - фенилаланин аммоний-лиаза

РАМР - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны PI-II - proteinase inhibitor II, ингибитор протеаз II типа

PMEi - ингибитор ПМЭ

PR - pathogenesis-related, связанный с патогенезом белок/ген

PRR - pattern recognition receptor, рецептор, узнающий молекулярные паттерны

PTI - pathogen-triggered immunity, иммунитет, индуцируемый патогеном

RB и LB - right border, left border, последовательности, фланкирующие Т-ДНК

RLK - receptor-like kinase, рецептор-подобная киназа

RLP - receptor-like protein, рецептор-подобный белок

SAR - systemic acquired resistance, приобретенная системная устойчивость растения

SEL - size exclusion limit,пропускная способность (плазмодесм)

T3SS (или TTSS) - type III secretion system, система секреции III типа

T4SS - type IV secretion system, система секреции IV типа

TAL - transcription activator-like, белковые эффекторы, подобные транскрипционным активаторам

Y-BK - Y вирус картофеля

АБК - абсцизовая кислота

АФК - активные формы кислорода

БО - белок оболочки

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЖКЯ - вирус желтой карликовости ячменя

ВККТ - вирус курчавой карликовости томатов

ВМК - вирус мозаики костра

ВМКГ - вирус мозаики коровьего горошка

BMJI - вирус мозаики люцерны

ВМЦК - вирус мозаики цветной капусты

ВОМ - вирус огуречной мозаики

ВСЛК - вирус скручивания листьев картофеля

ВТМ - вирус табачной мозаики

ГПГ - горизонтальный перенос генов

ДСН - додецилсульфат натрия

ЖК - жасмоновая кислота

кДНК - комплементраная ДНК

кмРНК - короткие мРНК

кнРНК - короткие некодирующие РНК

крВТМ - тобамовирус, заражающий растения сем. Крестоцветные

КС - клеточная стенка

ЛЗЛ - ДОС зеленых листьев

ЛОС - летучие органические соединения

ЛЦ - легкая цепь МА

МА - моноклональные антитела

МЖК - метилжасмоновая кислота

МИГ - метанол-индуцируемый ген

мРНК - матричная РНК

МСК - метилсалициловая кислота

нт - нуклеотид

НТО - нетранслируемая область ОРС - открытая рамка считывания

ОТ-РВ-ПЦР - количественная ПЦР в реальном времени с предварительным получением кДНК с помощью обратной транскрипции

ПААГ - полиакриламидный гель

ПД - плазмодесма

ПК - промежуточная конструкция

ПМ - плазматическая мембрана

ПМЭ - пектинметилэстераза

ПТМ - посттрансляционная модификация

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РЕП - репликаза

рРНК - рибосомальная РНК

сгПр - субгеномный промотор

сгРНК - субгеномная РНК

СК - салициловая кислота

ТБ - транспортный белок

ТБГ - тройной блок генов

тРНК - транспортная РНК

ТЦ - тяжелая цепь МА

УИС - участок инициации сборки вируса

УФ - ультрафиолет

ФТ - фитотрастузумаб

ХВК - X вирус картофеля

ХЕЛ - хеликазный домен репликазы

ЭР - эндоплазматический ретикулум

ЭТ - этилен

ВВЕДЕНИЕ

Произрастая в агробиоценозах, растения постоянно испытывают давление внешних факторов окружающей среды, как биотической, так и абиотической природы. Повреждающее воздействие ветра, осадков или фитофагов нарушают целостность покровных тканей растения, открывая путь для проникновения внутрь различных патогенов. Растения в ответ на вторжение вирусов и бактерий синтезируют макромолекулы (РНК и белки), транспортируемые в различные ткани и органы. Существует три уровня движения макромолекул по растению: (а) ядерно-цитоплазматический транспорт, включающий перемещение РНК из ядра в цитоплазму и движение белков, синтезированных в цитоплазме, в ядро; (б) межклеточное перемещение РНК и белка (ближний транспорт); (в) дальний транспорт по сосудистой системе растения белков и РНК, в том числе вирусных нуклеопротеидов. Вирусы и бактерии различаются между собой в способности эксплуатировать эти три уровня транспорта. Вирусы растений, большая часть из которых цитоплазматические РНК-содержащие вирусы, активно используют ближний и дальний транспорт для переноса генетического материала по растению. Бактерии, как внеклеточные патогены, не нуждаются в транспорте генетического материала по растению, однако при колонизации используют ядерно-цитоплазматический транспорт, вводя белковые факторы вирулентности в хозяйское ядро для его «переформатирования». Современное представление о вирусном и бактериальном патогенезе предполагает возможность конкурентных взаимоотношений между макромолекулами хозяина и патогена на уровне транспорта. Однако экспериментальных данных на этот счет недостаточно, что определяет актуальность исследования роли транспорта макромолекул в иммунитете растений.

При рассмотрении ядерно-цитоплазматического транспорта макромолекул в растении следует иметь в виду, что растения в ответ на внешнее воздействие и атаку патогена проявляют серию защитных реакций, включающих повышенную транскрипцию некодирующих и кодирующих участков генома, вовлеченных в адаптивные реакции растений. Ядро растительной клетки структурно и функционально отделено от цитоплазмы, поэтому ядерно-цитоплазматический экспорт

РНК через ядерную пору играет фундаментальную роль в регуляции генома. В последние годы установлена важная роль коротких некодирующих РНК (кнРНК) в иммунитете растений и в проявлении защитных реакций в ответ на вирусную и/или бактериальную инфекцию. В частности показана связь между вирулентностью вирусов и уровнем накопления в цитоплазме кнРНК (Bazzini и др., 2007, 2011). Более того, установлено, что суперэкспрессия кнРНК и увеличение их содержания в цитоплазме стимулирует репродукцию вируса табачной мозаики (ВТМ) (Dorokhov и др., 20066). Молекулярные механизмы этих явлений неясны и требуют дополнительных экспериментов для выяснения роли ядерного экспорта РНК в реакциях растений на бактериальную и вирусную атаку. Этим определяется необходимость создания экспериментальной модели экспорта мРНК, а также коротких некодирующих РНК из ядра растительной клетки. На подобной модели можно охарактеризовать молекулярные механизмы конкуренции РНК за экспорт из ядра в цитоплазму и изучить участие ядерного транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений.

На втором уровне транспорта клеточных макромолекул, когда через плазмодесмы происходит перенос клеточных белков, например, транскрипционных факторов хозяина и кодирующих их мРНК, также может происходить конкуренция с вирулентными факторами патогенов, а именно, с вирусными транспортными белками (ТБ) и эффекторными молекулами бактерий. Вероятность такой конкуренции до сих пор не исследовалась, прежде всего, из-за отсутствия адекватной экспериментальной модели, позволяющей изучать роль межклеточного транспорта в бактериальном и вирусном патогенезе в условиях, максимально приближенных к природным. В интактном растении табака только молодые (0,5-3,0 см) верхние быстрорастущие листья, являющиеся акцепторами (sink) фотоассимилятов, характеризуются наличием «открытых» плазмодесм и интенсивным межклеточным транспортом. Эти листья, однако, не представляют собой природных «ворот» инфекции и малопригодны для экспериментального заражения. С другой стороны, зрелые крупные (10-20 см) листья табака, являющиеся донорами (source) фотоассимилята и обычно использующиеся для экспериментального заражения ВТМ и бактериями, такими как Ralstonia

9

8о1апасеапип и А^гоЪас1ег'шт 1ите/асгет, содержат плазмодесмы, которые «закрыты» для крупных макромолекул. Пропускная способность плазмодесм «зоигсе»-листьев увеличивается при вирусной инфекции, например, с помощью транспортного белка вируса. Оптимальной экспериментальной системой могли бы быть растения, у которых плазмодесмы «зоигсе»-листьев «открываются» при воздействии газообразного вещества, не повреждающего листья и не вносящего в систему фактор травмы. Вообще, летучие органические вещества, которые могут играть роль сигналов коммуникации между растениями, известны достаточно давно. Среди них идентифицирован метанол, который образуются в реакции деметилирования пектина ферментом клеточной стенки табака, пектинметилэстеразой (ПМЭ). В нашей лаборатории этот фермент впервые был идентифицирован в качестве рецептора транспортного белка ВТМ (БогокЬоу и др., 1999).

Использование разработанной экспериментальной системы контролируемого межклеточного транспорта позволит проверить выдвинутую ранее гипотезу относительно участия ПМЭ и метанола в регуляции межклеточного транспорта и патогенезе растений (Дорохов, 2007). Кроме того, именно в условиях данной системы появляется возможность исследования роли ПМЭ и метанола как факторов мобилизации растительного сообщества в ответ на травму и проникновение вирусного или бактериального патогена.

В последние годы биотехнология рассматривает растения в первую очередь в качестве некоего «ферментера» рекомбинантных фармацевтических молекул, включая ферменты, вакцины и антитела. Поэтому другим направлением нашего исследования является определение молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия растения и вируса в искусственных условиях растения-биофабрики. Наиболее эффективными оказались системы продукции, основанные на введении вирусного вектора, кодирующего целевой белок, с помощью бактерии Agrobacteril^m иипе/аЫет в клетки растения ЪИсойапа Ьешкттста. Этот подход позволяет получить временную экспрессию гена целевого белка с высоким выходом конечного продукта и в короткие сроки (до 7 дней). Таким образом, мы рассматриваем возможность практического применения выявленных закономерностей

10

переноса макромолекул хозяина и патогена в клетке и между клетками. Выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе подобных систем экспрессии, также представляется актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является расшифровка молекулярных ме�