Разработка аффинной тест-системы для количественного определения гликозилированного гемоглобина

Сулейманова, Марзия Хажиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка аффинной тест-системы для количественного определения гликозилированного гемоглобина
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка аффинной тест-системы для количественного определения гликозилированного гемоглобина"

На правах рукописи

¿4

СУЛЕЙМАНОВА МАРЗИЯ ХАЖИЕВНА

РАЗРАБОТКА АФФИННОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗИЛИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА

03.00.23 - биотехнология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа — 2006

Работа выполнена в Институте биологии и Институте органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель;

кандидат биологических наук, Басченко Игорь Анатольевич

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Зарудий Феликс Срульевич

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук, профессор Бахцкатов Сергей Александрович

доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович

Ведущая организация;

Центр «Биоинженерия» РАН, Москва

Защита состоится « 20 » декабря 2006 г. в 10:00 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002,136.01 при Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, 69.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, 69,

Автореферат разослан « 20 » ноября 2006 г.

Ученый секретарь

Регионального диссертационного совета, кандидат биологических наук

Р.В.Уразгильдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Аффинные сорбенты с

использованием иммобилизованной аминофенилбороновой кислоты (АФБК) позволяют выделять биополимеры, содержащие ^ис-диольные группы, например, нуклеозиды, гликопротеины, нуклеиновые кислоты, моносахариды, биологически"активные вещества [Остерман, 1985; Дин И др., 19S8]. Монослой производного АФБК на ферментном электроде применяют для определения глюкозы [Zayats and Katz, 2002], как сенсор моносахаридов [Lee et al., 2002], для ингибирования липазы [Raghavendra, 2002]. Сорбент с иммобилизованной ФБК используется при испытании различных лекарственных средств на активность растворимой и связанной с мембраной дофамин-|3-гидроксилазой [Markoglou, 2002], удалении кетоз из реакционной смесн, содержащей альдозы [Dukler и Freeman, 2001], стерическом блокировании адгезии клеток с биологическими тканями [Winblade et al„ 2002], при экстракции нуклеозидов из мочи [Kim et al., 2001].

Преимущества использования аффинных сорбентов очевидны, поэтому их применение ежегодно расширяется. Однако, несмотря на широкий выбор носителей, реагентов для иммобилизации, проблема поиска, разработки и исследования новых аффинных сорбентов является одной нз актуальных задач биотехнологии. В рамках национальной программы «Развитие биотехнологии в Российской Федерации на 2006 - 2015г.г.» один из проектов направлен на совершенствование лабораторной диагностики в стране.

В настоящее время сахарный диабет является глобальной медико-социальной проблемой. По данным ВОЗ, сахарным диабетом страдает 2 - 5 % населения всего мира, т.е. более 150 млн. человек. Заболеваемость и общее число больных во всех странах мира ежегодно увеличивается на 5 - 10 % [Аметов, 2005; Kordonouri and Danne, 1999; King et al., 1998; Keen and Pickup, 1999; Stratton et ai„ 2006]. После сердечно-сосудистых {51 %) и онкологических заболеваний (17 %) сахарный' диабет занимает третье место (6 %) по инвалндизации и смертности населения в мире. К числу наиболее тяжелых

последствий диабета относятся слепота, ампутация конечностей вследствие гангрены, поражение сердечно-сосудистой системы, почечная недостаточность, высокая перинатальная смертность и врожденные аномалии развития {Дедов и соавт., 2004; Балабол кин и соавт., 2006; Justin and МсСгшу, 2006).

Разработка методов ранней диагностики нарушений углеводного обмена сопряжена с поиском новых схринирукнцих биомаркеров, одним из которых является гллкозилированны й гемоглобин (HbAjc). Величина НЬАю представляет собой интегральный показатель уровня гликемии [Древаль, 2000; Дмитриев и соавт., 2005; Светликов и соавт., 2005] за период, определяемый временем полужизни эритроцита в кровотоке (90-120 дней), и не подвержен резким колебаниям в течение короткого промежутка времени, что характерно для уровня глюкозы в крови. В настоящее время интерес, к применению показателя НЬА!С для диагностики диабета возрос [Жестовский и соавт., 2005; Моисеев, 2005; Недосугова, 2005], однако широкое использование этого надежного параметра в клиниках сдерживается из-за сложности методов его определения. Анализ существующих методов определения HbAie показывает, что аффинные методы являются одними из наиболее перспективных и разрабатываемых областей биотехнологии.

Цель работы. Создание аффинной тест-системы на основе высокомолекулярных соединений с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой для многократного количественного определения гликозилированного гемоглобина.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Синтезировать сорбенты с использованием различных материалов в качестве матрицы (агарозы, макропористого стекла, полиакриламидного геля) с иммобилизованной л(-АФБК и оценить их эффективность.

2. Определить оптимальные параметры синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной jh-АФБК на основе полиакриламидного геля.

3. Исследовать влияние температуры па сорбционную активность аффинного сорбента.

4. Разработать методику многократкого количественного определения НЬА[с в крови человека аффинной тест системой.

5. Определить степень корреляции уровня гликози лирован ного гемоглобина с содержанием глюкозы в крови.

6. Испытать аффинную тест-систему по определению гликозилированного гемоглобина на образцах крови здоровых доноров, больных сахарным диабетом и онкологическими заболеваниями.

Научная новизна. Разработан новый метод иммобилизации -м-АФБК на полиакриламидном сорбенте путем активации матрицы гидразин-гидратом с последующей обработкой гдутаровым альдегидом. Синтезирован новый широкопористый аффинный сорбент с иммобилизованной Д1-АФБК, пригодный для многократного количественного определения НЬА|С, Разработана аффинная методика количественного определения НЬАю позволяющая выявлять ранние и латентные формы нарушении углеводного обмена у человека в микроколоночном исполнении.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод синтеза широкопористого полиакриламидного аффинного сорбента с иммобилизованной л-АФБК путем активации его гидразин-гидратом с последующей обработкой глутаровым альдегидом.

2. Определены условия получения аффинного сорбента с достаточным содержанием ли ганда для выделения гликозилированного гемоглобина.

3. Аффинный сорбент с иммобилизованной .м-АФБК на основе ПААГ пригоден для многократного количественного определения НЬАц; в крови человека.

4. Разработана методика многократного количественного определения НЪА[о

5. Тест-система на основе модифицированного ПААГ с иммобилизованной м-АФБК пригодна для проведения массовых скриникговых исследований и обладает следующими преимуществами: 1) высокой специфической емкостью; 2) достаточной механической прочностью, необходимой для микроколоночного варианта проведения анализов; 3) биологической инертностью; 4) воспроизводимостью результатов.

Практическая значимость. Аффинный сорбент С иммобилизованной м-АФБК на основе модифицированного ПЛАТ может быть использован для контроля эффективности лечения сахарного диабета, в скрининге ранних и латентных форм сахарного диабета. Разработанная нами аффинная тест* система в форме диагностического набора микроколонок с сорбентом и комплекта буферов можно использовать в любой клинической лаборатории. Аффинная тест-система не уступает зарубежным аналогам ("Diagnostics Glycated Hemoglobin [HbAj]", фирмы "Sigma", США), но в то же время экономически более выгодна ввиду того, что каждая микроколонка позволяет произвести определение HbAic многократно (7 циклов).

Внедрение в практик результатов исследований осуществлено в работу эндокринологического отделения Республиканской клинической больницы, поликлиник №№ 8,13,21 г. Уфы, Уфимского НИИ глазных болезней, клинико-диагностической лаборатории Республиканского онкологического диспансера.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II на и Ш съездах биохимического общества РАН (Пущино, 1997), на симпозиуме «Биохимия — медицине» (Санкт-Петербург, 2002), на Российском научном форуме «Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия» (Москва, 2002), 1-ой Всероссийской научной internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофункциональных систем» (Уфа, 2002), на конференциях биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы прикладной биохимии и биотехнологии» (Уфа, 1998), биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 1999), «Современные методы диагностики» (Барнаул, 1999), «И.П. Павлов и современные проблемы биологии и медицины» (Уфа, 1999), «Безопасность - 2000: проблемы прогнозирования, предотвращения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций» (Уфа, 2000), «Биология -наука 21-го века» {Пущнно, 2002), «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук» {Уфа, 2006).

Публика дни. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в т.ч. 2 статьи в рецензируемых журналах, 1 статья в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 24 таблицы, 18 рисунков, 6 схем. Состоит из введения, обзора литературы, материалов н методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 285 источника (137 отечественных и 148 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность проблемы исследований, сформулированы цели и задачи работы, показана научная новизна, теоретическая и практическая значимость проводимых исследований,

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Содержит анализ литературы по методам диагностики нарушений углеводного обмена, социально-экономической значимости проблемы. Основной акцент сделан на методах аффинной хроматографии. Приводится историческая справка по применению методов диагностики сахарного диабета. Уделено внимание биохимии неферментативного гликозилированпя протеинов, взаимосвязи диабета и рака. Изучение литературных источников показало, что, несмотря на широкий выбор реагентов для аффинной хроматографии, проблема поиска высокоэффективного аффинного сорбента для определения гликозилированного гемоглобина остается актуальной.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ При разработке АС для химической модификации матрицы сорбента использовали гранулирован кую агарозу ('Terak", Германия); реактивы фирмы "Reanal" (Венгрия): МПС-1500, «Акрилекс-350», акриламид, KN'-метилен-бисакриламид, персульфат аммония, Ы,Ы,К№-тетрамети лэти лендиам и н (ТЕМЕД), глутаровый альдегид; уиетол-аминофенилбороновая кислота ("Sigma", США), реактивы отечественного производства: эпнхлоргидрин (х.ч.), этиловый спирт (96 %-ный), натрии боргидрид (NaBHO, КОН, NaOH, соляная кислота концентрированная (х.ч). Буферные системы были приготовлены из

отечественных реактивов марки «х.ч». Для идентификации активных групп были использованы реактив Несслера, реактив Шиффа (фуксинсернистая кислота), при определении степени эамещенности в геле активных групп -2,4,6-тринтробензолсульфоиат натрия (ТНЕС) («х.ч.»).

При разработке аффинной тест-системы для количественного определения НЬА1е было проведено исследований по содержанию среднесуточной глюкозы в крови и определений HbAu у более 300 человек, включая здоровых доноров, пациентов Уфимского НИИ глазных болезней, Республиканского онкологического диспансера, Республиканской детской клинической больницы.

Физико-химические методы. Определение, pH растворов стеклянным электродом проводили на отечественном рН-метре «рН-3'40», измерение оптической плотности растворов осуществляли на спектроколориметрах "Spekol-11" фирмы Carl Zeiss Jena (Германия). Определение содержания эпоксифупп в активированной агарозе проводили по реакции между оксирановым кольцом и тиосульфатом натрия [Туркова, 1980]. Альдегидные группы в смывах сорбента контролировали цветными реакциями с реактивом Несслера и реактивом Шиффа.

Биохимические методы, Определение содержания в крови глюкозы проведено общепринятыми методами в условиях клинических контрольно-диагностических лабораторий. Аффинное определение гликоз(тированного гемоглобина проводили на гемолизатах крови здоровых доноров, больных СД, раком. Гемолизат готовили из капиллярной крови, взятой из пальца (0,2 мл).

Математические методы, Статистический анализ полученных данных проводили с использованием методов вариационной статистики пакета компьютерных программ "Statistica-5", "Excel 8,0". Достоверность различия определяли с помощью критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05 [Лакин, 1990].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проблема получения различных сорбентов для аффинной хроматографии тесно связана с разработкой носителей аффинных сорбентов. Для придания материалу матрицы необходимых для хроматографии свойств его модифицируют.

1. Получение аффинного сорбента ва основе модифицированной а га розы с иммобилизованной льАФБК

Агароза является линейным полисахаридом. Ее элементарным звеном служит дисахарид агаробиоза [Осгерман, 1985]. Агароза гидрофильный материал с крупными порами и весьма жесткой матрицей, что обеспечивает хорошую скорость потока. Синтез аффинного сорбента с дигидроксиборильными группами на основе агарозы, предназначенный для количественного определения НЬАю в крови, включает две стадии (схема. 1).

I. Активация агарозы эпихлоргидрином

0-СН2-СН-СН2 + НС1

|-ОН + О-СНз-СН—СИг рр^9'5» ✓ _

А О

агароза ЭХГ

активированная агароза

//. Иммобилизация лигаида на активированный агарозный гель:

„он

|-О-СНг-СН-СНз + [ОГ" -" |-0-СНг-СН-сН-МН +1/2Н^

активированная ын^ аффииный

агароза М.АФЕК СОрбеНТ

Схема. 1. Получение аффинного сорбента с иммобилизованной ;и-АФБК на

. основе агарозы.

Гранулированная агароза предварительно набухала в воде. К 10 см1 агарозного геля добавляли 20 мл раствора ИаОН (1 М) и 2 мл эпихлоргидркна. Активированный полимер прогревали на водяной бане при температуре 60°С

2 ч., затем сорбент промывали 50 мл 1 М карбонатного буфера (рН 9,5) и доводили 0,1 н. раствором хлористоводородной кислоты до значения рН 7,0.

К активированному агарозному гелю немедленно добавляли 10 мл раствора л<-АФБК (1%-ныЙ) и оставляли на связывание при температуре 4°С на 24 ч. Затем отмывали полученный сорбент карбонатным буфером (10 мл), выдерживали 2 ч при комнатной температуре и ставили на 48 ч. в холодильник. Сорбент в дальнейшем использовали для определения НЬАю

2. Синтез аффинного сорбента на основе пол какрцлам ндн ого геля

Выбор ПААГ в качестве материала матрицы для нового аффинного сорбента обусловлен его свойствами: стабильностью в диапазоне рН 1-10; ПААГ не содержат заряженных групп, и поэтому ионообменные взаимодействия с хроматографируемыми веществами' минимальны; биологически инертный и вследствие этого не подвержен микробной атаке. Синтез аффинного сорбента состоит из 4 стадий (схема 2).

Гидразидыые производные ПААГ (I) были получены воздействием б М раствора гидразингндрэта на ПААГ в течение 5-7 ч. при температуре 47°С {схема 2, а), затем их отмывали дистиллированной водой до отрицательной реакции в смывах на альдегиды н уравновешивали 0,2 М натрий-фосфатным буфером (рН 7,4). Последующая активация I 25 %-ным раствором глутарового альдегида в течение 24 ч. при температуре 37°С способствовало тому, что в мягких условиях (рН 7,4-7,6) между I и молекулой глутарового альдегида образуется двойная связь, активированная соседством альдегидной труппы (схема 2, б). Модифицированную матрицу, активированную глутаровым альдегидом, - (II), отмывали дистиллированной водой с последующим контролем смывов на отсутствие альдегидных групп. Затем II помещали в натрий-фосфатный буфер (рН 9,3).

Для иммобилизации лиганда на II (схема 2, в) предварительно готовили раствор: 820 мг л<-АФБК растворяли в 1 мл 96 %-ного этилового спирта, 35 мл 0.1 и. карбонатного буфера (рН 9,3) и 5 мл I н. ЫаОН. Отбирали 40 мл из приготовленной смеси растворов и смешивали с 40 мл II, после сосуд с сорбентом ставили на инкубацию в темное место при температуре 20°С на 17 ч.

гш3

Н^К-Гт^

47 С

ш.

ПЛАТ

Гндр азннгндр ат

ны-мнг н н

- Ч,С-(СН2>5-С?

™-К=С-(СН2)з-сч

глутаровый аиьдегнд

ШЬ

он

н н

он

Аэоьмшнаьь» ^ свлан ь

4°С

,он чон

борогидрид

НН-1Ш- С3.7 -(СН2)з -СН2-ИН + Н3ВО3+ШОН+ 2Н3|

.он

Аффинный еарбевт

"ОН

Схема 2. Стадии синтеза аффинного сорбента: А - получен«« гидроидного производного I (ЛАГ; Б - активация матрицы глугаровым альдегидом; В - иммобилизация ли ганда; Г - стабилизация азом«гиновы> связей в сорбенте.

Иммобилизацию лиганда завершали добавлением раствора борогидрида натрия (2 %) и выдержкой при температуре 4 СС в течение 2 ч для стабилизации азометиновых связей (схема 2, г). Сорбент готов.

3. Поиск оптимальных параметров синтеза и оценка эффективности аффинного сорбента на основе IIЛАГ Исследована зависимость соотношений между количеством связавшегося с матрицей лиганда - лг-АФБК, определенного методами элементного анализа (по бору) и ИК-спектроскопии, и значением рН буфера. Установлено, что оптимальным интервалом значений рН буферного раствора является рН 8,0-9,5 (рис.3).

«5

а. х

г е

-Г.-.Л *

в,о

(Я в,1 рНб^ци

Рис. 3. Зависимость соотношений количества связавшегося с матрицей лиганда (по бору) от значения рН буфера.

В процессе иммобилизации .м-АФБК иа активированном ПЛАТ была определена зависимость соотношений между концентрацией Л1-АФБК в исходном растворе и количеством связавшегося лиганда в 1 см3 сорбента при рН 9,0 (рис. 4), Установлено, что увеличение концентрации .м-АФБК больше 20 мг/мл в исходном растворе не приводит к росту количества иммобилизованного лиганда на 1 см3 сорбента.

Было установлено, что для количественного определения НЬА|С пригодны сорбенты с содержанием бора не менее 0,05 %. Ограниченное количество определений, которое может быть проведено на одной порции сорбента, вероятно, объясняется постепенным падением специфической емкости

в4

«г 1

в*

Рис. 4. Зависимость количества селившейся .к-АФБК от концентрации лигаша в исходном растворе при рН 9,0.

сорбента из-за отщепления бора по связи В—С. Это подтверждается данными элементного анализа: в сорбенте с исходным содержанием бора 0,09 % после 12 циклов использования содержание бора в нем падало до 0,01 %. Одновременно

Таблица 1

Воспроизводимость показателей НЬА1с на одной порции сорбента*

Ха НЪА|с,*/о Цикл Гемолизах

д/п (М±т) Р использования

сорбента

1 4,26 ±1,03 1 А

2 4,24 ± 0,65 0,01 4 (здоровый

3 4,22 ± 1,22 6 донор)

4 4,19 ±1,40 7

5 4,17 ±1,28 9

6 2,76 ±1,14 >0,05 11

7 12,54 ±0,17 1 Б

12,50 ±1,25 <0,01 3 (больной СД)

12,23 ±1,15 5

10 12,15 ±2,16

11 11,85 ±1,75 10

12 7,32 ±2,15 >0,05 12

*Исходное количество содержания бора в сорбенте 0,08 %. происходило снижение специфической емкости АС, определяемой по связыванию НЬА)С в условиях максимального насыщения сорбента. У »сличен не

количества циклов определения снижает емкость сорбента (исходное содержание бора от 0,05 до 0,12 %).

Исследования по воспроизводимости результатов определения НЪАц на одной колонке тест-системы показали, что при проведении более 10 циклов определения НЪА1( на одной микроколонке происходит занижение результатов определения (табл. 1), в связи с чем падает статистическая достоверность определения процента НЬА|С. При данных условиях нами был сделан выбор на отметке 7 циклов определения НЬАц, на одной колонке без ркска искажений результатов определения.

Таблица 2

Вариабельность показателя НЬА]С при определении на одной микроколонке аффинной тест-системы на основе ПААГ с иммобилизованной .м-АФБК

Геыолизат крови Цикл работы Содержание НЬА 1с % Статистическая обработка

Больной П, 1 2 3 4 5 6 7 19.4 19,8 19,6 19.5 18,8 18,5 18,2 х = 19,1 % 8 = 0,61 У-3,2%

Больной Р. 2 3 4 6 7 13.2 14,0 13,8 14.3 13,6 13,0 12,6 х-13,5% з - 0,60 V = 4,4 %

Больной С. 1 2 3 4 5 6 7 9,8 10,2 30.0 9,6 9,5 9,3 8.8 х - 9.6 % 5 = 0,47

Примечания: х - ср. арифметическое, 5 - стандартное, отклонение от генеральной совокупности, V - коэффициент вариации.

Наряду с изучением воспроизводимости результатов определения было

проведено исследование вариабельности показателя НЬА|С, полученного при

использовании одной колонки тест-системы на протяжении 7 циклов (табл. 2).

Результаты исследований показали, что использование сорбента на одной микроколонке эффективно на протяжении 7 циклов определения НЬА^, т.к. показатели определения НЬА|е в одних и тех же пробах различаются между собой с коэффициентом вариабельности не более 5 %, что говорит о хорошей стабильности сорбента.

Исследования по изучению максимальной емкости сорбента на основе ПААГ при изменении нагрузки гемоглобином позволили установить, что оптимальный объем гемолизата, наносимый на колонку, равен 0,2 мл (рис. 5).

Исследование амссстн сорбента по нкгружф кмонюбннвм

Рис. 5. Определение максимальной емкости сорбента по нагрузке гемоглобином. Рис. б. Зависимость емкости сорбента

по НЪА|е от рН буфера, В работе исследовалась зависимость соотношений емкости сорбента по нагрузке НЬАи от значения рН буфера (рис.б) на примере образцов гемолизата крови здорового человека, т.е. не страдающего нарушением углеводного обмена, и больных СД. Установлено, что максимальная сорбция НЬАк осуществляется в буфере при рН 8,5,

Исследования влияния температуры на сорбционную активность при нагрузке НЬА|С, показали, что аффинная тест-система на основе ПААГ работает стабильно в широком температурном диапазоне - от 18 до 28 °С (рис.7), в отличие от сорбента типа катионообменника.

Дямаика «а у*а>и* НЬАДе ар* «лредел*««« в

нкг«м*м «т 16* м 28ФС

ИВ9

16 20 22 24 25 28

■ |опа*п«л«нтНЬА1 с на аффинном сое6«нт* с I

■ опрчд«л«нтНЬА1 с на аффинном сор6«нт* с имдебипиэониной и -АФБК на«еноа* ПААГ

0 01)р«д*л«ни*НЬА1 с на сер6*нт* по типу кат ко кообменника

Рис,7, Влияние температуры на сорбиионную активность при нагрузке НЬА(( сорбента на основе ПААГ с иммобилизованной л(-АФБК и сорбента по типу хатнонообыенника.

4. Разработка методика многократного количественного определения НЬАц тест-системой на основе ПААГ с иммобилизованной -и-ЛФПК

1. Приготовление гемрлц?^. Эритроциты 200 мкл капиллярной крови троекратно отмывали физиологическим раствором на центрифуге в режиме 3000 g по 10 мин. Добавляли 800 мкл дистиллированной воды. Через 5 минут гемолизат центрифугировали (3000 g) 15 мин. для очистки от стромы эритроцитов. Над осадок отбирали в эппендорф.

2. ХроматограФическое выделение фракций гемоглобина и гликозилированного гемоглобина. На колонку, содержащую 2 мл АС, уравновешенного 0,025 М натрий-фосфатным буфером при рН 8,5 (буфер А), наносили 0,2 мл гемолизата. После вхождения гемолизата в слой сорбента ток буфера останавливали на 15 минут для аффинного связывания сорбента с НЬА|С. Затем на сорбеот подавали буфер А и собирали фракцию 1-емоглобина, не содержащую глюкозных остатков (фракция 1) в количестве 25 мл. На рис.8 представлен хромато графи чес кий профиль выделения НЪАк. Для выделения

фракции НЬЛ^ элюировали 25 мл буфера Б, в составе которого содержится конкурирующий с глюкозой сахар - сорбнтол.

3. Спектрофотометрнческая детекция проводилась в области максимума поглощения гемоглобина, т.е. при 414 им, благодаря чему присутствие других белков во фракциях не сказывалось на результатах.

оп. X

Рис. 8. Хроматограмма выделения гликозилированного гемоглобина ОП - оптическая плотность, V - обь4м, ПС - гемолнзат крови, А, Б - буферные растворы, 1 -фракция гемоглобина, не содержащая глкжозных остатков, 2 — фракция гликозилированного гемоглобина.

4. Расчет содержания гликозилированного гемоглобина в крови человека. Процент НЬА]С в пробе по отношению к общему содержанию гемоглобина определяли по формуле:

ОПдц(2)* У(2)

%НЬА1с = -

400,

On,H(l)*V(l) + 0n«,«(2)*V(2) где: ОП414(1) и ОП^н(2>-оптическая плотность фракций 1 и 2; V(1) и V(2) — объемы первой и второй фракций,

5. Регенерация колонки тест-системы проводится после каждого цикла определения НЬА|„ после 7 цикла колонка утилизируется.

5. Экспериментально-клинические исследования тест-системы для определения HbAtl. 5.1. Определение гл и кем и чес кого статуса пациентов поликлиники. В поликлинике УНЦ РАН исследовали по аффинной методике 100 человек во время прохождения ежегодных медицинских осмотров (табл. 3).

Из них 19 имеют диагноз «сахарный диабет». Причем, у б больных значение гликогемоглобина находилось в пределах нормы. Вероятно, это связано с компенсационной формой сахарного диабета. В то же время среди здорового контингента у 17 человек было обнаружено повышенное содержание НЬА|С, тогда как содержание глюкозы в крови находилось в пределах нормы, что расценивается как ранняя диагностика нарушений углеводного обмена. У 4 лиц обнаружено, что и показатель НЬА)С, и содержание глюкозы в крови выше нормы, что было выявлено впервые. Таким образом, определение НЬА^ с использованием разработанного нами сорбента позволяет провести массовые исследования населения для скрининга ранних нарушений углеводного обмена и контроля гликемии у больных СД для эффективной фармакотерапии.

Таблица 3

Определение уровня НЬА1С и содержания глюкозы в крови человека

Здоровый контингент Больные сахарным диабетом

Показатели гликемического статуса Количество обследованных Показатели гликемического статуса Количество обследованных

НЬА (%) 1С Глюкоза (мМ/л) п % I ■1ЪА,с Глюкоза (мМ/л) п %

51 62 В Ш11 0 0

9 11 Щ 6 32

17 22 §Д| 0 0

4 5 13 68

Всего обследованных 81 100 Всего обследованных 19 100

Примечание:

'норма - выше нормы.

Критерии нормы: НЬАю ^>,0 %; содержание глюкозы в крови 3,33-5,55 мМ/л. 5.2. Исследования гликемического статуса больных СД типа 1 Испытания сорбента по определению НЬА к были проведены на образцах

гемолизата крови больных СД типа 1 в стадии компенсации (п=10), больных СД с диабетической ангиоретинопатией и другой офтальмологической патологией (п320), в том числе в стадии декомпенсации (п=13), в стадии субкомпенсации (п=7), а также группы здоровых людей, т.е. без диагноза СД, (п=10). Для определения HbAjc использовали разработанную нами аффинную тест-систему, гна основе ПААГ с иммобилизованной .м-АФБК, а в качестве контроля применяли тест-систему фирмы "Sigma" (США) (табл. 4).

Таблица 4

Показатели уровня HbAie, полученные аффинной тест-системой на основе ПААГ, тест-системой фирмы "Sigma" (США), среднесуточной гликемии в крови больных СД в стадии декомпенсации, больных СД в стадии

компенсации и здоровых доноров

Число обсле ДО ван ных Среди есуто чный показатель гликемии, мМ/л HbAic.%

п/ п контингент обследования Тест-система на основе ПААГ Тест-система на основе агарозы Тест-система 'SIGMA* (США)

1 СД + ДАРП, стадия декомпенсации 13 16,7 ±2,5" 17,50 ± 1,73* 17,80 ± 1,35* 17,20 ± 1,27*

2 СД + ДАРП, стадия су бком пенсации 7 9,0 ±1,2 12,30±1,10 13,40 ± 1,50 12,75 ± 1,60

3 СД, стадия компенсации 10 7,2 ±1,7" 10,65 ± 1,25" 10,15 ± 1,45" 10,28 ± 0,40"

4 Контрольная группа 10 4,5 ±1,2 4,50 ±1,36 4,00 ± 1,20 4,72 ± 0,59

Примечания:

отличие от группы больных СД в стадии компенсации (Р <0,01); " отличие от группы контроля (Р <0,01).

Исследована связь уровня гипергликемии со степенью выраженности и

профессированием сосудистых поражений органов зрения у пациентов с

диагнозом «сахарный диабет» в стадии декомпенсации. Найдена

положительная корреляция уровня НЬА|С с содержанием глюкозы в крови: г=+0,96; р<0,001.

53. Исследование глнкемического статуса у пациентов онкологического диспансера Было исследовано 133 образца гемолизатов крови онкободьных с различной нозологией, локализацией и стадией заболевания (Табл. 5). Причем у 10 (7,5 %) пациентов имелось сопутствующее заболевание СД типа I в стадии декомпенсации. Всего среди онкобольных имели повышенный уровень НЬА|с 143 %• Отмечено, что у 30,1 % пациентов показатель НЬА]с находится ниже физиологической нормы, в основном,' они являются бальными с поражением органов кроветворной системы. Показано, что лишь у 55,6 % обследованных пациентов уровень НЬАю находится в пределах физиологической нормы.

Таким образом, при определении уровня НЬАю обнаружено, что весьма существенный контингент (44,4 %) онкобольных имеют нарушение углеводного обмена. Обнаружение уровня НЬА(с ниже физиологической нормы у части населения может быть рассмотрено как один из сигналов к более глубокому обследованию этих лиц для предупреждения онкозаболеваний.

Таблица 5

Общая картина глнкемического статуса онкобольных (я=133)

№ группы Гликемичесхий статус Число обследованных Локализация онкологической патологии

Уровень НЬАЦ:. % Глюкоза, мМ/л и %

1 Выше нормы 6,1-10,0 5,6-10,8 19 14,3 Рак молочной железы, гинекология

2 В пределах нормы 4,0-6,0 3,3-5,5 '74 55,6 Рак печени, органов желудочно-кишечного тракта

3 Ниже нормы 2,5-3,9 3,0-3,2 40 30,1 ' Рак почек, кожи, органов кроветворения

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Конструирование и использование сорбционных систем на основе полимерных гидрогелей, способных обратимо реагировать на незначительные изменения внешней среды представляет большой теоретический и практический интерес. Аффинный сорбент, полученный на основе МПС, ввиду высокой неспецифической сорбции, нами был отклонен от клинических испытаний. 'Аффинный сорбент на основе активированной эдихлоргидрином агарозы может использоваться для определения НЬА]0. Однако легкая сжимаемость, приводящая к уменьшению объема сорбента, вызванная особенностью вторичной структуры агарозы, характеризующейся наличием линейных полисахаршшых цепей без ковалентнок поперечной сшивки, приводит к существенным и необратимым изменениям структуры, что препятствует к созданию сорбента для многократного количественного определения НЬА|С Аффинная тест-система на основе модифицированного ПААГ пригодна для многократного количественного определения НЬА]С. Простота синтеза, доступность реагентов позволяют использовать аффинную тест-систему на основе модифицированного ПААГ с иммобилизованной м-АФБК для проведения массовых исследований для скрининга заболеваний, вызванных нарушением углеводного обмена, например, как сахарный диабет.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной л(-АФБК на основе широкопористого ПААГ путем активации его гидразин-гидратом с последующей обработкой глутаровым альдегидом для количественного определения НЬАю

Показано, что новый аффинный сорбент на основе модифицированного ПААГ обладает большей эффективностью, чем сорбент с иммобилизованной м-АФБК на основе агарозы, следующими преимуществами: 1) высокой специфической емкостью; 2) стабильностью объема вследствие механической прочности структуры полимера; 3) биологической инертностью;

4) простотой синтеза, 5) воспроизводимостью результатов.

2. Оптимальными параметрами синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной лг-АФБК на основе ПААГ с достаточным содержанием ли ганда для выделения глнкозилированного гемоглобина являются:

- концентрация Л1-АФБК в исходном растворе при иммобилизации составляет 20 мг/мл на 1 см1 модифицированного ПААГ;

- диапазон буфера при иммобилизации лиганда составляет рН 8 -9,5.

3. Разработана методика многократного количественного анализа НЬА,с-Показано, что на одной микроколонке можно произнести до 7 циклов определения НЬА1С при содержании бора в сорбенте не менее 0,05 %.

4. Аффинная тест-система для количественного определения HbAic, на основе модифицированного ПААГ работает в широком • температурном диапазоне - от 18 до 28 °С.

5. Показано, что уровень НЬАю коррелирует с содержанием глюкозы в крови (г=0,96; р<0,001).

6. Анализ результатов клинико-экспериментальных исследований гликемического статуса у здоровых (контроль), больных сахарным диабетом и онкологической патолошеЙ показал:

1), В группе контроля (здоровые по СД) у 5 % (и=4) впервые выявлен повышенный показатель как уровня HbAic, так и содержания глюкозы в крови;

2). В группе больных СД установлена связь уровня НЬАю со степенью выраженности и прогрессированием сосудистых поражений органов зрения.

3). Среди онкобольных (w=133) выявлено нарушение углеводного обмена •у 44,4 % (и=59) пациентов: уровкь НЬАщ ниже физиологической нормы

зафиксирован у 30,1 % (гс=40); повышенный показатель уровня НЬА,с-у 14,3 % (яг=19); в пределах нормы - лишь у 55,6 % (п=74).

7. Аффинная тест-система для количественного определения НЬА,с, обладает следующими преимуществами перед тест-системой фирмы "Sigma" (США): высокая воспроизводимость результатов (р< 0,01), большая кратность использования колонки (7 циклов), коэффициент вариабельности не превышает 5 %. _

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Басчевко ИЛ., Гарнпова М.И., Сулейманова MX, Монаков Ю.Б., Зарудий Ф.С., Даалетов Э.Г. Разработка аффинного метола определения ппикознлиро ванного гемоглобина в крови человека, //Здравоохранение Башкортостана, № б, 1997. - С. 54-56,

2. Басченко И.А., Сулейманова М.Х., Зарудий Ф.С, Монаков Ю.Б., Сафарова В.Г, Аффинный метод определееия гликозшшрованного гемоглобина в крови человека на полиакриламидаом сорбенте с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой У/Мат. стендовых сообщений 2 съезда биохимического общества РАН, Пушило, 1997, ч,2. -С.403.

3. Сулейманова М.Х., Басчснко И.А., Зарудий Ф.С., Давлетов Э.Г,, Монаков Ю.Б. Изучение свойств сорбента с иммобилизованной м-амннофенилбороновой кислотой, предназначенного для определения гликозшшрованного гемоглобина в крови человека //Материалы Конференции биохимиков Урала, Поволжья п Западной Сибири «Актуальные проблемы прикладной биохимии и биотехнологии». - Уфа,1998. - С. 240-242.

4. Басченко НА., Сулейманова М.Х., Вавилова О.В., Даутова З.А. Определение гликогемоглобкна аффинным методом у больных инсулиизависимым сахарным диабетом и с офтальмологической патологией //Материалы конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири, посвященной 70-летию со дня рождения РЛ. Лифщица «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии». Челябинск, 1999. С. 10-12.

5. Бас**енко И.А., Сулейманова М.Х., Зарудий Ф.С, Сравнительный анализ аффинного и колориметрического методов определения гликотлировапного гемоглобина в крови человека //Сб. по материалам Всероссийской научно-практической конференция «Современные методы диагностики». Барнаул, 1999.-С. 195-196.

6. Басчспко H.A., Сулейманова М.Х., Сафарова В.Г., Монаков Ю.Б. Аффинный метод определения гликозилироаанного гемоглобина //Республиканская научная конференция «И.П. Павлов и современные проблемы биологии и медицины». Уфа, 1999. - С. 59,

7. Сулейманова М.Х, Басченко И „А., Монаков Ю.Б., Зарудий Ф.С., Сафарова В.Г., Зайдуллин И.С. Аффинный метод определения гликозилнрованного гемоглобина в системе мер по защите населения от чрезвычайных ситуаций и их последствий. //Материалы Всероссийской научно-технической конференции «Безопасность — 2000. Проблемы прогнозирования, предотвращения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций». Уфа, 2000.-С. 44-46.

8. Басчснко К.И., Сулейманова М.Х. Аффинный метод определения Г1шкозияиров1шного гемоглобина в крови человека. - В сборнике тезисов по материалам 6-ой Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - паука 21-го века». Пушино, 2002. - С. 50.

9. Сулейманова М.Х., Басченко И.А. Определение гликозшшровзиного гемоглобина аффинным методом - Б сборнике тезисов докладов по материалам симпозиума «Биохимия -медицине» на 3 съезде биохимического общества. Санкт-Петербург, 2002, с. 137-138.

10. Сафаргалеева Р.З., Сафарова В.Г., Сулейманова М.Х. Аффинный и колориметрический методы определения гликогемоглобина. - В сборнике докладов Межвузовской научной студенческой конференции УГНТУ. Уфа, 2002, с. 10-12.

11. Сулеймакова М.Х., Басченко И.А., Ганцев Ш.Х. Определение содержания гликозшдарованного гемоглобина в крови онкобольиых, //В сб. тезисов до материалам Российского научного форума «Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия». Москва, 2002, с. 177.

12. Сафаргалеева Р.З., Сафарова ВТ., Сулейманова М.Х., Басченко И А- Разработка методов определения гликозилнрованного гемоглобина б крови человека. - Материалы 1-ой Всероссийской научной tNTERNET-конференщш «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем». Секция «Био и органическая химия, биотехнология». Уфа, 2002. http://www.conf/rusoil.|\et/pubi¡ka-гщЬцпЗй 15.

13. Сулейманова М.Х., Басченко И.А., Сафарова В.Г., Хасанова Э.Р, Случае пониженного содержания гликозилироващюго гемоглобина в крови онкобольных. — Там же, №17.

14. Сулейманова М.Х., Басченко И.А., Давыдович М.Г., Зайдуллин И.О. Скрининг гликемического статуса больных сахарным диабетом, отш-отенных офтальмологической патологией, метолом количествен ного определения гпикозилированного гемоглобина на аффинном сорбенте. - Сборник материалов Межвузовской научно-технической конференция «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных нар», УПГГУ, Уфа, 2006, с. 367-369.

15. Сулейманова MJC., Басчспко И.А., Давидович М.Г., Сафарова В.Г. Применение аффинного сорбента на основе агарозы с иммобилизованной м-аминофеня лбороновой кислотой для скрининга ранних и скрытых форм нарушений углеводного обмена. - Там же, с. 366-367.

16. Сулейманова М.Х., Басченко И.А., Зарудай Ф.С., Монахов Ю.Б. Новый аффинный сорбент для определения гликозилированного гемоглобина в ранней диагностике нарушений углеводного обмена. //Химико-фармааевтичсский журнал. - 2006, т. 40, № 7, с, 41-44.

17. Сулейманова М.Х., Басченко И.А., Монаков Ю.Б. Влияние температуры на сорбциоккую активность аффинного сорбента с иммобилизованной м-аминофеннлбороновой кислотой //Башкирский химический журнал. 200б> т. 13, № 4, с. 22-25,

Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт +», заказ №86, тираж 100 шт, 450054, лр. Октября, 71

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сулейманова, Марзия Хажиевна

Перечень сокращений.

Введение.

ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ

Глава 1. Роль неферментативного гликозилирования протеинов в патогенезе сахарного диабета.

1.1 .Распространенность и социальная значимость сахарного диабета.

1.2. Сосудистые осложнения и диагностические критерии сахарного диабета.

1.3. Гликозилированный гемоглобин, его структура.

1.4. Биохимия неферментативного гликозилирования протеинов.

1.5. Роль гликозилированных протеинов в патогенезе сахарного диабета.

1.6. Взаимосвязь между нарушениями углеводного обмена и онкологическими заболеваниями.

1.7. Диагностическое значение определения уровня Hb Aic.

1.8. Методы ранней диагностики нарушений углеводного обмена.

1.9. Сравнительный анализ методов определения уровня Hb AiC.

Глава 2. Аффинный метод выделения биополимеров.

2.1. Принцип аффинной хроматографии.

2.2. Компоненты аффинного сорбента.

2.3. Материалы, применяемые в качестве матрицы аффинного сорбента.

2.3.1. Агароза.

2.3.2. Поливиниловый спирт.

2.3.3. Макропористое стекло.

2.3.4. Полиакриламидный гель.

2.4. Активация матрицы аффинного сорбента.

2.5. Спейсеры.

2.6. Лиганды.

2.7. Аффинная модификация биополимеров.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Материалы и методы исследования.

3.1. Реагенты для синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной м-АФБК.

3.2. Реагенты для проведения цветных реакций.

3.3. Реагенты для приготовления буферных растворов.

3.4. Объекты исследования на аффинных сорбентах.

3.5.Приборы, необходимые для работы.

3.6. Определение рН растворов стеклянным электродом.

3.7. Определение оптической плотности растворов.

3.8. Определение альдегидных групп реактивом Шиффа.

3.9. Определение альдегидных групп реактивом Несслера.

3.10. Цветная реакция с ТНБС натрия.

3.11. Определение оксирановых групп тиосульфатом натрия.

3.12. Определение карбоксильных, гидразидных и аминных групп кислотно-основным титрованием.

3.13. Статистическая обработка результатов.

РЕЗ УЛЬТА ТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Создание аффинных сорбентов с иммобилизованной .м-АФБК для количественного определения гликозилированного гемоглобина.

4.1. Аффинный сорбент с иммобилизованной ти-АФБК на основе гранулированной агарозы.

4.1.1. Приготовление матрицы аффинного сорбента эпоксиактивацией гранулированной агарозы.

4.1.2. Иммобилизация .м-АФБК на модифицированную агарозную матрицу сорбента.

4.2. Аффинный сорбент с иммобилизованной ,/и-АФБК на основе модифицированного ПААГ.

4.2.1. Синтез широкопористого ПААГ в качестве матрицы аффинного сорбента.

4.2.2. Модифицирование ПААГ гидразингидратом.

4.2.3. Активация глутаровым альдегидом гидразидного производного полиакриламидного геля.

4.2.4. Иммобилизация ти-АФБК на модифицированный ПААГ.

4.2.5. Стабилизация азометиновых связей в аффинном сорбенте с иммобилизованной м-АФБК.

4.3. Аффинное выделение гликогемоглобина.

4.4. Хроматограмма выделения гликозилированного гемоглобина.

4.5. Формула расчета содержания НЬА]С.

4.6. Механизм аффинного взаимодействия сорбентов с иммобилизованной лг-АФБК с гликозилированным гемоглобином

4.7. Исследование количественной характеристики параметров синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной лг-АФБК на основе модифицированного ПААГ.

4.7.1. Исследование влияния бис-метиленакриламида на свойства полиакриламидного геля.

4.7.2. Исследование зависимости изменения емкости сорбента от содержания бора в лиганде.

4.7.3. Исследование зависимости соотношений между количеством связавшегося лиганда и концентрацией исходного раствора.

4.7.4. Определение рН-оптимума буферной системы при иммобилизации м-АФБК.

4.8. Исследование влияния температуры на сорбционную активность аффинного сорбента на основе ПААГ.

4.9. Исследование изменения емкости сорбента от объема нагрузки

4.10. Исследование емкости сорбента при нагрузке гликогемоглобином от изменения рН буфера.

4.11. Воспроизводимость результатов определения НЬА]С при многократном использовании одной колонки с аффинным сорбентом на основе ПААГ с иммобилизованной м-АФБК.

4.12. Вариабельность показателей определения HbAic, многократно проведенных на одной колонке с аффинным сорбентом на основе ПААГ.

4.13. Исследование воспроизводимости результатов определения HbAic, полученных при многократном использовании одной колонки с аффинным сорбентом на основе агарозы.

4.14. Оценка эффективности применения аффинного сорбента на основе макропористого стекла.

Глава 5. Разработка методики количественного определения гликозилированного гемоглобина аффинной тест-системой.

5.1. Техника безопасности при проведении работ по определению гликозилированного гемоглобина.

5.2. Технология приготовления гемолизата крови.

5.3. Изготовление миниколонок с аффинным сорбентом.

5.4. Приготовление буферных растворов.

5.5. Проведение анализа определения содержания НЬА|С

5.6. Регистрация и оценка результатов определения НЬА]С.

5.7. Регенерация и условия хранения миниколонок с аффинным сорбентом для количественного определения НЬА,С.

Глава 6. Экспериментально-клинические испытания тест-системы для количественного определения HbAic.

6.1. Определение гликемического статуса пациентов поликлиники УНЦ РАН.

6.2. Определение НЬА]С у больных сахарным диабетом, отягощенных офтальмологической патологией.

6.2.1. Определение HbAic аффинной тест-системой на основе ПААГ с иммобилизованной лг-АФБК.

6.2.2. Определение HbA]c аффинной тест-системой на основе модифицированной агарозы с иммобилизованной jw-АФБК.

6.3. Определение НЬА,С аффинной тест-системой на основе ПААГ у пациентов эндокринологического отделения РДКБ.

6.4. Сравнительная характеристика диагностикумов, использованных для определении HbAic.

6.5. Исследования гликемического статуса онкобольных методом аффинной хроматографии.

Глава 7. Разработка периодатного метода определения гликозилированного гемоглобина.

7.1. Определение НЬА)с методом периодатного окисления с последующей детекцией альдегидных групп реактивом Несслера.

7.2. Определение НЬА1с методом периодатного окисления с последующей рН-метрической детекцией.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка аффинной тест-системы для количественного определения гликозилированного гемоглобина"

Актуальность исследований. Аффинные сорбенты с использованием иммобилизованной аминофенилбороновой кислоты (АФБК) позволяют выделять биополимеры, содержащие г/мс-диольные группы, например, нуклеозиды, гликопротеины, нуклеиновые кислоты, моносахариды, биологически активные вещества [1-3]. Монослой производного АФБК на ферментном электроде применяют для определения глюкозы [4], как сенсор моносахаридов [5], для ингибирования липазы [6]. Сорбент с иммобилизованной ФБК используется при испытании различных лекарственных средств на активность растворимой и связанной с мембраной дофамин-[3-гидроксилазой [7], удалении кетоз из реакционной смеси, содержащей альдозы [8], стерическом блокировании адгезии клеток с биологическими тканями [9], при экстракции нуклеозидов из мочи [10].

Преимущества использования аффинных сорбентов очевидны, поэтому их применение ежегодно расширяется. Однако, несмотря на широкий выбор носителей и реагентов для иммобилизации, проблема поиска, разработки и исследования новых аффинных сорбентов является одной из актуальных задач биотехнологии. В рамках национальной программы «Развитие биотехнологии в Российской Федерации на 2006-2015 г.г.» [11] один из проектов направлен на совершенствование лабораторной диагностики.

В настоящее время сахарный диабет является глобальной медико-социальной проблемой. По данным ВОЗ, сахарным диабетом страдает 2-5 % населения всего мира, т.е. более 150 млн. человек. Заболеваемость и общее число больных во всех странах мира ежегодно увеличивается на 5-10 %. После сердечно-сосудистых (51 %) и онкологических заболеваний (17 %) сахарный диабет занимает третье место (6 %) по инвалидизации и смертности населения в мире [12-16].

Разработка методов ранней диагностики нарушений углеводного обмена включает и поиск новых скринирующих биомаркеров, одним из которых является гликозилированный гемоглобин (НЬА]С). Величина HbAic представляет собой интегральный показатель уровня гликемии за период, определяемый временем полужизни эритроцита в кровотоке (90-120 дней), который не подвержен резким колебаниям в течение короткого промежутка времени, что характерно для уровня глюкозы в крови [17-19]. В настоящее время интерес к применению показателя НЬА,С для диагностики диабета возрос [20-25], но широкое использование этого надежного параметра в клиниках сдерживается из-за сложности методов его определения, дороговизны оборудования и импортных химических реактивов. Анализ существующих методов определения НЬАю показывает, что аффинные методы являются одними из наиболее перспективных и разрабатываемых областей биотехнологии.

Цель работы заключалась в создании аффинной тест-системы на основе высокомолекулярных соединений с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой для многократного количественного определения гликозилированного гемоглобина. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1). Синтезировать сорбенты с использованием различных материалов в качестве матрицы (агарозы, стекла, полиакриламидного геля), с иммобилизованной ти-АФБК и оценить их эффективность.

2). Определить оптимальные параметры синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной лг-АФБК на основе модифицированного полиакриламидного геля.

3). Исследовать влияние температуры на сорбционную активность аффинного сорбента.

4). Разработать методику многократного количественного определения НЬАю в крови человека аффинной тест-системой.

5). Определить степень корреляции уровня гликозилированного гемоглобина с содержанием глюкозы в крови.

6). Испытать аффинную тест-систему по определению гликозилированного гемоглобина на образцах крови здоровых доноров, больных сахарным диабетом и с онкологическими заболеваниями. Научная новизна. Разработан новый метод иммобилизации м-АФБК на полиакриламидном сорбенте путем активации матрицы гидразин-гидратом с последующей обработкой глутаровым альдегидом. Синтезирован новый широкопористый аффинный сорбент с иммобилизованной Л/-АФБК, пригодный для многократного количественного определения HbAio Разработана аффинная методика количественного определения HbAiC в микроколоночном исполнении, позволяющая выявлять ранние и латентные формы нарушений углеводного обмена у человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод синтеза широкопористого полиакриламидного аффинного сорбента с иммобилизованной ти-АФБК путем активации его гидразин-гидратом с последующей обработкой глутаровым альдегидом.

2. Определены условия получения аффинного сорбента с достаточным содержанием лиганда для выделения гликозилированного гемоглобина.

3. Аффинный сорбент с иммобилизованной ж-АФБК на основе ПААГ пригоден для многократного количественного определения НЬА ю

4. Разработана методика многократного количественного определения НЬА1С.

5. Тест-система на основе модифицированного ПААГ с иммобилизованной Л/-АФБК пригодна для проведения массовых скрининговых исследований и обладает следующими преимуществами: 1) высокой специфической емкостью; 2) достаточной механической прочностью, необходимой для микроколоночного варианта проведения анализов; 3) биологической инертностью; 4) воспроизводимостью результатов.

Практическая значимость. Аффинный сорбент с иммобилизованной >/-АФБК на основе модифицированного ПААГ может быть использован для контроля эффективности лечения сахарного диабета, в скрининге ранних и латентных форм сахарного диабета. Разработанную нами аффинную тест-систему в форме набора миниколонок с сорбентом и комплекта буферов можно использовать в любой клинической лаборатории. Аффинная тест-система не уступает зарубежным аналогам ("Diagnostics Glycated Hemoglobin [HbAi]", фирмы "Sigma", США), но в то же время экономически более выгодна ввиду того, что каждая микроколонка позволяет произвести определение HbAiC многократно (7 циклов).

Внедрение в практику результатов исследований осуществлено в Республиканской клинической больнице, поликлинике УНЦ РАН, Уфимском НИИ глазных болезней, Республиканском онкологическом диспансере.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II на и III съездах биохимического общества РАН (Пущино, 1997), на симпозиуме «Биохимия - медицине» (Санкт-Петербург, 2002), 1-ой Всероссийской научной internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофункциональных систем» (Уфа, 2002), на конференциях биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы прикладной биохимии и биотехнологии» (Уфа, 1998), биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 1999), «Современные методы диагностики» (Барнаул, 1999), «И.П. Павлов и современные проблемы биологии и медицины» (Уфа, 1999), «Безопасность - 2000: проблемы прогнозирования, предотвращения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций» (Уфа, 2000), «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002), «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук» (Уфа, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в т.ч. 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 24 таблицы, 18 рисунков, 6 схем. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 285 источника (137 отечественных и 148 зарубежных), приложений на 3 листах.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Сулейманова, Марзия Хажиевна

выводы

1. Разработан метод синтеза аффинного сорбента на основе активированного широкопористого ПААГ путем его активации гидразин-гидратом с последующей обработкой глутаровым альдегидом для количественного определения HbAic

Показано, что новый аффинный сорбент с иммобилизованной .м-АФБК на основе модифицированного ПААГ обладает большей эффективностью, чем сорбент на матрице из агарозы, следующими преимуществами: 1) высокой специфической емкостью; 2) стабильностью объема вследствие механической прочности структуры полимера; 3) биологической инертностью; 4) простотой синтеза; 5) воспроизводимостью результатов.

2. Оптимальными параметрами синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной ж-АФБК на основе ПААГ с достаточным содержанием лиганда для выделения гликозилированного гемоглобина являются:

- концентрация ти-АФБК в исходном растворе при иммобилизации 7 составляет 20 мг/мл на 1 см модифицированного ПААГ;

- диапазон буфера при иммобилизации лиганда составляет рН 8,0 - 9,5.

3. Разработана методика многократного количественного анализа HbAic- Показано, что на одной микроколонке можно провести 7 циклов определения HbA]C при содержании бора не менее 0,05 %.

4. Аффинная тест-система для количественного определения НЬА|С работает в широком температурном диапазоне: от 18 до 28 °С.

5. Показано, что уровень HbAiC коррелирует с содержанием глюкозы в крови (г+0,96; р<0,001).

6. Анализ результатов клинико-экспериментальных исследований гликемического статуса показал:

1). В группе контроля (здоровые лица, не имеющие диагноз СД) у

5 % (п=4) впервые выявлен повышенный показатель как уровня HbAic, так и содержания глюкозы в крови;

2). В группе больных СД установлена связь уровня HbAic со степенью выраженности и прогрессированием сосудистых поражений органов зрения.

3). Среди онкобольных выявлено нарушение углеводного обмена у 44,4 % (п=59) пациентов: уровень HbAic ниже физиологической нормы зафиксирован у 30,1 % (п=40); повышенный показатель уровня HbAic отмечен у 14,3 % (п=19); в пределах нормы - лишь у 55,6 % (п=74).

7. Аффинная тест-система для количественного определения HbAic обладает следующими преимуществами перед тест-системой фирмы "Sigma" (США): высокая воспроизводимость результатов (р<0,01), большая кратность использования колонки (7циклов), коэффициент вариабельности не превышает 5 %.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы бурное развитие претерпевает синтез и исследование полимерных материалов с новыми специфическими свойствами -полимерных гидрогелей, способных обратимо реагировать на незначительные изменения свойств внешней среды. Конструирование и использование иммобилизованных функциональных сорбционных систем с новыми полезными свойствами представляет большой теоретический и практический интерес. С их помощью можно моделировать различные биологические процессы, на их основе разрабатываются высокостабильные лекарственные формы пролонгированного действия, создаются высокоэффективные и высокочувствительные анализаторы.

Разработка методов определения НЬА]С является актуальной проблемой клинической биохимии в области ранней диагностики нарушений углеводного обмена и, прежде всего, при сахарном диабете [12-15, 17].

Сахарный диабет - одна из наиболее важных медико-социальных проблем современности. Это определяется его широкой распространенностью и тяжелыми осложнениями, приводящими к инвалидизации, а также экономическими затратами, связанными с организацией помощи больным СД, обеспечением их лабораторным обследованием и лекарствами [16, 21, 31, 223]. СД - хроническое заболевание и оно накапливается в общей популяции. Поэтому негативное влияние СД на демографическую ситуацию не вызывает сомнений. Не случайно во многих странах программа профилактики и лечения СД приобрела не только медицинское, но и общегосударственное значение. Свидетельством тому является принятие во многих странах государственных программ по борьбе с этим заболеванием [15, 19, 33].

Разработка аффинной тест-системы сорбента и методики количественного определения гликозилированного гемоглобина позволяют производить раннюю диагностику нарушения углеводного обмена, а также контроль эффективности фармакотерапии больных СД.

Гликозилированный гемоглобин представляет собой продукт неферментативного посттрансляционного соединения глюкозы с NH2-концевой аминокислотой (валином) обеих глобиновых |3-цепей [16]. Процесс неферментативного гликозилирования у человека составляет в норме 4-6 % и значительно усиливается при стойкой гипергликемии [18-22]. Уровень содержания HbAic как интегральный индекс гликемии привлекателен своей информативностью и стабильностью, не зависит от случайных и циркадных колебаний глюкозы в крови и отражает ретроспективный гликемический статус, т.е. тот уровень, который сохранялся на протяжении 3-4 месяцев (время жизни эритроцита), предшествовавших обследованию пациента.

Самым надежным методом химического связывания гликозилированного гемоглобина является использование сорбента с иммобилизованной, т.е. химически связанной, лг-аминофенилбороновой кислотой. И здесь главная задача биотехнологов - создать относительно недорогой, но высокоэффективный сорбент. В связи с этим решалась тройная задача [280]:

1) подобрать полимер-носитель, по функциональным группам которого необходимо химически связать .м-АФБК, сохранив ее группы, важные для определения HbAiC;

2) подшить полимерную матрицу таким образом, чтобы она не растворялась, но набухала в буферных растворах и элюенте, т.е. подобрать оптимальные условия сшивки;

3) связать с полимерной матрицей оптимальное количество м-АФБК.

Исследована зависимость между количеством связавшегося с матрицей лиганда (.м-АФБК), и значением рН буфера: оптимальным интервалом значений рН буфера при иммобилизации является рН 8,0-9,5 (рис. 12).

При изучении процесса иммобилизации ./w-АФБК установлена зависимость между концентрацией ж-АФБК в исходном растворе и количеством связавшегося лиганда. При достижении в исходном растворе концентрации м-АФБК 20 мг/мл происходит насыщение ПААГ и дальнейшее увеличение концентрации не приводит к росту количества иммобилизованного лиганда в сорбенте.

Используя для иммобилизации разные концентрации м-АФБК, нами были получены сорбенты, содержащие 10,1, 22,3 и 37,0 мкМ м-АФБК на 1 см3 ПААГ. Установлено, что для количественного определения НЬА|С пригодны сорбенты с содержанием бора не менее 0,05 %. Ограниченное количество определений, которое может быть проведено на одной порции сорбента, вероятно, объясняется постепенным падением специфической емкости сорбента из-за отщепления бора по связи В-С. Это подтверждается данными элементного анализа: в сорбенте с исходным содержанием бора 0,09 % после 12 циклов использования содержание бора в нем падало до 0,01 %. Одновременно происходило снижение специфической емкости АС, определяемая по связыванию НЬА]с в условиях максимального насыщения сорбента.

При помощи нового сорбента на основе ПААГ со связанной м-АФБК мы создали тест-систему для ранней диагностики СД. Для определения уровня НЬА]С необходимо всего 200 мкл капиллярной крови из пальца.

Исследования показали, что сорбент эффективно работает в течение 7 циклов определения HbAic на одной микроколонке. Результаты определения в одних и тех же пробах различаются между собой с коэффициентом вариабельности не более 5 %, что говорит о хорошей стабильности сорбента.

При увеличении количества определений в результате снижения емкости сорбента (исходное содержание бора от 0,05 до 0,12 %) падает достоверность определения процента HbA]C, происходит занижение результата определения по сравнению с его значением в том же гемолизате при определении в первых 7 циклах использования сорбента.

В основе механизма биоспецифичности сорбента лежит образование комплекса, возникающего при взаимодействии двух гидроксильных групп при атоме бора в лиганде сорбента, с цис-диольной группой глюкозного остатка молекулы НЬА|С. Комплекс легко расщепляется в слабокислой среде, а также при воздействии конкурирующих диолов, например, сорбитола.

Результаты исследований показали, что разработанная нами аффинная методика определения НЬА|С в крови человека позволяет получить воспроизводимые результаты, пригодные для оценки состояния углеводного обмена. Установлено, что полученный нами сорбент обладает высокой специфической емкостью, низким неспецифическим связыванием, устойчивостью к гидродинамическим воздействиям. Преимуществом нового аффинного сорбента является экономическая доступность исходных мономеров и простота синтеза. Аффинный сорбент, разработанный нами, выдерживает 7 циклов регенерации, что позволяет на 100 стандартных анализов использовать всего 15 миниколонок. По каталогу фирмы "Sigma" тест-система на 100 определений вместе со стандартами гемолизатов стоит более 300 долларов США. Микроколонки одноразовые, основанные на ионообменном принципе и требуют специального автоматизированного оборудования стоимостью 150-170 тысяч долларов США.

Аффинная тест-система прошла испытания во Всероссийском эндокринологическом центре РАМН (г. Москва), получила разрешение на производство и использование в Республике Башкортостан и успешно использовалась в ряде клиник г. Уфы (№ 8, 13, 21, РКБ) [281].

Помимо аффинного метода определения гликозилированного гемоглобина нами было разработано и два варианта колориметрического метода, которые показали принципиальную возможность определения гликогемоглобина с помощью периодатного окисления с последующим определением альдегидных групп реактивом Несслера и периодатного окисления с последующей детекцией изменения рН.

Метод определения гликогемоглобина периодатным окислением с последующим определением альдегидных групп колориметрически реактивом Несслера либо рН-метрической детекцией изменения рН среды имеет ряд достоинств: простота в исполнении, отсутствие дорогостоящих сорбентов, но при этом чувствительность метода уступает аффинному.

Результаты определения НЬА1с представляют несомненный интерес для экспертной оценки а) эффективности лечебных мероприятий, проводившихся больным сахарным диабетом в течение 2-3 месяцев, предшествовавших моменту текущего обследования; б) трудоспособности больных сахарным диабетом; в) при отборе лиц на военную службу; г) возможности сохранения беременности у больных сахарным диабетом [21, 282-285].

При проведении экспериментально-клинических исследований в Республиканском онкологическом диспансере установлено, что значительное число онкобольных (44,4 %) имеют клинически значимый уровень нарушений углеводного обмена. Результаты исследований уровня НЬА]с среди здоровых лиц, не имевших диагностированного сахарного диабета, выявили у 5% (п=81) скрытную или раннюю форму нарушения углеводного обмена.

Таким образом, разработанный нами аффинный сорбент на основе модифицированного ПААГ с иммобилизованной ти-АФБК, а также методика количественного определения HbAic, позволяют рекомендовать отечественный диагностикум (тест-систему) для скрининга ранних и скрытно протекающих форм нарушений углеводного обмена. Простота синтеза, доступность реагентов, низкая цена аффинного сорбента с иммобилизованной ж-АФБК на основе модифицированного ПААГ позволяют использовать тест-систему для проведения массовых скрининговых исследований по раннему выявлению таких заболеваний как сахарный диабет, рак.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сулейманова, Марзия Хажиевна, Уфа

1. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифцгирование (Практическое пособие). М.: Наука, 1981.

2. Аффинная хроматография: Методы. /Под ред. Дин П., Джонсон У., Мидл Ф., М.: Мир, 1988.

3. Остерман JI.A., Хроматография белков и нуклеиновых кислот, М.: Наука, 1985.

4. Raghavendra M.P., Prakash V. Phenylboronic acid~a potent inhibitor of lipase from Oryza sativa. //J. Agric Food Chem 2002 Oct. 9; 50(21 ):6037-41.

5. Markoglou N., Wainer I.W. On-line synthesis utilizing immobilized enzyme reactors based upon immobilized dopamine beta-hydroxylase. //J. Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci 2002 Jan. 5; 766(1): 145-151.

6. Dukler A., Freeman A. In situ product removal of ketoses by immobilized 3-amino phenyl boronic acid: effect of immobilization method on pH profile. //J. Biotechnol Bioeng 2001 Oct. 5; 75(l):25-28.

7. Kim K.R., La S., Kim A., Kim J.H., Liebich H.M. Capillary electrophoretic profiling and pattern recognition analysis of urinary nucleosides from uterine myoma and cervical cancer patients. //J. Chromatogr В Biomed Sci Appl 2001 Apr. 15; 754(1):97-106.

8. Национальная программа «Развитие биотехнологии в Российской Федерации на 2006-2015 гг.».

9. Проблемы здоровья населения. //Фарматека. -2005, № 16, с. 4.

10. Kordonouri О., Danne Т. Present and future perspectives on children with type 1 diabetes//Acta Paediatr. 1999. Suppl. 88(427):43-46.

11. King H., Aubert R.E., Herman W.H. Global burden of diabetes, 1995-2025. Prevalence, numerical estimates and projection //Diabetes Care. 1998, 21: 1414-1431.

12. Keen H., Pickup J.C. Проблема сахарного диабета в новом тысячелетии //М: Медикография. 1999, 721, № 4, с. 3-4.

13. Дедов И.И., Шестакова М.В., Миленькая Т.М., А.А. Александров, Галстян Г.Р., М.И. Балаболкин. Консилиум: Осложнения сахарного диабета. //Медицинская кафедра. -2004,1(9), с. 16-62.

14. В.А. Галенок, П.Н. Боднар, В.Е. Диккер, С.В. Ромашкан. Гликозилированные протеины. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1989.

15. Department of Health, Modern Standarts and Service Models. National Service Framework for Diabetes: Standards //London.-2001.

16. Торосян А.Г., Титов B.H., Мазовецкий А.Г., Завадский П.С. Гликозилированный гемоглобин: методические приемы и диагностическое значение (Обзор литературы) //Лабораторное дело. -1988, №8.-С. 5-8.

17. Дедов И.И., Шестакова М.В., Максимова М.А. Федеральная целеваяпрограмма «Сахарный диабет» М., 2002.

18. Жестовский С.С., Петрова Л.В., Мищерякова Т.Г. Методы повышения эффективности диагностики сахарного диабета //Врач и информационные технологии. 2005, № 6, с. 49-54.

19. Вартанян К.Ф. Проблемы специализированных служб в здравоохранении //Здравоохранение. 2004, № 8. С. 41-45.

20. ECODE Study Group, on behalf of the European Diabetes Epidemiology Group. //Arch Intern. Med. 2001,161: 397-404.

21. Догадин C.A., Крижановская E.B., Виноградова С.В., Макулова А.В., Безрукова Л.А., Варыгина О.В., Добрецов Д.Г., Опекунова Н.В. Результаты скрининга жителей Красноярска на сахарный диабет. //Сахарный диабет-2004,1 (22), с. 8-10.

22. Аметов А.С. Перспективы развития диабетологии. //Терапевтический архив. 2005, № 10, с. 5-9.

23. The Papyrus Ebers. The Greatest Egyptian Medical Document. Translated bu B. Ebbell. Copenhagen. - 1937.

24. Ч. Бест. Основные периоды в истории изучения диабета. В кн.: Диабет. /Под ред. Р.Уильямса: М., 1964.

25. Banting F.G., Best С.Н. The internal secretion of the pancreas //J. Lab. clin. Med.- 1922,-N7.-251.

26. D. Mc Carthy and P. Zimment, Diabetes 1994 to 2010: Global Estimates and Projectons, International Diabetes Institute, Australia, WHO Collaborating Center for Diabetes Mellitus Melbourne (1994).

27. Калинин А.П., Можеренков В.П., Прокофьева Л.Г. Распространенность сахарного диабета в Российской Федерации //Офтальмоэндокринология М., 1998.-С. 43-75.

28. Дедов И.И., Балаболкин М.И. Новая классификация, новые диагностические критерии и современные подходы к медикаментозной терапии сахарного диабета типа 2. М., ИМА-пресс. 2001.

29. Дедов И.И., Балаболкин М.И. Лечение сахарного диабета типа 1 насовременном этапе //Сахарный диабет. 2002, 4(17), с. 46-52.

30. Н. King и M.Rewers от имени специальной докладной группы ВОЗ по диабету. Диабет у взрослых как новая проблема в странах "третьего мира" //Бюллетень ВОЗ. 1991, 69, № 6. - С. 3-8.

31. Смирнова О.М. Впервые выявленный сахарный диабет типа 2 и сердечнососудистая патология //Клиническая фармакология и терапия. 2005, № 2, с 59-62.

32. Ордынский В.Ф. Особенности изменений структуры плаценты у беременных с сахарным диабетом по результатам ультразвукового исследования //Ультразвук и функциональная диагностика. 2005, № 5, с. 19-32.

33. Калиниченко С., Роживанов Р. Нейрогенные нарушения половой функции у мужчин, страдающих сахарным диабетом //Врач. 2006, № 1, с. 48-51

34. Александровский Я. А. Молекулярные механизмы развития диабетических осложнений. Обзор. //Биохимия. 1998. - Т. 63, №11.

35. Лосев Р.З., Куликова А.Н., Тихонова JI.A. Современные взгляды на диабетическую ангиопатию нижних конечностей //Ангиопатия и сосудистая хирургия. 2006, № 1, с. 25-31.

36. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Патогенез ангиопатий при сахарном диабете //Сахарный диабет. 1999, № 1 (2) С. 2-9.

37. Светликов А.В., Гамзатов Т.Х. Сахарный диабет и заболевание сосудов: Новое в патогенезе и лечении. //Амбулаторная хирургия. Стационарно размещающие технологии. 2005, № 2, 17-21.

38. Скибчик В.А., Соломенчук Т.М. Гликозилированный гемоглобин -фактор повышенного риска микро- и макрососудистых осложнений у больных сахарным диабетом. //Украинский медицинский журнал. 2005, № 5, с. 49-52.

39. Stratton I.M., Cull С.А., Adler A.I., Matthews D.R., Neil H.A., and Holman R.R. Additive effects of glycaemia and blood pressure exposure on risk of complications in type 2 diabetes: a prospective observational study United

40. Kingdom prospective Diabetes Study (UKPDS 75) //Diabetologia, 2006; 49:1761-1769.

41. Чазова Л.В. Сахарный диабет: распространенность, связь с факторами риска ишемической болезни сердца, прогностическое значение (эпидемиологическое исследование) //Терапевтический архив. 1996, 68, № 1, с. 15-18.

42. Скибчик Т.Н., Соломенчук Т.Н. Диагностика сахарного диабета в остром периоде инфаркта миокарда //Клиническая медицина. 2005, № 9, с. 2729.

43. Еникеев Д.А., Идрисова Л.Т., Александров М.А. Патофизиология сосудистых катастроф. Уфа, БГМУ, 2005.

44. Александров А.А., Оганов Р.Г., Виноградова И.В. Нарушения углеводного обмена при инфаркте миокарда. //Кардиология. 1977, № 3, с. 147-155.

45. Гасилин B.C., Пивоваров В.Н., Касаткина Л.В. и др. Сравнительное изучение углеводного обмена у больных ишемической болезнью сердца с наличием и отсутствием коронарного атеросклероза //Кардиология. -1980, №8, с. 15-19.

46. Палеев Н.Р., Калинина А.П., Мравян С.Р. Сахарный диабет и сердце. //Клиническая медицина. -2005, № 8, с. 37-42.

47. Lundback К. Diabetische angeopathie neue Koncepte der pathogenese //Munch. Med. Wschr. 1977,119, 19: 617-654.

48. Джахангиров Т.Ш. Сахарный диабет как проблема современной кардиологии //Кардиология. 2005, № 10, с. 55-61.

49. Касаткина Э.П., Сивоус Г.И., Очирова Э.А., Сичинава И.Г. Профилактика хронических осложнений сахарного диабета у детей и подростков //Сахарный диабет. 2003, 4 (21), С. 9-13.

50. Чазова Т.Е. Сахарный диабет и сердечно-сосудистые заболевания: факторы риска, клинические особенности, диагностика //Медицинская помощь. 2001, № 5. С. 28-32.

51. Лукашина Т.В. Факторы риска диабетической ретинопатии у больных инсулинозависимым и инсулинонезависимым типами сахарного диабета: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1984. - с. 20

52. Чумиева Е.А. Офтальмологические последствия сахарного диабета: социально-гигиенические и клинические аспекты //Вестник офтальмологии. 2003, № 5, с. 43-45.

53. Нероев В.В., Зуева М.В., Цапенко И.Д. Функциональная диагностика ретинальной ишемии: Сообщение 2. Роль мюллеровских клеток в развитии неоваскуляции сетчатки при диабетической ретинопатии //Вестник офтальмологии. 2005,121, № 1, 22-24.

54. Азнабаев М.Т., Зайдуллин И.С., Азнабаев Р.А., Давлетова Л.М. Изменения электрофизиологических показателей органа зрения у детей, больных инсулинзависимым сахарным диабетом //Вестник офтальмологии. 2004, № 2. С. 20-22.

55. Давыдова Н.Г., Балишанская Т.И., Никольская В.В. Флюоресцентная ангиография конъюнктивальных сосудов при глаукоме и диабете //Вестник офтальмологии. 1980, № 3, с. 34-36.

56. Марголис М.Г., Малькович В.Е. О дифференциально-диагностических признаках изменений глазного дна при сахарном диабете //Вестник офтальмологии. 1980, № 2,с. 31 -34.

57. Евграфов В.Ю. О классификации изменений глазного дна при сахарном диабете //Вестник офтальмологии. 2004, № 4. С. 11-14.

58. Кашинцева Л.Т. Офтальмологические изменения глазного дна у больных сахарным диабетом и их классификация //Офтальмологический журнал. -1980, №2, с. 108-112.

59. Миленькая Т.М., Бессмертная Е.Г., Александрова В.К., Ищенко И.М. Диабетическая ретинопатия и антиоксиданты //Сахарный диабет. 2003, 2(19), с. 30-33.

60. Викалюк Ю.Ф., Данилишина B.C., Войковская И.В. Поражение почек при сахарном диабете (клинико-морфологические сопоставления)

61. Здравоохранение Белоруссии. 1980, № 4. - С. 34-36.

62. Шестакова М.В. Диабетическая нефропатия (диагностика, профилактика и лечение). М., 2000. 37 с.

63. Раков С.С., Башарова Н.Г., Балаболкин М.И. Белковые маркеры диабетической нефропатии в условиях функционального нагрузочного теста //Клиническая лабораторная диагностика. 1994, № 2, с. 24-25.

64. Башарова Н.Г., Шапиро С.Б., Раков С.С., Долгов В.В. Использование функционального нагрузочного теста для определения стадии диабетической нефропатии //Клиническая лабораторная диагностика. -1994, №2, с. 25-27.

65. Шестакова М.В. Ранняя диагностика диабетической нефропатии: Автореф. дис. канд. мед. наук. -М., 1991.

66. Викторова JI.H., Городецкий В.К., Наводный О.А., Василенко В.В., Имбердиева Ф.Ф. Гликированные белки при диабетической нефропатии //Клиническая лабораторная диагностика. 1993, № 1. - С. 40-43.

67. Довлатян А.А. Острый пиелонефрит при сахарном диабете //Урология. -2003, №6. С. 65-70.

68. Кондратьева Е.И., Пузырев В.П., Суханова Г.А. и др. Генетические и биохимические механизмы формирования деабетической нефропатии у детей //Проблемы эндокринологии. 2005, № 1, с. 30-34.

69. Строков И.А., Новосадова М.В., Баринов А.Н., Яхно Н.Н. Клинические методы оценки тяжести диабетической полинейропатии //Неврологический журнал. 2000, №5, с. 14-19.

70. Попелянский Я.Ю. Болезни периферической нервной системы. М.: МЕДпресс-информ, 2005. - 366 с.

71. Варламова Т.В., Мейгал А.Ю., Соколов A.JI. Диагностика диабетической невропатии на доклинической стадии. //Медицинский академический журнал. -2004,4(2), 110-114.

72. Суркова Е.В., Дробижев М.Ю., Мельникова О.Г., Захарчук Т.А., Дедов И.И. Сахарный диабет и сопутствующие депрессии //Проблемыэндокринологии. 2003, 49, № 6. С. 11-16.

73. Forgacs S., Rosinger A., Vertes L. Diabetes mellitus and osteoporosis //Endocrinologie. 1976, 67 (3): 343-350.

74. Анциферов M. Синдром диабетической стопы, диабетическая остеоартопатия//Врач. -2000, № 1. С. 12-15.

75. Терехина Н.А., Акимов П.А. Биохимический анализ стекловидного тела глаза в постмортальной диагностике диабетических ком. //Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2005, № 2, 24-25.

76. Дедов И.И., Юшков П.В., Токмакова А.Ю. Остеопатия при синдроме диабетической стопы. //Архив патологии. 2004, 66 (11), 10-14.

77. Шаповал В.И. Молниеносная гангрена мошонки у больных сахарным диабетом //Клиническая хирургия. 1990, №12. - С. 57.

78. Зиннатуллин М., Циммерман Я., Трусов В. Сахарный диабет и язвенная болезнь //Новые медицинские технологии. 2004, № 8. С. 50-59.

79. Field, L.L. Insulin-dependent diabetes mellitus: a model for the study of multifactorial disorders //American journal of human genetics. 1988, 43: 793798.

80. Титович E.B., Щербачева JI.H. Гликогеновая болезнь и сахарный диабет типа 1 //Сахарный диабет 2003, 4 (21), с.36-40.

81. Гориловский Л.М. Диабетическая цистопатия //Урология. 2003, №6. С. 65-70.

82. Древаль А.В. Сахарный диабет и другие эндокринопатии поджелудочной железы //Российский медицинский журнал. 2000, № 4. - С. 42-46.

83. Кочемасова Т.В., Шестакова М.В., Миленькая Т.М. Изучение молекул адгезии эндотелиальных клеток и лейкоцитов у больных с диабетической микроангиопатией. //Молекулярная медицина. 2004, № 2,28-31.

84. National Diabetes Data Group. Classification and diagnosis of diabetes mellitus and other categories of glucose intolerance. //Diabetes. 1979. - 28: 1039-1057.

85. Sachse G., Schornstein A., Laube H., Federlin K. Kommt der aldiminform der glykosylierten Hemoglobine beim diabetes mellitus eine diagnostische und/oder prognostische Wertigkeit zu? //Laboratoriumsmedizin. 1984, 8, 2: 36-39.

86. Tsuchiya K., Fujisowo Т., Matsukura Y. Determination of plasma glycosylated protein and a comparison of its clinical use with that of hemoglobin A, //J. Jap. Diabet. Soc. 1981. 24, 6: 627-633.

87. Becattini U., Brogioni M., Capizzana E. et al. Dossagio dell'emoglobina (Hb) glicosilata quale indice dello "status" glicemico dei soggetti diabetici e prediabetici //Quad. Sclavo diagn. Clin, e lab. 1982. 18, 2: 140-147.

88. Kennedy A.L., Baynes J.W. Non-enzymatic glycosylation and the chronic complicotion of diabetes: an overview //Diabetologia. 1984. - 26, 2: 93-98.

89. Meons G.E., Chang M.U. Nonenzymatic glycosylation of proteins: structure and function changes //Diabetes. 1982. - 31: 1-4.

90. Bunn H.F., Shapiro R., Manus M. et al. Non-enzymatic glycosylation of protein; Relevance to diabetes //Am. J. Med. 1981. - 70, 2:325-330.

91. O'Shaughnessy R. Role of the glyxohemoglobins (Hb A.) in the evalution and management of the diabetic pregnancy //Clin. Obstet. Gynes. 1981, 24, 1: 6571.

92. Иржак JI.И. Гемоглобины и их свойства. М.: Наука, 1975. - 240 с.

93. Дервиз Г.В. Проблемы изучения гемоглобина //Клиническая медицина. -1981, № 3, с. 11-16.

94. Крю Ж. Биохимия. Медицинские и биохимические аспекты. М., Медицина, 1979.-510 с.

95. Наследственные анемии и гемоглобинопатии /Ред. Ю.Н.Токарев, С.Р.Холлан, Х.Ф.Корраль-Альмонте. -М.: Медицина, 1983. 336 с.

96. Garrick L.M., McDonald M.J., Shapiro R. et al. Structural analysis of the minor human hemoglobin components: Hb Alal, Hb Ala2, Hb Alb //Europ. J. Biochem. 1980. -106, 2: 353-359.

97. Bunn H.F., Haney D.N., Gabby P.M. Further identification of the nature andlinkage of the carbohydrate in hemoglobin A)C //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1971.-67: 103-109.

98. Bookchin R.M., Gallop P.M. Structure of hemoglobin Ale: nature of the N-terminal beta-chain blocking group //Biochem. Biophys. Res. Commun. -1968.-32, 1: 86-93.

99. Koenig R.J., Blobstein S.H., Cerami A. Structure of carbohydrate of hemoglobin A1C //J. Biol. Chem. 1977. - 252, 9: 2992-2997.

100. Berger W., Sonnenberg G.E. Blutsuchertragesprofile und Hamoglobin Al, Ale zur uberwachung der Diabetes behandlung //Schweiz. Med. Wochenschr. 1980.-110,13:485-491.

101. Holmquist W.R., Schroeder W.A. A new terminal blocking group involving a Schiffbase in hemoglobin A1C //Biochemistry. 1966. - 5: 2489-2503.

102. Efremov G.D., Huisman T.H.J. On the quanternary structure of hemoglobin AIC //Biochim. et biophys. Acta. 1969. -194, 2: 609-611.

103. Koenig R.J., Cerami A. Glycohemoglobins in the adult erythrocyte //Curr. Top. Hematol. 1979. - 2: 53-73.

104. Peterson C.M., Jovanovic L. Glycosylated proteins in normal and diabetic pregnancy //Acta endocrinol. 1986. - 112, 277: 107-111.

105. Гаппаров M.M., Вировец О.А. Неферментативное гликозилирование сывороточного альбумина и ДНК тимуса пищевыми моносахаридами и их естественными метаболитами, образующимися в организме //Вопросы питания. 1990, № 1, 36-40.

106. Малинова Л.И., Довгалевский П.Я., Симоненко Г.В. и др. Влияние глюкозы высоких концентраций на физиологические параметры эритроцитов больных ишемической болезнью сердца //Кардиология. -2004, № И, с. 24-27.

107. Miller J.A., Gravallese Е., Bunn H.F. Non enzymatic glycosylation of erythrocyte membrane proteins: relevance to diabetes //J. Clin. Invest. - 1980. -65: 896-901.

108. McDonald M.J., Davis J.E. Glycosylated hemoglobins and diabetes mellitus

109. Hum. Pathol. 1979. -10, 3: 279-291.

110. Ninoi K. Acombination of glycosylated hemoglobin and fasting plasma glucose testing facilitate screening of diabetes mellitus //Fokuoka, Acta med.- 1984.-75,5:271-282.

111. Paisey R., Hopton M., Hartog M. Correlation between skin glycosylation and glycaemic control in human diabetes //Clin. Endocrinol. 1984. - 20, 5: 521525.

112. Svendsen P.A., Lasuritzen Т., Sagaard U., Nerup J. Glycosylated haemoglobin and steady-state mean blood glucose concentration in type I (insulin-depedent) diabetes //Diabetologia. 1982. - 23 (5): 403-405.

113. Bolli G., Cartechini M.G., Compagnucci P. et al. Modification of glycosylated Hb concentration during artificial endocrine pancreas treatment of diabetics. Evidence for a short term effect on Hb Al (a+b+c) levels //Diabetologia. - 1980. -18: 125-130.

114. Garel M.S., Blonquist J., Molko F., Roso J. Hb A|C: a review on its structure, byosynthesis, clinical significance and methods of assay //Biomedicine. -1979.-30 (5): 234-240.

115. Абдулаева Ж.М. Гликозилированный гемоглобин в клинической оценке нарушений углеводного обмена //МРЖ. XX раздел. - Эндокринология.- 1986, №5, с. 14-16.

116. Baba Y., Kai М., Kamada Т. et al. Higher levels of erythrocyte membrane microviscosity in diabetes //Diabetes. 1979. - 28(12): 1138-1140.

117. Galacteros F., Wautier M.P., Bluekit G., Wautier J.L. Erythrocyte adhesion to endothelial cells and G.H.//Thromb. Haemost. 1981. - 46 (1): 405-407.

118. Wautier J.L., Paton R.C., Wautier M.P. et al. Increased adhesion of erythrocytes to endothelial cells in diabetes mellitus and its relation to vascular complications //N. Engl. J. Med. 1981.-305 (5) :237-242.

119. Stevens V.J., Rouzer C.A., Mormier V.M., Cerami A. Diabetic cataract formation: potential role of glycosylation of lens crystallins//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978.-75: 2918-2922.

120. Liotta L.A., Tryggvason К., Carbisa S. et al. Partial purification and characterization of neutral protease which cleaves type IV collagen //Biochemistrt. 1981.-20: 100-104.

121. Buckingham B.A., Uitto J., Sandborg C. et al. Scleroderma like syndrome and nonenzymatic glycosylation of collagen in children with poorly controlled insulin depedent diabetes //Pediatr. Res. - 1981.-15: 626-628.

122. Robins S.P., Beiley A.J. Age related in collagen: the identification of redensation products //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. - 48: 76-84.

123. Rosenberg H., Madrok J.B., Hassig J.M. et al. Glycosylated collagen //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. - 91: 498-501.

124. Schnider S.L., Kohn R.R. Effects of age and diabetes mellitus on the solubility and non-enzymatic glycosylation of human skin collagen //J. Clin. Invest.- 1981.-67: 1630-1635.

125. Perejda A.J., Uitto J. Nonenzymatic glycosylation of collagen and other proteins: relationship to development of diabetic complications //Collagen and Relat. Res.- 1982.-2(1): 81-90.

126. Schnider S.L., Koh R.R. Glycosylation of human collagen in aging and diabetes mellitus//J. Clin. Invest. 1980. - 66 (5): 1179-1181.

127. Shaklai N., Garlick R.L., Bunn H.F. Tryptophan fluorescence and ligand binding properties of glycosylated human serum albumin //Fed. Proc. 1983. -42: 2098-2099.

128. Michael A.F., Brown D.M. Increased concentration of albumin in kidney basement membranes in diabetes mellitus //Diabetes. 1981. - 30 (10): 843846.

129. Королев В. А., Головская Г. Г., Селиванова К. Ф., Молдован К. И., Борисенко С. Н. Содержание гемоглобина А1С и модифицированного альбумина сыворотки крови у больных сахарным диабетом. //Вопросы медицинской химии. 1991. - Т. 37, № 3. - С. 41-43.

130. Rosenthal Murray A., Hoching David R.: Combinet glycated hemoglobin and immunoturbidometric glycated albumin assay from whole blood lysate:

131. Пат. 5 284 111 США, МКИ5 G 01 N 33/53; G 01 N 33/536/Rosenthal Murray A., Hoching David R., Isolab. Ins. N 664401; Заявл. 04.03.91; Опубл. 08.02.94.

132. Dolhofer R., Renner R., Wieland O.H. Different behaviour of Hb Ala.c and glycosyl albumin levels during recovery from diabetic ketoacidosis and non-acidotic coma//Diabetologia. - 1981.-21(3): 211-215.

133. Guthrow C.E., Morris M.A., Day J.F. et al. Enhanced nonenzymatic glycosylation of human serum albumin in diabetes mellitus //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - 76: 4258-4261.

134. Мазовецкий А.Г., Завадский П.С., Турсунов Б., Масенко В.П. Иммуиореактивный инсулин и С-пептид при нарушениях толерантности к глюкозе у родственников больных сахарным диабетом. //Проблемы эндокринологии. 1980. V. 26, № 1, с. 8-11.

135. Боднар П.Н., Ромашкан С.В. Гликозилированные липопротеиды у больных сахарным диабетом //Доклады АН УССР. Киев. - 1984, № 7, с. 63-65.

136. Lyons T.J., Baynes J.W., Patrick J.S. et al. Glycosylation of low density lipoprotein in patients with Type 1 (insulin-depedent) diabetes: correlations with other parametrs of glycaemic control //Diabetologia. 1986. - 29, 90: 685-689.

137. Schleicher E., Deufel Т., Wieland O.H. Non-enzymatic glycosylation of human serum lipoproteins: elevated E-lysine glycosylated low density lipoproteins in diabetic patients //FEBS Lett. 1981. - 129 (1): 1-4.

138. Kim H.-J., Kurup J.V. Nonenzymatic glycosylation of human plasma low density lipoproteins. Evidence for in vitro and in vivo glycosylation //Metabolism. 1982.-31 (4): 348-353.

139. Schleicher E., Deufel Т., Wieland O.H. Non-enzymatic glycosylation of human serum lipoproteins: elevated E-lysine glycosylated low density lipoproteins in diabetic patients //FEBS Lett. 1981. -129 (1): 1-4.

140. Денисенко T.B. Гликозилированные липопротеиды как атерогенныйфактор при диабете (Обзор). // Вопросы медицинской химии. 1990, № 2, с. 5-10.

141. Каневская Н.П., Исмагилова А.И., Ахметова Р.Н. Нарушение углеводного и липидного обмена факторы риска развития желчекаменной болезни. //Здравоохранение Башкортостана. - 2004, № 3, 206-207.

142. Williams S.K., Hawarth N.L., Devenny J.J., Bitensky M.W. Structural and functional consequences of increased tubulin glycosylation in diabetes mellitus //Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1982. -79 (21): 6546-6550.

143. Алексеев Л.П. HLA-гены маркеры инсулинзависимого сахарного диабета, этические аспекты //Иммунология. - 2003, № 5. С. 3-9.

144. Носиков В.В. Идентификация генетических маркеров, сцепленных с сахарным диабетом типа 1 //Проблемы эндокринологии 2002, № 4. С. 10-13.

145. Качина Н.Н. Содержание гликозилированного гемоглобина в трупе как доказательство уровня прижизненной гликемии //Современные вопросы судебной медицины и экспертной практики. Ижевск, 1993. - Вып. 6, с. 197-200.

146. Дмитриев Л.Ф., Дулин С.Ф. Механизмы развития гипергликемии и возможные способы нормализации углеводного обмена. (Обзор). //Терапевтический архив. 2005, 77 (10), 24-29.

147. Нелаева Ю.В., Бышевский А.Ш., Алборов Р.Г., Шестакова М.В., Нелаева А.А. Оксидативный стресс и тромбоцитарно-коагуляционный гемостаз у больных сахарным диабетом типа 1 с диабетической нефропатией //Сахарный диабет. 2003, 3 (20), с .10-13.

148. Weisgraber К.Н., Innerarity T.L., Mahley R.N. Role of the lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts // J. Biol. Chem. 1978, 253, 24, 9053-9062.

149. Галенок B.A., Гриншпун M.H., Диккер B.E. Гемоглобин A iC и кислородный баланс в процессе компенсации сахарного диабета

150. Клиническая медицина. 1987, № 3. С. 95-99.

151. Белявский А.Д. Сахарный диабет: современные акценты в патогенезе и в подходах к интенсивной терапии //Вестник интенсивной терапии. -2003, № 1.С. 3-9.

152. Кармен Н.Б., Милютина Н.П., Орлов А.А. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов и его коррекция перфтораном //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005, 139 (5), с.517-519.

153. Прихожан В.И. Классификация диабетической невропатии //Проблемы эндокринологии. 1987, № 3. С. 79-85.

154. Vlassara Н., Brownlee М., Cerami A. Excessive non-enzymatic glycosylation of peripheral and control nervous system insulin components in diabetic rats //Diabetes. 1983.-32: 670-674.

155. Крутецкая З.И., Лебедев O.E., Курилова Л.С. Механизмы внутриклеточной сигнализации. СПб., 2003. - 208 с.

156. Kovtun Y., Chiu W.L., Тепа G., Sheen J. Phunctional analysis of oxidative stress-activated mitigen-activated protein kinase cascade in plants // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 2000. - 97: 2940-2945.

157. Vessby J., Basu S., Mohsen R., Berne C., Vessby B. Oxidative stress and antioxidant status in type 1 diabetes mtllitus //J. Intern. Med. 2002, Jan; 251(1): 69-76.

158. Wulf D. Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function // Physiol. Rev. 2002. - 82: 47-95.

159. Rotter, J.I. et al. Genetic of diabetes mellitus. In: Rifkin, H. & Porte, D., ed. Diabetes mellitus: theory and pracktice. New York. Elsevier, 1990. P. 378413.

160. Allen R.G., Tressim M. Oxidative stress and gene regulation //Free Radical. Biol. Med.-2000.-28:463-499.

161. Schumm D.E., and Matthews R.H. Diabetes and cancer: a postulated relationship // Medical Hypothesis. 1979.-5: 1353-1361.

162. La- Vecchia С., Negri E., Franceschi S., D'Avanzo В., and Boyle P. A case-control study of Diabetes mellitus and cancer risk. //Br. J. Cancer. 1994. - 70:950-953.

163. Glicksman A.S., and Rawson R.W. Diabetes and altered carbohydrate metabolism in patients with cancer. //Cancer.- 1956. 9: 1127-1134.

164. Daniel B.T. Glycemie crises in patients with hematologic malignacies. //Crit. Care Nurs. Clin. North Am. -2000. -12:297-305.

165. Dispenzieri A., and Loprinzi C.L. Chemotherapy-Induced Insulin-dependent diabetes mellitus. //J. Clin.Oncol. 1997. -15:1287.

166. Александровский Я.А. Молекулярные механизмы взаимовлияния патологических процессов при совместном протекании сахарного диабета и рака. Научные и клинические аспекты (Обзор). //Биохимия, 2002, 67, вып. 12, с. 1611-1631.

167. Rockstroh Н., and Schroter Н. Die Haufigleit des Krebses beim Diabetes mellitus.

168. Miinchen. Med. Wochenschrift. -1961. -102 (18): 897-901.

169. Камышева Е.П., Абелевич И.Г., Андрюхина H.H., Панова Е.И., Блохина Н.Ю. Сахарный диабет и рак. //Российский медицинский журнал. 1992, №2, с. 8-11.

170. Rhomberg W. Metastasierendes Mammakarzinom und Diabetes mellitus -eine prognostisch guenstige Krankheitskombination //Deutsch. Med. Wochenschrift. 1975. - 100: 2422-2427.

171. Куницына M.A. Некоторые особенности течения рака молочной железы у больных сахарным диабетом. //Вопросы онкологии. 1987, 33, № 9, 78-81.

172. Salzberg D., and Griffin А.С. Ingibition of azodye carcinogenesis in the alloxan-diabetic rat. //Cancer Res. 1952. V.12. P. 294.

173. Билыповский Ф., Билыновская M. Канцерогенез у крыс с аллоксановым диабетом. Механизмы канцерогенеза. М.: Иностранная литература, 1961. С. 128-141.

174. Дубошина Т.Б., Ершова Г.И. Рак поджелудочной железы и сахарный диабет.//Вопросы онкологии 1992, 38 (3), с. 259-264.

175. Aleksandrovski, Ya. A. (1992) Tromb. Res., 67, 179-189.

176. Schneider M.B., Matsuzaki H., Haorah J., Ulrich A., Standop J., Ding X.Z., Adrian Т.Е., and Pour P.M. Prevention of pancreatic cancer induction in hamsters by metformin //Gastroenterology 2001. V. 120. P. 1263-1270.

177. Phillips S.A., and Thornalley P.J. The formation of methylglyoxal from triose phosphates. Investigation using a specificassay for methylglyoxal. //Eur. J. Biochem. 1993.- 212: 101-105.

178. Алексеев B.C. Метилглиоксаль: метоболизм и биологическая активность //Укр. биохим. журн., 1987, т.59, № 6, с. 88-94.

179. Kalapos М.Р. On the promine/retine theory of cell division: now and then. //Toxilogy Lett. 1999. - 110: 145-175.

180. McLellan A.C., Thornalley P.J., Benn J., and Sonksen P.H. Glyoxase system in clinical Diabetesmellitus and correlation with diabetic complications. //Clin. Science. 1994. - 87: 21-29.

181. Beisswenger P.J., Howell S.K., Touchette A.D., Lai S., and Szwergold B.S.//Diabetes (1999), 48, 198-202.

182. Apple M.A., and Greenberg D.M. Arrest of Cancer bu Therapy with Normal Metabolites. 1, 2-Oxipropanol (NSC-79019). //Cancer Chemotherapy Reports. 1967. V. 51. P. 455-464.

183. Jerzykovski Т., Matuszewski W., Otrzonsek N., and Winter R. Antineoplastic Action of Methylglyoxal. //Neoplasma. 1970. 17: 25-35.

184. Milanesa D.M., Choudhyry M.S., Mallouh C., Tazaki H., and Konno S. Methylglyoxal-induced apoptosis in human prostata carcinoma: potencial modality for prostata cancer treatment. //Eur. Urol. 2000. - 37: 728-734.

185. Kang Y., Edwards L.G., and Thornalley P.J. Effect of methylglyoxal on human leukaemia 60 cell groth: modification of DNA, G1 growth arrest and induction of apoptosis. //Leukemia Res. 1996. - 20: 397-405.

186. Moulinoux J.Ph., Quemener V., Khan N.A. Biological significance of circulating polyamines in oncology.//Cell. Mol. Biol. 1991.-37: 773-783.

187. Kaneko H., Hibasami H., Mori K., Kawarada Y., Nakashima K. Apoptosis induction in human breast cancer MRK-NU-1 cells bu a polyamine synthesis inhibitor, methylglyoxal his (cyclopentylamidinohydrazone) (MGBCP).//Anticancer Res., 1998. -18: 891-896.

188. Wakabayashi H., Hibasami H., Iida K., Satoh N., Yamazaki Т., Sonoda J., Hirata H., Nakashima K., Ichida A. Prevention on metastasis bu a polyamine synthesis inhibitor in an animal bone metastasis model.//Oncology, 2000. -59: 75-80,

189. RiordanJ.F., McElvany K.D., and Borders C.L. Arginyl residues: anion recognition sites in enzymes.//Science, 1997. -195 (4281): 884-886.

190. Leoncini G., Maresca M., and Bonsgnore A. The effect of methylglyoxal on the glycolytic enzymes.//FEBS Letters, 1980.- 117: 17-18.

191. Leoncini G., Maresca M., and Buzzi E. Inhibition of the Glycolytic Pathwaybu Methylglyoxal in Human Platelets.//Cell Biochem. Funct., 1989.- 7: 65-70.

192. Haider J., Ray M., and Ray S. Inhibition of glycolysis and mitochondrial respiration of Ehrlich ascites carcinoma cells bu methylglyoxal.//Int. J. Cancer, 1993. 54 (3): 443-449

193. Biswass S., Ray M., Misra S., Dutta D.P., and Ray S. Selective inhibition of mitochondrial respiration and glycolysis in human leukaemic leucocytes bu methylglyoxal.//Biochem. J., -1997.-323: 343-348.

194. Gugliucci A., and Bendaun M. Histonesfrom diabetic rats contain increased levels of advanced glycation end products. //Biochem. Biophys. Res. Comm., 1995.-212(1): 56-62

195. Fazal F., Ahmed S., Rahman A., and Hadi A.M. Generation of superoxide anion and hydroxyl radical bu methylglyoxal. //Med. Sci. Res., 1994. 22: 21-22.

196. Murata-Kamija N., Kamija H., Kaji H., and Kasai H. Methylglyoxal induces G:C to C:G and G:C to T:A transversions in the supF gene on a shuttle vector plasmid replicated in mammalian cells.//Mutat. Res., 2000. - 468: 173-182

197. Kjaergaard J.J., Hansen P., Madsen H., Dofzel J. Hemoglobin AIC as an indicator of long -term blood glucose levels in diabetics with special reference to diabetic pregnancy //Acta Endocrinol. 1980, 94, suppl. 238: 25-29.

198. Borsey D.O., Fraser D.M., Gray R.S. et al. Glycosylated hemoglobin and its temporal relationship to plasma glucose in non-insulin-depedent (type 2) diabetes mellitus //Metabolism. 1982, 31, 4: 362-365.

199. Duhn P.J., Cole R.A., Soeldner J.S. Glycosylated Hb in Diabetes Mellitus //J. Chin. Endocr. 1981, 52:1019-1022.

200. Gonen В., Rochman H., Rubenstein A.H. Metabolic control in diabetic patients: assessment by Hb Ai values //Metabolism. 1979. 28, 4, suppl. 1:448.455.

201. Land R., Siria J., Thibult W. et al. Glycosylated Hb concentrations and clinitest results in insulin-depedent diabetes //Lancet. 1977. - 2: 1156-1156.

202. Topper E., Donor M., Karp M. Relationship between glycosylated Hb and postprandial blood glucose in insulin depedent juvenile diabetes patients //Isreel J. Med. Sci. - 1979,15(3): 283-285.

203. Walinder O., Wibell L., Trwemo T. Relation between Hb A) and determinations of glucose in diabetics treated with and without insulin //Diabete et Metabol. 1980, 6(4): 251-255.

204. Koenig R.J., Cerami A. Hemoglobin AiC and diabetes mellitus //Annu. Rev. Med.: Selec. Top. Clin. Sci. Palo Alto, Calif. - 1980, 31: 29-35.

205. Grabbay K.H., Sosenko J.M., Banuchi G.A. et al. Glycosylated Hb: increased glycosylation of Hb A in diabetic patients //Diabetes. 1979, 28(4): 337-340.

206. Casparie A.F., Miedemo H. Hb A,c in compason with other parameter as index of diabetic control //Neth J. Med. 1978, 21: 73-76.

207. Николов M., Дамянова JI., Цонев Д., Златова С. Уровень гликозилированного гемоглобина у больных сахарным диабетом //Совр. мед.- 1982, 33(6): 383-385.

208. Lantz В., Wajeman Н., Beaufils М. et al. Minor Hemoglobins fractions in uraemic and in diabetic patients //Diabete et Metabolism. 1981, 7(2): 109114.

209. Justin R. and McCrary M.D. More News from UKPDS: Aggressive Glucose, Blood Pressure Management Benficial //Diabetes and vascular education. 2006, August 10.

210. UKPDS Group: Intencive blood-glucose control with sulfphonyureas or insulin compared with conventional triatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes (UKPDS 33) //Lancet 1998, p. 352-837.

211. Mehl T.D., Wenzel S.E., Russel B. et al. Comparison of two indices of glycemic control in diabetic subjects: glycosylated serum protein and hemoglobin //Diabetes Care. 1983, 6(1): 34-39.

212. Trivelli L. A., Ranney H. M., Lai H. T. Haemoglobin components in patients with diabetes mellitus //New Engl. J. Med. 1971, 284: 353-357.

213. Мазовецкий А.Г. Диагностика сахарного диабета. Раннее распознавание эндокринных заболеваний и новые методы лечения. //Вопросы экспериментальной эндокринологии: Тез. докл. 1-го Всероссийского съезда эндокринологов. Уфа, 1984. - С. 71.

214. Моисеев B.C. Современные подходы к лечению нарушений углеводного обмена в общей практике. //Фарматека. 2005, № 10, 16-20.

215. Князев Ю.А., Беспалова В.А. Гормонально-метаболические диагностические параметры. Справочник. М.: Изд. дом «Русский врач», 2000. 96 с.

216. Massari V., Eschwege Е., Valleron A,J. Imprecission of new criteria for the oral glucose tolerance test. //Diabetologia. 1983, 24(2): 100-106.

217. Ditzel J., Nielsen N.V., Berg O. Hemoglobin A.C concentrations in subjects with normal and borderline glucose tolerances /Acta endocrin. Scand. Society for the study of diabetes: 13 th annual meeting. Danmark, 1978, 88: 219. Abstr. 23.

218. Lev-Ran A., Vanderlaan W.P. Glycohaemoglobins and glucose tolerance //J. Am. Med. Assoc. 1979, 241: 912-914.

219. Dods R.F., Bolmey C. Glycosylated Hb assay and oral glucose tolerance test compared for detection of diabetes mellitus//Clin. Chem. 1979, 25(5): 764768.

220. Kawahara R., Amemiya Т., Komori Т., Hirata Y. Chanhes of Hb Ai and red cell 2,3-DPG on 100 mg oral glucose tolerance test in diabetics and nondiabetic control //J. Jap. Diabet. Soc. 1980, 23(12): 1089-1094.

221. Качество клинических и лабораторных исследований. Новые горизонты и ориентры. /Под ред. В.В.Меньшова. М.- 2002.- 304 с.

222. Dix D., Cohem P., Barzegar S., Striefler M. The oral glucose tolerance test: A comparison of the time points on the basis of limit values, normal dispersion, and reproducibility. //Acta Diabetol. Lat. 1981,18(1): 21-26.

223. Trell E., Krislenson H., Peterson В. et al. Two-nour glucose and insulin responses after a standardixed oral glucose load in relation to serum gamma-glutamyle transferase and alcohol consumption. //Acta Diobetol. Lat. 1981, 18(4): 311-317.

224. Aronoff S., Bennett P.H., Williamson J.R. et al. Muscle capillary basementmembrane measurement in prediabetic, diabetic and normal pinca indians andnormal caueasians.//Clin. Res. 1976, 24: 455 A.

225. Siperstein M.D., Unger R.H., Madison L.L. Studies of muscle capillarybasement membrabes in normal subjects, diabetic and prediabetic patients //J. Clin.1.vest.- 1968, 47: 1973-1975.

226. Моренкова C.A. Неинвазивный метод диагностики диабета //Клиническая лабораторная диагностика. 2003, № 3. С. 14-15.

227. Корягина И.Ю. Лабораторные технологии диагностики и мониторинга сахарного диабета: (Лекция) //Клиническая лабораторная диагностика.2002, №5. С. 25-32.

228. Simon M., Eissler J.: Critical factors in the chromatographic measurement of glycohemoglobin (HbA,). //Diabetes. 1980, 29(6): 467-474.

229. Королев В. А., Петров А. В., Борисенко С. Н., Молдован К. И.: Микрометод определения гликозилированного гемоглобина. //Клиническая лабораторная диагностика. 1993, № 2, 28-30.

230. Eckerbom Solveig, Bergqvist Yugve, Jeppsson Jan-Olot.: Improved method for analysis of glycated hemoglobin by ion exchange chromatography //Ann. Clin. Biochem. 1994, 31(4): 355-360.

231. Cole R.A., Soeldner J.S., Dunn P.S., Bunn H.F.: A rapid method for the determination of glycosylated hemoglobins using high pressure liquid chromatography //Metabolism. 1978, 27(3): 289-301.

232. Davis J. E., McDonald J. M., Hane F. D.: A high performance liquid chromatography method HbAic //Diabetes. 1978,27: 102-108.

233. Wajcman H., Dastuque В., Labie D.: Quantitation of hemoglobin A|C: a rapid automated precision-chromatography technique //Clinical Chemica Acta. -1979, 92:33-39.

234. John W. Garry, Braconnier Francois, Miedeme Kor, Aulesa Carlos, Piras Gampiero.: Evalution of the Menarini-Arkray HA 8140 hemoglobin A.C analyser //Clin. Chem. 1997, 47(6): 968-975.

235. Singh Jagat, Kulig K.: Evalution of Abbot JMX method for human glycated hemoglobin assay: Abstr. Amer. Assoc. Clin. Chem. 46 th Nat. Med., Now Orleans, La July 17-21, 1994//Clin. Chem. 1994, 40(6): 1060-1061.

236. Рабинович С.Э., Платонова JI.B., Дюжева Т.Г. Определение гликозилированного гемоглобина методом аффинной хроматографии на борфенилагарозе. //Вопр. мед. химии. 1993,39, № 5, 58-61.

237. Muruyama Nobuyuki, Kaneko Yoshitaka, Miyamoto Motoaki, Ando Yasuhiko.: Evalutions on the measurement of glycosylated hemoglobin by Ropet-AF using affinity chromatography //Эйсэй кэнса = Jap. J. Med. Technol. 1989, 38(5): 92-98.

238. Kunika Kiyoshi, Itakura Mitsuo.: Affinity column chromatography. The 1 st report: Highly sensitive total glycohemoglobin (T-GHb) assay measuringglycation of valine and lisine residues //Эйсэй хэнса = Jap. J. Med. Technol. -1990, 39(8): 46-51.

239. Bisse E., Wieland H.: Coupling of m-aminophenylboronic acid to s-triazine-activated Sephacryl: use in the affinity chromatography of glycated hemoglobins. //J. Chromatogr. Biomed. Appl. 1992, 575, (2): 223-228.

240. Данилова Л.А., Лопатина Н.И. Колориметрический метод определения гликозилированных гемоглобинов.//Лабораторное дело. 1986, № 5, с. 281-283. .

241. Карпова Е.А., Городецкий В.К.: Колориметрический метод определения неферментативно гликозилированного гемоглобина в крови человека. //Вопросы медицинской химии. 1989, № 1, с. 122-127.

242. Seibene V., Brembilla L., Bertoletti A. et al. Chromotographic and colorimetric detection of glycosylated hemoglobins: a comparative analysis of two differentmethods //Clin. Chim. Acta. 1979, 93: 199-205.

243. Королев B.A., Петров A.B., Чуманский Л.И. Сравнение методов определения гликозилированного гемоглобина. //Клиническая лабораторная диагностика. 1992, № 5/6, с. 37-40.

244. Троцкий Г.В., Ажицкий Г.Ю. Изоэлектрическое фокусирование белков в самоорганизующих и искусственных рН-градиентах. Киев, 1984.

245. Королев В.А., Борисенко С.Н., Селиванова К.Ф., Щеколодкин В.Ф.

246. Метод изоэлектрического фокусирования в борат-полиольной системе для выявления гемоглобина А ^//Лабораторное дело. 1989, № 1, с. 61-62.

247. ТурковаЯ. Аффинная хроматография. M., 1980.

248. Панорама современной химии России: Синтез и модификация полимеров. М., Химия, 2003. - 356 с.

249. Полимеры специального назначения. /Под ред. Н. Исэ и И. Табуси. М., 1983.

250. Кузнецов П. В. Современные тенденции развития классических и нетрадиционных вариантов аффинной хроматографии: (Обзор) //Химико-фармацевтический журнал. 1992, №2, 78-84.

251. Федьке М. Химические реакции полимеров. -М., 1980.

252. Даванков В.А., Навратил Дж., Уолтон X. Лигандообменная хроматография. М., 1989.

253. Кузнецов П.В. Эпоксиактивнрованные адсорбенты в жидкостной хроматографии физиологически активных веществ (Обзор) //Химико-фармацевтический журнал. 1993, № 6, 56-65.

254. Кузнецов П. В., Кононенко В. Я., Зинчук С.Ф. и др. Синтез аффинных адсорбентов с иммобилизованными стероидными лигандами. -Красноярск, 1991.-С. 37.

255. Бондарь B.C., Кузнецов П.В., Межевикин В.В. Синтез, скрининг и использование новых аффинных адсорбентов для получения высокоочищенных НАДФ*Н зависимых ферментов. - Красноярск, 1987.

256. Наумова JI.B., Елькин Г.Э., Дмитриенко JI.B. Кинетика сорбции сывороточного альбумина на макропористом стекле МПС-250 ГХ //Прикладная биохимия и микробиология. 1996, 32, № 5, 493-495.

257. Препаративная жидкостная хроматография. /Под ред. Б.Бидлингмейера. -М, 1990.

258. Бектенова Г.А. Иммобилизация ферментов на неорганических и органических полимерных носителях. Автореф. дисс. докт. хим. наук. - Республика Казахстан, Алматы. - 2000.

259. Кузнецов П.В., Шкаренда В.В. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ. 1. Определение фурокумаринов в фитопрепаратах //Химико-фармацевтический журнал. -1991, №4, 72-76.

260. Гарипова М.И., Басченко И.А., Фролова И.С., Клеева О.Б., Кузнецов В.П. Новый иммуносорбент для очистки интерферона //Доклады АН. -1993,3, №6, 738-739.

261. Власов В.В., Грачев М.А., Лаврик О.И. и др. Аффинная модификация. М., Наука, 1983.243 с.

262. Новые методы практической биохимии./Под ред. Кретович В.Л. и Шольц К.Ф.- М.: Наука, 1988.

263. Горчаков В.Д., Сергиенко В.И., Владимиров В.Г. Селективные гемосорбенты. М.: Медицина, 1989. - 224 с.

264. Биоспецифическая аффинная сорбция биополимеров и ее применение в иммунологии. /Ред. Хавкин Ю.А. Уфа, 1978. - 128 с.

265. Кнорре Д.Г, Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 2002. - Новосибирск: Наука, 1983. 243 с.

266. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия, М: Мир, 1980, с.88-94.

267. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990, 293 с.

268. Hay G.W., Lewis В.A., and Smith F. Periodate oxidation of polysacharides general procedures.//Methods Carbohyd. Chem., 1965, 5: 357-361.

269. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: Наук, думка, 1982, 192с.

270. Монаков Ю.Б. Полимеры для медицины: работы Института органической химии УНЦ РАН //Вестник Академии наук Республики Башкортостан, 2001, т. 6, № 4, с. 3-12.

271. Басченко И.А., Гарипова М.И., Сулейманова М.Х., Монаков Ю.Б., Зарудий Ф.С., Давлетов Э.Г. Разработка аффинного метода определения гликозилированного гемоглобина в крови человека //Здравоохранение Башкортостана, 1997, № 6, с. 54-56.

272. Ушакова О.В., Шапиро И.А. Фармаэкономическое обоснование перевода больных сахарным диабетом 1-го типа на инсулиновый аналог короткого действия «Аспарт» (Новорапид) //Проблемы эндокринологии. -2006, №4, с. 9-12.

273. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. Инсулинотерапия сахарного диабета на современном этапе //Лечащий врач, 2006, № 2, с. 24-27.

274. Арбатская Н.Ю. Самоконтроль гликемии у беременных с сахарным диабетом типа 1 //Российский медицинский журнал, 2005, № 3, с. 11-13.

275. Сулейманова М.Х., Басченко И.А., Зарудий Ф.С., Монаков Ю.Б. Новый аффинный сорбент для определения гликозилированного гемоглобина вранней диагностике нарушений углеводного обмена //Химико-фармацевтический журнал, 2006, т. 40, № 7, с. 41-44.

Информация о работе

Сулейманова, Марзия Хажиевна
кандидата биологических наук
Уфа, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка аффинной тест-системы для количественного определения гликозилированного гемоглобина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы