Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние дезамидирования на антиокислительные свойства лактоферрина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белизи, Саид, Ростов-на-Дону

РОСТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

Б Е Л И 3 И САИД

ВЛИЯНИЕ ДЕЗАМИДИРОВАНИЯ НА АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

МКТОФЕРРИНА

03.00.04 - БИОХИМИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор медицинских наук., профессор, А.П.Шепелев кандидат биологических наук доцент, Н.В.Пушкина

Ростов-на-Дону 1998

СОДЕРЖАНИЕ

В ВЕДЕНИЕ...............................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................9

1. 1. Лактоферрин в организме человека и животных,..........9

1.2. Свободнорадшальные процессы в биологических системах ...................................................21

1.3. Посттрансляционые модификации и их роль в функционировании белков........................................ 36

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ........51

2.1. Материалы исследования................................51

2.2. Методы исследования...................................51

2.2.1. Получение Лактоферрина............................ 52

2.2.2. Критерии чистоты и физико-химических свойств исследуемого белка................................ 54

2.2.2.1. Спектрофотометрический метод определения белка.............................................................................54

2.2.2.2. Определение количества белка методом Оедма-

ка............................................ 55

2.2.2.3. Количественное определение белка методом радиальной иммунодиффузии в агарозном геле......55

2.2.2.4. Определение спектра поглощения лактоферрина...57

2.2.2.5. Электрофорез белков е градиентном полиакре-ламидном геле в присутствии SDS............... 58

2.2.2.6. Определение N-концевых аминокислот............60

2.2.2.7. Аминокислотный анализ.........................60

2.2.2.8. Получение спектров флуоресценции препаратов

лактоферрина.........................................60

2.2.2.9. Насыщение лактоферрина железом................61

2.2.2.10. Содержание железа в препаратах лактоферрина..61

2.2.3. Изучение антиоксидантных свойств лактоферрина.....61

2.2.3.1. Приготовление и инкубация растворов белка.....64

2.2.3.2. Определение содержания амидных групп в белках. .................................................................64

2.2.3.3. Определение ТХУ-растворимых фолин-положительных продуктов.......................................65

2.2.4. Статическая обработка результатов исследования----66

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И

И X ОБСУЖДЕНИЕ.............................67

3.1. Выделение лактоферрина из женского молозива----.......67

3.2. Антиоксидантные свойства лактоферрина................. 91

3.3. Влияние посттрансляционного дезамидирования лактоферрина на его антиокислительные свойства............. 104

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................118

В Ы В ОДЫ...................................................120

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................121

СПИСОК СОКРАЩЕНИЯ

АКМ активные кислородные метаболиты

АпоЛФ лактоферрин несодержащий железо

АФК активные формы кислорода

гп глутатионпероксидаза

ГР глутатионредуктаза

гт глутатионтрансфераза

жлп желточные липопротеины

ЛАГ легкогидролизуемые амидные группы

ЛФ лактоферрин

ЩА малоновый диальдегид

МеШЬ метгемоглобин

нь гемоглобин

Н202 перекись водорода

02~ супероксидный анион радикал

102 синглетный кислород

ОН' гидроксильный радикал

пол перекисное окисление липидов

сод супероксиддисмутаза

САГ суммарные амидные группы

ТАГ трудногидролизуемые амидные группы

ХЛ хемшюминесценция

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. ЛФ- один из важных компонентов женского молока, который выполняет многообразные физиологические функции такие, как антимикробное действие, регуляция клеточной пролиферации, стимуляция неспецифического иммунного ответа,, пищевая значимость для новорожденных и участие в метаболизме железа [413= ЛФ, открытый в молоке, обнаружен и в других биологических жидкостях организма [81,66,86], Во многих современных публикациях, посвященных ЛФ, делается акцент на применение его в качестве добавок к искусственным заменителям молока» При этом в качестве аргументов приводится широкий спектр действия ЛФ, поступающего с молоком в организм новорожденного. Существующие способы получения ЛФ имеют ряд методических сложностей, что затрудняет их воспроизведение [41,66,103,190].

Важнейшей биологической функцией ЛФ является способность связывать ионы железа. Он служит одним из специфических белков, транспортирующих железо и обеспечивающих высокую степень его усвояемости из женского молока £41,66,1391. Связывание ЛФ железа, обладающего, как известно, высоким прооксидантным потенциалом, определяет, очевидно, и его роль в свободнорадикальных реакциях, в том числе процессах перекисного окисления липидов биомембран. Литературные данные об участие ЛФ в регуляции уровня свободнорадикальных процессов противоречивы: Имеются указания на его анти-оксидантные [94,123] и прооксидантнные [£09] свойства. Другие авторы считают, что присутствие ЛФ не влияет на окислительные процессы [102].

Степень связывания ионов железа с белками, в том числе с ЛФ5 среди многих факторов может определяться и посттрансляционными модификациями аминокислотных радикалов его молекул.

Одной из важнейших посттрансляционных модификаций является дезамидирование остатков аспарагина, и глутамина, которые обеспечивают формирование и поддержание пространственной структуры белка [84,£143 - Универсальный процесс посттрансляционного деза-мидирования является началом структурных преобразований, облегчающих атаку белка протеолитическими ферментами [72,2293 и может явиться причиной нарушения функций белковых молекул [174,230]. Можно предположить, что дезамидирование способно изменить активность белков, участвующих в свободнорадикальных процессах.

Цель и задачи исследования. Целью исследования явилось установление действия ЛФ на интенсивность свободно-радикальных процессов и возможность изменения его эффективности при посттрансляционном дезамидировании, а также разработка относительно простого способа препаративного получения ЛФ из женского молозива.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способ препаративного получения ЛФ из женского молозива,

2. Получить очищенный препарат ЛФ из женского молозива модифицированным способом,

3. Идентифицировать полученный препарат ЛФ по иммунохими-ческим характеристикам и физико-химическим свойствам.

4. Установить динамику дезамидирования ЛФ в условиях, моделирующих физиологические.

5. Изучить влияние ЛФ на интенсивность свободнорадикальных процессов в модельных системах.

6. Установить влияние неферментативного дезамидирования ЛФ на его антиокислительные свойства.

Научная новизна работу;

Разработана новая простая экономичная модификация выделения высокоочищенного препарата ЛФ из женского молозива.

Впервые показаны антиокислительные свойства ЛФ в модельных системах, которые реализуются разными способами.

Впервые установлена динамика дезамидирования ЛФ из женского молозива е условиях, моделирующих физиологические, и определено его влияние на антирадикальный эффект ЛФ.

Основные положение, выносимые на защиту:

1. Разработан модифицированный способ препаративного выделения ЛФ из женского молозива. Полученный препарат идентифицирован по физико-химическим и иммунологическим характеристикам.

Е. Установлена антиокислительная активность ЛФ в модельных системах реакции Фентона и в системе желточных липопротеинов в присутствии родамина 61, которая реализуется разными способами.

3. Установлено неферментативное дезамидирование ЛФ в условиях, моделирующих физиологические (рН-7, Ь=37°, НаС1-0,9%).

4. Дезамидирование белка сопровождается изменением его антиокислитель ной активности и способности связывать ионы железа.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в работе данные представляют существенный интерес., с одной стороны, для промышленного получения лактоферрина, с другой стороны, для понимания механизмов его антирадикального действия,

Обнаруженные антирадикальные свойства ЛФ,которые усиливаются, в процессе спонтанного дезамидирования в физиологических условиях позволяют считать ЛФ компонентом сложной системы эндогенных антиоксидантов, поддерживающих уровень свободнорадикальных процессов на безопасном для биологических структур уровне.

Предложенный модифицированный метод позволяет, без специального оборудования, получить хорошо очищенный препарат ЛФ из женского молозива,, что дает возможность использовать белок в качестве пищевых добавок или лекарственных средств, в том числе и при состояниях организма, связанных с избыточной генерацией свободных радикалов.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ЛАКТОФЕРРИН В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Лактоферрин был впервые обнаружен сначала в коровьем, а затем в женском молоке. Последующие исследования показали его наличие в плазме крови, нейтрофилах и практически во всех экзокринных секретах млекопитающих (желчь, слезы, семенная плазма, пот и другие) и тканях в различных концентрациях [61,66,82].

По данным разных авторов, концентрации ЛФ в плазме крови и нейтрофильных лейкоцитах варьируют от 0,13 - 0,42 мкг/мл и 3 мкг на 10® клеток до 0,2 - 1,5 мкг/мл и 15 мкг на 10б клеток [66]. Концентрация ЛФ в женском молоке весьма значительна: 1 - 3 мг/мл. Наиболее богато им молозиво-женское молоко первых трех-четырех суток лактации - 7 мг/мл [413.

Оптимальный уровень ЛФ поддерживается за счет эндогенной выработки и экзогенного поступления белка. Для растущего организма этот баланс в большей степени определен экзогенным ЛФ, основным источником которого является женское или коровье молоко [66].

Изучению строения ЛФ и его физиологической роли было посвящено значительное число исследований, позволивших сформулировать положения о его важных и многообразных физиологических функциях, таких как антимикробное действие, регуляция клеточной пролиферации, иммунного ответа, воспалительной реакции [413, участие в обмене железа [41,66,1393, пищевая значимость для новорожденных [413.

Присутствие лактоферрина в экзокринных секретах первоначально

позволило считать местом его синтеза клетки железистого эпителия. Позднее было показано., что ЛФ появляется впервые в клетках мононуклеарах (предположительно гранулоцитах) печени, селезенки, вилочковой железы, желудка, надпочечников. Были получены данные о том, что количество ЛФ растет во вторичных гранулах нейтро-фильных лейкоцитов по мере созревания промиелоцитов. Низкий уровень ЛФ при нейтропенических состояниях и отсутствие его в плазме крови при агранулоцитозе свидетельствует о том, что плазменный ЛФ - производное нейтрофилов. Продукция ЛФ в других тканях ретикуло-эндотелиальной системы не влияет на его количество в плазме крови. Нейтрофильный ЛФ высвобождается из специфических вторичных гранул лейкоцитов в процессе фагоцитоза одновременно с другими белками [663.

Некоторые исследователи полагают, что ЛФ может выделяться во внеклеточную среду или диффундировать в плазму из клеток, осевших на тканях [663.

Вопрос об источнике ЛФ е молоке обсуждался мало. По биохимическим свойствам, аминокислотному составу, иммунологическим характеристикам ЛФ молока идентичен ЛФ из нейтрофилов кроЕИ человека [403. Однако последние вряд ли могут быть главным источником ЛФ в молоке, так как при маститах уровень ЛФ достигает нескольких мг, увеличиваясь в десятки раз за несколько часов. В молочной железе коровы при введении сальмонелезного эндотоксина он увеличивается в 20-25 раз за несколько часоЕ. Таким образом, ЛФ молока является скорее всего специфичным белком, синтезированным в клетках молочной железы [1033.

Обнаружена способность ЛФ in vitro ингибировать синтез е мак-

рофагах женского молока простатландкнов Ео, оказывающих значительное влияние на секреторные и моторные свойства тонкой кишки. Другие белки молока (лактальбумин, лактоглобулин) такого действия не оказывали. Эти данные позволили рассматривать ЛФ как один из важных природных Факторов, участвующих в регуляции функционального состояния тонкой кишки у детей раннего возраста [41, 663.

При острых вирусных инфекциях (корь., краснуха, ОРВИ, гепатиты А и В) выявлен деффект синтеза ЛФ в нейтрофилах. Эти данные могут быть использованы для прогноза риска наслоения и течения бактериальной суперинфекции у больных, перенесших вирусную инфекцию. ЛФ рассматривается как перспективный диагностический критерий малигнизации эпителиальных тканей - синтез ЛФ при этом резко снижается [41,663.

Рассматриваются некоторые негативные последствия повышения уровня ЛФ в крови. Гипссидермию, наблюдаемую при острых инфекциях, связывают с увеличением в крови аполактоферрина, который связывает железо сыворотки и снижает его уровень [413. Образование комплексов ЛФ с различными макромолекулами (альбумин, белки молока) в результате разрушения лейкоцитов в очагах воспаления приводит к снижениям иного рода, например к закупорке протока поджелудочной железы при панкреатите [663.

Вопрос о пищевой значимости ЛФ долгое время оставался спорным. Результаты балансовых исследований показали, что в неизменном виде у шестинедельных детей с калом выводится лишь 1 % ЛФ -таким образом 99 % этого белка расщепляется в желудочно-кишечном тракте (при том, что доля ЛФ в общем белке молока составляет

15-18 %. Полагают., однако, возможным, что даже небольшие количества ЛФ, избежавшие протеолиза в желудочно-кишечном тракте ребенка, достаточны для реализации его биологических функций. Кроме того, показано, что антимикробную активность сохраняют фрагменты ЛФ, образующиеся при его протеолизе [190]. Весьма вероятно, что защитные эффекты ЛФ осуществляются в верхних отделах кишечника [411. Установлено, что железо лучше усваивается из ЛФ, чем из неорганических солей [66,139].

Исследуются другие вопросы влияния ЛФ на клетки ретикуло-зн-дотелиальной системы. Имеются сообщения об усилении фагоцитоза у лейкоцитов при связывании ЛФ [41,99]. Обсуждается возможная роль ЛФ нейтрофилов в качестве ловушки выходящего из фагоцитированных бактерий железа. В опытах in vitro с нейтрофилами и E.coli до 88 % радиоактивного железа бактерии включалось в ЛФ [159]. ЛФ участвует в регуляции гранулопоэза, ингибируя миелопоэз [41]. Выдвинута гипотеза о выполнении в организме лактоферрином специфической иммуномодулирующей функции, путем воздействия на Т- и В-лимфоциты [66], которые имеют рецепторы для ЛФ [165], и участвуют в формировании локального иммунитета [66]. Имеются данные как о стимулирующем, так и об ингибирующем влиянии ЛФ на синтез антител [41].

Показано, что лизоцим, альбумин, фукоза не влияют на связывание ЛФ с клетками HT29-D4, которое, по видимому, протекает без участия электростатических сил. Также показано что лейкоцитарная протеиназа катепсин G подавляет связывание с клетками ЛФ С175].

Изучено ингибирование ЛФ и гликомакропептидом К-казеина коровьего молока связывания холерного токсина с клетками яичников

китайских хомячков линии К/1. Как ЛФ, так и гликомакропепид, эффективно снижали степень индуцированных токсином морфологических изменений клеток. Высказано предположение, что ингибирующее действие ЛФ и гликомакропептида объясняется, по-видимому, наличием у них концевой сиалоЕой кислоты [140]. Бактериостатические эффекты ЛФ были показаны в отношении Staphylococcus albus, Stap-hilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, E.coli (1). Обсуждается бактерицидное воздействие ЛФ на Streptococcus mutants [90,1831; сильное бактерицидное влияние белка зафиксировано в отношении E.coli [190].

Антимикробные свойства ЛФ в значительной мере обусловлены его способностью связывать железо. Этому явлению посвящено главное число работ по выявлению бактериостатических эффектов ЛФ, Антимикробная активность ЛФ тем выше, чем ниже степень насыщения апопротеина ЛФ железом. По этому антимикробная активность у коровьего ЛФ, содержащего железа в четыре раза больше, чем ЛФ женского молока, существенно ниже [41].

Для антимикробной функции ЛФ очень важны его взаимодействия с другими белками. Существует мнение, что ЛФ с секреторным иммуноглобулином А, лизоцимом и комплементом образует единую функциональную "бактериолитическую" систему женского молока, вызывающую лизис бактерий, и защищающую желудочно-кишечный тракт от инфекции [10].

Имеется большое число данных о наличии специфических рецепторов к ЛФ у различных микроорганизмов. У некоторых штаммов E.coli выявлено около 5400 таких рецепторов на одну клетку [165]. Примерно 5700 рецепторов на одну клетку имеют некоторые штаммы

Staph,aureus [164]. В связи с этим предложена двухэтапная теория механизма действия ЛФ. При взаимодействии с микроорганизмом он присоединяется к специфическим рецепторам на клеточной поверхности микроорганизма и связывает железо. Это приводит к глубокому нарушению метаболизма бактерий [66], так как они во многом лишаются защиты от перекисных воздействий, что препятствует их росту СЮ].

Лактоферрин относится к классу сидерофшшинов-трансферринов,

поэтому по физико-химическим свойствам он ео многом сходен с сывороточным трансферрином и овотрансферрином.

ЛФ - гликопротеид, состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной