Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическое действие пептидов лактоферрина и α-лактальбумина на желудочно-кишечный тракт

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биологическое действие пептидов лактоферрина и α-лактальбумина на желудочно-кишечный тракт"

На правах рукописи

САМОХИНА Людмила Сергеевна

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДОВ ЛАКТОФЕРРИНА И а-ЛАКТ АЛЬБУМИНА НА ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫЙ ТРАКТ

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехпологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0050Ьо»оо

Ь ! І

Москва 2013

005058988

Работа выполнена в ФГБУ Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН в лаборатории молекулярной инженерии и ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» на кафедре «Технология молока и молочных продуктов»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Комолова Галина Сергеевна

доктор химических наук, профессор Тишков Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

Донская Галина Андреевна

доктор биологических наук, профессор Заведующая лабораторией ресурсосберегающих процессов и специальной тематики

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности

Гунар Людмила Эдуардовна доктор биологических наук, доцент Заведующая кафедрой технологии хранения и переработки плодов и овощей Российский государственный аграрный университет - Московская сельскохозяйственная академия К.А.Тимирязева

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие

Государственный научно- исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится 11 июня 2013 г в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

Тел. 8(495)939-54-83, эл. почта: npisktinkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан_мая 2013 года.

ичртшй гртртяш. /*

------------1-----г- ¿л

Диссертационного совета, к.б.н. <1/.Д Пискункова Нина Федоровна

' Т СП/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

В условиях неблагоприятной экологии рост вторичных иммунодефицитных состояний, определяет необходимость повышения неспецифической резистентности здоровых и больных людей, улучшения функционирования естественных систем де-токсикации и механизмов обеспечения иммунобиологической реактивности организма. Это становится возможным за счет использования в качестве активной основы в продуктах профилактического и лечебного назначения природных физиологически активных соединений. Молоко и его компоненты, прежде всего белки - продукты питания животного происхождения, потребляемые с первых дней жизни. Они участвуют в энергетических и транспортных процессах, осуществляют регуляторную и защитную функции.

Особое внимание заслуживают сывороточные белки молока лактоферрин (ЛФ) и а-лактальбумин (а-ЛА). Лактоферрин в последние годы привлекает большое внимание исследователей в связи с его полифункциональностью, направленной на поддержание гомеостаза животного организма. Он обладает антибактериальным, противовирусным, бифидогенным действием, является фактором роста, переносчиком железа, участвует в метаболических процессах, способен катализировать различные биохимические реакции, обладая РНКазной, ДНКазной, лактопероксидазной активностями. Что касается а-ЛА, второго после р-лакгоглобулина по содержанию в молоке белка, то это прежде всего белок, который содержится в высоких концентрациях в молоке, при этом практически не иммуногенен и обладает целым рядом значимых защитных свойств: антимикробным, иммуномодулнрующим, опоидным, антиоксидантным, противоязвенным, противоопухолевым, антигипертензивным, противострессовым, регулирующим клеточный рост.

В последние годы японскими исследователями было показано, что образующиеся при протеолизе пептиды по целому ряду показателей, оказались более активными, чем нативные белки. Открывается перспектива получения новых, более эффективных лечебных и профилактических средств на основе пептидных комплексов. Однако в этом аспекте требуются углубленные структурно-функциональные исследования пептидов при различных условиях протеолиза.

Современные работы в основном направлены на лечение пептидными препаратами заболеваний, в то время как, отсутствуют данные касающиеся их профилактического действия. Есть основание полагать, что наряду с созданием лечебных средств на основе высокоочищенных пептидов, практически целесообразно, в том числе и экономически, разрабатывать профилактические средства на основе комплексов пептидов с различными функциональными свойствами. Это расширяет их физиологическое действие. Данное исследование проводилось с учетом этих положений.

Список сокращений: ЖКТ-желудочно-кишечный тракт; ЛФ-бычий лактоферрин; а-Ла-бычий а-лактальбумин; БСА-бычий сывороточный альбумин; ЛФц - лактоферрицин; ЛФп-лактоферрампин; Р-ЛГ-р-лактоглобулин; ЛП-лактопероксидаза; ГТ-галактозилтрансфераза; ИПХИ-интеграяьный показатель хронической интоксикации; CAMP- база данных антимикробных пептидов; АА-антнмикробная активность; RF- классификационное древо; SVM -векторная машина; DA - дискримйяантный анализ; АОЕ- антиоксидантная ёмкость; ТЕАС -антиоксидантная ёмкость по отношению к катион - радикалу АБТС; ORAC - метод анализа антиоксидантной ёмкости по отношению к пероксилъному радикалу; АБТС - 2,2'-азинобис-(3-этил-бензотиазолинсульфонат); Mr- молекулярная масса; а.о. - аминокислотный остаток;

Цель и задачи исследований.

Целью настоящей работы являлось изучение защитного влияния пептидов ЛФ и a-JIA на желудочно-кишечный тракт и обоснование состава пептидного комплекса противоязвенного, антидисбактериозного, антиоксидантного действия. В соответствии с поставленной целью последовательно решались следующие задачи:

- Изучить пептидный состав гидролизатов ЛФ и а-ЛА и их защитные свойства против повреждений желудочно-кишечного тракта в зависимости от условий протео-литического процесса;

- Установить функциональную связь между пептидным составом гидролизатов и их биологической активностью: противоинфекционной, бифидогенной, противоязвенной, антиоксидантной;

- Изучить совместное защитное действие относительно желудочно-кишечного тракта пептидов ЛФ и а-ЛА;

- Разработать рекомендации по созданию полифункционалыюй пептидной композиции с защитным действием против повреждений желудочно-кишечного тракта.

Научная новизна.

Впервые показано профилактическое и защитное действие пептидов ЛФ, а-ЛА и их комплекса относительно повреждений ЖКТ (противоязвенное, антидисбактериоз-ное);

Установлено наличие в мембране Bifidobacterium Adolecsentis В-1 белка (58 кДа), связывающего лактоферрин и его пептиды;

Теоретически и экспериментально обоснован состав нового пептидного комплекса, рекомендуемого в качестве биологически активной основы средств относительно защиты ЖКТ.

Практическая значимость работы.

С учетом установленных в работе биологических свойств пептидов ЛФ и а-ЛА результаты исследований могут быть использованы в биотехнологических схемах разработок физиологически эффективных препаратов медицинского, косметического, пищевого назначения.

Примененные в работе методологические подходы в исследовании структурно-функциональных свойств пептидов ЛФ и а-ЛА могут рассматриваться как адекватные в разработках методов скрининга пептидов различной функциональной направленности.

На основе пептидного комплекса разработан препарат «ЖКТ-НОРМ», обладающий антимикробным, бифидогенным, антидисбактериозным, антиоксидантным, противоязвенным действием.

Результаты исследования включены в учебный курс лекций по дисциплине «Биологически активные вещества молока».

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были представлены на международных конгрессах, конференциях: Международной научной конференции студентов и моло-

дых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2010 г.); Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012 г.); Ю-й международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (в конкурсе молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу получен диплом и присуждена медаль); Пленарном заседании Ю-й международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2012); Работа выполнялась в рамках гранта РФФИ 10-04-01005-А.

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 публикаций (из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК и 5 тезисов докладов конференций).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы, приложений. Основной текст работы изложен на 183 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 32 рисунка. Библиография представлена 288 источниками, в том числе 199 зарубежных.

Благодарности

Автор выражает благодарность зав. каф. «Технология молока и молочных продуктов» проф., д.т.н. В.И. Ганиной, проф., д.т.н. H.A. Тихомировой, доц., к.т.н. И.И. Ионовой, аспирату Е.С. Шаталовой, аспиранту М.А. Головину, проф. каф. «Химия пиши и пищевая биотехнология» Т.И.Громовых за помошь, оказанную при работе над диссертацией; руководителю лаборатории молекулярных основ биотрансформаций Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук проф., д.б.н. О.В. Королевой за предоставление базы лаборатории для проведения экспериментальных исследований; к.б.н. И.В. Николаеву, аспиранту A.A. Торковой за помощь в проведении исследований; к.ф.-м.н. Кононихину A.A. и сотрудникам лаборатории масспектромет-рии биомакромолекул Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля Российской академии наук. Благодарность сотрудникам ООО «Афродита» - Сторожук Л.Н., Карпову А .Б, Величко Е.А; сотрудникам ЗАО «Захаровский молочный завод»- Коеву P.A., Косоруковой Л.Н., Тереховой Е.Г., Мишиной Е.В. Благодарность за безграничную помощь, терпение и поддержку к.т.н. С.Н. Лисицыну, к.х.н. А.Б. Лисицыной.

Отдельная благодарность научным руководителям проф., д.б.н. Г.С. Комоловой, проф., д.х.н. В.И. Тишкову за неоценимую помощь, понимание, терпение и поддержку на всех этапах работы над диссертацией.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Пептиды ЛФ

Получение и характеристика

Лактоферрин получали катионнообменной хроматографией на сорбенте Macro-Prep СМ - Support (рис.1).

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 70 75 80 85 90 Время, МИН

Рисунок 1 - Хроматографическая очистка ЛФ из коровьего молока на катионо-обменнике Macro Prep CM - Support (Sigma, США)

Белок, соответствующий на хроматограмме пику 2, согласно электрофоретиче-скому и иммуноферментному анализу - ЛФ. Полученный белок гидролизовали свиным пепсином (Sigma, США) с активностью 90 U/мг при 37 °С, pH 2,0 (рис.2).

"Да ....... ■ШПШи11,итдТі«ГТ1___П

16,950Йр§ 14,437p« 6.512 s««»».

SPSI«

Рисунок 2 - Трицин-ПААГ электрофорез пептидных композиций, полученных при гидролизе ЛФ пепсином: А - 2ч (I ЛФ), Б - 4ч (II ЛФ), В - 8ч (III ЛФ), Г - 24 ч (IV ЛФ). М - маркерные белки

При протеолизе пепсином бычьего ЛФ в реакционной среде уже в первые часы отмечалось накопление продуктов распада ЛФ с молекулярной массой ниже 4 кДа. К 4 часам пептидное пятно увеличилось за счет накопления низкомолекулярных пептидов, образующихся при пролонгировании протеолитического процесса. В интервале 8 - 24 часа уровень низкомолекулярной компоненты гетерогенной популяции пептидов существенно не менялся.

Хроматомасспектрометрический анализ полученных гидролизатов ЛФ показан в табл. I.

Таблица 1 - Хроматомасспектрометрический анализ гидролизатов ЛФ

Экспозиция протеолиза, ч Гидролизаты Ам и но кислотная последовательность пептидов Позиция расщепления, № Длина пептида, а.о. Молекулярная масса, Да Скор Mascot

2 1 ЛФ AAPRK.N VRSSTISQPFji GTEgVTAJAN LAEDVGDVA AfTASTTDDilV LRETAEEVKA [19-35] [680-690] [552-560] [201-212] [237-246] 17 10 9 11 10 2039 1038 883 1653 1057 30 41 25 28 36

4 II ЛФ LRPVAAEllGTKESPQTieiAVAVVKKGSN AQVPSfAVVARSVDGKEDL NNSRAPVDA DKgVPNSKEKYYGWTGA DGGillTAGKCGLVPVL LSKAQEKSGK.NKSRS AENRKSSbClSSL PEKADRDQYE AVAVVKKANEG LQDGAGDVA GKNGKNlPDK [93-122] [267-285] [252-260] [397-413] [527-543] [290-304] [431442] [698-707] [454-464] [218-226] ¡638-647] 30 19 9 17 17 15 12 10 И 9 10 3279 1976 1945 1924 1728 1649 1338 1254 1085 844 1061 47 46 32 36 27 29 41 26 29 34 39

8 III ЛФ KDKKSfeHTAVDRTAGiSiNlPJiG LGAPSITlVRRAFA VKNDTVHENTNGESTADpAKN DGTRKPVTEAQSfljf SCAVGPEEQKKCQQl SQSjgAPGADPKSRL IVNQTGSiA [320-340] [48-61] [364-384] [594-607] [467-480] [507-520] [493-501] 35 21 15 14 14 14 9 3318 2377 1568 1525 1464 1415 894 57 29 57 34 41 49 24

24 IV ЛФ llCGEGENQiAPSSREPYF FSASiVPpIDRQAiPNL KfRRiQlRSKK EpPGIAEKKADAVT GRSAGgfllPMGl QGRKSiliTGL GGRPTfEEl [573-590] [172-188] [36-47] [63-77] [139-150] [129-138] [671-679] 18 17 11 15 12 10 9 2005 1887 1604 1547 1258 1084 1075 83 70 58 28 63 53 78

И - остатки редокс-активных аминокислот (Туг, Тгр, Met, Cys, His), входящих в состав ответственных за антиоксидантную активность пептидов.

Проанализированы данные в сравнении с Insilico моделированием протеолиза ЛФ с помощью программы Peptide Cutter. Сравнение результатов представленных в табл.1 с модельными данными позволяет заключить, что в гидролизатах в большинстве случаев пептиды прогнозируемы. Присутствуют и не прогнозируемые. Образование их может быть обусловлено тем, что в процессе вторичного протеолиза, за счет изменения вторичной структуры, может изменением доступа сайтов для атаки фер-

ментов. Используя базу данных CAMP на основании аминокислотной последовательности пептиды ЛФ были прогнозированы на наличие или отсутствие антимикробной активности (АА) по трем алгоритмам прогноза: векторной машине (SVM), классификационному древу (RF), дискриминантному анализу (DA) (табл.2).

Таблица 2 - ЫвШсо анализ антимикробной активности пептидов идентифицированных в гидролизатах ЛФ

й SVM RF 1 DA I

3 с; о а g s и Последовательность пептида * С <c Вероятность * Вероятность * < < Вероятность*

GTEYVTAIAN - 0,965 - 0,506 - 0,660

AAPRKNVRWCT1SQPEW - 0,623 - 0,562 - 0,467

ACTASTTDDCIV - 0,707 - 0,712 - 1,290

1 ЛФ LRETAEEVKA - 0,914 і SHE - 1,457

LAEDVGDVA + 0,689 + 0,768 - 0,473

LRPVAAEIYGTK.ESPQTHYYAVAVVKKGSN - 0,922 - 0,834 - 0,451

AQVPSHAVVARSVDGKEDL - 0,967 - 0,968 - 0,935

LSKAQEKSGKNKSRS - 0,858 - 0,660 - 0,455

PEKADRDQYE - 0,802 - 0,688 - 1,839

LQDGAGDVA - 0,571 - 0,748 - 0,810

AENRK.SSKHSSL 0,974 - 0,644 - 0,403

GKNGKNCPDIC - 0,954 - 0,568 - -1,635

II ЛФ AVAVVKKANEG - 0,888 - 0,608 - -0,017

NNSRAPVDA - 0,932 1 |0,842| - 0,105

DGGYIYTAGKCGLVPVQ и PjS 0,533 1 0,550 1 ШШІ

DKCVPNSKEKYYGYTGA + 0,652 0,610 + -0,337

VK.NDTVWENTNGESTADWAK.N - 0,859 - 0,978 - 1,477

LGAPSITCVRRAFA - 0,622 + 0,696 + -0,501

WCAVGPEEQKKCQQW - 0,945 - 0,844 - 0,111

DGTRKPVTEAQSCH - 6,886 - 0,990 - 0,538

Ш ЛФ IVNQTGS'CA ^¡r __L 0,534 І ¡3,566: 1 -0,860

KDK.K.SCHTAVDRTAGWNIPMG 0,795 - ' ЗІ+ІІ-0,697|

SQSCAPGADPKSRL - 1,000 - 0,802 1,658

ECIPGIAEKKADAVT - 0,848 - 0,848 - 0,488

QGRKSCHtGC И * fl.743 s 0,700 1 -'1,146

FSASCVPCIDRQAYPNL - 0,798 - 0,756 - 0,085

CKGEGENQCACSSREPYF - 0,956 - 0,780 - 0,791

IV ЛФ GGRPTYEEY - 0,781 a ШИ - 0,672

GRSAGWIIPMGI - 0,766 + 0,586 + -0,832

KCRRWQWRMKKi 0,976 1 0.596 -1,907

* - антимикробная активность пептида; ** - пептид по прогнозам считается антимикробным, если дискриминант балл меньше — 0,251.

В - совпадает 1 тест; □ - совпадает 2 теста; □ - совпадает 3 теста

При совпадении 2, 3 тестов (табл.2) есть основание предположить, что пептид обладает антимикробной активностью. На основании анализа полученных данных следует заключить, что гидролизаты отличаются по антимикробной активности и наиболее активным является IV ЛФ, что подтверждается, в частности, ингибировани-ем Е. coli 0157:Н7 - чувствительного к ЛФ микроорганизма (рис.3).

Культнрование, час

Рисунок 3 - Влияние на рост Е. coli 0157:Н7 ЛФ и его гидролизатов

Доза 6 мкг/смЗ соответствует ID30 для ЛФ.

Пептиды ЛФ вызывают антибактериальное действие, более выраженное, чем на-тивный белок. Эффект наиболее выражен для пептидов образующихся на позднем этапе протеолитического процесса в период от 4 часов до 24 часов. Значение ID 100%-ной инактивации гидролизатами IV ЛФ на несколько порядков ниже, чем соответствующая величина полученная для нативного ЛФ (табл. 3).

Таблица 3 - Ингибирующая активность ЛФ и его гидролизатов (относительно Е. coli 0157:Н7)

Обозначение Антибактериальная активность ID*, мкг/смЗ

ЛФ 20,0 ± 1,2

I ЛФ 1,8 ±0,2

11 ЛФ (2,1 ±0,3) 10-2

111 ЛФ (1,9 ± 0,4) 10-2

IV ЛФ (1,6 ±0,2) 10-2

*- минимальная концентрация активного вещества, соответствующая 100% ингибированию роста бактерий (Е. coli 0157:Н7).

Влияние на роет и бактерицидность микроорганизмов полезной микрофлоры кишечника

Чувствительность и характер реакции разных пробиотических клеток на ЛФ и продукты его протеолиза может значительно отличаться. Имеет место выраженная штаммозависимость, которая в значительной мере отражает многофакторность механизмов защиты микроорганизмов от агентов, способных нарушать структуру и функцию клеточных систем. По крайней мере два основных механизма, вероятно, определяют характер и выраженность реакций пробиотических культур на ЛФ и ело гидро-лизаты. Это механизмы: 1. реализуемый через связывание ЛФ с мембранными рецепторами клетки, 2 связанный с передачей клеткам Fe3+ - важного для процессов клеточного метаболизма элемента. Из изучаемых нами пробиотических бактерий под действием ЛФ активировался рост, например, L. Acidophilus АТ-44, однако, только в том случае если ЛФ был в достаточной степени насыщен железом. Для апо - формы эффект отсутствовал. О роли в механизме действия на пробиотические клетки рецепторного механизма свидетельствуют данные о корреляции между эффектами ЛФ по активации роста и связыванием его с поверхностными структурами пробиотических клеток. Было установлено, что ЛФ действует на исследуемые пробиотики согласно следующему порядку: Bifidobacterium adolescentis B-l> Lactobacillus acidophilus 887 > Lactobacillus plantarum 885 > Lactobacillus fermentum LFM-2. В том же порядке располагаются клетки по связыванию с меченным люминисцентной меткой ЛФ-м (рис.4).

Варианты

Рисунок 4 - Связывание 6ЛФ с поверхностными структурами бактериальных клеток: / - Bifidobacterium adolescentis B-l: 2- 1Lactobacillus acidophilus 887;

3 - Lactobacillus plantarum 885;

4 - Lactobacillus fermentum LFM-2.

На основании результатов исследования различных пробиотиков по активации роста и связыванию их клеточной стенкой меченого люминисцентной меткой ЛФ в качестве модельной клетки в исследовании рецептора ЛФ была принята В. adolescentis B-l. Эта бифидобактерия проявляет положительную дозозависимую ростовую реакцию на ЛФ независимо от содержания Fe3+ в его молекуле. Пептиды ЛФ более активное действие на рост В. adolescentis В-1 чем нативный ЛФ. Наиболее ак-

тивным является гидролизат IV ЛФ. Как следует из диаграммы, представленной на рис.5, эффект дозозависим. Существенно отметить, что ростовые эффекты ЛФ и его пептидов не сказываются на других функциях бифидобактерий и, прежде всего, бактерицидное™ относительно патогенных микроорганизмов. Как следует из результатов, приведенных на рис.6, синтез бактериоцинов В. ас1о!езсепИ$ В-1 под влиянием гидролизата IV ЛФ значительно превышает интактный контроль и эффективнее на-тивного ЛФ.

80 70 60 50 40 30 20 10 0

50

100 150 200 250 300 Концентрация ЛФ и его пептидов, мкг/см3

а ЛФ и Пептндный комплексК

Рисунок 5 - Активация роста В. асіоіезсепіїї В-1 ЛФ-ом и пептидным комплексом (IV ЛФ). За 100% принята концентрация клеток в логарифмической фазе роста в контроле (без активирующих агентов) см3

У, 6

<;

ь со О 4

О. 3

и

«5 1

о

0

1 2 3

Варианты

Рисунок 6 - Влияние ЛФ и IV ЛФ на образование бактериоцинов культурой В. АЛоІезсепІй. Варианты: I-интактный контроль (без воздействия); 2-ЛФ; З — IV ЛФ.

Заслуживает внимание тот факт, что не чувствительные к ЛФ бифидобактерии оказались также инертны и отаосительно его пептидов, что может указывать на возможность реализации действия на клеточную мишень ЛФ и продуктов его ограниченного протеолиза через единый механизм, скорее всего рецепторный.

Из мембраны бактерий В. ас1о1е5сепИ$ В-1 были выделены белки, которые были проверены методом '\Уез1егп-блоттинга на наличие ЛФ - связывающих (рис.7).

М

■97:40 pgy 'é?:4o

кДо кД.з

мши 11§.?§

45.20 !..-•==g 45.20

31,00 ••ч«?.'.» ' 31,00

21.50 ■ 21,50 - ■■ч,.^

14,40 jv 14.40 . ,

6,50 ■ 6.50

Рисунок 7 - Идентификация рецептора ЛФ

А. Электрофоретическое разделение мембранных белков (1). Б. ХУезІегп-блоттинг с биотинилированным ЛФ (1) и IV ЛФ (2) в качестве тест-пробы на ЛФ-связывающий белок. М-маркерные белки.

Согласно электрофореграммы в мембране исследуемого пробиотика содержатся белки с различной молекулярной массой (А). Блоттирование показало, что нативный 6ЛФ связывается только с одним белком. Его молекулярная масса около 58 кДа. Аналогичные результаты получены и для биотинилированных фрагментов 6ЛФ. Они связываются с тем же белком клеточной мембраны пробиотика (Б), что соответствует представлению о рецепторном механизме действия на бактерию как лактоферрина, так и его пептидов.

Защитные свойства пептидов ЛФ относительно ЖКТ

Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки возникает в результате дисбаланса между действием в них вредных и защитных факторов. Индуцировать язвенные повреждения в желудке могут патогенные микроорганизмы, агрессивные химические вещества, стресс и другие агенты. Наиболее общими нарушениями в слизистой желудка при индукции язвы является возникновение некротических повреждений слизистой за счет снижения кровотока. Из-за нарушений функции слизистая меньше синтезирует слизи, выполняющей барьерную роль. В желудке повышается кислотность, снижается уровень предшественников антиоксидантов и, как следствие, повышается уровень активных форм кислорода. Эти характерные для патогенеза язвы различной природы нарушения не исключают безусловно и специфических, присущих преимущественно данному некротизирующему агенту. В настоящей работе рассматривается цитопротекторное действие пепсиновых гидролизатов ЛФ в экспериментальной модели - индуцирование in vivo язвенных повреждений подкисленным этанолом. Слизистая желудка крыс группы интактного контроля не имеет некротиче-

ских повреждений (Рис.8А). Введение орально физиологического раствора в объеме 5 мл не оказывало влияния на её состояние (Рис.8Б). Глубокие и обширные некротические повреждения, однако, отмечались уже через 60 мин при введении в желудок 5 мл смеси: ЮОмМ НС1+60%С2Н50Н (Рис.8В).

ІІІ щтш•>, и'*, Щ < 'йж*1* А. , Ь

А- интактный контроль Б - Через 60 мин после введения 5 мл физиологического раствора

^ і

В - Через 60 мин после введения 5 мл: индуцирующей язву смеси: ЮОмМ НС1+60%С2Н50Н Г- За 30 мин до индуцирования язвы вводили 5 мл пептидов IV ЛФ

Рисунок 8 - Слизистая желудка крыс

Если за 30 минут до введения индуктора язвы крысам внутрижелудочно вводить ЛФ или его пептиды в зависимости от дозы «индекс язвы», интегральный показатель длины образующихся в слизистой желудка некротических повреждений, снижался или повреждения вообще не проявлялись (Табл.4-6). Как в случае нативного ЛФ, так и его пептидов, отмечалась четкая дозовая зависимость протекторного эффекта.

Таблица 4 -Защитное действие ЛФ против индуцирования этанолом

повреждений в желудке крыс

Доза ЛФ, мг/кг массы тела 0 50 100 150 200 250 300

«Индекс язвы», мм 160 132 93 71 47 24 0

Таблица 5 - Защитное действие II ЛФ против индуцирования этанолом повреждений в желудке крыс_

Доза И ЛФ, мг/кг массы тела 0 20 40 60 80 100

«Индекс язвы», мм 160 128 89 77 58 0

Таблица 6 - Защитное действие IV ЛФ против индуцирования этанолом

повреждении в желудке крыс

Доза IV ЛФ, мг/кг массы тела 0 1 2 3 4 5

«Индекс язвы», мм 160 126 95 62 31 0

Минимальная доза ЛФ, при которой некротические повреждения в желудке практически уже отсутствовали, составляла приблизительно 300 мг/кг массы тела

животного. Пептиды ЛФ, согласно полученным данным, значительно эффективнее нативного ЛФ. Их протекторная активность различна и зависит от времени протеоли-за ЛФ, проявляясь, наиболее выражено при длительной обработке пепсином. Для пептидов II ЛФ минимальная доза, снимающая индукцию язвенных повреждений слизистой желудка приблизительно в 3 раза ниже установленной для нативного ЛФ. Пептиды IV ЛФ практически на порядок оказались эффективнее, чем II ЛФ. Уже при дозе 5 мг/кг массы тела у крыс с введенным в желудок пептидов IV ЛФ не было отмечено индуцируемых этанолом повреждений (Табл.4-6). Не исключено, что высвобождаясь из сложной структуры нативного белка соответствующие функциональные домены становятся более контактными с клеточными системами, обуславливающими устойчивость слизистой к повреждениям, в том числе и индуцируемым этанолом. Следует учитывать гетерогенность популяции полученных пептидов. Значимой составляющей в механизме патогенеза язвы, в том числе и индуцируемой этанолом, является потеря антиоксидантов слизистой при повышении уровня активных форм кислорода. Супероксид (02 -) и гидроксил (-ОН) - радикалы приводят к перекисному окислению липидов, что чревато образованием в желудке раковых опухолей. Противостоять этому могут химические соединения с антиокислительным действием. Известно, что ЛФ обладает антиоксидантным свойством.

Анализ полученных нами гидролизатов ЛФ показал, что они обладают антиоксидантным действием, более выраженным, чем нативный белок. Наиболее эффективными оказались пептиды с низкой молекулярной массой, образующиеся при длительном протеолизе ЛФ за счет содержания остатков редокс-активных аминокислот (Туг, Тф, Met, Cys, His) (табл.7).

Таблица 7 - Антиоксидантная емкость пепсиновых гидролизатов ЛФ

Обозначение АОЕ по отношению к ORAC, мкмольТЭ/г АОЕ по отношению к ТЕАС, мкмольТЭ/г

ЛФ 72,68 ± 4,44 284,87 ±19,80

I ЛФ 118,17 ±7,07 346,94 ± 7,42

II ЛФ 164,12 ±6,57 391,01 ± 12,67

III ЛФ 192,63 ±6,45 405,74 ± 17,98

IV ЛФ 257,63 ± 12,54 612,88 ± 14,57

Сравнение результатов антиоксидантной и противоязвенной активностей пепсиновых гидролизатов позволяет заключить о наличии корреляции между этими показателями. Не исключено, что пептиды, по сравнению с нативным белком, более легко in vivo проникают в клетки слизистой, взаимодействуя с системами, отвечающими за уровень антиоксидантов, в значительной мере обуславливающими ее устойчивость к повреждениям. Согласно современным представлениям, основная роль в патогенезе язвенных повреждений желудка и двенадцатиперстной кишки принадлежит грамот-рицательной бактерии Helicobacter pylori (Н. Pylori). Используемая в работе модель язвы с этанолом в основном предусматривает острые повреждения слизистой желудка, вызываемые например агрессивными химическими соединениями, сильным стрессом. Острые нарушения предшествуют хроническим, в патогенезе которых ведущая роль может принадлежать H.pylori. Во всяком случае, при условии инфециро-вания этой бактерией нарушения в слизистой желудка благоприятствуют реализации индуцирования ею хронической язвы и пептиды могут её предотвратить.

Пептиды a-JIA Получение и характеристика

Нативный а-ЛА был получен анионообменной хроматографией на сорбенте Macro-Prep DEAE Support (рис.9).

10

210

Объем фрДКЛНИ- МП

Рисунок 9. Хроматограмма разделения анионных сывороточных белков на Macro-Prep DEAE Support при ступенчатом градиенте элюента

Электрофоретические исследования показали, что по молекулярной массе белок, вышедший первым пиком соответствовал а-ЛА, вторым и третьим БСА и (3-ЛГ соответственно. Протеолиз а-ЛА проводили трипсином (Sigma-Aldrich, США) с активностью 90 U/мг при 37 °С, рН 7,8. Как следует из электрофореграммы (рис.10), при обработке трипсином а-ЛА через 6 часов уже отсутствует нативный белок. Глубокое расщепление белка отмечено в период с 12 по 24 часа - молекулярная масса гетерогенной популяции пептидов ниже 1,4 кДа. Хроматомасспектрометрический анализ гидролизатов а-ЛА показан в табл. 8.

кДа 26,625

16,950 *г

14,437 ~ '

6 512 ## "

3.496

1,423 Щ* -

і -ШГ' •>**■•*

о

М 1 2 3

Рисунок 10 - Трицин-ПААГ электрофорез пептидных композиций, полученных при гидролизе а-ЛА трипсином: 1 - 6ч (1 а-ЛА) , 2 - 12ч (II а-ЛА), 3 - 24ч (III а-ЛА). М - маркерные белки

Таблица 8 - Хроматомасспектрометрический анализ гидролизатов а-ЛА

Экспозиция протеолиза, ч Обозначение Аминокислотная последовательность пептидов Позиция расщепления, № Длина пептида, а.о. Молекулярная масса, Да Скор Mascot

6 I а-ЛА GYGGGVSLPE^V^TAFNTSGYDT DDQNPNSSNÎfjNISCDK KILDKVGIN®! [17-39] [63-79] [94-104] 22 17 11 4623 1890 1548 48 36 52

12 II а-ЛА QNNDSTEpGLFQINNK FLD DD LTDDlgiVKK FLDDDLTDDI KILDKVGIN§§ FLDDDLTDD FLDDDLTD FLDDDLTDDllg ILDKVGINfH ALgSEK [43-58] [80-94] [80-89] [94-103] [80-88] [80-87] [80-90] [95-104] [109-114] 16 15 10 10 9 8 11 10 6 2302 2292 1181 1162 1067 952 1328 1220 649 45 43 62 44 43 45 72 78 30

24 III а-ЛА FLDDDLTDDlKJiV EQLTK ' gfEVFR FLDDD FLDDDL FLDDDLT g^ggvslpeMv ldqWl'cek YGINYWI.AHK KII.DK ILDKVGINl [80-92] [1-5] [6-10] [80-84] [80-85] [80-86] [17-27] [115-122] [99-108] [94-98] [95-103] 13 5 5 5 6 7 11 8 10 5 9 1125 617 652 623 736 837 1163 1033 1200 615 1034 48 27 29 30 29 26 30 53 28 34 73

□ - остатки редокс-активных аминокислот (Туг, Trp, Met, Cys, His), входящих в состав ответственных за антиоксидантную активность пептидов.

Проанализированы данные в сравнении с Insilico моделированием протеолиза ЛФ с помощью программы Peptide Cutter. Сравнение результатов, представленных в табл.8 с модельными данными позволяет заключить, что в гидролизатах в большинстве случаев пептиды прогнозируемые, некоторые из прогнозируемых отсутствовали. Выявлены непрогнозируемые пептиды.

Используя базу данных CAMP исследуемые пептиды ЛФ были на основании аминокислотной последовательности прогнозированы на наличие или отсутствие антимикробной активности (АА) по трем алгоритмам прогноза: векторной машине (SVM), классификационному древу - Random Forest (RF), дискриминантному анализу Discriminant analysis (DA) (табл.9).

Таблица 9 - ЫбШсо анализ антимикробной активности пептидов идентифицированных в гидролизатах а-ЛА

БУМ ЯР ОА

Обозначение гидролизата Аминокислотная последовательность пептидов * < < Вероятность * С <с Вероятность АА* Вероятность**

0У00У8ЬРЕ\УУСТАРМТ80У01 - 0,963 - 0,862 - 0,865

I ООС^РЫЗЗМСШЭСОК. - 0,795 я 0,412

а-ЛА К1ЬОКУСШУ\У + 0,614 0,558 + -2,487

О^ОЗТЕУОЬРОПч^К - 0,613 - 0,852 - 0,901

риЭООШЮМСУКК - 0,948 - 0,972 - 0,729

РЬ0001ЛТ>01 + 0,508 + 0,736 - 1,430

риюоигоо - 0,928 а |0,736 - 1,601

Р1ХЮО[ЛТ> - 0,774 Й |0,756 - 1,124

II РЬОООЬТШМ - 0,700 0,752 - 1,848

а-ЛА КПЛЖУСГМУ Й 0,657 1 0,6 1 -2,714

п.ркуситчу + 0,718 ш 0,63 1 г 1,995

АЬСвЕК - 0,993 + 0,632 + -0,278

риЮОПТЮМСУ - 0,928 - 0,862 - 1,412

К01.ГК + 0,985 0,738 -0,640

СЕУге - 0,603 + 0,648 + -0,549

РЬЭОО - 0,895 Л - 0,979

ПЛЮШ, + 0,505 + одГ6 - 1,273

РЬООЭЬТ - 0,965 X - 0,959

СУОСУ8ЬРЕ\УУ - 0,790 (165$ - 0,282

III Г^ОУ/ЬСЕК - 0,709 X : - 1,107

а-ЛА УОЮТХУЬАНК, х 0.906 + 0,688 12,757

К1ЬШС - 1,000 + 0,586 + -1,838

11ЛЖУОШУ я 0,865 + 0,7 Гб + -2.190

* -антимикробная активность пептида; **- пептид по прогнозам считается антимикробным, если дискриминант балл меньше - 0,251.

□ - сопадает 3 теста; □ - совпадает 2 теста; !§ - совпадает 1 тест

При совпадении 2, 3 тестов (табл.9) есть основание предположить, что пептид обладает антимикробной активностью. На основании полученных данных можно считать, что. в гидролизате III а-ЛА содержится больше, обладающих антимикробной активностью пептидов, чем в других гидролизатах.

Защитные свойства пептидов а-ЛА против повреждений желудка

Представлены медико-биологические исследования по изучению профилактического действия трипсиновых пептидов а-ЛА на профилактику индуцирования этанолом язвенных повреждений в слизистой желудка крыс. Если за 30 минут до индуцирования язвы внутрижелудочно вводили а-ЛА или его пептиды в зависимости от дозы повреждения были менее выраженны или вообще отсутствовали (рис. 11, Б - Г).

в

Ва««__.. гі.

А - Через 60 мин после введения ] желудок крыс смеси 1 ООмМ НС1+ 60%С2Н50Н

Б - За 30 минут до индукции язвенных повреждений в желудок введен а-ЛА в дозе 84 мг/кг массы тела

ІІ

шЗЁЁ

В - За 30 минут до индукции язвенных повреждений в желудок крыс введен а-ЛА в дозе 300 мг/кг массы тела

Г- За 30 минут до индукции язвенных повреждений в желудок крыс введен гидролизат III а-ЛА в дозе 5 мг/кг массы тела

Рисунок 11 - Слизистая желудка крыс

Согласно данным, приведенным на рис. 12, защитный эффект дозозависим. Для нативного а -ЛА минимальная доза, при которой имела место 100% защита, составляла < 280 мг/кг, для пептидных комплексов - I а -ЛА и III а -ЛА соответственно 84

Доза, мг/кг тела

Рисунок 12 Дозовая зависимость противоязвенной активности нативного а-ЛА и гидролизатов

Следует заметить, что сопутствующие проведению эксперимента факторы и, прежде всего, введение в желудок 5 мл жидкости, в том числе двухкратное с интервалом в 30 минут, согласно исследованиям животных соответствующих контрольных групп, не оказывали влияние как на морфологическое состояние слизистой желудка, так и на степень язвенных повреждений в желудке крыс обеих опытных групп (без введения и с введением протекторов). Вероятно, этому способствовали условия и специальные процедуры, предусматривающие минимизацию при инсталляции в желудок жидкостей, стрессовых явлений. Полученные данные свидетельствуют о том, что трипсиновые пептиды а-ЛА, так же как и нативный белок, оказывают противоязвенное действие, причем более эффективное. Сравнение протекторного эффекта гидро-лизатов при дозе, соответствующей 50%- ной защите, а-ЛА-ом (140 мг/кг массы тела) показало, что наиболее выраженное противоязвенное действие оказывают пептиды с более низкой молекулярной массой. Исследование пептидов а-ЛА на антиоксидантную активность методом определения антиоксидантной емкости по двум радикалам: пероксильному и катион-радикалу АБТС показало, что гидролизаты обладают более высокой антиоксидантной активностью, чем нативный белок. Наиболее эффективными оказались пептидные комплексы с низкой молекулярной массой, содержащие остатки редокс-активных аминокислот (табл.10).

Таблица 10 - Антиоксидантная емкость пептидных комплексов а-ЛА

Обозначение АОЕ по отношению к ORAC, мкмольТЭ/г АОЕ по отношению к ТЕАС, мкмольТЭ/г

а-ЛА 104,68 ± 11,46 208,16 ±11,36

I а-ЛА 157,71 ±6,52 351,53 ±4,04

II а-ЛА 245,15 ± 16,93 475,97 ± 6,99

Ш а-ЛА 310,46 ±5,30 719,82 ±13,40

Сравнение результатов антиоксидантной и противоязвенной активностей трип-синовых гидролизатов позволяет заключить о наличии корреляции между этими показателями.

Комплекс лечебпо-профилактической направленности на основе пептидов ЛФ+ а-ЛА

Интегральным показателем состояния микрофлоры кишечника (патогенная и полезная) можно рассматривать дисбактериоз. Дисбактериоз - качественное изменение бактериальной микрофлоры организма, главным образом, кишечника. Дисбактериоз возникает в результате нарушения равновесия кишечной микрофлоры из-за различных причин: применения антибактериальных средств, в частности антибиотиков, неправильного питания, нарушения функции иммунитета. Как уже установлено пептиды ЛФ и а-ЛА действуют сильнее на патогенную и полезную микрофлору, чем натив-ные белки. С учетом к тому же расширяющей биоактивный спектр штаммоспецифич-ности компонентов, есть основание полагать, что их комплекс окажется средством с повышенной эффективностью против дисбакгериоза. Дисбактериоз у крыс индуцировали введением в желудок антибиотика-10 % фторхиналон байтрила (Bayer HealthCare Animal Health), содержащего в качестве действующего вещества энрофлоксацин (100 мг/мл) в дозе 10 мг на 1 кг массы тела. При оральном введении крысам фторхиналон байтрила, уже через 5 суток в ЖКТ имеют место, по сравнению с интактным контролем, изменения, свидетельствующие о развитии умеренного дисбакгериоза. Прежде

всего, это касается состава микрофлоры кишечника. Наряду с вызываемым антибиотиком частичном ингибированием патогенной отмечено и подавление полезной микрофлоры. Так, в толстом кишечнике уровень лактобацилл .снижался на 33,4%, бифи-добактерий - на 49,8%. Изменения касались и морфологических показателей слизистой как тонкого, так и толстого отделов кишечника. На фотографиях видны структурные изменения в ткани кишечника, особенно четко проявляемые относительно длины, а также диаметра ворсинок и крипт. Они существенно снижены. Ведение животным орально в объеме 5 мл физиологического раствора или воды не выявило каких-либо изменений в ЖКТ, по сравнению с интактным контролем. Следовательно, отмеченные при введении крысам антибиотика изменения в ЖКТ не обусловлены сопутствующими факторами, связанными с процедурой инстилляции препарата в желудок с использованием зонда. Если за 30 мин до введения антибиотика крысы получили орально комплексные препараты ЛФ и а-ЛА или их гидролизаты (в соотношении 1:1 по весу) характерных для дисбактериоза нарушений по морфологическим и микробиологическим показателям было меньше. На основании дозовых закономерностей установлено, что для комплекса нативных белков доза, соответствующая 100%-й профилактики дисбактериоза, составляла 350 мг/кг, для гидролизатов - в 100 раз меньше. На рис.13 показано протекторное действие комплекса «ЛФ + а-ЛА» и пептидных комплексов «1УЛФ+111 а-ЛА» на морфологические показатели тонкого отдела кишечника.

В - Оральное введение за 30 мин до антибиотика комплекса (50% ЛФ + 50% а-ЛА) доза 350 мг/кг массы тела_

Г - Оральное введение за 30 мин до антибиотика комплекса (50% IV ЛФ + 50% 111 а-ЛА) доза 3,5 мг/кг массы тела_

Микроструктура гистологических срезов тонкого отдела кишечника крыс Увеличение 40 - слева, 200 - справа

А - Интактный контроль

Б - Оральное введение антибиотика '10% фторхиналон байтрила)

Рисунок 13 - Морфологические показатели слизистой тонкого отдела кишечника

Аналогичные данные получены и для толстого кишечника. В случае пептидного варианта исследуемые величины далее превышают установленные для интактного контроля, то есть пептиды проявляют свое свойство, как фактор роста. Измерение длины ворсинок, крипт и величины их диаметров показало, что у крыс с предшествующим антибиотику введением комплексных препаратов повышается длина тканевых органелл (Рис.14). Запуск механизма активации клеточной пролиферации может быть компенсаторной адаптационной реакцией клеток на отрицательное влияние

антибиотика относительно рассматриваемых показателей. Более выраженное защитное действие гидролизатных комплексов установлено также относительно микрофлоры кишечника. Заслуживает внимания тот факт, что уровень лактобацилл и бифидо-бактерий в случае предварительного введения животным пептидного комплекса, содержащего «IV ЛФ + III а-ЛА» не только нормализовался, но и превысил более чем в 2 раза соответствующие показатели интактного контроля.

220 200 -180 -160 -140 -120 -100 -80604020 -0

и

н-А □ -Б ■ -В

Длина Диаметр Длина Диаметр ворсин ворсин крипт крипт

Рисунок 14 - Влияние комплексов «ЛФ + а-ЛА» и «1УЛФ + Ша-ЛА» на некоторые морфологические показатели тонкого отдела кишечника крыс при индуцировании дисбактериоза. Варианты: А - Без введения защитных средств (Контроль, принятый за 100%); Б - Ведение «ЛФ + а-ЛА» в дозе 350 мг/кг массы тела); В - Введение «IV ЛФ + III а-ЛА» в дозе 3,5 мг/кг массы тела).

Протекторный эффект, характеризующийся аддитивным взаимодействием компонентов, установлен также и по противоязвенному действию пептидных комплексов (рис.15).

180

160

s 140 2

120 I 100

к

Ц 80 60 40 20 0

а>

т

Контроль 5ез протекторов)

IV ЛФ

IV ЛФ + III а-ЛА

Рисунок 15 - Протекторное действие пептидного комплекса IV ЛФ и III а-ЛА (1:1) против индуцирования этанолом повреждений в желудке крыс.

Пептидный комплекс обладает антиоксидантным свойством (табл.11)

Таблица 11 - Антиоксидантная емкость пептидных комплексов

Обозначение АОЕ по отношению к ORAC, мкмольТЭ/г АОЕ по отношению к ТЕАС, мкмольТЭ/г

ЛФ + а-ЛА II ЛФ +1 а-ЛА III ЛФ + II а-ЛА IV ЛФ + III а-ЛА 89,45 ± 7,95 161,92± 6,55 219,98 ± 11,69 284,05 ± 8,48 247,84± 14,59 372,61± 8,36 441,87± 12,39 667,35 ±11,84

Как следует из данных представленных в табл. 11 пептидный комплекс обладает антиоксидантным свойством. Максимальное действие оказывает комплекс IV ЛФ + III а-ЛА, что коррелирует с его противоязвенной активностью. С одной стороны, антиоксидантная активность - один из компонентов механизма повышения противоязвенного действия пептидов, с другой - ее следует рассматривать как самостоятельный защитный фактор в биоакгивности пептидного комплекса.

Пептидный комплекс как активная основа полифункционалыюго препарата «ЖКТ-HOPiM»

Полученные данные о биоактивных свойствах пептидного комплекса ЛФ и а-ЛА позволяет рассматривать его в качестве основы профилактического препарата с антимикробным, противоязвенным, антидисбактериозным, антиоксидантным действием. Принципиальная схема производства пептидного комплекса, названного «ЖКТ-НОРМ» приведена на рис.!6.

Рисунок 16 - Принципиальная схема получения пептидного комплекса «ЖКТ-НОРМ»

Характеристика выработанного в лабораторных условиях образца «ЖКТ-НОРМ» приведена в табл.12-14.

Таблица 12 - Органолептические свойства пептидного комплекса «ЖКТ-НОРМ»

Наименование показателя Результаты контроля

Внешний вид, консистенция Прозрачная жидкость или однородный сыпучий порошок. Допускается присутствие небольших комочков, легко рассыпающихся при механическом воздействии.

Цвет, вкус, запах Цвет молочно-белый равномерный по всей массе порошка. Вкус сладковатый, без запаха

Таблица 13 - Физико-химические свойства пептидного комплекса «ЖКТ-НОРМ»

Наименование показателя Показатели препарата Показатели, нормируемые поСанПиН 2.3.2.2351-08

Массовая доля влаги, % 1,70±0,05 не более 5

Растворимость, сек 43±5 не более 60

Активная кислотность восстановленного продукта, рН, ед. 6,7-6,9 —

Таблица 14 - Микробиологические свойства пептидного комплекса «ЖКТ-НОРМ»

Наименование показателя Показатели препарата Показатели, нормируемые по СанПиН' 2.3.2.2351-08

КМАФАнМ, КОЕ/г 1,2x102 Не более 5*104

Содержание дрожжей и плесневых грибов в 1,0 г препарата, КОЕ Не обнаружены Не более 20

Бактерии группы кишечных палочек в 1,0 г препарата Не обнаружены Не допускаются

S. aureus в 0,1 г препарата Не обнаружены Не допускаются

Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, в 25,0 г препарата Не обнаружены Не допускаются

Для исследования возможного негативного действия пептидного комплекса проводили медико-биологическим исследования его токсичности. Крысы были разделены на две группы: контрольную и опытную. Животные опытной группы в течение 21 дней непосредственно перед едой перорально получали препараты в десятикратной дозировке, в то время как животные группы интактного контроля пищевую добавку не получали. В обеих группах отмечалась хорошая поедаемость корма. Выживаемость всех подопытных животных была полной (100 %). В течение всего эксперимента у животных опытной группы не отмечали каких-либо клинических отклонений в состоянии здоровья. Двигательная активность не снижена. Случаев изменения поведенческих реакций (угнетения, возбуждения) не выявлено. В ходе всего эксперимента шерсть животных, получавших препарат, сохраняла блеск и плотное прилегание, кожа - бледно-розовый цвет без сыпей и повреждений. Признаков воспаления не обнаружено. По окончании эксперимента патологоанатомическое исследование животных

(табл.15), не выявило внешних проявлений патологических процессов во внутренних органах - пищеварительном тракте, поджелудочной железе и печени, дыхательной системе, органах кровообращения и кроветворения, мочевыделителыюй системе. Не происходило изменений в массе тимуса, чувствительном, как известно, показателе на стресс.

Таблица 15 - Абсолютная масса тела и интегральный показатель хронической интоксикации лабораторных животных

Показатели Группы животных

Контрольная Опытная

Абсолютная масса тела, г 105,00±3,90 118,00±5,20

ИПХИ селезенки,% 0,58±0,07 0,62±0,09

ИПХИ почек,% 0,48±0,02 0,45±0,03

ИПХИ печени,% 4,54±0,41 4,69±0,39

ИПХИ сердца,0/» 1,00±0,03 0,56±0,03

Рассчитанный показатель хронической интоксикации селезенки, почек, печени и сердца не выявил каких-либо значимых различий у животных опытной и контрольной групп. Полученные данные свидетельствует о том, что десятикратное увеличение рекомендуемой физиологически эффективной дозы препарата не оказывает токсичного действия на животный организм. Введение в рацион животных пептидного комплекса не оказало негативного влияния на массу тела, подтверждая отсутствие кумулятивного токсического его эффекта. При соотношении компонентов 1:1 минимальная доза рассматриваемых пептидов составляет 3,5 мкг иа I кг массы тела животного. Разработанная технология получения «ЖКТ-НОРМ» в принципе применима и в промышленных условиях. Производство нового биологически-активного препарата на основе пептидного комплекса сывороточных белков молока целесообразно рекомендовать для включения в качестве одного из звеньев в схему безотходной переработки молочного сырья.

ВЫВОДЫ

1. Пептиды ЛФ и а-ЛА молока обладают противоязвенным, антидисбактериоз-иым, антиоксидантным действием в значительной мере более выраженным, чем нативные белки.

2. Установлена функциональная связь между составом пептидных комплексов полученных при различных условиях протеолиза и их биологической активностью: противоязвенной, противоинфекционной, бифидогенной, антиоксидант-ной.

3. Пептиды а-ЛА, по сравнению с пептидами ЛФ, более эффективны против повреждений слизистой желудка, но менее эффективны против дисбактериозной профилактики. В комплексных препаратах эффекты в отношении профилактики язвенных повреждений и дисбакгериоза показывают аддитивность.

4. Обоснован состав пептидной композиции «IV ЛФ + III а-ЛА», названной «ЖКТ-НОРМ».

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Самохина Л.С., Головин М.А., Комолова Г.С., Гапина В.И., Ионова И.И., Шаталова Е.С. Антибактериальная активность лактоферрина из коровьего молока // Молочная промышленность.-2012,- №7.- С. 56-57.

2. Самохина Л.С., Комолова Г.С., Ионова И.И., Семенов Г.В. // Противоязвенное действие лактоферрина и его гидролизатов. Хранение и переработка сельхоз-сырья.- 2012 - №9,- С.21-23.

3. Самохина Л.С., Комолова Г.С., Ганина В.И., Ионова И.И., Семенов Г.В.// Про-тиводисбактериозное действие композиции гидролизатов а-лактальбумина и лактоферрина // Известия вузов. Пищевая технология.- 2012,- № 5-6,- С.17-20.

4. Самохина Л.С., Ионова И.И., Тишков В.И., Комолова Г.С. Защитное действие продуктов протеолиза а-лактальбумина против язвенных повреждений слизистой желудка крыс // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии (в печати)

Тезисы конференций

1. Самохина Л.С., Шаталова Е.С. Выделение и идентификация препарата лактоферрина. Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы 8 международной научной конференции студентов и молодых ученых,- М.: МГУПБ, 2010,- С.20-21.

2. Петров Д.А., Александрова A.A., Кузьмина А.Л., Кислова В.А., Самохина Л.С., Овчинникова O.E. Очистка а-лактальбумина из коровьего молока с использованием гель-фильтрации. Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы 8 международной научной конференции студентов и молодых ученых,- М.: МГУПБ, 23-24 ноября 2010,- С.71-72.

3. Самохина Л.С., Петрова С.Н., Комолова Г.С., Ионова И.И. Изучение динамики образования в процессе протеолиза лактоферрина пептидов, активных против E.Coli. Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы 8 международной научной конференции студентов и молодых ученых,- М.: МГУПБ, 2011.-С.54-55.

4. Самохина Л.С. Противоязвенное действие пептидов а-лактальбумина и лактоферрина. Фармацевтические и медицинские биотехнологии: Материалы 10 международной научно-практической конференции,- М.: 2012,- С. 175-176.

5. Самохина Л.С., Кузьмина A.A., Комолова Г.С. Влияние а-лактальбумина и его гидролизатов на защитную функцию ЖКТ. Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы 10 международной научной конференции студентов и молодых ученых.- М.: МГУПБ, 2012, С.63-64.

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" Подписано к печати 06.05.2013г. Формат 60x84/16. Бумага "Офсетная №1" 80г/м2. Печать трафаретная. Усл.печл. 1,50. Тираж 100. Заказ 579.

WWW.FRANTERA.COM

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Самохина, Людмила Сергеевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет

пищевых производств

На правах рукописи

04201357091

Самохина Людмила Сергеевна

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДОВ ЛАКТОФЕРРИНА И а-ЛАКТ АЛЬБУМИНА НА ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫЙ ТРАКТ

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д. б. н., профессор Комолова Г.С.

д. х. н., профессор Тишков В. И.

Москва - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................

1.1 Функциональное питание как важный элемент здоровья населения.............

1.2 Сывороточные белки молока и их пептиды- активная основа

функционального питания..............................................................................

1.3 Пептиды лактоферрина.....................................................................................

1.3.1 Структура и свойства......................................................................................

1.3.2 Прикладные аспекты применения.................................................................

1.4 Пептиды альфа-лактальбумина......................................................................

1.4.1 Структура и свойства.....................................................................................

1.4.2 Прикладные аспекты применения.................................................................

1.6 Композиционные препараты на основе биолологически активных белков

молока и их пептидов......................................................................................

ЗАКЛЮЧЕНИЕ К ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.....................................................

2.1 Объекты исследований....................................................................................

2.2 Методы исследования......................................................................................

2.2.1 Выделение сывороточных белков из молочного сырья..............................

2.2.2 Получение гидролизатов ЛФ, а-ЛА и фракционированиеО олигопептидных компонентов.......................................................................

2.2.3 Количественное определение белков...........................................................

2.2.4 Определение железосвязывающей активности ЛФ.....................................

2.2.5 Определение ферментативной активности белков......................................

2.2.6 Белковый БББ электрофорез в ПААГ..........................................................

2.2.7 Трицин-ПААГ электрофорез белковых гидролизатов................................

2.2.8 Идентификация ЛФ - связывающего белка с использованием Western-блoттингa..........................................................................................

2.2.9 Определение антиоксидантной емкости (АОЕ)..........................................

2.2.10 Культивирование микроорганизмов...........................................................92

2.2.11 Определение связывания лактоферрина с пробиотическими микроорганизмами..........................................................................................92

2.2.12 Изоляция белка из мембраны бифидобактерий..........................................93

2.2.13 Определение связывающей активности рецепторного белка....................93

2.2.14 Медико-биологические исследования.........................................................94

2.2.15 Характеристика биологически активного препарата на основе пептидов ЛФ + а-ДА.......................................................................................................96

2.2.16 Статистическая обработка полученных результатов.................................96

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..............................97

3.1. Пептиды ЛФ.....................................................................................................97

3.1.1. Получение и характеристика........................................................................97

3.1.2 Влияние на рост и бактерицидность микроорганизмов полезной микрофлоры кишечника...............................................................................104

3.1.3 Защитные свойства пептидов ЛФ относительно ЖКТ...............................108

3.2 Пептиды а-ЛА.................................................................................................114

3.2.1 Получение и характеристика.......................................................................114

3.2.2 Защитные свойства пептидов а-ЛА против повреждений желудка..........119

3.2.3 Комплекс лечебно-профилактической направленности на основе пептидов ЛФ + а-ЛА.....................................................................................................122

3.2.4. Пептидный комплекс как активная основа полифункционального препарата «ЖКТ-НОРМ»..............................................................................127

3.2.5. Разработка способа обогащения стерилизованного молока препаратом «ЖКТ-НОРМ»...............................................................................................131

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................................137

ВЫВОДЫ..............................................................................................................138

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................139

ПРИЛОЖЕНИЕ А (обязательное)........................................................................169

ПРИЛОЖЕНИЕ Б (дополнительное).....................................................177

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБТС - 2,2'-азинобис-(3-этил-бензотиазолинсульфонат); АТФ - аденозинтрифосфат;

ААРН- 2,2'-азобис(2-метилпропионамидина) дигидрохлорид;

ААр - сток акриламида (разделяющий гель);

ААк - сток акриламида (концентрирующий гель);

АОЕ- антиоксидантная ёмкость;

а.о. - аминокислотный остаток;

a-JIa - бычий а-лактальбумин;

БАД - биологически активная добавка.

БГКП- бактерии группы кишечной палочки;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ß-ЛГ - ß-лактоглобулин;

ГТ -галактозилтрансфераза;

ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота;

ДЭАЭ-целлюлоза - диэтиламиноэтил-целлюлоза;

ЖКТ-желудочно-кишечный тракт;

ИПХИ - интегральный показатель хронической интоксикации;

КМАФАнМ-количество мезофильных аэробных и факультативно

анаэробных микроорганизмов;

КОЕ - колониеобразующая единица;

ЛПС - липополисахарид;

ЛФ - бычий лактоферрин;

ЛФц - лактоферрицин;

ЛФп - лактоферрампин;

ЛП -лактопероксидаза;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ПА- персульфат аммония;

ПСА - персульфат аммония;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

США - Соединенные Штаты Америки;

ТЕМЕД - N,N,N',N'- тетраметил эти лен диамин;

ТЭ - эквиваленты тролокса;

ФСБ - фосфатно-солевой буфер;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

АА-антимикробная активность;

CAMP- база данных антимикробных пептидов;

DA - дискриминантный анализ;

LC-MS/MS - жидкостная хроматография с тандемной масс спектрометрией;

МС/МС - тандемная масс-спектрометрия; Mr- молекулярная масса;

netAUC- приведенная площадь под кинетической кривой; ORAC - метод анализа антиоксидантной ёмкости по отношению к пероксильному радикалу;

pi- изоэлектрическая точка; RF- классификационное древо;

RP-HPLC-ESI-FT-ICR-MS - обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография с электроспрей ионизацией и масс-спектрометрией ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье; SDS - додецилсульфат натрия; SVM - векторная машина;

ТЕАС - антиоксидантная ёмкость по отношению к катион - радикалу АБТС.

ВВЕДЕНИЕ

В условиях неблагоприятной экологии рост вторичных иммунодефицитных состояний, определяет необходимость повышения неспецифической резистентности здоровых и больных людей, улучшения функционирования естественных систем детоксикации и механизмов обеспечения иммунобиологической реактивности организма. Это становится возможным за счет использования в качестве активной основы в продуктах профилактического и лечебного назначения природных физиологически активных соединений.

Молоко и его компоненты, прежде всего белки - продукты питания животного происхождения, потребляемые с первых дней жизни. Они участвуют в энергетических и транспортных процессах, осуществляют регуляторную и защитную функции.

Особое внимание заслуживают сывороточные белки молока лактоферрин (ЛФ) и а-лактальбумин (а-ЛА).

Лактоферрин в последние годы привлекает большое внимание исследователей в связи с его полифункциональностью, направленной на поддержание гомеостаза животного организма. Он обладает антибактериальным, противовирусным, бифидогенным действием, является фактором роста, переносчиком железа, участвует в метаболических процессах, способен катализировать различные биохимические реакции, обладая РНКазной, ДНКазной, лактопероксидазной активностями.

Что касается а-ЛА, второго после (3-лактоглобулина по содержанию в молоке белка, то это прежде всего белок, который содержится в высоких концентрациях в молоке, при этом практически не иммуногенен и обладает целым рядом значимых защитных свойств: антимикробным, иммуномодулирующим, опоидным, антиоксидантным, противоязвенным, противоопухолевым,

антигипертензивным, противострессовым, регулирующим клеточный рост.

В последние годы японскими исследователями было показано, что образующиеся при протеолизе пептиды по целому ряду показателей, оказались более активными, чем нативные белки.

Открывается перспектива получения новых, более эффективных лечебных и профилактических средств на основе пептидных комплексов. Однако в этом аспекте требуются углубленные структурно-функциональные исследования пептидов при различных условиях протеолиза.

Современные работы в основном направлены на лечение пептидными препаратами заболеваний, в то время как, отсутствуют данные касающиеся их профилактического действия.

Есть основание полагать, что наряду с созданием лечебных средств на основе высокоочищенных пептидов, практически целесообразно, в том числе и экономически, разрабатывать профилактические средства на основе комплексов пептидов с различными функциональными свойствами. Это расширяет их физиологическое действие. Данное исследование проводилось с учетом этих положений.

Цель работы

Цель работы - изучение защитного влияния пептидов ЛФ и а-ЛА на желудочно-кишечный тракт и обоснование состава пептидного комплекса противоязвенного, антидисбактериозного, антиоксидантного действия.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

- Изучить пептидный состав гидролизатов ЛФ и а-ЛА и их защитные свойства против повреждений желудочно-кишечного тракта в зависимости от условий протеолитического процесса;

- Установить функциональную связь между пептидным составом

гидролизатов и их биологической активностью: противоинфекционной, бифидогенной, противоязвенной, антиоксидантной;

- Изучить совместное защитное действие относительно желудочно-кишечного тракта пептидов ЛФ и a-JTA;

- Разработать рекомендации по созданию полифункциональной пептидной композиции с защитным действием против повреждений желудочно-кишечного тракта.

Научная новизна работы

Впервые показано профилактическое и защитное действие пептидов ЛФ, а-ЛА и их комплекса относительно повреждений ЖКТ (противоязвенное, антидисбактериозное).

Установлено наличие в мембране Bifidobacterium Adolecsentis В-1 белка (58 кДа), связывающего лактоферрин и его пептиды

Теоретически и экспериментально обоснован состав нового пептидного комплекса, рекомендуемого в качестве биологически активной основы средств относительно защиты желудочно-кишечного тракта.

Практическая значимость работы

- С учетом установленных в работе биологических свойств пептидов ЛФ и а-ЛА результаты исследований могут быть использованы в биотехнологических схемах разработок физиологически эффективных препаратов медицинского, косметического, пищевого назначения.

- Примененные в работе методологические подходы в исследовании структурно-функциональных свойств пептидов ЛФ и а-ЛА могут рассматриваться как адекватные в разработках методов скрининга пептидов различной функциональной направленности.

- На основе пептидного комплекса разработан препарат «ЖКТ-НОРМ»,

обладающий антимикробным, бифидогенным, антидисбактериозным, антиоксидантным, противоязвенным действием.

- Результаты исследования включены в учебный курс лекций по дисциплине «Биологически активные вещества молока».

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на международных конгрессах, конференциях: Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2010 г.); Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012 г.); 10-й международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (в конкурсе молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу получен диплом и присуждена медаль); Пленарном заседание 10-й международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2012); Работа выполнялась в рамках гранта РФФИ 10-04-01005-А.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Функциональное питание как важный элемент здоровья населения

Общеизвестно, что питание является одной из важнейших физиологических потребностей организма, которая обеспечивает его формирование, функционирование, устойчивость к неблагоприятным воздействиям внешней среды. Все это обуславливает повышенное внимание к проблемам питания со стороны государства и общества.

Одним из путей решения проблем питания современного человека является создание функциональных пищевых продуктов.

Перспективным направлением в создании биологически активных добавок нового поколения является использование в их рецептуре биологически активных веществ - пептидов, в частности ЛФ и а-ЛА.

Изречение «Пусть твоя пища будет твоим лекарством, а твое лекарство — твоей пищей» принадлежит «отцу медицины» — великому Гиппократу [74]. И сегодня, спустя 2,5 тысячи лет, ученые подтверждают, что питательные вещества, содержащиеся в ней, способны поддерживать и умножать наши жизненные силы. Причем для нормального функционирования всего организма в целом этих веществ требуется как минимум 600. Лишь небольшую их часть человеческий организм в состоянии производить сам, все же остальные поступают в составе пищи.

По оценкам диетологов, более половины населения земного шара испытывают состояние так называемого голода, которое вызвано отнюдь не низкокалорийной пищей, а постоянным недополучением этих веществ.

Потеря биологически активных белков влечет за собой практически исчезновение защитной функции животного организма.

Дети не получают материнского молока, находятся либо на искусственных

смесях, либо на смешанном питании. При этом особенно страдает желудочно-кишечный тракт. Происходит рост вторичных иммунодефицитных состояний, онкологических заболеваний, алиментарно - зависимых болезней, включая пищевую аллергию, язвенную болезнь желудка, гастрит, дисбактериозы различного генеза и другие заболевания [8].

Почти 10% населения земного шара страдают язвенной болезнью желудка.

В России на учете у гастроэнтеролога состоит больше 1,5 миллионов язвенников, а сколько болеют, но не обращаются к врачу, можно только догадываться [74].

Также огромный процент россиян страдают от дисбактериозов, масштабы этого заболевания достигли национальной катастрофы, затронув 90 % взрослого населения страны и более 25 % детей в возрасте до одного года [82].

Так, где же выход из этого тупика? Необходимо повышение неспецифической резистентности здоровых и больных людей, улучшение функционирования естественных систем детоксикации и механизмов обеспечения иммунобиологической реактивности организма с использованием в питании физиологичных безвредных природных соединений и их сочетаний, действие которых направлено на коррекцию функций поврежденных звеньев обеспечения гомеостаза [74].

Ведущие специалисты мира считают, что наиболее эффективным, быстрым и экономически приемлемым способом решения этой проблемы является широкое применение в повседневной практике функционального питания, лечебно-профилактических препаратов, биологически активных добавок, представляющих собой композиции натуральных или идентичных натуральным биологически активных веществ.

Понятие «биологически активные добавки», или проще БАД, для России довольно новое, хотя в Японии, например, их применяют уже более 50 лет, а в США — около 20.

С помощью БАД можно весьма успешно справляться с болезнями, устраняя их причинно-следственные связи, а также эффективно использовать в профилактических целях или при комплексном лечении многих хронических заболеваний.

Длительное же и постоянное их применение оказывает настолько глубокое лечебное влияние, что зачастую превосходит воздействие лекарственных препаратов.

Традиционно БАДы подразделяются на нутрицевтики и парафармацевтики.

Нутрицветики - это БАД, применяемые для коррекции химического состава пищи. Их смысл заключается в том, чтобы довести содержание естественных эссенциальных пищевых веществ до уровня физиологической потребности здорового организма. Они являются источником витаминов, белков, углеводов, аминокислот, полиненасыщенных жирных кислот, макро- и микроэлементов и пищевых волокон. Суточная доза витаминов Е и С в нутрицевтиках не должна превышать 10-кратной суточной потребности в них человека, витаминов А, О, группы В и других — 3-кратного у