Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменение содержания цинка в крови человека при сахарном диабете типа I и особенности гипогликемического действия цинксодержащего комплекса инсулин - хондроитинсульфат
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Изменение содержания цинка в крови человека при сахарном диабете типа I и особенности гипогликемического действия цинксодержащего комплекса инсулин - хондроитинсульфат"

На правах рукописи

Ильина Ольга Сергеевна

ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЦИНКА В КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ

САХАРНОМ ДИАБЕТЕ ТИПА I И ОСОБЕННОСТИ ГИИОГЛИКЕМИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЦИНКСОДЕРЖАЩЕГО КОМПЛЕКСА ИНСУЛИН - ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТ

03.01.06. - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 мдр 2012

Уфа-2012

005014153

005014153

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»

Научные руководители доктор биологических наук,

Гарипова Маргарита Ивановна доктор биологических наук, профессор Киреева Наиля Ахняфовна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Алимова Фарида Кашифовна доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович Ведущая организация Институт биохимии и биофизики Казанского НЦРАН

Защита диссертации состоится 23 марта 2012 г. в 14.00 часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.136.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биологии Уфимского научного центра Российской академии наук по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, д. 69, тел.: 235-53-62, e-mail: ib@anrb.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра Российской академии наук и на официальном сайте http://www.anrb.ru/inbio/dissovet/index/htm

Автореферат разослан

» 2012 г.

Ученый секретарь Объединенного диссертационного совета, кандидат биологических наук

ч

РБ. Уразгильдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Известно, что в составе секреторных гранул клеток островков Лангерганса инсулин находится в комплексе с катионами цинка (Грачева и др., 1972). Кроме того, была доказана роль этого катиона во взаимодействии инсулина с транспортными белками крови (Гарипова и др., 2005, 2007), что свидетельствует о важности этих катионов для поддержания структуры и проявления биологической активности гормона, а также о необходимости присутствия физиологических концентраций солей цинка в препаратах для гормональной терапии сахарного диабета. Возможные отклонения концентрации катионов цинка в крови человека от нормы могут быть одной из причин снижения эффективности проявления биологической активности и доставки инсулина к чувствительным клеткам. Данные литературы о соответствии норме концентрации катионов цинка в крови больных сахарным диабетом противоречивы (McNair et al., 1981; Pai и Prasad, 1988, Greenwood et. al., 1997, Скальный и др., 2003, Мухина и др., 2005, King et. al., 2011). В связи с этим представляет интерес сравнение содержания этого катиона в крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом.

Обязательным компонентом внутреннего пространства секреторных гранул и лизосом, наряду с двухвалентными катионами металлов, согласно современным представлениям, являются сульфатированные мукополисахариды (протеогликаны), подобные хондроитинсульфату (ХС), формирующие основу, на которой сорбируются заключенные в гранулах активные компоненты, такие как ферменты, гормоны и катионы металлов. Протеогликаны также формируют основу межклеточного матрикса (Марри и др., 1993, Segal, 2005). В крови присутствуют транспортные гликопротеиды, такие как трансферин и а-фетопротеин, имеющие структурное сходство с мукополисахаридами, и связывающие наряду с катионами металлов, гормоны, витамины, ферменты (Грачева, 1976, Марри, 1993, Гарипова, 2009). Таким образом, формирование комплекса гормонов, в том числе инсулина, с прогеогликанами необходимо на

всех стадиях существования гормона от синтеза и секреции до транспортировки и связывания с чувствительными клетками. Особенности протеогликанов, формирующих комплексы с секретируемыми соединениями - высокая гидрофилыюсть, связанная с высоким содержанием углеводов, низкая иммуногенность, высокая плотность отрицательного заряда, антикоагулянтные свойства. Подобными свойствами обладает низкомолекулярная форма хондроитинсульфата (ХС), для которой доказано наличие антикоагулянтных и иммуносупрессорных свойств (Бычков и др., 1979, Bait etal., 1983, Марри и др., 1993), что делает перспективным использование комплекса инсулина с низкомолекулярной формой ХС в качестве лекарственной формы инсулина, близкой по свойствам природной транспортной форме гормона. Учитывая важность присутствия катионов цинка для реализации действия инсулина, мы предположили, что в составе подобной лекарственной формы гормона должна присутствовать соль цинка в физиологической концентрации. В связи с этим, цель данного исследования - выявить возможные отклонения от нормы в содержании катионов цинка в крови больных сахарным диабетом типа I, получить комплекс инсулина с низкомолекулярной формой хондроитинсульфата и исследовать особенности его гипогликемического действия.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи исследования:

1. Разработать вариант метода количественного определения катионов цинка в плазме крови с применением дитизона.

2. Сравнить концентрации общего цинка в плазме крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом типа I.

3. Провести сравнение концентрации несвязанных с белком катионов цинка в крови больных сахарным диабетом и здоровых доноров.

4. Разработать метод получения частично гидролизованного хондроитинсульфата из хрящей крупного рогатого скота.

5. Получить комплекс инсулина с хондроитинсульфатом.

6. Исследовать особенности сахароснижающего действия комплекса инсулина с хондроитинсульфатом по сравнению с действием свободного инсулина.

Научная новизна

Показано, что концентрация катионов цинка в крови больных сахарным диабетом типа I достоверно превышает этот показатель в крови здоровых доноров. Установлено, что это повышение обусловлено увеличением количества катионов цинка, связанных с белками крови больных сахарным диабетом, что согласуется с данными других авторов (Скальный A.B., 2001, Мухина и др., 2005), при этом концентрация свободных катионов цинка в крови больных сахарным диабетом достоверно снижается по сравнению с нормой. Полученные данные позволяют сделать предположение о том, что повышение связывания катионов цинка белками крови обусловлено изменением их состава, в частности повышением концентрации в крови больных диабетом ai-кислого гликопротеина.

Установлено, что в присутствии катионов цинка в растворе, инсулин формирует надмолекулярный комплекс с ХС, причем формирование комплекса тормозится при добавлении свободных аминокислот (гидролизата бычьего сывороточного альбумина). Это позволяет предположить, что формирование комплекса инсулина с белковыми фрагментами протеогликана происходит также как в случае формирования гексамеров цинка, за счет взаимодействия катионов с гистидином и цистеином, включенными в состав инсулина и коровых белков хондроитинсульфата.

Показано, что при введении лабораторным животным инсулина с хондроитинсульфатом в присутствии катионов цинка гипогликемическое действие инсулина сохранялось более длительное время, чем при введении свободного инсулина. Вероятно, освобождение инсулина из этого комплекса происходит постепенно, в результате чего формируется эффект пролонгированного действия гормона. Обнаруженное явление заслуживает

дальнейшего исследования и может быть использовано для получения новых лекарственных форм инсулина с пролонгированным действием.

Практическая значимость работы

Предложен вариант метода количественного определения катионов цинка в сыворотке крови с использованием цветной реакции с дитизоном (дифенилтиокарбазоном).

Разработан метод получения высокоочищенного частично гидролизованного хондроитинсульфата.

Разработаны принципы получения препаратов инсулина пролонгированного действия на основе низкомолекулярной формы хондроитинсульфата и солей цинка.

Показано, что связывание инсулина с протеогликаном тормозится в присутствии свободных аминокислот, что свидетельствует об участии в образовании комплекса аминокислотных остатков корового белка ХС и инсулина, формирующих координационные связи с катионом цинка. Это явление может бьггь использовано для получения препаративной формы инсулина, из которой инсулин освобождается в результате вытеснения из комплекса свободными аминокислотами при повышении их концентрации, происходящем после приема пищи. Таким образом, может быть создан препарат, имитирующий выброс инсулина из Р-клеток в кровь после еды.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Доказано, что в крови больных сахарным диабетом типа I происходит достоверное снижение концентрации свободных катионов цинка, обусловленное повышенным связыванием катионов с белками плазмы крови.

2. Для формирования комплекса инсулина с хондроитинсульфатом необходимо присутствие катионов цинка.

3. Гипогликемическое действие инсулина в комплексе с низкомолекулярным хондроитинсульфатом и катионами цинка при

в

введении лабораторным мышам продолжается более длительное время по сравнению с использованием свободного инсулина.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (Саранск, 2008), ХШ международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск.-2008), 12-ой международной путинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2008), Международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов» (Уфа, 2009, на XLIX), на XLVHI Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология ( Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2011), IV Международной научно-практической конференции (Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011 г.),

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 17 печатных работах, в том числе в четырех статьях в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 8 рисунков, 3 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 149 работы.

Благодарности. Выражаю глубокую признательность научным руководителям - д.б.н. Маргарите Ивановне Гариповой, профессору, д.б.н. Наиле Ахняфовне Киреевой за консультации и ценные советы, способствовавшие совершенствованию работы, а также всем моим коллегам, оказавшим неоценимую помощь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В исследовании использованы пробы крови 42 больных сахарным диабетом типа I, находившихся на стационарном лечении в эндокринологическом отделении РКБ им. Куватова (г.Уфа), с процентным содержанием в капиллярной крови гликозилированной формы гемоглобина от 8 % до 18,6%.

Формирование группы здоровых доноров проводили на основании заключения эндокринолога об отсутствии отклонений от нормы в регуляции углеводного обмена и процентного содержания гликозилированного гемоглобина (%Ггб) в капиллярной крови. Для исследования отобраны пробы крови 53 здоровых добровольцев 20-25 лет с содержанием Ггб от 4 до 7,5%, что соответствует нормальному уровню гликемии.

Определение концентрации глюкозы в крови лабораторных мышей экспериментальных животных проводили с использованием диагностического набора «Глюкоза - ФКД», произведенного ООО «Фармацевтика и клиническая диагностика» (Москва), глюкозооксидазным методом (Меньшиков, 1987).

Определение % Ггб проводили с использованием аффинной диагностической системы, содержащей микроколонки с сорбентом, представляющим собой мета-аминофенилбороновую кислоту (м-АФБК), иммобилизованную на поливиниловой матрице (Гарипова и др.1994). Для приготовления гемолизатов использовали 0,2 мл капиллярной крови пациента, взятой общепринятым методом. Пробу крови суспендировали в 10 мл физиологического раствора и центрифугировали при 600£ с использованием клинической центрифуги. Надосадок отбрасывали, эритроциты вновь суспендировали в физиологическом растворе и повторяли центрифугирование. Лизировали отмытые эритроциты добавлением 0,4 мл дистиллированной воды. Гемолизат выдерживали 5 минут для завершения лизиса эритроцитов и

центрифугировали в течение 10 минут при 800 ё для удаления стромы

8

эритроцитов. Содержание гликогемоглобина в пробах определяли сразу после приготовления гемолизата или в течение одного месяца при хранении гемолизатов при -20°С. Хроматографическое разделение гемоглобина на гликозшшрованную и негликозилированную фракции регистрировали при помощи проточного спектрофотометра "1Мсог(1-2" и самописца фирмы "ЬКВ" (Швеция) (рисунок 1). На каждой порции сорбента проводили не менее 20 определений. На колонку, содержащую 2 мл аффинного сорбента, уравновешенную 0,025 М натрий-фосфатным буфером рН 8,5, наносили 0,4 мл ранее приготовленного гемолизата. Температура растворов и колонки поддерживалась в пределах 20 - 24°С. После проникновения гемолизата в слой сорбента ток буфера останавливали на 15 минут для проведения связывания гликогемоглобина с м-АФБК, иммобилизованной на сорбенте. Затем сорбент промывали 25 мл стартового буфера для сбора фракции гемоглобина, не содержащего остатков глюкозы (фракция 1). Гликозилированный гемоглобин элюировали с колонки тем же буфером, содержащим 200 мМолей конкурирующего сахара - сорбитола, содержащего гидроксильные группы в соседнем положении, и способного вытеснять Ггб с поверхности сорбента (фракция 2), объем этой фракции также доводили до 25 мл. Затем следы гликогемоглобина отмывали от сорбента 20 мл элюирующего буфера и проводили регенерацию колонки 50 мл 0,0001М соляной кислоты рН 4,0. После завершения цикла колонку уравновешивали стартовым буфером рН 8,5 и проводили следующие определения.

Процент гликогемоглобина в пробе по отношению к общему содержанию гемоглобина определяли по формуле:

0П414(2)

% Ггб = *100,где

0П4н(1)+ 0П4и(2) % Ггб - % содержания в пробе гликозшшрованного гемоглобина; 0П4М(1) - оптическая плотность фракции 1 при 414 им; 0П414(2) - оптическая плотность фракции 2 при 414 нм;

Измерение оптической плотности фракций проводили в области

максимума поглощения гемоглобина, то есть при 414 нм, благодаря чему

присутствие других белков во фракциях не сказывалось на результате определения.

0,4

II.

и

V,-

Б "4*

VI

■щ

Рисунок 1. Хроматографическое выделение гликогемоглобина на сорбенте с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой. №1-гемолизат больного сахарньм диабетом на стадии декомпенсации; №2 - гемолизат здорового донора;

Определение концентрации катионов цинка проводили по авторской методике, описанной в главе П, п.4.1 диссертации с использованием дитизона.

Исследование сахароснижагащсго действия комплекса инсулина с хондроитинсульфатом проведено на самцах белых беспородных лабораторных мышей.

Определение содержания в пробах ^-кислого гликопротеина и трансферина проводили методом иммунонефелометрии при помощи диагностических наборов фирмы Иммунотех (Россия) по прилагаемой инструкции. Дня количественной оценки результатов применялась оценка интенсивности реакции в баллах по трехбалльной шкале. Пределы нормального содержания щ-кислого гликопротеина в сыворотке крови взрослых обследуемых составляют 25-135 мг на 100 мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка метода количественного определения катионов цинка в плазме крови с применением дитизона

Метод количественного определения катионов цинка в сыворотке крови человека разработан на основе качественного варианта дитазонового метода определения цинка (Алексеев, 1960).

Известно, что комплексное соединение малиново-красного цвета с катионами цинка дитизон образует при щелочных значениях рН. В связи с этим, было предложено проводить количественное определение катионов цинка по следующей методике.

К 2 мл сыворотки крови добавляли 0,1 мл 10% ЫаОН и 0,2 мл раствора 1% раствора дитизона в четыреххлористом углероде. В отрицательном контроле вместо сыворотки крови добавляли 2 мл дистиллированной воды, в положительном контроле - 2 мл 0,0001 М раствора сульфата цинка. Пробы фотометрировали при 540 нм. Расчет концентрации катионов цинка в пробе проводили по формуле:

С2„ = 0,0001 М * ОП54о Пробы/ ОП54о Стандарта

Проведено определение катионов цинка в сыворотках крови 53 здоровых доноров 23-35 лет и 42 больных сахарным диабетом типа I 20-35 лет. Результат измерения ОП54о представлен в таблице 1. Как следует из данных, приведенных в таблице, концентрация катионов цинка в крови обследованных больных сахарным диабетом достоверно превышает этот показатель в крови здоровых доноров. В норме ОП54о проб составила 23,6±1,32мкМоль/л, при сахарном диабете - 34,3±1,26мкМоль/л. Проведена проверка достоверности различия полученных показателей с использованием параметрических критериев Стьюдента и Фишера после проведения тестов на нормальность распределений. Полученные данные достоверно различаются как по критерию Стьюдента (I = -3,66; р = 0,0007), так и по

и

Таблица 1

Результат определения цинка в сыворотке крови здоровых доноров (I) и больных сахарным диабетом (II)

Здоровые доноры ОП540 Больные сахарным диабетом ОП540

Средние значения 23,6 ±1,32 мкМоль/л 34,3±1,26 мкМоль/л

1- критерий Стьюдента Т = -3,66; р = 0,0007

Р-критернй Фишера Р=3,42, р=0,008

критерию Фишера (Р=3,42, р=0,008). Данные литературы об изменениях концентрации цинка при сахарном диабете противоречивы: по данным ряда авторов содержание цинка при всех формах диабета ниже нормы (№е\тое1гпег й ей., 1986; МоссЬе^ам ег а1., 1989), в то время как данные других авторов свидетельствуют о повышении концентрации цинка в крови больных диабетом типа I (МесШгоз « а1., 1983, СапНеЫ й а1., 1984, Ра1 et а1., 1988, Ьапу й. а1., 2001). Мы предположили, что для устранения этого противоречия необходимо дифференцировать свободную и связанную с белками формы катионов цинка в крови обследуемых.

Таблица 2

Результат определения свободных катионов цинка в сыворотке крови здоровых доноров (I) и больных сахарным диабетом (II)

Здоровые доноры ОП54о Больные сахарным диабетом ОП540

Средние значения 1,62±0,093 мкМоль/л 0,98± 0,036 мкМоль/л

критерий Манна-Уитни г=-4,14; р=0,000034

Для определения концентрации несвязанных с белками катионов цинка (свободный цинк), проводили предварительное осаждение белков сыворотки крови равным объемом 15% раствора трихлоруксусной кислоты.

Полученные данные представлены в таблице 2. Как следует из таблицы 2, концентрация свободного цинка в крови больных сахарным диабетом ниже, чем в крови здоровых доноров: среднее значение свободного цинка в крови больных диабетом составило 0,98± 0,036 мкМоль/л, в то время как в крови здоровых доноров концентрация составила 1,62± 0,093 мкМоль/л. Так как полученные ряды данных не соответствуют нормальному распределению, различие доказано с использованием критерия Манна-Уитни (Z=-4,14; р=0,000034).

Таким образом, показано, что концентрация несвязанного с белком цинка в крови диабетиков достоверно ниже, чем в крови здоровых доноров. Соответственно, полученные данные свидетельствуют о повышенном связывании катионов цинка белками крови при сахарном диабете типа I. Явление повышения прочности связывания катионов цинка белками крови больных сахарным диабетом всех клинических форм было описано в работах ряда авторов (McNair et al., 1981 Sagaraetal., 1982). Авторы высказывают предположение, что это явление обусловлено повышенным гликозилированием белков крови при декомпенсированном сахарном диабете. Предполагается, что неферментативно (в результате МаШаг<1-реакции) связанная с аминогруппами белков глюкоза способна образовывать хелаты с цинком, что способствует повышению связывания с белками крови и, вследствие этого, к снижению концентрации свободного катиона в крови. Однако, формирование комплекса цинка с остатками глюкозы маловероятно, так как основными органическими соединениями, формирующими комплексы с катионами цинка, являются аминокислоты гистидин, лизин, треонин, цистин и глютамин (Greenwood et al., 1997). В связи с этим, было высказано предположение, что прочность связывания цинка с белками крови возрастает в связи с изменением их состава. При сравнении концентраций в исследованных сыворотках здоровых доноров и

13

больных сахарным диабетом не выявлено достоверного различия в концентрациях трансферина, однако, концентрация аггликопротеина в крови больных сахарным диабетом достоверно превышала этот показатель в крови здоровых доноров (1,86 ± 0,4 балла в крови больных диабетом по сравнению с 0,3 ± 0,2 балла).

Повышение общей концентрации ионов цинка в крови больных сахарным диабетом, вероятно, направлено на компенсацию дефицита свободного цинка, но не достигает своей цели.

Сниженная концентрация свободных катионов цинка в крови больных сахарньм диабетом может служить одной из причин нарушения включения инсулина в транспортный комплекс, основу которого формируют транспортные гликопротеины крови: трансферин и а-фетопротеин, для формирования которого необходимо присутствие катионов цинка (Гарипова, 2009).

Выделение хондроитинсульфата из трахей крупного рогатого скота проводили методом, описанным С.Е. Васюковым и соавторами (Васюков и др., 1996) с дополнительным двукратным осаждением ХС концентрированной соляной кислотой, повышающим производительность выделения. Для выделения ХС 50 г хряща после двукратного обезжиривания ацетоном гомогенизировали при помощи ножевого гомогенизатора и проводили экстракцию ХС в 300 мл 3 М хлорида калия при перемешивании в течение 24 часов при 50° С. Затем надосадок отделяли центрифугированием при 600g в течение 15 минут и проводили нейтрализацию с последующим осаждением концентрированной соляной кислотой. Осадок ХС отделяли центрифугированием в течение 10 минут при 600 g и перерастворяли в незабуференном физиологическом растворе в минимальном объеме и проводили повторное осаждение ХС концентрированной соляной кислотой из расчета 6 мл HCL на 100 мл раствора. Образовавшийся осадок выделяли центрифугированием и вновь перерастворяли в 100 мл дистиллированной воды и доводили pH до 6. Благодаря двукратному переосаждению ХС концентрация белка, определенного при помощи биуретовой реакции, в

14

целевом продукте снизилась с 46% до 15±1,5%. На следующем этапе очистки хондроитинсульфата к 100 мл экстракта добавляли 100 г анионита Дауэкс 1 х 2 фирмы "Sigma" и встряхивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем анионит промывали двадцатикратным объемом дистиллированной воды и элюировали ХС 200 мл 1,5 М хлорида натрия. Проведение ионообменной хроматографии в хроматографической колонке было невозможно в связи с высокой вязкостью хондроитинсульфата. Выделенный хондроитинсульфат содержал 15±1,5% белка, и характеризовался высокой вязкостью, что затрудняло работу с ним. Известно, что низкомолекулярная фракция ХС обладает свойствами антикоагулянта, менее выраженными, чем у гепарина и свойствами иммунодепрессанта (Мейл и др., 2007), что позволяет предположить, что его использование для получения комплекса с инсулином позволит смоделировать иммуносупрессорные свойства гликопротеидов крови, транспортирующих инсулин в крови здорового человека (Гарипова, 2009). В связи с этим, для получения комплекса с инсулином был использован ХС, подвергнутый кислотному гидролизу при 60° С в 0,5 М соляной кислоте в течение 6 часов. Подтверждением осуществления гидролитического расщепления ХС в указанных условиях является снижение вязкости полученного раствора ХС с 74,3 м2/сек до 6,9 м2/сек.

Частично гидролизованный ХС, полученный описанным методом, при гельхроматографии на колонке с Сефадексом G- 75 выходит преимущественно в свободном объеме, но содержит и более низкомолекулярные фракции (рисунок 2).

Рисунок 2. Гельхроматография гидролизованного ХС на Сефадексе 0-75, откалиброваняой при помощи молекулярных маркеров: голубого декстрана (молекулярный вес 2*10б Д), гемоглобина (молекулярный вес 68*103 Д) и амидочерного В (молекулярный вес ~ 103 Д). Стрелками показан объем выхода фракций хондроитансульфата, использованных для получения комплекса с инсулином.

Для получения комплекса с инсулином отобраны фракции, вышедшие в средней части второго пика, имеющие молекулярный вес около 50 тысяч Д.

Получение комплекса инсулина с хондроитинсуьфатом и исследование его сахароснижающего действия. Гипогликемическое действие инсулина в присутствии ХС в сравнении с эффектом свободного инсулина исследовали на трех группах самцов белых лабораторных беспородных мышей, каждая из которых состояла из 20 животных весом 10-15 грамм. На первой группе определено действие свободного инсулина из расчета 0,08 единиц гормона на мышь, на второй - действие инсулина в присутствии хондроитансульфата (0,08 единиц инсулина с добавлением 0,2 мг хондроитансульфата в 0,2 мл физиологического раствора в расчете на мышь). На третьей группе мышей исследовалось действие инсулина в комплексе с хондроитинсульфатом и сульфатом цинка (0,08 единиц гормона в комплексе с

0,2 мг хондроитинсульфата в 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 1 мкМ/л сульфата цинка, в расчете на мышь).

С инокозы

0.5 О

Рисунок 3. Динамика гликемии после введения лабораторным мышам 1- свободного инсулина в дозе 0,08 единиц гормона на мышь в физиологическом растворе; 2 - 0,08 единиц инсулина с добавлением 0,2 мг частично гидролизованного хондроитинсульфата в 0,2 мл физиологического раствора в расчете на мышь; 3. 0,08 единиц гормона в комплексе с 0,2 мг хондроитинсульфата и 1 мкМ сульфата цинка в 0,2 мл физг "логического раствора в расчете на мышь.

Этот вариант комплекса исследовался в связи с тем, что в предыдущих исследованиях было установлено, что для включения инсулина в комплекс с транспортными белками крови необходимо присутствие катионов цинка (Гарипова и др., 2010). Результаты сравнения концентрации глюкозы в крови мышей в период от 30 минут до 6 часов после инъекции инсулина в трех группах мышей представлены на рисунке 3.

Установлено, что исходный уровень гликемии белых беспородных лабораторных мышей в среднем составляет 3,9 ±0,61 ммоль/л и колеблется в пределах от 3,13 ммоль до 4,66 ммоль глюкозы на литр крови. После введения 0,08 единиц свободного инсулина на мышь концентрация глюкозы в крови животных снизилась и составила 0,84±0,07 ммоль/л через 30 минут после введения гормона. Гликемия через 30 минут после инъекции той же дозы

17

инсулина с хондроитинсульфатом (группа 2) и хондроитинсульфатом в присутствии соли цинка (группа 3) составила соответственно 0,8±0,08 ммоль/л и 1,045± 0,11 ммоль/л и достоверно не отличалась от гликемии через 30 минут после введения свободного инсулина.

Через 2 часа после введения инсулина гликемия в первой и второй группах мышей нормализовалась и составила соответственно 3,86 ±0,4 ммоль/л и 4,06±0,35 ммоль/л. Однако, в группе мышей, получавших инсулин в комплексе с хондроитинсульфатом и солями цинка, через 2 часа после введения гликемия была достоверно ниже нормального значения и составила 2,07±0,19 ммоль/л.

Таким образом, при введении инсулина с хондроитинсульфатом в присутствии катионов цинка сахароснижающее действие инсулина сохранялось более длительное время, чем при введении свободного инсулина и инсулина с хондроитинсульфатом без соли цинка.

Полученные результаты позволяют предположить, что при введении инсулина с хондроитинсульфатом и катионами цинка, гормон формирует комплекс с хондроитинсульфатом с участием катионов цинка. Вероятно, освобождение инсулина из этого комплекса происходит постепенно, в результате чего формируется эффект пролонгированного действия инсулина.

Для подтверждения предположения о необходимости присутствия катионов цинка для формировании комплекса инсулина с ХС, проведена гельхроматография на колонке с Сефадексом С-75 трех проб: 1. 5 мг ХС с 2 ед. инсулина в 1 мл физиологического раствора; 2. 5 мг ХС с 2 ед инсулина в 1 мл физиологического раствора, содержащего 1 мкМ/л сульфата цинка, 3. 5мг ХС с 2 ед. инсулина в 1 мл физиологического раствора, содержащего 1 мкМ/л сульфата цинка в присутствии гидролизата 5 мг бычьего сывороточного альбумина.

ОПза

ОПаз

0,3

ОПао

0,2

С 50 100 150 »!«

10» 150

Рисунок 4. Гельхроматография на колонке с Сефадексом С-75 проб, содержащих 1. 5 мг ХС с 2 ед. инсулина в 1 мл физиологического раствора; 2. 5 мг ХС с 2 ед инсулина в 1 мл физиологического раствора, содержащего 1 мкМ/л сульфата цинка, 3. 5мг ХС с 2 ед инсулина в 1 мл физиологического раствора, содержащего 1мкМ/л сульфата цинка в присутствии гидролизата 5 мг бычьего сывороточного альбумина.

Эта проба была исследована для изучения возможности торможения сшивки ХС с инсулином катионами цинка, свободными аминокислотами, такими как гистидин, лизин, треонин, цистин, глютамин (принимают участие в формировании цинксодержащих белковых структур, Мухина и др., 2005). Полученные хроматограммы приведены на рисунке 4.

Как следует из приведенных хроматограмм, смесь Хс и инсулина без соли цинка при хроматографии выходит во внутреннем объеме Сефадекса 0-75, совпадающем с объемом выхода исходного ХС. Очевидно, это свидетельствует о том, что оба компонента присутствуют в свободном виде, что согласуется с отсутствием отличия в действии инсулина в присутствии ХС от

действия исходного инсулина (рисунок 4а). В то же время, добавление соли цинка приводит к появлению пика, соответствующего свободному объему колонки и, следовательно, имеющего молекулярный вес больше 100 тысяч Д, что свидетельствует о сшивке ХС и инсулина катионами цинка (рисунок 4 б).

Добавление смеси аминокислот отменяет сшивающее действие катионов цинка (рисунок 4в), что, вероятно, свидетельствует о том, что в формировании связи с инсулином принимают участие аминокислотные остатки белкового компонента ХС, формирующие хелатные комплексы с катионами цинка.

^с а|е

Таким образом, показано, что при сахарном диабете в связи с изменением состава сывороточных белков, повышается их цинксвязывающая активность, что приводит к снижению концентрации свободных катионов цинка по сравнению с нормой. Повышение общей концентрации катионов цинка в плазме крови больных сахарным диабетом, возможно, направлено на компенсацию дефицита свободного цинка, но в обследованной нами группе не достигает своей цели.

Ранее было показано, что для включения инсулина в комплекс с транспортными белками крови необходимо присутствие катионов цинка (Гарипова и др., 2010). В связи с этим, снижение свободных катионов цинка при сахарном диабете может нарушать доставку экзогенного инсулина к тканям. Следовательно, препараты инсулина для терапии сахарного диабета должны включать экзогенный цинк.

Применение низкомолекулярного хондроитинсульфата в качестве носителя при добавлении соли цинка позволяет получить комплекс, обладающий пролонгированным гипогликемическим действием по сравнению с действием свободного инсулина. Заслуживает внимания тот факт, что добавление смеси свободных аминокислот препятствует формированию комплекса инсулина с хондроитинсульфатом. Можно предположить что, их добавление также может приводить к постепенному вытеснению гормона из комплекса, что может имитировать выброс инсулина в кровь из

20

поджелудочной железы после приема пищи. Таким образом, при использовании комплекса хондроитинсульфата с цинком может быть получена форма инсулина «выбрасывающая» гормон в кровь после приема пищи, то есть имитирующая активность бета клеток островков Лангерганса.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод количественного определения катионов цинка в плазме крови с использованием дитизона.

2. Достоверно показано, что общая концентрация катионов цинка в крови больных сахарным диабетом выше, чем в крови здоровых доноров: среднее значение концентрации цинка в крови больных диабетом составило 34,3±1,26 мкМоль/л, в крови здоровых доноров -23,6 ±1,32 мкМоль/л. Различие доказано с использованием критериев Стьюдента и Фишера (1=-3,66, р=0,0007, Р=3,42, р=0,008).

3. Установлено, что концентрация несвязанных с белком катионов цинка в крови больных сахарным диабетом достоверно ниже, чем в крови здоровых доноров: среднее значение показателя в крови больных диабетом составило 0,98± 0,036 мкМоль/л, в то время как в крови здоровых доноров концентрация составила 1,62±0,093 мкМоль/л. Различие доказано с использованием критерия Манна-Уитни (г=-4,14; р=0,000034).

4. Разработан метод получения частично гидролизованного хондроитинсульфата с содержанием углеводов 85±1,5% и молекулярным весом около 50 тысяч Д.

5. Установлено, что образование комплекса инсулина с хондроитинсульфатом требует присутствия катионов цинка и тормозится смесью свободных аминокислот.

6. Показано, что гипогликемическое действие комплекса инсулина с протеогликаном является более продолжительным по сравнению с действием свободного инсулина. Эффект пролонгированного действия

21

инсулина, возможно, объясняется постепенным освобождением гормона из комплекса. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК

1. Елисеева О.С., Киреева НА., Першина A.C., Буторина О.Л., Бикбулатова СМ., Гарипова МИ. Исследование природы взаимодействий инсулина с поверхностью эритроцитов и состава гормонтранспортирующего комплекса плазмы крови человека. / Вестник Оренбургского государственного университета,- 2009.-№6.-С.476-478.

2. Першина A.C., Киреева H.A., Елисеева О.С., Гарипова МЛ. Изучение эритроцитарного транспорта инсулина в норме и при сахарном диабете первого типа. / Вестник Оренбургского государственного университета.- 2010.-№ 2. -С.141-143.

3. Гарипова МИ., Киреева H.A., Баранова МБ., Елисеева О.С., Першина A.C., Набиуллина Р.Р. Аффинное выделение связывающих инсулин сывороточных гликопротеидов человека и изучение их разнообразия в норме и при сахарном диабете. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова,- 2007.-т.З.-№1.-С 27-32.

4. Гарипова М.И., Моругова ТБ., Киреева НИ., Ибрагимов Р.И., Першина A.C., Елисеева О.С.,. Баранова МБ. Аффинное выделение и изучение состава связывающих инсулин белков сыворотки крови человека. Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2010. - № 8,- С.40-44

Статьи, материалы, тезисы

5. Першина A.C., Елисеева О.С., Гарипов О.С., Киреева НА., Гарипова МИ. Влияние условий современного промышленного города на соотношение эритроцитарного и сывороточного транспорта инсулина. / Материалы международной научной конференции «Проблемы бигоколога и пуга их решения»,-Саранск.-2008.-С.318-319.

6. Елисеева О.С., Киреева H.A., Гарипова МИ. Влияние экологических условий промышленного города на состав связывающих инсулин

22

транспортных белков крови человека. // Материалы международной научной конференции «Проблемы биоэкологи и пути их решения».-Саранск.-2008.-С.303-305.

7. Першина A.C., Елисеева О.С., Гарипова МП. Транспорт инсулина в крови человека эритроцитарной системой. / Материалы ХШ международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий».- Новосибирск.-2008.-С.157-158.

8. Елисеева О.С., Першина A.C. Состояние шгсулш¡связывающего белкового комплекса крови человека в условиях промышленного города. /Материалы ХШ международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий».- Новосибирск.-2008.-С.158-159.

9. Першина A.C., Гарипова МЛ., Киреева НА., Елисеева О.С. Особенности транспорта инсулина в крови человека. / 12-ая международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века».-Пущино.-2008.-С. 101 -102.

Ю.Елисеева О.С., Першина A.C., Гарипова М.И., Киреева H.A. Транспорт инсулина в сыворотке крови здоровых людей и больных сахарным диабетом первого тала. / 12-ая международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века».-Пущино.-2008.-С.84.

11.Першина A.C., Гарипова МЛ., Моругова НА., Киреева H.A., Елисеева О.С. Аффинные методы в исследовании транспорта инсулина в крови человека./ Вестник биотехнологии. Оригинальные статьи.- Москва,- 2007.-№3,- С. 33-34.

12. Гарипова МЛ., Киреева H.A., Моругова H.A., Елисеева О.С., Першина A.C. Аффинное выделение связывающих инсулин сывороточных гликопротевдов человека и изучение их состава в норме и при сахарном диабете первого типа /Вестник биотехнологии. Оригинальные статьи.- Москва.-2007.-№3.- С. 2732.

13. Гарипова МЛ ,Елисеева О.С., Першина A.C. Инсулшпранспортирующие системы крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа. // Материалы Международной научно-пракшческой конференции «Роль

23

классических университетов в формировании инновационной среды регионов». Уфа РЩ БашГУ.-2009.- Т.2.-С.69-72.

14. Гарипова М.И., Буторина О.Л., Елисеева О. С., Калимуллина Р. А. Изменение концентрации катионов цинка в крови человека при сахарном диабете типа I. // Материалы IV Международной научно-практической конференции Ростов-на-Дону.- 2011.-С.85.

15. Буторина О. Л,. Елисеева О. С , Калимуллина Р. А., Першина А. С. Сравнительный анализ содержания катионов цинка в крови больных сахарным диабетом типа I и здоровых доноров. // Материалы ХЬУШ Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология.- Новосибирск: Новосиб. гос. ун-т.-2011,- С. 164.

16. Буторина О. Л., Елисеева О. С. , Калимуллина Р. А., Першина А. С. Изменение концентрации катионов цинка в крови человека при сахарном диабете типа I.- Материалы студенческих научных конференций «Студент и наука».-Уфа РИД БашГУ,- 2011 .-С.26-27.

17.Факиева С. А., Гарипов О.С., Елисеева (Ильина) О.С., Буторина О. Л., .Исследование особенностей сахароснижающего действия комплекса инсулина с хондроитинсульфатом.- Материалы студенческих научных конференций «Студент и наука».-Уфа РИЦ БашГУ.- 2011 ,-С.З 7-3 8.

Подписано в печать 20.02.12 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ Гарнитура «Типез№уЛ1отап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем I п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ильина, Ольга Сергеевна, Уфа

61 12-3/845

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО

ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Ильина Ольга Сергеевна

ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЦИНКА В КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ

САХАРНОМ ДИАБЕТЕ ТИПА IИ ОСОБЕННОСТИ ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЦИНКСОДЕРЖАЩЕГО КОМПЛЕКСА ИНСУЛИН - ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТ

03.01.06. - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

03.01.04. - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доц., д.б.н. Гарипова Маргарита Ивановна проф., д.б.н. Киреева Наиля Ахняфовна

Уфа-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................4

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................5

Глава 1. Обзор литературы....................................................11

1.1. Транспорт и метаболизм инсулина. Транспортные формы инсулина, присутствующие в крови человека...............................11

1.2. Транспортные белки крови человека.....................................20

1.3. Биологическое значение цинка и нарушение содержания цинка в крови при сахарном диабете.....................................................33

1.4. Лекарственные формы инсулина..........................................51

Глава 2. Материалы и методы................................................62

2. Объекты исследований, реактивы и материалы..........................62

2.1.Принципы формирования групп добровольцев при изучении системы транспорта инсулина в норме и при сахарном диабете первого типа...................................................................................62

2.2. Основные реактивы для синтеза аффинных сорбентов..............62

2.3. Методы исследований.......................................................63

2.3.1. Определение концентрации глюкозы ферментативным методом...............................................................................63

2.3.2. Аффинное определение содержания гликогемоглобина в капиллярной крови пациента...............................................................................63

2.3.2.1. Приготовление гемолизатов...........................................64

2.3.2.2. Хроматографическое выделение гликогемоглобина на сорбенте, содержащем дигидроксиборильные группы.................................64

2.3.3. Определение концентрации катионов цинка.........................66

2.3.4. Исследование сахароснижающего действия комплекса инсулина с

хондроитинсульфатом..............................................................67

2.3.5. Определение содержания в пробах а г кис лого гликопротеина...68 Глава 3. Результаты и обсуждение..........................................69

3.1. Разработка метода количественного определения катионов цинка в плазме крови с применением дитизона.......................................69

3.2. Сравнение концентрации общего цинка в плазме крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом типа 1..............................70

3.3. Определение концентрации свободных катионов цинка в крови больных сахарным диабетом и здоровых доноров.........................73

3.4. Выделение хондроитинсульфата из трахей крупного рогатого скота.................................................................................79

3.5. Получение комплекса инсулина с хондроитинсульфатом и

исследование его сахароснижающего действия............................82

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................89

ВЫВОДЫ...........................................................................94

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................95

ПРИЛОЖЕНИЕ..................................................................118

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГП - а! -кислый гликопротеин; АЛП - Б - аполипротеин Б; АФП - сс-фетопротеин;

%Ггб - процентное содержание гликозилированной формы гемоглобина в

капиллярной крови;

ИРИ - иммунореактивный инсулин;

ИСБ — инсулин - связывающие белки;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ИФР - инсулинподобный фактор роста;

ЗФР - забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 7,2-7,4;

Р-ЛГ - (3-лактоглобулин;

(Х1-МГ- агмикроглобулин;

м-АФБК - мета- аминофенилбороновая кислота;

РСБ - ретинол-связывающий белок;

СГСГ - секс-гормон- связывающий глобулин;

ТЭСГ - тестостерон - эстроген -связывающий глобулин;

ТСГ - тироксин - связывающий глобулин;

ТСПА - тироксинсвязывающий преальбумин;

ХС - хондроитинсульфат;

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Известно, что в составе секреторных гранул клеток островков Лангерганса инсулин находится в комплексе с катионами цинка (Грачева и др., 1972). Кроме того, была доказана роль этого катиона во взаимодействии инсулина с транспортными белками крови (Гарипова и др., 2005, 2007), что свидетельствует о важности этих катионов для поддержания структуры и проявления биологической активности гормона, а также о необходимости присутствия физиологических концентраций солей цинка в препаратах для гормональной терапии сахарного диабета. Возможные отклонения концентрации катионов цинка в крови человека от нормы могут быть одной из причин снижения эффективности проявления биологической активности и доставки инсулина к чувствительным клеткам. Данные литературы о соответствии норме концентрации катионов цинка в крови больных сахарным диабетом противоречивы (McNair et al., 1981; Pai и Prasad, 1988, Greenwood et. al., 1997, Скальный и др., 2003, Мухина и др., 2005, King et. al., 2011). В связи с этим представляет интерес сравнение содержания этого катиона в крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом.

Обязательным компонентом внутреннего пространства

секреторных гранул и лизосом, наряду с двухвалентными катионами металлов, согласно современным представлениям, являются сульфатированные мукополисахариды (протеогликаны), подобные хондроитинсульфату (ХС), формирующие основу, на которой сорбируются заключенные в гранулах активные компоненты, такие как ферменты, гормоны и катионы металлов. Протеогликаны также

формируют основу межклеточного матрикса (Марри и др., 1993, Segal, 2005), в крови присутствуют транспортные гликопротеиды, такие как трансферин и а-фетопротеин, имеющие структурное сходство с мукополисахаридами, и связывающие наряду с катионами металлов гормоны, витамины, ферменты (Грачева, 1976, Марри, 1993, Гарипова, 2009). Таким образом, формирование комплекса гормонов, в том числе инсулина, с протеогликанами необходимо на всех стадиях существования гормона от синтеза и секреции до транспортировки и связывания с чувствительными клетками. Особенности протеогликанов, формирующих комплексы с секретируемыми соединениями - высокая гидрофильность, связанная с высоким содержанием углеводов, низкая иммуногенность, высокая плотность отрицательного заряда, антикоагулянтные свойства. Подобными свойствами обладает низкомолекулярная форма хондроитинсульфата (ХС), для которой доказано наличие антикоагулянтных и иммуносупрессорных свойств (Бычков и др., 1979, Bait etal., 1983, Марри и др., 1993), что делает перспективным использование комплекса инсулина с низкомолекулярной формой ХС в качестве лекарственной формы инсулина, близкой по свойствам природной транспортной форме гормона. Учитывая важность присутствия катионов цинка для реализации действия инсулина, мы предположили, что в составе подобной лекарственной формы гормона должна присутствовать соль цинка в физиологической концентрации. В связи с этим, цель данного исследования - выявить возможные отклонения от нормы в содержании катионов цинка в крови больных сахарным диабетом типа I, получить комплекс инсулина с низкомолекулярной формой хондроитинсульфата и исследовать особенности его гипогликемического действия.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи исследования:

1. Разработать вариант метода количественного определения катионов цинка в плазме крови с применением дитизона.

2. Сравнить концентрации общего цинка в плазме крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом типа I.

3. Провести сравнение концентрации несвязанных с белком катионов цинка в крови больных сахарным диабетом и здоровых доноров.

4. Разработать метод получения частично гидролизованного хондроитинсульфата из хрящей крупного рогатого скота.

5. Получить комплекс инсулина с хондроитинсульфатом.

6. Исследовать особенности сахароснижающего действия комплекса инсулина с хондроитинсульфатом по сравнению с действием свободного инсулина.

Научная новизна

Показано, что концентрация катионов цинка в крови больных сахарным диабетом типа I достоверно превышает этот показатель в крови здоровых доноров. Установлено, что это повышение обусловлено увеличением количества катионов цинка, связанных с белками крови больных сахарным диабетом, что согласуется с данными других авторов (Скальный A.B., 2001, Мухина и др., 2005). При этом концентрация свободных катионов цинка в крови больных сахарным диабетом достоверно снижается по сравнению с нормой. Полученные данные позволяют сделать предположение о том, что повышение связывания катионов цинка белками крови обусловлено изменением их состава, в

частности повышением концентрации в крови больных диабетом аг кислого гликопротеина.

Установлено, что в присутствии катионов цинка в растворе, инсулин формирует надмолекулярный комплекс с ХС, причем формирование комплекса тормозится при добавлении свободных аминокислот (гидролизата бычьего сывороточного альбумина). Это позволяет предположить, что формирование комплекса инсулина с белковыми фрагментами протеогликана происходит, также как в случае формирования гексамеров цинка, за счет взаимодействия катионов с гистидином и цистеином, включенными в состав инсулина и коровых белков хондроитинсульфата.

Показано, что при введении лабораторным животным инсулина с хондроитинсульфатом в присутствии катионов цинка гипогликемическое действие инсулина сохранялось более длительное время, чем при введении свободного инсулина. Вероятно, освобождение инсулина из этого комплекса происходит постепенно, в результате чего формируется эффект пролонгированного действия гормона. Обнаруженное явление заслуживает дальнейшего исследования и может быть использовано для получения новых лекарственных форм инсулина с пролонгированным действием.

Практическая значимость работы

Предложен вариант метода количественного определения катионов цинка в сыворотке крови с использованием цветной реакции с дитизоном (дифенилтиокарбазоном).

Разработан метод получения высокоочищенного частично гидролизованного хондроитинсульфата.

Разработаны принципы получения препаратов инсулина пролонгированного действия на основе низкомолекулярной формы хондроитинсульфата и солей цинка.

Показано, что связывание инсулина с протеогликаном тормозится в присутствии свободных аминокислот, что свидетельствует об участии в образовании комплекса аминокислотных остатков корового белка ХС и инсулина, формирующих координационные связи с катионом цинка. Это явление может быть использовано для получения препаративной формы инсулина, из которой инсулин освобождается в результате вытеснения из комплекса свободными аминокислотами при повышении их концентрации, происходящем после приема пищи. Таким образом может быть создан препарат, имитирующий выброс инсулина из Р-клеток в кровь после еды.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Доказано, что в крови больных сахарным диабетом типа I происходит достоверное снижение концентрации свободных катионов цинка, обусловленное повышенным связыванием катионов с белками плазмы крови.

2. Для формирования комплекса инсулина с хондроитинсульфатом необходимо присутствие катионов цинка.

3. Гипогликемическое действие инсулина в комплексе с низкомолекулярным хондроитинсульфатом и катионами цинка при введении лабораторным мышам продолжается более

длительное время по сравнению с использованием свободного инсулина.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (Саранск, 2008), XIII международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск.-2008), 12-ой международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008), Международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов» (Уфа, 2009, на XLIX), на XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология ( Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2011), IV Международной научно-практической конференции (Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011г.).

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 17 печатных работах, в том числе в четырех статьях в журналах, рекомендованных ВАК.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Транспорт и метаболизм инсулина. Транспортные формы инсулина, присутствующие в крови человека

Инсулин оказывает множественные эффекты на инсулинзависимые ткани (печень, мышцы, жировая ткань). Предполагается, что на почечную, нервную ткань и хрусталик он не оказывает непосредственного действия (Касаткина, 1996). Инсулин является анаболическим гормоном, усиливающим синтез гликогена, белков, нуклеиновых кислот и липидов. Связывание инсулина с клеточными рецепторами приводит к усилению транспорта глюкозы и аминокислот в клетку, подавлению глюконеогенеза, гликогенолиза, липолиза. Базальная концентрация инсулина, определенная иммунологически (ИРИ) составляет у здоровых людей 15-20 мкЕД/мл. После пероральной нагрузки глюкозой уровень гормона через час повышается в 5-10 раз по сравнению с исходным. Скорость секреции инсулина натощак составляет 0,5-1 ЕД/ч, а после приема пищи увеличивается до 2,5-5 ЕД/ч (Старкова, 1996; Колб, 1982).

Инсулин находится в крови в свободном (иммунореактивный инсулин, ИРИ) и связанном с белками состоянии (Rändle et.al., 1958). Большая часть поступившего в кровь инсулина метаболизируется в печени, причем за один пассаж в ней задерживается 40 - 60% гормона, поступающего из системы портальной вены. При парентеральном применении инсулина возникает дефицит инсулина в печеночной ткани (Ахметов и др, 2005). Деградация инсулина в печени происходит под влиянием глютатионтрансферазы и глютатионредуктазы, в почках - под

влиянием инсулиназы, в жировой ткани под влиянием гетерогенных

протеаз. Проинсулин и С-пептид подвергаются деградации в основном в печени, но значительно медленнее (Старкова, 1996).

Деградация связанного с рецептором гормона и индуцированное инсулином снижение концентрации рецепторов являются

взаимосвязанными процессами. Существует состояние динамического равновесия между скоростью внедрения инсулинорецепторных комплексов, их деградацией и рециркуляцией, повторным включением в структуру мембраны, а также скоростью их синтеза (Старкова, 1996).

По мнению Л.К. Старосельцевой, поступивший в кровь инсулин неоднороден: часть его остается в свободном виде (иммунореактивный инсулин), другая часть формирует комплексы с белками сыворотки крови (связанный инсулин) (Старосельцева, 1983). По данным авторов, существует две формы связанного инсулина, одна из которых образует комплекс с трансферином, другая с гликопротеином крови с электрофоретической подвижностью ос-глобулинов - орозомукоидом ( аг кислым гликопротеином). Старосельцева Л.К. высказывает предположение о том, что в образовании этих форм принимают участие сиаловые кислоты трансферина и орозомукоида, взаимодействующие с молекулами инсулина. Биологическое значение образования связанных форм инсулина, по мнению Л.К. Старосельцевой, заключается в том, что инсулин в связанном виде доставляется к жировой ткани, не реагируя с мышечной тканью. Кроме того, связанный инсулин является резервом свободного инсулина и формой его хранения в циркуляции. Процессы связывания регулируют уровень активного инсулина (Старосельцева, 1972). Переход из связанной формы инсулина в свободную происходит за несколько минут, тогда как секреция вновь синтезированного инсулина, включая время превращения проинсулина в инсулин, требует 30 минут. В

тех случаях, когда требуется немедленное изменение концентрации свободного инсулина, его концентрация увеличивается за счет освобождения из комплекса с белками сыворотки крови. Наряду со связанными формами инсулина в сыворотке крови обнаружена форма инсулина, которая появляется при необходимости быстрого увеличения активности инсулина (A-форма). Эта форма гормона активна по отношению к мышечной, но не жировой ткани. При электрофорезе А-форма локализуется в области Р - глобулинов, и отличается от свободного и связанного инсулина по молекулярному весу, электрофоретической подвижности, иммунологическим и физико-химическим свойствам (Старосельцева, 1981). Установлено, что (3-субъединица инсулина транспортируется в крови в комплексе с сывороточным альбумином, в то время как а-субъединица не формирует комплексов с белками сыворотки (Eksinck et. al., 1964). Таким образом, вероятно, нативный инсулин транспортируется в крови за счет формирования комплекса Р- субъединицы с белками сыворотки. Описано присутствие в сыворотке крови человека двух белков, связыв�