Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа"

На правах рукописи

Лотош Наталья Юрьевна (у

МАРКЕРЫ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЕ ГЛИКЕМИЧЕСКИЙ СТАТУС И РАЗВИТИЕ НЕЙРОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1-го ТИПА

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени л п

13 МАИ 2015

кандидата химических наук

Москва - 2015

005568727

Работа выполнена в лаборатории № 1 Автономной некоммерческой организации «Институт биомедицинских проблем» и на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В.Ломоносова».

Научный руководитель:

доктор химических наук, в.н.с. биологического факультета лаборатории физико-химии биомембран МГУ имени М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией нейроиммунопатологии, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН

кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории биокатализа, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН

Ведущая организация:

Селищева Алла Анатольевна

Морозов Сергей Георгиевич

Белогуров Алексей Анатольевич

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Научно исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства»

Защита диссертации состоится «22» июня 2015 года в 14 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119571, г.' Москва, проспект Вернадского, д. 86, ауд. М-119

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» и на интернет сайте МИТХТ им. Ломоносова http://www.mitht.ru. С авторефератом можно ознакомиться на интернет-сайтах ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru и МИТХТ им. Ломоносова http://www.mitht.ru.

Автореферат диссертации разослан <«2-8» апреля 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник ЛУЛ-^-^г --------- д ^ _дютик

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Сахарный диабет первого типа (СД1), или иисулинозависимый диабет является аутоиммунным заболеванием, при котором разрушаются р-клетки поджелудочной железы. СД1 — многофакторное заболевание, механизм возникновения которого до конца не изучен; известно, что его развитию могут способствовать такие факторы окружающей среды, как вирусы, токсины, стресс; так же играет роль генетическая предрасположенность. При данном заболевании необходимы постоянный контроль содержания глюкозы в кропи и коррекция инсулинотерапии. Существующие на сегодняшний день маркеры гликемического контроля - содержание глюкозы и гликировамного гемоглобина в крови - имеют ряд недостатков, вследствие чего требуется поиск дополнительных маркеров.

СД1 характеризуется рядом осложнений, самым распространенным из которых является дистальная полинейропатия (ДПН) - нарушение структуры и функции периферических нервных волокон. ДПН рассматривается как следствие ухудшения показателей компенсации углеводного обмена.

Итак, ввиду гетерогенности заболевания, вероятности развития множественных осложнений и необходимости тщательного гликемического контроля перед исследователями встают задачи по поиску новых диагностических критериев и маркеров.

Список используемых сокращений:

HbAlc - гликированный гемоглобин, MALDI-TOF - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization time of flight (времяпролетная матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация), аАТ -аутоантитела, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ГФКБ - глиальный фибриллярный кислый белок, ДПН - дистальная полинейропатия, ЖХ/МС - жидкостная хроматография/масспектрометрия, ИФА - иммуноферментный анализ, КПГ - конечные продукты гликирования, ОБМ - основной белок миелина, ПААГ - полиакриламидный гель, СД 1 - сахарный диабет первого типа, СД 2 - сахарный диабет второго типа, СТЗ - стрептозотоцин, ТИС -тетразолий нитросиний, ФРН - фактор роста нервов, ЧСА - человеческий сывороточный альбумин, ЭМГ - электромиография. Термины:

Оксиальбумин - коммерческий ЧСА, в котором содержится 0,4 M SH-групп в 1 M белка (0,4 М/М); Меркаптоальбумин - коммерческий ЧСА, в котором SH-группы восстановлены до 0,7 M в 1 M белка (0,7 М/М);

Супероксиальбумин - коммерческий ЧСА, в котором SH-группы окислены до 0,2 M в 1 M белка (0,2 М/М).

Цель работы

Целью нашей работы стал поиск диагностических маркеров и отработка методологии их применения для выявления механизма развития СД1, оценки степени гликирования и окисления альбумина, выделенного из сыворотки крови пациентов с СД1, и для ранней диагностики развития у них нейрональных осложнений.

Задачи работы

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

/• Исследовать гликированный человеческий сывороточный альбумин in vitro:

а) получить препараты ЧСА с различной степенью окисления и гликирования и определить в них содержание кетоамина, карбонильных групп и SH-групп; также исследовать спектры флуоресценции альбумина;

б) проанализировать методом анионообменной ВЭЖХ степень окисления и гликирования ЧСА;

г) определить в гликированном ЧСА методом ЖХ/МС сайты связывания глюкозы с остатками лизина и аргинина.

2. Исследовать альбумин, выделенный из сыворотку крови детей с СД1:

а) апробировать методику выделения альбумина из сыворотки крови детей с СД1 с помощью аффинной хроматографии на голубом аффи-геле и определить в нем содержание кетоамина и SH-rpynn;

б) проанализировать методом анионообменной ВЭЖХ степень окисления и гликирования выделенного альбумина;

3. Определить содержание проинсулина в сыворотке крови детей с СД1

для оценки частоты встречаемости такого типа СД1, который отличен от аутоиммунного;

4. Выявить наличие дистатыюй полинейропатии у детей с различными сроками СД1;

5. Определить аАТк Р{аЬ)2-фрагментаи аптиидиотипических аАТк SI00. ГФКБ. ОБМ и ФРН в сыворотке крови детей с различными сроками заболевания СД1 и в контрольной группе;

6. Определить аутоантитеча к белкам нейрональной ткани SI00. ГФКБ. ОБМ и ФРН в сыворотке крови крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином, а также аутоантитела к инсулину и уровень глюкозы в крови, как показателей деструкции Р-клеток.

Научная новизна

Проведено систематическое изучение влияния окислительного гликирования на различные характеристики человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) in vitro в условиях нормо- и гипергликемии, а также при нефизиологической концентрации глюкозы с учётом особенностей коммерческого альбумина. Было обнаружено, что альбумин, в котором сульфгидрильные группы

частично окислены, подвержен гликировапию в большей степени, чем ЧСЛ с нормальным содержанием БН-групп.

Разработан метод разделения ЧСЛ на окисленную и восстановленную фракции с помощью анионообменной хроматографии и предложен показатель (коэффициент отношения площадей пиков флуоресценции), характеризующий глико-окислительный статус белка.

Апробирован модифицированный метод выделения ЧСА из сыворотки крови с помощью аффинной хроматографии на голубом аффи-геле с перспективой использования этого метода в условиях клинической лаборатории. Впервые были изучены следующие свойства ЧСА, выделенном из сыворотки крови детей с СД1 и без нарушения углеводного обмена (контрольная группа): содержание кетоамина и его положительная достоверная корреляция с НЬА1с, содержание БН-групп, коэффициент отношения хроматографических пиков, отражающий глико-окислительный статус.

Впервые были исследованы аутоантитела (аАТ) к нейрональным белкам, имеющим различную локализацию в периферической нервной системе и в поджелудочной железе (5100, ФРН, ОБМ и ГФКБ) в сочетании с СД1 и наличием/отсутствием ДПН. Установили, что повышенный уровень нейрональных аАТ встречается с высокой частотой (более 30%) в крови детей, больных СД1, и это явление не зависит от продолжительности диабета и наличия ДПН. Поскольку нейрональные аАТ обнаружены как у детей с ранними сроками диабета, так и со стажем, можно предположить, что эти аАТ сохраняются довольно долго, в отличие от аАТ к компонентам (5-клеток поджелудочной железы, которые к моменту манифестации СД1 уже не обнаруживаются. Таким образом, аАТ к нейрональным белкам могут служить как предвестниками развития ДПН, так свидетелями уже происходящих нарушений. Установили, что ДПН встречается у детей с различными сроками заболевания практически с одинаковой частотой. Полученные данные по высокой частоте нейрофизиологических нарушений, не зависящей от компенсации углеводного обмена и продолжительности СД1, позволили предположить участие нейрогенных механизмов в развитии СД1.

При изучении динамики появления нейрональных аАТ у крыс с диабетом, вызванным СТЗ, обнаружили достоверный подъём аАТ к ГФКБ и ФРН на 5-ый день после введения СТЗ с последующим снижением уровня антител. Кроме того, впервые было установлено, что наравне с аАТ к нейрональным белкам одновременно повышаются аАТ к инсулину. Это может свидетельствовать том, что два патогенетических процесса - гибель р-клеток и клеток нервной системы - идут одновременно. Поскольку в литературе отмечались нейрофизиологические нарушения у СТЗ-крыс (на 3-7 дни после введения СТЗ - в ЦНС, спустя 2 месяца - в ПНС), нейро аАТ можно рассматривать как предвестников развития ДПН.

Практическая значимость работы

Измерение содержания проинсулина, (а не С-пептида и/или инсулина) может оказаться полезным для выявления механизмов развития СД1.

Для оценки эффективности инсулинотерапии и её коррекции предложены два маркера: содержание кетоамина в ЧСА и коэффициент отношения площадей пиков, полученных при анион-обменной ВЭЖХ (А1/АП), которые могут охарактеризовать глико-окислительное состояние ЧСА. Использование аАТ к нейрональным белкам в качестве диагностических маркеров ДПН позволит предположить развитие данного осложнения без применения ЭМГ (что актуально для детей младшего возраста) и, следовательно, своевременно начинать превентивное лечение.

Основные положения, выносимые на защиту

- систематическое изучение свойств коммерческого препарата альбумина в окисленном и восстановленном состоянии выявило наличие остатков глюкозы. Дальнейшая инкубация с нормальным содержанием глюкозы не сопровождалась увеличением степени гликирования; при повышенном содержании глюкозы происходило увеличение содержания кетоамина, причем в окисленном альбумине содержание кетоамина возрастало с большей скоростью, чем в восстановленном;

- для определения глико-окислительного состояния альбумина предложено использовать коэффициент отношения площадей пиков, полученных методом анионообменной ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией;

- содержание кетоамина в альбумине, выделенном из сыворотки детей, больных СД1, хорошо коррелирует с пикированным гемоглобином, что позволяет рекомендовать его в качестве маркера для оценки гликемического состояния больных за более короткий промежуток времени (например, в период нахождения пациента в стационаре);

- определение содержания проинсулина в сыворотке крови детей, больных СД1, способствует уточнению диагноза заболевания;

- одновременно с СД1 развиваются нейрональные нарушения и появляются нейрональные аАТ, которые обнаруживаются также на поздних сроках заболевания.

Апробация работы

Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на XXII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» ИБХ РАН (Москва, 2010); Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли», Казанская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, два тезиса (Казань, 2010); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); II Всероссийском конгрессе «Инновационные технологии в эндокринологии» (Москва, 2014).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликованы 3 научные статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 4 тезиса в сборниках докладов научных конференций.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 215 источников. Работа изложена на 116 страницах, содержит 49 рисунков и 15 таблиц.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Введение

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, сформулирована цель и в соответствии с ней поставлены задачи исследования, указаны научная новизна к практическая значимость работы, количество публикаций и конференций, на которых были представлены основные результаты работы.

II. Литературный обзор

Обзор литературы состоит из следующих разделов: введение, в котором рассказывается об общих современных представлениях о диабете 1-го типа и подчёркивается необходимость поиска новых диагностических маркеров. Во второй главе рассматриваются причины возникновения и иммунологические аспекты СД1; описываются экспериментальные модели диабета; также уделено внимание диагностике заболевания и развитию нейрональных осложнений; отдельный параграф посвящён исследованию нейрональных антител при СД1. В заключительном разделе обсуждаются особенности влияния окисления и пикирования на структуру и свойства ЧСА и возможность применения различных параметров в клинической практике.

III. Экспериментальная часть

Объекты исследования: 1) сыворотка крови детей 4-14 лет с различными сроками СД1 и из контрольной группы (дети с нарушением физического развития, не имеющие метаболического синдрома и нарушения углеводного обмена; 2) сыворотка крови крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином и контрольных животных; 3) коммерческий ЧСА и альбумин, выделенный из сыворотки крови детей.

Исследование альбумина in vitro. В исследовании использовали ЧСА (Sigma А1653, США). Для получения гликированных форм ЧСА инкубировали в фосфатно-солевом буфере в присутствии глюкозы при 37 °С в течение 3-х недель. В качестве контроля ЧСА инкубировали без глюкозы. В физиологических условиях гликировали следующие препараты ЧСА: оксиальбумин (исходный коммерческий ЧСА, содержит 0,4 М SH-групп/М белка) и меркаптоальбумин

(коммерческий ЧСА, в котором SH-группы восстановлены дитиотриитолом до 0,70 SH-rpynn/M белка). Оба препарата (40 мг/мл) инкубировали с 5 и 50 мМ глюкозой. При гликировании в пефизиологических условиях оксиальбумин (20 мг/мл) инкубировали с 1,6 М глюкозой. Для получения супероксиальбумина (содержит 0,2 М SH-групп/М белка) оксиальбумин окисляли перманганатом калия.

Кетоамии определяли с помощью тетразолия нитросинего по методу Mashiba S.; количество SH-групп с помощью реактива Эллмана по методу Aitken А.; карбонильные производные определяли с помощью 2,4-динитрофенилгидразина по методу Levine R.L. Количество белка определяли методом Бредфорда [Досон Р.] и по оптической плотности при Х=280 нм (¡;=34445 М"'см" '). Спектр флуоресценции альбумина и пентозидина измеряли при возбуждения =285, ^„спускания =290-500 нм и ^Возбужления=325, ^„спускания =330-550 нм соответственно. Анионообменную ВЭЖХ альбумина проводили на хроматографе Varían (США) с анионообменной колонкой Mini Q 4.6/50 PE (GE Healthcare Швейцария) в градиенте NaCl. Белок регистрировали по флуоресценции при ^возбуждения = 285 нм и ^-испускания = 340 нм и по поглощению при X = 280 нм. Электрофоретическое разделение сывороточных белков в агарозе проводили с помощью диагностического кита (Cormay gel protein 100, Польша). Для определения m*/z гликированных in vitro образцов ЧСА пользовались масс-спектрометром MALDI-TOF Bruker Ultraflex TOF/TOF II (Bruker Daltonics, ФРГ). Для определения в гликированном ЧСА сайтов связывания с остатками глюкозы образцы ЧСА подвергали гидролизу трипсином. Продукты гидролиза анализировали с помощью системы ВЭЖХ, совмещенной с масс-спектрометром типа орбитальной ионной ловушки Q-Executiv (Thermo, США). Для обработки и анализа полученных спектров использовали пакеты программ Bruker FlexAnalysis, GPMAW (Lighthouse data, Дания), Mascot (MatrixSciense, Великобритания) а также базу данных NCBInr. Исследования MALDI-TOF и ЖХ/МС проводились в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича».

ЧСА выделяли из сыворотки крови аффинной хроматографией на голубом геле (Affi gel blue, Bio Rad, США), анализировали методом анионообменной ВЭЖХ и определяли содержание кетоамина и SH-rpynn.

Содержание ппоннсулина н С-пептида в сыворотке определяли методом ИФА с использованием стандартных наборов реактивов фирм «Biovendor» (Чехия) и «Monobind Inc.» (США) соответственно.

ЭлектромнограФнческое исследование (ЭМП проводилось в Российской детской клинической больнице врачом Муталовой З.М. В нервах рук и ног пациентов с СД1 были определены амплитуда М-ответа и скорость распространения возбуждения. Во всех случаях диагностированная дистальная полинейропатия была на субклинической стадии.

Определение аутоантител к нейрональным белкам в сыворотке крови детей с СД1.

Уровень аАТ к Р(аЬ)2-фрагментам антиидиотипических антител (АТ2) кролика к нейрональным белкам ГФКБ, Б100, ФРН и ОБМ определяли методом ИФА с помощью набора (Биофарм-тест, Россия). Результат оценивали в условных единицах, равных отношению оптической плотности образца к оптической плотности контрольной сыворотки (ОП0бра1ец/ОПко„троль).

Экспериментальная модель диабета. Опытной группе (10 крыс линии \Vistar) вводили стрептозотоцин (СТЗ), контрольной группе (10 крыс) вводили физиологический раствор. Забор крови производили из хвостовой вены за день до начала эксперимента («О» день), а также на 5, 10, 17, 25 и 32 дни. Уровень аАТ к инсулину и к нейрональным белкам Б100, ГФКБ, ОБМ и ФРН определяли методом ИФА. Изменение уровня аАТ для каждой крысы рассчитывали в условных единицах: отношение ОП образца к ОП в пробе «0 день». Далее рассчитывалось среднее значение в у.е. в каждой группе.

IV. Основные результаты и обсуждение

Как уже отмечалось во введении, СД1 является заболеванием неясной этиологии, для которого характерны многочисленные осложнения. Поэтому требуется многосторонний контроль состояния пациентов, для чего соответственно необходимо использовать широкий спектр диагностических маркеров. В настоящей работе для диагностики состояния пациентов и изучения механизма развития диабета 1-го типа выбраны содержание гликированного альбумина и проинсулин, а в качестве маркера нейрональных нарушений, которые часто сопровождают диабет, антитела к нейрональным белкам.

1. Уровень проинсулина у детей с диабетом 1- го типа

Содержание проинсулина в контрольной группе находилось в интервале 0,0010 - 0,0074 нмоль/л. Анализ данных по содержанию проинсулина у 82-х детей, больных СД1, позволил выделить три группы: группа 1: < 0,0010 нмоль/л (44 чел); группа 2: 0,0010-0,0078 нмоль/л (34 чел); группа 3: > 0,0078 нмоль/л (4 чел.)

Видно, что в 54% случаев (группа 1) содержание проинсулина в крови было значительно ниже нижней границы нормального интервала, что согласуется с представлениями о ключевой роли гибели Р-клеток в патогенезе СД1. В тоже время у значительного числа пациентов с разными сроками заболевания (группа 2; 41 %) уровень проинсулина находился внутри нормального интервала значений. По-видимому, такой результат свидетельствует о различной степени гибели Р-клеток в поджелудочной железе больных СД1 не только на начальном этапе СД1, но и при длительных сроках заболевания. Наконец, выявлены такие больные, у которых содержание проинсулина почти в два раза превышало верхнюю границу нормального интервала значений (группа 3; 5%). Корреляционный анализ между содержанием проинсулина и С-пептида выявил

коэффициент корреляции г = 0,61 (р<0,05), но в 5% повышенный уровень проинсулина, не коррелировал с содержанием С-пептида. Это означает, что у этого контингента больных клиническая картина диабета обусловлена не аутоиммунной деструкцией ß-клеток, а например, мутацией в гене, кодирующем проинсулин, в результате чего аргинин в положении 65 заменяется на гистидин и расщепления прогормона не происходит. Другой причиной может быть снижение активности протеинконвертазы, фермента, расщепляющего молекулу проинсулина. Полученные данные свидетельствуют о гетерогенности этиологии и патогенеза СД1, в 7-9% случаев имеющем неаутоиммунную природу [Vauhkonen I., 2005], [Dib S.A., 2008]. Определение проинсулина в клинической практике позволит выявить случаи, отличные от аутоиммунного диабета, и, возможно, применить иную тактику лечения.

Учитывая необходимость постоянного гликемического контроля при диабете, остаётся актуальным вопрос о поиске адекватного маркера гликемического контроля. Одним из таких маркеров может служить количество кетоамина в альбумине.

2. Исследование гликированного альбумина in vitro

В работе исследовали изменение различных свойств ЧСА (содержание кетоамина, SH-rpynn и карбонильных групп, флуоресценция альбумина и пентозидина) под влиянием окисли-тельного гликирования для использования этих параметров в качестве маркеров глико-окислительного состояния альбумина, выделенного из сыворотки крови пациентов с СД1.

2.1. Окислительное пикирование альбумина in vitro

Окислительное гликирование белков представляет собой неферментативную реакцию между карбонильной группой глюкозы и свободной Ç-аминогруппой лизина или аргинина (рис. 1). На рисунке отмечена группа -CO-CH2NH-, называемая кетоамином, которую определяют колориметрической реакцией с ТНС.

2.1.1. Определение содержания кетоамина, SH-групп и карбонильных групп в молекуле альбумина, инкубированного в присутствии физиологических концентраций глюкозы

На данном этапе определяли, как содержание SH-групп влияет на гликирование альбумина. Содержание кетоамина определяли в меркаптоальбумине и в оксиальбумине. инкубированных с глюкозой (0 мМ, 5мМ и 50 мМ) при 37 °С в течение 3 недель, что соответствует биологической жизни альбумина. При количественном определении с помощью калибровочной кривой концентрацию кетоамина (М) относили к концентрации белка (М). Таким образом определяли содержание кетоамина в 1 молекуле белка (М/М).

Y

с-он

н N—(CM,)—R

он + ью-|_0

«-j-Ob CH. OH

Сд О

1-е

лизин основание энаминол продукт Амадори в белке Шиффа (интермедиат) (фруктозолизин)

I

С= О

I

о- С н+н I— он СИ он

+ новый пептид

снон

N —(СН,)—R С= О

I

Карбоксиметил-лизин Эритрониковая (КПГ) кислота

1) — N — Лизин

2) — S — Цистеин

3)

О

Гистидин

Амадори диион (поперечная сшивка)

Рис. 1. Окислительное гликирование белков глюкозой в открытой форме.

Инкубация обоих препаратов в присутствии 5 мМ глюкозы не приводит к увеличению содержания кетоамина. Однако при повышенной концентрации глюкозы (50 мМ) содержание кетоамина возрастает во времени (рис. 2).

Рис. 2. Содержание кетоамина в альбумине в зависимости от степени окисления SH-групп: 1,2 — оксиальбумин и меркаптоальбумин, инкубированные с 50 мМ глюкозой; 3, 4— оксиальбумин и меркаптоальбумин, инкубированные с 5 мМ глюкозой.

Обнаружили, что в оксиальбумине кетоамин образуется с большей интенсивностью, чем в меркаптоальбумине: в первом случае содержание кетоамина возрастает с 0,22 М/М до 1,05 M/M, а во втором - с 0,22 М/М до 0,47 М/М.

Содержание SH- и карбонильных групп на 1 молекулу белка после инкубации с глюкозой оставалось без изменений, что позволяет сделать вывод о том, что окислительной «мощи» глюкозы

при данных условиях недостаточно для изменения этих параметров.

2.1.2. Определение сайтов связывания глюкозы с остатками лизинов и аргининов в альбумине методом ВЭЖХ/МС.

Далее препараты оксиальбумина и меркаптоальбумина, инкубированные с глюкозой (50 мМ) 3 недели, подвергали гидролизу трипсином и определяли сайты связывания остатков лизинов и аргининов с остатком глюкозы. m7z полученных пептидов идентифицировали в системе Mascot, допуская в качестве возможных модификаций КПГ, представленные на рис. 3. Установили, что в молекуле оксиальбумина содержится 34 возможных сайта связывания остатков лизина с остатком глюкозы, а в меркаптоальбумине - 25. Это подтверждает выше изложенные результаты, согласно которым белок, антиоксидантный пул которого снижен из-за уменьшения количества SH-rpynn, гликозилируется в большей степени, чем белок с нормальным содержанием сульфгидрильных групп. В случае остатков аргининов существенного различия в количестве сайтов связывания не обнаружено (9 в меркаптоальбумине, 7 в оксиальбумине).

—1П=1ГГГ

у и ^ ОН ОН ОН NH он ОН

Фруктоз ил-лизин Фрухгозил-лизин (-2Д,0)

д М-162 0528 ДА Фруктозил-лизин (-1НО) ^

d М=144 0423 Да д М=126,0317 Да

I

НС-(£Лу,-N

J I

L

I н / I

НС-(С!1,)4-Ы-С—И ¡1С-(СИ ;>s-

I

NH

I

Пирралин ,vt. Карбокснэтил-лизин Л',-Карбоксиметил-лизин

д М=108,0211 Да ДМ=72,0211 Да д М=58,0055 Да

Lys (Arg)

(CHOH):CH,OH

1-Алкил-2-формил-3,4-гликозил-пиррол

ДМ = 270.0740 Да

-(СИ.),-

сн.

-(С'Н.),-

¡V,- (5-Гидро-5-метил-4-имидазолон-2-ил)орнитин N'- (5-Гидро-4-иЫидазолон-2-ия)орни™н ДМ=54.010вДа Д М=39,3949 Да

Рис 3. Конечные продукты гпикирования, модифицирующие остаток липши (А) и аргинина (Б) /IVa Ch/.

2.1.3. Флуоресценция альбумина и пентозидина

Для того, чтобы оценить изменение структуры альбумина при гликировании, изучали его специфическую флуоресценцию на разных стадиях гликирования. Поскольку реакция гликирования белков приводит к образованию КПГ, в образцах ЧСА определяли наличие одного из них -пентозидина. Спектры флуоресценции альбумина и пентозидина приведены на рис. 4.

Рис, 4. Спектры флуоресценции альбумина (А) и пентозидина (Б) в исходном ЧСА и а препаратах, инкубированных с глюкозой 3 недели: 0 - не инкубированный оксиальбумин; I, 2, 3 — меркаптоальбумин, инкубированный с глюкозой (О, 5 и 50 мМ соответственно); 4, 5, 6 - оксиальбумин, инкубированный с глюкозой (0, 5 и 50 мМ соответственно)

Интенсивность флуоресценции меркаптоальбумина, содержащего 0,2 - 0,4 М/М кетоамина, не менялась после 3-х недельной инкубации с глюкозой; следовательно, такое содержание кетоамина не оказывает влияния на структурную организацию белка. В наибольшей степени интенсивность флуоресценции снижалась в случае оксиальбумина, содержащего наибольшее количество кетоамина (выше 0,4 М/М). Вероятно, в этом случае снижение интенсивности флуоресценции вызвано существенным уменьшением суммарного положительного заряда на аминогруппе, что приводит к уменьшению содержания альфа-спиралей в белке и к увеличению полярности окружения триптофана.

Интенсивность флуоресценции пентозидина более всего возрастала в оксиальбумине, в котором содержание кетоамина составило 1 М/М белка. Это вполне логичный результат, согласно которому при увеличении содержания кетоамина увеличивается образование пентозидина. Следует учесть, что существенное увеличение содержания пентозидина отмечается только для окисленного препарата альбумина.

2.1.4. Анионообменная ВЭЖХ различных препаратов альбумина

В работе были изучены особенности разделения ЧСА с различной степенью окисления и гликирования с помощью анионообменной ВЭЖХ, чтобы апробировать этот метод для определения глико-окислительного состояния ЧСА, выделенного из сыворотки крови пациентов с диабетом. Разработанная нами методика отличалась типом колонки и составом подвижной фазы от

предложенной ранее Hayashi T.

Сначала анализировали ЧСА с различной степенью окисления сульфогрупп: меркаптоальбумин. оксиальбумин и супероксиальбумин. в которых содержание кетоамина было одинаковым и составило 0,2 М/М. Затем анализировали ЧСА с различной степенью гликирования, содержащим 1,5 М/М и 20 М/М кетоамина и одинаковое число SH-rpynn, равное 0,4 М/М. На хроматограмме всех препаратов присутствовали два основных пика (I и II) с временем удерживания 1-2 мин и 4-6 мин (рис. 5). Уменьшение содержания SH-групп и увеличение содержания кетоамина приводило к уменьшению площади пика I и увеличению площади пика II.

меркаптоальбумин SH-группы 0,7 М/М кетоамин 0,2 М/М

оксиальбумин SH-группы 0,4 М/М кетоамин 0,2 М/М

супероксиальбумин SH-группы 0,2 М/М кетоамин 0,2 М/М

b ц

\ \ к

и \

кетоамин 1,5 М/М SH-группы 0,4 М/М

iW

Д I V

кетоамин 20 М/М SH-группы 0,4 М/М

Рис 5. Анинообменная ВЭЖХ (флуоресцентная детекция) ЧСА с различной степенью окисления и гликирования. /. 11 - пики, отвечающие за «нормальную» и «изменённую» формы ЧСА.

Для исследуемых образцов ЧСА был рассчитан коэффициент отношения площадей пиков AI/A1I. Согласно данным, представленным на рис. 6, наибольший коэффициент имеет наименее окисленный и гликированный ЧСА, и наоборот, наименьшее значение коэффициента у ЧСА с большим количеством кетоамина. Исходя из этого, коэффициент отношения площадей пиков AI/AII можно рассматривать как параметр, отражающий глико-окислительное состояние альбумина.

Рис. 6. Отношение площадей пиков AI/AU, полученных при анионообменной ВЭЖХ.

ЧСА 1 - меркаптоальбумин (AI/AI¡=4,70); ЧСА 2 - оксиальбумип (AI/AI 1=3,00); ЧСА 3 -сунероксиольбумин (AI/AII=0,50); ЧСА 4 - ¿пикированный оксиальбумип (кетоамин 1,5 M/M; Al/Al1=0,65); ЧСА 5 - ¿пикированный оксиальбумип (кетоамин 20 M/M; AI/AII—0,06).

В перспективе этого направление может быть предложено для клинических исследований с целью оценки глико-окислительного состояния альбумина сыворотки крови, поэтому представляется интересным выяснить референсные значения коэффициента.

2.2. Гликированне ЧСА в нефизиологических условиях.

Для наглядной демонстрации изменения молекулярной массы ЧСА и содержания кетоамина в результате гликирования была проведена реакция взаимодействия белка (20 мг/мл) с глюкозой в нефизиологических концентрациях (1,6 М) в течение 1, 3 и 5 недель. После инкубации реакционную смесь анализировали методом электрофореза в агарозном геле и в ПААГ в денатурирующих условиях; в аликвотах реакционной смеси определяли кетоамин и т+/г белка. Изменение молекулярной массы и количества кетоамина продемонстрировано на рис. 7 А, из

А Б

72000 , 71000 470000 44 69000 44

68000 Ь

57000 -р 66000 -р

0 | 1нед I Знед 5нед

время инкубации с глюкозой

^■(ÛfflCM О <4 LO ОТ 00 ОТ О тОО Т- ^

h-

АЛЛА

122 133 133

Рис 7. А. т /г ЧСА, инкубированного с 1,6 М глюкозой (I) ив её отсутствие (3); кетоамин (2) в зависимости от времена инкубации. Б. Спектр образца ЧСА, инкубированного с 1,6 М глюкозой в течение 3-х недель.

которого видно, что m /z сильно гликированного препарата ЧСА увеличивается по сравнению с исходным образцом более, чем на 5000 М, а кетоамин возрастает до 55 молекул на молекулу белка, т.е. в реакции гликирования задействованы практически все остатки лизинов. Спектр образца, инкубированного с глюкозой 3 недели, снятый при большом разрешении (рис. 7 Б), показал присутствие нескольких близко расположенных масс-ионов, что означает, что образец содержит смесь различных продуктов реакции.

Анализ продуктов реакции методом электрофореза в ПААГ показал увеличение массы белка, инкубированного при высокой концентрации глюкозы по сравнению с исходным белком. В случае с электрофорезом в агарозном геле можно также отметить, что в сильно гликированном альбумине преобладают отрицательные заряды, поскольку при pH > 8.0 (pH электрофоретического буфера) этот альбумин быстрее приближается к катиону. Изменение заряда белка должно сказаться на его структурной организации. Данные по флуоресценции, приведённые выше, также указывают на изменение структурной организации белка вследствие гликирования.

3. Определение гликированного альбумина в сыворотке крови 3.1. Подбор методик для выделения альбумина из сыворотки

Следующей задачей данного исследования явилось определение кетоамина в ЧСА сыворотки крови с помощью ТНС, для чего было необходимо отработать методику выделения альбумина из сыворотки крови. Для этой цели мы апробировали несколько способов - с применением ПЭГ6000, с помощью раствора ТХУ в спирте и остановились на методе выделения альбумина из сыворотки крови с помощью аффинной хроматографии на голубом геле. Альбумин выделяли согласно методике Bio Rad с нашей модификацией. Элюированные фракции ЧСА диализовали, концентрировали с помощью ультрацентрифужных фильтров Amicon-Ultra 30 kDa (Merck Millipore, Германия) и анализировали методом электрофоретического разделения в агарозе (рис. 8).

яр

1 2 3 4 S

Рис S. Электрофореграмма фракций сыворотки, полученных после тюирования с аффи-голубого геля и концентрирования: 1 - сыворотка до нанесении на голубой аффи-гель; 2 - фракция, элюированная 0,2 М NaCI; -фракция, элюированная 0,4 М NaCI; 4 - фракция, элюированная 0,8 М NaCI; 5 - фракция, элюированная 1,5 М NaCI (содержит выделенный альбумин).

Хотя на всех стадиях элюирования происходят небольшие потери альбумина, мы сочли

возможным применить этот метод в дальнейшем, поскольку молярное количество определяемого кетоамина соотносится с молярным количеством альбумина.

3.2 Определение гликированного альбумина у детей с диабетом 1-го типа

Для выполнения поставленной задачи были сформированы группы детей в возрасте 9-12 лет: группа 1 - дети с манифестацией СД1 (13 человек); группа II - дети, болеющие СД1 более года (11 человек) и контрольная группа (6 человек). Кроме того, группа со стажем СД1 была разделена на две подгруппы - «компенсация» (среднее значение HbAlc 7,6%) и «декомпенсация» (среднее значение HbAlc 9.96%). Альбумин из сыворотки выделяли методом аффинной хроматографии на аффи-голубом геле. В альбумине определяли степень окисления (содержание тиоловых и карбонильных групп) и содержание кетоамина; для каждого образца проводили разделение альбумина на анион-обменной ВЭЖХ и рассчитывали коэффициент отношения площадей пиков окисленной и восстановленной форм A1/AII. Хроматограммы выделенного ЧСА имели тот же вид, что и коммерческого препарата, т.е характеризовались двумя пиками (I и II). Результаты средних значений коэффициента отношения площадей флуоресцентных пиков AI/AII представлены на рис. 9 А. Содержание кетоамина в молекуле белка (М/М) представлено на рис. 9 Б.

12.00 -10.00 -8.00 -

6.00 ......

4.00 -Щ

2.00 -Щ 0.00 Ш

С-40 0.35

< С.ЗЭ

и

S 0.25 <0.20

i 0.15 §

® 0.10 0.05 0.00

II

СД1 коькнсацпя СД1 д

Рис. 9. А. Коэффициент отношения площадей флуоресцентных пиков ЧСА (AI/AI/), выделенного из сыворотки крови детей (три группы). Б. Средние значения кетоамина в ЧСА (М/М) в различных группах детей с СД1.

Видно, что коэффициент отношения изменялся недостоверно, но имел тенденцию к увеличению от группы СД1 со стажем до контрольной группы. Следовательно, по сравнению с контрольной группой и группой детей с впервые выявленным диабетом у детей с продолжительным сроком заболевания СД1 альбумин сильнее подвержен окислению и гликированию. Корреляционный анализ между содержанием SH-групп и коэффициентом AI/AI1 показал положительную корреляцию г = 0,60.

Наименьшее содержание кетоамина наблюдалось в контрольной группе. Дети с впервые

выявленным диабетом, поступающие в отделение в самом тяжелом состоянии, имели самые высокие значения этого показателя. Значения кетоамина в ЧСА для детей с компенсацией диабета достоверно ниже, чем у детей в декомпенсированном состоянии, но выше, чем в контрольной группе. Корреляционный анализ между содержанием кетоамина и процентом НЬА1с показал положительную корреляцию г = 0,72, что говорит о том, что метод выполнен корректно и может использоваться в клинике.

4. Выявление дистальной полинейропатии у детей с диабетом 1-го типа

ДПН - наиболее распространенное осложнение диабета - характеризуется нарушением структуры и функции периферических нервов вследствие гипергликемии. Для выявления частоты встречаемости ДПН и корреляции с показателем углеводного обмена НЬА1с проводили ЭМГ-обследование детей с СДI различной продолжительности. Установили, что субклинические признаки ДПН встречаются с одинаково высокой частотой как у детей со сроком заболевания СД1 менее 1 года (в т.ч. впервые выявленные) (группа 1). так и у детей, болеющих более 1 года (группа 2) (рис. 10).

к

й зо

¡5 20 о

ГС 10

т

0------I—.........—I

группа 1 группа 2

Рис. Ю. Частота встречаемости дистальной полинейропатии в группах детей с СД1 в зависимости от срока заболевания.

При выявлении достоверности различий в частоте нарушений между группами выяснили, что в группе с ранними сроками заболевания СД1 частота нарушений показателей ЭМГ в малоберцовом и большеберцовом нервах достоверно выше, чем в группе с продолжительными сроками (р<0,05). Частота нарушений в других нервах от срока заболевания не зависела (рис. II). Снижение частоты поражений в малоберцовом и большеберцовом нервах при увеличении срока заболевания можно объяснить нормализацией углеводного обмена пациентов, которым была назначена инсулинотерапия.

I Группа "ДПН" I I Группа "ДПН" I!

Р5>( .100

1 —

П5игг|||3 прегспеиз п.ИЫаНзСмоторная п.тесйапиг п.тес||апи5

(сенсорная (моторная часть) часть) (сенсорная (моторная часть)

часть) часть)

Рис. //. Частота нарушении параметров ЭМГ а различных сенсорных и моторных нервах в группах детей с СД1 и ДПН. Указана достоверность различий в проценте нарушений между группами (р).

Корреляционный анализ показателей ЭМГ и HbAlc показал достоверную корреляцию только между HbAlc и амплитудой М-ответа большеберцового нерва и между HbAlc и СРВ по малоберцовому нерву (г = -0,71 и - 0,61 соответственно при р<0.05) и только в группе пациентов с ранним сроком заболевания. По остальным нейрофизиологическим параметрам корреляция с HbAlc отсутствовала. Учитывая необходимость своевременной диагностики ДПН для назначения (Соответствующей терапии и затруднения, которые могут возникнуть при процедуре ЭМГ мы поставили задачу поиска ранних маркеров выявления ДПН.

5. Определение аутоантител к: иейрональным белкам у детей с диабетом 1-го типа

Методом ИФА определяли аАТ к иейрональным белкам ФРН, ГФКБ, S100 и ОБМ в сыворотке крови детей с СД1. Нейрональные аАТ рассматриваются как ранние маркеры нарушения структуры нервных волокон. Обнаружили, что повышенный уровень аАТ встречается в 32% случаев у детей с диабетом до 1 года и в 38% с продолжительным сроком. В контрольной группе аАТ были повышены у 6% детей (рис. 12А.). Зависимости между наличием/отсутствием ДПН и уровнем нейро аАТ не выявлено (рис. 12Б).

Таким образом, структурные изменения периферических нервов, происходящие уже на стадии манифестации сахарного диабета, возможно, приводят к появлению AT к иейрональным белкам, которые могут служить маркерами ранней диагностики ДПН. Однако, в литературе мало данных о связи исследуемых нами антител и ДПН.

А

35 30 25 20

15

32f

■

группа I болеют группа И болеют контрольная < 1 года, 57 > 1 года 52 группа 31

человек человека человек

Рисунок 12. Нейрональные антитела в зависимости от срока СД1 (А); достоверность различий между группами по критерию Фишера: между группами 1 и 2 р>0.05, между группами 1 и 3, 2 и 3 р<П,05. Нейрональные антитело в зависимости от наличия или отсутствия ДПН (Б); достоверность различии между группами по критерию Фишера: р> 0.100

6. Определение нейрональных аутоантител у крыс с диабетом, вызванным стрептозотоцином

Рассматривая нейрональные аАТ как ранние диагностические маркеры для выявления структурных нарушений периферических нервов, необходимо оценить, как они появляются во времени. Для этой цели методом ИФА определяли динамику появления аАТ к нейрональным белкам ФРН, ГФКБ, S100 и ОБМ и к инсулину в сыворотке крови крыс с экспериментальным диабетом, вызванным СТЗ. На следующий день после введения СТЗ у животных опытной группы развилась гипергликемия (25-30 ммоль/л глюкозы), которая сохранялась на протяжении всего эксперимента (30 дней) (рис. 13 А). Уровень аАТ к инсулину (свидетелей распада р-клеток) достоверно увеличивался на 5-ый и 10-ый дни после введения СТЗ и сохранялся на таком уровне до 20-го дня эксперимента (р<0,05) (рис. 13 Б)

дни после введения СТЗ, сут.

Усл. ед 1.80

/ " " -¿1

—I ^^

л -¿2

срокпосле введения СТЗ, сут.

Рис. 13. Содержание глюкозы (А) и аАТ к инсулину (Б) в сыворотке крови крыс в опытной (1) и в контрольной (2) группах.

Уровень нейро аАТ (ко всем четырем белкам) в опытной группе достоверно возрастал на 5, 10, 17, 25 и 32 дни по сравнению с их уровнем в начальной пробе, а в контрольной группе оставался без изменений. При сравнении уровней аАТ в опытной и контрольной группах показали, что в

опытной группе достоверно увеличивается содержание антител к белкам ГФКБ и ФРН на 5-ый день после индуцирования диабета (рис. 14 А и Б). В содержании аАТ к белкам S100 и ОБМ в опытной группе не обнаружено достоверных изменений по сравнению с контрольной группой (рис. 14 В и Г).

Уел ед 1.6

Усл. ед

1

/ ^

■2

У т 1-"-"""

Ï i

А

срок после введения СТЗ. суг

1

: ¿я 2

г— s!/ -

-i'

в

■2

1

_-I

_______________ -----------

Г

срок поспе введения СТЗ, суг

[Рис. 14. Относительный уровень аАТ к ГФКБ (.4), ФРН (Б), ОБМ (В), БЮО (Г) в сыворотке крови крыс опытной (I) и контрольной (2) групп. Достоверность различий в уровне нейрональных аАТ между группами «диабет» и контрольной (по непараметрическому И-кратершо Манна-Уитпи):

- между уровнями аАТ к ГФКБ на 5-ый день после введения р= 0,004:- между уровнями аАТ к ФРН на 5-ый день после введения БТ2 р= 0,017;- остальные различия недостоверны.

Одновременное повышение аАТ к инсулину и к нейрональным белкам свидетельствует том, что два патогенетических процесса - гибель р-клеток и клеток нервной системы - идут одновременно и, следовательно, нейро аАТ можно рассматривать как маркеры развития ДПН.

V. Заключение

1. Было показано, что при инкубации альбумина в течение трёх недель в присутствии 5 мМ глюкозы, в отличие от 50 мМ, увеличения количества кетоамина не происходит. В оксиальбумине образуется большее количество кетоамина, чем в меркаптоальбумине. Снижение интенсивности флуоресценции альбумина (т.е. изменение его структуры вследствие гликирования) происходит при наличии в молекуле белка выше 0,4 молекул кетоамина на молекулу белка. Это значение превышает норму и характерно при хронической гипергликемии. При нормальном содержании кетоамина (0,2 -0,3 М/М) интенсивность флуоресценции альбумина не изменяется. Существеннее всего интенсивность флуоресценции снижается в оксиальбумине. Судя по тому, что наибольшая интенсивность флуоресценции пентозидина отмечена в оксиальбумине, содержащем 1 М/М

кетоамина, можно сделать вывод, что пентознднн образуется в течение 3-х недельной реакции оксиальбумина с глюкозой в повышенной концентрации.

Разработанный в нашей лаборатории метод анализа альбумина с помощью анион-обменной хроматографии позволил разделить альбумин на две фракции (пики I и II). Предложенный коэффициент отношения площадей этих пиков (AI/AII) можно рассматривать как параметр, отражающий окислительно-гликированный статус альбумина: чем меньше коэффициент, тем сильнее окислен или гликирован альбумин.

2. В результате анализа продуктов гидролиза трипсином образцов ЧСА, гликированных in vitro, с помощью ЖХ/МС и идентификации в системе Mascot обнаружили, что количество остатков лизинов, связанных с остатком глюкозы в меркаптоальбумине равно 24, а в оксиальбумине - 35, что подтверждает предположение о преимущественном гликировании белка, содержащего меньшее количество SH-rpynn.

3. Нами был модифицирован метод выделения альбумина из сыворотки крови с помощью аффи-голубого геля. Был рассчитан коэффициент отношения площадей пиков, полученных при анион-обменной ВЭЖХ (AI/AII) для 3-х групп детей: в контрольной группе он был наибольшим, в группе впервые выявленных детей с СД1 снижался и самым низким оказался в группе с продолжительным СД1 (стаж более года). В выделенном альбумине был определен кетоамин, количество которого приведено к количеству белка. Содержание кетоамина увеличивалось от группы к группе: контроль - компенсированный СД1 - декомпенсированный СД1 - впервые выявленный СД1. Корреляционный анализ между содержанием кетоамина и процентом HbAlc показал достоверную положительную корреляцию, что говорит о корректности выполненного метода и, следовательно, возможности использования его в клинической практике.

4. Проведённое в данной работе определение содержания гормона проинсулина (предшественника инсулина) показало, что у 5% детей с диагнозом СД1 отмечается повышенное содержание проинсулина. Это означает, что у этого контингента больных снижение содержания инсулина обусловлено не аутоиммунной деструкцией ß-клеток. Одной из причин этой ситуации может быть мутация в гене, кодирующем проинсулин, в результате чего аргинин в положении 65 заменяется гистидином, и расщепления проинсулина не происходит. Другой причиной может быть нарушение активности фермента, гидролизующего проинсулин - протеинконвертазы. Определение проинсулина в клинической практике позволит выявить случаи, отличные от аутоиммунного диабета, и, возможно, применить иную тактику лечения.

5. Было установлено, что субклинические признаки ДПН встречаются с высокой частотой (более 70 %) на самых ранних стадиях заболевания СД1, в том числе на стадиях нарушения толерантности к глюкозе и манифестации. С началом инсулинотерапии часть нейрофизиологических

показателей нормализуются (в моторных частях малоберцового и большеберцового нервов), однако, некоторые из них не зависят от степени компенсации углеводного обмена. Учитывая полученные результаты о развитии ДПН на самых ранних сроках заболевания СД1, следует своевременно назначать соответствующую терапию.

6. Было обнаружено, что повышенный уровень аутоантител к нейрональным белкам S100, ГФКБ, ФРН и ОБМ встречается с высокой частотой (более 30%) как у детей со сроком заболевания до 1 года (в т.ч. и впервые выявленные), так и у детей со стажем. Таким образом, структурные изменения периферических нервов происходят уже на стадии манифестации сахарного диабета и продолжаются с течением времени. Нейрональные аАТ не исчезают из кровотока в отличие от аАТ к компонентам ß-клеток и могут служить маркерами ранней диагностики ДПН.

7. На модели экспериментального диабета было показано одновременное повышение аАТ к нейрональным белкам и инсулину. Это свидетельствует том, что два патогенетических процесса -гибель ß-клеток и клеток нервной системы - идут одновременно и, следовательно, нейро аАТ можно рассматривать как маркеры развития ДПН.

VI. Выводы

1. Методами колориметрии и ЖХ/МС было показано, что человеческий сывороточный альбумин, в котором сульфгидрильные группы частично окислены, гликируется в большей степени, чем тот, в котором нормальное содержание SH-rpynn;

2. Был предложен параметр, характеризующий глико-окислительный статус человеческого сывороточного альбумина: коэффициент отношения площадей пиков, полученных при анион-обменной ВЭЖХ (AI/All), и показано, что этот параметр коррелирует с содержанием сульфгидрильных групп и кетоамина в ЧСА детей;

3. Было показано, что содержание кетоамина в ЧСА, выделенном из сыворотки крови детей с СД1 и из контрольной группы, положительно коррелирует с содержанием гликированного гемоглобина;

4. Определение проипсулина в клинической практике позволит выявить случаи, отличные от аутоиммунного диабета, и, возможно, применить иную тактику лечения;

5. Было установлено, что дистальная полинейропатия развивается одновременно с диабетом и не все нейрофизиологические показатели зависят углеводного обмена;

6. В сыворотке крови детей с СД1 был зафиксирован повышенный уровень аутоантител к нейрональным белками S100, ГФКБ, ОБМ и ФРН как при манифестации, так и при продолжительном СД1;

7. На модели экспериментального диабета (в сыворотке крови крыс) был зафиксирован подъём

аутоантител к нейрональным белкам S100, ГФКБ, ОБМ и ФРН одновременно с появлением аутоантител к инсулину.

VI. Список опубликованных научных работ по теме диссертации

1. Лотош Н.Ю., Селищева A.A., Надоров С.А., Бадыштов Б.А., Волков Н.Э., Савельев C.B. Уровень проинсулина в крови детей, больных сахарным диабетом 1 типа разной продолжительности // Биомедицинская химия. - 2013. - № 5. - С. 563-569; [The proinsulin level in blood of children with type 1 diabetes mellitus of various duration // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry July. - 2012. - V. 6 (3). - P. 288-291 ]

2. Лотош Н.Ю., Савельева E.K., Селищева A.A., Савельев C.B. Аутоантитела к нейроспецифичным белкам S100, GFAP, МВР и NGF в сыворотке крови крыс с диабетом, индуцированным введением стрептозотоцина // Бюллетень Экспериментальной биологии и медицины.-2013.-Т. 155,№ 1.-С.55-58

3. Лотош Н.Ю., Линева O.A., Волков И.Э., Муталова З.М., Савельев C.B., Селищева A.A. Дистальная полинейропатия у детей с сахарным диабетом 1-го типа // Журнал неврологии и психиатрии им.С.С.Корсакова. - 2012. - № 1. - С. 26-30

4. Лотош Н.Ю., Савел ьева Е.С., Селищева A.A., Савельев C.B. Аутоантитела к нейрональным белкам S100, GFAP, МВР, и NGF в сыворотке крови крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином // VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. - 2011. - С. 115

5. Лотош Н.Ю., Селищева A.A., Савельев C.B. Нейрональные аутоантитела у детей при сахарном диабете 1-го типа// Международная научно-практическая конференция «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли». - Казань, - 2010.-С. 19-20

6. Селищева A.A., Лотош Н.Ю., Прощина А.Е., Савельев C.B. Гетерогенность этиологии сахарного диабета 1-го типа у взрослых и детей // Международная научно-практическая конференция «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли».-2010. - Казань. - С. 90-91

7. Лотощ H. IO. Селищева А. А., Савельев С. В. Антитела к нейрональным белкам в крови детей, больных сахарным диабетом I типа // II Всероссийский конгресс «Инновационные технологии в эндокринологии». - Москва. - 2014. - С. 391

Лотош Наталья Юрьевна Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 21.04.2015 Заказ № 274 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86