Биотехнологические исследования и разработка состава лечебно-профилактического средства на основе регуляторных белков гепатопротекторного действия

Привалов, Игорь Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнологические исследования и разработка состава лечебно-профилактического средства на основе регуляторных белков гепатопротекторного действия
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические исследования и разработка состава лечебно-профилактического средства на основе регуляторных белков гепатопротекторного действия"

На правах рукописи

Привалов Игорь Михайлович

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И РАЗРАБОТКА СОСТАВА ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОГО

ДЕЙСТВИЯ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 0КГ ?пг}о

Москва 2009

003479584

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пятигорской государственной

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук,

профессор кафедры технологии лекарств Степанова Элеонора Фёдоровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

ВИЛАР РАСХН Минеева Майя Федоровна

доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой биотехнологии ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и

биотехнологий имени К.И. Скрябина» Тихонов Игорь Владимирович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»

Защита состоится « 9 » ноября 2009 г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений ВИЛАР РАСХН по адресу: 117216, Москва, Грина, 7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, Москва, Грина, 7.

Автореферат разослан « 1 » октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

фармацевтической академии Росздрава.

Д 006.070.01

доктор фармацевтических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В настоящее время сырьевые объекты, полученные с помощью биотехнологии, используются сравнительно редко, в то время как эффективность и перспективность таких объектов на сегодняшний день уже доказана. Особенно интересна группа лекарственных и парафармацевтических средств нового поколения, основу которых составляют регуляториые белки, проявляющие биологическую активность в сверхмалых дозах.

Исследованиями, проведенными институтом элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН и институтом биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, в различных тканях млекопитающих: крови, печени, легком, сердце, тимусе, мозге, сетчатке глаза, поджелудочной, щитовидной, молочной железах была обнаружена группа белков, которые в сверхмалых дозах осуществляют регуляцию гомеостаза на органно - тканевом уровне и получившая название - регуляториые белки (РБ) (Ямскова и др., 1977; Маленков и др., 1978; Ямскова, Резникова, 1991; Ямскова и др., 1994; Ямсков и др., 1999).

Белки этой группы представляют собой низкомолекулярные, высокоглн-козилированные пептиды со значением молекулярной массы менее 10 кДа. Являясь эндогенными протекторами, при патологии ткани они оказывают влияние на свойства плазматической мембраны клеток, что стимулирует восстановительные и репаративные процессы (Ямскова, Резникова, 1991; Борисенко, 2007).

В настоящий момент выделено уже 50 регуляторных белков, но полностью исследована лишь часть из них и прежде всего недостаточно изучены биотехнологические аспекты, в том числе и масштабирование биотехнологических процессов.

На основе слабокислого белка сыворотки крупного рогатого скота (КРС) созданы лекарственные препараты нового поколения: «Адгелон» - глазные капли, и «Адгелон» для инъекций. Эти лекарственные препараты внедрены в медицинскую практику и успешно применяются в офтальмологии и травматологии. В то время как фракция регуляторных белков, полученная из ткани печени млекопитающих, является в биотехнологическом плане не полностью исследованной, а в плане прикладном - недостаточно востребованной.

Цель и задачи исследования.

Целью работы является совершенствование биотехнологической схемы получения регуляторного белка из печени крупного рогатого скота и создание на его основе средства с гепатопротекторным эффектом профилактической направленности, его биотехнологическое исследование и определение норм качества.

Для успешной реализации поставленная цель была конкретизирована следующими задачами:

- провести совершенствование основных этапов биотехнологического процесса производства субстанции из печени крупного рогатого скота;

- провести совершенствование и апробацию способа определения специ-

фической биологической активности регуляторного белка печени;

- выбрать и обосновать оптимальный состав лечебно - профилактического средства для перорального применения, разработать для него оригинальную таблетированную форму и определить её нормы качества;

-сконструировать технологическую схему производства и апробировать её в условиях пилотного производства;

- провести фармакологические исследования исходной субстанции кислого регуляторного белка и таблеток, созданных на её основе;

-разработать нормативную документацию на полученные субстанцию и её таблетированную форму.

Научная новизна.

Впервые на основе комплексных биологических, биотехнологических, биофармацевтических исследований разработано оригинальное лечебно-профилактическое средство гепатопрогекторного действия, содержащее регу-ляторные белки печени, сохраняющее их органоспецифические функции и обладающее биостимулирующим действием на гомологичный орган.

Экспериментально установлены оптимальные параметры технологического процесса производства регуляторного белка из печени КРС, позволяющие апробировать его в опытно-промышленных условиях, и создана научно-обоснованная, модифицированная технология производства исходного компонента на основе регуляторного белка печени.

Впервые научно обоснован и экспериментально установлен состав и способ получения таблетированной формы для исследуемых регуляторных белков,

Установлены и обоснованы основные технологические параметры производства. Для подтверждения подлинности включенной в таблетированную форму субстанции использовали модифицированный метод биотестирования на наличие мембранотропного эффекта, для установления биологической активности исходной субстанции методом in vitro применили биологический тест на модели Paramecium caudatum, результаты которого позволили опосредованно подтвердить гепатопротекторный эффект данной субстанции.

Проведены фармакологические исследования и практически доказано, что тритурационные таблетки, полученные на основе регуляторных белков печени, по своей терапевтической активности эквивалентны лекарственному препарату «Карсил», который выпускается фармацевтическими предприятиями.

Установлено так же, что разработанный лечебно профилактический препарат оказывает выраженное гепатозащитное действие при остром токсическом поражении печени.

Практическая значимость результатов исследования.

Разработаны и предложены к применению тритурационные таблетки ге-патопротекторного действия с условным названием «Гепотрит».

Результаты проведенных комплексных физико-химических и технологических исследований позволили предложить для промышленного освоения технологическую схему производства, объединяющую в единый процесс стадии получения собственно субстанции регуляторного белка печени и тритура-

циоиных таблеток на её основе.

Гепатозащитная активность разрабокшпого препарата, доступность исходных ингредиентов, а также эффективность и воспроизводимость технологам являются обоснованием целесообразности производства лечебно-профилактического средства «Гепотрит».

Внедрение результатов исследований в практику.

На лечебно-профилактическое средство - гритурациопные таблетки гепатопро-текгорного действия, полученные на основе кислого регуляторного белка печени крупного рогатого скота, разработан комплект нормативных документов: технологическая инструкция на приготовление биологически активной добавки к пище - триту-рационные таблетки «Гепотрит» и технические условия (ТУ 9358-027-45713216-08). Получен акт технологической апробации на опытную партию тршурационных таблеток от ООО НПФ «ФИТЭКО» (г. Ростов-на-Дону). На усовершенствованную технологию производства субстанции составлен лабораторный регламент и утвержден на производствах: ЗАО «Цетрально-Европейская фармацевтическая компания» г. Москва, ООО « Биотехнология -07» г. Нальчик

Основные положения, выносимые на защиту: Результаты обоснования мотивации разработки гепатозащитного средства на основе кислого регуляторного белка печени КРС.

Результаты совершенствования биотехнологической схемы многофакторио-го процесса выделения кислого регуляторного белка из печени КРС: выбор оптимальных параметров экстрагирования, очистки и концентрирования. Результаты исследований по обоснованию состава и технологии получения тритурационных таблеток, содержащих кислый регуляторный белок. Результаты биотестирования и биологического исследования субстанции кислого регуляторного белка и разработанных тритурационных таблеток на модели Paramecium caudatum.

Результаты фармакологического исследования по изучению гепатопротек-торного действия разработанных тритурационных таблеток, содержащих кислый регуляторный белок печени КРС.

Апробация и публикация результатов исследования.

Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на 65-й юбилейной открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Волгоград, апрель 2007 г.), ежегодной научной региональной конференции Пятигорской государственной фармацевтической академии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2008 г.), конгрессе «Человек и лекарство» (г. Краснодар, 18-19 октября 2008 г.).

По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 - в рецензируемых журналах ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста в компьютерном наборе, содержит 23 таблицы, 31 рисунок, 168 литературных ссылок. Состоит из введения, обзора литературы,

главы посвященной объектам и методам исследований, трех глав собственных исследований (включающих технологические аспекты, разработку норм качества, фармакологические исследования), выводов, списка литературы, и приложений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Объекты исследования- субстанция кислых регуляторных белков, выделенная из ткани печени крупного рогатого скота, и разработанное на её основе лечебно-профилактическое средство.

Теоретические и экспериментальные исследования проводились согласно схеме представленной на рисунке 1.

Рис. 1. Схема проведения исследований

В работе использовали методику выделения регуляторных белков, включающую получение гкаиезых экстрактов и изоэлектрофокусироваиие белков (Ямскова и др., 1977; Ямсков и др., 1999) и модифицированный метод биотестирования (Ямскова, Резникова, 1991).

Для изучения биологической активности in vitro использовалась модель Paramecium caudatum (Балабаньян, 1998). Получение культуры гепатоцитов для экспериментов выполнялось согласно методике Гладских (Гладских, 1997).

Опыты in vivo проводили на крысах-самцах массой 200-220 г линии Wis-tar. Исследования выполняли в соответствии с рекомендациями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств». В работе использовали экспериментальные модели токсического гепатита, вызванные у крыс введением тетрахлорметана (Владимиров и др, 1998).В качестве препарата сравнения выбран гепатопротектор »Карсил» производства « Sopharma» , взятый в эквивалентной терапевтической дозе.

Содержание в сыворотке крови общего белка определяли биуретовьш методом, общего билирубина - модифицированным методом Иендрашика-Грофа. Активность алашшамипотрансферазы (АлАТ) измеряли динитрофенилгидра-зиновым методом, щелочной фосфатазы (ЩФ) - по расщеплению п-нигрофенилфосфата в глициновом буфере. Количество триглицеридов в гомо-генаге печени измеряли по Gottfrieds S.P., Rosenberg В.Р. в модификации Сен-теребовой H.A. Содержание гликогена в гомогенате печени определяли по методу Montgomery (Строев, 1986).

При выборе вспомогательных веществ таблегируемой массы оценку структурно - механических свойств проводили используя метод погружения конуса (Ребиндер, Семененко, 1946)

Определение микробиологической чистоты лекарственной формы проводится в соответствии с методикой ГФ XII изд., вып. 1, раздел «Методы микробиологического контроля лекарственных средств».

Результаты обрабатывали методом парных сравнений по критерию Ман-на-Уитни. (Хафизьянова и др., 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка технологии экстрагирования печени. Повышение эффективности процесса извлечения

Для выделения регуляторных белков использовали печень крупного рогатого скота, полученную у клинически здоровых животных. Из свежего материала получали экстракт. В качестве первого значимого для экстракции фактора изучали измельчённость сырья. Одновременно с увеличением поверхности частиц и уменьшением их размера необходимо было обеспечить максимальную сохранность клеточной структуры. Учитывая эти требования и механическую прочность тканей печени КРС, сырьё резали на частицы размером 2-5 мм с помощью гильотинного механизма с падающим ножом.

Экстрагент подбирали с учетом свойств избирательности, физиологично-сти и возможности обеспечивать минимальную адгезию гепатоцитов. Как возможные компоненты экстрагента рассматривались два раствора,: физиологический раствор (0,9% NaCl) и раствор Рингера (NaCl 147 мМУл, KCl 4 мМ/л, СаС12 2,25 мМ/л). Исследовали влияние ионов Са2+, содержащихся в растворе Рингера, на адгезивные свойства ткани печени КРС. Адгезиометрическим методом рассчитывался коэффициент разобщенности гепатоцитов (табл. 1).

Таблица 1

Результаты определения степени разобщенности гепатоцитов в

зависимости от состава экстрагента

Исследуемая модель Среднее число живых клеток в поле зрения Среднее число клеточных ядер б поле зрения Коэффициент разобщенности

Интакгная печень 3 ± 1 10 ±1 0,2307

Печень, экстрагированная раствором Рингера 10± 2 3±1 0,7692

Печень, экстрагированная физиологическим раствором 2± 1 10 ±2 0,1666

Суспензия гепатоцитов 13 ± 1 Oil - 1

Экстрагирование в растворе Рингера обеспечивало наименьшую адгезию гепатоцитов.

Учитывая ионообменные адсорбционные свойства межклеточных компонентов следует использовать экстракт с ионной силой близкой к физиологической, и с соответствующим значением pH. Для поддержания постоянного ки-слотио-щелочного баланса среды в раствор Рингера добавляли буфер HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazone-H-2-Ethanesulfonic Acid).

Был установлен оптимальный состав экстрагента: 147 мМ NaCl; 4 мМ KCl; 2,25 мМ СаС12; 1мМ HEPES.

Затем определяли рациональный температурный режим процесса экстрагирования. Зависимость коэффициента разобщенности гепатоцитов от температуры, установленная эмпирическим путем, представлена на рисунке 2.

Коэффициент разобщенности максимален при температуре +2° С. Учитывая нижний предел температур промышленных установок, целесообразно температуру экстрагирования выбирать +3°, +4° С.

Оптимальным способом экстрагирования, соответствующим специфике требований к извлечению регуляторных белков, является ремацерация.

Количество ступеней ремацерации рассчитывали по формуле:

п ——, где М - отношение общего и задержанного в сырье экстракта, М- суммарная эффективность ремацерации.

Таблица 2

Суммарная эффективность ремацерации_

Эффективность ремацерации Е (суммарная)

Исходное сырье (печень КРС), г Общее количество экстрагента. мл Поглощенный экстрагент, мг М Количество ступеней ремацерации

1 2 3

1010 750 86 8,721 0,885 0,987 0,998

995 750 80 9,375 0,893 0,989 0,999

1005 750 85 8,824 0,887 0,987 0,999

1025 750 93 8,065 0,876 0,985 0,998

990 750 90 8,333 0,880 0,986 0,998

1001 750 98 7,653 0,869 0,983 0,998

Как следует из приведенных данных (табл. 2), необходимая эффективность достигается по истечении второй ступени ремацерации.

Влияние времени экстрагирования на процесс извлечения ре1уляторного белка изучали при температуре 3"С и продолжительности контакта фаз сырье-экстрагент от 0,5 час до 3,5 час на первой ступени и от 0,5 час до 2,5 час - на второй. Максимальная полнота извлечения белков на первой ступени ремацерации достигается при экстрагировании в течение 2,5 часов, на второй ступени - 1,5 часов. Суммарное время экстрагирования составило 4 часа.

Для очистки извлечения использовали центрифугирование. Скорость центрифугирования определяли, как обеспечивающую полное разделение фаз, спектрофотометрически, по равенству оптических плотностей чистого экетра-гента и экстракта после центрифугировании. Оптимальная скорость центрифугирования составила 3500 g, время центрифугирования составило 10 мин.

При высаливании тканевого экстракта, регуляторные белки остаются в растворенном состоянии в насыщенном растворе соли, а примесные белки переходят в осадок.

С целью предотвращения контаминации микроорганизмами и порчи сырья использовали консерванты: гермаль 115- 0,5% , парабены: нипагин 0,4%, нипазол 0,4%, которые вводились в состав сырья уже на стадии высаливания.

Для определения оптимального времени высаливания из раствора отбирались пробы через каждые 3 часа. В каждой из проб определялось количество общего белка в надосадочной жидкости. Процесс высаливания белка останавливали при стабилизации содержания белка (рис. 3).

По истечению 35 часов высаливания концентрация белка в надосадочной жидкости стабилизировалась, содержание белка уменьшилось на 52,2%. Остаток соосажденных белков убирали центрифугированием. Наиболее полное разделение происходило на скорости 14500 g.

ю 8 6 4 2 0

20 30

время, час

Рис. 3. Изменение концентрации белка в процессе первого высаливания

Диализ выполняли против очищенной воды для удаления низкомолекулярных примесей и сульфата аммония. После девяти замен приемной жидкости качественная реакция на сульфат аммония была отрицательной.

Затем определяли время одной ступени диализа. Для количественного определения сульфат - ионов использовали гравиметрический метод. Как следует из приведенных данных (рис. 4), после 20 часов диализа при температуре 4°С наступает равенство концентраций в камерах диализатора.

Рис. 5. Зависимость скорости диализа от интенсивности перемешивания

При использовании магнитной мешалки оптимальное время одной ступени диализа составило 2 часа, при скорости вращения магнитной мешалки 500 об/мин. Более высокая скорость к уменьшению времени диализа не приводит.

Таким образом, чтобы процесс диализа был максимально эффективным необходимо проводить его в течение 20 часов при постоянном перемешивании приемной жидкости в приемной камере диализатора со скоростью 500 об/мин и сменой приемной жидкости каждые два часа при температуре 4° С.

Полученный после двукратного высаливания раствор разделяли методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ). Препаративное ИЭФ экстракта печени проводили в колонке 8100 ЬКВ (440 мл), на которую наносили до 100 мл раствора, содержащего не более 100мг общего белка. При изоэлектрофокусировании использовали 0,5% раствор амфолинов (ЬКВ, Швеция) с интервалом рН 3,5-10 в градиенте концентрации сахарозы 60-0%. Время изоэлектрофокусирования 48 часов при напряжении 200-600 В и температуре 4°С. После проведения ИЭФ собирали фракции по 5 мл, во всех фракциях определяли рН и светопоглощение при 280 нм. Первые девять фракций имели рН<3,5, их объединяли.

С целью интенсификации процесса диализа применяли магнитную мешалку. Динамика изменения концентрации соли представлена на рисунке 5.

0,90 0,80 0,70 ! 0,60 • 0,50 ■ 0,40 . 0,30

о,го 0,10 0,00

0,0 2,0 4,0 6,0

Время диализа, час

—об/ши —®—У=500 об/мин ■ \/-й00 об/мин

Разработка лечебно-профилактического препарата на основе кислых регуляторных белков печени

При выборе формы введения кислого регуняторного белка печени необ- | ходимо было учитывать всю совокупность его химико-фармацевтических свойств и особенности дозировки и прежде всего то, что действующий компонент препарата органоспецифичен, поэтому необходимо обеспечить доставку действующего вещества к «органу мишени»; при этом лекарственное вещество должно легко высвобождаться из таблетированной формы, таблетки должны обладать повышенной остаточной влажностью, а в процессе получения следует исключить повышенное давление и контакт с металлическим оборудованием. Тритурационные таблетки как лекарственная форма достаточно полно соответствуют вышеизложенным требованиям, и в настоящем случае они предназначены для рассасывания в ротовой полости, что позволяет исключить их покрытие оболочкой, и это в свою очередь делает технологию более экономичной и 1 компактной. !

Для разрабатываемых тритурациогшых таблеток необходимо было выбрать состав вспомогательных веществ.

Исследовались комбинации вспомогательных веществ глюкоза, лактоза, сахароза с увлажнителями - 10% раствор колидона- 25 водный и спиртовой, 3% водный раствор метилцеллюлоза 8 (МЦ - 8), 10% раствор колликута. Для каждой из пластичных масс определяли предельное напряжение сдвига.

Пластичные массы, имеющие более одного максимума напряжения сдви- ' га, не обладают достаточной прочностью вследствие нестабильности. Поскольку количество увлажнителя должно быть максимальным, экстремум графика I должен иметь наибольшую абсциссу (рис. 6, рис. 7).

(2*10-!, ш

350 300 250 200 150 100 50 О

О 5

1 Лактоза

10 15 20 25 30

■ Сахароза -^----Глюкоза

кол~сю увлажнители, Ть

0*10!,Па

250

10 20 30 <0

- Лактоза Сахароза -у.

кол - во увлажнители, %

а) б)

Рис. 6. Зависимость напряжения предельного сдвига неразрушенной структуры от концентрации увлажнителя: а) 10% водный раствор колидон-25, б) 10% спиртовой раствор колидон-25

2'Ю-2, фа

200 180 160 140 130 100

10 15 20 25 30

Сахароза ■ А ~ 7люкоза кол - во цвхажншпелм., %

ячо-3,

350 300 250 200 150 100

10 20 30 40 50 60

-Лактоза Сахароза -&— У л.юкоза

кои. - во у&алжмшп&аа. %

а)

б)

Рис. 7. Зависимость напряжения предельного сдвига неразрушенной структуры от концентрации увлажнителя: а) 3% раствор МЦ-8, б) 10% колликут)

Этим требованиям удовлетворяла только пластичная масса, состоящая из лактозы, где в качестве увлажнителя используется 10% водный раствор коли-дона-25, вводимый в количестве 18% от массы сухого вещества. Состав тритурационных таблеток представлен в таблице 3.

Таблица 3

Наименование сырья Обозначение НД Содержание в 1 таблетке, мг

Раствор гликопротеина печени, 10"1 %г белка/мл ТУ экспериментальной партии 1,62

Лактоза ТУ 6-09-2293-79 7,00

Колидон-25 ТУ 42-8482-98 0,16

Ароматизатор сухой «Лимон» ТУ 9145-001-47929464-98 0,22

ИТОГО: 9,00

Стандартизацию тритурационных таблеток проводили по содержанию действующих веществ и физико-химическим показателям в соответствии с фармакопейной статьей «Таблетки».

Определение описания, цвета, вкуса, запаха, и физико-химических показателей таблеток проводили по СТ СЭВ 4710-84. Описание и цвет - по ГФ XI, вып. 2, ст. «Таблетки», с. 154, вкус и запах - органолептически.

Распадаемость и среднюю массу тритурационных таблеток определяли согласно ГФ XI, вып. 2, ст. «Таблетки», с.154. При установлении сроков хранения таблетки подвергали исследованию по качественным показателям при хранении в естественных условиях.

Учитывая характер действующего вещества таблеток и его дозировку, определение подлинности проводили модифицированным методом биотестирования на наличие мембранотропного эффекта.

Исследование образца тритурационных таблеток методом биотестирования на наличие специфической активности подтвердило мембрааотропный эф-

фект (табл. 4), что свидетельствует о подлинности препарата.

Таблица 4

Результаты биотестироваиия разработанных тритурационных таблеток

Количество клеточных ядер, выделившихся из 1 мг ткани

из культуры печени кон- из культуры печени опыт- м„',%

трольной серии (>!„) ной серии (Non.)

45,0±3 17,5±1

32,0±2 21,0±1

38,3±3 29,2±2 19,0±1 19,0±1 144.2%±3,8%

32,0± 13,0±2

30,0±2 22,0±2

Нормы качества разработанных таблеток приведены в таблице 5

Таблица 5

_Оценка качества разработанных таблеток_

Наименование показателен Характеристика и норма

Внешний вид Плоскоцюшпдрической формы таблетки серовато-белого цвета, одинакового размера, с ровными без сколов краями.

Подлинность Наличие гликопротеина печени определяется биотестированием

Вкус раствора Кисло-сладкий

Внешний вид раствора Прозрачная жидкость

Запах раствора Цитрусовый (лимон)

Размеры, мм Диаметр 2±0,1 , высота 1 0,1

Прочность на сжатие, Мпа 0,23

Прочность на истирание, % менее 15

Распадаемость, мин не более 0,4

Средняя масса таблеток, мг 9 0,5

Результаты контроля микробиологической чистоты разработанного средство представлены в таблице 6.

Таблица 6

Микробиологические показатели чистоты разработанных тритурационных

таблеток

Определяемые показатели Гигиенический норматив Единицы измерения ВД на методы исследований Результаты анализа

КМАФАнМ 5*10"' КОЕ/1- ГОСТ 10444.15-94 соответствует

БГКЩколи-формы) не допускается в 0,01 г ГОСТ Р 50474-93 ГОСТ Р 30518-97 соответствует

Е. СоН не допускается в 1,0 г ГОСТ 30726-2001 соответствует

Патогенные, в том числе сальмонеллы не допускается в 10,0 г ГОСТ 50480-93 соответствует

Дрожжи и плесени не более 100 КОЕ/г ГОСТ 10444.12-88 соответствует

Обобщенная схема технологического процесса приведена на рисунке 8.

Стадии технологического процесса (ТС) Операции технологического процесса (ТО)

Рис. 8. Обобщенная схема технологического процесса получения лечебно-профилактического средства - «Гепотрит»

Фармакологические исследования субстанции регуляторных белков печени КРС и препарата, разработанного на их основе

Изучение биологической активности исходной субстанции in vitro на модели Paramecium caudatum

Биологическое действие исходной субстанции испытывали на культуре Paramecium caudatum, выращенной на среде Л.К. Лозина-Лозинского. Особенностью применения данной методики явилось её использование для исследования биологических объектов животного происхождения, что позволило вы-

явить наличие дозозависимого эффекта субстанции. В хроническом опыте определяли влияние исследуемого вещества на аппарат размножения и темп роста парамеций. Исследовалась субстанция регуляторного белка в интервале доз от 10~12 до 10~24мг белка/мл. Опыт проводился в течении 24 суток.

Наибольшая плотность инокулята во всех дозах наблюдается на 4-5 день культивирования (рис. 9), причем максимальное количество особей в одной капле субстанции, взятой в дозировке 10"'2 мг белка/мл, существенно превышало

Рис. 9. Зависимость плотности инокулята от концентрации субстанции КРС

Пики плотности инокулята приходятся на концентрации 10"12, 10"21, в интервале концентраций 10"15 - 10"16 наблюдается нечетко выраженное экстремальное значение.

Затем был поставлен хронический опыт с тремя веществами гепатоиро-текторного действия: исследуемой субстанцией регуляторного белка и референтными гепатонротекторами - эссенциале и лецитином (рис. 10). Дозы у препаратов были взяты от 10"12 до 10"24 мг/мл, кроме того лецитин и эссенциале исследовали в обычных терапевтических дозах. Максимальная плотность инокулята в терапевтических дозах лецитина составила 11, эссенциале - 0, что обусловлено токсичностью препарата.

Рис. 10. Зависимость плотности инокулята от дозы гепатопротекторов

Все три препарата проявляют высокоактивное стимулирующее действие на интенсивно размножающихся парамеции, находящихся в экспоненциальной фазе роста. Зависимость «доза-эффект» носит немонотонный, полимодальный характер. В интервале доз 10" -10" ,10" -10" эффект отсутствует. У всех трех препаратов резкое возрастание эффекта наблюдается в концентрации 10~21 мг/мл. Полученные результаты коррелируют с результатами исследования «доза - эффект» вязкоупругих свойств плазматической мембраны гепатоцитов.

На основании вышеизложенного можно предположить, что плотность инокулята обусловлена мембранотропным эффектом гепатопротекторных препаратов. Аналогичное действие эти препараты оказывают и на мембраны гепатоцитов, непосредственно встраиваясь в фосфолипидную структуру поврежденных мембран, т.е. косвенно подтверждается гепатопротекгорный эффект исследуемого средства.

Изучение гепатопротекторной активности in vitro с использованием первичной культуры гепатоцитов

Скринииговые исследования полученной субстанции кислого регулятор-ного белка проводили на первичной культуре изолированных гепатоцитов. В качестве препаратов сравнения брали растворы эссенциале и карсила. Воспроизводилась модель поражения клеток в культуре. Моделировалось поражение печени лекарственным средством - индометацином.

Для применяемой культуры клеток был определена LC50. Оценка действия индометацина на клетки в культуре проводилась по их выживаемости (рис.11).

,100% ^ 90% ■ | 80% ■ | 70% -Я 60% • н 50% | 40% • ё 30% ■ g 20% • I 10% « 0% -0

Рис. 11. Оценка выживаемости гепатоцитов в первичной культуре под воздействием индометацина в зависимости от концентрации

Индометацин в концентрации 5,33 мкг/мл привел к гибели 47,06% клеток в культуре. Для выбранных гепатопротекторов определяли ЕС50 • Наиболее эффективной концентрацией для эссенциале является 0,3 мкг/мл культуральной среды. Эта концентрация обеспечивает при использовании ЕС50 индометацина выживаемость 92,31% гепатоцитов. Эффективная концентрация карсила составляет 1,725 мкг/мл культуральной среды. При использовании индометацина

в концентрации ECso выживаемость гепатоцитов составляет 80,77%.

Эффективная концентрация исследуемого регуляторного белка печени (РБП) - 10~12 мкг/мл культуральной среды. При этом наблюдается 84% выживаемости гепатоцитов. Следующее экстремальное значение выживаемости -66,67% наблюдается при концентрации 10~21. Зависимость «доза - эффект» по РБП коррелируется с результатами но исследованию воздействия регуляторного белка печени на аппарат размножения Paramecium caudatum.

120% - --

; юо% •

5 * 80%

S I 6096 ■

1 I

I S 40% - -

I 20% -

0% - —1

Рис. 12. Зависимость жизнеспособности гепатоцитов на модели интоксикации

индометацином

Степень жизнеспособности гепатоцитов под воздействием индометацина было различной и характеризовалась следующим образом: эссенциале > регу-ляторный белок печени > карсил (рис. 12).

Первичная оценка гепатозащитной активности субстанции кислых регуляторных белков печени in vivo

Первичная оценка гепатозащитной активности полученной субстанции кислых РБП проводилась на модели острого СС14 гепатоза при их лечебно -профилактическом введении. В исследованиях гепатозащитного действия оценивались следующие параметры: выживаемость животных, динамика изменения массы тела, коэффициент массы печени, длительности гексеналового сна и степень жировой дистрофии печени.

В группе негативного контроля выживаемость животных снижена до 83,3% (табл.7). При применении исследуемых препаратов выживаемость составила 100%.

Несмотря на отсутствие достоверных различий в динамике массы тела между крысами групп, получавших гепатозащитные средства, более выраженной была потеря массы тела в группе, получавшей карсил.

В группе крыс, отравленных СС14, отмечалось достоверное увеличение удельной массы печени (табл. 7), удельная масса печени леченых животных в среднем на 12% меньше.

При лечебно-профилактическом применении РБ печени продолжительность гексеналового сна достоверно снижается на 25,5%.

Раствор регуляторного белка ослабил стеатоз печени до 2,4-3,6 баллов.

В проведенной серии экспериментов регуляторный белок печени обладает выраженным гепатозащитным действием в условиях острого ССЛ4 гепатоза.

Таблица 7

Функциональные и метаболические показатели печени при остром СС14

гепатозе

Экспериментальные 1-руппы Выживаемость, % Изменение массы тела, % Удельная масса печени, г Степень жировой ИНфильтрации печени

Интакткые животные 100 5,49±1,65 50,95±1,1

СС1.4 - гепатит 83,33 -9,15±0,72 Р*=0 62,08+1,5 Р*=0 4,2±0,3 Р*=0

РБ печени 100 -4,42±1,99 Р*=0,04, Р**=0,49 56,7±3,2 Р*=0,121 , Р**=0,16 3,0±0,6 Р*=0, Р**=0,082

Карсил 100 -5,84±0,26 Р*=0, Р**=0,007 55,9±4,1 Р*=0,274, Р**=0,188 3,2±0,5 Р*=0,04, Р**=0,09

Р*<0,05 достоверное отличие от группы интактного контроля Р*<0,05 достоверное отличие от группы негаишного контроля

Эффективность действия сравнима с карсилом и по ряду показателей незначительно и недостоверно его превышает.

Оценка терапевтической эффективности препарата на модели экспериментального поражения печени

Терапевтическую эффективность разработанного препарата определяли на модели острого токсического СС14 гепатоза у крыс.

Гипербилирубинемия у больных с токсическим поражением печени является следствием воздействия яда на активность фермента трансглюкуронидазы. Исходная норма содержания билирубина в сыворотке крови составила 17,97±0,88 мкмолъ/л. Под воздействием токсиканта обнаружен достоверный резкий подъем содержания общего билирубина почти в пять раз. Исследуемый препарат снизил концентрацию билирубина на 56,9%, карсил - на 69,1%.(рис.13) _ __ _______________ _______________

интактная негативный исследуемый карсил группа контроль препарат

Рис. 13. Содержание билирубина в сыворотке крови при остром ССЦ гепатозе

При цитолизе паренхимы печени возрастает проницаемость клеточной мембраны гепатоцитов, возрастает уровень аланинаминотрансферазы (АлАт). В наших экспериментах тетрахлорметан повышал активность АлАт более чем в 8,3 раза (при норме. 0,18±0,01 ммоль/(г*л). Исследуемые гепатопротекторы ограничивали выход в кровь аланинаминотрансфераз; исследуемый препарат - на 48,2 %, карсил - на 18,2% по сравнению с показателями у нелеченных животных (рис.14).

интактнал негативный исследуемый карсил группа контроль препарат

Рис. 14. Содержание АлАт в сыворотке крови при остром ССЦ гепатозе

Активность ЩФ в сыворотке крови иитактных крыс составила 183,6±11,46 мкмоль /(мин*л). При интоксикации тетрахлорметаном элиминация в кровь щелочной фосфотазы осуществлялась со скоростью в четыре раза превышающую диффузию этого фермента через синусоидальную мембрану гепатоцитов у интактных крыс. Исследуемый препарат снижал, активность ЩФ на 62,5%, карсил - на 69,9% по сравнению с соответствующим показателем группы негативного контроля (рис. 15).

1 500 471

5 --

3 а

А н н

200 • 100 - 177 ___„1Д2..........-

а -е- 1 ~ ХОТ"........ ; Ь I ,

ш^вЁ , шшк

интакгная негативный исследуемый карсил

группа контроль препарат

Рис. 15. Активность ЩФ в сыворотке крови при остром СС14 гепатозе В результате токсического действия теграхлорметаиа в печени нарушается обмен липидов, что сопровождается, повышением продукции триглицеридов (ТРГ).

Норма содержания ТРГ в гомогенате печени крыс составляет 30,61±2,21 мкмоль/г. В группе негативного контроля уровень ТРГ повысился в два раза. Концентрацию триглицеридов, повышенную токсикантом, препарат, содержащий регуляторный белок, снизил незначительно. При применении карсила уро-

вень ТРГ снижен на 25,8% по сравнению с соответствующим показателем в группе негативного контроля^исЛб).

интактная негативный исследуемый карсил группа контроль препарат

Рис. 16. Содержание ТРГ в гомогенате печени при остром ССЦ гепатозе

Нуклеиновые кислоты рассматриваются в качестве маркера белково-синтетической функции печени. Норма содержания нуклеиновых кислот в гомогенате печени крыс составляет 45,59±1,76 мкг. При остром токсическом гепатите наблюдалось достоверное снижение содержания нуклеиновых кислот на 13,9%. Введение карсила нормализует уровень нуклеиновых кислот. При применении исследуемого препарата уровень нуклеиновых кислот выше на 12,1% по сравнению с уровнем при CCI ^-гепатозе (рис.17).

Рис.17. Содержание нуклеиновых кислот при остром СО4гепатозе

У животных с гепатитом наблюдалось нарушение белково - синтетической функции печени, что проявлялось в повышении концентрации общего белка крови на 21,9%. При применении исследуемого препарата и карсила содержание общего белка, не превысило 9% нормы (рис. 18).

Si 140 5 120

100

интактная группа

карсил

негативный исследуемый контроль препарат

Рис. 18. Содержание общего белка в сыворотке крови при остром СС1^ генатозе

При интоксикации ^^етрахлорметаном происходит угнетение глюконеоге-неза и усиление гликогенолиза, уровень гликогена печени снизился более чем в три раза. При введении исследуемого препарата содержание гликогена печени увеличивалось на 180% по сравнению с соответствующим показателем при СС14-гепатозе (рис. 19).

.......Г Ш

5 100 -! 80

I 40 I

Э 20 о

интактная негативный исследуемый кэрсил группа контроль препарат

Рис. 19. Содержание гликогена печени при остром СС^гепатозе

Разработанное лечебно-профилактическое средство способно оказывать комплексное терапевтическое влияние, затрагивая различные звенья патогенеза токсических поражений печени.

Выводы

1. Разработана современная биотехнологическая схема производства исходной субстанции регуляторных белков гепатопротекторного действия из печени крупного рогатого скота и проведено усовершенствование основных этапов ее производства.

2. Выбраны оптимальные технологические условия на этапе экстракции: способ экстрагирования - двухступенчатая ремацерация; способ измельчения - резание на части размером 2-5 мм; общее количество экстрагента составляет 1,5 по отношению к объему сырья; состав экстрагента: 147 мМ NaCl; 4 мМ КС1; 2,25 мМ СаС12; 1мМ HEPES; температура экстрагирования: +3°, +4° С. длительность экстрагировании - 4 часа при рН - 8,3-

3. Установлены и экспериментально обоснованы параметры каждой из ступеней очистки полученного извлечения: центрифугирование со скоростью 14500g, высаливание в течение 35часов, диализ с использованием магнитной мешалки в течение двух часов.

4. Доказано, что оптимальной формой введения регуляторных белков гепа-топротекторного действия в организм являются гритурационные таблетки. Определен состав вспомогательных веществ, обладающий необходимыми структурно-механическими свойствами и имеющий предельное напряжение сдвига 300* 10"2 Па : лактоза, увлажнитель - 10% водный раствор колидона-25, вводимый в количестве 18% от массы сухого вещества, ароматизатор «Лимон».

5. Разработана технологическая схема производства тритурационных таблеток, а также единая сочегагшая схема, сконфигурированная с учётом требований GMP и с акцентом на биотехнологических операциях - очистке су-пернатанта и изоэлектрофокусировании.

6. Разработана и реализована методика контроля функциональной активности раствора кислого регуляторного белка печени с помощью культуры микроорганизмов Paramecium caudatum. Подтверждена зависимость «доза-эффект» для регуляторных белков печени и установлены концентрации при которых наблюдаются пики активности.

7. Выполнены фармакологические исследования субстанции регуляторного белка и разработанных тритурационных таблеток. Проведена оценка терапевтической эффективное™ субстанции и лечебно-профилактического средства « Гепотрит» на модели экспериментального острого токсического гепатита крыс. Показано, что гепатопротекгорная активность предложенных таблеток сопоставима с эффектом таблеток гепатопротектора « Кар-сил».

8. Разработана нормативная документация на тритурационные таблетки «Гепотрит» и проведена их технологическая апробация в производственных условиях.

Список опубликованных работ

1. Привалов, И.М. Исследование возможности использования регуляторных пептидов для создания парафармацевтических средств с гепатопротектор-ным эффектом / И.М. Привалов // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины. Материалы 65 юбилейной открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. - Волгоград, 2007. - С. 206.

2. Привалов, И.М. Исследование адгезивного белка вигерон для создания парафармацевтических средств с гепатопротекторным эффектом / И.М. Привалов // Известия Высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Проблемы фармации, фармакологии и рациональной терапии. Спец. выпуск Естественные науки. - Ростов на Дону, 2007. - С. 106-107.

3. Привалов, И.М. Исследование гепатопротекторного действия регуля-

торного белка вигерон для создания на его основе парафармацевтических средств / И.М. Привалов Н Международная выставка конгресс «Аптека 2007». -Москва, 2007.-С. 144-145.

4. Привалов, И.М. Технологическое и биохимическое исследование регу-ляторного белка вигерон и поиск путей использования / И.М. Привалов, В.II. Ямскова // Фармация из века в век. Труды научно - практической конференции. - Санкт-Петербург, 2008. - С. 107-112.

5. Привалов, И.М. Разработка состава и технологические исследования гепатопротекторного средства на базе биотехнологического сырья / И.М. Привалов // Конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. - Краснодар, 2008. - С 72-73.

6. Привалов, И.М. Разработка оптимальной технологии экстрагирования регуляторного белка гепатопротекторного действия из биотехнологического сырья / И.М, Привалов, Э.Ф. Степанова, В.П. Ямскова // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П.Павлова. - Рязань, 2009. - №2. -С.145-151.

7. Привалов, И.М. Изучение гепатопротекторной активности регуляторного белка печени in vitro с использованием первичной культуры гепатоцитов / И.М. Привалов, Э.Ф. Степанова // Вестник новых медицинских технологий. -Тула, 2009. - №2. - С.130-133.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 28.09.2009г. Формат бумаги 60x84 1/16. Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 21/09

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Привалов, Игорь Михайлович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 Обзор литературы.

1.1 Пространственно-функциональная организация ткани печени.

1.2 Биологически активные в сверхмалых дозах адгезивные белки, выделенные из печени млекопитающих.

1.3 Современное состояние исследований по созданию гепатопротекторных препаратов.

1A Paramecium caudatum - как модель in vitro для изучения биологической активности.

Глава 2 Организация проведения экспериментов, объекты, материалы и методы исследования.

2.1 Организация работы и планирование эксперимента.

2.2 Объекты изучения. Вспомогательные вещества и оборудование

2.3 Методы исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 3 Экспериментальное обоснование выбора технологии получения субстанции регуляторных белков печени.

3.1 Разработка технологии экстрагирования печени. Повышение производительности и эффективности процесса извлечения.

3.1.1 Определение оптимального извлекающего состава.

3.1.2 Выбор температурного режима экстрагирования.

3.1.3 Выбор метода экстрагирования.

3.1.4 Определение длительности экстрагирования.

3.2 Получение супернатанта экстракта ткани печени. Выбор оптимальных параметров высаливания и диализа.

3.2.1 Центрифугирование экстракта.

3.2.2 Высаливание белков.

3.2.3 Диализ. Интенсификация процесса диализа.

3.3 Фракционирование экстракта ткани печени методом изоэлектрофокусирования.

Глава 4 Разработка лечебно-профилактического препарата на основе кислых регуляторных белков печени.

4.1 Тритурационные таблетки как оптимальная форма введения исследуемого белка.

4.2 Исследования по выбору вспомогательных веществ.

4.3 Технологическая схема получения таблеток. Характеристика основных этапов.

4.4 Оценка качества тритурационных таблеток «Гепотрит».

4.5 Общая технологическая схема, её основные этапы и параметры.

Глава 5 Фармакологические исследования субстанции регуляторных белков печени КРС и лечебно-профилактического средства, разработанного на их основе.

5.1 Изучение биологической активности исходной субстанции in vitro на модели Paramecium caudatum.

5.2 Изучение гепатопротекторной активности in vitro с использованием первичной культуры гепатоцитов.

5.3 Первичная оценка гепатозащитной активности субстанции кислых регуляторных белков печени.

5.4 Патогенез экспериментального токсического гепатита, инициированного тетрахлорметаном.

5.5 Оценка терапевтической эффективности препарата на модели экспериментального поражения печени.

5.6 Исследование тритурационных таблеток «Гепотрит» на модели Paramecium caudatum.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические исследования и разработка состава лечебно-профилактического средства на основе регуляторных белков гепатопротекторного действия"

Актуальность темы

В настоящее время сырьевые объекты, полученные с помощью биотехнологии, используются сравнительно редко, в то время как эффективность и перспективность таких объектов на сегодняшний день уже доказана. Особенно интересна группа лекарственных и парафармацевтиче-ских средств нового поколения, основу которых составляют регулятор-ные белки, проявляющие биологическую активность в сверхмалых дозах.

Белки этой группы представляют собой низкомолекулярные, высо-когликозилированные пептиды со значением молекулярной массы менее 10 кДа. Являясь эндогенными протекторами, при патологии ткани они оказывают влияние на свойства плазматической мембраны клеток, что стимулирует восстановительные и репаративные процессы [16,116].

На основе слабокислого белка сыворотки крупного рогатого скота (КРС) созданы лекарственные препараты нового поколения: «Адгелон» -глазные капли, и «Адгелон» для инъекций. Эти лекарственные препараты внедрены в медицинскую практику и успешно применяются в офтальмологии и травматологии. В то время как фракция регуляторных белков, полученная из ткани печени млекопитающих, является в биотехнологическом плане не полностью исследованной, а в плане прикладном — недостаточно востребованной.

Цель и задачи исследования.

Для успешной реализации поставленная цель была конкретизирована следующими задачами:

- провести совершенствование и апробацию способа определения специфической биологической активности регуляторного белка печени;

-сконструировать технологическую схему производства и апробировать её в условиях пилотного производства;

-разработать нормативную документацию на полученные субстанцию и её таблетированную форму.

Научная новизна исследований

Впервые на основе комплексных биологических, биотехнологических, биофармацевтических исследований разработано оригинальное лечебно-профилактическое средство гепатопротекторного действия, содержащее регуляторные белки печени, сохраняющее их органоспецифиче-ские функции и обладающее биостимулирующим действием на гомологичный орган.

Впервые научно обоснован и экспериментально установлен состав и способ получения таблетированной формы для исследуемых регулятор-ных белков.

Установлены и обоснованы основные технологические параметры производства. Для подтверждения подлинности включенной в таблетиро-ванную форму субстанции использовали модифицированный метод биотестирования на наличие мембранотропного эффекта, для установления биологической активности исходной субстанции методом in vitro применили биологический тест на модели Paramecium caudatum, результаты которого позволили опосредованно подтвердить гепатопротекторный эффект данной субстанции.

Практическая значимость результатов исследования.

Разработаны и предложены к применению тритурационные таблетки гепатопротекторного действия с условным названием «Гепотрит».

Гепатозащитная активность разработанного препарата, доступность исходных ингредиентов, а также эффективность и воспроизводимость технологии являются обоснованием целесообразности производства лечебно-профилактического средства «Гепотрит».

Внедрение результатов исследований в практику.

На лечебно-профилактическое средство — тритурационные таблетки гепа-топротекторного действия, полученные на основе кислого регуляторного белка печени крупного рогатого скота, разработан комплект нормативных документов: технологическая инструкция на приготовление биологически активной добавки к пище — тритурационные таблетки «Гепотрит» и технические условия (ТУ 9358-027-45713216-08). Получен акт технологической апробации на опытную партию тритурационных таблеток от ООО НПФ «ФИТЭКО» (г. Ростов-на-Дону). На усовершенствованную технологию производства субстанции составлен лабораторный регламент и утвержден на производствах: ЗАО «Центрально-Европейская фармацевтическая компания» г. Москва, ООО « Биотехнология-07» г.Нальчик

Положения, выносимые на защиту

• Результаты обоснования мотивации разработки гепатозащитного средства на основе кислого регуляторного белка печени КРС.

• Результаты совершенствования биотехнологической схемы многофакторного процесса выделения кислого регуляторного белка из печени КРС: выбор оптимальных параметров экстрагирования, очистки и концентрирования.

• Результаты исследований по обоснованию состава и технологии получения тритурационных таблеток, содержащих кислый регуляторный белок.

• Результаты биотестирования и биологического исследования субстанции кислого регуляторного белка и разработанных тритурационных таблеток на модели Paramecium caudatum.

• Результаты фармакологического исследования гепатопротекторного действия разработанных тритурационных таблеток, содержащих кислый регуляторный белок печени КРС.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на 65-й юбилейной открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Волгоград, апрель 2007 г.), ежегодной научной региональной конференции Пятигорской государственной фармацевтической академии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2008г.), конгрессе «Человек и лекарство» (г. Краснодар, 1819 октября 2008 г.).

По материалам диссертационной работы опубликовано 7 работ. В научных изданиях, входящих в перечень ВАК, опубликованы 3 работы.

Связь задач исследования с планом НИР учреждения, где выполнялась диссертация.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорская ГФА Росздрава. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 160 странице машинописного текста в компьютерном наборе, содержит 23 таблицы, 31 рисунок, 168 литературных ссылок. Состоит из введения, обзора литературы, главы второй, по

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Привалов, Игорь Михайлович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя полученные в данном исследовании результаты, можно заключить следующее.

Создание новых гепатопротекторных средств, повышающих резистентность печени к действию химических агентов и способных усиливать регенеративные процессы, является актуальной проблемой биологии и медицины. Одним из перспективных направлений расширения спектра гепатопротекторов следует считать поиск гепатозащитных средств среди соединений животного происхождения.

Нами рассматривалось создание лекарственного препарата на основе кислого регуляторного белка, выделенного из печени крупного рогатого скота.

По предварительным исследованиям РБП стимулирует функцию паренхиматозных клеток печени, что обеспечивает восстановление нарушенной структуры ткани печени и тормозит развитие в ней патологических процессов.

Разработанный препарат предполагалось использовать в качестве протектора, предотвращающего развитие цирроза печени различной этиологии, а также как лечебно-профилактическое средство в реабилитационный период после заболевания вирусными гепатитами и после де-токсикации организма.

В связи с этим, необходимо было провести исследования по совершенствованию биотехнологической схемы получения субстанции кислого регуляторного белка из печени, адаптировать её для печени КРС, провести расширенное изучение специфической активности и эффективности гепатозащитного действия полученной субстанции на моделях in vitro и in vivo в сравнении с эталонными гепатопротекторами. Необходимо было создать лечебно-профилактическое средство, разработать технологию его производства и провести его комплексное исследование.

Разработанная ранее методика выделения регуляторных белков легла в основу первой стадии технологического процесса получения кислого регуляторного белка из печени крупного рогатого скота.

Согласно результатам исследования, для печени КРС нами определены оптимальные параметры, оказывающие влияние на процесс выделения РБ из ткани печени: экстрагирующий состав, величина рН, соотношение сырье - экстрагент, температурный режим экстрагирования, метод экстрагирования, продолжительность стадий процесса, а также оптимальные параметры очистки РБ из получаемого извлечения. Предложенная технология экстракции печени обеспечивает эффективное использование животного сырья и соответствует принципам ресурсосбережения.

Скрининговые исследования полученной субстанции на модели Paramecium caudatum выявили полное отсутствие острой и хронической токсичности. В хроническом опыте при культивировании Paramecium caudatum добавление раствора регуляторного белка приводило к увеличению темпа размножения более чем в 20 раз. Указанная тенденция сохранялась и при уменьшении концентрации и носила полимодальный характер. Данные исследований «доза — эффект» тесно коррелируют с данными полученными Институтом биологии развития им. Н.К.Кольцова. Максимумы плотности инокулята и максимумы мембранотропной активности наблюдались при одних и тех же концентрациях, что дает основание использовать культуру Paramecium caudatum для определения специфической активности субстанции регуляторного белка печени.

Данные, полученные в настоящей работе, показали также способность субстанции РБ оказывать стимулирующее действие в отношении жизнеспособности гепатоцитов в культуре, подвергшихся интоксикации индометацином.

На отдельной экспериментальной модели in vivo было показано, что применение субстанции РБП уменьшает жировую дистрофию печени, снижает продолжительность гексеналового сна, уменьшает потерю массы животного при интоксикации тетрахлорметаном, что свидетельствовало о гепатозащитном действии субстанции и явилось основанием для создание препарата на её основе.

Правильно подобранные лекарственная форма и её состав должны гарантировать не только удобство применения, точность дозировки, стабильность, но и высокую степень биологической доступности, эквивалентной активности исходной субстанции. Поэтому с учетом совокупности химико-фармацевтических свойств регуляторных белков была выбрана форма введения действующего вещества - тритурационные таблетки.

Подбор вспомогательных веществ и выбор технологической схемы в значительной степени определялся специфической биологической активностью действующего вещества в СМД. В результате комплексной оценки различных веществ и их композиций предложен состав вспомогательных веществ, обеспечивающих регламентируемое качество разработанному лечебно - профилактическому средству.

Были разработаны состав и технологическая схема производства тритурационных таблеток с регуляторным белком печени, даны рекомендации по стадиям технологического процесса.

При нормировании качества тритурационных таблеток «Гепотрит» в качестве критериев стандартизации были рассмотрены: внешний вид, вкус раствора, внешний вид раствора, запах раствора, размеры, прочность на сжатие, прочность на истирание, подлинность. Определение подлинности разработанных таблеток проводили методом биотестирования на наличие специфической активности. Подтвержден мембранотропный эффект, что свидетельствует о подлинности препарата.

Высокая биологическая доступность и выраженные фармакотера-певтические свойства разработанного лечебно- профилактического средства подтверждены результатами оценки его гепатопротекторной активности при экспериментальном CCI4 гепатите. Под влиянием тетрахлорме-тана развивалось тяжелое поражение печени, характеризующееся развитием синдрома цитолиза и холестаза, гипербилерубинемией, жировой дистрофией печени, нарушением гликосинтетической функции печени. Лечебно-профилактическое применение препарата ослабляло вызванную введением CCI4 гиперлипиденимию и противодействовало накоплению в печени триглицеридов. Под влиянием разработанного препарата подвергался обратному развитию синдром холестаза, что проявилось в снижении содержания билирубина и щелочной фосфотазы в крови. Разработанный препарат улучшил барьерную функцию мембран, препятствовал развитию цитолиза гепатоцитов.

Эффективность действия тритурационных таблеток «Гепотрит» сравнима с карсилом, но в отношении нормализации содержания АлАт в сыворотке крови превышает действие этого гепатопротектора. Комбинация исследуемого препарата с экстрактом кукурузных рылец проявила менее выраженный мембраностабилизирующий эффект и не превосходила исследуемый препарат и экстракт кукурузных рылец при раздельном назначении по способности устранять нарушения липидного обмена и стимулировать антитоксическую функцию печени.

Таким образом, разработанный препарат обладает фармакотерапев-тической активностью, эквивалентной исходной субстанции.

На разработанное оригинальное гепатопротекторное средство животного происхождения - тритурационные таблетки «Гепотрит», полученное на основе кислого регуляторного белка печени крупного рогатого скота, разработан комплект нормативных документов: технологическая инструкция и технические условия. Технология их производства апробирована на базе ООО НПФ «ФИТЭКО» . На усовершенствованную технологию производства субстанции составлен лабораторный регламент и утвержден на производствах: ЗАО «Центрально-Европейская фармацевтическая компания»,' ООО « Биотехнология -07».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Привалов, Игорь Михайлович, Пятигорск

1. Авдеева, Е.В. Теоретическое и экспериментальное обоснование лекарственных растений, содержащих фенилпрепаноиды, для получения гепатопротекторных и иммуномодулирущих препаратов: Автореф. дис. .. докт. фармац. наук. / Е.В. Авдеева - Пермь, 2006. - 45с.

2. Алейникова, Т.Л. Руководство к практическим занятиям по биохимии / Т.Л. Алейникова, Г.В. Рубцова - М.: Высшая школа, 1988.239с.

3. Алексеев, В.В. Современные органотерапевтические препараты /В.В. Алексеев, В.Е. Белай, З.К. Бодина и др. - М.: ВНИИМП,1984. 69с.

4. Аношин, Н.М. Теоретические основы массообменных процессовпищевых производств/ Н.М. Аношин — М.: «Пищевая промышленность», 1970.-216с.

5. Архипенко, В.И. Структура и функции межклеточных контактов /В.И. Архипенко, Л.В. Гербильский, Ю.П. Черненко и др. // Структура и функции биологических мембран - М.: Наука. 1975. 77-95.

6. Арчаков, А.И. Молекулярные механизмы взаимодействия четыреххлористого углерода с мембранами эндоплазматического ретикула печени / А.И. Арчаков, И.И. Карузина // Успехи гепатологии. - Рига, 1973.-С.14-23.

7. Арчаков, А.И. Окисление чужеродных соединений и проблемы токсикологии / А.И. Арчаков, И.И. Карузина // Вестник АМН СССР. 1988. - № 1 . - 14-23.

8. Балабаньян, В.Ю. Разработка системы скрининга лекарственных веществ антиоксидантного и мембраностабилизирующего типов действия: Автореф. дис. .. канд. фармац. наук/ В.Ю. Балабаньян. — М., 1998.-24с.

9. Балаковский, Д. Методы химического анализа крови /С.Д. Балаковский. - М., 1953. -295с.

10. Беленький, Н.Г. Некоторые вопросы теории и практики производстваорганотерапевтических препаратов / Н.Г. Беленький //Мат. к совещанию научнотехн. совета по координации научно-исслед. работ в мясн. пром. - М . , 1961.- 104с.

11. Беликов, В.Г. Фармацевтическая химия / В.Г. Беликов — М.: Высш.школа, 1993.-Т. 1.-520с.

12. Белобородов, В.В. Методы расчета процесса экстракции растительных масел / В.В. Белобородов - М.: «Пищепромиздат», 1960. — 215с.

13. Белоусов, Ю.Б. Клиническая фармакология и фармакотерапия: Руководство для врачей изд-е 2-е./ Ю.Б. Белоусов, B.C. Моисеев, В.К. Лепахин, - М.: "Универсум паблишинг", 1997. - 426с.

14. Богдан, А.С. Популяция одноклеточных организмов как модель интегральной оценки воздействия вредных факторов/ А.С. Богдан // Тез. докл. Всесоюзной конф. - М., 1989. - 12-13.

15. Борисенко, А.В. Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих: Дис. .. канд. биол. наук / А.В. Борисенко - М., 2007. - 139с.

16. Буеверов, А.О. Место гепатопротекторов в лечении заболеваний печени/А.О. Буеверов//РМЖ.-2002.-№1. 12-28.

17. Бунятян, Н.Д. Природные антиоксиданты как гепатопротекторы /Н.Д. Бунятян, О.А. Герасимова, Т.С. Сахарова и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1999. — Т. 62.- №2. — 64-67.

18. Бурновский, И.В. Основы экологии свободноживущих инфузорий:Автореф. дис. .. докт. биол. наук / И.В. Бурновский. - М., 1986. 43с.

19. Владимиров, Ю.А Перекисное окисление липидов в биологическихмембранах / Ю.А.Владимиров - М.: Медицина, 1979. - 258с.

20. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологическихмембранах / Ю.А.Владимиров, А.И. Арчаков — М.: Медицина, 1992. — 252с.

22. Гладских, Л.В. Оценка жизнеспособности клеток печени свиней /Л.В. Гладских, М.Ю. Штукарева // Мясная индустрия. - 1993. - № 4. - С . 25-26.

23. Гладских, Л.В. Создание новых тканевых препаратов на основе гепатоцитов для коррекции функции печени: Автореф. дис. .. докт. фармац. наук / Л.В. Гладских - М., 1997. - 40с.

24. Горбаков, В.В. Гептрал - новое средство лечения диффузных болезней печени / В.В. Горбаков, А.В. Калинин, В.П. Галик и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - Т.8, №4. - 98-102.

25. Горбаков, В.В. Опыт применения гептрала в лечении диффузных заболеваний печени / В.В. Горбаков, В.П. Галик, С М . Кириллов // Терапевтический архив. - 1998. - Т.70, № 10. - 82-86.

26. Гордиенко, А.Д. Гепатозащитное действие липофена — нового комбинированного фосфолипидного препарата природного происхождения / А.Д. Гордиенко // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2001. - Т. 64, № 3. - 45-47.

27. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа/ МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - 336с.

28. Громашевска, Л.Л. Деяки замечание к исследованию активностиаминотрансфераз и толкованию их результатов у больных с патологией печенки / Л. Л. Громашевска // Лабораторная диагностика. — 1997.- №2. - С . 7-11.

29. Грошовый, Т.А. Оптимизация процессов создания и исследованиетаблетированных лекарственных препаратов: Автореф. дис. .. докт. фармац. наук / Т.А. Грошовый. — Харьков, 1989. - 45 с.

30. Губский, Ю.И. АТФ-азная активность митохондрий печени при остромотравлении тетрахлорметаном / Ю.И. Губский // Укр. биохим. журн. — 1982. -Ml.- 46-50.

31. Губский, Ю.И. Коррекция химического поражения печени / Ю.И. Губский. -Киев: Здоров'я, 1989. - 168 с.

32. Губский, Ю.И. Транспорт кальция и перекисное окисление липидов вмикросомах печени при острой интоксикации тетрахлорметаном / Ю.И. Губский, А.П. Заика, Е.Д. Левицкий и др. // Фармакология и токсикология. - 1990. - № 25. - 90-93.

33. Гуров, В.А. Производство органопрепаратов / В.А. Гуров. - М.: Пищ.пром., 1976.-171 с.

34. Диагностика и лечение диффузных заболеваний печени. Методическое пособие / Под ред. В.Т.Ивашкина, Н.Д.Юшука. - М., 2003. - 64 с.

35. Дэвени, Т. Аминокислоты, пептиды и белки: пер. с англ. / Т. Дэвени,Я. Гергей. - М.: Мир, 1976. - 368 с.

36. Евтушенко, Н.С. Методы контроля консервантов, используемых приизготовлении органопрепаратов и некоторых других лекарственных форм / Н.С. Евтушенко, И.В. Пахомова //Фармация. - 1988. - Т. 37, N 8 . - 76-81.

37. Журавель, Е.В. Фосфолипидные препараты в гепатологии: реалии иперспективы / Е.В. Журавель, СМ. Дроговоз // Провизор. — 1998. Ш2.-С.12-17.

38. Загребельный, Н. Количественные методы определения белка. Обзорная информация ВНИИ СЭНТИ / Н. Загребельный, В.И. Пупкова-М., 1986.-110 с.

39. Заявка на патент РФ № 93025259/14 Способ консервирования интактных клеток печени / Гладских Л.В., Уша Б.В., Бруслик В.Г. и др. // Заявлено 30.04.93. положит, реш. от 23.05.95. - 40 с.

40. Зоров, B.C. Исследование возможностей применения методов корреляционной спектроскопии в биотестировании / B.C. Зоров, А.В.Пожаров // Известия ЛЭТИ. - 1990. - вып. 428. - 32-36.

41. Ильченко, Л.Ю. Гепатопротекторы при хронических заболеванияхпечени / Л.Ю. Ильченко, Т. И. Карлович // Фарматека. - 2007. №8/9.-С. 54-58.

42. Калинина, Э.Н. Патогенетическое обоснование использования цеолитсодержащих препаратов в терапии вирусного гепатита: Автореф. дис. .. канд. фармац. наук / Э.Н. Калинина. - Пятигорск, 2005. - 24 с.

43. Камышников, B.C. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике / B.C. Камышников. — М.: МЕДПресс-информ, 2004. - 920 с.

44. Кафаров, В.В. Основы массопередачи / В.В. Кафаров. - М.: «Высшаяшкола», 1972.-245 с.

45. Клиническая биохимия / Под ред. В.А. Ткачука. - 2е изд., испр. идоп. - М.: «Гэотар-Мед». - 2004 г. - 512 с.

46. Колб, В.Г. Справочник по клинической биохимии / В.Г. Колб, B.C.Камышников. - Минск, 1982. - 248 с.

47. Краснов, М.С. Исследование влияния регуляторного белка, выделенного из хрусталика глаза быка, на катарактогенез у крыс in vitro / М.С. Краснов, Е.П. Гурмизов, В.П. Ямскова и др. // Вестник офтальмологии. - 2005. - Т. 121, №1. - 37-39.

48. Краснов, М.С. Регуляторные белки тканей глаза позвоночных /М.С. Краснов, Э.Н. Григорян, В.П. Ямскова и др. // Радиционная биология и радиоэкология. - 2003. - N3. — 265-268.

49. Крыжановский, А. Современные лекарственные препараты:Полное практич. руководство / А. Крыжановский, М.Б. Витинова - М.: Рипол классик, 1998. - 1040 с.

50. Кузнецова, Е. Л. Новые данные о молекулярных механизмах гепатобилиарного транспорта / Е.Л. Кузнецова, Е.Н. Широкова, В.Т. Ивашкин // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2006. — № 6. - 8-11.

51. Кучеренко, Н.Е. Биохимия: Практикум / Н.Е. Кучеренко,Ю.Д. Бабенюк, А.Н. Васильев. - Киев: Выща школа, 1988. -128 с.

52. Кушманова, О.Л. Руководство к практическим занятиям по биологической химии / О.Л. Кушманова, Г. М. Ивченко - М.: Медицина, 1983.-272 с.

53. Легин, Г.Я. Консервация косметических изделий и эффективные современные консерванты / Г.Я. Легин, Н.М. Шехтман, В.М. Андреев // Хим. Фармац. журн. - 1983. - Вып. 3. - 1-36.

54. Логинов, А.С. Клиническая морфология печени / А.С. Логинов,Л.И. Аруин - М.: Медицина, 1985. - 239с.

55. Любшина, О.В. Эффективность различных гепатопротекторов припеченочной энцефалопатии/ О.В. Любшина, В.Е. Гречко, А.Л. Верткий и др. // Клиническая медицина. - 1999. - Т.77, № 10. - 17-20.

56. Лященко, В.И. Биотранформация ксенобиотиков - детоксикация илиусиление токсичности / В.И.Лященко, В.Н. Черкаль // Гигиена и санитария. - 1990. - №5. - 56-59.

57. Маев, И.В. Лечение и профилактика печеночной энцефалопатии гепатопротекторами / И.В. Маев, К.Г. Гуревич // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2001.— Т.11, № 4 . - С . 41-45.

58. Маленков, А.Г. Межклеточные контакты и реакция ткани /А.Г. Маленков, Г.А. Чуич - М . : Медицина, 1979. - 135 с.

59. Маленков, А.Г. Тканевоспецифические адгезионные факторы - G1 кейлоны / А.Г. Маленков, Е.А. Модянова, В.П. Ямскова // Биофизика. — 1977. — Т.22.-С.156-157.

60. Маргасюк, Д.В. Исследование регуляторного белка, выделенного изроговицы глаза быка. Выделение, очистка, локализация в ткани и биологическая активность / Д.В. Маргасюк, М.С. Краснов, В.П. Ямскова и др. // Офтальмология. - 2005. - Т.2, № 3. - 81-87.

61. Машковский, М.Д. Лекарственные средства. Пособие для врачей, 14е изд-е./ М.Д. Машковский - М.: Новая Волна, 2002. - Т.1. - 540 с.

62. Меркулов, Г.А. Курс патогистологической техники / Г.А. Меркулов- М.: Высш. шк.- 1963. - 129-142.

63. Методические указания к лабораторным занятиям по биохимии / Подред. В.В. Рудакова. - М.:Медицина, 1986. - 54 с.

64. Минушкин, О.Н. Некоторые гепатопротекторы в лечении заболеваний печени / О.Н. Минушкин // Лечащий врач. - 2002. - № 6. - 5558.

65. Муравьев, И.А. Технология лекарств: Учеб. для учащихся фармац, вузов / И.А. Муравьев - М.: Медицина, 1980. - Т.2. - 783 с.

66. Нидерау, К. Интерферон и эссенциальные фосфолипиды в лечениихронических вирусных гепатитов В и С / К. Нидерау // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 1998. — Т. 9, № 5. - 67-68.

67. Николаенко, А.Н. Концептуальные подходы в разработке высокоэффективных лекарственных препаратов нового поколения класса "Эрбисол" / А.Н. Николаенко // Физический вакуум и природа. - 1999. № 4 . - С . 129-136.

68. О применении препарата легалон при хронических заболеваниях печени /А.Л. Гребнев, B.C. Голочевская, А.С. Кузнецов, И.Н. Дорогунцева // Клиническое значение препарата легалон: Материалы симпоз., 7 апр. .1981г.-М., 1981.-С. 104-107.

69. Оковитый, СВ. Клиническая фармакология гепатопротекторов /СВ. Оковитый // Фарминдекс Практик. - 2002. - №3. - 28-38.

70. Ольшевская, Л.В. Влияние ионов кальция и магния на ультраструктуру контактов клеток печени / Л.В. Ольшевская, Е.А. Модянова // Цитология. - 1971. - T.XIII, №.1. - 37-42.

71. ОСТ 91500.05.001.00. Стандарты качества лекарственных средств.Основные положения. - М.: Изд.-во стандартов, 2001, — 45 с.

72. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот:Электрофорез и ультрацентрифугирование / Л.А. Остерман - М.: Изд-во Наука, 1981. - 536 с.

73. Патобиохимия / Под ред. Е.А. Строева, В.Г. Макаровой, Д.Д. Пескова. - М.: ГОУ ВУНМЦ, 2002. - 234 с.

74. Пономарёв, А.Б. Гос.вет.надзор за безопасностью продукции животного происхождения / А.Б. Пономарёв, А.С. Герасимов, Н.В. Баркова // Ветеринария. - 1998. - № 7. - 3-9.

75. Пономарёв, В.Д. Исследование процесса экстрагирования и технологии препаратов корней солодки: Дис. .. докт. фармац. наук. / В.Д. Пономарёв - Тбилиси, 1972. — 452 с.

76. Пономарёв, В.Д. Экстрагирование лекарственного сырья /В.Д. Пономарёв - М.:«Медицина», 1976. - 410 с.

77. Практикум по биоорганической химии / Под ред. В.А.Стоник. - Владивосток: Изд-во ДВГУ, 2002. - 156 с.

78. Практикум по биохимии / Под ред. Н.И. Мешковой и акад. СЕ. Севергина. - М.: изд. МГУ, 1979. - 158 с .

79. Радченко, В.Г. Гепасол А в лечении хронических заболеваний печени с проявлениями системной энцефалопатии / В.Г. Радченко, О.Н. Радченко // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2002. - Т. 12, № 2. - 73-76.

80. Ребиндер, П.А. О методе погружения конуса для характеристикиструктурно-механических свойств пластично-вязких тел / П.А. Ребиндер, Н.А. Семененко // Докл. АН СССР, 1949. - Т.64. - 835-838.

81. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии /Под ред. Т.Т. Березова. - М.: Медицина, 1976. - 294 с.

82. Руководство по ветеринарно-санитарной экспертизе и гигиене переработке животных продуктов / Под редакцией профессора. И.В. Щура. М.: Медицина, 1992. - 616с.

83. Рыбакова, Е.Ю. О возможном механизме, лежащем в основе методабиотестирования in vitro регуляторных белков, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах / Е.Ю. Рыбакова // Онтогенез. - 2005.-Т.36,№3.- 234-235.

84. Сампиев, A.M. Исследование полисахаридов кукурузных рылец /A.M. Сампиев, Е. Б. Никифорова //Кубанский научный медицинский вестник. - 2006. - № 1-2. - 96-98.

85. Саратиков, А.С. Новые гепатопротекторы природного происхождения / А.С. Саратиков, А.И. Венгеровский // Эксперим. и клинич. фармакология. - 1995. - № 1 . - 8-11.

86. Сахатов, Э.С. Создание твердых лекарственных форм./ Э.С. Сахатов,А.А. Коканов, В.И. Чуешов и др. - Ашгабад, 1992. - 157 с.

87. Сборник технологических инструкций по предубойной подготовке,переработке скота, обработке продуктов и производству технической продукции: Сб. науч. тр. - М.:Пищевая пром., 1979. - 146 с.

88. Скакун, Н.П. Клиническая фармакология гепатопротекторов /Н.П. Скакун, В.В. Шманько, Л.М. Охримович — Тернополь: Збруч, 1995.-272 с.

89. Скакун, Н.П. Экспериментальная фармакотерапия повреждений печени, вызванных индометацином / Н.П. Скакун, Е.В. Климнюк // Фармакология и токсикология. - 1990. - Т.53, №6. - 52-54.

90. Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс — М., «Мир», 1985.430 с.

91. Смирнов, А.Л. Консерванты для продуктов личной гигиены /А.Л. Смирнов, Д. Пател // Вторая Международная научнопрактическая конференция "Биологически активные вещества и новые продукты в косметике" (Тезисы докладов). — 1997. — 22-24.

92. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. - М., 2007.-1522 с.

93. Строев, Е.А. Практикум по биологической химии / Е.А.СтроевМ.:Высщая школа, 1986.-231 с.

94. Тенцова, А.И. Руководство к лабораторным занятиям по заводскойтехнологии лекарственных форм / А.И. Тенцова - М.: Медицина, 1986.-272 с.

95. Ушаков, В.Ф. Адгезионная прочность ультраструктурных элементовконтактов гепатоцитов / В.Ф. Ушаков, Ю.П. Черненко // Биофизика. 1978.- Т.23,№3.-С.558-559.

96. Ушаков, В.Ф. Состояние клеточной поверхности гепатоцитов придействии четыреххлористого углерода / В.Ф. Ушаков, Л.А. Палиенко, К.И. Лившиц и др. // Архив анат., гистол. и эмбриол. -1990.-№12.-С.44-48.

97. Ушкалова, Е.А. Проблемы применения гепатопротекторов /Е.А. Ушкалова // Фарматека. - 2004. - № 4. - 45-55.

98. Хазанов, А.И. Особенности лекарственных и вирусно-лекарственныхпоражений печени /А. И. Хазанов, О. Н. Румянцев. А.В. Калинин и др. // Кремлевская медицина. Клинич. Вести. - 2000. - №1. — 3-10.

99. Харченко, Н.В. Современные гепатопротекторы в комплексном лечении больных хроническим гепатитом / Н.В. Харченко, Т.В. Бородина // Провизор. - 1999. - №5. - 5-12.

100. Чуешов, В.И. Промышленная технология лекарств: В 2 т. /В.И. Чуешов - Харьков: НФАУ МТК-Книга, 2002. - Т.2. - 567 с.

101. Чучалин, B.C. Фармакологические и технологические аспекты разработки новых гепатопротекторных препаратов природного происхождения: Дис. .. докт. фармац. наук. / B.C. Чучалин. - Томск, 2003. 317 с.

102. Энциклопедия клинических лабораторных тестов / Под ред.Н.У. Тица, - М.:«Мир», 1997. - 317с.

103. Эффективность гепатозащитных средств при экспериментальномхроническом гепатите / А.С. Саратиков, А.И. Венгеровский, Н.О. Батурина, B.C. Чучалин // Эксперим. и клинич. фармакология. - 1996. № 1 . - С . 24-26.

104. Ямсков, И.А. Низкомолекулярный гликопротеин из сыворотки кровикрупного рогатого скота: структура и свойства / И.А. Ямсков, А.А. Виноградов, А.Н. Даниленко и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2001. - Т.37, №1. - 36-42.

105. Ямсков, И.А. Фармакологические препараты нового поколения наоснове ранее неизвестных биорегуляторов-гликопротеинов клеточного микроокружения / И.А. Ямсков, В.П. Ямскова // Рос. хим. ж. (ЖРХО им. Д.И. Менделеева). - 1998. - Т.42, №3. - 85-90.

106. Ямскова, В. П. Низкомолекулярный полипептид сыворотки кровитеплокровных: влияние на клеточную адгезию и пролиферацию / В.П. Ямскова, М.М. Резникова // Журнал общей биологии. — 1991. — Т. 52,№2,-С. 181-191.

107. Ямскова, В.П Адгезивные белки тканей млекопитающих: Дис. ..докт. биол. наук. / В.П. Ямскова — М., 2003. - 356 с.

108. Ямскова, В.П. Высокоактивные тканевоспецифические адгезионныефакторы печени и легкого / В.П. Ямскова, Е.А. Модянова, М.М. Резникова и др. // Молекулярная биология. — 1977. — Т.11, №5. - С . 1147-1154.

109. Ямскова, В.П. Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови млекопитающих / В.П. Ямскова, Е.Ю. Рыбакова, А.А. Виноградов и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т.40, №4, - 407-413.

110. Ямскова, В.П. Макромолекулярные факторы Са-зависимой адгезииклеток печени / В.П. Ямскова, Н.Б. Туманова // Известия Акад. наук. Серия биол. - 1994. - №5. - 732-737.

111. Ямскова, В.П. Низкомолекулярный полипептид сыворотки крови теплокровных: влияние на клеточную адгезию и пролиферацию / В.П. Ямскова, М.М. Резникова // Журнал общей биологии. - 1991. — Т.52,№2.-С.181-191.

112. Ямскова, В.П. Роль ионов кальция в стабилизации адгезионного фактора печени крыс / В.П. Ямскова // Биофизика. — 1978. - Т.23. 428-432.

113. Ямскова, В.П. Роль макромолекулярных компонентов клеточной поверхности в специфической адгезии клеток / В.П. Ямскова, М.М.Резникова // Успехи биологической химии. - 1979. - Т.20. 95-112.

114. Ямскова, В.П. Сравнительное исследование действия экстрактов печени мышей линии С57В1 и СВА на адгезию гепатоцитов / В.П. Ямскова, Н.Б. Туманова, А.С. Логинов // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1990. - №3, - 303-306.

115. Ahmad, F. Detection of free radical formation in various tissues afteracute carbon tetrachloride administration in gerbil / F. Ahmad, D. Cowan, A. Sun // Life Sci. - 1987. - Vol. 41, № 22. - P. 2469-2475.

116. Anderson, H. Adhesion molecules and animal development / H. Anderson// Experientia. - 1990. - V.46- P.2-13.

117. Clarke, H Alpha-glutathione s-transferase (alpha-GST) release, an earlyindicator of carbon tetrachloride hepatotoxicity in the rat / H. Clarke, D.A. Egan, M. Heffernan etal.//Hum. Exp. Toxicol. -1997. -Vol. 16, №3. -P. 154-157

118. Council Directive 76/768 EEC on the approximation of laws of the Member States relating to cosmetic products.- August 1993.- 13 p.

119. Decrease in protein kinase and phosphatase activities in the liver nuclei ofrats exposed to carbon tetrachloride / M. Omura, T. Katsumata, H. Misawa, M. Yamaguchi // Toxicol. Appl. Pharmacol. — 1999. — Vol. 15, № 160(2).-P. 192-197.

120. Freshney, R. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4thed. / R. Freshney // Wiley-Liss, New York. -2000. - P . 90-91

121. Gebhardt, R. Oxidative stress, plant-derived antioxidants and liver fibrosis/ R. Gebhardt // Planta Med. - 2002. - №68. - P.89-96.

122. Gordon, A. Effects of Silybum marianum on serum hepatitis Cyir.usRNA, alanine aminotransferase levels and well-being in patients with chronic hepatitis / A. Gordon, D.A. Hobbs, D.S. Bowden, et al. I 1С J Gastroenterol Hepatol. -2006. -№2. - P.75-80.

123. Kataria, M. Hepatoprotective effect of Liv-52 and kumaryasava on carbontetrachloride induced hepatic damage in rats / M. Kataria, L.N. Singh // 1.dian J. Exp. Biol. - 1997. - Vol. 35, № 6. - P. 655-657

124. Kretzschmar, M. The hepatic glutathione system / M. Kretzschmar, W.Klinger// Exp. Pathol. - 1990. - Vol. 38, № 3. - P. 155-164.

125. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4. / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - P. 680685.

126. Li, A.P. Primary hepatocyte cultures as in vitro experimental model forxenobiotic metabolism and toxicology / A.P. Li, // Comments Toxicology. - 1998. - Vol.6, №3. -P. 199-220.

127. Margasyuk, D.V. Regulatory Protein from Bovine Cornea: Localizationand Biological Activity", pp. 47-59 / D.V. Margasyuk, M.S. Krasnov,

128. V. Blagodatskikh et all // In the book "Biochemical Physics Frontal Research". - 2006. - P. 47-49/

129. Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. Electron immunohistochemical studies in normal rat liver / A. Martinez-Hernandez // 1.b. Invest. - 1984. - V.51. - P.57-75.

130. Monohydroperoxides of linoleic acid in endoplasmic lipids of rats exposed to tetrachloromethane / H. Franc, M. Vlegand, M. Steker, D. Thel // 1.pids. - 1987. - Vol. 22, № 10. - P. 689-697.

131. Muriel, P. Prevention by silimarin of membrane alterations in acute CCI4liver damage/ P. Muriel, M. Mourelle //. JAppI Toxicol. - 1990. - P. 7579.

132. Nicola, N. Guidebook to cytokines and their receptors / N. Nicola // ASambook and Tooze Publication.Oxford University Press. O. N.Y.T. — 1994.-P.261.

133. Nishida, K. Gamma-glutamylcysteinylethyl ester attenuates progressionof carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice / K. Nishida, Y. Ohta, I. Ishiguro//Toxicology. - 1998. - Vol. 20, № 126(1). - P. 55-63.

135. Reducing the Use of Laboratory Animals in Biomedical Research: Problems and Possible Solutions The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 29,1999. - P . 283-301.

136. Sailer, R. The use of silimarin in the treatment of liver diseases / R. Sailer,R. Meier, R. Brignoli // Drugs. - 2001. -P. 35-63.

137. Salmi, H.A. Effects of silimarin on chemical, functional and morphological alterations of the liver. A double-blind controlled study / H.A. Salmi, S. Sarna // Scand J Gastroenterol. - 1982. - P. 17-21.

138. Schagger, H. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. / H. Schagger, von G. Jagow // Anal. Biochem. - 1987. - P. 368-379.

139. Schuppan, D. Herbal products for liver diseases: A therapeutic challengefor the new millennium. / D. Schuppan, J. Jia, B. Brinkhaus, E.G. Hahn // Hepatology.- 1999.-Vol. 3 0 . - P . 99-104.

140. Singh, J. Protection of CCL4-induced liver damage in rats by some calcium channel blockers / J. Singh, A.H. Kaur, S.K. Mathur // Indian J. Physiol. Pharmacol. - 1995. - Vol. 39, № 3. - P. 275-278.

141. Sonnenbichler, J. Biochemical effects of the flavolignan silibinin onRNA, protein, and DNA synthesis in rat liver / J. Sonnenbichler // Progn Clin Biol Res.-1986.-Vol. 213, № 3 . - P. 19-31.

142. Sundari, P.N. Does oxidative protein damage play a role in the pathogenesis of carbon tetrachloride-induced liver injury in the rat / P.N. Sundari, G.W. Ramakrishna // Biochim. Biophys. Acta. - 1997. - Vol. 31, № 1362(2-3).-P. 169-176.

144. Tsokos-Kuhn, J. Evidence in vivo for evaluation of intracellular freeС a in the liver after diquat, acetaminophen and CCI4/ J. Tsokos-Kuhn // Biochem. Phar-macol. - 1989. - Vol. 38, №8. - P. 3061-3065.

145. Varghese, L. Silibinin Efficacy against Human Hepatocellular Carcinoma/ L. Varghese, C. Agarwal, A. Tyagi et al. // Clin Cancer Res. - 2005. Vol. 11, №84. - P . 41-48.

146. Waller, R. Evaluation of a role for phosgene production in the hepatotoxicmechanism of carbon tetrachloride and bromteichlormethane / R. Waller, R. Recknagel// Toxicol, and Appl. Pharmacol. - 1982 - Vol.66, №2 - P. 172-181.

147. Westermeier, R. Electrophoresis in Practice/ R. Westermeier // WeinheimNew York: WILEY-VCH. - 2001. - P.350.

Информация о работе

Привалов, Игорь Михайлович
кандидата биологических наук
Пятигорск, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Биотехнологические исследования и разработка состава лечебно-профилактического средства на основе регуляторных белков гепатопротекторного действия - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы