Инсулин-транспортирующие системы крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа. Теоретические и прикладные аспекты

Гарипова, Маргарита Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Инсулин-транспортирующие системы крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа. Теоретические и прикладные аспекты
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Инсулин-транспортирующие системы крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа. Теоретические и прикладные аспекты"

На правах рукописи

ГАРИПОВА МАРГАРИТА ИВАНОВНА

ИНСУЛИН-ТРАНСПОРТИРУЮЩИЕ СИСТЕМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ ПЕРВОГО ТИПА. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРИКЛАДНЫЕ

АСПЕКТЫ

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

00346217Б

Уфа-2009

003462176

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии ГОУ ВПО Башкирский государственный университет

Научный консультант доктор биологических наук, профессор

Киреева Наиля Ахняфовна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Лопина Ольга Дмитриевна Московский государственный университет

доктор биологических наук, профессор Меденцев Александр Григорьевич Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

доктор биологических наук, профессор Мустафина Ольга Евгеньевна Институт биохимии и генетики УНЦ РАН

Ведущая организация Казанский государственный

университет

Защита состоится "19" марта 2009 г. в 14 часов назаседании Объединенного Диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Адрес: 450054, Уфа, пр. Октября, 71. Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, www.anrb.ш/шolgen/dissov.html.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимскс научного центра РАН.

Автореферат разослан "_" февраля 2009 г.

Ученый секретарь -- /

диссертационного совета - Л^хЗ^к Бикбулатова С. М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Инсулин - первый белок с доказанной гормональной активностью (Abel, 1926), однако механизм его транспорта в крови во многом остается неясным до настоящего времени. Из данных литературы следует, что в транспорте инсулина принимают участие два механизма. Первый механизм заключается в доставке инсулина к периферическим тканям плазмой крови, в которой инсулин транспортируется в составе двух фракций: "связанного" и "свободного" инсулина (Касаткина, 1996). Состав и свойства белков, формирующих фракцию связанного инсулина, изучены недостаточно; по мнению Н.К. Грачевой и соавторов (1972), эта фракция формируется за счет взаимодействия гормона с трансферином. Однако, ввиду использования авторами физико-химических методов выделения содержащих инсулин фракций, возникает сомнение в том, что были выделены все из них. Что касается свободного инсулина, то до настоящего времени не ясно, находится ли он в истинно свободном состоянии или формирует лабильный комплекс с белками крови (Старосельцева и др., 1983, Марри и др., 1993, Касаткина, 1996, Покровский, 2007).

Второй механизм транспорта инсулина заключается в доставке гормона к периферическим тканям в комплексе со специфическими рецепторами плазматической мембраны эритроцитов (Сандуляк, 1972). В работах ряда авторов показано, что эритроциты крови человека и животных участвуют в транспорте инсулина наряду с плазмой и формируют его депо, из которого инсулин поступает в плазму крови и ткани в ответ на повышение уровня глюкозы, молочной кислоты и под влиянием физико-химических факторов (Доломатов, 1999; Картун и др., 2000; Запорожан и др., 2001).

Соотношение между двумя системами транспорта инсулина в норме и при сахарном диабете до настоящего времени не получило своей оценки.

В то же время, несмотря на успехи в изучении этиологии сахарного диабета и создание новых препаративных форм инсулина, сахарный диабет продолжает занимать третье место среди причин смертности после сердечно-сосудистых заболеваний и рака (Старосельцева и др., 1983; Касаткина, 1996; Покровский, 2007; Chan, 2007;

Neumiller et. al, 2008). Это свидетельствует о необходимости углубления знаний о механизмах синтеза, транспорта и биологического действия инсулина.

Доказано, что диабет первого типа имеет аутоиммунную природу. Разрушение продуцирующих инсулин ß-клеток осуществляют собственные лимфоциты организма (Atkinson, 1990; Bach, 1994; Нош et. al., 1998; Espe et. al., 2007; Stefan et. al., 2007). По данным литературы, аутоиммунная реакция специфична ко многим антигенам ß-клеток, в том числе к инсулину (Atkinson, 1990). Однако, механизм формирования аутоиммунных реакций к антигенам ß-клеток, не выявлен. Известно, что развитие иммунного ответа к антигенным детерминантам зависит от свойств носителя, распознаваемого лимфоцитами (Галактионов, 2004). Роль носителя при антигенном распознавании инсулина могут играть молекулы, транспортирующие его к клеткам-мишеням. Из этого вытекает важность идентификации и изучения свойств компонентов крови, принимающих участие в транспорте инсулина к периферическим тканям в норме и при сахарном диабете.

Цель работы - изучение инсулин-транспортирующих систем крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа с использованием аффинных методов.

Задачи исследования:

1. Оценить соотношение вкладов эритроцитарной и сывороточной систем в транспорт инсулина в сопоставлении с аналогичными соотношениями ряда гидрофильных и гидрофобных гормонов.

2. Разработать новый носитель для аффинной хроматографии, отличающийся повышенной стабильностью по сравнению с традиционно используемыми полисахаридными носителями.

3. Изучить свойства полученных на основе нового носителя аффинных сорбентов при использовании в условиях лаборатории, биотехнологического производства и в аффинных диагностических системах.

4. Создать диагностическую систему для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека.

5.Разработать метод количественного определения связывающих инсулин белков сыворотки крови человека и провести сравнение их концентрации в норме и при сахарном диабете первого типа.

6. Синтезировать аффинный сорбент с иммобилизованным инсулином на основе предложенного носителя и провести аффинное выделение связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа.

7. Определить роль ионов цинка и других двухвалентных катионов во взаимодействии инсулина и транспортных белков сыворотки крови.

8.Оценить гетерогенность инсулинсвязывающих белков крови и провести идентификацию в их составе известных транспортных соединений методами электрофореза, гельхроматографии, иммунохимии и классической биохимии в норме и при сахарном диабете первого типа.

9.Количественно оценить содержание липидов и гормонов первой и второй групп в составе связывающего инсулин комплекса.

10. Изучить иммуномодулирующие свойства инсулин-связывающих белков сыворотки крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом.

Научная новизна

Впервые установлено, что особенность транспорта инсулина, по сравнению с транспортом других белковых гормонов, заключается в равноценном использовании сывороточного и эртроцитарного механизмов. При сахарном диабете происходит достоверное снижение вклада сывороточной системы в транспорт инсулина, соответственно, возрастает вклад эритроцитарного транспорта.

Разработан и запатентован новый метод синтеза матрицы для аффинной хроматографии, позволяющий получить сорбент с иммобилизованным инсулином, не загрязняющий выделенные связывающие инсулин белки продуктами расщепления полисахаридной матрицы и иммобилизованного лиганда. На основе предложенной матрицы синтезирован и запатентован сорбент с иммобилизованной аминофенилбороновой кислотой,

использованный при создании диагностической системы для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека.

Впервые показано, что в плазме крови человека инсулин взаимодействует со сложным комплексом белков, формирующих при физиологических значениях рН ядро транспортирующего гормоны комплекса. Для включения инсулина в транспортный комплекс необходимо присутствие ионов цинка. Показано, что в крови здоровых доноров в состав связывающего инсулин комплекса входят белки с доказанной транспортной функцией: альбумин, а-фетопротеин и трансферин.

Установлено, что при сахарном диабете первого типа состав белков транспортного комплекса достоверно изменяется: альбумин и а-фетопротеин, входящие в ядро комплекса в норме, замещаются в нём белком острой фазы воспалительной реакции - а1-кислым гликопротеином.

Доказано, что транспортирующий гормоны комплекс плазмы крови человека является общим для гормонов различной природы: наряду с инсулином, он содержит как гидрофобные (тироксин, трийодтиронин, тестостерон), так и гидрофильные гормоны (лютеинизирующий гормон, тиреотропный гормон, пролактин).

Показано, что гликопротевды, формирующие комплекс с инсулином в крови здоровых доноров, обладают способностью снижал, иммунный ответ при добавлении к антигенам при иммунизации.

Практическая значимость работы

Разработан и запатентован метод получения носителя для аффинной хроматографии на основе поливинилового спирта. Новый носитель (Поливиналь) не уступает по плотности активных групп бромциан-Сефарозе 4В, обладает лучшими, по сравнению с полисахаридными матрицами, колоночными свойствами и превосходит их по химической стабильности (Гарипова М.И. и др. Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений. Авторское свидетельство № 1789532,22.09.1992).

Иммуноаффинный сорбент, синтезированный на основе предложенного носителя, испытан в условиях производства человеческого лейкоцитарного интерферона в Отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи на стадии удаления антигенных примесей из полуфабрикатов интерферона. По результатам производственных испытаний,

принято Дополнение к регламенту «Лейкинферон для инъекций. Стадия ВР-5.4. Иммобилизация иммуноглобулинов». Сорбент для очистки лейкоцитарного интерферона человека, синтезированный на основе запатентованного носителя, с ноября 1991 года до настоящего времени используется на производстве инъекционного препарата лейкоцитарного интерферона в отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи согласно утвержденному производственному регламенту (Акт об использовании предложения от 23 января 1992 года).

Создана диагностическая система для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека, включающая микроколонки с иммобилизованной на предложенном носителе мета-аминофенилбороновой кислотой (Гарипова и др. Сшитый поливиниловый спирт с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина. Патент на изобретение , № 20935525.2002). Диагностическая система разрешена к применению для диагностики сахарного диабета в лечебно-профилактических учреждениях Республики Башкортостан решением Научно-технического Совета Министерства Здравоохранения Республики Башкортостан от 28 июля 1992 года.

На основе нового носителя получен сорбент с иммобилизованным инсулином и впервые проведено аффинное выделение связывающих инсулин белков сыворотки крови (транспортирующего гормоны комплекса) здоровых доноров и бальных сахарным диабетом первого типа. Выделенный аффинно транспортирующий гормоны комплекс крови может быть использован в качестве препарата, корректирующего гормональные нарушения, а также при создании новых препаративных форм инсулина с повышенной эффективностью доставки гормона к периферическим тканям.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Особенность транспорта инсулина в крови человека, по сравнению с транспортом большинства других белковых гормонов, заключается в равноценном использовании двух транспортных систем: системы сывороточных транспортных белков и эритроцитарной системы транспорта.

2. При сахарном диабете первого типа снижается роль сывороточного и повышается роль эритроцитарного транспорта в доставку инсулина к периферическим тканям.

3. Предложена новая матрица для аффинной хроматографии, позволяющая получить сорбент с иммобилизованным инсулином, не загрязняющий выделенные инсулин-связывающие белки продуктами расщепления полисахаридной матрицы и иммобилизованного лиганда. На основе новой матрицы синтезирован сорбент с иммобилизованной аминофенил-бороновой кислотой, использованный при создании диагностической системы доя аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека.

4. В плазме крови человека инсулин включается в общий для гидрофильных и гидрофобных гормонов транспортный комплекс, ядро которого формируют альбумин, а-фетопротеин, аг-глобулины и (3- глобулины (в том числе трансферин), для включения инсулина в транспортный комплекс необходимо присутствие ионов цинка.

5. При сахарном диабете первого типа состав белков транспортного комплекса изменяется: из него исчезают альбумин и а-фетопротеин, снижается содержание а2 -глобулинов, появляется фракция агглобулинов (в том числе кислый ар гликопротеин).

6. Белки транспортирующего гормоны комплекса крови в норме обладают иммуносупрессивным действием.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на I Всесоюзной конферен- ' ции «Аффинная хроматография антител - теоретические и прикладные аспекты» (Москва, 1983), на V Всесоюзной конференции «Новые направления в биотехнологии» (Путцино, 1984), на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на V конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пущино,1988), на I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), на 33 Международном съезде физиологов (Санкт-Петербург, 1997), на Ш съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997), на Всероссийской конференции «Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей» (Санкт - Петербург, 2001), на конференции «Экологические,

морфологические особенности и современные методы исследования живых систем» (Казань, 2003), на Всероссийской конференции с международным участием «Достижения биологической функционологии и их место в практике образования» (Самара, 2003), на региональной конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2007), на конференции «Проблемы биоэкологи и пути их решения» (Саранск, 2008).

Публикации. Основные материалы диссертации обобщены в монографии и изложены в 48 печатных работах, в том числе в 9-ти статьях в журналах, рекомендованных ВАК, а также защищены 2 патентами и 2 авторскими свидетельствами.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 336 страницах, содержит 20 рисунков, 24 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 536 работ.

Благодари ости. Выражаю глубокую признательность научному консультанту - профессору, д.б.н. Наиле Ахняфовне Киреевой за плодотворное сотрудничество, консультации и ценные советы, способствовавшие совершенствованию работы; за подробный анализ работы и доброжелательное отношение к.б.н. Ольге Борисовне Кузовлевой и к.м.н. Маю Яковлевичу Корну, за ценные консультации профессору, д.б.н. Станиславу Юрьевичу Веселову, профессору, д.м.н. Сергею Владимировичу Сибиряку и всем моим коллегам, оказавшим неоценимую помощь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Формирование группы здоровых доноров, из крови которых аф-финно выделяли связывающие инсулин белки, проводили на основании заключения эндокринолога об отсутствии отклонений от нормы в регуляции углеводного обмена. В качестве второго критерия отбора использовано процентное содержание гликозилированного гемоглобина (% Ггб) в капиллярной крови обследуемых, отражающее средний уровень гликемии за 2 месяца, предшествующие взятию пробы (Вго\уп1ее е(:.а1., 1980; ОагНск е! а1., 1983; НиЬЬисЬ, 1983). Для количественного определения белков, связывающих инсулин, в плазме крови и их аффинного выделения были отобраны пробы крови 800 здоровых добровольцев 2025 лет с содержанием Ггб от 4 до 7,5%, что соответствует нормальному уровню гликемии.

Определение коэффициентов распределения гормонов проведено в пробах крови 100 здоровых доноров 25-35 лет со средним содержанием гликогемоглобина в капиллярной крови 5,2±0,41%.

Для количественного определения белков, связывающих инсулин, в плазме крови и их аффинного выделения были отобраны пробы крови 800 больных сахарным диабетом первого типа (8 серий по 100 пациентов), находившихся на стационарном лечении в эндокринологических отделениях больниц г. Уфы. Процентное содержание гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови обследованных колебалось от 10,3 % до 18,6 %, что соответствует стадии заболевания с неудовлетворительной компенсацией нарушений углеводного обмена. Эта стадия заболевания была выбрана в связи с тем, что именно в стадии декомпенсации следовало ожидать проявления наиболее выраженных изменений транспорта инсулина.

В работе использованы следующие методы: аффинное выделение связывающих инсулин белков крови проводили на сорбентах, синтезированных на основе предложенного носителя; иммуно-ферментное определение альбумина крови человека, а-фетопротеина, овальбумина, и антител к овальбумину проводили по стандартному методу (Епдуа1 е1:. а1., 1971) с использованием наборов для иммуноферментного анализа производства Предприятия по производству бактерийных

препаратов НИИ им. Н.Ф. Гамалеи; иммуноферментное определение гормонов, альбумина и а-фетопротеина проводили с использованием диагностических наборов фирмы НВО Иммунотех (Россия); иммуно-люминесцентное определение гормонов на автоматическом анализаторе Amerham (Англия), проводили при помощи наборов Amerlite; имму-нонефелометрическое определение ai-кислого гликопротеина и трансферта проведено при помощи диагностических наборов фирмы НВО Иммунотех (Россия); электрофорез белков на ацетатцеллюлозных пленках проводился с использованием системы Microtech 648 PC фирмы Interlab, предназначенной для полностью автоматизированного проведения электрофореза; иммуномодулирующие свойства инсулин-связывающих белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом изучены в эксперименте по иммунизации белых лабораторных мышей дифтерийным анатоксином. Для определения концентрации противодифтерийных анштел и связывающих инсулин белков крови использовали реакцию пассивной гемагглютинации с диагности-кумом, приготовленным по ранее описанному методу (Гарипова и др., 2005). Изоэлектрическое фокусирование связывающих инсулин фракций крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом проводили по ранее описанному методу (Гарипова и др., 1984) с использованием амфолинов фирмы Pharmacia (Швеция). Спектры поглощения выделенных фракций в ультрафиолетовой области получены при помощи Спектрофотометра СФ-123 (Россия). Расчет статистических ошибок, применение критериев сравнения и корреляционный анализ проводили с использованием статистического пакета Statistica for Windows версии 5,5

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Соотношение вкладов эритроцитарной и сывороточной систем в транспорт инсулина и ряда гормонов первой и второй групп.

Проведено экспериментальное определение коэффициентов распределения между поверхностью эритроцитов и плазмой крови здоровых доноров инсулина и ряда гормонов первой и второй групп. Величина коэффициента распределения определялась двумя методами. В крови здоровых доноров коэффициент распределения рассчитывался

как отношение концентрации гормона, элюированного с поверхности эритроцитов к его концентрации в плазме крови. Определение концентрации гормона проводили иммунолюминесцентным методом. Коэффициент распределения инсулина в крови больных сахарным диабетом и здоровых доноров определяли по соотношению активности пероксидазы, конъюгированной с инсулином, связанной с поверхностью эритроцитов, к её активности в плазме крови (*). Коэффициент распределения инсулина в крови здоровых доноров определен при использовании каждого из указанных методов. Сопоставление значений коэффициента распределения инсулина в норме, полученных двумя методами, показало, что использованные методы дают статистически тождественные результаты (0,49±0,0132 и 0,47±0.0159 , табл. 1). Обследовано 100 здоровых доноров 20-35 лет.

Из данных таблицы 1, следует, что для всех исследованных гормонов второй группы (как простых белков, так и гликопротеидов), характерно резкое преобладание связанной с эритроцитами фракции гормона по сравнению с гормоном, присутствующим в плазме крови. Величина определенных в эксперименте коэффициентов распределения гормонов второй группы, за исключением инсулина, превышает 100. Очевидно, это свидетельствует, о наличии на поверхности эритроцитов специфических рецепторов к этим гормонам и о чрезвычайно низкой концентрации в плазме крови связывающих эти гормоны белков.

Установлено, что коэффициенты распределения гормонов первой группы (прогестерона, кортизола, трийодтиронина, тироксина) близки к 0 (таблица 1). Следовательно, гидрофобные гормоны транспортируются в основном плазмой крови, что согласуется с данными литературы о присутствии в плазме транспортирующих эти гормоны гликопротеидов (Ообоуас-гттегтапп ; 1988; Марри,1993; Кеп£ш et.al., 2007).

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что в норме коэффициент распределения инсулина составляет 0,49±0,0053. Очевидно, это свидетельствует о том, что в отличие от других гормонов второй группы, инсулин доставляется к периферическим тканям при равноценном участии двух механизмов, характерных как для гормонов второй, так и первой групп.

Таблица 1

Распределение гормонов между поверхностью эритроцитов и плазмой крови здоровых доноров

Гормон группа Поверхность эритроцитов Плазма Коэффициент распределения эритроциты/ плазма

Кортизол I 0 148,5±3,52 нмоль/л 0

Прогестерон I 0 0,88 ±0,041 нмоль/л 0

ТЗ I 0 1,1± 0,05 нмоль/л 0

Т4 I 0 57,9 ±2,64 нмоль/л 0

Тиреотропный гормон II 65,7± 2,98 мкМЕ/мл 0,55± 0,027 мкМЕ/мл 119,4545±3,56

Лютеинизи-рующий гормон II 200± 8,36 МЕ/мл 0,49 ± 0,025 МЕ/мл 408,1633±8,64

Фолликуло-стимулирующий гормон II 360 ± 17,55 МЕ/мл 3,56 ±0,182 МЕ/мл 101,12±17,56

Пролактин II 132,4 ±6,74 нг/мл 1,3 нг/мл 101,8

Инсулин норма II 33,03±1,66% 66,97±1,56 % 0,49±0,0132

31,80±1,25%* 66,97±1,56% * 0,47±0.0159*

Инсулин сахарный диабет II 41,96±1,84% * 58,04±1,42 %* 0,73±0,0165*

Таким образом, согласно полученным данным, своеобразие транспорта инсулина, в сравнении с транспортом других белковых гормонов, заключается в том, что в него вносит значительный вклад система транспорта, типичная для гидрофобных гормонов - система транспортных белков плазмы крови.

Для выявления изменений в транспорте инсулина, происходящих при сахарном диабете, обследована группа 100 больных сахарным диабетом первого типа с неудовлетворительной компенсацией заболевания (процентное содержание фракции гликозилированного гемоглобина в капиллярной крови обследованных в среднем составило 9,36±0,52%).

Среднее значение коэффициента распределения инсулина между эритроном и плазмой в пробах крови больных диабетом составило 0,73±0,0065, то есть было достоверно выше аналогичного показателя, определенного в пробах крови здоровых доноров (таблица 1, t=2,176, р=0,036). На основании результатов сравнения коэффициентов распределения инсулина в норме и при сахарном диабете первого типа, был сделан вывод о том, что при диабете наблюдается достоверное увеличение вклада эршроцитарной системы в доставку инсулина к периферическим тканям. Увеличение эритроцигарного транспорта инсулина при сахарном диабете, вероятно, носит компенсаторный характер и обусловлено снижением его взаимодействия с транспортными белками крови. Эти данные согласуются с полученными ранее результатами титрования активности связывающих инсулин сывороточных белков в крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом, из которых следует, что связывание инсулина белками плазмы крови снижается при сахарном диабете первого типа (Гарипова и др., 2005).

Снижение роли сывороточного транспорта инсулина при сахарном диабете первого типа свидетельствует о необходимости изучения состава и свойств инсулин-транспортирующих белков. Наиболее полное выделение всего спектра взаимодействующих с инсулином белков крови возможно при использовании аффинной хроматографии. В предварительных экспериментах установлено, что аффинные сорбенты с инсулином, иммобилизованным на основе активированной бромцианом Сефа-розы-4В, не позволяют выделить связывающие инсулин белки крови, свободные от примесей продуктов разложения полисахаридной матрицы. В связи с этим, на первом этапе исследований была поставлена задача разработать носитель для аффинной хроматографии, отличающийся повышенной стабильностью по сравнению с традиционно используемыми полисахаридными носителями.

Разработка носителя для аффинной хроматографии на основе поливинилового спирта. Выделение специфически взаимодействующих с инсулином белков крови с последующим определением их состава и структуры предъявляет повышенные требования к матрице аффинного сорбента, использованной для синтеза сорбента с иммобилизованным инсулином.

В 80-х годах 20 века коммерческие носители повышенной стабильности на основе поливинилового спирта были получены фирмой Toyo Soda и

использованы для синтеза широкого спегара аффинных сорбентов и ионо-обменников (Matsumoto et al., 1982). Метод получения гелей поливинилового спирта с коваленгао сшитыми цепями, использованный фирмой Тоуо Soda, в литературе не описан. В связи с этим, метод формирования геля поливинилового спирта и способ его активации разработаны в отдельной серии экспериментов (Гариповаидр., 1989,1993, Гарипова 1998).

Формирование геля поливинилового спирта, устойчивого в широком диапазоне температур и рН, проводили за счет реакции внутримолекулярного ацеталирования гидроксильных групп полимера карбонильными группами, образовавшимися при окислении раствора поливинилового спирта натриевой солью перийодной кислоты. Ранее этот метод получения стабильного геля поливинилового спирта использовался в текстильной промышленности и для синтеза сорбентов не применялся (Ушаков, 1960). В качестве катализатора при проведении реакции ацеталирования применяли соляную кислоту и соли трехвалентного железа (Гарипова и др., 1993). Качество полученных гелей оценивали по гидродинамическим свойствам и проницаемости для белковых маркеров фирмы Serva

Известно, что гель, полученный за счет реакции ацеталирования гидроксилов поливинилового спирта образовавшимися в результате окисления альдегидными группами, не является достаточно стабильным из-за обратимого перехода гель-золь (Matsumoto et al., 1982). Из этого вытекает необходимость дополнительной стабилизации геля, полученного этим методом, перед использованием его в аффинной хроматографии. В связи с этим, были испытаны два метода стабилизации гелей поливинилового спирта: за счет создания поперечных сшивок в реакции с эпихлоргидрином и глутаровым альдегидом. Условия стабилизации, необходимые для получения стабильного геля поливинилового спирта, выдерживающего кипячение при контрастных значениях рН, были подобраны экспериментально (табл. 2).

Как следует из данных, приведенных в таблице 2, достаточная стабилизация геля происходит при использовании как глу-тарового альдегида, так и эпихлоргидрина. Полученные гели превосходят по стабильности широко используемые в аффинной хроматографии полисахаридные носители, так как выдерживают кипячение при крайних значениях рН. Однако, наиболее удобной оказалась стабилизация глутаровым альдегидом,

Таблица 2

Оптимизация стабилизации геля поливинилового спирта эпихлоргидрином и глутаровым альдегидом_

Реагент для стабилизации Эффективность стабилизации* Количество активных групп в 1 мл геля

15% эпихлоргидрин + + + + 20 мкМ

10% эпихлоргидрин + + + + 14 мкМ

5% эпихлоргидрин + + + + 9 мкМ

1% эпихлоргидрин + + + 4,5 мкМ

10% глутаровый альдегид + + + + 100-120 мкМ

5% глутаровый альдегид + + + + 100-120 мкМ

2,5% глутаровый альдегид + + + + 60-80 мкМ

1 % глутаровый альдегид + + + + 40-50 мкМ

0,5% глутаровый альдегид + + + 10-15мкМ

*Эффективность стабилизации определяли в баллах; (++++ -полученные гели выдерживают кипячение при крайних значениях рН; -Н-+ - гели стабильны во всем диапазоне рН при нормальных условиях; ++ - гели нестабильны при крайних значениях рН, +- гели нестабильны во всем диапазоне рН).

так как в этом случае одновременно со стабилизацией происходит достаточная активация геля: в расчете на 1 мл геля в ходе реакции вводится 100 и более микромолей активных альдегидных групп, в то время как при использовании эпихлоргидрина в гель вводится не более 20 микромолей эпоксидных групп на 1 мл геля.

Таким образом, использование метода формирования геля поливинилового спирта после его частичного окисления периодатом натрия в сочетании со стабилизацией полученного геля глутаровым альдегидом позволяет получить носитель для аффинной хроматографии, имеющий крупнопористую структуру, обладающий хорошими гидродинамическими свойствами, содержащий не менее 100 мкМ/мл активных альдегидных групп. Предложенный метод синтеза носителя для аффинной хроматографии защищен авторским свидетельством (Гарипова и др., Авторское свидетельство № 1789532 22.09.1992).

Для лабораторных исследований свойств полученного носителя получены аффинные сорбенты с иммобилизованным протеином А. Staphylococcus aureus, овальбумином и глобулиновой фракцией кроличьей антисыворотки к овальбумину (анти-ОВА). Проводили параллельное сравнение свойств сорбентов, полученных на основе предложенного носителя (Поливиналя) и бромциан-Сефарозы 4В фирмы Pharmacia fine chemicals (Швеция). Как следует из данных, приведенных в таблице 3, аффинные сорбенты на основе нового носителя обладают специфической емкостью, сравнимой с емкостью сорбентов на основе Сефарозы 4В, низким неспецифическим связыванием и лучшими, по сравнению с сорбентами на основе Сефарозы, гидродинамическими свойствами (Гарипова, 1998; Хайбуллина и др., 2003).

В условиях производства инъекционных препаратов интерферона проведено испытание иммуноаффинного сорбента на основе нового носителя с. иммобилизованными антителами к примесям, подлежащим удалению из полуфабрикатов препарата. По результатам производственных испытаний, проведенных в Отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, принято Дополнение к производственному регламенту "Лейкинферон для инъекций. Стадия ВР-5.4. Иммобилизация иммуноглобулинов" и получен Акт об использовании предложения.

Предложенный носитель был использован для иммобилизации

Таблица 3

Сравнение удельной емкости аффинных сорбентов на основе бромциан-Сефарозы 4В и Поливиналя

Носитель Лиганд Среднее значение удельной емкости* мг/мл Неспецифическое связывание БСА Замедление тока буфера в 10 цикле

1 цикл 2-10 циклы мг/мл %*"

BrCN-Сефароза протеин А И,00± 0,40 10,20± 0,37 0,16± 0,02 3,20± 0,15 В 1,5 раза

Поливи-наль протеин А 9,20± 0,40 8,50 + 0,36 0,15+ 0,02 3,00± 0,16 Нет

BrCN-Сефароза оваль-бумин 3,80 ± 0,20 3,20+ 0,19 0,13 ± 0,01 2,60± 0,09 В 1,5 раза

Поливи-наль оваль-бумин 3,3 0± 0,21 2,80+ 0,19 0,10± 0,04 2,00± 0,06 Нет

BrCN-Сефароза анти-ОВА 1,30 ± 0,06 1,10± 0,05 0,20 ± 0,01 4,00± 0,14 В 1,5 раза

Поливи-наль анта-ОВА 0,80 ± 0,035 0,60± 0,025 0,20 ± 0,010 4,00± 0,20 Нет

*- мг белка, элюированного с 1 мл сорбента; **- бычий сывороточный альбумин (БСА); ***- процент от нанесенного количества БСА

инсулина в эксперименте по выделению связывающих инсулин белков крови человека. Для иммобилизации использован инсулин Хумулин Р фирмы Lilly из расчета 10 единиц гормона на 1 мл сорбента. Создание диагностической системы для определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека. Глико-зилированная фракция гемоглобина является своеобразной "памятью" о среднем уровне гликемии за время жизни эритроцита, составляющем 2-3 месяца. Образование этой фракции обусловлено неферментативным связыванием глюкозы молекулами исходно негликозилированного гемоглобина за счет реакции между альдегидной группой глюкозы и аминогруппой гемоглобина (Guthrow et. al., 1979, Day et al., 1980, Higgins et.al., 1982, Hubbuch, 1985, Morris et al., 1985, Мазовецкий, 1991). Существует ряд методов определения процентного содержания глгасозилированной формы гемоглобина. Наиболее популярными из них являются ионообменная хроматография (Hubbuch, 1985), аффинное определение на сорбенте с иммобилизованной фенилбороновой кислотой (Dean et. al., 1980) и колориметрическое определение с тиобарбитуровой кислотой (Guthrow et. al., 1979). В 80-х годах двадцатого века фирма Pierce Chemical Company начала выпуск диагностического набора, содержащего микроколонки с аффинным сорбентом, представляющим собой мета-аминофенилбороновую кислоту (м-АФБК), иммобилизованную на 6% агарозе. Принцип аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина основывается на свойстве фенилбороновой кислоты избирательно связывать молекулы, содержащие цис-диольную группировку, в том числе, гликозилированный гемоглобин (Weith et. al.,1970, Okayama et. al., 1978, Reed et. al., 1986). Набор содержит 25 колонок, каждая из которых рассчитана на 3-6 определений. Небольшое количество достоверных определений, которое можно провести на одной колонке фирмы Pierce Chemical Company объясняется недостаточной стабильностью использованного при синтезе аффинного сорбента носителя. Для повышения количества достоверных определений гликозилированной формы гемоглобина на одной микроколонке с аффинным сорбентом, проведена иммобилизация м-АФБК на носителе Поливи-наль. Полученный сорбент с иммобилизованной аминофенилборо-новой кислотой использован в диагностической системе для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека (Гарипова, 1996). Предложенная диагностическая система является аналогом системы фирмы Pierce Chemical Company.

Для количественного определения гликозилированной формы

гемоглобина использована методика определения, рекомендованная фирмой Pierce Chemical Company с некоторыми изменениями. Клинические испытания предложенной диагностической системы, проведенные в клинико-диагностических лабораториях больниц г. Уфы, показали, что при ее использовании ошибка определения не превышает 5% (табл. 4). За счет повышенной стабильности аффинного сорбента, использование новой диагностической системы позволило увеличить количество определений процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина в пробе с 3-6 (при использовании набора фирмы Pierce Chemical Company) до 20.

Таблица 4.

Вариабельность определения гликозилированного гемоглобина на протяжении 20 циклов использования сорбента Поливиналь-мета-АФБК

Гемолизат нь1с(%) № цикла % Ггб Среднее значение % Ггб

1 14,0

1 4 13,5 13,7±0,503

11,6 7 14,8

10 14,2

13 12,8

16 13,5

19 13,2

2 15.2

5 16,1

2 8 15,8 15,81±0,297

12,4 11 16,4

14 15,6

17 16,0

20 15,6

3 7,8

6 7,2

3 7,0 9 8,2 7,74±0,275

12 7,4

15 8Д

18 7,6

21 7,9

В лаборатории клинической биохимии Эндокринологического научного

Центра РАМН проведено параллельное определение процентного содержания гликогемоглобина с использованием предложенного аффинного сорбента и определение основной фракции гликозилированного гемоглобина Нв А 1о методом высокоэффективной ионообменной хроматографии при помощи хроматографа AUTO А1СТМНА (фирма Kyoto Kagaku Со, LTD, Япония). Коэффициент корреляции между полученными значениями показателей составил +0,95, р=0,0136.

Рис. 1. Взаимосвязь среднего за период наблюдения значения гликемии и процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина, определенного в конце периода наблюдения (г=+0,945, р=0,0001).

Таким образом, в ходе клинических испытаний диагностической системы на основе предложенного аффинного сорбента, показано, что полученные значения % Ггб соответствуют клинической картине течения заболевания и динамике гликемии. Установлено, что при оценке полученных результатов следует использовать критерии, предложенные А. НаЬЬисЬ и соавторами (НаЬЬисЬ, 1985).

Использование предложенной диагностической системы позволило провести объективную оценку состояния углеводного обмена обследуемых при формировании групп здоровых доноров и больных сахарным диабетом в стадии декомпенсации заболевания при изучении инсулин-транспортирующих систем крови человека.

Сравнение инсулинсвязывающей активности плазмы крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа. На первом этапе изучения транспорта инсулина в плазме крови проведено сравнение количества связывающих инсулин белков плазмы крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа. Количественное определение белков сыворотки, специфически связывающих инсулин, проводили методом титрования в реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитами барана, сенсибилизированными инсулином. Эритроциты сенсибилизировали инсулином из расчета 0,4мг гормона на 1 мл 50% стабилизированных формалином эритроцитов по методике, описанной ранее (Гарипова и др., 2005; 2007).

Показано, что в сыворотках крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом присутствуют компоненты, агглютинирующие эритроциты барана, сенсибилизированные инсулином. Агглютинация происходила только при введении в реакционную среду ионов цинка и специфически подавлялась при добавлении в реакционную среду свободного инсулина. Внесение в рабочий буферный раствор эквимолярных количеств солей кальция и магния не замещало действия ионов цинка. Агглютинация несенсибилизированных эритроцитов не выявлена.

Как следует из данных, приведенных в таблице 5, средний логарифм титра (^2) связывающих инсулин белков в плазме крови здоровых доноров составляет 6,98+0,61, по сравнению 3,86±0,47 в крови больных сахарным диабетом. Следовательно, концентрация связывающих инсулин белков плазмы крови здоровых доноров достоверно выше, чем в крови больных сахарным диабетом первого типа (1=5,76; р=0,0023, п=64).

Таблица 5

Результат титрования инсулинсвязывающей активности сывороток здоровых доноров и больных сахарным диабетом

% гликогемогло-бина, норма кэ&тгарав РПГА, норма % гликогемоглобина, сахарный диабет титра В РПГА, сахарный диабет

4,4 У 4,4 4,0 7 9 9 7 7,4 10,0 8,4 8,5 6 3 3 3

4,0 5,1 5.6 6,6 6 8 6 5 8,6 п,б 7,6 9,1 6 4 3 4

4,5 4,4 5,4 5Д Ю 6 5 6 9,5 ц 8,4 8.4 4 4 4 3

5,1 6,0 4,2 4,9 7 8 6 9 141 6,9 9Д 9.0 4 3 3 4

У 5,2 5,8 4,7 6 7 5 5 83 8,7 8,8 10,2 5 4 3 3.

4,5 43 6Д 5,8 6 9 И 6 10,5 8,8 V 93 5 4 4 3

5,4 5£ 4,6 7 7 5 6 7.4 9,2 7,6 8,9 3 5 4 2

4,7 4,1 4,4 4,8 10 6 7 5 6,7 6,8 9,4 9,1 4 5 3 2

53 5,8 5,9 5,3 7 6 5 6 9.3 113 7.9 8,8 4 5 4 3

5.0 5,5 4,9 6,4 7 5 10 7 11,0 8,4 8,9 8,5 3 5 5 3

4.6 6,0 43 5.5 6 6 8 6 10,6 9,5 103 8,0 4 4 4 -»

4.8 4,4 5.9 4.8 7 6 8 7 7.8 9,8 7.9 9,4 4 2 5 2

5,4 4,8 4,5 5.7 9 7 6 6 8,4 8,7 8.5 8.8 5 3 4 4

6,6 62 5,5 53 7 8 6 11 10,6 93 7,5 10,2 5 3 3 4

4,8 « 4,3 6Д Ё 7 8 7 7.8 ад 93 93 5 2 5 3

5,4 4,9 « 6,1 9 7 6 8 8,4 Щ1 112 8,9 5 2 4 4

5,23±0,21% 6,98+0,61 8,95±0,27% 3,86±0,47

Хроматографическое выделение и анализ гетерогенности связывающих инсулин компонентов сыворотки человека. На основании результатов сравнения концентраций специфичных к инсулину белков в крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом, высказано предположение о том, что аффинные к инсулину белки плазмы крови играют важную роль в доставке инсулина к тканям и снижение их титра в крови больных диабетом связано с формированием заболевания. На втором этапе исследований проведено выделение специфичных к инсулину белков из сывороток крови здоровых

доноров и больных сахарным диабетом на сорбенте с иммобилизованным инсулином, синтезированным на основе Поливиналя. Для изучения роли ионов цинка в формировании комплекса инсулина с белками плазмы, аффинную хроматографию проводили в присутствии (опыт) и в отсутствии (контроль) ионов цинка в буфере связывания. В опытной серии в состав 0,01М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 0,14 М хлорида натрия вводили 0,007 мМ хлорида цинка. Как следует из хроматограмм, приведенных на рисунке 2, связывание сывороточных транспортных белков с иммобилизованным инсулином происходит только в том случае, если в состав буфера связывания входят ионы цинка. При добавлении эквимолярных количеств хлорида кальция и магния связывания сывороточных белков с сорбентом не происходило.

Рис. 2. Влияние ионов цинка на эффективность взаимодействия транспортных белков крови с инсулином. Хроматограммы выделения инсулинсвязывающих компонентов сывороток здоровых доноров на сорбенте с иммобилизованным инсулином а) в присутствии ионов цинка в буфере связывания; б) в отсутствии ионов цинка в буферном растворе. I - сорбат; II - элюат.

ОП280

^ V (мл)

В выделенных аффинно фракциях связывающих инсулин белков, полученных из 1 мл сывороток здоровых доноров, содержание белка составило 0,062±0,003 мг/мл. В аналогичных фракциях, выделенных из сывороток крови больных сахарным диабетом, концентрация связывающих инсулин белков была достоверно ниже - 0,042±0,0025 мг/мл (1=4,35; р=0,008). Таким образом, в пробах, выделенпых аффинно на иммобилизованном инсулине из сывороток здоровых доноров, количество связывающих инсулин белков достоверно выше, чем в пробах больных сахарным диабетом. Полученные данные согласуются с результатами титрования инсулинсвязывающей активное™ исследованных сывороток (табл. 5).

Сравнительный анализ состава связывающих инсулин фракций сывороток здоровых доноров и больных сахарным диабетом. При сравнении спектров поглощения в ультрафиолетовой области выделенных аффинно связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом установлено, что пробы, выделенные из крови больных сахарным диабетом, имеют более выраженное поглощение в области 260 нм (рис. 3).

0.2250

Рис. 3. Спектры поглощения в ультрафиолетовой области связывающих инсулин фракций 1-здоровых доноров, 2- больных сахарным диабетом.

Соотношение опгаческих плотностей в области 260 и 280 нм (ОПая/ОП^) в пробах больных сахарным диабетом составило 1 Д09±0,042 по сравнению с

1,095±0,034 в норме. Проведение качественных реакций, выявляющих нуклеиновые кислоты и их компоненты, показало, что в связывающих инсулин фракциях плазмы крови эти соединения отсутствуют. В связи с этим было высказано предположение о том, что для инсулинсвязывающих белков больных сахарным диабетом характерно более высокое содержание углеводов.

Для оценки молекулярного веса и степени гетерогенности веществ, формирующих комплекс с инсулином, полученные пробы были разделены гельхроматографией на колонке с Сефадексом G-75, откалиброванной при помощи маркеров молекулярного веса фирмы Serva (Швеция). Гельхроматографию проводили при рН 2,8 (элюаты без нейтрализации) и при физиологическом значении рН. Как следует из хроматограммы, приведенной на рисунке 4 (I) , при рН 2,8 связывающие инсулин компоненты разделились по молекулярному весу на два пика. Первый пик имеет объем выхода, соответствующий молекулярному весу около 100 тысяч дальтон, и, вероятно, представлен сывороточными глобулинами. Соотношение ОПгво/ ОП28о этой фракции в норме составило 1,109, что свидетельствует о высоком содержании углеводов в веществах, формирующих эту фракцию. Второй пик представлен соединениями, молекулярный вес которых близок к 50 тысячам дальтон. Соотношение ОП260/ ОП280, равное 0,98 свидетельствует о меньшем содержании углеводов в этой фракции. Таким образом, данные гельхроматографии на Сефадексе-О-75 свидетельствуют о гетерогенности сывороточных компонентов, формирующих специфические комплексы с инсулином.

При хроматографии на той же колонке проб, полученных методом аффинной хроматографии после плавного доведения рН до 7,2, получен один пик, имеющий молекулярный вес более 100 тысяч Д. Вероятно, это свидетельствует о том, что при физиологических значениях рН связывающие инсулин белки ассоциируют, формируя единый комплекс (рисунок 4II).

Для оценки степени гетерогенности и идентификации в пробах известных транспортных веществ сыворотки крови по их электрофоретической подвижности, проведено электрофоре-тическое разделение полученных аффинно проб при рН 8,6

на ацетатцеллюлозных пленках. В таблице 6 приведен фракционный состав связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом.

I II

0П» ОПа,

¥ш

Ума

100

150

100

150

Рис. 4. Оценка гетерогенности связывающих инсулин белков крови методом гельхроматографии. Хроматограммы разделения инсулинсвязы-вающих белков, выделенных из сыворотки здорового донора ) и больного диабетом - (+), на сефадексе G-75.1 - при рН 2,8; П- при рН 7,2.

Как следует го данных таблицы 6, в связывающих инсулин белках сывороток больных сахарным диабетом в 2 раза больше у-глобулинов (41±1,83%) по сравнению с их количеством в связывающих инсулин белках здоровых доноров (21+0,95%). Возможно, это обусловлено повышенным содержанием специфичных к инсулину антител в крови больных сахарным диабетом. Полученные результаты согласуются с данными литературы о появлении в крови больных сахарным диабетом антител к инсулину (Atkinson et al., 1990). Присутствие в составе связывающих инсулин белков значительного количества у-глобулинов может свидетельствовать о том, что вьщеленная инсулин - связывающая фракция представлена иммунными комплексами. Для проверки этого предположения, провели рехроматографию выделенных фракции на сорбенте с иммобилизованным протеином А золотистого стафилококка, специфически связывающим иммуноглобулины. Как следует из хроматограмм, приведенных на рисунке 5, связывающие инсулин белки крови содержат две фракции: взаимодействующую (2) и не взаимодействующую (1) с протеином А.

Таблица 6.

Относительное содержание (%) белковых фракций связывающих инсулин белков крови, полученное методом электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках

Белковая фракция I II

Альбумин 25,9+1,75 0,0

агглобулин 0,0 21,5+1,12

а2 -глобулин 33,0+1,54 18,9±0,87

Р -глобулин 20,0± 1,26 18,5+1,07

у - глобулин 21,1 ±0,95 41,1+1,83

Содержание фракций в инсулинсвязывающих белках крови (%) I - здоровых доноров; II - больных сахарным диабетом;

Взаимодействующая с протеином А фракция инсулинсвязывающих белков здоровых доноров составляет не более 20% от их общего содержания, в то время как в пробах инсулинсвязывающих белков больных сахарным диабетом она достигает 50% (различие доказано с использованием критерия Стьюдента, 1=3,43; р=0,028). Вероятно, эта фракция представлена иммунными комплексами. Фракция невзаимодействующих с протеином А белков, вероятно, представляет собой белки крови, осуществляющие транспорт инсулина.

Обращает на себя внимание тот факт, что в норме значительная часть связанного с инсулином белка сыворотки (25,9± 1,75%, табл. 6) представлена альбумином, или белком, имеющим ту же электрофоретическую подвижность.

Рис. 5. Выделение иммунных комплексов из связывающих инсулин белков здоровых доноров на протеине A Staphylococcus aureus. I - первый цикл выделения взаимодействующей с протеином А фракции; П -рехроматография сорбата, полученного в первом цикле. 1 -сорбат, 2-элюат, содержащий иммунные комплексы.

При сахарном диабете первого типа этот транспортный белок в связывании с инсулином участия не принимает: в комплексе связывающих инсулин веществ, выделенном из сывороток больных сахарным диабетом альбумин не выявлен. Электрофорегически наиболее подвижной фракцией связывающих инсулин гликопротеинов больных сахарным диабетом является агглобулин, содержание которого составило 21,5±1,12%. В нормальных сыворотках инсулинсвязываюхцие вещества с этой электрофоретической подвижностью отсутствуют.

В инсулинсвязывающей фракции здоровых доноров выявлено примерно двукратное превышение содержания фракции с подвижностью ач-глобулина по сравнению со связывающей инсулин фракцией больных сахарным диабетом (32,2+1,54% по сравнению с 18,1±1,07%, табл. 6). Различие связывающих инсулин компонентов сывороток здоровых доноров и больных сахарным диабетом в содержании р -глобулинов

оказалось не достоверным (20,8±1,26% в пробах здоровых доноров по сравнению с 18,9±1,07% в пробах больных сахарным диабетом).

На основании анализа электрофореграмм было сделано предположение о присутствии в пробах связывающих инсулин белков здоровых доноров альбумина и транспортных белков крови с подвижностью а2 -глобулинов и р-глобулинов. Кроме того, было высказано предположение о том, что связывающие инсулин фракции больных сахарным диабетом содержат белки острой фазы воспалительной реакции, обладающие подвижностью агптобулинов, и транспортные белки с подвижностью р-глобулинов. Для проверки высказанных предположений использованы методы иммунофер-ментного анализа и иммунонефелометрии.

Методом иммуноферментного анализа установлено, что в пробах здоровых доноров содержится 0,015±0,0007 мг/мл альбумина, во фракциях связывающих инсулин белков крови больных диабетом этот транспортный белок не выявлен, что согласуется с данными элекгрофоретиче-ского разделения полученных проб. По данным иммуноферментного анализа, пробы, выделенные из крови здоровых доноров содержат 6,7±0,3 нг/мл а-фетопротеина- гликопротеина крови с подвижностью ос-глобулинов с доказанной транспортной, иммуномодулирующей и деток-сицирующей функцией (Parmelee et. al., 1978; Hirohashi et. al., 1979; Savu et. al, 1981; Tyner et. al., 1990; Melbye et. al, 2000; Smith et.al, 2006; Mize-jewski et. al, 2007). Присутствие а-фетопротеина в пробах, выделенных из крови больных сахарным диабетом не выявлено. Методом иммунонефелометрии в пробах связывающих инсулин белков больных диабетом и здоровых доноров обнаружен трансферин - транспортный белок крови с подвижностью Р-глобулинов, что согласуется с результатами Н.К. Грачевой и соавторов (1972). Достоверных различий содержания трансферина в пробах больных сахарным диабетом и здоровых доноров не выявлено. Трансферин, согласно современным представлениям, относится к классу липокалинов и принимает участие в транспорте широкого спектра биологически активных соединений (Flower et al, 1996).

При помощи метода иммунонефелометрии также показано, что в выделенных аффинным методом комплексах связывающих инсулин белков сыворотки крови больных сахарным диабетом присутствует белок острой фазы воспалительной реакции - агкислый гликопротеин

(орозомуковд). В норме а]-кислый гликопротеин содержится в связывающих инсулин фракциях лишь в следовых количествах..

Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод о том, что в крови здоровых доноров в состав связывающего инсулин комплекса входят транспортные белки, в том числе, альбумин, а-фетопротеин и трансферин (Гарипова, 2007 б). Установлено, что состав белков связывающего инсулин комплекса при сахарном диабете первого типа достоверно изменяется. Альбумин и а-фетопротеин присутствующие в комплексе в норме, в пробах, выделенных из крови больных диабетом, выявляются лишь в следовых количествах и замещаются а^кислым гли-копротеином и, возможно, другими, не идентифицированными белками.

Различия состава белков, формирующих комплекс с инсулином, в норме и при диабете подтверждаются различием их аминокислотного состава и различным содержанием углеводного компонента в их молекулах. Установлено, что в гликопротеидах, взаимодействующих с инсулином в крови больных сахарным диабетом, снижено по сравнению с нормой, содержание ароматических аминокислот. При использовании в качестве стандарта раствора фенилаланина, установлено, что в пробах здоровых доноров содержание ароматических аминокислот составляет 0,0064±0,0002 мг/мг, по сравнению с 0,0003 6±0,0005 мг/мг во фракциях больных сахарным диабетом. Аналогичный результат был получен при сравнении в связывающих инсулин фракциях здоровых доноров и больных сахарным диабетом количества серосодержащих аминокислот. Содержание цистеина в пробах из сывороток здоровых доноров было достоверно выше, чем в пробах больных сахарным диабетом (0,0048±0,00008 мг/мг, по сравнению с 0,00021±0,00007 мг/мг).

Таким образом, белковый компонент связывающих инсулин фракций плазмы крови больных сахарным диабетом, очевидно, обладает небогатым разнообразием аминокислотного состава, что характерно для транспортных гликопротеидов крови (Марри, 1993). В составе белковой части молекул, образующих комплекс с инсулином в сыворотке крови здоровых доноров, присутствует больше ароматических и серосодержащих аминокислот. Это, вероятно, подтверждает предположение о присутствии в комплексе связывающих инсулин белков

здоровых доноров, наряду с транспортными гликопротеидами, альбумина. Проведено количественное определение углеводов в пробах связывающих инсулин фракций крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом. Установлено, что в пробах здоровых доноров содержание углеводов составляет 0,00128±0,0004 мг (около 20% по отношению к содержанию белка в пробе), в пробах больных сахарным диабетом - 0,00192±0,0002 мг (40%).

Выявление в связывающем инсулин комплексе лнпидов и гормонов первой и второй групп. Наличие у связывающих инсулин белков свойств, характерных для липокалинов, послужило основанием для изучения содержания в полученных фракциях ли-пидных структур и гидрофобных гормонов. В полученных аффин-но связывающих инсулин фракциях проведено определение холе-стерола и триглицеридов. В пробах здоровых доноров содержание холестерола составило 0,07±0,0004 ммоль/л, в пробах больных сахарным диабетом - 0,08+0,0007 ммоль/л. В связывающих инсулин фракциях здоровых доноров выявлено 0,1010±0,003 ммоль/л триглицеридов, во фракциях больных диабетом -0,0944±0,0025 ммоль/л. Установлено, что в связывающих инсулин фракциях сыворотки крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом присутствуют следующие гидрофобные гормоны: тироксин (11,0±0,5 нмоль/л), трийодтиронин (1,3 ±0,06 нмоль/л), тестостерон (7,0±0,03 нмоль/л). Достоверного различия в содержании ли-пидов и гидрофобных гормонов во фракциях здоровых доноров и больных сахарным диабетом не выявлено.

В то же время, в составе связывающих инсулин фракций выявлены незначительные количества белковых гормонов: 1МЕ/мл лютеинизирующего гормона, 0,03 мкМЕ/мл тирео-тропного гормона, 0,5МЕ/мл пролактина (Гарипова, 2007). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что выделенные на иммобилизованном инсулине белки, формируют ядро транспортного комплекса, переносящего в плазме крови не только гидрофобные соединения, но и белковые гормоны. Биологическое значение существования выявленного транспортного комплекса может заключаться в повышении надежности доставки гормонов к клеткам-мишеням за счет использования дублирующего механизма их связывания

с клетками-мишенями с участием транспортных гликопротеидов и их клеточных рецепторов.

Изучение иммуномодулирующих свойств связывающих инсулин белков сыворотки крови. Присутствие в связывающих инсулин фракциях а-фетопротеина и сц-кислого гликопротеина, обладающих иммуномодулирующим действием (Lester et. al., 1976, Sheppard et. al., 1977, Sell et. al., 1977, Lu et. al., 1984, Fleischer et.al., 1988, Pinheiro et. al., 1992, Mizejewski, 2004, Cavin et. al., 2004, Smith etal., 2006), послужило основанием для изучения иммуномодулирующих свойств выделенных фракций. Исследование проведено на модели иммунизации белых лабораторных мышей дифтерийным анатоксином. Проведена иммунизация трех групп белых лабораторных мышей: двух опытных и контрольной. Мышей всех групп трехкратно иммунизировали дифтерийным анатоксином. В опыте 1 мышей иммунизировали анатоксином с добавлением инсулинсвязывающих гликопротеидов, выделенных из сывороток крови здоровых доноров, в опыте 2 - при добавлении аналогичной фракции из крови больных сахарным диабетом. Полученные антисыворотки к дифтерийному анатоксину оттитрованы в реакции пассивной гемагглютинации с диагностикумом, выявляющим антитела к дифтерийному анатоксину.

Как следует из данных, приведенных на рисунке 6, среднее значение титра антител к дифтерийному токсину в опыте 1 достоверно ниже этого показателя, определенного в контроле. Среднее значение логарифма (log2) титра в опыте 1 составило 3,76±0,31, в контроле - 6,44±0,39 (различие достоверно с р=0,00035, ti=10,55). Достоверного влияния связывающих инсулин белков крови больных сахарным диабетом на концентрацию антител к дифтерийному анатоксину не выявлено: концентрация противодифтерийных антител в опыте 2 составила 6,20±0,34 по сравнению с 6,44±0,39 в контроле (t2 =1,43; р—0,159). Таким образом, концентрация антител к дифтерийному анатоксину в опытной группе с проведением иммунизации на фоне связывающих инсулин белков крови здоровых доноров достоверно ниже, чем в группе контрольных мышей. Следовательно, транспортные белки, на фоне которых проводилась иммунизация, вызвали достоверное снижение иммунного ответа к дифтерийному анатоксину.

Вероятно, это свидетельствует о наличии у них иммуносупрессирую-щих свойств.

Рис. 6. Исследование иммуномодулирующего действия связывающих инсулин фракций крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом. Средняя концентрация противодифтерийных антител: 1 - в контрольной группе мышей; 2 - в опыте 1 (иммунизация мышей дифтерийным анатоксином на фоне связывающих инсулин белков здоровых доноров); 3 - в опыте 2 (иммунизация мышей дифтерийньш анатоксином на фоне связывающих инсулин белков больных сахарным диабетом).

Биологическое значение подавляющего иммунный ответ действия изучаемых белков крови, очевидно, заключается в предотвращении аутоиммунных реакций к гормонам и биологически активным веществам, входящим в состав транспортного комплекса. Возможно, иммуносупрессирующие свойства белков транспортирующего гормоны комплекса объясняются присутствием в их составе а-фетопротеина, в норме выполняющего функцию защиты инсулина и других присутствующих в комплексе гормонов от распознавания клетками иммунной системы. Возможно, отсутствие иммуно-супрессивного действия белков транспортного омплекса при сахарном диабете первого типа объясняется замещением в его

составе а-фетопротеина белком острой фазы воспалительной реакции кислым аг гликопротеином.

Л А АЛ А

Экспериментально доказано, что в крови человека при участии ионов цинка инсулин вовлекается в сложные межмолекулярные взаимодействия с транспортными белками крови и связывается с поверхностью эритроцитов. Таким образом, инсулин транспортируется в крови при участии двух механизмов: сывороточного и эрит-роцитарного. Значение коэффициента распределения инсулина между эритроном и плазмой крови, в норме составляющее 0,49±0,005, свидетельствует о преобладании в крови здоровых доноров транспорта гормона плазмой крови. Значительно больший вклад сывороточного транспорта в доставку инсулина по сравнению с транспортом других белковых гормонов, свидетельствует о биологической целесообразности снижения его связывания с эритроцитами и включения в транспортирующий гормоны комплекс сыворотки.

Показано, что в норме связывающие инсулин белки плазмы крови обладают иммуносупрессирующими свойствами. Вероятно, биологическое значение включения инсулина в сывороточный комплекс заключается в его защите от аутоиммунного распознавания и в повышении эффективности доставки гормона к клеткам-мишеням. Необходимость взаимодействия инсулина с транспортными белками плазмы крови, возможно, объясняется наличием в его структуре антигенных детерминант, хорошо распознаваемых собственной иммунной системой. Это предположение подтверждается существованием в крови человека транспортных молекул у антигенно родственных инсулину гормонов релаксина (Tager, 1984) и инсулинопо-добных факторов роста 1 и 2 (Suikkari et.al., 1988; Lee et.al., 1989).

содержащегося в сыворотке трийодтиронина, значительный процент тестостерона и других гидрофобных гормонов, а также некоторое количество белковых (пролактина) и гликопротеидных (лютеинизирующего и тиреотропного) гормонов. Можно предположить, что транспортный комплекс содержит оптимальное для клеток соотношение гормонов и его биологическое значение заключается в обеспечении дублирующего механизма доставки гормонов за счет клеточных рецепторов к транспортным белкам.

Наряду с транспортирующим гормоны комплексом, инсулин включается также в иммунные комплексы, количественно более представленные в связывающей инсулин фракции больных сахарным диабетом. Показано, что при сахарном диабете первого типа альбумин и а-фетопротеин замещаются в транспортном комплексе сыворотки крови СХ]-глобулинами, в частности, белком острой фазы воспалительной реакции «гкислым гликопротеином. Это приводит к практическому исчезновению иммуносупрессивных свойств белков ядра транспортного комплекса. Изменение состава белков транспортного комплекса при сахарном диабете, вероятно, является также причиной снижения включения в него инсулина и компенсаторного возрастания связывания инсулина с эритроном.

Так как инсулин включается в транспортный комплекс наряду с другими гормонами, правомерно предположить, что при сахарном диабете первого типа нарушается доставка к клеткам-мишеням не только инсулина, но и других входящих в комплекс гормонов. Возможно, это объясняет многочисленные примеры из клинической практики, свидетельствующие о том, что сахарный диабет первого типа часто сочетается с другими аутоиммунными поражениями эндокринной системы.

выводы

¡.Установлено, что особенность транспорта инсулина в крови человека, в сравнении с транспортом других белковых гормонов, заключается в равноценном вкладе в доставку гормона к клеткам - мишеням эритроцитарной и сывороточной транспортных систем.

2. При сахарном диабете первого типа наблюдается достоверное увеличение вклада эритроцитарной системы в доставку инсулина к периферическим тканям, обусловленное снижением его взаимодействия с транспортными белками крови.

3. Разработан и запатентован новый метод синтеза матрицы для аффинной хроматографии, позволяющий получить сорбент с иммобилизованным инсулином, не загрязняющий выделенные связывающие инсулин белки продуктами расщепления полисахаридной матрицы.

4. Показано, что сорбенты, синтезированные на основе нового носителя, обладают высокой специфической емкостью, низкой неспецифической сорбцией, лучшими, по сравнению с бромциан-Сефарозой 4В, гидродинамическими свойствами и повышенной стабильностью.

5. Синтезирован и запатентован сорбент с иммобилизованной фе-нилбороновой кислотой, на его основе создана диагностическая система для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека.

6. Разработан метод определения концентрации связывающих инсулин белков сыворотки крови в реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитами, сенсибилизированными инсулином. Установлено, что концентрация связывающих инсулин белков в сыворотке крови здоровых доноров достоверно выше, чем в сыворотках больных сахарным диабетом первого типа

7. Показано, что транспортирующие инсулин белки плазмы крови при физиологических значениях рН формируют транспортный комплекс, ядро которого в норме формируют альбумин, а- фетопротеин и трансферин, для включения инсулина в транспортный комплекс необходимо присутствие ионов цинка.

8. При сахарном диабете первого типа альбумин и а-фетопротеин замещаются в транспортирующем инсулин комплексе сыворотки крови белком острой фазы воспалительной реакции кислым аг гликопротеином.

9. Показано, что наряду с инсулином, в сывороточный транспортный комплекс включаются гидрофобные (тироксин, трийодтиронин, тестостерон) и гидрофильные (тиреотропный гормон, пролактин, лютеинизирующий гормон) гормоны, а также триглицериды и холестерол.

10. Доказано, что белки транспортирующего инсулин комплекса здоровых доноров обладают иммуносупрессивным действием.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК

1. Гарипова М.И., Фазлыева В.А., Беишев Я.Х., Хавкин Ю.А. Высокочувствительный вариант изоэлектрического фокусирования с иммунопроявлением // Лабораторное дело (Клиническая и лабораторная диагностика).-1984.-№3 .-С. 159-162.

2. Зайцев Е.М., Свиридов В.В., Гарипова М.И., Титова Н.Г., Лебедев B.C. Исследование молекулярной гетерогенности моноклональных и поликлональных антител к дифтерийному токсину. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-1985.-№2.-С.37-41.

3. Гарипова М.И., Фролова И.С., Клеева О.Б., Кузнецов В.П. Новый иммуносорбент на основе поливинилового спирта для очистки интерферона. // Доклады академии наук России.-1993.-Т.328.-№6.-736-739.

4. Гарипова М.И., Фролова И.С., Клеева О.Б., Кузнецов В.П. Иммуносорбент для очистки интерферона. // Вопросы вирусологии.-1993 .-Т.З 8.-№3 .-С. 129,-132.

5. Гарипова М.И. Применение аффинных. сорбентов повышенной стабильности в биотехнологии. // Вестник Башкирского университета.-1998.-№ 1 .-С.41 -44.

6. Гарипова М.И., Баранова М.В., Штыкова Л.И. Аффинное выделение инсулинсвязывающего компонента сыворотки крови человека и изучение его биохимической природы. // Вестник Башкирского университета.-2005.-№2.-С. 46-48.

7. Гарипова М.И., Умнова В.Ю., Штыкова Л.И. Инсулинсвязывающий компонент сыворотки человека в норме и при заболевании сахарным диабетом первого типа. // Вестник Башкирского университета.-2005.-№4.-С.44-46.

8. Гарипова М.И. Изучение механизмов транспорта инсулина в крови человека. // Вестник Оренбургского государственного университета ,-2007.-№ 75.-С.72-74.

9. Гарипова М.И., Ибрагимов Р.И., Умнова В.Ю., Штыкова Л.И. Инсулинсвязывающий компонент сыворотки крови человека в норме и при заболевании сахарным диабетом первого типа. //Клиническая и лабораторная диагностика. -2008.-№4.-С. 44-45.

Монография

Ю.Гарипова М.И. Транспорт инсулина в крови человека. -Уфа.-РЩ БашГУ.-2007.-127 С.

Патенты и авторские свидетельства

11. Гарипова М.И., Леплянин Г.В., Антонова Л.Ф., Хавкин Ю.А. Способ получения иммобилизованных белков. Авторское свидетельство № 1500670.-1989.

12. Гарипова М.И., Басченко И.А., Еркеева И.А., Шигапова А.И. Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений. Авторское свидетельство № 1789532 22.09.1992.

13. Гарипова М.И., Толстиков Г.А., Монаков Ю.Б., Басченко И.А., Юсупова Ф.Г. Сшитый поливиниловый спирт с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина.- Патент на изобретение №20935525.2002.

14. Гарипова М.И., Давидович М.Г. Пористый силикагель, модифицированный глицерилпропилсиланом и эпихлоргидрином с иммобилизованной мета- аминофенилбороновой кислотой в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина. «Изобретения и полезные модели».- 2004.-Ш7.-С.564-565. Патент на изобретение № 2231059, зарегистрирован 20.06.2004.

Статьи, материалы, тезисы

15.Гарипова М.И. Изучение изоэлектрических спектров иммуноглобулинов класса Д больных множественной миеломой. // Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР-Уфа.-1983.-С.185.

16. Гарипова М.И. Антигенные варианты иммуноглобулинов класса Д человека.- // Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР-Уфа.-1983 .-С.186.

17. Гарипова М.И., Киреева Т.А., Басченко И.А., Хавкин Ю.А.-Изучение влияния заряда антигена на спектротип антител. // Аффинная хроматография антител-теоретические и прикладные аспекты. 1 Всесоюзная конференция .-Москва-1983.-с.253.

18.Гарипова М.И., Хавкин Ю.А., Свиридов В.В., Зайцев Е.М. Принципы конструирования иммунопрепаратов на основе моноклональных (гибридомных) антител. //Новые направления в биотехнологии. 1 Всесоюзная конференция.-Пущино.-1984.-е. 107.

19. Гарипова М.И. Изучение влияния заряда антигена на спектротипы антител. //Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР.-Уфа.-1985.-С.152.

20. Гарипова М.И. Методы повышения чувствительности изоэлектрического фокусирования. // Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР.-Уфа.-1985.-С.153.

21. Гарипова М.И. Формирование пористой структуры поливинилового спирта с заданными свойствами. // Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР.-Уфа.-1985.-С.154.

22. Гарипова М.И., Киреева Т.А., Хавкин Ю.А. Исследование молекулярной гетерогенности моноклональных и поликлональных антител. // 5 Всесоюзный биохимический съезд.-1986.-С.34.

23. Гарипова М.И., Басченко И.А., Смирнова H.H. Особенности биоаффинных взаимодействий на ферромагнитных носителях. //5 конференция молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии.-Пущино.-1988.-С.138.

24. Гарипова М.И., Басченко И.А., Сысоева Л.Б. Аффинные сорбенты на основе поливинилового спирта. // Изучение и рациональное использование природных ресурсов.-Уфа.-1991.-С.95.

25. Гарипова М.И., Еркеева И.А., Басченко И.А., Сысоева Л.Б. Выделение и очистка на иммобилизованной гиалуроновой кислоте гиалуронидазы семенников северного оленя. // Изучение и рациональное использование природных ресурсов.-Уфа.-1991.-С.97.

26. Гарипова .И.. Басченко И. А., Юсупова Ф.Г., Маннанова Г.В. Определение гликогемоглобина аффинным методом и его диагностическое значение для выявления сахарного диабета. // Изучение и рациональное использование природных ресурсов.-Уфа,-1991.-С.98.

27. Гарипова М.И., Басченко И.А., Монаков Ю.Б. Иммуносорбент на основе поливинилового спирта. // 1 съезд иммунологов России,-Новосибирск.-1992.-с.86.

28. Гарипова М.И. Разработка аффинной диагностической системы для определения гликогемоглобина в капиллярной крови человека. // Сб. «Современные проблемы эволюционной морфологии и физиологии».-Уфа.-1996.-С.59-63.

29. Гарипова М.И. Аффинные сорбенты повышенной стабильности и их использование в биотехнологии и медицинской диагностике. // Сб. «Современные проблемы эволюционной морфологии и физиологии».-Уфа.-1996.-С.85-89.

30. Гарипова М.И. Бобкова Е.В. Использование сорбента, устойчивого к биодеградации, для аффинного выделения гамма-интерферона. // Сб. «Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.-1996.-с.56.

31. Хафизова Л.Г, Гарипова М.И, Бобкова Е.В. Выделение фактора переноса, имеющего сайты аффинного связывания с поверхностными антигенами Candida Albicans. // Сб. «Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.-1996.-с.57.

32. Гарипова М.И. Проблемы и перспективы применения аффинной хроматографии в биотехнологии. // Сб. «Результаты научных исследований биологического факультета Башкирского гос. универсигета».-1997.-С.7-9.

33. Гарипова М.И. Информативность и методы определения гликозилированного гемоглобина при состояниях, не связанных с сахарным диабетом. // Сб. «Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета-1997.-е. 101-103.

34. Гарипова М.И, Басченко И.А, Зарудий Ф.Х, Давлетов Э.Г. Разработка аффинного метода определения гликозилированного гемоглобина в крови человека. // Здравоохранение Башкортостана.-1997.-№6.-С.55-57.

35. Гарипова М.И. Использование интегральных методов для выявления нарушений углеводного обмена. // Конференция по научно-техническим программам Минобразования России.-1997.-c.58-61.

36. Garipova M.I, Kalimullina L.B. Estimation of tissue metabolism damage and approach to it's correction. // 33 International Congress of Physiologica Science.-St.Petersburg.-1997.-p.543.

37. Гарипова М.И., Басченко И.А. Метод оценки влияния экологияческих факторов на организм человека. // 3-й съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока-Новосибирскю-1997.-c.36

38. Хафизова Л.Г., Гарипова М.И., Бобкова Е.В. Повторное использование лейкоцитов после вирусиндуцированного синтеза интерферона для получения препарата с активностью фактора переноса. //Сб. «Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.-1998.-с.140-142..

39. Гарипова М.И., Габдуллина 3.3., Веселов С.Ю. Иммуноопределение с использованием метки коллоидным золотом с серебряным усилением. //Сб. «Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.-1998.-с.126-1129.

40. Гарипова М.И.. Метод оценки влияния экологических факторов на организм человека. // 3-й съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока-Новосибирск. -1997.-е. 36.

41. Гарипова М.И. Сб. Применение интегральных методов оценки состояния углеводного обмена для раннего выявления дезадаптаций человека. //Сб. Экология человека в свете проблем городской антропоэкосистемы.-Уфа,-1998.-С.42-61.

42. Гарипова М.И., Сысоева Л.Б. Применимость аффинного определения гликозилированного гемоглобина доя диагностики сахарного диабета. // Сб. Итога научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета,- Уфа-1999.-С171-173.

43. Гарипова М.И., Луканин A.C. Показатель, позволяющий прогнозировать тип заживления послеоперационных ран. // Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей.-2001.-С.Петербург.- с.25-26.

44. Гарипова М.И. Применение интегральных показателей состояния углеводного обмена в исследованиях по экологии человека. // Материалы конференции «Экологические, морфологические особенности и современные методы исследования живых систем».- Казань.-2003.-с.62-63.

45. Гарипова М.И., Ибрагимов Р.И., Умнова В.Ю., Штыкова Л.И. Инсулинсвязывающий компонент сыворотки человека в норме и при заболевании сахарным диабетом. // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Достижения биологической функционологии и их место в практике образования»,- Самара.-2003.-с.62-63.

46. Гарипова М.И., Киреева H.A., Моругова Т.В., Елисеева О.С., Першииа A.C., Аффинное выделение связывающих инсулин сывороточных гликопротеидов человека и изучение их состава в норме и при сахарном диабете первого типа. //Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова - 2007.-т.З.-№1.-с 27-32.

47. Елисеева О.С., Киреева H.A., Гарипова М.И. Состав связывающих инсулин транспортных белков крови человека. // Материалы международной научной конференции «Проблемы биоэкологи и пути их решения».-Саранск.-2(Ю8.-С.303-305.

48. Першина A.C., Киреева H.A., Гарипова М.И. Соотношение эршроцитарного и сывороточного транспорта инсулина. // Материалы международной научной конференции «Проблемы биоэкологи и пути их решения»,- Саранск.-2008.-С.318-319.

Гарипова Маргарита Ивановна

ИНСУЛИН-ТРАНСПОРТИРУЮЩИЕ СИСТЕМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ ПЕРВОГО ТИПА. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Лицензия на издательскую деятельность ЛР № 021319 от 05.01.99 г.

Подписано в печать 26. 01.2009 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2,53. Уч.-год. л. 2,03. Тираж 120 экз. Заказ 30.

Редакционно-издателъский центр Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. ЗакиВалиди, 32.

Отпечатано на множительном участке Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гарипова, Маргарита Ивановна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Транспорт гормонов первой группы в плазме 18 крови человека

1.1. Липокалины

1.2. Транспортные белки крови, не относящиеся к липокали- 33 нам

Глава 2. Гормондепонирующая функция эритроцитов и транс- 35 порт гормонов второй группы.

Глава 3. Особенности транспорта инсулина в крови человека.

Глава 4. Применение аффинной хроматографии в медицине 43 и биотехнологии

4.1 .Виды аффинной хроматографии

4.2. Носители для аффинной хроматографии и методы 49 их активации

4.3. Использование поливинилового спирта в медицине и 54 биотехнологии

4.4. Аналитические системы на основе аффинных сорбентов 56 ЧАСТЬ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 5. Объекты исследований, реактивы и материалы 61 5.1. Принципы формирования групп добровольцев при изуче- 61 нии системы транспорта инсулина в норме и при сахарном диабете первого типа

5.2.0сновные реактивы для синтеза аффинных сорбентов

5.3. Реагенты белковой природы и иммунологические препа

Глава 6. Методы исследований

6.1. Химические методы

6.1.1. Синтез аффинных сорбентов

6.1.2. Качественное определение альдегидных групп активи- 65 рованного глутаровым альдегидом ПВС-носителя

6.1.3. Определение оксирановых групп ПВС-носителя 65 6.1.4 Получение диазопроизводного овальбумина

6.2. Хроматографические методы

6.2.1. Иммуноаффинное извлечение антигенных примесей из препаратов человеческого лейкоцитарного интерферона

6.2.2. Выделение иммуноглобулинов (иммунных комплексов) 68 из фракций связывающих инсулин белков

6.2.3. Выделение антител к овальбумину на иммобилизован- 68 ном антигене

6.2.4. Аффинное определение гликозилированного гемогло- 68 бина

6.2.4.1. Приготовление гемолизатов

6.2.4.2. Хроматографическое выделение гликозилированного 69 гемоглобина на сорбенте, содержащем дигидроксиборильные группы

6.2.5. Определение фракции НЬА1С гемоглобина методом 71 высокоэффективной ионообменной хроматографии

6.2.6. Иммобилизация инсулина на активированной бромциа- 71 ном матрице

6.2.7. Проведение хроматографического выделения связы- 72 вающих инсулин белков сыворотки человека

6.2.8. Проведение гельхроматографии

6.3. Иммуноферментный анализ

6.4. Иммунолюминесцентное определение гормонов

6.5. Количественная оценка инсулинсвязывающей активности 76 сыворотки крови

6.5.1. Формалинизация эритроцитов

6.5.2. Приготовление эритроцитарных диагностикумов

6.5.3. Определение концентрации связывающих инсулин бел- 78 ков крови в реакции пассивной гемагглютинации

6.5.4.Титрование антител к овальбумину в реакции пассивной 78 гемагглютинации

6.5.5. Определение овальбумина в реакции торможения пас- 79 сивной гемагглютинации

6.6. Анализ спектров поглощения проб в ультрафиолетовой 80 области спектра

6.7. Проведение электрофореза ^

6.7.1. Метод проведения электрофореза белков на ацетатцел- 80 люлозных пленках

6.8. Изоэлектрическое фокусирование с иммунопроявлением

6.8.1. Подготовка стеклянной подложки

6.8.2. Формирование геля

6.8.3. Проведение изоэлектрического фокусирования

6.8.4. Фиксация и окраска белков

6.9. Качественное выявление углеводного, белкового и ли-пидного компонентов в связывающей инсулин фракции сы- 85 воротки крови

6.9.1 .Метод определения холестерина в пробе

6.9.2. Метод определения триглицеридов

6.9.3. Определение концентрации глюкозы ферментативным 86 методом

6.10. Оценка иммуномодулирующих свойств компонентов сыворотки, связывающих инсулин

6.10.1 .Изучение влияния связывающих инсулин белков крови 88 здоровых доноров и больных сахарным диабетом на титры мышиных антител к дифтерийному анатоксину 6.10.2. Оценка модулирующего действия хондроитинсульфата 90 на действие инсулина на перитонеальные мышиные макрофаги in vitro

6.11 .Определение коэффициента распределения инсулина между поверхностью эритроцитов и плазмой крови 6.12.Определение aj - кислого гликопротеина и трансферина 95 методом нефелометрии

6. 13. Разработка методов синтеза аффинных сорбентов на ос- 96 нове гелей поливинилового спирта

6.13.1. Стабилизация гелей ПВС

6.13.1.1. Стабилизация гелей ПВС глутаровым альдегидом

6.13.1.2. Стабилизация гелей ПВС эпихлоргидрином

6.13.2. Синтез аффинных сорбентов на основе Поливиналя и их использование в условиях лаборатории

6.13.2.1. Оптимизация условий иммобилизации белковых ли- 110 гандов на Поливинале

6.13.2.2. Оптимизация условий проведения аффинной хрома- 113 тографии

6.13.3. Испытания сорбентов на основе Поливиналя в услови- 117 ях биотехнологического производства

6.14. Использование сорбента на основе Поливиналя с дигид- 135 роксиборильными группами для количественного определения гликозилированного гемоглобина в капиллярной крови человека

6.14.1. Синтез и лабораторные испытания сорбента для коли- 136 чественного определения гликогемоглобина

6.14.2 Оценка достоверности и воспроизводимости количест- 139 венного определения гликозилированного гемоглобина на полученном сорбенте

6.14.3. Исследование природы фракции гемоглобина, взаи- 144 модействующей с сорбентом Поливиналь-м-АФБК

6.14.4. Клинические испытания аффинного сорбента для оп- 145 ределения гликогемоглобина в крови человека

6.15. Статистическая обработка экспериментальных данных 152 ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 7. Соотношение вкладов эритроцитарной и сывороточ- 153 ной систем в транспорт инсулина и ряда гормонов первой и второй групп.

7.1. Распределения инсулина между поверхностью эритроци- 154 тов и плазмой крови.

7.2. Изучение распределения между поверхностью эритроци- 157 тов и плазмой крови гормонов первой и второй групп.

Глава 8. Выявление, аффинное выделение и анализ гетеро- 164 генности связывающих инсулин компонентов плазмы крови 8.1. Сравнение инсулинсвязывающей активности плазмы кро- 164 ви здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого

8.2. Хроматографическое выделение связывающих инсулин 168 компонентов плазмы крови человека.

8.2.1. Изучение роли ионов цинка в формировании комплекса 169 инсулина и транспортных белков.

8.3. Спектрофотометрическое изучение связывающих инсу- 172 лин фракций сывороток здоровых доноров и больных сахарным диабетом

8.4. Электрофоретические спектры связывающих инсулин 179 компонентов сыворотки крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом

Глава 9. Структурный анализ связывающих инсулин белков 188 плазмы крови

9.1. Углеводный, белковый и липидный компоненты связы- 188 вающей инсулин фракции сыворотки крови

9.1.1. Особенности структуры белковой области связываю- 189 щих инсулин компонентов плазмы крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом

9.1.2. Углеводный компонент инсулинсвязывающих белков 190 крови в норме и при сахарном диабете

9.1.3. Липидный компонент связывающего инсулин комплек- 192 са белков крови

9.2. Изучение модулирующего действия инсулинсвязываю- 193 щих белков крови

9.2.1 .Влияние связывающих инсулин белков крови здоровых 193 доноров и больных сахарным диабетом на титры мышиных антител к дифтерийному анатоксину

9.2.2. Влияние хондроэтинсульфата на эффект добавления инсулина в культуру мышиных перитонеальных макрофагов

Глава 10. Гормоны, входящие в состав связывающего инсулин комплекса

10.1. Содержание в составе связывающего инсулин комплекса 200 гормонов первой группы

10.2. Гормоны второй группы, входящие в состав связываю- 201 щего инсулин комплекса

Введение Диссертация по биологии, на тему "Инсулин-транспортирующие системы крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа. Теоретические и прикладные аспекты"

Актуальность темы. Несмотря на то, что инсулин был первым белком с доказанной гормональной активностью (Abel, 1926), механизм его транспорта в крови во многом остается неясным до настоящего времени. Из данных литературы следует, что в транспорте инсулина принимают участие два механизма.

В сыворотке крови инсулин транспортируется в составе двух фракций: "свободного" и "связанного" инсулина (Касаткина, 1996). Состав и свойства белков, формирующих фракцию связанного инсулина, изучены недостаточно. По мнению Н.К. Грачевой и соавторов (Грачева и др., 1972), "связанный инсулин" формируется за счет взаимодействия гормона с транс-ферином. Однако, ввиду использования авторами физико-химических методов выделения содержащих инсулин фракций, возникает сомнение в том, что выделены все из них. Не ясно также, находится ли свободный инсулин, действующий на мышцы и печень, в истинно свободном состоянии, или же он формирует лабильный комплекс с белками крови (Старосельцева и др., 1983, Марри и др., 1993, Касаткина, 1996, Покровский, 2007).

Второй механизм транспорта инсулина, по данным литературы, заключается в доставке гормона к периферическим тканям в комплексе со специфическими рецепторами плазматической мембраны эритроцитов. В работах ряда авторов показано, что эритроциты крови человека и животных участвуют в транспорте инсулина наряду с плазмой и формируют его депо, из которого инсулин поступает в плазму крови и ткани в ответ на повышение уровня глюкозы, молочной кислоты и под влиянием физико-химических факторов (Сандуляк, 1972; Доломатов, 1999; Картун и др., 2000; Запорожан и др., 2001).

В то же время, несмотря, на успехи в изучении этиологии сахарного диабета и создание новых препаративных форм инсулина, сахарный диабет продолжает занимать третье место среди причин смертности после сердечно-сосудистых заболеваний и рака (Покровский, 2007; Chan, 2007; Neumiller et. al, 2008), что говорит о необходимости углубления знаний о механизмах синтеза, транспорта и биологического действия инсулина, а также о процессах, лежащих в основе формирования сахарного диабета.

Известно, что развитие иммунного ответа к антигенным детерминантам зависит от свойств носителя, распознаваемого лимфоцитами (Галактионов, 2004). Роль носителя при антигенном распознавании инсулина могут играть молекулы, транспортирующие его к клеткам-мишеням. Из этого вытекает важность идентификации и изучения свойств компонентов крови, принимающих участие в транспорте инсулина к периферическим тканям в норме и выявления изменений, происходящих в системе транспорта инсулина при формировании сахарного диабета.

Цель работы — изучение инсулин - транспортирующих систем крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа с использованием аффинных методов.

Задачи исследования: 1. Оценить соотношение вкладов эритроцитарной и сывороточной систем в транспорт инсулина в сопоставлении с аналогичными соотношениями ряда гидрофильных и гидрофобных гормонов.

2. Разработать новый носитель для аффинной хроматографии, отличающийся повышенной стабильностью по сравнению с традиционно используемыми полисахаридными носителями, оценить свойства полученных на его основе аффинных сорбентов в условиях лаборатории, биотехнологического производства и при использовании в аффинных диагностических системах для оценки состояния системы регуляции углеводного обмена обследуемых.

3. Разработать метод количественного определения связывающих инсулин белков сыворотки крови человека и провести сравнение их концентрации в норме и при сахарном диабете первого типа.

4. На основе предложенного носителя синтезировать аффинный сорбент с иммобилизованным инсулином. Определить роль ионов цинка и других двухвалентных катионов во взаимодействии инсулина и транспортных белков сыворотки крови.

5. Оценить гетерогенность инсулинсвязывающих белков и провести идентификацию в их составе известных транспортных белков крови методами электрофореза, гельхроматографии, иммунохимии и классической биохимии в норме и при сахарном диабете первого типа.

6. Количественно оценить содержание липидов и гормонов первой и второй групп в составе связывающего инсулин комплекса.

7. Изучить иммуномодулирующие свойства инсулин - связывающих белков сыворотки крови здоровых донов и больных сахарным диабетом.

Научная новизна.

Впервые установлено, что особенность транспорта инсулина, по сравнению с транспортом других белковых гормонов, заключается в сопоставимом использовании сывороточного и эритроцитарного механизмов. При сахарном диабете происходит достоверное снижение вклада сывороточной системы в транспорт инсулина, соответственно, возрастает вклад эритроцитарного транспорта.

Установлено, что при сахарном диабете первого типа состав белков транспортного комплекса достоверно изменяется: альбумин и а-фетопротеин, входящие в ядро комплекса в норме, вытесняются из него белком острой фазы воспалительной реакции - агкислым гликопротеином.

Доказано, что транспортирующий гормоны комплекс плазмы крови человека является универсальным: наряду с инсулином, он содержит как гидрофобные (тироксин, трийодтиронин, тестостерон), так и гидрофильные гормоны (лютеинизирующий гормон, тиреотропный гормон, пролактин).

Показано, что гликопротеиды, формирующие комплекс с инсулином в крови здоровых доноров, обладают способностью снижать иммунный ответ при добавлении к антигенам при иммунизации.

Практическая значимость работы

Разработан и запатентован метод получения носителя для аффинной хроматографии на основе поливинилового спирта (Поливиналь). Новый носитель не уступает по плотности активных групп бромциан - Сефарозе 4В, являющейся своеобразным эталоном носителя для аффинной хроматографии. Он обладает лучшими, по сравнению с полисахаридными матрицами, колоночными свойствами и превосходит их по химической стабильности, устойчив к действию органических растворителей, детергентов, ферментов микроорганизмов, крайних значений рН, выдерживает кипячение, стерилизуется в ходе приготовления (Гарипова М.И., и др., // Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений. Авторское свидетельство № 1789532 22.09.1992).

Иммуноаффинный сорбент на основе предложенного носителя с иммобилизованной глобулиновой фракцией антисыворотки к антигенам ал-лантоисной жидкости испытан в условиях производства человеческого лейкоцитарного интерферона в Отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н,Ф. Гамалеи на стадии удаления антигенных примесей из полуфабрикатов интерферона. Использование нового носителя позволило увеличить производительность очистки интерферона в 5 и более раз, снизило риск загрязнения препаратов фрагментами иммобилизованных иммуноглобулинов и позволило проводить не менее 100 циклов иммуносорбции без перебивки колонки (Гарипова и др., 1993). По результатам производственных испытаний, принято Дополнение к регламенту «Лейкинферон для инъекций. Стадия ВР-5.4. Иммобилизация иммуноглобулинов» и получен Акт об использовании предложения. Сорбент для очистки лейкоцитарного интерферона человека, синтезированный на основе запатентованного носителя для аффинной хроматографии, с ноября 1991 года до настоящего времени используется на производстве инъекционного препарата лейкоцитарного интерферона в отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи согласно утвержденному производственному регламенту (Акт об использовании предложения от 23 января 1992 года).

С использованием сорбента с иммобилизованными дигидроксибо-рильными группами на основе нового носителя разработана и запатентована диагностическая система для количественного определения гликозилиро-ванной формы гемоглобина в капиллярной крови человека (Гарипова и др. Сшитый поливиниловый спирт с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина. // Патент на изобретение №

20935525.2002). Диагностическая система разрешена к применению для диагностики сахарного диабета в лечебно-профилактических учреждениях Республики Башкортостан решением Научно-технического Совета Министерства Здравоохранения Республики Башкортостан от 28 июля 1992 года.

На основе нового носителя получен сорбент с иммобилизованным инсулином и впервые проведено аффинное выделение связывающих инсулин белков сыворотки крови (транспортирующего гормоны комплекса) здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа. Выделенный аф-финно комплекс, транспортирующий гормоны, может быть использован в качестве корректирующего гормональные нарушения препарата, а также при разработке новых препаративных форм инсулина с повышенной эффективностью доставки гормона к периферическим тканям.

Разработан метод определения концентрации в крови человека специфичных к инсулину транспортных белков сыворотки крови. Метод может быть использован для диагностики нарушений транспорта инсулина в крови пациентов.

Метод определения коэффициента распределения инсулина между рецепторами эритроцитов и плазмой крови может быть использован для диагностики нарушений системы транспорта инсулина в крови человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Особенность транспорта инсулина, по сравнению с транспортом в крови человека большинства других белковых гормонов, заключается в равноценном вкладе в доставку гормона к периферическим тканям двух транспортных систем: системы сывороточных транспортных белков и эритроцитарной системы транспорта.

2. При формировании сахарного диабета первого типа происходит снижение роли сывороточного и повышение роли эритроцитарного транспорта в доставку инсулина к периферическим тканям.

3. В плазме крови человека инсулин включается в общий для гидрофильных и гидрофобных гормонов транспортный комплекс, основу которого составляют транспортные белки крови.

4. В норме ядро транспортного комплекса формируют: альбумин, а- фе-топротеин, а,2-глобулины и р- глобулины (в том числе трансферин). Для включения инсулина в транспортный комплекс необходимо присутствие ионов цинка.

5. При сахарном диабете первого типа состав белков транспортного комплекса достоверно изменяется: из него исчезает альбумин и а-фетопротеин, снижается содержание (Хг — глобулинов, появляется фракция ар глобулинов, в том числе, а 1-кислый гликопротеин.

6. Белки транспортирующего гормоны комплекса крови в норме обладают иммуносупрессирующими свойствами.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 1 Всесоюзной конференции «Аффинная хроматография антител -теоретические и прикладные аспекты» (Москва, 1983), на 1 Всесоюзной конференции «Новые направления в биотехнологии» (Пущино, 1984), на 5 Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на 5 конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пущино, 1988), на 1 съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), на 33- ем Международном съезде физиологов (Санкт- Петербург, 1997), на 3-ем съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997), на Всероссийской конференции «Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей» (Санкт - Петербург, 2001), на конференции «Экологические, морфологические особенности и современные методы исследования живых систем» (Казань, 2003), на Всероссийской конференции с международным участием «Достижения биологической функ-ционологии и их место в практике образования» (Самара, 2003), на конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2007), на конференции «Проблемы биоэкологи и пути их решения» (Саранск, 2008).

Публикации. Основные материалы диссертации обобщены в монографии и изложены в 48 печатных работах, в том числе 9 статьях в журналах, рекомендованных ВАК, а также защищены 2 патентами и 2 авторскими свидетельствами.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 354 страницах, содержит 20 рисунков, 24 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 539 работ, приложения.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гарипова, Маргарита Ивановна

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Установлено, что особенность транспорта инсулина в крови человека в сравнении с транспортом других белковых гормонов, заключается в равноценном вкладе в доставку гормона к клеткам - мишеням эритроцитар-ной и сывороточной транспортных систем.

5. Синтезирован и запатентован сорбент с иммобилизованной фенилборо-новой кислотой, на его основе создана диагностическая система для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека.

8. При сахарном диабете первого типа альбумин и а- фетопротеин замещаются в транспортирующем инсулин комплексе сыворотки крови белком острой фазы воспалительной реакции кислым аг гликопротеином.

9. Транспортирующий гормоны сывороточный комплекс плазмы крови является общим для гидрофильных и гидрофобных гормонов. Наряду с инсулином в него включаются гидрофобные (тироксин, трийодтиронин, тестостерон) и гидрофильные (тиреотропный гормон, пролактин, лютеи-низирующий гормон) гормоны, а также триглицериды и холестерол.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Считается доказанным, что диабет первого типа имеет аутоиммунную природу. Разрушение продуцирующих инсулин ß-клеток в организме больного диабетом осуществляют собственные лимфоциты организма (Atkinson, 1990; Bach, 1994; Нот et. al., 1998; Espe et. al., 2007; Stefan et. al., 2007). По данным литературы, иммунный ответ специфичен ко многим антигенам ß-клеток, в том числе к инсулину. Однако, механизм формирования аутоиммунного процесса, направленного к антигенам ß-клеток не выявлен.

Известно, что развитие иммунного ответа к антигенным детерминантам зависит от свойств носителя, распознаваемого лимфоцитами (Галактионов, 2004). Роль носителя при антигенном распознавании инсулина могут играть молекулы, транспортирующие его к клеткам-мишеням. Из этого вытекает важность изучения природы и свойств соединений, осуществляющих транспорт инсулина в крови человека.

По данным литературы, в транспорте инсулина в крови человека принимают участие две транспортные системы: эритроцитарная и сывороточная.

Изучению сывороточного транспорта инсулина посвящены работы Грачевой Н.К, Старосельцевой Л.К и соавторов, Старковой Н.Т и соавторов, выполненные в 70-80 годы 20 века. По мнению Л.К. Старосельцевой, поступивший в кровь инсулин неоднороден: часть его остается в свободном виде (иммунореактивный инсулин), другая часть формирует комплексы с белками сыворотки крови (связанный инсулин) (Старосельцева, 1983). По данным авторов, существует две формы связанного инсулина, одна из которых образует комплекс с трансферином, другая с гликопротеином крови с электро-форетической подвижностью ос-глобулинов - орозомукоидом ( ар кислым гликопротеином). Старосельцева Л.К. высказывает предположение о том, что в образовании этих форм принимают участие сиаловые кислоты трансферина и орозомукоида, взаимодействующие с молекулами инсулина. Биологическое значение образования связанных форм инсулина, по мнению Л.К. Старосельцевой, заключается в том, что инсулин в связанном виде доставляется к жировой ткани, не реагируя с мышечной тканью. Кроме того, по мнению авторов, связанный инсулин является резервом свободного инсулина и формой его хранения в циркуляции. Процессы связывания регулируют уровень активного инсулина (Старосельцева, 1972). Переход из связанной формы инсулина в свободную происходит за несколько минут, тогда как секреция вновь синтезированного инсулина, включая время превращения проинсулина в инсулин, требует 30 минут. В тех случаях, когда требуется немедленное изменение концентрации свободного инсулина, его концентрация увеличивается за счет освобождения из комплекса с белками сыворотки крови. Однако, в более поздние годы изучению транспорта инсулина в крови человека уделялось незаслуженно мало внимания, в то время как благодаря развитию новых научных подходов и методов исследования стало возможным более детальное изучение белков крови, принимающих участие в транспорте инсулина. В работах Грачевой Н.К, Старосельцевой Л.К и соавторов показано, что "связанный инсулин" формируется за счет взаимодействия гормона с трансферином. Однако, можно предположить, что в связи с использованием авторами физико-химических методов выделения содержащих инсулин фракций, выделены не все из них. Не решенным также, остался вопрос о том, находится ли свободный инсулин, действующий на мышцы и печень, в истинно свободном состоянии, или же он формирует лабильный комплекс с белками крови (Старосельцева и др., 1983, Маррии др., 1993, Касаткина, 1996, Покровский, 2007).

Изучению эритроцитарного транспорта инсулина посвящены работы Сандуляк Л.И. и соавторов, ОБ1у .Г., Доломатова С.И., Картун Л.В., Запоро-жан В.Н. В работах этих авторов показано, что, несмотря на то, что эритроциты не относятся к классическим чувствительным к инсулину клеткам, на их плазматической мембране присутствуют рецепторы к этому гормону (Сандуляк, 1974; СоЬап е1. а1., 2008). Одна из функций рецепторов к инсулину, локализованных на поверхности эритроцитов, вероятно, заключается в доставке гормона к периферическим тканям. Экспериментально доказана способность эритроцитов транспортировать значительные количества инсулина (Сандуляк, 1978) и трийодтиронина (ОБ1у е1 а1., 1988). Проблема физиологической роли эритроцитов в транспорте инсулина обсуждается в научной литературе на протяжении тридцати лет. Впервые попытку рассмотреть общебиологическое значение инсулиндепонирующей функции эритроцитов предпринял Л.И. Сандуляк (Сандуляк, 1974). В работах этого автора сформулирована гипотеза об участии эритроцитов в системе депо и транспорта инсулина. По мнению В.Н. Запорожан и соавторов, изучение гормон-депонирующей функции эритроцитов может существенно облегчить понимание патогенеза многих эндокринных заболеваний и содействовать разработке принципиально новых методов коррекции эндокринных нарушений. Авторы высказывают предположение о решающем регулирующем значении рН, состава ионов и белков плазмы на способность эритроцитов депонировать и освобождать гормоны (Запорожан, 2001). В работах этих авторов показано, что эритроциты крови человека и животных участвуют в транспорте инсулина наряду с плазмой и являются его громадным депо. Из этого депо инсулин поступает в плазму крови и ткани в ответ на повышение уровня глюкозы и молочной кислоты в крови (Сандуляк и др., 1978). Авторами показано, что на поверхности 70% эритроцитов периферической крови человека иммунолюминесцентным методом выявляется инсулин. Установлено, что количество инсулин - положительных эритроцитов и интенсивность их люминесценции уменьшается после применения нагрузки глюкозой. В дальнейшем было обнаружено, что эритроциты крови депонируют не только инсулин и тиреоидные гормоны, но и стероидные (кортизол) и тимические гормоны (Кирдей и др., 1995; Доломатов и др., 1999; Федорович и др., 2001), которые могут высвобождаться из эритроцитарного депо под влиянием физико-химических факторов, в частности, под влиянием ультрафиолетового облучения.

Известно, что разрушение эритроцитов осуществляется преимущественно макрофагами печени за счет процесса, получившего наименование «эритрофагоцитоз» (Галактионов, 2004). Элиминации подвергаются состарившиеся и поврежденные эритроциты. Таким образом, формирование комплекса гормона с рецепторами эритроцитов задает вероятность его элиминации из кровотока и повышает вероятность распознавания лимфоцитами в составе "процессированного" антигена, секретируемого фагоцитами (Галактионов, 2004). Исходя из этого, можно предположить, что преимущественная доставка гормона за счет эритроцитарного транспорта означает повышенную вероятность развития на него аутоиммунной реакции.

Соотношение вкладов в доставку к периферическим тканям инсулина эритроцитарного и сывороточного транспорта до настоящего времени не получило экспериментальной оценки. В связи с этим, была поставлена цель экспериментально оценить это соотношение по величине коэффициента распределения инсулина между эритроном и плазмой крови. Исследование проводилось при сопоставлении распределения инсулина в норме с его распределением при сахарном диабете первого типа и с распределением других гормонов гидрофоильной и гидрофобной природы.

Предполагается, что в крови человека сывороточный транспорт используется преимущественно для транспорта гидрофобных гормонов, в то время как в транспорте белковых гормонов большее значение имеет эритро-цитарный транспорт. Это утверждение подтверждено полученными экспериментальными данными. Установлено, что все исследованные гормоны гидрофобной природы (стероидные - прогестерон и кортизол, и производные тиронина - трийодтиронин и тироксин) имеют коэффициенты распределения между поверхностью эритроцитов и плазмой крови, близкие к О (таблица 15). Это подтверждает справедливость утверждения, о том, что в плазме крови присутствуют транспортирующие эти гормоны гликопротеи-ды (Godovac-Zimmermann J., 1988; Марри,1993; Kengni et.al., 2007).

В то же время, установлено, что для всех исследованных белковых гормонов (как простых белков - пролактина, так и гликопротеидов - тирео-тропного гормона, лютеинизирующего гормона, фолликулостимулирующе-го гормона) характерно резкое преобладание связанной с эритроцитами фракции гормона по сравнению с гормоном, присутствующим в плазме крови. Величина коэффициентов распределения всех гормонов этой группы, за исключением инсулина, превышает 100 (таблица 15). Очевидно, это свидетельствует о наличии на поверхности эритроцитов специфических рецепторов к этим гормонам и о чрезвычайно низкой концентрации в плазме крови связывающих эти гормоны белков. На основании того, что инсулин также относится к группе белковых гормонов, можно было бы предположить, что коэффициент его распределения имеет тот же порядок.

Однако, в норме, в отличие от аналогичных коэффициентов других белковых гормонов, коэффициент распределения инсулина близок к 1 и составляет 0,49±0,0053 (таблица 15). Вероятно, это свидетельствует о том, что в отличие от других гормонов второй группы, инсулин доставляется к периферическим тканям при активном участии переноса гормона транспортными белками крови.

В литературе не описано существование специфичного к инсулину транспортного белка, однако, известно, что существуют транспортные белки для антигенно подобных ему гормонов: секретина, инсулинподобных факторов роста 1 и 2 (Suikkari et.al., 1988; Lee et.al., 1989). В настоящее время инсулин, наряду с релаксином, инсулинподобными факторами роста 1 и 2, инсулиноподобным пептидом клеток Лейдига, ранними плацентарными инсулиноподобными пептидами, а также инсулин/релаксин подобными факторами кишечника и центральной нервной системы человека, объединяют в суперсемейство структурно и антигенно подобных гормонов (Blundell et. al., 1980; Roth J. et. al., 1982; Humbel et.al., 1990; Марри и др.,1993; Chassin et.al., 1995, банк данных SWISS-PROT). Исходя из этого можно предположить, что за счет перекрестного взаимодействия, инсулин способен связывается с транспортными белками, специфичными к указанным гормонам. С другой стороны, существование белков крови, транспортирующих антигенно подобные инсулину гормоны может свидетельствовать о биологической целесообразности использования для этих гормонов сывороточного механизма транспорта, возможно, в связи с необходимостью маскировки транспортными молекулами антигенных детерминант гормона и необходимостью снижения эритроцитарного транспорта, повышающего вероятность развития аутоиммунной реакции.

Таким образом, согласно полученным данным, своеобразие транспорта инсулина по сравнению с другими гормонами второй группы, заключается в том, что в нем участвует система транспорта, типичная для гормонов гидрофобной природы - система транспортных белков крови. Вероятно, особенность транспорта инсулина обусловлена биологической необходимостью снижения его связывания с эритроцитами.

Для определения изменений в транспорте инсулина, происходящих при сахарном диабете, определены коэффициенты распределения инсулина между эритроном и плазмой в крови 100 больных сахарным диабетом первого типа с неудовлетворительной компенсацией заболевания. Значение коэффициента распределения инсулина в крови больных сахарным диабетом составило 0,73±0,0065 (таблица 15). Таким образом, выявлено достоверное увеличение значения коэффициента распределения инсулина в крови больных сахарным диабетом по сравнению с аналогичным показателем здоровых доноров (значение критерия Стьюдента t составило 2,176 при уровне значимости р=0,036). Это свидетельствует о значительном увеличении вклада эри-трона в доставку инсулина к периферическим тканям при сахарном диабете первого типа. Таким образом, показано, что при сахарном диабете снижено связывание инсулина с белками крови. Возможно, это свидетельсвует о существовании причинно-следственной связи между снижением связывания инсулина с белками сыворотки и развитием аутоиммунного процесса при сахарном диабете первого типа. Из этого вытекает важность изучения состава и свойств белков крови, формирующих комплекс с инсулином.

На первом этапе исследования проведено сравнение концентраций ин-сулинсвязывающих белков в сыворотке крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом в стадии декомпенсации. Разработана методика определения связывающих инсулин белков крови, основанная на реакции пассивной гемагглютинации эритроцитов, сенсибилизированных инсулином, и проведена оценка их количества в сыворотке крови в норме и при сахарном диабете первого типа. Установлено, что концентрация связывающих инсулин белков в сыворотке крови здоровых доноров достоверно выше, чем в сыворотках больных сахарным диабетом первого типа (таблицы 17,18). Достоверность различия титров связывающих инсулин белков в норме и при сахарном диабете доказана с использованием критерия Стьюдента (1=5,76; р=0,0023) (Гарипова и др., 2003). Очевидно, что этот результат согласуется с данными о повышении доли эритроцитарного и, соответственно, снижении доли сывороточного транспорта при сахарном диабете (таблица 15, рисунок 13). На основании этих данных высказано предположение о том, что аффинные к инсулину белки крови играют важную роль в доставке инсулина к тканям и снижение их титра в крови больных диабетом связано с формированием заболевания.

Для изучения состава и свойств белков крови, транспортирующих инсулин, проведено их аффинное выделение. Использование этого метода позволяет более полно выделить и охарактеризовать состав связывающих инсулин белков крови, по сравнению с аналогичными экспериментами, основанными на физико-химических методах выделения.

Выделение специфически взаимодействующих с инсулином белков крови с последующим определением их состава и структуры предъявляет повышенные требования к матрице аффинного сорбента, использованной для синтеза сорбента с иммобилизованным инсулином. В предварительных экспериментах установлено, что при использовании аффинных сорбентов с иммобилизованным инсулином на основе активированной бромцианом Се-фарозы-4В, полученные инсулинсвязывающие фракции не пригодны для дальнейшего биохимического анализа, так как они загрязнены продуктами разложения полисахаридной матрицы и иммобилизованного лиганда. В связи с этим, на первом этапе исследований была поставлена задача разработать носитель для аффинной хроматографии, отличающийся повышенной стабильностью по сравнению с традиционно используемыми полисахарид-ными носителями. В ходе проведенных исследований разработан и запатентован новый метод синтеза матрицы для аффинной хроматографии на основе поливинилового спирта (Поливиналя), позволяющей получить сорбент с иммобилизованным инсулином, не загрязняющий выделенные связывающие инсулин белки продуктами расщепления полисахаридной матрицы. В ходе лабораторных, производственных и клинических испытаний аффинных сорбентов, синтезированных на основе нового носителя, показано, что они обладают высокой специфической емкостью, низкой неспецифической сорбцией, лучшими, по сравнению с бромциан-Сефарозой 4В, гидродинамическими свойствами и повышенной стабильностью. Метод получения носителя для аффинной хроматографии на основе поливинилового спирта запатентован (Гарипова и др., 1992, б)

Формирование групп здоровых доноров и больных сахарным диабетом в стадии декомпенсации, из проб крови которых выделяли инсулинсвязывающие фракции, проводили на основании заключения эндокринолога и определения количества гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови обследуемых. Известно, что это объективный метод оценки состояния испытуемых за 2-3 месяца, предшествовавшие взятию пробы. (Brownlee et. al., 1980, Duncan et. al., 1984, Horn et.al., 1998). Гликозилиро-ванная фракция гемоглобина является своеобразной "памятью" о среднем уровне гликемии за время жизни эритроцита, составляющем 2-3 месяца. Образование этой фракции обусловлено неферментативным связыванием глюкозы молекулами исходно негликозилированного гемоглобина за счет реакции между альдегидной группой глюкозы и аминогруппой гемоглобина (Guthrow et. al., 1979, Day et. al., 1980, Higgins et.al., 1982, Hubbuch, 1985, Morris et. al., 1985, Мазовецкий, 1991). Существует ряд методов определения процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина. Наиболее популярными из них являются ионообменная хроматография (Hubbuch, 1985), аффинное определение на сорбенте с иммобилизованной фе-нилбороновой кислотой (Dean et. al., 1980) и колориметрическое определение с тиобарбитуровой кислотой (Guthrow et. al., 1979). В 80-х годах двадцатого века фирма Pierce Chemical Company начала выпуск диагностического набора, содержащего микроколонки с аффинным сорбентом, представляющим собой мета-аминофенилбороновую кислоту (м-АФБК), иммобилизованную на 6% агарозе. Принцип аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина основывается на свойстве фенилбороновой кислоты избирательно связывать молекулы, содержащие цис-диольную группировку, в том числе, гликозилированный гемоглобин (Weith et. al.,1970, Oka-yama et. al., 1978, Reed et. al., 1986).

В связи с недостаточной стабильностью сорбента на основе агаолзы, на одной колонке набора фирмы Pierce Chemical Company можно провести небольшое количество достоверных определений. Для повышения количества достоверных определений гликозилированной формы гемоглобина на одной микроколонке с аффинным сорбентом, проведена иммобилизация м-АФБК на носителе Поливиналь. Полученный сорбент с иммобилизованной амино-фенилбороновой кислотой использован в диагностической системе для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека (Гарипова, 1996). Предложенная диагностическая система является аналогом диагностической системы фирмы Pierce Chemical Company. Для количественного определения гликозилированной формы гемоглобина использована методика определения, рекомендованная фирмой Pierce Chemical Company с некоторыми изменениями. Клинические испытания предложенной диагностической системы, проведенные в клинико-диагностических лабораториях больниц г. Уфы, показали, что при ее использовании ошибка определения показателя не превышает 5% (таблица 13). За счет повышенной стабильности аффинного сорбента, использование новой диагностической системы позволило увеличить количество определений процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина в пробе с 3-6 (при использовании набора фирмы Pierce Chemical Company) до 20. В лаборатории клинической биохимии Эндокринологического научного Центра РАМН проведено параллельное определение процентного содержания гликогемоглобина с использованием предложенного аффинного сорбента и определение основной фракции гликозилированного гемоглобина НвА ]с методом высокоэффективной ионообменной хроматографии при помощи хроматографа AUTO А1СТМНА (фирма Kyoto Kagaku Со, LTD, Япония). Коэффициент корреляции между полученными значениями показателей составил +0,95, р=0,0136.

Обследовано 380 больных сахарным диабетом и 125 больных с другими диагнозам. Установлена положительная корреляция среднего значения гликемии натощак при взятии крови 2 раза в неделю в течение месяца со значением процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина (% Ггб), определенным в конце этого периода. Коэффициент корреляции между средними значениями гликемии натощак за один месяц наблюдения и %Ггб, определенным в конце периода наблюдения, составил +0,945,р=0,0001 (таблица 14). Таким образом, в ходе клинических испытаний диагностической системы на основе предложенного аффинного сорбента, показано, что полученные значения % Ггб соответствуют клинической картине течения заболевания и динамике гликемии. Установлено, что при оценке полученных результатов следует использовать критерии, предложенные А. НаЬЬисЬ и соавторами (НаЬЬисЬ, 1985). Использование предложенной диагностической системы позволило провести объективную оценку состояния углеводного обмена обследуемых, при изучении инсулин-транспортирующих систем крови человека.

Для аффинного выделения белков, связывающих инсулин, в плазме крови и их аффинного выделения были отобраны пробы крови 800 здоровых добровольцев 25-35 лет с содержанием Ггб от 4 до 7,5%, что соответствует нормальному уровню гликемии. Аффинное выделение белков, связывающих инсулин, проведено из проб крови 800 больных сахарным диабетом первого типа (8 серий по 100 пациентов), находившихся на стационарном лечении в эндокринологических отделениях больниц г.Уфы, с процентным содержанием в капиллярной крови гликозилированной формы гемоглобина от 10,3 % до 18,6 %, что соответствует стадии заболевания с неудовлетворительной компенсацией нарушений углеводного обмена. Эта стадия заболевания была выбрана в связи с тем, что именно в стадии декомпенсации следовало ожидать проявления наиболее выраженных изменений системы транспорта инсулина.

Известно, что в составе секреторных гранул р-клеток островков Лан-герганса инсулин находится в комплекс с катионами цинка (Марри и соавт., 1993), что свидетельствует о важности этих катионов для поддержания структуры и проявления биологической активности гормона. В связи с этим, мы поставили перед собой задачу изучить роль этого иона в формировании выявленного транспортного комплекса. Для изучения роли ионов цинка в формировании комплекса инсулина с белками плазмы, аффинную хроматографию проводили в присутствии (опыт) и в отсутствии (контроль) ионов цинка в буфере связывания. В опытной серии в состав 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 0,14 М хлорида натрия вводили 0,001 мг/мл хлорида цинка. Как следует из данных хроматографии, связывание сывороточных транспортных белков с иммобилизованным инсулином происходит только в том случае, если в состав буфера связывания входят ионы цинка (рисунок 14). Небольшой пик на хроматограмме Б, вероятно, обусловлен неспецифическим связыванием сывороточных белков с сорбентом. При добавлении эквимолярного количества хлорида кальция связывания ИСБ с сорбентом не происходило. Эти данные согласуются с результатами титрования инсулинсвязывающей активности исследованных сывороток в РПГА. Агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных инсулином, происходит лишь в том случае, если для сенсибилизации использованы препараты цинк-инсулина, либо в состав буферного раствора введены ионы цинка. Полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что ионы цинка играют важную роль в осуществлении взаимодействия инсулина с транспортирующими белками. Необходимость присутствия ионов цинка для взаимодействия с транспортными гликопротеидами, очевидно, является одной из причин высокого биологического значения этих ионов для поддержания нормального обмена веществ. Вероятно, присутствие ионов цинка необходимо для реализации возможности доставки инсулина к периферическим тканям в комплексе с транспортными гликопротеидами.

Благодаря использованию высокостабильного, не содержащего углеводов аффинного сорбента, синтезированного по авторскому методу (Гари-пова и др., 1992), проведено выделение связывающих инсулин белков крови без загрязнения их углеводами и фрагментами иммобилизованного инсулина. Очевидно, что аффинное выделение ИСБ позволяет получить более полное представление об их составе, по сравнению с физико-химическими методами, использованными Н.К. Грачевой и соавторами (1977). Вероятно, различием в методах выделения объясняется значительное различие степени разнообразия взаимодействующих с инсулином белков крови, полученное в эксперименте по сравнению с разнообразием связывающих инсулин белков, описанным Н.К. Грачевой и соавторами. Количество связывающих инсулин белков крови, выделенное аффинным методом из 1 мл сыворотки крови здоровых доноров было достоверно выше, чем из 1 мл сыворотки крови больных диабетом: 0,062±0,003 мг/мл по сравнению с 0,042±0,0025 мг/мл.

Для оценки молекулярного веса и степени гетерогенности веществ, формирующих комплекс с инсулином, полученные препараты были разделены гельхроматографией на колонке с Сефадексом G-75, откалиброванной при помощи маркеров молекулярного веса фирмы Serva (Швеция). Гельхрома-тографию проводили при рН 2, 8 (элюаты без нейтрализации) и при физиологическом значении рН. Как следует из хроматограммы, приведенной на рисунке 16 (I), при рН 2,8 связывающие инсулин компоненты и здоровых доноров и больных сахарным диабетом разделились по молекулярному весу на два пика. Первый пик имеет объем выхода, соответствующий молекулярному весу около 100 тысяч дальтон. Соотношение ОП28о/ ОП2бо этой фракции в норме составило 0,902±0,0458, что свидетельствует о высоком содержании углеводов в соединениях, формирующих эту фракцию. На основании примерного значения молекулярного веса и высокой степени гли-козилирования можно предположить, что эта фракция содержит сывороточные транспортные глобулины и иммуноглобулины. Второй полученный при гельхроматографии пик представлен веществами, молекулярный вес которых близок к 50 тысячам дальтон. Соотношение ОП28о/ ОП2бо> равное 1,020±0,0487 свидетельствует о меньшем содержании углеводов в соединениях, формирующих вторую фракцию. Величина молекулярного веса и относительно меньшее поглощение в области 260 нм позволяет предположить, что эта фракция представлена сывороточным альбумином. Таким образом, данные гельхроматографии свидетельствуют о гетерогенности сывороточных компонентов, формирующих специфические комплексы с инсулином. Следовательно, в отличие от транспортных белков, осуществляющих перенос в крови человека других членов суперсемейства инсулина (релаксина и инсулинподобных факторов роста), (Tager, 1984; Suikkari et. al.,

1988; Lee et.al., 1989) инсулинсвязывающие белки отличаются повышенной гетерогенностью. Возможно, это объясняется меньшей специфичностью связывания инсулина с белками крови, в том числе, возможностью низкоаффинного взаимодействия с транспортными молекулами, специфичными к другим лигандам, взаимодействием за счет катионов цинка с белками, транпорти-рующими катионы. Кроме того, гетерогенность инсулинсвязывающих соединений может объясняться сопряжением транспорта инсулина с системами транспорта других гормонов, опосредованным всзимодействием транспортных белков между собой, подобным взаимодействию липокалинов (Flower, 1996).

При хроматографии на той же колонке проб, полученных методом аффинной хроматографии после плавного доведения рН до 7,2, получен один пик, соответствующий молекулярному весу более 100 тысяч Д. Эти результаты, вероятно, свидетельствует о том, что при физиологических значениях рН связывающие инсулин белки ассоциируют, формируя единый комплекс, рисунок 16 (II), .

С целью выявления степени гетерогенности и идентификации в полученном аффинно комплексе связывающих инсулин гликопротеинов известных транспортных веществ сыворотки крови по их электрофоретической подвижности, проведено электрофоретическое разделение выделенных аффинно инсулин-связывающих белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом. Проведено электрофоретическое разделение проб, полученных методом аффинного выделения на сорбенте с иммобилизованным инсулином, из 8 серий сывороток, каждая из которых включала сыворотки крови 100 здоровых доноров и 100 больных сахарным диабетом. Показано (Таблица 21, приложение III), что в элюатах из сывороток больных сахарным диабетом в 2 раза больше гамма-глобулинов (40,7%±1,83) по сравнению с их количеством в эшоатах из сывороток здоровых доноров (20,3%±0,95). Очевидно, это обусловлено повышенным содержанием специфических иммуноглобулинов к инсулину у больных сахарным диабетом. Полученные результаты согласуются с данными литературы о появлении в сыворотке больных сахарным диабетом специфических к инсулину антител (Балаболкин и др., 1983; Atkinson et al., 1990). Присутствие в составе связывающих инсулин белков значительного количества у-глобулинов свидетельствует о возможности того, что выделенная инсулинсвязывающая фракция представляет собой иммунные комплексы, а не сывороточные транспортные белки. Для проверки этого предположения, провели рехроматографию выделенных фракций на сорбенте с иммобилизованным протеином А золотистого стафилококка, специфически связывающем иммуноглобулины человека (иммунные комплексы). Установлено, что инсулинсвязывающие белки крови содержат две фракции: взаимодействующую и невзаимодействующую с протеином А (рисунок 18). Взаимодействующая с протеином А фракция инсу-линсвязывающих белков здоровых доноров составляет не более 20% от их общего содержания, в то время как в пробах инсулинсвязывающих белков больных сахарным диабетом она достигает 50% (Различие доказано с использованием критерия Стьюдента, t=3,43; р=0,028, п=30). Таким образом, предположение о том, что выделенные аффинно фракции представляют собой иммунные комплексы и не содержат белков, выполняющих транспортную функцию, было отвергнуто.

На основании анализа электрофореграмм было сделано предположение о присутствии в пробах связывающих инсулин белков здоровых доноров альбумина и транспортных белков крови с подвижностью а2 -глобулинов и (3-глобулинов. Кроме того, было высказано предположение о том, что связывающие инсулин фракции больных сахарным диабетом содержат белки острой фазы воспалительной реакции, обладающие подвижностью aj-глобулинов, и транспортные белки с подвижностью Р-глобулинов. Для проверки высказанных предположений использованы методы иммунофермент-ного анализа и иммунонефелометрии (таблица 22).

По данным иммуноферментного анализа, в пробах инсулинсвязываю-щих белков здоровых доноров, но не в пробах больных сахарным диабетом, выявлены альбумин и а-фетопротеин. По данным иммуноферментного анализа в пробах здоровых доноров содержится 6,7±0,3 нг/мл а-фетопротеина и 0,015±0,0007 мг/мл альбумина ( определение проведено с повторностыо, равной 30). В пробах связывающих инсулин белков здоровых доноров и больных диабетом обнаружен трансферин - транспортный белок крови с подвижностью р-глобулинов, что согласуется с результатами Н.К. Грачевой и соавторов (1972). Достоверных различий содержания трансферина в пробах больных сахарным диабетом и здоровых доноров не выявлено. Трансферин, согласно современным представлениям, относится к классу липока-линов и принимает участие в транспорте широкого спектра биологически активных соединений (Flower et al., 1996). При помощи метода иммунонефелометрии также показано, что в выделенных аффинным методом комплексах связывающих инсулин белков сыворотки крови больных сахарным диабетом присутствует белок острой фазы воспалительной реакции - otr кислый гликопротеин (орозомукоид). Кислый гликопротеин -ai содержит 45% углеводов и обладает очень высоким отрицательным зарядом. Орозомукоид электрофоретически гетерогенен и генетически полиморфен, имеет два кодирующих локуса. Молекулярная масса орозомукоида составляет 41000 дальтон, время его полувыведения - 5 суток. Большая часть этого липокалина синтезируется в печени, а остальная часть - в других органах, в том числе в очагах опухолевого роста. Индукторами синтеза а\-кислого гликопротеина являются: липополисахарид грамотрицательных бактерий (ЛПС), некоторые цитокины (интерлейкин -lb, фактор некроза опухолей-а (ФНО), (интерлейкин-6) и глюкокортикоиды (Lacki et al., 1995; Fournier et al., 2000). Другие цитокины (интерлейкин-Ira, интерлейкин-4, интерлейкин-10, ТвР-Ь), наоборот, ингибируют синтез этого белка (Ьаск! е1 а1., 1995). Примечательно, что при воспалительных процессах синтезируется а] - кислый гликопротеин, содержащий двухразветвленные углеводные цепи (Роигтег е1 а1., 2000). Эта форма сильно связывается конканавалином А (КонА) (МасЫешюг е! а1., 1995; Роигтег е1 а1., 2000). Биологические функции орозомукоида очень многообразны и до конца еще не изучены, в частности показано его участие в регуляции иммунных реакций, защите от бактериальных инфекций, стабилизации повышенной проницаемости капиллярного русла, ингибировании апоптоза клеток и многих других биологических процессах (ВгаЯ, 2000; Рошшеге1 а1., 2000). В последнее время все более важное значение придают транспортным свойствам агкислого гликопротеина, который наряду с ретинол-связывающим белком и а] -микроглобулином относят к большой группе белков - липокалинов, объединяемых по их способности к связыванию и внеклеточному транспорту малых гидрофобных молекул. В плазме крови а]-кислый гликопротеин выступает основным переносчиком положительно заряженных лекарственных веществ (хлорпромазина, пропранолола, лидокаина, верапамила, тамоксифена). Кроме того, этот белок связывает стероиды (прогестерон, андростандион, кортизол) и анионные лиганды (варфарин, фенобарбитал, ретинол), а также серотонин, мелатонин, гистамин и фактор активации тромбоцитов (Кгетег е1 а1., 1988 Роигтег е! а1., 2000). Показано, что оро-зомукоид обладает мощным иммуномодулирующим действием (Е^ а1., 1997; 1^с1Ьег§ et а1., 2000). Данные иммунохимического исследования ин-сулинсвязывающих фракций позволяют сделать вывод о том, что в крови здоровых доноров в состав связывающего инсулин комплекса входят транспортные белки, в том числе, альбумин, а-фетопротеин и трансферин (Гарипова, 2007 б). Установлено, что состав белков связывающего инсулин комплекса при сахарном диабете первого типа достоверно изменяется. Альбумин и а-фетопротеин присутствующие в комплексе в норме, в пробах, выделенных из крови больных диабетом, выявляются лишь в следовых количествах и замещаются аг кислым гликопротеином и, возможно, другими, не идентифицированными белками. Различия состава белков, формирующих комплекс с инсулином, в норме и при диабете подтверждаются различием их аминокислотного состава и различным содержанием углеводного компонента в их молекулах. Установлено, что в гликопротеидах, взаимодействующих с инсулином в крови больных сахарным диабетом, снижено, по сравнению с нормой, содержание ароматических аминокислот. При использовании в качестве стандарта раствора фенилаланина, установлено, что в пробах здоровых доноров содержание ароматических аминокислот составляет 0,0064±0,0002 мг/мг, по сравнению с 0,00036±0,0005 мг/мг во фракциях больных сахарным диабетом. Аналогичный результат был получен при сравнении в связывающих инсулин фракциях здоровых доноров и больных сахарным диабетом количества серосодержащих аминокислот. Содержание цистеина в пробах из сывороток здоровых доноров было достоверно выше, чем в пробах больных сахарным диабетом (0,0048±0,00008 мг/мг, по сравнению с 0,00021±0,00007 мг/мг). Таким образом, что белковый компонент связывающих инсулин фракций плазмы крови больных сахарным диабетом, характеризуется пониженным содержанием ароматических и серосодержащих аминокислот, что характерно для некоторых транспортных гликопротеидов крови (Марри, 1993). В составе белковой части молекул, образующих комплекс с инсулином в сыворотке крови здоровых доноров, присутствует больше ароматических и серосодержащих аминокислот. Это, вероятно, подтверждает данные иммуноферментного анализа, свидетельствующие о присутствии в комплексе связывающих инсулин белков здоровых доноров, наряду с гликопротеи-дами, альбумина. Вероятно, с присутствием альбумина, не содержащего углеводного компонента, в ИСБ здоровых донорови связано меньшее содержание в них углеводов. Показано, что инсулинсвязывающих фракциях здоровых доноров содержание углеводов составляет 0,00128±0,0004 мг/мг

20%), в пробах больных сахарным диабетом-0,00192±0,0002 мг/мг (40%).

Показано, что как в норме, так и при диабете, в связывании инсулина принимают участие гликопротеиды, относящиеся к семейству липокалинов. В норме это трансферин, при сахарном диабете - трансферин и орозомуко-ид. Вероятно, способность липокалинов к формированию межмолекулярных комплексов за счет перекрестного взаимодействия делает возможным создание единого белкового комплекса, транспортирующего широкий спектр гормонов, в том числе инсулин. Обращает на себя внимание тот факт, что клеточный рецептор к трансферину также является липокалином (Flower, 1996). Вероятно, это делает возможным взаимодействие трансфе-рина и связанных с ним молекул с клеточной поверхностью по механизму, характерному для взаимодействия липокалинов. Свидетельством того, что инсулинсвязывающие белки формируют единый транспортный кломплекс, является их ассоциация после нейтрализации элюатов, выявленная при гельхроматографии.

Таким образом, показано, что транспортирующие инсулин компоненты плазмы крови представлены сложным комплексом белков. В его составе в норме выявлены транспортные белки крови, в том числе альбумин, а- фе-топротеин и трансферин. При сахарном диабете первого типа альбумин и а- фетопротеин вытесняются из комплекса белком острой фазы воспалительной реакции а гкислым гликопротеином. Известно, что концентрация этого транспортного гликопротеида, относящегося к семейству липокалинов, резко возрастает при различных патологических состояниях, в том числе при сахарном диабете первого типа (Fournier et al., 2000). Исчезновение из инсулинсвязывающего комплекса а- фетопротеина неизбежно должно приводить к изменению его свойств. По данным литературы, а-фетопротеин представляет собой полипептид, состоящий 600 аминокислот, содержащий 4% углеводов, по структуре и своим физико-химическим свойствам он близок к сывороточному альбумину. Фетопротеин образует нековалентные комплексы с полиненасыщенными жирными кислотами, билирубином, некоторыми стероидными гормонами и другими биологически активными лигандами (Вегёе Qt а1., 1979, Решетников., 1997). Обнаружена способность а-фетопротеина препятствовать связыванию вирусов с мембранами лимфоцитов и ограничивать атаку аутоантител на специфические сайты и рецепторы клетки, доказано его иммуносупрессивное (Aoyagi е1. а1., 1982). Указанные свойства послужили основанием для использования а-фетопротеина в качестве иммуномодепрессанта. Показана эффективность а-фетопротеина при лечении заболеваний с выраженным аутоиммунным компонентом (аутоиммунные поражения щитовидной и поджелудочной желез, спаечная болезнь, артриты, артрозы, астма, постинфекционные поражения сердца и почек, миастения и так далее), изучается возможность применения а-фетопротеина в комплексной терапии сахарного диабета, ревматизма, злокачественных опухолей и ряда других заболеваний (Пухальский и др., 2001). Присутствие в инсулинтранспортирующем комплексе в крови здоровых доноров а-фетопротеина позволяет предположить, что в норме этот липокалин выполняет функцию защиты инсулина от распознавания клетками иммунной системы и контролирует его взаимодействие с клетками-мишенями. Возможно, при повышении концентрации в сыворотке крови больных сахарным диабетом а (-кислого гликопротеина (и, возможно, других белков острой фазы воспаления) в результате развития воспалительной реакции, он вытесняет а-фетопротеин из комплекса с инсулином, что неизбежно должно изменять свойства транспортирующего инсулин комплекса и нарушать его взаимодействие с клетками-мишенями. Это предположение согласуется с литературными данными о влиянии повышения концентрации в крови определенных липокалинов (к семейству которых относится агкислый гликопротеин) на эффективность действия инсулина на клетки-мишени. В работе Yan Q. и соавторов (Yan et.al., 2007) сообщается о способности липокалина 2, ассоциированного с ожирением, вызывать резистентность к инсулину. Можно предположить, что повышение в крови концентрации липокалина 2 приводит к вытеснению им из транспортного комплекса транспортных белков, присутствующих в нем в норме. В свою очередь, это, возможно, приводит к снижению доступности инсулина для клеток-мишеней. По данным Chan Т. и соавторов (Chan et. al., 2007), у женщин, больных сахарным диабетом, отмечается повышение в крови концентрации другого представителя липокалинов ретинол-связывающего белка. Таким образом, возможно, что в вытеснении альбумина и а-фетопротеина из компоекса с инсулином принимает участие не только кислый oti гликопротеин, но и другие представители семейства липокалинов, концентрация которых увеличивается при воспалительной реакции.

Выявление в составе связывающих инсулин белков а-фетопротеина и орозомукоида послужило основанием для изучения иммуномодулирую-щих свойств ИСБ здоровых доноров и больных сахарным диабетом. Это исследование проведено на модели иммунизации белых лабораторных мышей дифтерийным анатоксином. В эксперименте использовано три группы белых лабораторных мышей: две опытные и одна контрольная. Мышей всех групп трехкратно иммунизировали дифтерийным анатоксином. В опыте 1 мышей иммунизировали анатоксином с добавлением инсулинсвязывающих гликопротеидов, выделенных из сывороток крови здоровых доноров, в опыте 2 - при добавлении аналогичной фракции из крови больных сахарным диабетом. Полученные антисыворотки к дифтерийному анатоксину оттитрованы в реакции пассивной гемагглютинации с диагностикумом, выявляющим антитела к дифтерийному анатоксину. Как следует из данных, приведенных в таблице 23, белки крови, транспортирующие инсулин в плазме крови здоровых доноров, вызвали достоверное снижение уровня иммунного ответа к дифтерийному анатоксину при иммунизации лабораторных мышей, на основании чего можно сделать вывод о наличии у них иммуносу-прессивных свойств. Иммуномодулирующее действие аналогичной фракции больных сахарным диабетом не выявлено. Вероятно, вопрос о наличии у ИСБ больных сахарным диабетом свойств, влияющих на поведение гормона в процессе его транспорта в крови и представления чувствительным клеткам, заслуживает дальнейшего изучения.

Биологическое значение подавляющего иммунный ответ действия ИСБ крови здоровых доноров, очевидно, заключается в предотвращении аутоиммунных реакций к гормонам и другим биологически активным соединениям, входящим в состав транспортного комплекса. Можно предположить, что состав транспортных молекул, формирующих комплекс с гормоном в плазме крови, определяет реакцию иммунной системы на инсулин и определяет вероятность развития аутоиммунной реакции на этот гормон. Доступность инсулина для связывания с клеточными рецепторами клеток-мишеней и длительность его присутствия в сыворотке, очевидно, также могут определяться свойствами гликопротеидов, входящих в состав транспортного комплекса. Возможно, утрата иммуносупрессивных свойств белков транспортирующего гормоны комплекса при формировании сахарного диабета происходит за счет вытеснения из него орозомукоидом а-фетопротеина, известного своим иммуносупрессирующим действием (Cavin et. al., 2004).

В экспериментах по изучению модулирующего влияния аналога структуры углеводного компонента транспортных гликопротеидов — хонд-роитинсульфата на действие инсулина показано, что одновременное внесение с инсулином этого гетерополисахарида резко стимулирует синтетическую активность перитонеальных макрофагов мыши in vitro (таблица 24). Одно из возможных объяснений наблюдаемого увеличения функциональной активности макрофагов может заключаться в повышении эффективности доставки инсулина к клеткам-мишеням, приводящей к усилению анаболического действия инсулина в присутствии хондроитинсульфата. Сложность интерпретации полученных результатов заключается в необходимости учета того факта, что макрофаги являются фагоцитирующими и антиген-представляющими клетками (Ройт и др., 2000). Однако, вероятно, приведенные экспериментальные данные свидетельствуют о способности гетеропо-лисахаридов и, в частности углеводных компонентов транспортных глико-протеидов крови, модифицировать влияние инсулина на клетки-мишени и иммунокомпетентные клетки. Возможно, это влияние заключается в использовании для доставки инсулина в клетку клеточного рецептора к хондрои-тинсульфату.

Наличие у выделенных из сывороток здоровых доноров и больных сахарным диабетом связывающих инсулин свойств, характерных для липока-линов, основная функция которого заключается в транспорте широкого спектра малых гидрофобных молекул, послужило поводом для изучения содержания в полученных фракциях ИСБ липидных структур и гидрофобных гормонов.

Для выявления общего содержания липидов в полученных элюатах провели определение холестерола и триглицеридов. В пробах ИСБ из сывороток здоровых доноров содержание холестерола составило 0,07±0,0004 ммоль/л, а в пробах из сывороток крови больных сахарным диабетом — 0,08±0,0007 ммоль/л. Достоверного различия содержания холестерола и триглицеридов в сравниваемых пробах выявлено не было.

С использованием метода иммунолюминесценции установлено, что в связывающих инсулин фракциях сыворотки крови и здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа присутствуют следующие гидрофобные гормоны: 11,0±0,5 нмоль/л тироксина, 1,3±0,06 нмоль/л трийодти-ронина, 7,0±0,03 нмоль/л тестостерона. Обращает на себя внимание тот факт, что в ИСБ содержится не менее 50% всего содержащегося в сыворотке крови трийодтиронина (норма содержания в цельной сыворотке 1,1-2,8 нмоль /л), и значительный процент тестостерона и других гормонов. Нормальное содержание тестостерона в сыворотке крови мужчин среднего возраста составляет 12,1-38,3 нмоль/л, трийодтиронина - 1,1-2,8 нмоль/л, тироксина - 54-156 нмоль/л. Полученные результаты согласуются с данными литературы о влиянии половых гормонов на эффект инсулина на клетки-мишени (Gutierrez et. al., 2007). Возможно, это влияние опосредуется транспортным комплексом, включающим оба гормона.

В изучаемом связывающем инсулин комплексе выявлены также незначительные количества белковых гормонов: 1МЕ/мл лютеинизирующего гормона, 0,03 мкМЕ/мл тиреотропного гормона (норма содержания в сыворотке крови 0,3-3,4 мкМЕ/мл) и 0,5 МЕ/мл пролактина (норма содержания в сыворотке крови 2,5-25 МЕ/мл). Следовательно, гормоны гидрофильной природы, доставляемые в основном поверхностными рецепторами эритроцитов, также входят в состав универсального транспортного комплекса, основу которого составляют транспортные гликопротеиды крови, в том числе, относящиеся к классу липокалинов, способные обеспечить доставку гормонов к клеткам-мишеням при помощи собственных клеточных рецепторов. Таким образом, наряду с инсулином, в сывороточный комплекс, ядро которого формируют транспортные белки, включаются гидрофобные (тироксин, трийодтиронин, тестостерон) и гидрофильные (тиреотропный гормон, про-лактин, лютеинизирующий гормон) гормоны, а также триглицериды и холе-стерол.

На основании полученных данных высказано предположение о присутствии в крови человека общего для гидрофобных и гидрофильных гормонов транспортного комплекса. Возможность существования такого комплекса подтверждается данными о сопряжении транспорта различных гормонов. Так, например, известно, что тироксинсвязывающий преальбумин в крови комплексируется с ретинол - связывающим белком, относящимся к классу липокалинов, за счет чего происходит сопряжение двух транспортных систем - системы транспорта ретинола и тиреоидных гормонов (Wang et. al., 1997, Картун и др., 2000). Вероятно, совместный транспорт многих гормонов в составе единого сывороточного комплекса объясняет многочисленные клинические примеры сочетания сахарного диабета первого типа с другими аутоиммунными поражениями эндокринной системы (Castaño et. al., 1990; Bach, 1994; Балаболкин, 1998). Изменение состава белков транспортирующего гормоны комплекса при сахарном диабете первого типа, вероятно, является причиной снижения включения в комплекс инсулина. Возможно, по этой же причине при сахарном диабете первого типа нарушается доставка к клеткам-мишеням не только инсулина, но и других входящих в комплекс гормонов.

Как известно, одна из функций липокалинов, к которым относятся выявленные в транспортном комплексе трансферин и орозомукоид заключается в обеспечении доставки транспортируемых ими лигандов клеткам-мишеням за счет собственных клеточных рецепторов (Akerstrom et. al., 1981; Bratt, 2000; Fournier et al., 2000; Logdberg et al., 2000). Следовательно, биологическое значение существования выявленного транспортного комплекса может заключаться в повышении надежности доставки гормонов к клеткам-мишеням за счет использования дублирующего механизма связывания гормонов с клетками-мишенями через транспортные гликопротеиды и их клеточные рецепторы, а также за счет сопряжения систем, транспортирующих различные гормоны (Castaño et. al., 1990; Bach, 1994; Fournieret al., 2000; Von Eynatten et. al., 2007).

Экспериментальные данные позволяют сделать предположение о том, что фракция "свободного инсулина" реально представляет собой комплекс транспортных гликопротеинов с гормонами и другими гидрофобными веществами, находящимися в лабильной связи и равновесии с рецепторами клеток-мишеней. Можно предположить, что вероятная схема развития нарушений транспорта инсулина при формировании сахарного диабета заключается в следующей цепи событий.

1. Увеличение в крови концентрации белков острой фазы воспалительной реакции приводит к вытеснению а-фетопротеина из транспортирующего инсулин комплекса аг кислым гликопротеином.

2. Изменение состава белкового ядра комплекса приводит к нарушению включения инсулина в транспортный комплекс плазмы, снижению эффективности доставки инсулина к периферическим тканям и увеличению иммуно-генности комплекса.

3. Происходит компенсаторное увеличение доли эритроцитарного механизма в транспорт инсулина и, следовательно, более интенсивное поглощение инсулина фагоцитирующими клетками, приводящее к более активному представлению антигенных детерминант инсулина дендритным клеткам.

4. Увеличение иммуногенности транспортирующего инсулин сывороточного комплекса и увеличение доли эритроцитарного транспорта инсулина приводят к развитию аутоиммунной реакции на инсулин.

5. Разрушкние Р-клеток в результате аутоиммунной реакции и появление симптомов сахарного диабета. Вероятность реализации этих событий, видимо, определяется генетической предрасположенностью данного человека к сахарному диабету первого типа.

Таким образом, впервые установлено, что в плазме крови человека при участии ионов цинка, инсулин включается в единый для гидрофильных и гидрофобных гормонов транспортный комплекс, ядро которого составляют транспортные белки крови, в том числе, относящиеся к классу липокалинов. Инсулин, входящий в состав этого комплекса, формирует сывороточное депо.

Доступность гормона в этом комплексе для связывания с клеточными рецепторами клеток-мишеней и длительность его присутствия в сыворотке, зависит от состава транспортных белков, формирующих ядро комплекса. Одно из биологических значений включения инсулина в выявленный транспортный комплекс может заключаться в снижении его связывания с эритроном для снижения вероятности его распознавания иммунной системой организма. Показано, что в норме связывающие инсулин белки плазмы крови обладают иммуносупрессирую-щими свойствами. Вероятно, биологическое значение включения инсулина в сывороточный комплекс заключается в его защите от аутоиммунного распознавания и в повышении эффективности доставки гормона к клеткам-мишеням. Необходимость взаимодействия инсулина с транспортными белками плазмы крови, возможно, объясняется наличием в его структуре антигенных детерминант, хорошо распознаваемых собственной иммунной системой. Это предположение подтверждается существованием в крови человека транспортных молекул у антигенно родственных инсулину гормонов релаксина (Tager, 1984) и ин-сулиноподобных факторов роста 1 и 2 (Suikkari et.al., 1988; Lee et.al., 1989).

Установлено, что транспортирующие инсулин белки плазмы крови при физиологических значениях рН формируют транспортный комплекс, ядро которого в норме формируют альбумин, а- фетопротеин и трансферин. Выявленный транспортный комплекс является общим для ряда гидрофильных и гидрофобных гормонов. Комплекс, наряду с инсулином, включает примерно 50% всего содержащегося в сыворотке трийодгиронина, значительный процент тестостерона и других гидрофобных гормонов, а также некоторое количество белковых (пролактина) и гликопротеидных (лютеинизирующего и тиреотропного) гормонов. Можно предположить, что транспортный комплекс содержит оптимальное для клеток соотношение гормонов и его биологическое значение заключается в обеспечении дублирующего механизма доставки гормонов за счет клеточных рецепторов к транспортным белкам.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гарипова, Маргарита Ивановна, Уфа

1. Анциферов М.Б., Любарская С.Г. Сравнение специфического связывания инсулина рецепторами эритроцитов и мононуклеарных клеток крови у больных сахарным диабетом II типа // Сахарный дикабет:Сб. тр. Саратов. мед. Института.-Саратов, 1985.-т.130.-с.11-13.

2. Балаболкин М.И. Эндокринология: Учебное пособие. М.: 1998.

3. Балашова Т. С., Голега Е. Н., Рудько И. А., жд М.И., Кубатиев A.A. Влияние биосинтетического инсулина на перекисное окисление липидов мембран эритроцитов у больных сахарным диабетом I типа. // Проблемы эндокринологии.-1994.-Т. 4.- № 3.- с. 12-15.

4. Басченко И.А., Зарудий Ф.Х., Гарипова М.И., Давлетов Э.Г. Разработка аффинного метода определения гликозилированного гемоглобина в крови человека. / Здравоохранение Башкортостана.-1997.-№6.-С.55-57.

5. Бем Э. Радиальная иммунодиффузия по Ухтерлони // Иммунологические методы.- Фримель Х.-М. 1979.- с. 31-37.

6. Блок Р., Боллинг Д. Аминокислотный состав белков пищевых продуктов. -М.: Мир, 1969.-е. 54-56.

7. Галактионов В.Г. Иммунология. М.: Академия.- 2004.-342 С.

8. Гарипова М.И. Изучение изоэлектрических спектров иммуноглобулинов класса Д больных множественной миеломой.- Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР-Уфа.-1983.-С. 185.-(а).

9. Гарипова М.И. Антигенные варианты иммуноглобулинов класса Д человека.- / Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР-Уфа.-1983.-С.186. -(б).

10. Гарипова М.И., Киреева Т.А., Басченко И.А., Хавкин Ю.А.Изучение влияния заряда антигена на спектротип антител.-/ Аффинная хроматографияантител-теоретические и прикладные аспекты. 1 Всесоюзная конференция .-Москва-1983 .-с.253 .-(в).

11. Гарипова М.И., Фазлыева В.А.,Беишев Я.Х., Хавкин Ю.А Высокочувствительный вариант изоэлектрического фокусирования с иммунопро-явлением.//Лабораторное дело.-1984.-№3 .-С. 159-162.

12. Гарипова М.И. Методы повышения чувствительности изоэлектрического фокусирования./ Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР.-Уфа.-1985 .-С. 153. -(а).

13. Гарипова М.И. Формирование пористой структуры поливинилового спирта с заданными свойствами. / Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР.-Уфа.-1985.-С.154. -(б).

14. Гарипова М.И., Киреева Т.А., Хавкин Ю.А. Исследование молекулярной гетерогенности моноклональных и поликлональных антител. / 5 Всесоюзный биохимический съезд.-1986.-С.34.

15. Гарипова М.И., Басченко И.А., Смирнова H.H. Особенности биоаффинных взаимодействий на ферромагнитных носителях. / 5 конференция молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии.-Пущино.-1988.-С.138.

16. Гарипова М.И., Леплянин Г.В., Антонова Л.Ф., Хавкин Ю.А.-Способ получения иммобилизованных белков.// Авторское свидетельство № 1500670.-1989.

17. Гарипова М.И., Басченко И.А., Сысоева Л.Б. Аффинные сорбенты на основе поливинилового спирта./ Изучение и рациональное использование природных ресурсов.-У фа.-1991 .-С.95 .-(а).

18. Гарипова М.И., Еркеева И.А., Басченко И.А., Сысоева Л.Б. Выделение и очистка на иммобилизованной гиалуроновой кислоте гиалуронидазы семенников северного оленя. / Изучение и рациональное использование природных ресурсов.-Уфа.-1991.-С.97. -(б).

19. Гарипова М.И., Басченко И.А., Монаков Ю.Б. Иммуносорбент на основе поливинилового спирта./ 1 съезд иммунологов России.-Новосибирск.1992.-c.86.-(а).

20. Гарипова М.И., Басченко И.А., Еркеева И.А., Шигапова А.И. Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соедине-ний.//Авторское свидетельство.- № 1789532.- 22 сентября 1992.-(б).

21. Гарипова М.И., Фролова И.С., Клеева О.Б., Кузнецов В.П. // Новый иммуносорбент на основе поливинилового спирта для очистки интерферона.- Доклады академии наук России.-1993.- Т.328.-№6.-736-739.

22. Гарипова М.И., Фролова И.С., Клеева О.Б., Монаков Ю.Б. Кузнецов

23. B.П. //Иммуносорбент для очистки интерферона.// Вопросы вирусологии.1993.-Т.38.-№3.-С. 129.-132.

24. Гарипова М.И., Калимуллина Л.Б. Разработка аффинной диагностической системы для определения гликогемоглобина в капиллярной крови человека. / Сб. «Современные проблемы эволюционной морфологии и фи-зиологии».-Уфа.-1996.-С.59-63, (а).

25. Гарипова М.И. Аффинные сорбенты повышенной стабильности и их использование в биотехнологии и медицинской диагностике. / Сб. «Современные проблемы эволюционной морфологии и физиологии».-Уфа.-1996.1. C.85-89, (б).

26. Гарипова М.И. Бобкова Е.В. Использование сорбента, устойчивого к биодеградации, для аффинного выделения гамма-интерферона./ Сб. «Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.-1996.-с.56, (в).

27. Гарипова М.И. Проблемы и перспективы применения аффинной хроматографии в биотехнологии. / Сб. «Результаты научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета».-1997.-С.7-9 (а).

28. Гарипова М.И. Информативность и методы определения гликозилиро-ванного гемоглобина при состояниях, не связанных с сахарным диабетом. / Сб. «Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.- 1997.-е. 101 -103 (б).

29. Гарипова М.И. Применение аффинных сорбентов повышенной стабильности в биотехнологии.-Вестник Башкирского университета.-1998.-№1.-С.41-44

30. Гарипова М.И. В.Ю., Умнова, Л.И Штыкова, Пиндюрина Т.Е Ин-сулинсвязывающий компонент сыворотки человека в норме и при заболевании сахарным диабетом первого типа.//Вестник Башкирского универси-тета.-2005.-№4.- с.44-46.-(а).

31. Гарипова М.И., Баранова М.В., Розова О.П. Аффинное выделение инсулинсвязывающего компонента сыворотки крови человека и изучение его биохимической природы. //Вестник Башкирского университета.-2005.-№2.-С 46-48.-(б).

32. Гарипова М.И. Транспорт инсулина в крови человека. Уфа.- РИЦ БашГУ.-2007.-127 С.(б)

33. Гарипова М.И., Ибрагимов Р.И., Умнова В.Ю., Розова О.П., Штыкова Л.И. Инсулинсвязывающий компонент сыворотки крови человека в норме и при заболевании сахарным диабетом первого типа. // Клиническая и лабораторная диагностика -2008.-№4.-с. 44-45.

34. Грачева Н.К., Князева А.П., Старосельцева Л.К.-В кн.: Актуальные проблемы физиологии биохимии и патологии эндокринной системы. М.-1972.- 328 С.

35. Грачева Н.К., Харитоненков И.Г. Изучение «связанного инсулина» сывороток крови доноров и больных сахарным диабетом методом кругового дихроизма. // Лабораторное дело.-1977.-стр.8-13.

36. Денисова О.В., Мягкова М.А., Балабанова P.M., Соловьев С.Н. Получение высокоочищенного ревматоидного фактора из сыворотки крови человека для физико-химических и иммунологических исследований. //

37. Лабораторное дело.-1988.-№ 9.-С.48-52.

38. Дин П., Джонс У., Мидл Ф. Аффинная хроматография. Методы.-М.: Мир.-1988.-с. 142-152.

39. Доломатов С.И., Пишак В.П., Слипенюк Т.С., Мещишен И.Ф., Окопная Т.В. Способность эритроцитов депонировать тиреоидные гормоны: регулятоная рольфизико-химических факторов in vitro// Вопросы медицинской химии.- №6.- 1999.-С. С. 572-577 .

40. Запорожан В.Н., Гоженко А.И., Доломатов С.И. Влияние физико-химических факторов in vitro на гормондепонирующую способность эритроцитов человека.- Проблемы эндокринологии.-2001.-т. 47.-№ 5.-С. 4143.

41. Зайцев Е.М., Свиридов В.В., Гарипова М.И., Титова Н.Г., Лебедев B.C. Исследование молекулярной гетерогенности моноклональных и поликло-нальных антител к дифтерийному токсину. /Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-1985.-№2.-С.37-41.

42. Иголкина Л. Руденская Ю., Руденская Г. Аффинные сорбенты на основе хитозана для выделения протеолитических ферментов.// Вестник Московского университета.- Сер.2. Химия.- 2000.-Т. 41.- № 6.- с. 398-401.

43. Картун Л.В., Ходосовская Е.В., Чумаков В.Н. К оценке различий плазменного и сывороточного уровня половых стероидных гормонов и кортизола в свете данных о гормондепонирующей функции эритроцитов //Вопросы медицинской химии.-№9.-2000.-С. 23-30.

44. Касаткина Э.П. Сахарный диабет у детей и подростков.- М.: Медицина.- 1996.- 240 С.

45. Кирдей Е.Г., Дмитриева Л.А. Характер и условия сорбции эритроцитами биологически активных веществ. // Сибирский медицинский журнал.-1995.-№ 2.-е. 23-2 5.

46. Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии. — 2-е изд. Мн.: Беларусью- 1982. - 366 С.

47. Коноваленко O.A., Громакова И.А., Эритроциты как модель исследования инсулин-связывающей активности тканей // Вопросы медицинской химии.-1997.-№7.-с.30-31.

48. Кузнецов В. П., Мехедов Д.М., Киктенко A.B., Соловьев Д.Л. Биохимия и биофизика микроорганизмов.- Горький: 1981.- с. 57-63.

49. Кузнецов В.П. Иммунобиологические основы производства медицинских препаратов интерферона. -М.: 1983.-215 С.

50. Кузнецов В.П. Интерфероны как средство иммуномодуляции. //Иммунология.- 1987.-№4.-с.30-39.

51. Кузовлева О.Б. Иммуносорбенты на основе агарового геля, способные присоединять большие кличества антигена. // Вопросы иммунологии: материалы симпозиума по общей иммунологи. НИИЭМ им. Гамалеи.-1971.-Т.5.-С.64-75.

52. Кузовлева О.Б. Выделение индивидуальных белков при помощи новых иммуносорбентов, способных присоединять большие количества антигена. // Доклады Академии наук СССР.-1972.-т.203.-№ 5.-е. 1193-1195.

53. Кузовлева О.Б., Шаханина К.Л. Сравнение различных способов иммобилизации препаратов чистых антител и неспецифических иммуноглобулинов. // Лабораторное дело.-1982.-№3.-с. 13 7-140.

54. Кузовлева О.Б., Пенарт Э.П., Коллист А.П., Труус К.Э. Свойства аффинных носителей одигозы и одифила (этилсульфоактивированной ага-розы). // Прикладная биохимия и микробиология.- 1989.-Т.25.-№3.-с.417-424.

55. Куриненко Б.М., Шаги-Мухаметова Ф.Ф., Нужина. Использование цианурхлорида для иммобилизации нуклеиновых кислот // Биоорганичеекая химия.-1975.-Т. 1.- с. 1624-1632.

56. Лакин Г.Ф. Биометрия. М: Высш. школа.-1990.-352 С.

57. Мазовецкий А. Гемоглобин эритроцитов как средство надежного контроля диабета. // Диабет. Образ жизни.- 1991.-№1.-с.29-30.

58. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека.- М.: Мир.-2 т, 1993-С.247-263.

59. Машковский М.Д. Лекарственные средства.-М.:Медицина, 1993.-2т.

60. Меньшиков В.В. Справочник лабораторных методов исследования в клинике. М.: Медицина, 1987. - 364 С.

61. Меркулова Е.А., Корн М.Я., Ломакин O.A., Полеско И.В., Харламова Ф.С. Способ диагностики паталогии клеточного иммунитета при хронических вирусных инфекциях// Патент RU (11) 2187813 (13) С2 зарегистрирован 2002.08.20.

62. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука.-1985.-536 С.

63. Офицеров В.И., Ястребов С.И., Николаева E.H., Дедкова Л.М., Покровский А.Г., Фролова С.Б. Композиционные сорбенты для аффинной хроматографии белков // Биоорган, химия. 1994. - т. 20.- N 10. - С. 10891094.

64. Петренко Ю. М., Матюшин А. И., Титов В. Ю., Владимиров Ю. А. Эритроцитарный путь метаболических превращений половых гормонов.

65. Экспериментальная и клиническая фармакология. 1995.-т. 58.-№4.-С. 36-42.

66. Покровский В.М. Коротько Г.Ф. Физиология человека М:2007.

67. Пухальский А.Л., Шмарина Г.В., Лютов А.Г. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2001 - т. 131 - с.564-567.

68. Райхер И.И., Процерова Н.М., Сухова Б.А. Выделение дифтерийного анатоксина с помощью иммуносорбента, приготовленного на основе гидрата окиси алюминия.// Ж. микробиол.-1968.- № 6.-е. 99-101.

69. Решетников С.С. Иммуноферментный анализ альфа-фетопротеина, использование в диагностике заболеваний человека //Новости «Векюр-Бест».-1997.-N6.-C. 12-16.

70. Розенберг М.Э. Полимеры на основе винилацетата //Ленинград. Хим.-1983.-С. 161.

71. Ройт А. Основы иммунологии. М.: Мир, 1991 .-320с.

72. Ройт А., Бростофф Дж., Мейбл Д. Иммунология.- М:.- 2000.- 327с.

73. Сальникова Л.А., Мусатова Н.В. Действие инсулина на антиокислительные ферменты и перекисное окисление липидов в эритроцитах. // Проблемы эндокринологии,-1990.-т. 36.- № 2.-е. 32-34.

74. Скворцов В.Т., Гурвич А.Е. Синтез высокоемкого иммуносорбента с ориентированной иммобилизацией РаЬ-фрагментовдля выделения антигена. // Бюллетень эксперим. биол. и медицины.-т.97.-№2 .-с. 179-180.

75. Сельков С.А. Новый способ выделения и очистки эстроген-связывающего глобулина из ретроплацентарной сыворотки // Вопросы медицинской химии.-1997.-№7.-30-36;

76. Сакодынский К., Бражников В., Волков С. Аналитическая хроматография.- М.:Химия.- 1993.-463 С.

77. Сандуляк Л.И. Эритроциты как депо и система транспорта инсулина // Доклады Академии наук С С С Р.-1974.-Т. 219.-№ 4.-е. 1020-1021;

78. Сандуляк Л.И, Ковалёв В.П. — Иммунофлуоресцентный метод выявления инсулина в эритроцитах. Проблемы эндокринологии.-1978.-т. 24.-№5.-с. 77-78.

79. Старкова Н.Т. Заболевания островкового аппарата поджелудочной железы. В Руководство по клинической эндокринологии.- 1996.-СПБ: Питер.- 544 С.

80. Старосельцева Л.К. Современные вопросы эндокринологии.- М., Медицина.-1972,- т. 4.- с. 123-132.

81. Старосельцева Л.К. Регуляция роста и дифференцировки. М., 1981. — с. 192-206.

82. Старосельцева Л.К. Гормоны поджелудочной железы в патогенезе сахарного диабета.// Вестник АМН СССР.-1983.-№2.-С.28-33.

83. Туркова Я. Аффинная хроматография.- 1980.-347 С.

84. Ушаков С.Н. Поливиниловый спирт и его производные.- М:1960.-245С.

85. Федоров Ю. М., Шаханина К.Л. Получение поликонденсационных иммуносорбентов для выделения противостолбнячных антител // Вопросы иммунологии: Сб. научн. тр. -М., 1974.- с.23 -25.

86. Федорович Е.И., Демидчик Ю.Е., Свиридов О.В. Биомедицинские аспекты взаимодействия тиреоидных гормонов с эритроцитами при ракещитовидной железы.-АОЗТ "Издательский дом "ОГОНЁК".-Москва, 2001.-96 С.

87. Филлипович Ю.Практикум по биологической химии.- М: 1975.293 С;

88. Фримель X. Иммунологические методы М. 1979.-С.38-65.

89. Хавкин Ю.А., Булыгина Н.Г. Высокоэффективный иммуносорбент на основе полиакриламида.// Биоспецифическая аффинная сорбция и ее применение в иммунологии: Сб. научн.тр.-Уфа.-1978.-с.18-39.

90. Хайбуллина С.Ф., Морзунов С.П., Веселов С.Ю., Гарипова М.И. Ранняя диагностика геморрагической лихорадки с почечным синдромом на основе использования рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса пумала. // Микробиология.-№1.-2003.-с.55-59.

91. Харитоненков И.Г. Использование метода аффинной хроматографии в вирусологии. //Вопросы вирусологии.-1977.-№ 1.-C.97-102.

92. Aberkromby D., Allenmark С., Агате С. Some alternative coupling chemistries for affinity chromatography// Mol. Biotechnol. 1994. - N 2. - p. 157-178.

93. Ahn J., Chung K., Kim D. Systematic identification of hepatocellular proteins interacting with NS5A of the hepatitis С virus. // J. Biochem. Mol. Biol. 2005.- v. 37.- N 6.- p. 741-748.

94. Akerstrom B. ,Logdberg, L. Lipocalins // Scand. J. Immunol.-1981.-v. 24,-p. 575-581.

95. Akerstrom B. and Logdberg, L. Microglobulin ai //Trends in Biochem. Sci.-1990.-v. 15.-p. 240-243.

96. Akerstrom B. and Enghild J. Alphaj-microglobulin //J. Biol. Chem.1995.-v. 270.-p. 4478-4483.

97. Akerstrom, B. aj-Microglobulin: a yellow-brown lipocalin.// Biochim. Biophys. Acta.-2000.-v. 1482, 172-184.

98. Akerstrom В., Maghzal G., Winterbourn C., Kettle A. The lipocalin al-phai-microglobulin has radical scavenging activity. // J. Biol. Chem. 2007.v.282.- N 43.- p. 31493-31503.

99. Allen H. Jonson E. Isolation and partial characterization of lectin from vicia faba.//Biochem. Biophys. Acta.-1976.-v.444.-p.374-385.

100. Alpert E., Drysdale J., Isselbacher K., Schur P. Human -Fetoprotein. Isolation, characterization, and demomstration of microgeterogenity. // J. Biol. Chem.-1972.-v. 247.- p. 3792 3798.

101. Andersen, J.F., Weichsel, A., Balfour, C.A., Champagne, D.E., Montfort, W.R. The Crystal Structure of Nitrophorin 4 at 1.5 Angstrom Resolution: Transport of Nitric Oxide by A Lipocalin-Based Heme Protein. Structure 6: 1315-1327, 1998.

102. Andrews G., Dziadek M., Tamaoki T. Expression and methylation of the mouse alpha-fetoprotein gene in embryonic, adult, and neoplastic tissues. // J. Biol. Chem.-1982.-v. 257.- p. 5148 5153.

103. Anfinsen O., Bose R., Corley L.A. Partial purification of human interferon by affinity chromatography. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1974.-v.71.-p. 3139-3142.

104. Ansorge W.de Macyer L., /J. Chromatogr.-1980.- v. 202.- p.45-53.

105. Aoyagi Y., Takahashi Y., Odani S., Ogata K., Ono T., Ichida F. Inhibitory effect of alpha-fetoprotein on protein synthesis in a reticulocyte lysate cellfree system. // J. Biol. Chem.-1982 .- v. 257.- p.9566 9569.

106. Apiraksakom J, Nitisinprasert S, Levin RE Grass Degrading beta-1,3-1,4-D: -glucanases from Bacillus subtilis GN156: Purification and Characterization of Glucanase J1 and pJ2 Possessing Extremely Acidic pi. //Appl. Biochem.

107. Biotechnol.- 2008.-v.149.-N l.-p. 53-66.

108. Aizawa P, Winge S, Karlsson G. Large-scale preparation of thrombin from human plasma. // Thromb Res. -2008.- N 37.- p. 54-59.

109. Arrigoni G., Pagano M., Sarno S., Cesaro L., James P., Pinna L. Mass Spectrometry Analysis of a Protein Kinase CK2beta Subunit Interactome Isolated from Mouse Brain by Affinity Chromatography. // J. Proteome Res.-2008.-V. 7.- N 3.-p. 990-1000.

110. Astrom A., Pettersson U., Voorhees J. Structure of the human cellular retinoic acid-binding protein II gene. Early transcriptional regulation by retinoic acid. // J. Biol. Chem.-1993.- v. 267.- N 35.- p. 25251-2525.

111. Atkinson M., Maclaren N.,Scharp D. 64 000 Mr autoantibodies as predictor of insulin-dependent diabetes.-Lancet.-1990.-V.35.-P. 1357-1360.

112. Arnaud P., Miribel, L. and Roux, A. F.// Methods Enzymol. -1988.-Y. 163.-p. 418-431.

113. Austin G., Mullins R., Morin L. Non-enzymatic glycation of individual plazma proteins. // Clin. Chem. -1987.- v. 33.- p. 2220-2224.

114. Axen R., Porath J., Ernback S. Chemical coupling of peptides and proteins to polysaccharides by means of cyanogen halids // Nature (London).-1967,-v. 214.-p.l302-1304.

115. Bach J. Insulin-dependent diabetes mellitus as an autoimmune disease.-Endocr. Rev.- 1994,-v. 15.-p.516-542.

116. Bagshaw S., Bellomo R. Early diagnosis of acute kidney injury. // Curr. Opin. Crit. Care.- 2007.-V. 13.-N 6.-p. 638-644.

117. Bajaj I. Insulin and Metabolism. Amsterdam.-1977.-p.86-91.

118. Basset C., Dedieu A., Guerin P., Quemeneur E., Meyer D., Vidaud C. Specific capture of uranyl protein targets by metal affinity chromatography. // J. Chromatogr.-2008.- v. 28.-N 2.-p. -233-240.

119. Belayew A., Tilghman S. Genetic analysis of alpha-fetoprotein synthesis in mice. // Mol. Cell. Biol.-1982.-v. 2.-p. 1427 1435.

120. Beilby O., Home C., Milne G., Parkinson C. Alpha-fetoprotein, alpha-1antitrypsin, and transferrin in gonadal yolk-sac tumours. // J. Clin. Pathol.-1979.-v. 32.- p. 455 -461.

121. Berg K. Sequvential antibody affinity chromatography of human leukocyte interferon. //J. Immunol.-1977.- v.6.- p. 77-86.

122. Berg K., Ogborn C., Pauchker K. Affinity chromatography of human leukocyte and diploid cell interferons on sepharose bound antibodies // J. Immunol. 1975.-V.114.-p.640-644.

123. Berg K., Heron I., Hamilton R. / Purification of human interferon by antibody affinity chromatography using highly absorbed anti-interferon // Scand. J. Immunol.-1978.-v.8.-p. 429-436.

124. Berg K., Heron I. The complete purification of human leucocyte inter-feron.//Scand. J. Immunol.- 1980,-v. 11.- p.480-502.

125. Berde C., Nagai M;, Deutsch H. Human alpha-fetoprotein. Fluorescence studies on binding and proximity relationships for fatty acids and bilirubin. // J. Biol. Chem.-1979.- v. 254.-p. 12609 12614.

126. Bernfeld P. ,Wan J. Antigens and enzymes made insoluble by entrapping them into lattices of synthetic polimers. // Science .-1963.- V.142.-N 3563.-p. 678-679.

127. Berthold W., Tan C., Tan Y. Purification and in vitro labeling of interferon from a human fibroblastoid cell line.// J. Biol. Chem.-1978.-v.253.-p.5206-5212.

128. Blanco-Vaca F., Via, D. P., Yang, C.-Y., Massey, J. B. and Pownall H.J.//(1992).-J. Lipid Res. 33, 1785-795.

129. Blaese M., Santo-Hoeltje L., Rodemann H. CRABP I expression and the mediation of the sensitivity of human tumour cells to retinoic acid and irradiation. // Int. J. Radiat. Biol.-2004.- v. 79.- N12.- p. 981-991.

130. Blundell T.L., Humbel R.E. Hormone families: pancreatic hormones and homologous growth factors.// Nature.- 1980.-V. 287.-p.781-787.

131. Blouqui Y Calvi M., Chen-Marote J. Purification of human erythrocyte phosphoglycerate kinase by dye ligand affinity chromatography.- J. Chrom-togr.v.258.-1983.-p. 213-222.

132. Bocskei, Z., Groom, C.R., Flower, D.R., Wright, C.E., Phillips, S.E.V., Cavaggioni, A, Findlay, J.B.C, North, A.C.T. Pheromone Binding to 2 Rodent Urinary Proteins Revealed by X-Ray Crystallography. Nature. 360: 186-188, 1992.

133. Bollin E., Vastola K., Oleszek D. The interaction of mammalian interferons with immobilized cibacron Blue, modulation of binding strength. // Prep. Biochem. -1978.-V.8.- p.266-274.

134. Bollin E., Sulkovski E. Metal chelate affinity chromatography of hamster interferon. // Arch. Virol.-1978.- v. 58.-p.l49-152.

135. Boguski M., Peitsch M. The first lipocalin with enzymatic activity. // Trends Biochem. Sci.-1991.- v. 16.- N 10.- p.361-363.

136. Boysen R., Hearn M. HPLC of peptides and proteins: standard operating conditions. // Curr.Protoc.Mol.Biol.-2001.-Chapter lO.-Unit 10.13.

137. Borchers T., H0jrup P., Nielsen S. Revision of the amino acid sequence of human heart fatty acid-binding protein. // Mol. Cell. Biochem. 1991.-v. 98.-N 1-2.-p. 127-133.

138. Borchers T., Hohoff C., Buhlmann C., Spener F. Heart-type fatty acid binding protein involvement in growth inhibition and differentiation. // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids.-1997.- v. 57.- Nl.-p. 77-84.

139. Borghoft, S. J., Short, B. G. and Swenberg, J. A. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1990.-v.30.-p. 349-367.

140. Bonventre J. Urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a marker of acute kidney injury in critically ill children. // Nat Clin Pract Nephrol. -2008.-V. 4.-N 2 .-p. 78-79.

141. Bourguignon J., Diarra-Mehrpour M., Sesboiie R. Human inter-alpha-trypsin-inhibitor: characterization and partial nucleotide sequencing of a light chain-encoding cDNA. // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1985.- v. 131.- N 3.- p. 1146-1153.

142. Bratt T. Retinoic acid binding protein // Biochim.biophys.acta. 2000 -N. 1482. -p.318-326.

143. Breborowicz J., Tamaoki T. Detection of Messenger RNAs of a-Fetoprotein and Albumin in a Human Hepatoma Cell Line by in Situ Hybridization. // Cancer Res.- 1985.-v. 45.-p. 1730- 1736.

144. Briand, L. 2002 Evidence of an odorantbinding protein in the human olfactory mucus: location, structural characterization, and odorant-binding properties. // Biochemistry.-2002.-V. 41.-p. 7241-7252 .

145. Bridgen P., Anfinsen C., Corley L. Human lymphoblastoid interferon. Large scale production and partial purification. J. Biol. Chem.-1977.-v. 252.-p. 6585-6587.

146. Brownlee M., Vlassara H., Cerami A. Measurement of glycosylated amino acids and peptides from urine of diabetic patients using affinity chromatography. // Diabetes.-1980.- v. 29.-p. 1044-1047.

147. Brownlow, S, Cabral, J.H.M, Cooper, R., Flower, D.R., Yewdall, S.J., Polikarpov, I., North, A.C.T., Sawyer, L. Bovine Beta-Lactoglobulin at 1.8 Angstrom Resolution Still an Enigmatic Lipocalin. Structure. 5: 481-495, 1997.

148. Buamah P., Harris R., James O., Skillen A. Lentil-lectin-reactive alpha-fetoprotein in the differential diagnosis of benign and malignant liver disease. //

149. Clin. Chem.-1986.-v. 32.-p. 2083 2084.

150. Bunt J., Rietveld T., Schierbeek H., Wattimena J., Zimmermann L., Gou-doever J. Albumin synthesis in preterm infants on the first day of life studied with 1-13C. leucine. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.-2007.-v. 292.-p.1157- 1161.

151. Campbell D.H., Luecher E.L., Lerman L.S. Immunological adsorbents. Isolation of antibody by means of a cellulose protein antigen// Proc. Nat. Acad. Sci.U.S.-1951.-V. 37. -N9.-P.575-578.

152. Camper S., Tilghman S. Postnatal repression of the alpha-fetoprotein gene is enhancer independent. // Genes and Dev.-1989.-v. 3.-p. 537 546.

153. Cantell K., Hirronen S. Prepararion of human leukocyte interferon for clinical use. // Texas Rep. Biol. Med.-1977.-v. 35.-p. 138-244.

154. Carrel S., Barandum S. Protein-conteining polyacrylamide gels: their use as immunosorbents high capacity. // Immunochem. .- 1971.- v. 8.- N 1.- p. 3948.

155. Carroll S., Roth K., Gordon J. Liver fatty acid-binding protein: a marker for studying cellular differentiation in gut epithelial neoplasms. // Gastroenterology 1990.- v. 99.- N 6.- p. 1727-1735.

156. Castaño L., Eisenbarth G. Type-I diabetes: a chronic autoimmune diseaseof human, mouse and rat. // Annu.Rev. Immunol.-1990.- v. 8.- p. 647-679.

157. Chassin D., Laurent A. , Janneau J.L., Berger R., Bellet D. Cloning of a new member of the insulin gene superfamily (INSL4) expressed in human placenta. // Genomics.-1995.-v. 29.-p. 465-470;

158. Chan L., Wei C., Li W. Human liver fatty acid binding protein cDNA and amino acid sequence. Functional and evolutionary implications. // J. Biol. Chem.-1985.-v. 260.-N5.-p. 2629-2632.

159. Cheon M., Kim S., Fountoulakis M., Lubec G. Heart type fatty acid binding protein (H-FABP) is decreased in brains of patients with Down syndrome and Alzheimer's disease. //J. Neural Transm. Suppl.-2004.-v. 67.-p.225-234.

160. Chen Y., Luo W., Wang M., Wang J., Li L., Yuan Q., Zhang J, Xia N. Isolation of human antibodies against hepatitis E virus from phage display library by immobilized metal affinity chromatography. // Biomed Environ Sci.-2007.- V.20.-N 6.- p. 488-494.

161. Coban T., Beydemir S., Gu^in I., Ekinci D. The effect of ethanol on erythrocyte carbonic anhydrase isoenzymes activity: An in vitro and in vivo study. // J. Enzyme. Inhib. Med. Chem.- 2008.- v. 23.-N 2 .-p. 266-270.

162. Chan T., Chen H., Chen Y., Lee C., Chou F., Chen IJ., Chen S., Jong S., Tsai E. Increased serum retinol-binding protein 4 concentrations in women with gestational diabetes mellitus. // Reprod Sci.- 2007.V.14.- N 2.-p.l69-174.

163. Chaudhuri B., Kleywegt G., Broutin-L'Hermite I. Structures of cellular retinoic acid binding proteins I and II in complex with synthetic retinoids. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.-2000.- v. 55.- N 11.- p. 1850-1857.

164. Chen X., Tordova M., Gilliland G. Crystal structure of apo-cellular retinoic acid-binding protein type II (R111M) suggests a mechanism of ligand entry. // J. Mol. Biol. -1998.- v. 278.- N 3.-p. 641-653.

165. Cesario T., Schryer P., Mandel A. Affinity of human fibroblast interferon for Blue Dextran. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1976.- v. 153.-p. 486-489.

166. Coakley J., Kellie S., Nath C., Munas A., Cooke-Yarborough C. Interpretation of alpha-fetoprotein concentrations in cerebrospinal fluid of infants. // Ann Clin Biochem.- 2005.-v. 42.- p. 24 29.

167. Coles, M., Diercks, T., Muehlenweg, B., Bartsch, S., Zolzer, V., Tschesche, H., Kessler, H. // The Solution Structure and Dynamics of Human Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin. Journal of Molecular Biology, 289: 139-157, 1999.

168. Cowan S.W., Newcomer, M.E., Jones, T.A. Crystallographic Refinement of Human Serum Retinol Binding- Protein at 2 angstroms Resolution. Proteins-Structure Function and Genetics. 8: 44-61, 1990.

169. Cram E.D., Mc. Gregor D.M. Isolation of antibody by means of a cellulose-protein antigen//Cell immunol.-1976.-v.23.-p.211-222.

170. Cuatrecasas P. Protein purification by Affinity Chromatography // J. Biological Chemistry.-1970.-v.245.-N12.-p.3059-3065.

171. Cuatrecasas P., Elg S.A., Mayer A.R., Carson L.F. et al. // Cancer 1997-V.80 -P.1448-1456.

172. Dabeva M., Laconi E., Oren R., Petkov P., Hurston E., Shafritz D. Liver Regeneration and -Fetoprotein Messenger RNA Expression in the Retrorsine Model for Hepatocyte Transplantation. // Cancer Res.-1998.-v. 58.- p. 5825 -5834.

173. Davey M., Huang J., Sulkovski E. Hydrophobic interaction of human interferon with concanavalin A-agarose. // J. Biol. Chem.-1974.- v. 249.-p. 63546355.

174. Davey M., Sulkovski E., Carter W. Hydrophobic interaction of human, mouse and rabbit interferons with imibilised hydrocarbons. // J. Biol. Chem.-1976.- v. 251.-p. 7620-7625.

175. Day J., Ingebretsen C., Ingebretsen W., Baynes J. Thorpe. Nonenzymatic glucosylation of serum proteins and hemoglobin: response to changes in blood glucose levels in diabetic rates. //Diabetes.- 1980.- v. 29.- p.524-527.

176. De Maeyer-Guignard J., Tovey M., Gresser I. Purification of mouse interferon by sequential affinity chromatograpy on poly(U)-and antibody-agarose columns.-Nature.-1978.-v.271.-p.622-625.

177. Despouy G., Bastie J., Deshaies S. Cyclin D3 is a cofactor of retinoic acid receptors, modulating their activity in the presence of cellular retinoic acid-binding protein II. // J. Biol. Chem. -2003.- v. 278.- N 8.- p. 6355-6362.

178. De Maeyer-Guignard J., Tang M., De Maeyer F. Binding of mouse interferon to polynucleotides. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1977.- v. 74.- p.3787-3790.

179. De Maeyer-Guignard J., Tovey M., Gresser I. Purification of mouse interferon by sequential affinity chromatografy on poly-(U) and antibody-agarose columns. //Nature.- 1978.- v. 271.-p. 622-625.

180. Dean P., Brown A., Bouriotis J. U.K. Patent .-1980.-N 2024829.

181. Deng L., Xu Y., Huang J. Developing a double-antigen sandwich ELISA for effective detection of human hepatitis B core antibody. // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis.- 2008,-v. 31p. 182-189.

182. Diarra-Mehrpour M., Bourguignon J., Sesboiie R. Structural analysis of the human inter-alpha-trypsin inhibitor light-chain gene. // Eur. J. Biochem. -1990.-v. 191.-N1.-p. 131-139.

183. Dong X., Tang B., Li J., Xu Q., Fang S., Hua Z. Expression and Purification of Intact and Functional Soybean (Glycine max) Seed Ferritin Complex in Escherichia coli. // J. Microbiol. Biotechnol.- 2008.-v.18.-N 2.-p. 299-307.

184. Duncan B., Heiss G. Nonenzymatic glycosylation of proteins a new tool for assessment of cumulative hyperglycemia in epidemiologic studies, past and future.- Am. J. Epidemiol.-1984,-v. 120.-p.l69-189.

185. Ekstrom B., Berggard I. Human alpha 1-microglobulin. Purification procedure, chemical and physiochemical properties. // J. Biol. Chem. 1977.- v. 252.- N22.- p. 8048-8057.

186. Edy V., Billfau A., De Somer P. Purification of human fibroblast interferon by zinc chelate affinity chromatography. // J. Biol. Chem.-1977.-v.252.-p. 5934-5935.

187. Eichinger A., Nasreen A., Kim H., Skerra A. Structural insight into the dual ligand specificity and mode of high density lipoprotein association of apol-ipoprotein D. // J. Biol. Chem.- 2007,-v. 282.- N 42.- p.31068-31075.

188. Elkakz A., Matta H., Uzun L. One-step separation of IgG subclasses of

189. DNA hydrolyzing autoantibodies: a study on sera of patients with systemic lupus erythematosus and primary antiphospholipid syndrome by histidine ligand affinity chromatography. // Prep. Biochem. Biotechnol.-2008. v. 38. -N 2.- p. 139-151.

190. Enghild J., Salvesen G., Hefta S. Chondroitin 4-sulfate covalently crosslinks the chains of the human blood protein pre-alpha-inhibitor. // J. Biol. Chem.- 1991.- v. 266.- N 2.-p. 747-751.

191. Eksinck J., Cooms J., Williams R. Studies in Vitro of the Transport of the A and B Chains of Insulin in Serum. // J. of Immunological Invest. 1964.-v. 239.-N10.- p. 3372-3381.

192. Eller M., Oleksiak M., McQuaid T. The molecular cloning and expression of two CRABP cDNAs from human skin. // Exp. Cell Res. -1992.-V. 198.-N2.-p. 328-336.

193. Elmendorf J. Fluidity of insulin action. // Molecular Biotechnology.-2004.- v. 27.-N2.-p. 127-138.

194. Erickson J., Paucker K. Purification of acid ethanol-extracted human lymphoid interferons by Blue Sepharose chromatography. Anal. Biochem.1979.- v. 98.- p. 214-218.

195. Erickson J., Dalton B., Paucker K. Biological properties of human interferon fractions obtained by Blue Sepharose chromatography. // Arch. Virol.1980.- v. 63,- p. 253-261.

196. Espe K.,Galler A., Raila J., Kiess W., Schweigert F. High-normal C-reactive protein levels do not affect the vitamin A transport complex in serumof children and adolescents with type 1 diabetes. // Pediatr.Res.-2007.-v.62.-N 6.-p. 741-745.

197. Farrar M., Schreinber R. The molecular cell biology of interferon-y and its receptor. // Annu. Rev. Immunol.-1993.-N 1 l.-p. 571-611.

198. Flower D., Attwood T., North A.,C Mouse oncogene protein 24p3 is a member of the lipocalin protein family. // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1991.-V. 180.-N l.-p. 69-74.

199. Flower, D. R., North, A. C. T. and Attwood, T. K. Structure and sequence relationships in the lipocalins and related proteins.- 1993.- Protein Sci. .- N 2.-p. 753-761.

200. Flower, D.R. the Lipocalin Protein Family: Structure and Function.// Biochem. J. -1996.- v. 318.- p. 1-14.

201. Flower, D. R., Sansom, C. E., Beck, M. E. and Attwood, T. K. (1995) Trends Biochem.Sci. 20, 498-499

202. Flower D. R. The lipocalin protein family: structure and function. // Biochem. J. -1996.-V. 318.- p. 1-14.

203. Forest J., Verreault F., Pouliot M. Measurement of alpha-fetoprotein in maternal serum: three commercial radioimmunoassay kits and two noncommercial radioimmunoassays compared.// Clin. Chem.-1982.-v. 28.-p. 339 -343.

204. Frengen J., Schmid R., Kierulf B., Nustad K., Paus E., Berge A., Lindmo T. Homogeneous immunofluorometric assays of alpha-fetoprotein with macroporous, monosized particles and flow cytometry. // Clin. Chem.-1993.-v. 39.- p. 2174-2181.

205. Frolund B., Keiding K. Implementation of an HPLC polystyrene divinyl-benzene column for separation of activated sludge exopolymers. // Appl. Microbiol. and Biotechnol. 1994. - v. 41.- N 6. -p.708-716.

206. Falkenberg C.s Grubb A., Akerstrom B. Isolation of rat serum alpha 1-microglobulin. Identification of a complex with alpha l-inhibitor-3, a rat alpha 2-macroglobulin homologue. // J. Biol. Chem. -1990.- v. 265.- N27.- p. 1615016157.

207. Fernandez-Luna J. L., Levy-Cobian, F. and Mollinedo, F. // FEBS Lett-1988.-v. 236.-p. 471-474.

208. Fisher E.A. in: Affinity Chromatography and Related Techniques. -Elsvie.- Amsterdam.- 1982.- POSTER A 15.

209. Fleischer A., Kurtz A., Wapner R., Ruch D., Sacks G., JeantyP., Shah D., Boehm F. Elevated alpha-fetoprotein and a normal fetal sonogram: association with placental abnormalities. // Am. J. Roentgenol.- 1988,-v. 150.-p. 881 883.

210. Flory I. Chain structure of vinil and diene polymers in relation to polymerization mechanism. //1. Polymer Sci.-1947.-v.2.-p.36-32.

211. Flory I J. Chain structure of vinil and diene polymers in relation to polimerization mechanizm// J. polymer Sci.-1947.-v. 2.-p.36-39.

212. Folkesson M., Kazi M., Zhu C., Silveira A., Hemdahl A., Hamsten A., Hedin U., Swedenborg J., Eriksson P. Presence of NGAL/MMP-9 complexes in human abdominal aortic aneurysms. // Thromb. Haemost.- 2007.-V. 98.- N 2.-p.427-3

213. Fournier T., Medjoubi N., Porquet D. // Biochim.biophys.acta. 2000 -V.1482. - P.157-171.

214. Frolund B., Keiding K. /Implementation of an HPLC polystyrene divi-nylbenzene column for separation of activated sludge exopolymers.//Appl. Microbiol. and Biotechnol. 1994. - 41, N 6. - C. 708-716.

215. Fung K., Ng M. Purification of human diploid fibroblast interferon by immobilized neuraminidase. // Arch. Virol.- 1978,-v. 57.-p. 185-188.

216. Fujii H., Ichikawa K., Takagaki T., Nakanishi Y., Ikegami M., Hirose S., Shimoda T. Genetic evolution of fetoprotein producing gastric cancer. // J. Clin. Pathol.-2003.-v. 56.-p. 942 949.

217. Garipova M.I., Kalimullina L.B. Estimation of tissue metabolism damage and approach to it's correction./ 33 International Congress of Physiologica Sci-ence.-St.Petersburg.-1997.-p.543.

218. Gasymov 0., Abduragimov A., Glasgow B. Characterization of fluorescence of ANS-tear lipocalin complex: evidence for multiple-binding modes. // Photochem. Photobiol.-2007,-v. 83.-N 6.-p. 1405-1414.

219. Gasymov O., Abduragimov A., Merschak P., Redl B., Glasgow B. Oli-gomeric state of lipocalin-1 (LCN1) by multiangle laser light scattering and fluorescence anisotropy decay. // Biochim. Biophys. Acta.- 2007.-V.1774.- N 10.- p.1307

220. Gasymov O., Abduragimov A, Glasgow B. Evidence for internal and external binding sites on human tear lipocalin. // Arch. Biochem. Biophys.-2007.-v. 468.-N 1.-p. 15-21.

221. Gasymov O., Abduragimov A., Glasgow B. Ligand binding site of tear lipocalin: contribution of a trigonal cluster of charged residues probed by 8-anilino-l-naphthalenesulfonic acid. // Biochemistry, -2008.-v.47.- N 5.-p. 14141424.

222. Gerhard D., Wagner L., Feingold E. The status, quality, and expansion of the NIH full-length cDNA project: the Mammalian Gene Collection (MGC). //

223. Genome Res. -2004.- v. 14.- N 10B.- p. 2121-2127.

224. Glatz J., Borchers T., Spener F., van der Vusse G. Fatty acids in cell signalling: modulation by lipid binding proteins. // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids .- 1995.- v. 52.- N 2-3.- p. 121-127.

225. Gitlin D., Perricelli A., Gitlin G. Synthesis of a-Fetoprotein by Liver, Yolk Sac, and Gastrointestinal Tract of the Human Conceptus. // Cancer Res.-1972.-V. 32,-p. 979-982.

226. Godbout R., Tilghman S. Configuration of the alpha-fetoprotein regulatory domain during development. // Genes and Dev.-1988.-v. 2.-p. 949 956.

227. Govin R., Roth J. Insulin-binding erythrocyte receptors. // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.-1972.-V.69.-N 3.-p.747-751.

228. Grob P., Chadha K. Purification of human leukiocyte interferon components by concanavalin -Sepharose affinity chromatography and their characterization." Biochemistry.-v. 18.-p. 5782-5786.

229. Gupta K.,Shukla M., Cowland J., Malemud C., Haqqi T. Neutrophil ge-latinase-associated lipocalin is expressed in osteoarthritis and forms a complex with matrix metalloproteinase 9. // Arthritis. Rheum.-2007.-v.56. — N 10.- p. 3326-3335.

230. Gutierrez S., De Paul A., Petiti J. The regulatory action of estradiol in interaction with insulin on the secretory and proliferative lactotroph cell. // Steroids. -2008.-v.73.-N 5.-p. 515-527.

231. Guthrow C., Morris M., Day J., Thorpe S., Baynes J. Enhanced nonen-zymatic glucosylation of human serum albumin in diabetes mellitus. // Proc. Nat. Acad Sci. USA.- 1979.-v.76.-p.4258-4261.

232. Garlick R., Mazer J. The principal site of nonenzymatic glycosylation of human serum albumin in vivo. // J. Biol. Chem.- 1983.-V.258.-6142-6146.

233. Garlick R., Mazer J., Higgins P., Bunn H. Characterization of glycosylated hemoglobins.-J. Clin.-Invest.- 1983.- v. 71.- p. 1062- 1072.

234. Garipova M., Minibaeva Z., Kalimullina L. Estimation of tissue metabolism damage and approach to it's correction//33 International Congress of Physiologica Science.-St.Petersburg.-1997.-P.543.

235. Gould В., Hall P., Cook J. Measurement of glycosylated hemoglobin using an affinity chromatography method. // Clin. Chim. Acta .-1982.- v. 125.-p.41-48.

236. Gasymov O., Abduragimov A., Glasgow B. Characterization of fluorescence of ANS-tear lipocalin complex: evidence for multiple-binding modes. // Photochem Photobiol.- 2007,-v. 83.-N 6 .-p. 1405-1414.

237. German H., Geel R., Герм. Пат. 516996; Амер.Пат. 1672156, 1924.

238. Gebhard W., Schreitmiiller Т., Vetr H. Complementary DNA and deduced amino acid sequences of porcine alpha 1-microglobulin and bikunin. // FEBS Lett. 1990.- v. 269.- N l.-p. 32-36.

239. Goodman, W.S (1984) in The Retinoids (Sporn, M. В., Roberts, A. B. and Goodman, W. S, eds.).-v. 2, pp. 41-88, Academic Press, New York.

240. Gluszek J., Szszesniak, L., Banaszak, F., Tykarski, A.R. and Rychlewski, T. (1990) Pol. Arch. Med.r 101, 191-196.

241. Grubb A., Mendez, E., Fernandez-Luna, J. L., Lopez, C., Mihaesco, E. and Vaerman, J.-P. // J. Biol. Chem. -1986.-v.281.- p. 14313-14320.

242. Godovac-Zimmermann J. The structural motif of beta-lactoglobulin andretinol-binding protein: a basic framework for binding and transport of small hydrophobic molecules? // Trends Biochem. Sci. -1988.- v. 13 .-N 2.- p. 64-66.

243. Goetz, D.H. et al. (2002) The neutrophil lipocalin NGAL is a bacteriostatic agent that interferes with siderophore-mediated iron acquisition// Mol. Cell 10, 1033-1043.

244. Goldstein L., Georgiades J., Landford M. Human immune interferon isoelectrofocusinganalysis. //IPCS Med. Sci.- 1979.-v.7.-p.560-566.

245. Gruenwedel D., Fu J. Mercurated dextran column chromatography for fractionating mononucleotides. // Proc. Nat. Sci. USA.-1971.- v. 68.- p.2002-2005.

246. Hage D. S. Handbook of Affinity Chromatography. //Chromatographic Science Series.- Vol. 92.- 2006.- 944 p.

247. Hashimoto T., Kusakabe T., Sugino T. Expression of heart-type fatty acid-binding protein in human gastric carcinoma and its association with tumor aggressiveness, metastasis and poor prognosis. // Pathobiology.- 2005.-v. 71.- N 5.- p. 267-273.

248. Heine J., Mikulski A., Sulkovski E. Stabilization of human fibroblast interferon purified on concanavalin A-agarose. // Arch. Virol. -1978.- v. 57.- p. 185-188.

249. Hirsch R., Dent C., Pfriem H., Allen J., Beekman R., Ma Q., Dastrala S., Bennett M., Mitsnefes M., Devarajan P. NGAL is an early predictive bio-marker of contrast-induced nephropathy in children. // Pediatr. Nephrol.- 2007.-v.22.- N 12.- p. 2089-2095.

250. Horn F., Ettinger B., Lin M. Comparison of serum fructosamine and measures of glycemic control in large diabetic population // Acta Diabetologica .-1998.-v.35.-p. 48-51.

251. Hubbuch A. Separation of glycosylated haemoglobins using immobilized phenylboronic acid. Effect of ligand concentration, column operating conditions and comparison with ion-exang and isoelectric-focusing. // Biochem.J.-1983.-V.209.-N 3.-p.771-779.

252. Humbel R.E. Insulin-like growth factors I and II. // Eur. J. Biochem. -1990.-v.l90.-p.445-462;

253. Huynh H., Larsson C., Narod S. Pollak M. Tumor suppressor activity of the gene encoding mammary-derived growth inhibitor. // Cancer Res. 1995.-V.55.-N11.- p. 2225-2231.

254. Hess M., Katzer M., Antranikian G. Extremely thermostable esterases from the thermoacidophilic euryarchaeon Picrophilus torridus. // Extremo-philes.-2008.-N 4.-p. 76-81.

255. Higgins P., Garlick R., Bunn H. Glycosilated haemoglobin in human and animal red cells.//Diabetes.-1982.-v.31.-p.743-748.

256. Holden, H.M., Rypniewski, W.R., Law, J.H., Rayment, I. the Molecular-Structure of Insecticyanin from the Tobacco Hornworm Manduca-Sexta L at 2.6 A Resolution. Embo Journal. 6: 1565-1570, 1987.

257. Horn F., Ettinger B., Lin M. Comperison of serum fructosamine and gly-cohemoglobin as measures of glycemic control in large diabetic population. // Acta Diabetologica.-1998.-v. 35.-N l.-p. 48-51.

258. Hook M. Cell-surface glycosaminoglycans. // Annu. Rev. Biochem.-1981.- v. 50.-p. 555-557.

259. Hosokawa S., Muramatsu M., Nagaike K. Detection of Membrane-bound a-Fetoprotein in Human Hepatoma Cell Lines by Monoclonal Antibody 19F12. // Cancer Res.-1989.- v. 49.-p. 361 366.

260. Hiilsmeier A., Paesold-Burda P., Hennet T. N-Glycosylation Site Occupancy in Serum Glycoproteins Using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. // Mol. Cell. Proteomics. -2007.-V. 6.-p. 2132-2138.

261. Huang J., Davey M., Hejna C., Selective binding of human interferon to albumin immobilized on agarose. // J. Biol. Chem.-1974.- v. 249.-p. 4665-4667.

262. Huang Y., Chapelle A., Pellegata N. Hypermethylation, but not LOH, is associated with the low expression of MT1G and CRABP1 in papillary thyroid carcinoma. // Int. J. Cancer .-2003.- v. 104 .- N 6.- p. 735-744.

263. Inman J., Dintzis H. The derivatization of crosslinked polyacrilamide beads. Controlled introduction of functional groups for the preparation of special-purpose, biochemical adsorbents// Biochem.- 1969.-V.8.-N 10.-p.4074-4082.

264. Innis A., Miller D. Alpha-Fetoprotein gene expression. Partial DNA sequence and COOH- terminal homology to albumin. // J. Biol. Chem.-1980.-v. 255.-p. 8994 8996.

265. Ikeda K., Sakamoto Y., Kawasaki Y., Miyake T., Tanaka K., Urata T., Katayama Y., Ueda S., Horiuchi S. Determination of glycated albumin by enzyme-linked boronate immunoassay. // Clinical Chemistry.-1998.-v. 44.- N 2.-p.256-263.

266. Ishibashi K., Hanada S., Uozumi K., Otsuka M. An enzyme-linked imu-nosorbent assay for immune complex of HTLV-1. // J. Immunol.Methods.-1989.-v.ll9.-p.217-221.

267. Jankovic M, Milutinovic B. Glycoforms of CA125 antigen as a possible cancer marker. // Cancer Biomark. 2008.-4 .- v.l.-p. 35-42.

268. Jancovski W., Davey M., O'Malley J. Binding of human interferons to immobilized cibacron blue F3GA: the nature of molecular interaction. // J. Vi-rol.-1975.-v. 16.-p.l 124-1130.

269. Jones S., Florence M., Ellis I., Kankova K., Schor S., Schor A. Co-expression by keratinocytes of migration stimulating factor (MSF) and a functional inhibitor of its bioactivity (MSFI). // Exp. Cell Res.-2007.-v. 313.- N 20.-p. 4145-4157

270. Kalashnikova I., Ivanova N., Tennikova T. Development of a strategy of influenza virus separation based on pseudoaffinity chromatography on short monolithic columns. // Anal. Chem.- 2008.- v. 80.- N 15.-p. 2188-2198.

271. Kasuga I., Miyamoto D., Ichinose W. Alpha-fetoprotein producing pulmonary blastoma in a patient with systemic sclerosis: pathogenetic analysis. // Eur.Respir. J.-1998.-v.il.-p. 1185 1187.

272. Khamzina L., Borgeat P. Correlation of a-Fetoprotein Expression in Normal Hepatocytes during Development with Tyrosine Phosphorylation and1.sulin Receptor Expression. // Mol. Biol. Cell.- 1998.-V. 9.- p. 1093-1096.

273. Kaneko K., Fukuda H., Chuang V., Yamasaki R., Kawahara K., Naka-yama H., Suenaga A., Maruyama T.,Otagiri M. Subdomain IIIA of Dog Albumin Contains a Binding Site Similar to Site II of Human Albumin. // Drug Me-tab. Dispos. -2008;.-N 36.- p. 81 86.

274. Kaikaus R., Chan W., Ortiz de Montellano P., Bass N. Mechanisms of regulation of liver fatty acid-binding protein. // Mol. Cell. Biochem. -1993.-v.123 .-N1-2.-p. 93-100.

275. Kaumeyer J., Polazzi J., Kotick M. The mRNA for a proteinase inhibitor related to the HI-30 domain of inter-alpha-trypsin inhibitor also encodes alpha-1-microglobulin (protein HC. // Nucleic Acids Res.-1986.- v. 14.- N 20.- p. 7839-7850.

276. Keen J., Caceres I., Eliopoulos E., Zagalsky P., Findlay J. Complete sequence and model for the A2 subunit of the carotenoid pigment complex, crustacyanin. //Eur. J. Biochem. 1991.- v. 197.- N 2. - p. 407-417.

277. Kim D., Garcia A. Retention behavior of amino acids using immobilized Ag (I) chromatography// Biotechnol. Progr. 1995. - 11, N 4. - C. 465-467.

278. Kim K, Han J., Kim H., Lee M. Expression, purification and characterization of TAT-high mobility group box-lA peptide as a carrier of nucleic acids. // Biotechnol Lett. 2008 .- N 3.- p. 18-23.

279. Kirkpatrick A., Wepsic H., Nakamura R. Comparison of double-antibody radioimmunoassay with Farr-technique radioimmunoassay and double-antibody enzyme. Immunoassay for alpha- fetoprotein. // Clin. Chem.-1977.-v. 23.-p. 50

280. Kleywegt G., Bergfors T., Senn H. Crystal structures of cellular retinoic acid binding proteins I and II in complex with all-trans-retinoic acid and a synthetic retinoid. // Structure.-1995.- v. 2.- N 12.- p. 1241-1258.

281. Kobayashi H., Suzuki M., Hirashima Y., Terao T. The protease inhibitor bikunin, a novel anti-metastatic agent. // Biol. Chem.-2004.- v. 384.- N5.-p. 749-754.

282. Kock K., Ahlers C., Schmale H. Structural organization of the genes for rat von Ebner's gland proteins 1 and 2 reveals their close relationship to lipocalins. // Eur. J. Biochem. 1994.- v.221.- N3.- p. 905-916.

283. Kogo H., Yoshie M., Kutsuke M., Tamura K. Roles of Implantation-related Factors, Stathmin and Insuline-like Growth Factor-binding Protein 7 in Reproductive Endocrinology. // Yakugaku Zasshi. 2008.- v. 128.- N 4.-p. 565-574.

284. Kreutz M., Fritsche J., Andreesen R., Krause S. Regulation of cellular retinoic acid binding protein (CRABP II) during human monocyte differentiation in vitro. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998 .- v. 248.-N3,- p-. 830-834.

285. Lester E. A, Miller J., Yachnin S. Postsynthetic Modification of Human -fetoprotein Controls Its Immunosuppressive Potency. // PNAS.-1977.-v. 74.-p. 3988 3992.

286. Lin Y., Jin D., Vacher J., Feuerman M. Sequence requirements for alpha-fetoprotein gene expression during liver regeneration. // Cell Growth Differ.1995.-V. 6.-p. 1549-1552.

287. Liu C., Chen J., Kuei C., Sutton S., Bonaventure P., Lovenberg T. Re-laxin-3/Insulin-like Peptide 5 Chimeric Peptide, a selective ligand for G-protein -Coupled Receptor. // Molecular Pharmacology .- 2005.- V.67.-N l.-p. 231240.

288. Londraville R. Intracellular fatty acid-binding proteins: putting lower vertebrates in perspective. // Braz. J. Med. Biol. Res.-1997.- v. 29.- N 6.- p. 707-720.

289. Lowe J., Boguski M., Sweetser D. Human liver fatty acid binding protein. Isolation of a full length cDNA and comparative sequence analyses of orthologous and paralogous proteins. // J. Biol. Chem. — 1985.- v. 260.- N 6.316. p. 3413-3417.

290. Lu N., Changelian P., Unanue E. Alpha-fetoprotein inhibits macrophage expression of la antigens. // J. Immunol. 1984.- v. 132.- p. 1722 - 1727.

291. Mclntire K., Waldmann T., Moertel C., Go V. Serum -Fetoprotein in Patients with Neoplasms of the Gastrointestinal Tract. // Cancer Res.-1975.- v. 35.- p. 991 -996.

292. Melbye M., Wohlfahrt J., Lei U., N0rgaard- Pedersen B., Mouridsen H., Lambe H., Michels K. Fetoprotein-a Levels in Maternal Serum During Pregnancy and Maternal Breast Cancer Incidence. // J. Natl. Cancer Inst.-2000.- v. 92.-p.1001 1005.

293. Mizejewski G., Keenan R., Setty R. Separation of the estrogen-activated growth-regulatory forms of alpha- fetoprotein in mouse amniotic fluid. // Biol. Reprod.-1990.-v. 42.-p. 887 898.

294. Mizejewski G., Pass K. Fetoprotein-a and Hypothyroidism in Infants. // Pediatrics.- 1992,-v. 90.- p. 1008 1009.

295. Mizejewski G., MacColl R. Fetoprotein-a growth inhibitory peptides: Potential leads for cancer therapeutics. // Mol. Cancer Ther.-2003.- v. 2.-p. 1243-1251.

296. Mizejewski G. Biological Roles of Alpha-Fetoprotein During Pregnancy and Perinatal Development. // Experimental Biology and Medicine.-2004.- v. 229.- p. 439 463.

297. Mizejewski G. Physiology of Alpha-Fetoprotein as a Biomarker for Perinatal Distress: Relevance to Adverse Pregnancy Outcome. // Experimental Biology and Medicine.-2007.-v. 232.- p. 993 1004.

298. Morinaga T., Yasuda H., Hashimoto T., Higashio K., Tamaoki T. A human alpha-fetoprotein enhancer-binding protein, ATBF1, contains four ho-meodomains and seventeen zinc fingers. // Mol. Cell. Biol.-1991.-v. 11.-p. 6041 6049.

299. Morii M., Travis J. The reactive site of human inter-alpha-trypsin inhibitor is in the amino-terminal half of the protein. // Biol. Chem. Hoppe-Seyler.- 1985,-v. 366.-N 1.-p. 19-21.

300. Murphy E. L-FABP and I-FABP expression increase NBD-stearate uptake and cytoplasmic diffusion in L cells. // Am. J. Physiol.-1998.- 275.- v. 2.-N 1.- p.244-249.

301. Musa K. Caglar J., Bakkeren A., Geven W. Fetoprotein-a Normal Values. // Pediatrics.- 1989.- v. 83.- p. 640-643

302. Kahn C. The molecular mechanism of insulin action. // Annu. Rev. Med.-1985.-v. 36.- p. 429-432.

303. Kitao S., Yamada T., Ishikawa T., Madarame H., Furuichi M., Neo S., Tsuchiya R.,Kobayashi K. Alpha-fetoprotein in serum and tumor tissues in dogs with hepatocellular carcinoma. // J .Vet. Diagn. Invest.-2006.-v.18.- p. 291 295.

304. Koen H., Pugh T., Nychka D., Goldfarb S. Presence of a-Fetoprotein-positive Cells in Hepatocellular Foci and Microcarcinomas Induced by Single Injections of Diethylnitrosamine in Infant Mice. // Cancer Res.-1983.-v. 43-p. 702 708.

305. Kovalyov L., Shishkin S., Efimochkin A. The major protein expression profile and two-dimensional protein database of human heart. // Electrophoresis .- 1996.-V. 16.-N7.-p. 1160-1169.

306. Scand. J. Clin. Lab. Invest.- 2007.-v.67.- N 6.-p. 612-618.

307. Kroes R., Williams G., Weisburger J. Early Appearance of Serum a-Fetoprotein during Hepatocarcinogenesis as a Function of Age of Rats and Extent of Treatment with 3'-Methyl-4-dimethylaminoazobenzene. // Cancer Res.-1972.-V. 32.-p. 1526- 1532.

308. Krumlauf R., Hammer R., Tilghman S., Brinster R. Developmental regulation of alpha-fetoprotein genes in transgenic mice. // Mol. Cell. Biol.-1985.- v. 5.-p. 1639- 1648.

309. Krusius T., Ruoslahti E. Carbohydrate structure of the concanavalin A molecular variants of alpha-fetoprotein. // J. Biol. Chem.-1982.-v. 257.-p. 3453 3457.

310. Kuznetsov V.P. Soloviev V.D. Serruareo Cubano Sobre Interferon.-1-st.-Havana.-l 983.-p. 163-174.

311. Lacki J.K., Klama K., Mackiewicz S.H. Interleikins. // Inflam.Res. -1995-Vol.44-P.24-26.

312. Lind G., Kleivi K., Meling G. ADAMTS1, CRABP1, and NR3C1 identified as epigenetically deregulated genes in colorectal tumorigenesis. // Cell. 0ncol.-2007.- v. 28.- N 5-6.- p. 259-272.

313. Liu W., Hellman P., Li Q. Biosynthesis and function of all-trans- and 9-cis-retinoic acid in parathyroid cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1997.- v. 229.- N 3.-p. 922-929.

314. Lovelace L., Chiswell B., Slade D., Sodetz J., Lebioda L. Crystal structure of complement protein C8gamma in complex with a peptide containing the

315. C8gamma binding site on C8alpha: implications for C8gamma ligand binding. // Mol. Immunol.-2008.-v.45.-N 3.- p.750-756.

316. Lee J., Im J., Lee H., Shim J., Youn B., Lee D. Visceral adiposity is associated with serum retinol binding protein-4 levels in healthy women. // Obesity (Silver Spring).-2007.-v.l5.- N 9.- p. 225-232.

317. Lee S., Lee J., Kim S., Park J., Lee W., Mori K., Kim S., Kim I., Suk K. A dual role of lipocalin 2 in the apoptosis and deramification of activated microglia. J. Immunol.- 2007.-V. 179.- N 5.- p.3231-3241.

318. Lee J., Bruley D., Kang K. Manipulation of the affinity between protein and metal ions by imidazole and pH for metal affinity purification of protein C from Cohn fraction IV-1. // Adv. Exp. Med. Biol.- 2008,-v. 614.-p. 93-100.

319. Lei G., Liu L. Xiong X. Wei Y. Zheng X. New alpha-amino phenylalanine tetrazole ligand for immobilized metal affinity chromatography of proteins.//J.Sep. Sci.-2008 . V.12.-N 3. p. 112-117.

320. Lester E., Miller J., Yachnin S. Human Alpha-Fetoprotein as a Modulator of Human Lymphocyte Transformation: Correlation of Biological Potency with Electrophoretic Variants. //PNAS.-1976.-v.73.-p. 4645 4648.

321. Lin S., Huang S., Choo C. Inhibition of a-Fetoprotein Production in a Hepatoma Cell Line by Antisense Oligonucleotide Analogues. // J. Biochem.1995.-v. 117.-p. 1100- 1104.

322. Lim H., Bragg J., Ganesan U., Lawrence D., Yu J., Isogai M., Hammond J., Jackson A. Triple gene block protein interactions involved in movement of barley stripe mosaic virus. // J Virol.-2008.-N3.-p. 19-23

323. Little R., England J., Wiedmeyer H., Goldstein D. Glycosylated hemoglobin measured by affinity chromatography: Micro-sample collection and room temperature storage. // Clin.Chem. -1983.- v.29.-p. 1113-1115.

324. Logdberg L., Wester L. Lipocalins // Biochim.biophys.acta. 2000 -V.1482. - P.284-297.

325. Lundberg E., Brismar H., Graslund T. Selection and characterization of Affibody ligands to the transcription factor c-Jun. // Biotechnol. Appl. Bio-chem.- 2008.- v. ll.-N2.-p. 34-42.

326. Mackiewicz A., Mackiewicz K. Alpha 1 acid glycoprotein. // Glycocon-jugate J. 1995.-V. 12 -P.241-247.

327. Ma X., Mohammad S., Kim S. Heparin removal from blood using poly(L-lysine) immobilized hollow fiber.//Biotechnol. and Bioeng. 1992. - 40. - C. 530-536.

328. Malaba, L., Smeland, S., Senoo, H., Norum, K. R., Berg, T., Blomhoff, R. and Kindberg, G. M. (1995)// J. Biol. Chem. 270, 15686-15692.

329. Mallia A., Hermanson G., Krohn R., Fujimoto E., Smith P. Preparation and use of boronic acid affinity support for separation and quantitation of glycosylated hemoglobins. Anal. Letters.-1981.-v. 14.-p.649-661.

330. Mantovaara T., Pertoft H., Porath J. Carboxymethylated aspartic acid agarose, a selective adsorbent for calcium-binding proteins, preliminary studes. // Biotechnology and applied biochemistry.-1991.-v. 13.-p.315-322.

331. Mantovaara T., Pertoft H., Porath J. Further Characterization of carboxymethylated aspartic acid agarose. Purification of human a2 macroglobu-lin and hemopexin. // Biotechnology and applied biochemistry.-1991.- v. 13.-p.371-379.

332. March S.C., Parikh I.I., Quatrecasas P.C. A simple method for cyanogen bromide activation of agarose for affinity chromatography// Analitical Biochemistry.-1974.- V. 60.-Nl.-p. 149-152.

333. Marcon N., Brenner D., Lubman D. Plasma Glycoprotein Profiling for Colorectal Cancer Biomarker Identification by Lectin Glycoarray and Lectin Blot. // J. Proteome Res.-2008 .-N2.-p. 27-33.

334. Méndez E., Fernández-Luna J., Grubb A., Leyva-Cobián F. Human protein HC and its IgA complex are inhibitors of neutrophil chemotaxis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-1986.- v. 83.- N 5.- p. 1472-1475.

335. Baldeon M., Chun T., Gaskins H.Manuel. Interferon a and interferon-y differently affect pancreatic p - cell phenotype and function. // Amer. J. of Physiology.- 1998.- v.275.-issue l.-p.25-32.

336. Matsumoto I., Ito I., Seno N. Affinity adsorbents on TSK-gel base.// J. Chromatogr.-1982.-V.239.- P.- 747-754.

337. Matsuo A. Molecular heterogenity of human leukocyte interferon. Differing properties in affinity chromatography on poly U and Con A Sepharose. // Kyoto furitsu IkaDaigaku Zasshi.- 1978.-v.87.-p.l 115-1127.

338. Merril C., Sold D., Sedman S. Hier sensitive method of protein detection // Science .-1981.-v.211.-N4489.-p. 1437-1438.

339. Middle F., Bannister A., Bellingham A., Dean P. Separation of glycosylated haemoglobins using immobilized phenilboronic acid. // Biochem. J.-1983,-v.209.-p.771-779.

340. Mikaelyan M., Poghosyan G., Gasparyan V. Rapid purification of annexin V from human placenta by affinity chromatography. // Prep. Biochem. Biotechnol.-2008.-v.38.-N2.- p. 152-157.

341. Mikulski A., Heine J., Le H. Lage scale purification of human fibroblast interferon.//Biochem. 1980.-v.10.-p. 108-119.

342. Mizejewski G., Pass K. Fetoprotein-a and Hypothyroidism in Infants. // Pediatrics.- 1992,-v. 90.- p. 1008 1009.

343. Mogensen K., Cantell K. Nonspecific adsorbtion of interferon to immobilised serum immunoglobulins. //J. Gen. Virol.- 1979.-V. 45.- 171-175.

344. Morris M., Grandis., Litton J. The correlations of glycosylated serum protein and glycosylated hemoglobin concentrations with blood glucose in diabetic pregnancy. // Am. J. Obset Gynecol.-1985.-v. 153.-p. 257-260.

345. Morel L., Depeiges A„ Dufaure J. LESP, an androgen-regulated lizard epididymal secretory protein family identified as a new member of the lipocalin superfamily. // J. Biol. Chem.- 1993.- v. 268.- N 14.- p. 10274-10281.

346. Mukaida N., Kasahara T., Ko Y., Kawai T. Establishment of a highly sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for interleukin- la emploing a fluorogenic substrate. // J. Immunol. Methods.- 1988.-v.l07.-p.41-46.

347. Nakabayashi H., Taketa K., Yamane T., Oda M., Sato J. Hormonal Control of a-Fetoprotein Secretion in Human Hepatoma Cell Lines Proliferating in Chemically Defined Medium. // Cancer Res.-1985.- v. 45.-p. 6379 6383.

348. Nagata A., Igarashi M., Toh H., Urade Y., Hayaishi O. Structural organization of the gene for prostaglandin D synthase in the rat brain. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1992,-v. 89.- N 12.- p. 5376-5380.

349. Nahon L., Tratner I., Poliard A., Presse F., Poiret M., Gal A., Sala-Trepat G., Legres L., Feldmann G., Bernuau D. Albumin and alpha-fetoprotein gene expression in various nonhepatic rat tissues. // J. Biol. Chem.-1988.-v. 63.-p. 11436- 11442.

350. Nakajima T., Okazaki I., Morinaga S., Tsumuraya M., Shimosato Y., Saiki S. A Case of Alpha-Fetoprotein-Producing Rectal Carcinoma. // Jpn. J. Clin. Oncol.-1985.- v. 15.-p. 679 685.

351. Nalwar D., Barr B., Kesson C., Robb D. Determination of adult and fetal hemoglobins by affinity chromatography. // Clin. Chim. Acta.-1983.-v.128.-p. 61-67.

352. Nazimova S., Akulenko I., Zaitseva I. Immunoenzyme analysis of placenta-specific alpha(l)-microglobulin in the blood serum in normal and pathological pregnancy. // Akusherstvo i ginekologiia .- 1990.- N7.- p. 70-72.

353. Neumiller J., Odegard P., White J., Setter S., Campbell R. Looking to the Future: Focus on DPP-4 Inhibitors for the Treatment of Type 2 Diabetes and Emerging Therapies. //Diabetes Educ. -2008 .- v. 34.- N 2.-p. 183-200

354. Newcomer M. Structure of the epididymal retinoic acid binding protein at 2.1 A resolution. // Structure .- 1993.- v. 1.- N 1.- p. 7-18.

355. Nielsen S., Spener F. Fatty acid-binding protein from rat heart is phosphorylated on Tyrl9 in response to insulin stimulation. // J. Lipid Res. -1993,-v. 34.-N8.-p. 1355-1366.

356. Ng W., Ng F. Elevated serum alpha-fetoprotein in a patient with undifferentiated carcinoma of the gall bladder. // J. Clin. Pathol.-1995.- v. 48.- p. 1061 1063.

357. Ngo T., Narinesingh D. Kosmotropes Enhance the Yield of Antibody Purified by Affinity Chromatography using Immobilized Bacterial Immunoglobulin Binding Proteins. // J. Immunoassay Immunochem. — 2008.-v.29.-Nl.-p. 105115.

358. Nuhse T., Yu K., Salomon A. Isolation of phosphopeptides by immobilized metal ion affinity chromatography. // Curr. Protoc. Mol. Biol.- 2007.- v. 18.-Unit 18.13.

359. Obamura H., Bertold W., Hood L. Human fibroblastoid interferon: immunosorbent column chromatography and N-terminal amino cid sequence. // Biochemistry .-1980.-v.19.- p. 6215-6219.

360. Offner G., Brecher P., Sawlivich W. Characterization and amino acid sequence of a fatty acid-binding protein from human heart. // Biochem. J. — 1988.-v. 252.-Nl.-p. 191-198.

361. Ogburn C., Berg K., Paucker K. Purification of mouse interferon by affinity chromatography on anty-interferon globulin-Sepharose. // J. Immunology.-1973.-V. lll.-N4.-p. 1206-1218.

362. Okayama H., Ueda K., Hayashi O. Purification of ADP-ribosylated nuclear proteins by covalent chromatography on dihydroxyboryl poliacrylamide beads and their characterization. // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. -1978.-V. 75.-p. 1111-1115.

363. Ong D. Cellular retinoid-binding proteins. // Archives of dermatology.-1987.- v. 123.- N 12.- p. 1693-1695.

364. O'Neil M. New range of applications found for high performance liquid chromatography . // Genet. Eng. News. 1994. -v. 14.- N 9. - C. 6- 29.

365. Osborne L., Georgiades J., Johnson H. Classification of interferons with antibody to immune interferon. // Cell. Immunol.-1980.- v.53.-p.65-70.

366. Orazine C., Hincapié M.,Hancock W., Hattersley M.,Hanke J. A Pro-teomic Analysis of the Plasma Glycoproteins of a MCF-7 Mouse Xenograft: A Model System for the Detection of Tumor Markers. // J. Proteome Res.-2008.-N3.- p. 211-217.

367. Ortlund, E. Crystal structure of human complement protein C8y at 1.2 A resolution reveals a lipocalin fold and a distinct ligand binding site// Biochemis-try.-2002.-v. 41.- p. 7030-7037.

368. Osborn L., Georgiades J., Jonson H. Classification of interferons with antibody to immune interferon. // Cell. Immunol.-1980.- v. 53.-p. 65-70.

369. Osty J., Laurence J., Jacques F., Blondeau J.-P. Tiroksin-binding erythrocyte function. // Endocrinology. 1988,-v. 123 .-N5.-p. 2303-2311.

370. Paesen, G.C, Adams, P.I., Harlos, K., Nuttall, P.A., Stuart, D.I. Tick His-tamine-Binding Proteins: Isolation, Cloning, and Three-Dimensional Structure. Molecular Cell. 3: 661-671, 1999.

371. Parmelee D, Evenson M., Deutsch H. The presence of fatty acids in human alpha-fetoprotein. //J. Biol. Chem.-1978.-v. 253.-p. 2114 2119.

372. Pasman.Y., Sikkel E., Cessie S., Oepkes D., Roelandse W., Vandenbuss-che F. Bilirubin/Albumin Ratios in Fetal Blood and in Amniotic Fluid in Rhesus Immunization. // Obstet. Gynecol.-2008.- v.l 11.- p. 1083 1088.

373. Pathange L., Bevan D., Zhang C. Quantifying protein microstructure and electrostatic effects on the change in gibbs free energy of binding in immobilized metal affinity chromatography. // Anal. Chem.- 2008.-V. 80.-N 5.- p. 16281640.

374. Peeters R., Veerkamp J., Geurts van Kessel A. Cloning of the cDNA encoding human skeletal-muscle fatty-acid-binding protein, its peptide sequence and chromosomal localization. // Biochem. J. -1991.- v. 276.- N l.-p. 203-207.

375. Pervaiz, S. and Brew, K. Homology and structure-function correlations between al-acid glycoprotein and serum retinol-binding protein and its relatives. // FASEB J.-1985.-v.l.- p. 209-214.

376. Pepper D. Some alternative coupling chemistries for affinity chromatography. // Mol. Biotechnol. 1994. - v. 2.- N 2. - p. 157-178.

377. Peitsch M., Tschopp J., Jenne D., Haefliger J. Structural and functional characterization of complement C8 gamma, a member of the lipocalin protein family. Mol. Immunol. - 1991.-v. 28.- N 1,- p. 123-131.

378. Petty K. Metal-chelate affinity chromatography. // Curr. Protoc. Mol. Biol.- 2001.-Chapter 10.- Unit 10.1 IB.

379. Peyrol S., Grimaud J., Pirson T., Chayvialle J., Touillon C., Lambert B. Ultrastructural immunoenzymatic study of alpha-fetoprotein-producing cells in the human fetal liver. // J. Histochem. Cytochem.-1977.-v. 25.-p. 432-435.

380. Pfoertner S., Goelden U., Hansen W. Cellular retinoic acid binding protein I: expression and functional influence in renal cell carcinoma. // Tumour Biol.-2005.-v. 26.-N6.-p. 313-3123.

381. Phelan C., Larsson C., Baird S. The human mammary-derived growth inhibitor (MDGI) gene: genomic structure and mutation analysis in human breast tumors. // Genomics .- 1996.- v. 34.-N l.-p. 63-68.

382. Platis D., Labrou N. Affinity chromatography for the purification of therapeutic proteins from transgenic maize using immobilized histamine. // J. Sep. Sci.- 2008 .-N 4 .- p. 636-645.

383. Pinheiro S., Weinbaum P., Limber E., Amyot K. Low Maternal Serum Aipha-Fetoprotein and Renal Agenesis: A Case Report. // Journal of Diagnostic Medical Sonography.-1992,-v. 8.-p. 320 322.

384. Porath J., Axen R., Ernback S., Nature (London).- 1967.-V. 215.-p. 1491-1492.

385. Porath J. General methods and coupling procedures. // Methods enzy-mol.- 1974.- v.34.-part B.-p. 13-30.

386. Pope R., Apps J., Page M., Allen K., Bodansky H. A novel device fort he rapid in-clinic measurement of haemoglobin Ale. // Diaet. Med.-1993.v.lO.-N 3.- p.260-263.

387. Richardson B., Hulka S., Peck J., Hughes C., Berg B., Christianson R., Calvin J. Levels of Maternal Serum Alpha-fetoprotein (AFP) in Pregnant Women and Subsequent Breast Cancer Risk.// Am. J. Epidemiol.-1998.- v. 48.-p. 719 727.

388. Reed P., Bhathnagar D., Dhar H., Winocour P. Precise measurent of glycated serum albumin by column affinity chromatography and immunoturbidi-metry. // Clin. Chim. Acta.-1986.- v. 161.- p. 191-199.

389. Rendell M., Rasbold K., Neirenberg J., Hermanson G., Klenk D., Smith P. // Clin. Biochem.- 1986.- v. 19.- N 4.- p. 216-220.

390. Sakai M., Morinaga T., Urano Y., Watanabe K., Wegmann T., Tamaoki

391. T. The human alpha-fetoprotein gene. Sequence organization and the 5' flanking region. // J. Biol. Chem.-1985.-v. 260.- p. 5055 5060.

392. Savu L., Benassayag C., Vallette G., Christeff N., Nunez E. Mouse alpha 1-fetoprotein and albumin. A comparison of their binding properties with estrogen and fatty acid ligands. // J. Biol. Chem.-1981.- v. 256.-p. 9414 9418

393. Schefer H., Mattmann S., Joss R. Hereditary persistence of -fetoprotein: Case report and review of the literature. // Ann. One.- 1998,-v. 9.-p. 667 672.

394. Scoazec J, Moreau A., Feldmann G., Bernuau D. Cellular Expression of a-Fetoprotein Gene and Its Relation to Albumin Gene Expression during Rat Azo-Dye Hepatocarcinogenesis. // Cancer. Res.-1989.- v. 49.- p. 1790 1796.

395. Sell S., Sheppard H, Poler M. Effects of -Fetoprotein on Murine Immune Responses: II. Studies on Rats. // J. Immunol.-1977.- v.l 19.-p. 98 103.

396. Sheppard H., Sell J., Trefts P., Bahu R. Effects of-Fetoprotein on Murine Immune Responses: I. Studies on Mice. // J. Immunol. -1977.- v.l 19.- p. 91 -97.

397. Shima K., Ito N., Hirota M., Yono M., Yamamoto Y., Uchida T. Highperformance liquid chromatographic assay of serum glycated albumin. // Dia-betologia.- 1988.-V. 31.- 627-631.

398. Sparbier K., Asperger A., Resemann A., Kessler I., Koch S., Wenzel T., Stein G., Vorwerg L., Suckau D., Kostrzewa M. Analysis of Glycoproteins in Human Serum by Means of Glycospecific Magnetic Bead Separation and LC

399. MALDI-TOF/TOF Analysis with Automated Glycopeptide Detection. // J. Biomol. Tech.- 2007.-V. 18.-p. 252 258.

400. Spener F., Unterberg C., Borchers T., Grosse R. Characteristics of fatty acid-binding proteins and their relation to mammary-derived growth inhibitor.// Mol. Cell. Biochem. -1991.-v. 98,- N (1-2.- p. 57-68.

401. Stone R. Maurer R. Radioimmunoassay of Porcine Alpha Fetoprotein. // Biol Reprod.-1979.-v.20.-p. 947 953.

402. Strausberg R., Feingold E., Grouse L. Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -2003.- v. 99 N 26.- p. 16899-16903.

403. Tager H.S. Adnormal products of the human insulin gene // Diabetes.-1984.-33.-p.693-697.

404. Qi Q., Yu Z, Ye X, Zhao F., Huang P., Hu F., Franco O., Wang J., Li H., Liu Y., Lin X. Elevated retinol-binding protein 4 levels are associated with metabolic syndrome in Chinese people. // J. Clin. Endocrinol. Metab.- 2007.-v.92.- N 12.- p.4827-4834.

405. Radanyi C., Mercier-Bodard C., Secco-Millet C., Baulieu E.,Richard-Foy H. Alpha-fetoprotein is not a Component of the Estradiol Receptor of the Rat Uterus. // PNAS.-1977.-v. 74.-p. 2269 2272.

406. Rassart E. Apolipoprotein D // Biochim. Biophys. Acta.-2000-v. 1482.-p. 185-198.

407. Randle P., Taylor K. Insulin in protein fractions of serum from healthy people and from insulin-treated diabetics.// Lancet 1958,-v. 2.- N7054.p. 996-997.

408. Rigler R. Acta physiologica Scandinavica. - Stockholm. - 1966. - Suppl. - v.267, p.67-87.

409. Rubinstein M., Rubinstein S. Familletti P. Human leucocyte interferon: production, purification to homogeneity and initial characterization. // Proc. Nat. ACAD. Sci. USA.-1979-v. 76.-p.640-644.

410. Roy R., Kundu S. Silicagel affinity adsorbents // Anal. Biochem. -1979.-v.98.-p. 338-341.

411. Schreitmuller T., Hochstrasser K., Reisinger P. cDNA cloning of human inter-alpha-trypsin inhibitor discloses three different proteins. // Biol. Chem. Hoppe-Seyler.- 1987,-v. 368.- N 8.- p. 963-970.

412. Schroeder F., Atshaves B., Starodub O. Expression of liver fatty acid binding protein alters growth and differentiation of embryonic stem cells. // Mol. Cell. Biochem. -2001.- v. 219.- N 1-2.- p. 127-138.

413. Sell H., Eckel J. Regulation of retinol binding protein 4 production in primary human adipocytes by adiponectin, troglitazone and TNF-alpha. // Dia-betologia.- 2007.-v.50.- N10.- p. 2221-2223.

414. Secher D., Burte D. A monoclonal antibody for large-scale purification ofhuman leucocyte purification. //Nature.- 1980.- v. 285.-p.446-450.

415. Skerra A. Alternative non-antibody scaffolds for molecular recognition. // Curr. Opin. Biotechnol 2007.-V. 18.- N 4.- p. 295-304.

416. Sipe J., de Mayer-Guignard J., Fauconner B. Purification of mouse cell interferon by affinity chromatography on a solid-phase immunoadsorbent. // Proc. Nat. Acad. Sci.USA.- 1973.-v. 70.- p. 1037-1040.

417. Shea J., Randell E., Vasdev S., Wang P., Roebothan B., Sun G. Serum retinol-binding protein 4 concentrations in response to short-term overfeeding in normal-weight, overweight, and obese men. // Am. J. Clin. Nutr. -2007.-V.86-N 5.-p.1310-1315.

418. Smith K. Iron metabolism at the host pathogen interface: lipocalin 2 and the pathogen-associated iroA gene cluster. // Int. J. Biochem. Cell Biol.- 2007.-V.39.-N 10.-p.l776-1780.

419. Schwartz N., Michaelson J., Putterman C. Lipocalin-2, TWEAK, and other cytokines as urinary biomarkers for lupus nephritis. // Ann. N. Y. Acad. Sci.- 2007,-v.l 109.-p.265-274.

420. Speziale P., Visai L., Rindi S., Di Poto A. Purification of human plasma fibronectin using immobilized gelatin and Arg affinity chromatography. // Nat Protoc.-2008.-v. 3.-N 3.- p. 525-533.

421. Phillips K., Scurry J., Toner G. Alpha-fetoprotein production by a malignant mixed mullerian tumour of the uterus. // J. Clin. Pathol.-1996.- v. 49.- p. 349-351.

422. Sato Y., Nakata K., Kato Y., Shima M., Ishii N, Koji T., Taketa K., Endo Y., Nagataki S. Early Recognition of Hepatocellular Carcinoma Based on Altered Profiles of Alpha-Fetoprotein. // N. Engl. J. Med. 1993.- v. 328.-p.1802- 1806.

423. Smith G., Wood A., Pell J., White I., Crossley J., Dobbie R. Second-Trimester Maternal Serum Levels of Alpha-Fetoprotein and the Subsequent Risk of Sudden Infant Death Syndrome. // N. Engl. J. Med.-2004.-v. 351.- p. 978 986.

424. Spear B., Tilghman S. Role of alpha-fetoprotein regulatory elements in transcriptional activation in transient heterokaryons. // Mol. Cell. Biol.-1990.-v. 10.-p. 5047 5054.

425. Strausberg R., Feingold E., Grouse L. Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-2003.- v. 99.-N 26.-16899-16903.

426. Sviridov D., Meilinger B., Drake S., Hoehn G., Hortin G. Coelution of Other Proteins with Albumin during Size-Exclusion HPLC: Implications for Analysis of Urinary Albumin. // Am. J. Physiol. Renal. Physiol.- 2007.-V. 292.-p.430 439.

427. Sun X., Ge R., Chiu J., Sun H., He Q. Identification of Proteins Related to Nickel Homeostasis in Helicobater pylori by Immobilized Metal Affinity Chromatography and Two-Dimensional Gel Electrophoresis. // Met. Based Drugs.-2008.-v.289.-490-497.

428. Sun Y. Peng X. Zhang Y. Lv S. Wu W. Wang S. Stability and Biological Activity of Human Intestinal Trefoil Factor Produced by Pichia pastoris. // Protein Pept.Lett.-2008. v. 15. -3 .-p. 255-259.

429. Sweetser D., Birkenmeier E., Klisak I. The human and rodent intestinal fatty acid binding protein genes. A comparative analysis of their structure, expression, and linkage relationships. // J. Biol. Chem. -1987.- v. 262,- N33.-p.16060-16071.

430. Tan Y., Barakat E., Berthold W. The isolation and amino acid/sugar composition of human fibroblastoid interferon/ // J. Biol. Chem,-1979.- v. 254.-p.8067-8072.

431. Tanaka T., Hirota Y., Sohmiya K. Serum and urinary human heart fatty acid-binding protein in acute myocardial infarction. // Clin. Biochem. 1991.-v.24.-N2.-p. 195-201.

432. Tanaka K., Imoto I., Inoue J. Frequent methylation-associated silencing of a candidate tumor-suppressor, CRABP1, in esophageal squamous-cell carcinoma. // Oncogene.- 2007.- v. 26,- N 44.- p. 6456-6468.

433. Toftager-Larsen K., Kjaersgaard E.,Jacobsen J., Norgaard-Pedersen B. Reactivity of amniotic fluid alpha-fetoprotein with concanavalin A in relation to gestational age: clinical implications. // Clin. Chem.-1980.-v. 26.- p. 1656 -1659.

434. Thompson N., Burgess R. Identification of polyol-responsive monoclonal antibodies for use in immunoaffinity chromatography. // Curr. Protoc. Mol. Biol.- 2001 .-Chapter 11 .-Unitl 1.18.

435. Thompson J., Bratt T., Banaszak L. Crystal structure of cellular retinoic acid binding protein I shows increased access to the binding cavity due to formation of an intermolecular beta-sheet. // J. Mol. Biol.-1995.-v. 252.- N 4,-p.433-446.

436. Traboni C., Cortese R. Sequence of a full length cDNA coding for human protein HC (alpha 1 microglobulin). // Nucleic Acids Res.-1986.- v. 14.- N 15.-p. 6340-6345.

437. Travensolo R., Garcia W., Muniz J., Caruso C., Lemos E., Carrilho E., Araujo A. Cloning, expression, purification and characterization of recombinant glutathione-S-transferase from Xylella fastidiosa. // Protein Expr. Purif. -2008.-N2.- p.l 13-120.

438. Troxler R., Offner G., Jiang J. Localization of the gene for human heart fatty acid binding protein to chromosome Ip32-lp33. // Hum. Genet.- 1994.-V. 92.- N 6.- p. 563-566.

439. Tyner A., Godbout R., Compton R., Tilghman S. The ontogeny of alphafetoprotein gene expression in the mouse gastrointestinal tract. // J. Cell Biol.-1990.- v. llO.-p. 915-918.

440. Urbach A., Zitelli В., Blatt J., Gartner J., Malatack J. Elevated a-Fetoprotein in a Neonate With a Benign Hemangioendothelioma of the Liver. // Pediatrics.-1987.-v.80.- p. 596 597.

441. Uriel J., Naval J., Laborda J. Fetoprotein- alpha-mediated transfer of ara-chidonic acid into cultured cloned cells derived from a rat rhabdomyosarcoma. // J. Biol. Chem.-1987.-v.262.-p. 3579 3585.

442. Virtanen T. Important Animal Allergens Are Lipocalin Proteins: Why Are They Allergenic? // Department of Clinical Microbiology; University of Kuopio. International Archives of Allergy and Immunology- 1999.

443. Vetr H., Gebhard W. Structure of the human alpha 1-microglobulin-bikunin gene. // Biol. Chem. Hoppe-Seyler .- 1991,-v. 371.- N 12.- p. 11851196.

444. Vij K., Wang H. Aberrant Expression of a-Fetoprotein in Intrahepatic Cholangiocarcinoma: An Exceptional Occurrence. // International Journal of Surgical Pathology.-2008.-v. 16.-p. 194- 198.

445. Wang L., Yan H. NMR study suggests a major role for Arg III in maintaining the structure and dynamical properties of type II human cellular retinoic acid binding protein. // Biochemistry .-1998.-V. 37.- N 37.- p. 1302113032.

446. Weith H., Wiebers J., Gilham P. Synthesis of cellulose derivatives containing the dihydroxyboryl group and study of their capacity to form specific complexes with sugars and nucleic acid components. // Biochemistry.-1970.-N9.- p. 4396-44401.

447. Waller D., Lustig L., Cunningham C. Second-trimester maternal serum alpha-fetoprotein levels and the risk of subsequent fetal death. // N. Engl. J. Med.-1991-v. 325.-p.6-10.

448. Ward V. K., Hammock B.D., Choudary P.V. A microplate assay for the determination of protein deglycosylation // BioTechniques. -1994. v. 16.- N 6. -p.1036-1038.

449. Wisniewski P., Master A., Kaminska B. Cloning and purification of functionally active Fas ligand Interfering Protein (FIP) expressed in Escherichia coli. //Acta. Biochim. Pol.- 2008.-v.l8.-p.435-439.

450. Wietzerbin J., Falcoff R., Catinot L. Affinity chromatographic analysis of murine interferonsinduced by viruses and by T and B cell stimulants.// Ann.Immunol.- 1977.-v.1280.-p. 699-708.

451. West I., Goldring O. Lectin affinity chromatography // Mol. Biotechnol.- 1994. 2, N 2. - C. 147-155.

452. Wide L., Porath J. Solid-phase radioimmunoessay // Biochim. Biophys. Acta.-1966.-v.l30.-p.257-260.

453. Wichterle O., Lim D. Hydrophilic gels for biological use // Nature.-1960.-v.l85.-p.ll7-118.

454. White C., Akbari A., Doucette S., Fergusson D., Hussain N., Dinh L, Filler G., Lepage N., Knoll G. A novel equation to estimate glomerular filtration rate using beta-trace protein. // Clin. Chem.- 2007.-v.53.-N 11.-p. 19651968.

455. Wolfrum C., Borchers T., Sacchettini J., Spener F. Binding of fatty acids and peroxisome proliferators to orthologous fatty acid binding proteins from human, murine, and bovine liver. // Biochemistry .- 2000.- v. 39.- N6.- p. 14691474.

456. Wang L, Li Y, Abildgaard F, et al. NMR solution structure of type II human cellular retinoic acid binding protein: implications for ligand binding. // Biochemistry .- 1998,- v. 37.- N 37.- p. 12727-12736.

457. Wells G., Nosworty M., Hamilton J., Tarnopolski M., Tein I. Skeletal muscle metabolic dysfunction in obesity and metabolic syndrome. // Can. J. Neurol. Sci.- 2008.- v. 35.- N 1.- p. 31-40

458. Wilting J., Kremer J., Janssen L. Drug binding to human alpha-l-acid glycoprotein in health and disease. // Pharmacol. Rev. 1988.-v.40 .- N 1.- p. 1-47.

459. Woo J., Kim K., Kang J., Zodpe P., Chae S., Hwang S., Lee H. Expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in human salivary glands. // Ann. Otol. Rhinol. Laryngol.- 2007.-v.116.- N 8.- p.599-603.

460. Wu H., Jia W., Bao Y., Lu J., Zhu J., Wang R., Chen Y., Xiang K. Serum retinol binding protein 4 and nonalcoholic fatty liver disease in patients with type 2 diabetes mellitus. // Diabetes Res. Clin. Pract.-2008.-v.79.- N 2.-p. -185-190.

461. Xu Y., Halsall B., Heineman W. Heterogeneous enzyme immunoassay of alpha-fetoprotein in maternal serum by flow-injection amperometric detection of4-aminophenol. //Clin. Chem.-1990.- v. 36.-p. 1941 1944.

462. Yan Q. Yang Q.,Mody N.,Graham T., Hsu C., Xu Z.,Houstis N., Kahn B., Rosen E. The adipokine lipocalin 2 is regulated by obesity and promotes insulin resistance. //Diabetes.-2007.-v.56,- N 10,-p. 533-540.

463. Yakobson E., Revel M., Gurari-Rotman D. Monkey interferon: activityon human cells and chromatographic properties. // Arc. Virol.-1979.-v.59.-p.251-255.

464. Young A., Scapin G., Kromminga A. Structural studies on human muscle fatty acid binding protein at 1.4 A resolution: binding interactions with three C18 fatty acids. // Structure.-1994.- v. 2.- N6.-p. 523-534.

465. Yamamoto R., Azuma M., Hoshi N., Kishida T., Satomura S., Fujimoto S. Lens culinaris agglutinin-reactive a-fetoprotein, an alternative variant to a-fetoprotein in prenatal screening for Down's syndrome. // Hum. Reprod.-2001.-v. 16.-p. 2438-2444.

466. Yang Y., Spitzer E., Kenney N. Members of the fatty acid binding protein family are differentiation factors for the mammary gland. // J. Cell Biol.-1994.- v. 127.-N4.-p. 1097-1109.

467. Yasukawa K. High-performance affinity chromatography system for rapid, efficient assay of glycated albumin. // J. Chromatogr. 1992.-v.597.-p.271-275.

468. Yasukawa Z., Sato S., Sano R., Ogawa Y., Kitajima K. Identification of disialic acid-containing glycoproteins in mouse serum: a novel modification of immunoglobulin light chains, vitronectin, and plasminogen. // Glycobiology.-2006,-v. 16.-p. 651 -665.

469. Yu Z., Ye X., Zhao F., Huang P., Hu F., Franco O., Wang J., Li H., Liu Y., Lin X. Elevated retinol-binding protein 4 levels are associated with metabolic syndrome in Chinese people. // J. Clin. Endocrinol. Metab.- 2007.-v. 92.-N 12.-p. 4827-4834.

470. Young P., Tilghman S. Induction of alpha-fetoprotein synthesis in differentiating F9 teratocarcinoma cells is accompanied by a genome-wide loss of DNA methylation. // Mol. Cell. Biol.-1984.-v. 4.- p. 898 907.

471. Zanotti G., Scapin G., Spadon P. Three-dimensional structure ofrecombinant human muscle fatty acid-binding protein. // J. Biol. Chem.-1992.- v. 267.- N 26.- p. 18541-18550.

472. Zaraiskii E., Nazimova S., Olefirenko G. Immunoenzyme analysis of placenta-specific alpha 1-microglobulin in the serum of blood donors. // Vopr. Med. Khim.-1990.-v. 35.- N 5 ,-p.-130-132.

473. Zanotti G., Scapin G., Spadon P. Three-dimensional structure of recombinant human muscle fatty acid-binding protein. // J. Biol. Chem.- 1992.-v. 267.-N 26.-p. 18541-18550.

474. Zhao Y., Meng X., Wei Y. Cloning and characterization of a novel cardiac-specific kinase that interacts specifically with cardiac troponin I. // J. Mol. Med.-2004.-v. 81.- N 5.-p.297-304.

475. Zasshi Y. Roles of Implantation-related Factors, Stathmin and Insuline-like Growth Factor-binding Protein 7 in Reproductive // Endocrinology — 2008.-v. 128.-N 4.-p. :565-574.

476. Zhang X., Dong J., Chiu J. Regulation of alpha-fetoprotein gene expression by antagonism between AP-1 and the glucocorticoid receptor at their overlapping binding site. // J. Biol. Chem.- 1991.- v. 266.- p. 8248 8254.

477. Zhuang R, Zhang Y, Zhang R, Song C, Yang K, Yang A, Jin B. Purification of GFP fusion proteins with high purity and yield by monoclonal antibody-coupled affinity column chromatography. // Protein Expr. Purif.- 2008.-N 2 .p. p.108-112.

478. Ziegelmeier M., Bachmann A., Seeger J., Lossner U., Kratzsch J., Bliiher M., Stumvoll M., Fasshauer M. Serum levels of adipokine retinol-binding pro-tein-4 in relation to renal function. // Diabetes Care. 2007.- v. 30.- N 10.-p.2588-2592.

479. Zimmerman A., van Moerkerk H., Veerkamp J. Ligand specificity and conformational stability of human fatty acid-binding proteins. // Int. J.

480. Biochem. Cell Biol. -2001.- v. 33.- N 9.-p. 865-876.

481. Zoon K., Smith M., Bridfen P. Purification and partial characterization of human lymfoblastoid interferon // Proc.Nat., Acad. Sci. USA.- 1979.- v. 76.- p. 5601-5605.• . Прилогение I •

482. Типовая междуведомственная форма № Р-2 Утверждена приказом ЦСУ СССР Га 681 от 18 августа ,1976 го~а1. НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеяпредприятие, организация, учреждение

483. А' К •Т ' . • об использовании предложения

484. Регистрационный номер (рационализаторского ' • предложения или авторского свидетельства)

485. Название предложения новая отечественная основа дляизготовлвния ишлуносорбента и метод иммобилизации иммуноглобулина.использовано с ноября19

486. Предприятия по производству бактерийных препаратов ^ЙИЗМ^нм.Н $ Гамалв соответствии с описанием рационализаторского предложения или формулойизобретения, разработанного в лаб.стереорегуляркых полимеров Института

487. Ош?аничес::ой хиппи УрО £АП. Прилагаются: 1 .Дополг-гепле к регламенту ЛЁИКИФЕРОН ДЛЯ ИНЪЕЩЬ'1СТАДИЯ 13Р-5.4.И?,МОБИЛИЗАЦИЯ ИЛОТОГЛОБУЛШЮ!

488. Члены Начальник отдела по изобрета-комис- тельствуи рационализации сии: (начальник патентного отдела или уполномоченный по реализации и изобретательству)

489. СУШШН: Дополнение к экспериментально-пропз иодственногду регдат .енту "Лепшш^ерон дая инъекции". Стадия ВР-5.4 Ижобшшзация Ш/.: .уноглоб„ линов

490. Динамика антигенов в полуфабрикатах лейкинферона в ходе иммуноаффинной очистки

491. Матрица сорбента Серия препарата* Титр интерферона МЕ/мл Уровень антигенов аллантоисной жидкости ** Фрагменты иммуноглобулинов кролика нг/мл** Скорость хроматографии мл/час

492. До очистки После очистки До очистки нг/мл После очистки нг/мл

493. Сефароза 4В 616 Л 16000 16000 100 Нет 1,5 120пвс- носитель 616Л 16000 16000 100 Нет Нет 120пвс- носитель 616 Л 16000 16000 100 Нет Нет 500

494. Сефароза 4В 617 Л 16000 16000 250 Нет 3,0 120

495. ПВС-носитель 617 Л 16000 16000 250 Нет Нет 120

496. ПВС-носитель 617 16000 16000 250 Нет Нет 700

497. Сефароза 4В 618 Л 8 000 8 000 100 Нет 1,0 120пвс- носитель 618 Л 8 000 8 000 100 Нет Нет 120пвс- носитель 618 Л 8 000 8 000 100 Нет Нет 500

498. Сефароза 4В 647 Л 16000 16000 250 Нет 2,0 120

499. ПВС-носитель 647 Л 16000 16000 250 Нет Нет 120

500. ПВС-носитель 647 Л 16000 16000 250 Нет Нет 500

501. Сефароза 4В 648 Л 16000 16000 400 Нет 1,5 120

502. ПВС-носитель 648 Л 16000 16000 400 Нет Нет 120

503. ПВС-носитель 648 Л 16000 16000 400 Нет Нет 600

504. Сефароза 4В 649 Л 16000 16000 500 Нет 2,0 120

505. ПВС-носитель 649 Л 16000 16000 500 Нет Нет 600

506. Сефароза 4В 650 Л 16000 16000 200 Нет 2,0 120

507. ПВС-носитель 650 Л 16000 16000 200 Нет Нет 600

508. Сефароза 4В 651 Л 16000 16000 250 Нет 8,0 120

509. ПВС-носитель 651 Л 16000 16000 250 Нет Нет 600

510. Сефароза 4В 652 Л 16000 16000 100 Нет 20,0 120

511. ПВС-носитель 652 Л 16000 16000 100 Нет Нет 600

512. Сефароза 4В 653 Л 16000 16000 500 Нет 20,0 120пвс- носитель 653 Л 16000 16000 500 Нет Нет 600

513. Сефароза 4В 654 Л 16000 16000 50 Нет 20,0 120

514. ПВС-носитель 654 Л 16000 16000 50 Нет Нет 600

515. Сефароза 4В 655 Л 16000 16000 140 Нет 16,0 120

516. ПВС-носитель 655 Л 16000 16000 140 Нет Нет 600

517. Сефароза 4В 656 Л 8 000 8 000 50 Нет 28,0 100пвс- носитель 656 Л 8 000 8 000 50 Нет Нет 600

518. Сефароза 4В 657 Л 16000 16000 120 Нет 20,0 100

519. ПВС-носитель 657 Л 16000 16000 120 Нет Нет 600

520. Сефароза 4В 658 Л 16000 16000 480 Нет 20,0 100пвс- носитель 658 Л 16000 16000 480 Нет Нет 600

521. Сефароза 4В 674 Л 8 000 8 000 160 Нет 30,0 100

522. ПВС-носитель 674 Л 8 000 8 000 160 Нет нет 600

523. Сефароза 4В 675 Л 16000 16000 40 Нет 20,0 100

524. ПВС-носитель 675 Л 16000 16000 40 Нет Нет 600

525. Сефароза 4В 676 Л 16000 16000 160 Нет 18,0 120

526. ПВС-носитель 676 Л 16000 16000 160 Нет Нет 600

527. Сефароза 4В 677 Л 16000 16000 50 Нет 25,0 100пвс- носитель 677 Л 16000 16000 50 Нет Нет 600

528. Сефароза 4В 686 Л/1 16000 16000 120 Нет 20,0 100

529. ПВС-носитель 686 Л/1 16000 16000 120 Нет Нет 600

530. Сефароза 4В 686 Л/2 16000 16000 140 Нет 18,0 100

531. ПВС-носитель 686 Л/2 16000 16000 140 Нет следы 600

532. Сефароза 4В 712 Л 16000 16000 50 Нет 30,0 100

533. ПВС-носитель 712 Л 16000 16000 50 Нет 1,5 600

534. Отмыв сорбентов 20-кратным объемом буфера регенерации

535. Сефароза 4В 714 Л 16000 16000 200 Нет 1,5 100

536. ПВС-носитель 714 Л 16000 16000 200 Нет Нет 600• Объем полуфабриката лейкинферона 2,5 литра, размер колонки - 1,5 * 22 см;• ** Определение методом иммуноферментного анализа с порогом чувствительности 0,5 нг/мл.

Информация о работе

Гарипова, Маргарита Ивановна
доктора биологических наук
Уфа, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Инсулин-транспортирующие системы крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа. Теоретические и прикладные аспекты - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Инсулин-транспортирующие системы крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа. Теоретические и прикладные аспекты - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы