Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние деэамидирования и гликирования на активность некоторых белков с антиоксидантньми свойствами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние деэамидирования и гликирования на активность некоторых белков с антиоксидантньми свойствами"

(Л

На правах рукописи

1 (1 ДПР

' Уманская Наталья Яковлевна

Влияние дезамидирования и гликирования на активность некоторых белков с антаоксидантными свойствами

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Рйстов-на-Дону 1995

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии Ростовского Ордена Трудового Красного Знамени государственного университета, в отделе физико-химической биологии НИИ Биологии РТУ.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: Филиал института Биоорганической химии РАН

им. А. М. Шемякина, Ю. В. Овчинникова (г. Пущино-на-Оке)

Защита диссертации состоится 26 апреля 1995 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 063.52.08 по биологическим наукам Ростовского государственного университета (344711. г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148)

Автореферат разослан 23 щрта.1995 г. Ученый секретарь Диссертационного совета

Лукаш А.И. (г. Ростов-на-Дону) кандидат биологических наук, доцент Пушкина Н.В. С г. Ростов-на-Дону)

Погорелсва Т.Н. С г. Ростов-на-Дону) доктор биологических наук, старший научный сотрудник Страдомский Б. В. С г. Ростов-на-Дону)

доктор биологических наук

Кирой В.Н.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ,ИССЛЕДОВАНИЯ Посттрансляционные модификации сопровождают все этапы существования белковой молекулы. Многочисленные ковалентные и нековалентные модификации обеспечивают формирование и поддержание пространственной структуры белка, приобретение функциональной активности,• транспорт через мембраны, активацию в процессе функционирования ■ (Троицкий,' 1991). На этих стадиях преобладают ферментативные посттрансляционные преобразования. В регуляции катболизма белков ведущая роль принадлежит неферментативным модификациям. В эволюции возникли универсальные механизмы, обеспечивающие деградацию дефектных белков, накопление которых может вызвать саше разнообразные нарушения жизнедеятельности (Tolleisbol, Gracy, 1983, Пушкина, 1988).

В'нашей работе рассмотрены две неферментативные посттрансляционные модификации, запускающие такие механизмы - гликирова-ние и дезамидирование белков. Реакция гликирования заключается во взаимодействии восстанавливающей формы свободной глюкозы с аминогруппой лизина, амидной группой аспарагина и гидроксильными группами серина или треонина (Kato, 1990, Ваупез, 1991). Глики-рование характерно для большинства белков и происходит при нормальном состоянии организма. Однако при гипергликемии гликирова- . ние заметно интенсифицируется. Показано усиление гликирования гемоглобина, белков плазмы крови, коллагена, белков хрусталика глаза и других белков при диабете (Dunn et al., 1989). Высказано предположение, -что глюкоза является "медиатором"' старения (Cerami, 1935, Фролькис, Мурадян, 1992). В то же время глюкоза является естественным метаболитом большинства организмов. Это дает основание считать гликирование универсальной модификацией, вызывающей серьезные структурные и функциональные изменения белков.

Другой важнейшей неферментативной модификацией является гидролиз амидов (дезамидирование) аспарагина и глутамина полипептидной цепи. Скорость деоамидирования зависит от окружения амидов в аминокислотной последовательности и пространственной структуре (Wright, 1991) и от многих внешних факторов: температуры, рн, ионной силы и других. Аналогично гликированию, дезамидирование происходит не только в экстремальных условиях, но и

при нормальном функционировании организма и может расматриваться как одна из возможных причин инактивации -белков in vivo и In vitro (Wright, 1991). Робинсоном выдвинуто предположение, что гидролиз амидов может рссматриваться как "молекулярные часы", определяющие продолжительность функциониования белковой молекулы (Robinson, Robinson, 1991).

Гликирование и дезамидирование могут быть взаимосвязаны. О одной стороны это вызвано тем, что ачидные груш аспарагина подвержены обеим модификациям. С другой стороны, обе модификации влекут за собой нарушения конформации белковой глобулы, а часто и разрыв полипептидной цепи по аминокислотному остатку, следующему за аспарагином - аспарагинзависимую автофрагментацшо (Олех-нович и др., 1985). Это может облегчать дальнейшее гликирование и дезамидирование.. В нашей лаборатории на ряде объектов -7-глобулине, альбумине, инсулине, алкогольдегидрогеназе- показана такая взаимосвязь при инкубации белков в растворах глюкоза (Цибульский, 1985, Назарова, 1994).

.. Широкс? известно, что активные формы кислорода также могут оказывать повреждающее действие на организм, изменяя структуру и свойства белков и дугах биополимеров. Окислительная модификация белков считается одним и факторов их "старения" и деградации (Дубинина, Шугалей, 1993). Свободнорадикальная теория старения (Эммануэль, 1984) к настоящему времени является одной из наиболее разработанных.

Повреждающему действию свободных радикалов противостоят ан-тиоксидантные системы, важнейшей составляющей которых являются антирадикальные ферменты. Антиоксидантными свойствами обладает также альбумин плазмы крови (Halllwell, 1990) Можно было предпо-.ложить, что гликирование и дезамидирование белков с антиоксидантными функциями способны изменить их активность и интенствность свободнорадикальных процесссов. Это определило цель и задачи настоящего исследования.

. Объектами исследования были ферменты антиоксидантной системы организма - каталаза и лактопероксидаза и неспецифический ан-тиоксидант - альбумин.

' ЦЕЛЬ_ИССМОВАНИЯ - установление роли неферментативного де-замидирования и гликирования белков с антиоксидантными функцидуи

в изменении их свойств и функциональной активности в условиях, моделирующих старение в норме и при гипергликемии. •

При этом необходимо было решить следующие исследовательские

задачи:

1. Определить степень гликирования препаратов каталазы, ла-ктопероксидазы и альбумина крови при их инкубации в растворах глюкозы различной концентрации.

2. Изучить дезамидирование каталазы, лактопероксидазы и альбумина при инкубации в физиологическом растворе и в растворах глюкозы различной концентрации.

3. Исследовать динамику флуоресцентных характеристик белков при гликировании и дезамидировании.

4., Изучить деструкцию лактопероксидазы и альбумина при гликировании и дезамидировании.

5. Определить функциональную активность модифицированных ферментов и антиоксидантную активность альбумина.

6. Изучить гликированность и амидированность альбумина плазмы крови молодых и старых доноров в норме и при сахарном диабв те.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИШВ НА ЗАЩИТУ;

1. Ферменты с антиоксидантными функциями - каталаза и лак-топероксидаза а также неспецифический антиоксидант альбумин при инкубации в растворах глюкозы различной концентрации подвергаются гликированию и дезамидированию.'Динамика модификаций индивидуальна для кавдого белка.

2. Структурные модификации белков сопровождаются изменениями свойств и антиоксидантной активности белков. Характер изменений определяется видом белка, концентрацией глюкозы и временем инкубации.

3. У больных сахарным диабетом увеличена степень гликирования и снижена амидированность альбумина плазмы крови.

НАУЧНАЯ Н0ВИЗНА РАБ0ТЫ Впервые установлена динамика дезамидирования и гликчрования белков антиоксидантной зациты в условиях. моделирующих старение в норме и при гипергликемии. Изучена динамика флуоресцентных характеристик каталазы, лактопероксидазы

и альбумина при инкубации в растворах глюкозы различной концентрации.

Впервые показана взаимосвязь ковалентных и конформационных изменений белков - антиоксидантов с их функциональной активностью в модели ускоренного старения.

Впервые показана зависимость амидированности и гликированкя альбумина плазмы крови доноров от возраста в норме и при сахарном диабете.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Полученные в работе данные представляют существенный интерес для понимания механизма старения и деградации белковых молекул. Показанные неферментативное дезамидирование и гликирование и вызванные ими конформационные изменения подтверждают роль посттрансляционных модификаций в'запуске механизмов "старения" белков. Изученные изменения каталазы и лактопероксидазы влияют на их функциональную активность. Эти данные конкретизируют некоторые механизмы свободнорадикальной теории.старения.

Полученные сведения подтверждают данные о том, что сахарный диабет является патологией, ускоряющей старение. При клинических обследованиях изучение уровня амидированности и гликированности альбумина может служить для определения биологического возраста и степени тяжести заболевания сахарным диабетом.

Обнаруженное уменьшение антиоксвдантной функции альбумина при инкубации в физиологическом растворе и 0,2%-ной глюкозе дает основание предложить использование в клинической практике препаратов этого белка, частично утративших антиоксидантные свойства совместно с экзогенными антиоксидантами.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ . Материалы диссертации докладывались на научной конференции биолого-гочвенного факультета РГУ (Ростов-на Дону, 1994), научной конференции аспирантов РГУ (Ростов-на-Дону, 1994), симпозиуме "Биологические механизмы старения" (Харьков, 1994), заседании Ростовского биохимического общества (Ростов-на-Дону, 1995).

ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ По теме диссертации опубликовано 3 работы. .

СТРУКТУРА РАБОТЫ-Диссертация изложена на 130 страницах, машинописного текста и состоит из введения, обзора- литературы, списания постановки эксперимента, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения и выводов. Работа содержит 13 таблиц, 8 рисунков. Список литературы включает 214 наименований.

2. ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для изучения гликирования и дезамидирования in vitro использовали коммерческие препараты каталазы, лактопероксидазы .(НПО "Биопрепарат", г. Ростов-на-Дону) и альбумина (НПО "Иммуно-препарат", г. Уфа). Каталазу инкубировали в 0,2, 0,5, I и 5%-ном растворе глюкозы, лактопероксидазу в 0,2, I и 5%-ном, альбумин - в 0,2 и. 5%-ном растворе. Инкубацию всех белков проводили при 37°С в'течение 7 и 14 суток соблюдая условия стерильности. Контролем служили белки, инкубированные в физиологическом растворе.

После инкубации белки очищали от несвязанной глюкозы и определяли степень гликирования (Parker et al., 1981). Затем исследовали общую амидированность белков и содержание легко- и трудногидролизуемых фракций амидов (Гершенович, Кричевская, I960). Концентрацию свободного аммиака после гидролиза амидных групп белков определяли. флуорометрическим методом (Suqawara, Oyama, 1931). По применению этого метода для определения амидных групп белков нами получено свидетельство о рационализаторском предложении (Регистр, номер 321/91 от 15 мая 1991 г.). Для изучения кснформационных преобразований белков использовали флуоресцентный метод титрования акриламидом (Лакэвич, 1986). Определение функциональной активности каталазы проводили молибдатовым методом (Королюк и др., 1988) в модификации (Свечникова, 1992). Активность каталазы определяли ортотолидиновым методом (Альперо-вич, Кеселъман, 1990). Антиоксидактное действие альбумина определяли по тушению им хемшшминесценции суспензии желточных липо-протеинов в присутствии родамина 6Ж (Владимиров и др., 1992). Об интенсивности фрагментации альбумина и лактопероксидазы судили по приросту ТХУ-растворимых Фолкн-положительных продуктов (Lowry, 1951). Для изучения динамики амидированности и гликирования альбумина крови при старении и в условиях гипергликемии In

- б -

у1уо получали альбумин из плазш крови доноров двух возрастных групп - от 18 до 25 лет и от 65 до 75 лет здоровых и страдающих сахарным диабетом средней тяжести. Выделение фракции альбуминов из плазмы крови проводили методом дробного высаливания сульфатом аммония (Скоупс, 1985, Меньшиков, 1987). Полученный белок очищали от низкомолекулярныхг примесей и использовали для определения гликирования и дезамидирования методами, описанными выше. Статистическую обработку проводили общепринятыми методами (Бейли, 1962, Лакин, 1973).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения влияния глюкозы на интенсивность гликирования использовали белки, имеющие значительные структурные ' и информационные отличия - каталазу, лактопероксидазу и альбумин. При инкубации иследованных белков в растворах глюкозы различной концентрации скорости их. гликирования существенно-различались.

Наиболее чувствительной к глюкозе была каталаза. Через 7 суток инкубации в 0,2%-ной глюкозе количество гликированной ка-талазы увеличилось на 67%, в то время как прирост гликированной лактопероксидазы составил 38%, а количество гликированного альбумина не изменилось (Рис.1а). Через 14 суток инкубации в 0,2%-ной глюкозе динамика гликирования белков осталась прежней (Рис.16). По мере увеличения концентрации глюкозы в среде глики-рование усиливалось и в 5%-ной глюкозе наиболее интенсивным был прирост гликированного альбумина - его уровень составил 340% от исходного. Менее интенсивно гликировались каталаза и лактоперок-сидаза. Прирост здесь составил 235 и 170% сответственно. Та же тенденция сохранилась и через 14 суток инкубации. Более интенсивное гликирование каталазы в 0,2%-ной глюкозе может быть связано с наличием "вакантных мест" для посадки глюкозы, поскольку этот белок не содержит стабильного углеводного компонента в норме. Аминокислотные остатки, по которым может присоединяться глюкоза не всегда доступны для ее воздействия, так как могут быть "упакованы" внутрь белковой глобулы. При нарушении конформации молекулы гликирование может облегчаться. Вероятно, подобная ситуация имеет место при гликирования альбумина, когда через 14 суток в 5%-ной глюкозе наблюдается резкое - 8-кратное - увеличение коли-

а

с/с0

б

"к

ч £ ч]

3__

□а

И

0,2 0,5

1 5 0,2 0,5

1

5

содержание'глюкозы в среде (55)'

РисЛ Динамика гликирования'белков а) инкубация в течение 7 суток; б)- инубация в течение 14 суток

О-каталаза; [ч]-лактопероксидаза; [§]- альбумин. 0/Со- отношение содержания гликированного белка к исходному уровню»

чества гликированного белка.

Существенный вклад в изменение пространственной структуры белковой молекулы вносит неферментативное дезамидирование. Эта универсальная посттрансляционная модификация в силу нескольких причин может быть связана с гликированием. Прямое взаимовлияние состоит в "конкуренции" двух модифицирующих воздействий за остаток аспарагина полипептидной цепи, который может как дезамидиро-ваться, так и гликироваться. Косвенная связь проявляется в повышении вероятности "разрыхления" конформации и одиночных разрывов ковалентного остова молекулы при дезамидировании аспарагина (ас-парагинзависимая автофрагментация). Подобные .изменения могут способствовать увеличению доступности потенциальных мест гликирования. Другой причиной взаимосвязи гликирования и дезамидиро-вания является подверженность белков, регулирующих уровень глюкозы в крови, обеим модификациям.

Однако не всегда такое взаимовлияние является настолько выраженным, чтобы обнаруживаться в модельном эксперименте. Из

диаграмм, представленных на рисунке 2 следует, что скорость дезамидирования белков была неодинаковой.- Максимальное снижение амидированности, обнаруженное при инкубации альбумина в физиологическом растворе» 0,2 и 5%-ной глюкозе в течение 14 суток, составило 10%. Гликирование альбумина не вызвало ускорения дезамидирования.

Ферменты дезамидировались более интенсивно. При инкубации в физиологическом растворе через 14 суток каталаза утратила 14% амидов, а лактопероксидаза - 42%. Эти результаты согласуются с данными о существовании корреляции между степенью амидированности белков и скоростью их обмена. Показано, что чем выше содержа-

концентрация глюкозы, в среде (%)

ч ч й- L ч ч ч ч Я u L ч ч ч ч А

N Ч ч ч ч ч / у

С/С„

С/С„

б

ч ¿1 ^ Jv

ч и

ч

— ч

ч

ч

ч

ч

ч

ч

Рис. 2 Динамика дезамидирования белков а)-инкубация в течение 7 суток; б) -инкубация в течение 14 суток □ ~ каталаза; лактопероксидаза; О

ношение степени амидированности белка к исходному уровню.

альбумин; С/С0- от-

ние амидов в белковой молекуле, тем меньше время ее "жизни" (Robinson et al., 1970). Действительно, суммарная амидирован-ность альбумина составила 603 мкМ азота амидных групп на 1г белка, а каталазы и лактопероксидазы - 1071 и 940 мкМ соответственно. Пропорционально этому скорость "старения" альбумина In vitro была ниже таковой для каталазы и лактопероксидазы.

В эксперименте по инкубации лактопероксидазы, как и в опыте с альбумином, мы не обнаружили ускорения дезамидирования при гликированш. Возможно, это объясняется тем, что скорость деза-с

мидирования лактопероксидазы была достаточно высокой и в отсутствие глюкозы и на фоне такого глубокого дезамидирования влияние глюкозы нивелировалось.

Иные результаты дало изучение динамики дезамидирования ка-талазы. При инкубации в физиологическом растворе и растворах глюкозы 0,2 - 1%-ной концентрации скорость дезамидирования была относительно небольшой и одинаковой во всех средах. Через 7 суток инкубации амидированность каталазы снизилась на 6-8%, а через 14 суток - на 14-15%. Инкубация белка в 5%-ной глюкозе вызвала более глубокое дезамидирование - на 23% через 7 суток и на 29% - через 14 суток. Таким образом, здесь наблюдается усиление дезамидирования при гликировании белка и проявляется то взаимовлияние двух посттрансляционных модификаций, о котором говорилось выше. Изменения по фракциям легко- и трудногидролизуемых амидных групп "'происходили одинаково во всех исследованных белках.

Следствием гликирования и дезамидирования явились конформа-ционные изменения исследуемых белков. Из диаграмм, представленных на рисунке 3 следует, что эти изменения не были однонаправленными.

Наиболее четкой выглядит динамика конформационных изменений каталазы. Наблюдаемые изменения мзгашо интерпретировать как достаточно интенсивное "разрыхление" белковой молекулы, одной из причин которого может быть снижение взаимодействий между субъединицами каталазы. Через 7 суток инкубации в физиологическом растворе доступность триптофана для тушителя увеличилась на 55%, а через 14 суток - на 61%. Можно утверждать, что эти изменения соответствовали характеру наблюдаемых ковалентных модификаций, которые происходили ,также относительно медленно. Присутствие в среде инкубации глюкозы не вызвало существенных конформационных изменений, как не вызвало и ускорения дезамидирования.

Динамика пространственных перестроек лактопероксидазы бйла не столь однозначна. Инкубация этого белка в физиологическом растворе вызвала незначительнее "разрыхление" глобулы - доступность триптофана тушителю возросла на 12 и 17% через 7 и 14 суток соответственно. 0,2%-ная глюкоза позволила белку в большей мере сохранить нативную конфэрмацию. Изменения составили 7 и 12% соответственно. Интересно, что через 7 суток инкубации в 1%-ном растворе глюкозы произошло некоторое "уплотнение" молекулы лак-

Kav KsF0

0,2 1

0,2

содержание глюкозы в среде (%)

Рис.3 Динамика флуоресцентных характеристик белков а ^инкубация в течение 7 суток; б) инкубация в течение

14 суток;О-каталаза; (3 -лактопероксидаза; [5]-альбумин; Кз7/Кзтл -отношение' значения константа Штерна-Фольмера к исходному

,п -отношение' значения константа Штерна-« значению ;

топероксидазы, однако по истечении 14 суток вновь наблюдалось "разрыхление" на 13% относительно исходного уровня. В целом можно Утверждать, что "старение" лактопероксидазы не вызвало глубоких конформационных изменений. Это соотносится с темпом ее гли-кирования, который был ниже, чем у каталазы и альбумина.

Наблюдаемоэ нами "уплотнение" молекулы альбумина, о котором свидетельствовало увеличение флуоресценции триптофана на 21% в' физиологическом растворе и на 14% в 0,2%-ной глюкозе, может объясняться усилением межмолекулярных взаимодействий альбумина. Это подтверждает литературные данные об агрегации молекул альбумина с возрастом (Никитин, 1977).

Предпринятое нами исследование позволило установить наличие конформационных изменений каталазы, лактопероксидазы и альбумина при их Устарении" в условиях гипергликемии In vitro, что является важным для изучения механизмов старения и деградации белков. Полученные результаты позволяют утверждать, что две изученные нами реакции, запускающие механизмы старения, Идут по общей схеме, когда изменения первичной структуры белка вызывают нарушения его натавной конформации. Следующим этапом деградации белков In vivo может быть протеолиз модифицированных молекул. Установлено

увеличение атакуемости дезамидированных белков тканевыми пептид-гидролазами и бактериальной проназой (Пушкина, 1979). Совокупность неферментативных протеолитических реакций может быстро привести молекулу белка к полной деструкции. Однако постановка эксперимента In vitro предполагала отсутствие в инкубационном растворе протеолитических ферментов. Поэтому далее нами рассматривался функционально значимый этап деградации белков - утрата их биологической активности.

Из диаграммы 4а видно, что измениния активности каталазы и лактопероксидазы через 7 суток инкубации были разнонаправленными. Интактная лактопероксидаза обладала активностью 35,6 Ед/г. Через 7 суток инкубации произошло снижение активности в физиологическом растворе на 22%, а в 0,2, I и 5%-ной глюкозе - на 27,

А/Ал

U75

Гл

А/Ал

0,2 0,5 I

ч 1 ч

ч u ч

ч % ч

ч — ч

ч ч

ч ч

ч ч

ч ч

ч ч

ч ч

ч ч

ч ч

ч ч

ч ч

ч ч

ч ч

ч ч

__

Гл

Рис.4 Динамика биологической активности белков

а) инкубация в течение 7 суток; б) инкубация в течение 14 суток

I |- каталаза;Гч]- лактопероксидаза; [§]- альбумин; А/А_- отношение биологической активности белка к исходному уровню; Гл - содержание глюкозы в среде (%).

Г

О

33 и 41% соответственно. В то время как лактопероксидаза инакти-ьировалась и скорость этого процеса возрастала параллельно с ростом уровня глюкозы в среде и усилением гликирования, для ката-лазы воздействие глюкозы-не стало инактивирующим. Наоборот, инкубация этого фермента в физиологическом растворе и в растворах глюкозы 0,2-1й-ной концентрации вызвала небольшое повышение ее биологической активности; Такие изменения труднообъяснимы и могут быть связаны со сложной структурой самого фермента.

В последующие 7 суток происходило снижение активности каталазы. Однако и здесь изменения не выявили зависимости от модифицирующего воздействия глюкозы или дезамидирования. Наиболее значительное снижение биологической активности - на 52% произошло у каталазы, инкубированной в физиологическом растворе.. Почти также инактивировался фермент в 0,2 и 5%-ной глюкозе - на 46 и 44 % соответственно. Воздействие глюкозы в'0,5 и 1%-ной концентрации не повлекло таких глубоких изменений и снижение активности в этих растворах составило 7-14%.''

Таким образом, наибольшие изменения ферментативной активности произошли при инкубации каталазы в отсутствие глюкозы. Это дает основания предполагать достаточно большую степень' защищенности активного центра каталазы от последствий изучаемых посттрансляционных неферментативных модификаций ее молекулы» Подобная устойчивость может иметь важное значение для поддержания ан-тиоксидантного потенциала эритроцитов & условиях гипергликемии.

Снижение ферментативной активности лактопероксидазы как через 7, так и через 14 суток инкубации происходило в прямой зависимости от концентрации глюкозы в среде (Рис.4б). Сопоставляя эти данные с результатами гликирования и дезамидирования можно заключить, что снижение активности фермента, инкубированного в Физиологическом растворе, происходит за счет 1 его дезамидирования. Это еще раз подтверждает участие этой модификации в инактивации белков. Поскольку снижение активности лактопероксидазы в растворах глюкозы было еще более интенсивным, как и гликирова-ше, то можно предположить для данного белка что гликированиа происходило по амидным грушам остатков аспарагина и глутамина полипептидной цепи, вызывая серьезные пространственные перестройки, а возможно и разрывы цепи. Подобные выводы дополняют данные литературы, согласно которым глидирование может приводить

к структурно-функциональным изменениям в белковой молекуле и служить одним из запускающих звеньев в механизмах инактивации и старения.

Изменения антиоксидантной активности альбумина существенно отличались от описанных для каталазы и лактопероксидазы. Через 14 суток инкубации альбумина б физиологическом растворе интенсивность тушения им хемилюминесценции снизилась на 22% по сравнению с исходной. Примерно такое же снижение произошло и в 0,2%-ном растворе глюкозы. Инкубация в 5%-ной глюкозе привела к увеличению активности альбумина на четверть от исходной. Важно, что подобное увеличение активности сопровождалось приростом количества дезамидированного и гликированного белка. Поэтому нет оснований считать.; его связанным с благоприятным воздействием среда инкубации, помогающим сохранить нативную структуру молекулы. Вероятна подобное усиление антиоксидантных свойств альбумина могло быть вызвано фрагментацией белка, в частности, автофрагментацией, в результате которой образовалось значительное количество низкомолекулярных соединений, в том числе так, называемых молекул средней массы, пептидные составляющие которых могут самостоятельно проявлять антиоксвдантные свойства (Лукаш и др., 1994). Рисунок 5 иллюстрирует эти изменения.

Большинство низкомолекулярных катаболитов-антиоксидантов (мочевина, урат, молекулы средней массы) проявляют свой эффект

Рис.5 Содержание ТХУ-растворшых Фолин-положителыгых продуктоь при инкубащш альбумина

посредством взаимодействия с ионами железа - важнейшими катализаторами свободнорадикальных процессов. Фрагментация полипептидной цепи увеличивает содержание в системе а-карбоксилов, вероятно, взаимодействующих с этими ионами и изменяющих их способность к. генерации свободных радикалов. Именно эти "осколки" молекулы альбумина, а не сохранившиеся его целые молекулы, вероятно, ви-зывали дополнительное тушение хемилюминесценции.

Полученные результаты обосновали- необходимость сравнения прироста ТХУ-растворимых продуктов деструкции альбумина с такой динамикой у другого бежа. Для сравнения выбрали лактопероксида-зу, результаты гликирования, дезамидирования и инактивации которой наиболее существенно отличались от результатов "старения" альбумина.

Из. диаграмм (Рис.6) видно, что темпы прироста • продуктов фрагментации в исследованных белках существенно различаются.

11

мкг ■ тирозина на мг

белка 6

5

4

3

0,5'

11 10

б 5 4

0,5'

ч

ч

ч

ч

ч

ч

ч

ч

ч

ч

ч

ч

ч

л ч

ч

ч

ч

ч

ч

0,2 1 5 . О 0,2 1 содержание глюкозы в среде (%)

Рис.6 Содержание ТХУ-растворимых продуктов деструкции в растворах белков при инкубации

а)инкубащ5я в течение 7 суток б)инкубация в течение 14 суток

лактопероксидаза альбумин

* - достоверные изменения, относительно контрольного раствора: А - достоверные изменения, относительно исходного уровня.

8

Прирост ТХУ-растворимых продуктов в альбумине, инкубированном в . физиологическом растворе через 7 суток составил 0,01 мкг тирозина на I мг'белка,а для лактопероксидазы, инкубированной в тех же условиях, прирост составил 2,3 мкг тирозина на 1мг белка. Через 14 суток инкубации эти показатели были для альбумина - 0,037 а для лакотопероксидазы - 3,31 мкг тирозина на 1мг белка. При инкубации белков в глюкозе интенсивность прироста продуктов фрагментации находилась в линейной зависимости от количества глюкозы в среде. _ -

Таким образом, в рассмотренных нами моделях ускоренного старения проявились все этапы "старения" белковой молекулы. Мы наблюдали действие двух универсальных систем, ограничивающих время функционирования белка. Исследования показали, что иногда неферментативное дезамидирование и гликирование могут происходить независимо^ друг от друга, а-'иногда между ними проявляется взаимосвязь. В любом случае обе' модификации вызывают дальнейшую деградацию белковой молекулы, определенным этапом которой является утрата ее биологической функции.

Использование наш моделей, в которых неизменными оставались все характеристики, а менялись лишь объекты исследования, позволило установить, что между каталазой, лактопероксидазой и альбумином существуют не только структурные и функциональные различия. Эти белки по-разному, иногда противоположно реагировали на одни и те.же воздействия. Подобные выводы подтверждают эволюционную заданность всех характеристик синтезируемых биомолекул .для условий их функционирования с учетом срока "жизни" и возможных повреждающих воздействий. Различия в динамике глокирования, дезамидирования и биологической активности, обнаруженные нами для разных белкоЗ с антиоксидантными функциями, дают основания предположить, что у больных сахарным диабетом может возникнуть дисфункция различных звеньев антиоксидантной защиты, что может быть одной из причин усиления свободнорадикальных процессов при этой патологии.

Далее нами исследовано гликирование и дезамидирование альбумина плазмы крови молодых (до 25 лет) и старых (после 65 лет) доноров, здоровых и больных сахарным диабетом. Альбумин здоровых молодых доноров содержал 8,5 мкМ фруктозы на 1г'белка. Для здо-

мкМ фруктозы на 1г белка

*

ZEL

норма

ч ч ч ч ч ч ч ч

диабет

Рис. 7 Гликирование альбумина плазмы крови

□ ~ молодые доноры; (3- старые доноры л - достоверные, изменения, относительно белка молодых доноров; * - достоверные изменения, относительно белка здоровых доноров.

ровых старых доноров этот показатель составил 8,94 мкМ на 1г. Уровень гликирования белка у молодых диабетиков на 676%, а у старых - на 700% выше, чем у здоровых доноров (Рис. 7). Отсутствие различий между степенью гликирования альбумина молодых и старых здоровых доноров можно объяснить тем, что в здоровом организме хорошо работают система деградации модифицированных белков и, вероятно, глшшрованный альбумин не успевает накапливаться. Данные по уровню гликированного альбумина у больных диабетом подтверждот, что процесс гликирования значительно усиливается при заболевании, сопровождающемся стойкой гипергликемией. При этом белки изменяют свои функции и, возможно, играют роль как в патогенезе диабетических осложнений, так и в процессе старения (Martins et al., 1983).

Уровень суммарной акидированности альбумина молодых здоровых доноров составил 617 мкМ амидного азота на 1г белка, что соответствует данным, полученным нами в модельном эксперименте. САГ альбумина здоровых старых доноров находились на близком уровне - 590,7 мкМ на 1г белка (Рис.8а).

Распределение амидов по фракциям ЛАГ и ТАГ произошло таким образом: 331,5 мкМ ЛАГ и 261 мкМ ТАГ на Iг белка. Содержание ЛАГ альбумина у здоровых старых доноров составило 308,3 мкМ на 1г бежа, что достоверно меньше, чем уровень ЛАГ молодых здоровых людей (Рис. 86). По фракции ТАГ, представленной, в основном, глутамином, нет разжк <л меаду альбумином молодых и старых здо-роЕых доноров. У доноров, страдающих диабетом, количество С AI'

мкМ N/NH3 на 1г белка

600

500

—

ч

s

ч

ч

ч

ч

ч

300

200

А

- *

ч л

ч *

ч ч

ч ч

ч ч

ч ч

_ ч ч

h ч

норма

диабет

норма

диабет

Рис.8 Дезамидарование альбумина плазмы крови доноров а) суммарные амидные группы (САГ); б) легкогидролизуемые амидные группы (ЛАГ) Q-. молодые доноры; Q- старые доноры

*•- достоверные изменения, относительно бежа здоровых доноров; А - достоверные'изменения, относительно белка молодых доноров.

было ниже, чем у здоровых: на 17% у молодых и на 11% у старых доноров. По фракции ЛАГ эти различия составили 12 и 18%. Во фракции ТАГ различия наблюдались только у молодых доноров. Уровень ТАГ альбумина у здоровых был на' 15% выше, чем у больных людей. Таким образом, по уровню легкогидролизуемой фракции амидных груш альбумина возможно определение биологического возраста, а по степени гликирования - оценка степени тяжести заболевания сахарным диабетом. В изолированном белке происходит более интенсивное снижение амидированности. Вероятно, это связано с отсутствием в модельном эксперименте тех систем утилизации модифицированных белков, которые нормально функционируют в живом организме.

Нами обнаружено, что инкубация альбумина в течение 14 суток в физиологическом растворе, а также в присутствии 0,2%-ной глюкозы уменьшает антиоксидантные характеристики препарата. Это ставит вопрос о необходимости исследования антиоксидантных свойств медицински препаратов этого белка, используемого для инъекций в процессе хранения. Ранее было показано, что дезамидарование, деструкция и инактивация препаратов иммуноглобулинов в ходе их инкубации при 37°С в ускоренном режиме отражают изменения, наступающие _< препаратах при обычном хранении (Альперович, 1985). Поэтому весьма вероятной представляется потеря при хране-

нии антиоксидантных функций белка. В этом случае перспективным может являться использование частично утративших ан'якжсидантные свойства препаратов совместно с экзогенными антиоксидантами.

ВЫВОДЫ

I. Степень плакирования каталазы при инкубации в растворах глюкозы 0,2; I и 5%-ной концентрации составляет 8,12; 10,11; 13,25 и 17,1 мкМ фруктозы на 1г белка ' через 7 суток и 9,36; 13,58; 18,54 и 24,66 мкМ - через 14 суток инкубации. Инкубация в 5%-ной глюкозе ускоряет дезамидирование на 23 и 29% через 7 и 14 суток соответственно. Гликирование и дезамидирование каталазы вызывают усиление тушения флуоресценции белка акриламидом на 6173% через 14 суток инкубации.

2.. Инкубация каталазы в 0,2 и 5%--ной глюкозе и физиологическом растворе в течение 14 суток вызывает снижение, ее активности па 49, 43 и 56%. Инкубация в 0,5'и 1%-ной глюкозе приводит к 15 и 20%-ному снижению активности.

3. Гдакирование лактопероксидазы в 0,2; I и 5%-ной глюкозе составило 4,64; 5,22 и 11,87 мкМ фруктозы на Хг белка через 7 суток и 5,57, 5,85 и 13,35 мкМ - через 14 суток инкубации. Снижение амидированности лактопероксидазы происходило независимо от содержания глюкозы в среде на 14-18% через 7 суток и на 38-43% -через 14 суток инкубации.

4. Инактивация лактопероксидазы происходила по мере усиления ее гликирования в 0,2, I и 5%-ной глюкозе на 43, 47 и' 53% через 7 суток и на 71, 68 и 84% - через 14 суток соответственно. Наименьшее снижение активности происходит"при.инкубации лактопероксидазы в физиологическом растворе: на 22% и 45% через 7 и 14 суток.

5. Наиболее значительное усиление тушения флуоресценции акриламидом происходит -при инкубации лактопероксидазы в 5%-ной глюкозе - на 18% через 7 суток и на 34% через 14 суток инкубации.

6. Гликирование альбумина плазмы крови происходит при инкубации в 5%-ной глюкозе на 340% от исходного через 7 суток и на 744% через 14 суток инкубации. Снижение амидированности при инку бации алъбмина в физиологическом растворе, 0,2 и 5%-ной глюкозе незначительно и достигает 10-11% через 14 суток инкубации.0

7. Структурные изменения, происходящие при инкубации альбумина плазмы крови в течение 14 суток в 0,-2%-ной глюкозе и физиологическом растворе вызывают снижение его антиоксидангной функции на 17 и 22%, а при инкубации в 5%-ной глюкозе антиоксидзнт-

. ная активность погашается на 24%.

8. Гликирование альбумина плазмы крови здоровых людей составляет 8,5 мкМ фруктозы на 1г белка в возрастной категории до 25 лет и 8,94 мкМ в возрастной категории старше 65 лет. У больных сахарным диабетом в тех же возрастных категориях степень гликирования альбумина составляет 66,15 и 71 мкМ соответственно.

9. Различия между молодыми и старыми донорами в амидирован-ности альбумина- плазмы крови по фракции ЛАГ составляют 7% у здоровых людей и 12% у' больных сахарным диабетом. Суммарная амиди-рованнос_ть альбумина крови диабетиков ниже чем у здоровых людей на 11%'ъ возрастной категории до 25 лет и на• 11% в возрастной категории старше 65 лет.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Лукаш A.A., Уманская Н.Я., Карпов O.E. Влияние посттрансляционных модификаций на активность ферментов антиоксидантной защиты. В сб.: Симпозиум "Биологические механизмы старения". Тезисы докладов., Харьков, 1994г.

2. Шепотиновская И.В., Уманская Н.Я., Пушкина Н.В. Использование ингибитора протеолитических ферментов для стабилизации медицинских препаратов при их хранении. Прикладная, биохимия и микробиология. 1994. -Т.30 -Вып. 4-5. -С. 709-716.

3. Шепотиновская И.В., Назарова И.Н., Уманская Н.Я. Флуоро-метрический способ определения амидных групп белков. Клиническая и лабораторная диагностика. 1995. -ЯЗ. -С. 17-24.