Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гипогликемии на состояние энергетического и азотистого обмена в печени крыс с экспериментальным сахарным диабетом

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние гипогликемии на состояние энергетического и азотистого обмена в печени крыс с экспериментальным сахарным диабетом"

005015595

На правах пукописи

м

МЕДВЕДЕВА НАТАЛИЯ БОРИСОВНА

Влияние гипогликемии на состояние энергетического и азотистого обмена в печени крыс с экспериментальным сахарным диабетом

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 У АР 2012

Ярославль 2012

005015595

Работа выполнена на кафедре биологической и общей химии ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Потапов Павел Петрович Официальные оппоненты

Федорова Марина Зотовна - доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой биотехнологии, морфологии и физиологии живых организмов ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Тихомирова Ирина Александровна — доктор биологических наук, доцент кафедры анатомии и физиологии человека и животных ФГБОУ ВПО «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского»

Ведущая организации ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия»

Защита состоится «22» марта 2012 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.307.02 при ФГБОУ ВПО "Ярославский государственный педагогический университет им. К. Д. Ушинского" (г. Ярославль, Которосльная наб., д. 46в).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО "Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского" (150000, г. Ярославль, ул. Респуб:

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Уровень глюкозы в крови является одним из наиболее строго регулируемых физиологических показателей (Ciyer, 2004, 2005; Briscoe, Davis, 2006; Griffin, Ojeda, 2008). Гипогликемия приводит к нарушению функций центральной и периферической нервной системы (Балаболкин, 2000; Дедов, Шестакова, 2003; Сгуег, 2007; Marty et aL, 2007; Kumar, 2007; Cherrmgton, 2008; Телушкин и соавт., 2008 и др.) и изменяет функциональную способность миокарда (Robinson et al., 2003; Огельмах, 2004; Lee et al., 2004; Koivikko et al., 2005).

Стратегическую позицию в обеспечении метаболического гомеосгазиса организма занимает печень. Именно печень обеспечивает поддержание уровня глюкозы в крови путем активации гормонзависимых процессов - мобилизации гликогена и глкжонеогенеза. Роль печени в регуляции гликемии' при различных физиологических и патологических состояниях, сопровождающихся изменением секреции гормонов, служила предметом многочисленных исследований (Cherrington, 1999, 2008). Инсулинодефицит приводит к развитию так называемых неалкогольных расстройств метаболизма в печени (West et al., 2006). Нарушения обмена, связанные с этим состоянием, могут приводить к уменьшению функциональных возможностей органа в отношении регуляции гликемии. С другой стороны, гипогликемия вызывает увеличение уровня контриисулярных гормонов (глюкахона, катехоламинов, адренокортикотропного гормона, соматотропного гормона, глюкокортикоидов, вазопрессина), стимулирующих катаболизм аминокислот и глюконеогенез в печени (Amiel, 1996; Inouye, 2002), и способна приводить к активации окислительного стресса и повреждению клеток (Телушкин, Ноздрачев, 1999; Телушкин и соавт., 2008).

Причиной развития гапогликемии в реальных условиях часто является увеличение уровня инсулина в крови, связанное с передозировкой гормона у пациентов с сахарным диабетом. Таким образом, гипогликемия возникает, прежде всего, в условиях предшествующего инсулинодефицита и гипергликемии (Генес, 1970; Балаболкин, 2000; Дедов, Шестакова, 2003; Сгуег, 2003, 2004; Bolli, 2003; Hirsch, 2005 и др.). Дефицит эффектов инсулина приводит к изменению доступности основных субстратов пластического и энергетического обмена и активности внутриклеточных ферментов (O'Brien et al., 2001; Bell, 2003; Griffin, Ojeda, 2008). Связанная с гипергликемией активация окислительного стресса вызывает повреждение многих ферментных систем, в частности углеводного и азотистого метаболизма (Brownlee, 2001; Du et al., 2003).

Повышение метаболической' нагрузки на печень при гипогликемии может оказывать неблагоприятное воздействие на обмен в печени и в целом организме, особенно если это накладываются на уже имеющиеся нарушения, вызванные предшествующим инсулинодефицитом и гипергликемией (Балаболкин, 2000; Дедов, Шестакова, 2003; West et al., 2006).

Изменения метаболизма при тяжелой инсулиновой гипогликемии исследованы недостаточно. Практически не рассматривались особенности метаболического ответа печени на инсулиновую гипогликемию в условиях предшествующего дефицита инсулина. Это затрудняет разработку рациональных методов терапии такого тяжелого состояния, как гипогликемическая кома, особенно гипогликемической комы у пациентов с сахарным диабетом. Поэтому комплексное изучение субстратного обеспечения основных метаболических процессов и активности ферментов энергетического и азотистого обмена в печени при инсулиновой гипогликемии, развивающейся в условиях предшествующего инсулинодефицита, представляет существенный интерес.

Различные экспериментальные модели в течение многих лет успешно используются для изучения метаболизма при дефиците эффектов инсулина. Такие исследования позволяют раскрыть многие механизмы патогенеза сахарного диабета и его осложнений (Баранов и соавт., 1983; Куликов, 1994; Szkudelski, 2001; Walde et al., 2002; Волчегорский и соавт., 2008; 2009).

Цель исследования

Выявить и оценить изменения энергетического и азотистого метаболизма в печени при инсулиновой гипогликемии, развивающейся в условиях предшествующего инсулинодефицита.

Задачи исследования

1. Изучить изменения содержания метаболитов энергетического и азотистого обмена в крови и печени при инсулиновой гипогликемии у первоначально здоровых животных и крыс с экспериментальным сахарным диабетом.

2. Исследовать интенсивность гликогенолиза и гликолиза, активность ферментов цикла трикарбоновых кислот и ферментов азотистого обмена в печени при гипогликемии у первоначально здоровых животных и животных с экспериментальным сахарным диабетом.

3. Исследовать указанные метаболические параметры в восстановительном периоде после купирования гипогликемической комы глюкозой у первоначально здоровых животных и крыс с предшествующим инсулинодефицитом.

Научная новизна

Впервые получены комплексные данные об изменениях показателей углеводного и азотистого метаболизма в печени при инсулиновой гипогликемии у животных с предшествующим инсулинодефицигом.

Состояние 11 шогликсми ческой комы у животных с инсулинодефицигом развивается при сохранении высокого уровня гликогена и в условиях снижения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и повышения активности сукцинатдегидрогеназы и не приводит к изменениям активности никотинамидадениндинуклеодид-зависимой изоцитратдегидрогеназы в печени.

Показано, что инсулиновая гипогликемия у животных с предшествующим инсулинодефицитом развивается в условиях увеличения активности ферментов катаболизма аминокислот в печени (адалин- и аспартат-амшютрансфераз, глутаминазы, глутаматдегидрогеназы) и приводит к еще большему увеличению катаболизма аминокислот и продукции мочевины в печени, а также приводят к повышению активности аденозинмонофосфатдезаминазы в печени и уровня мочевой кислоты в крови, которые наблюдаются и через 48 часов после купирования комы глюкозой.

Инсулиновая гипогликемия, развивающаяся в условиях предшествующего инсулинодефицита, потенцирует изменения азотистого метаболизма при этом состоянии и способна вносить вклад в биохимическую симптоматику сахарного диабета.

Практическая значимость

Оценена роль изменений уровня метаболитов углеводного, липидного и азотистого обмена в крови и активности ферментов окислительного и азотистого метаболизма в печени в обеспечении энергетического гомеостазиса при инсулиновой гипогликемии. Полученные данные позволяют раскрыть существенные особенности патогенеза нарушений метаболизма в печени и определтъ факторы, которые снижают функциональные возможности органа при гипогликемии, развивающейся в условиях предшествующего дефицита инсулина.

Результаты исследования являются основой для разработки патогенетически обоснованных мероприятий, направленных на коррекцию неблагоприятных метаболических изменений при гипогликемии у пациентов с сахарным диабетом.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При инсулиновой гипогликемии у первоначально здоровых животных развиваются метаболические эффекты, преимущественно связанные с анаболическим действием инсулина.

2. Гипогликемия у животных с инсулинодефицитом развивается в условиях увеличения катаболизма аминокислот в печени и способна потенцировать изменения азотистого метаболизма, характерные для инсулиновой недостаточности, приводит к повышению распада пуриновых нуклеотидов в печени и увеличению уровня мочевой кислоты в крови. Анаболические эффекты инсулина выражены слабо, преобладают эффекты гипогликемии и активации контринсулярного аппарата.

3. На 2-е сутки после купирования тяжелой инсулиновой гипогликемией глюкозой у первоначально здоровых животных происходит нормализация исследованных показателей и наблюдаются эффекты, связанные с анаболическим действием инсулина, а у крыс с инсулинодефицитом большинство метаболических показателей возвращаются к исходному (инсулинодефицш) состоянию, и сохраняются условия для активации процессов свободнорадикального окисления.

Апробация работы

Основные результаты исследования доложены и обсуждены на Всероссийской конференции "Механизмы синаптической передачи", Москва, 2004; конференции 'Тегиональная медицинская наука: тенденции и перспективы развития. Аспирантские чтения - 2004", Самара, 2004; IV Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине, Тула, 2005; VI конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке" (Томск, 2005); конференции "Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины", Астрахань-Волгоград-Москва, 2006; 2-ом Международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения", СПб., 2007; Российской конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии", Челябинск, 2009; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Актуальные вопросы медицинской науки", Ярославль, 2011.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Связь задач исследования с проблемным планом биологических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Ярославской государственной медицинской академии (номер государственной регистрации 0120.0600923).

Объем и структура диссертации

Работа представлена на 151 странице печатного текста, содержит 40 таблиц, 14 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка литературы.

Библиографический указатель включает 226 источников литературы, из них 168 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнепы с использованием 379 белых беспородных крыс-самцов массой 220-260 г.

Экспериментальные животные были разделены на 7 групп. 1-ая группа -крысы с 7-суточным диабетом; 2-ая - крысы с 15-суточным диабетом; 3-я -исходно здоровые животные, у которых вызывали состояние гипогликемической комы; 4-ая - животные с 7-суточным диабетом в состоянии гипогликемической комы; 5-ая - животные, у которых вызывали состояние гипогликемической комы на фоне 15-суточного диабета; 6-ая - первоначально здоровые крысы, обследованные через 30 и 60 минут и через 48 часов после купирования гипогликемической комы; 7-ая - животные с 15-суточным диабетом, обследованные через 30 и 60 минут и через 48 часов после купирования гипогликемической комы. Контрольные животные были обследованы одновременно с подопытными.

Экспериментальный аллоксановый сахарный диабет (инсулинодефицит) вызывали внутрибрюшшшым введением аллоксана в дозе 135 мг/кг массы животного. Аллоксан вводили после 12-14-часового лишения крыс пищи. Развитие сахарного диабета сопровождалось полиурией, глюкозурией и снижением массы тела.

Гипогликемическую кому вызывали внутримышечным введением инсулина в дозе 40 ЕД на 1 кг массы тела. Крысы впадали в кому через несколько часов после инъекции инсулина. Наступление комы фиксировали на основании неврологических симптомов (утрата постуральных рефлексов и болевой чувствительности при сохранении корнеальных рефлексов). Эти признаки четко корреллируют с данными электроэнцефалографии и уровнем глюкозы в крови, притекающей к мозгу ^агсШ е! а1., 1978; ВийешогЛ е! а1., 1982). У животных 6-ой и 7-ой групп купирование гипогликемической комы производили внутрижелудочным введением 3 мл 40% раствора глюкозы.

В ходе работы проведено изучение динамики ряда биохимических показателей после инъекции инсулина вплоть до развития гипогликемической комы у крыс 3-ей и 5-ой группы. В этом случае животных забивали через каждые 15 минут. Полученные динамические ряды сглаживали методом "скользящих средних" по 5 точкам (Гублер, 1978; Катинас, Быков, 1976; Павлов и соавт., 1986; Потапов, 1989). В остальных случаях статистическую обработку проводили с использованием 1-критерия Стьюдента.

Крыс забивали декапитацией под легким эфирным наркозом. Материалом для исследования служили сыворотка крови и печень животных.

В сыворотке крови определяли содержание глюкозы, кетоновых тел, свободных жирных кислот, свободных аминокислот (аминоазот), а также конечных продуктов азотистого обмена: мочевины и мочевой кислоты (Тодоров, 1961; Покровский, 1969; Прохорова, 1982; Меньшиков, 1987; Никушкин и соавт., 1989).

В печени определяли концентрацию гликогена (Прохорова, 1982) и интенсивность дихотомического распада углеводов с использованием в качестве субстратов глюкозы, глюкозо-6-фосфата и гликогена (Панин и соавт., 1982); активность окислительных ферментов: лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.27), НАД-изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41) и сукщшатдегидрогеназы (СДГ, КФ 1.3.99.1); НАДФ-зависимых дегидрогеназ: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49) и глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2); активность ферментов азотистого обмена: аланинаминотрансферазы (КФ 2.6.1.2), аспартатаминотрансферазы (КФ 2.6.1.1), тирозинаминотрансферазы (КФ 2.6.1.5), глутаматдегидрогеназы (КФ 1.4.1.3), глутаминазы (КФ 3.5.1.2) и АМФ-дезаминазы (КФ 3.5.4.6) (Левин, 1969; Кравченкова, 1977; Прохорова, 1982; Телунпшн и соавт., 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Введение высокой дозы инсулина первоначально здоровым животным приводило к развитию выраженной гипогликемии (уровень глюкозы в крови 1.02.0 ммоль/л, рис.1), гиполактатемии, снижению уровня СЖК и кетоновых тел в крови (табл. 1). Это обычные инсулиновые эффекты - инсулин увеличивает потребление глюкозы мышечной и жировой тканями и угнетает липолиз в жировой ткани и синтез кетоновых тел в печени (Timothy, 1996; Дедов, Шестакова, 2003; Holm, 2003; Griffin, Ojeda, 2008).

Уменьшите концентрации мочевины и свободных аминокислот в крови у первоначально здоровых животных при инсулиновой гипогликемии (табл. 2) является, по-видимому, результатом действия инсулина - гормон стимулирует потребление аминокислот клетками и протеиносинтез во многих тканях, в том числе и в печени (Charlton, Nair, 1998). Снижение катаболизма аминокислот приводит к редукции синтеза мочевины. Уменьшение концентрации мочевой кислоты в крови (табл. 2) также можно отнести к анаболическим эффектам

Таблица 1. Уровень энергетических субстратов в крови и печени экспериментальных животных (М±т)

Показатель Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5

Глюкоза, ммоль/л К 6.00±0.16 5.28±0.5 5.28±0.15 6.00±0.16 5.28±0.15

О 10.20±0.94*" 10.10±1.33" 1.78±0.13'" 2.03±0.15*" 2.10±0.17"*

Лахтат, ммоль/л К 2.10±0.13 2.14±0.11 2.14±0.11 2.10±0.13 2ЛШ.11

О 2.15±0.25 2.10±0.18 1.30±0.10*" 1.15±0.11*" 1.90±0.16

СЖК, мкмоль/л к 420±28 442±27 442±27 420±28 442±27

о 466±54 205±18*" 285±31*" 221±23"' 266±17*"

Кетонов. тела, мг % к 20.9±2.4 35.4±2.3 35.4±2.3 38.5±3.3 35.4±2.3

о 37.0±9.8 12.7±3.6*" 19.4±2.2"* 17.9±2.8*" 17.3±2.8*"

Гликоген печени мг/г ткани к 22.0±1.2 24.5±2.7 24.5±2.7 22.0±1.2 24.5±2.7

о 120±15*** 99.0±14.0*** 3.4±0.3*" 17.1±1.6* 15.0±1.4"

Примечание. Здесь и в таблицах 2-7 статистически достоверные по сравнению с

контролем изменения обозначены: * - Р < 0.05, ** - Р < 0.01, *** - Р < 0.001; в каждой группе 6-8 животных.

инсулина, т.е. это связано с увеличением синтеза пуриновых нуклеотидов и торможением их распада (Borza et al., 2005).

Наиболее вероятной причиной снижения интенсивности гликогенолиза (табл. 5) в печени при инсулиновой гипогликемии у первоначально здоровых животных является действие инсулина, поскольку гормон приводит к уменьшению активности гликогенфосфорилазы в печени (Adkins et al., 2003). Вместе с тем содержание гликогена в печени исходно здоровых крыс, находящихся в состоянии гипогликемической комы, значительно снижено (табл.1), т.е. у этих животных инсулин не препятствует мобилизации гликогена печени при гипогликемии. Существенное повышение активность Г6Ф-ДГ в печени крыс при инсулиновой гипогликемии и через 48 часов после купирования гипогликемической комы глюкозой (табл. 5,7) может быть связано с эффектами инсулина, который стимулирует экспрессию гена этого фермента в печени (Wagte et al., 1998).

Умеренное, но статистически достоверное уменьшение активности АлАТ и АсАТ и увеличение активности TAT у животных 3-ей группы (табл, 5) также

следует отнести к эффектам инсулина (Уогагоуа й а1., 2002; 11оез1ег, 2001; Моггектё е1 а1., 2003; иеБУег^е с1 а1., 2006). Колебаний активности других исследованных ферментов азотистого метаболизма, а также ЛДГ и СДГ не выявлено. Таким образом, изменения показателей углеводного и азотистого обмена при инсулиновой гипогликемии у исходно здоровых животных в значительной степени связаны с действием собственно инсулина

У животных с развившимся сахарным (аллоксановым) диабетом были обнаружены типичные для дефицита инсулина изменения - гипергликемия, гиперкетонемия, кетонурия, увеличение уровня мочевины в крови (табл. 1,2). Снижение концентрации СЖК и кетоновых тел, обнаруженное у животных на 15-е сутки после введения аллоксана, обусловлено, по-видимому, уменьшением запасов триацилглицеролов в жировой ткани (Баранов и соавт., 1983).

Развитие инсулгогодефицита сопровождалось значительным повышением содержания гликогена в печени экспериментальных животных, вместе с тем изменений интенсивности гликогенолиза не наблюдалось (табл. 1,5). Такие результаты оказались до некоторой степени неожиданными, поскольку увеличение мобилизации гликогена печени рассматривается как одна из причин развития гипергликемии при сахарном диабете (Балаболкин, 2000). Повышение интенсивности гликолиза при внесении в среду инкубации глюкозы и глюкозо-6-фосфата (табл. 5), отражающее увеличение активности гексокиназы и фосфофруктокиназы, обусловлено, по-видимому, развитием гипергликемии у этих животных. Инсулин увеличивает активность Г6Ф-ДГ в печени и выявленное в работе снижение активности фермента у животных с экспериментальным диабетом обусловлено дефицитом эффектов инсулина.

Развитие инсулинодефицита сопровождалось повышением активности АлАТ, АсАТ и ТАТ, глутаматдегидрогеназы и глутаминазы в печени экспериментальных животных (табл. 6), что в совокупности с ростом уровня мочевины в крови свидетельствует о значительном катаболизме аминокислот. Увеличение распада аминокислот в печени характерно для инсулинодефицита.

Изменения уровня субстратов и активности ферментов энергетического и азотистого обмена типичные для дефицита эффектов инсулина наблюдались в большей степени на 15-е сутки после инъекции аллоксана.

а

о I I I I I I 1-1-1 I I-1 I --1-1-1—1

К 60 120 180 мин

Рис. 1. Изменение концентрации глюкозы в крови первоначально здоровых крыс в течение времени после введения инсулина. По оси абсцисс - промежутки времени (mar 15 мин), по оси ординат - концентрация глюкозы в ммоль/л. "К" - уровень глюкозы в крови контрольных животных.

Рис. 2. Изменение концентрации глюкозы в крови диабетических крыс в течение времени после введения инсулина. По оси абсцисс - промежутки времени (шаг 15 мин), по оси ординат - концентрация глюкозы в ммоль/л. "К" - уровень глюкозы в крови контрольных животных.

Таблица 2. Уровень субстратов азотистого обмена в крови экспериментальных животных (М±ш)

Показатель Группа 1 Группа2 Группа 3 Группа 4 Группа

Аминоазот, К 5.6±0.3 6.1±0.4 6.1±0.4 5.6±0.3 6.1±0.4

мг% О 5.9±0.2 6.7±0.3 3.0±0.l"* 4.1 ±0.4* 4.5±0.3"

Мочевина, К 8.9 ±0.6 6.8±0.3 6.8±0.3 8.9±0.6 6.8±0.3

ммоль/л о 9.8±0.9 13.6±3.2* 2.3±0.2*" 9.6±1.1 22.0±3.8"

Мочевая кислота, мкмоль/л к 231±7 214±7 227±11 231±7 213±7

о 195±10** 229±8 159±13" 178±1б" 270±1б"

Таблица 3. Показатели энергетического обмена в крови и печени крыс в восстановительном периоде после купирования гипогликемической комы (М±т)

Показатель Группа 6 Группа 7

30 мин 60 мин 48 часов 30 мин 60 мин 48 часов

Глюкоза, ммоль/л К 5.49±0.17 5.49±0.17 5.49±0.17 5.54±0.21 5.54±0.21 5.54±0.21

О 8.57±2.43 3.65±0.26" 5.51±0.27 9.0041.0" 13.94±1.8" 7.84±0.83"

Лакгат, моль/л К 2.00±0.14 2.00±0.14 2.00±0.14 2.20±0.15 2.20±0.15 2.20±0.15

о 2.16±0.17 2.31±0.19 2.20±0.17 2.35±0.20 2.40±0.19 2.30±0.22

СЖК, мкмоль/л к 471±19 47Ы9 471±19 473±26 473±2б 473±26

О 350±35" 319±29"' 14б±9"' 286±ЗГ" 216±34*" ~ 239Ш'"

Кетон. тела, мг/л к 36.2±1.8 36.2±1.8 36.2±1.8 37.8±1.9 37.8±1.9 37.8±1.9

о 15.Ш.5'" 17.3±2.8"" 12.241.9'" Н.2±2.9'" tS.8±3.3 "' 17.3±3.1*'

Гликоген печени, мг/г ткани к 27.8±5.8 27.8±5.8 20.6±1.4 16.0*2.8 1б.0±2.8 18.3±3.2

О 10.0-Ы.0" 42.7±6.5 41.5±2.8"" 16.8±4.0 27.3±2.8" 169±32"'

о -.-.-,-,-.——1-——,----.-.-.-,-.-,----,-.---

К 60 120 180 240 мин

Рис. 3. Изменение концентрации мочевины в крови первоначально здоровых крыс в течение времени после введения инсулина. По оси абсцисс - промежутки времени (шаг 15 мин), по оси ординат - концентрация мочевины в ммоль/л. "К" - уровень мочевины в крови контрольных животных.

45

40

35

30

2!

га

19

ю

К 60 120 180 240 мин

Рис. 4. Изменение концентрации мочевины в крови диабетических крыс в течение времени после введения инсулина. По оси абсцисс - промежутки времени (шаг 15 мин), по оси ординат - концентрация мочевины в ммоль/л. "К" - уровень мочевины в крови контрольных животных.

Введение высокой дозы инсулина животным с экспериментальным сахарным диабетом вызывало развитие гипогликемической комы при достижении уровня глюкозы в крови 1.0-2.0 ммоль/л и сопровождалось снижением количества лактата в крови (табл.1, рис.2). Содержание СЖК у крыс этой группы было также ниже уровня контроля (интактные животные), однако превышало величину показателя в исходном состоянии (крысы с развившимся инсулинодефицитом). Другими словами, инсулиновая гипогликемия в данном случае приводила к увеличению уровня СЖК в крови. Вероятными причинами таких изменений являются снижение антилиполитического действия инсулина и больший эффект контринсулярных гормонов при гипогликемии - все контринсулярные гормоны стимулируют липолиз в жировой ткани (Timothy, 1996; Matthaei et al., 2000; Fruhbeck et al., 2001; Holm, 2003).

Таблица 4. Показатели азотистого обмена в крови крыс в восстановительном периоде после купирования гипогликемической комы (М ± т)

Показатель Группа 6 Группа 7

30 мин 60 мин 48 часов 30 мин 60 мин 48 часов

Аминоазот, мг% К 6.7±0.2 6.7±0.2 5.7±0.4 6.1±0.2 6.1±0.2 4.4±0.1

О 5.3±0.3" 5.2±0.4" 5.2±0.5 4.3±0.3"' 3.5±0.2"" 5.0±0.2"

Мочевина, моль/л к 4.8±0.4 4.8±0.4 4.8±0.4 6.5±0.3 б.5±0.3 6.5±0.3

О 6.3±0.3" 6.1±0.6 2.9±0.3"' 12.9-U.4"" 15.8±1.б"' 14.4±2.4"

Мочевая кислота, мкмоль/л о 214±7 214±7 214±7 207±13 207±13 207±13

к 183±15 161±17" 245±9' 238±41 147±12" 220±42

Тяжелая гипогликемия у животных с инсулинодефицитом, как и у первоначально здоровых животных, приводила к снижению уровня гликогена в печени (табл. 1). Однако количество полисахарида в печени диабетических крыс на момент развития гипогликемической комы значительно (в 5 раз) превышало величину показателя у исходно здоровых животных в состоянии комы. Таким образом, гипогликемия, приводящая к развитию гипогликемической комы, у крыс с сахарным диабетом возникает при сохранении относительно высокого уровня гликогена в печени. Вместе с тем у этих животных существенно увеличивалась скорость накопления лакгата при использовании в качестве субстрата гликогена (табл. 5). Обнаруженные изменения могут быть связаны с сохранением ингибирующего действия инсулина на активность глюкозо-6-фосфатазы у

животных с ш¡сули11одефицитом и отражать замыкание холостого, футильного цикла: гликоген —► глюкозо-6-фосфат —► гликоген (Collier, Scott, 2004; Azzout-Marniche et al. 2007).

Таблица 5. Интенсивность дихотомического распада и активность окислительных ферментов в печени экспериментальных животных (М ± т)

Показатель Группа 1 Группа2 Группа 3 Группа 4 Группа 5

Дихотом. распад глюкозы к 12.6±0.6 12.4±0.5 12.4±0.5 12.6±0.6 12.4±0.5

О 12.5±1.2 15.6±1.0" 12.3±1.1 12.6±1.3 15.8±0.7*"

Дихотом. распад гликогена к 18.3±0.8 19.1±0.6 19. ¡±0.6 18.3±0.8 19.Ш.6

О 19.5±0.7 20.0±0.9 11.6*1.1*" 18.1±2.2 24.9±1.7"

Дихотом. распад ГбФ-та к 25.4±1.2 27.4±1.1 27.4±1.1 25.4±1.2 27.4±1.1

О 26.0±1.9 34.4±1.9" 23.7±1.1* 25.6±1.7 35.7±2.5"

ЛДГ к 589±22 611±26 611±2б 589±22 61 Шб

О 732±37" 601±54 582±50 585±24 392±62"

Г6Ф-ДГ к 12.1±1.1 10.1 ±0.4 10.1±0.4 12.Ш.1 10.1±0.4

о Н.3±0.7 4.3±0.2*" 21.8±1.2*" 13.2±1.0 6.2±0.3""

ГР к 46.0±0.8 47.1±0.8 47.1±0.8 46.0±0.8 47.1±0.8

О 49.2±1.0* 46.9±1.8 50.5±0.7* 52.4±1.3*" 45.7±1.1

СДГ к 1.47±0.03 1.55±0.05 1.55±0.05 1.47±0.03 1.55±0.05

о 1.73±0.07" 1.58±0.05 1.51±0.08 1.63±0.06* 1.94±0.07*"

Примечание. Здесь и в таблице 7: Скорость дихотомического распада глюкозы, гликогена и Г6Ф, активности ЛДГ, Г6Ф-ДГ и ГР выражены в нмоль • мин • мг белка активность СДГ - в мкмоль ■ мин 1 • г ткани

У животных с развившимся инсулинодефицитом в состоянии гипогликемической комы и через 48 часов после купирования ее глюкозой активность Г6Ф-ДГ в печени увеличивалась по сравнению с исходным состоянием (крысы на 15-е сутки после введения аллоксана). Однако показатель оставался

Таблица 6. Активность ферментов азотистого обмена в печени экспериментальных животных (М ± т)

Показатель Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5

АлАТ К 23.7±1.2 24.3±0.6 24.3±0.6 23.7±1.2 24.3±0.6

О 31.8±0.6*" 28.5±0.6*** 22.5±0.6* 31.2±1.7*' 30.5±1.5*"

АсАТ К 16.3±0.3 15.7±0.4 15.7±0.4 16.3±0.3 15.7±0.4

о 21.8±0.3"* 18.7±0.6*" 14.240.3* 18.9±0.9" 21.ШЛ'"

TAT к 164±2 171±3 171±3 164±2 пш

о 175±2" 182±3* 257±9*" 1б8±5 пш

ГДГ к 0.56±0.01 0.61±0.02 0.61±0.02 0.56±0.01 0.61±0.02

о 0.64±0.02** 0.80±0.05" 0.58±0.03 0.55±0.01 0.66±0.02

АМФ-Д к - 92±7 92±7 - 92±7

о - 79±8 83±14 161±15*"

ГЛТ к - 415±20 415±20 - 415±20

о - 643±53'" 459±13 - 673±54*"

Примечание. Здесь и в таблице 7 активности АлАТ, АсАТ и ГДГ выражены в

мкмоль • мин• г тканиТАТ, АМФ-Д и ГЛТ - в нмоль • мин• г ткани.

пониженньм относительно уровня контроля (интактные животные), т.е. анаболические эффекты инсулина у животных с предшествующим инсулинодефицитом в полной мере не проявляются. Таким образом, активность фермента, регулирующего скорость пентозофосфатного пути и продукцию НАДФН2 в печени у животных с сахарным диабетом во всех условиях настоящего эксперимента оставалась сниженной. Такие изменения следует считать явно неблагоприятными, поскольку уменьшение производства НАДФН2 способно снижать резистентность гепатоцитов к окислительному повреждению (West, 2000).

С активацией окислительного стресса может быть связано и обнаруженное в настоящем исследовании увеличение активности СДГ в состоянии гипогликемической комы у крыс с развившимся инсулинодефицитом (табл. 5). Инсулин способен увеличивать активность СДГ и связанную с этим и продукцию перекиси водорода в митохондриях печени (Pomytkin, Kolesova, 2002; 2003; Zoccarato et al., 2004; Grivennikova, Vinogradov, 2006). Следует отметить, что

увеличения активности СДГ у исходно здоровых животных при инсулиновой гипогликемии не наблюдалось.

Таблица 7. Активность ферментов энергетического и азотистого обмена в печени крыс через 48 часов после купирования гипогликемической комы (М ± т)

Показатель Группа 6 Группа 7

лдг К 583±27 583±27

о 644±29 615±34

Г6Ф-ДГ к 10.0±0.4 10.0±0.4

О 13.5±0.8" 5.7±0.4 "

ГР к 45.3±1.1 45.3±1.1

о 47.1±1.5 45.9±1.2

СДГ к 1.51±0.06 1.51±0.06

о 1.38±0.21 1.48±0.07

АлАТ к 24.6±0.6 24.6±0.6

о 23.1±0.6 32.4±1.7'"

ЛсЛТ к 16.6±0.6 16.6±0.6

О 18.1±0.6 21.3±1.2 "

ТАТ к 167.2±2 167±2

О 134±1*" 168±6

гдг к 0.55±0.02 0.55±0.02

О 0.50±0.03 0.77±0.04"'

АМФ-Д к 104±9 104±9

О 112±15 134±16

ГЛТ к 427±24 427±24

О 205±29"" 691±59"

Введение высокой дозы инсулина крысам с развившимся инсулинодефицитом, в отличие от первоначально здоровых животных, не сопровождалось уменьшением содержания мочевины в крови, напротив, показатель имел явную тенденцию к увеличению по отношению к уровню животных с 15-ти суточным диабетом (рис.3,4, табл. 2). Выявленные изменения, по-видимому, отражают активацию глюконеогенеза из аминокислот в печени диабетических животных в исходном состоянии и при инсулиновой гипогликемии. Иными словами, инсулин не препятствует катаболизму аминокислот и глюкопеогенезу в печени крыс с

предшествующим инсулинодефицитом. Свидетельством этого является также и поддержание относительно высокого количества гликогена в печени крыс с диабетом в состоянии гипогликемической комы (табл. 1). Решающее значение имеют, по-видимому, гипогликемия и связанная с нею активация контринсулярного аппарата. Известно, что все контринсулярные гормоны стимулируют катаболизм аминокислот и продукцию мочевины в печени (Battezzati et al., 2000; Krishna et al„ 2000; Norrelund et al„ 2003).

У крыс с развившимся инсулинодефицитом после введения высокой дозы инсулина (5-ая группа) активности АлАТ, АсАТ и глутаминазы оставались повышенными, и наблюдалось значительное увеличение активности АМФ-Д (табл. 6). Такие изменения активности ферментов азотистого обмена в печени вместе со значительным ростом уровней мочевины и мочевой кислоты в сыворотке крови (табл. 2) свидетельствуют об увеличении катаболизма аминокислот и пуриновых нуклеотидов у крыс с сахарным диабетом при инсулиновой гипогликемии. Увеличение активности АМФ-Д тем более интересно, что у крыс с инсулинодефицитом величина этого показателя не изменялась, увеличение наблюдалось только в состоянии гипогликемической комы у животных с экспериментальным диабетом и сохранялось через 48 часов после купирования комы (табл. 7).

Катализируемая АМФ-Д реакция является лимитирующим этапом катаболизма адениловых нуклеотидов, поскольку не весь инозинмонофосфат регенерирует в цикле пуриновых нуклеотидов в АМФ (Schultz, Lowenstein, 1976; Borza et al., 2003). Катаболизм инозинмонофосфата и последующее окисление гипоксантина и ксантина в ксантиноксидазной реакции до мочевой кислоты сопровождаются образованием супероксиданионрадикала, инициирующего процессы перекисного окисления (Desco et al., 2002). Окисление SH-групп остатков цистеина в молекуле фермента, в свою очередь, увеличивает активность АМФ-Д (Tavazzi et al., 2001). Таким образом, повышение активности АМФ-Д может быть и одной из причин и, одновременно, следствием активации окислительного стресса у крыс с инсулинодефицитом при гипогликемии.

Результатом активации АМФ-Д и катаболизма пуриновых азотистых оснований является увеличение продукции мочевой кислоты. Содержание ее в сыворотке крови крыс с развившимся инсулинодефицитом в условиях тяжелой гипогликемии возрастало и оставалось повышенным через 48 часов после купирования комы глюкозой (табл. 7). Рост уровня мочевой кислоты в крови является свидетельством серьезных нарушений метаболизма, поскольку может бьггь не только следствием катаболизма свободных пуриновых нуклеотидов и

нуклеотидсодержагцих коферментов, но и результатом распада нуклеиновых кислот и гибели клеток (Зайчик, Чурнлов, 2000).

Динамика гликемии после купирования комы у первоначально здоровых животных и у крыс с сахарным диабетом имела существенные различия. У исходно здоровых животных уровень глюкозы в крови через 60 мин после купирования комы находился на нижней границе физиологической нормы (табл. 3). У животных с развившимся инсулинодефицитом после купирования гипогликемической комы концентрация глюкозы в крови быстро повышалась и через 60 мин превышала величину показателя у контрольных крыс в 2.5 раза. Относительно низкий уровень глюкозы в крови у первоначально здоровых животных через 60 мин после введения глюкозы является, по-видимому, результатом выделения эндогешюго инсулина в ответ на увеличение содержания глюкозы в крови. Уровни СЖК и кетоновых тел через 30 мин и 60 мин у животных 6-й и 7-й групп оставались сниженными (табл. 3), что является результатом действия инсулина в условиях увеличения гликемии.

Купирование гипогликемической комы у исходно здоровых животных и у крыс с дефицитом инсулина приводило к увеличению уровня гликогена в печени во все сроки исследования (табл. 3). Однако через 48 часов после купирования комы у первоначально здоровых животных количество гликогена в печени увеличивалось в 2 раза, а у крыс с сахарным диабетом - более чем в 9 раз, т.е. возвращалось к высокому исходному уровню. Вероятной причиной выявленных изменений является активация глюконеогенеза в печени крыс с инсулинодефицитом: каждая вторая молекула глюкозы, произведенной в ходе глюконеогенеза, используется в синтезе гликогена (Gomis et al., 2003; Azzout-Mamiche et al., 2007). С активацией глюконеогенеза, по-видимому, связано и накопление гликогена у диабетических животных, и сохранение высокого уровня гликогена в печени крыс с сахарным диабетом в состоянии гипогликемической комы (табл. 1).

Значительное накопление гликогена в печени крыс с инсулинодефицитом через 48 часов после купирования комы (табл. 3) свидетельствует также о том, что активность ферментных систем синтеза гликогена у этих животных сохраняется на достаточно высоком уровне. Инсулин увеличивает активность гликогенсинтетазы и уменьшает активность гликогенфосфорилазы в печени (Ferre et al., 2001; O'Brien et al., 2001 ;Cohen, 2002; Pap, Cooper, 2002; Halse et al., 2003; Bouché et al., 2004 и др.). Однако, накопление гликогена в печени этих животных связано скорее не с действием инсулина, но с исходно высокой интенсивностью глюконеогенеза. В отличие от первоначально здоровых животных у крыс с сахарным диабетом

повышался уровень СЖК в крови через 48 часов после купирования гипогликемической комы (табл. 3). Увеличение окисления СЖК необходимо для осуществления глюконеогенеза в печени (Bergman, Ader, 2000; Shah et al., 2002; Roef et al., 2003; Staehr et al., 2003).

У исходно здоровых животных и у крыс с дефицитом инсулина активности ДЦГ, глутатионредуктазы, СДГ и НАД-ИЦДГ через 48 часов после купирования гипогликемической комы не отличались от уровня контроля (табл. 7). В этот период активность Г6Ф-ДГ у первоначально здоровых животных была увеличена по сравнению с уровнем контроля, а у крыс с инсулинодефицитом оставалась существенно сниженной. Такие изменения активности Г6Ф-ДГ свидетельствуют о стойком снижении мощности антиоксидантных систем в печени животных с дефицитом инсулина.

Выраженные различия между первоначально здоровыми животными и крысами с развившимся инсулинодефицитом были выявлены и при определении ферментов азотистого метаболизма через 48 часов после купирования комы (табл. 7). У исходно здоровых животных изменений активности АлАТ и глутаматдегидрогеназы в печени не наблюдалось, и обнаруживалось снижение активности глутаминазы, тогда как у крыс с инсулиндефицигом активность этих ферментов была существенно повышена. Следуег отметить также явную тенденцию к увеличению активности АМФ-Д на 2-е сутки после купирования гипогликемической комы у крыс с инсулинодефицитом.

Через 48 часов после купирования комы содержание мочевины в крови у исходно здоровых животных снижалось наполовину, а у крыс с дефицитом инсулина, напротив, было значительно увеличено (в 2 раза по отношению к уровню контроля) (табл. 4). Количество свободных аминокислот в крови на 2-е сутки после перенесенного воздействия у животных с инсулинодефицитом также было повышено. Такие изменения в совокупности с существенным повышением активности ферментов катаболизма аминокислот в печени могут свидетельствовать уже об увеличении распада тканевых белков у крыс, перенесших гипогликемическую кому.

Таким образом, гипогликемия, развивающаяся на фоне предшествующего инсулинодефицита, приводит к увеличению катаболизма аминокислот в печени и может нарушать субстратное обеспечение протеиносинтеза в масштабе целого организма. Также крайне неблагоприятными является стойкие, сохраняющиеся у этих крыс и после купирования гипогликемии нарушения, способствующие активации процессов свободнорадикального окисления в печени.

Результаты проведенного исследования показывают, что инсулюювая гипогликемия способна отягощать метаболические изменения, характерные для сахарного диабета и вносить вклад в биохимическую симптоматику заболевания. Это имеет практическое значение, тем более что инсулиновая гипогликемия в ходе лечения пациентов с сахарным диабетом наблюдается неоднократно (Сгуег, 2004, 2005; Briscoe, Davis, 2006; Телушкин и соавт., 2008).

ВЫВОДЫ

1. Тяжелая инсулиновая гипогликемия у исходно здоровых животных вызывает изменения метаболизма, связанные преимущественно с действием инсулина: уменьшается уровень свободных жирных кислот, аминокислот и мочевины в крови, увеличивается активность ппокозо-6-фосфатдсгидрогеназы и умеренно уменьшается активность аланин- и аспартатаминотрансфераз в печени.

2. Инсулин не препятствует катаболизму аминокислот в печени крыс с предшествующим инсулинодефицитом - активность ферментов катаболизма аминокислот (аланин- и аспартат- аминотрансфераз, глутаминазы глутаматдегидрогеназы) в печени при инсулиновой гипогликемии значительно увеличена, в крови повышается уровень мочевины.

3. Инсулиновая гипогликемия у животных с сахарным диабетом, в отличие от первоначально здоровых крыс, приводит к увеличению активности аденозинмонофосфатдезаминазы в печени и концентрации мочевой кислоты в крови, что является свидетельством увеличения катаболизма пуриновых нуклеотидов.

4. Ипсулиновая гипогликемия приводит к уменьшению интенсивности гликогенолиза в печени и не препятствует мобилизации гликогена печени у первоначально здоровых крыс. Гипогликемическая кома у животных с инсулинодефицитом развивается при сохранении высокого уровня гликогена в печени и сопровождается увеличением скорости гликогенолиза Значительное накопление гликогена в печени крыс с инсулинодефицитом через 48 часов после купирования комы свидетельствует о сохранении активности ферментных систем синтеза гликогена у этих животных.

5. Инсулиновая гипогликемия у животных с инсулинодефицитом создает условия для активации перекисного окисления в печени: активность глюкозо-6-фосфатазы снижена и увеличивается активность аденозин-монофосфатдезаминазы. Такие изменения сохраняются через 48 часов после купирования комы глюкозой.

6. Инсулин не угнетает липолиз в жировой ткани у животных с предшествующим инсулинодефицитом - в отличие от первоначально здоровых крыс количество свободных жирных кислот в крови у этих животных в состоянии инсулиновой гипогликемии увеличивается и остается повышенным через 48 часов после купирования гипогликемической комы.

7. Купирование тяжелой инсулиновой гипогликемии глюкозой через 48 часов сопровождается полной нормализацией метаболических показателей у исходно здоровых животных, а у крыс с инсулинодефицитом приводит к метаболическому состоянию, характерному для инсулиновой недостаточности.

Всего по материалам диссертационного исследования опубликовано 14 работ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОТРАЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ АВТОРА:

1. Медведева, Н. Б. Показатели метаболизма у крыс при многократной инсулиновой гипогликемии / П. К. Телушкин, А. Д. Ноздрачев, П. П. Потапов, Н. Б. Медведева // Проблемы эндокринологии. - 2006. - Т.52, № 5. - С. 45-47. (авторских - 0,1 п.л.) (Журнал включен в перечень изданий рекомендованных ВАК РФ).

2. Медведева, Н. Б. Изменения показателей энергетического обмена в сердце крыс при аллоксановом диабете и инсулиновой гипогликемии / П. П. Потапов, А. Ю. Стельмах, П. К. Телушкин, Н. Б. Медведева // Вопросы биологической, медицинской и фармармацевтической химии. - 2007. - № 1. - С. 24-26. (авторских -0,1 п.л.) (Журнал включен в перечень изданий рекомендованных ВАК РФ).

3. Медведева, Н. Б. Показатели азотистого обмена при инсулиновой гипогликемии у крыс с аллоксановым диабетом / Н. Б. Медведева, П. К. Телушкин, А. Ю. Стельмах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 146, № 8. - С. 168-170. (авторских - 0,2 п.л.) (Журнал включен в перечень изданий рекомендованных ВАК РФ).

4. Медведева, Н. Б. Ферменты энергетического обмена ипероксидное окисление липвдов в печени крыс при инсулиновой гипогликемии / Н. Б. Медведева // Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА. - Ярославль, 2003. -С. 13. (авторских-0,06 п.л.)

5. Медведева, Н. Б. Интенсивность гликолиза в головном мозге и сердечной мышце крыс при гипогликемии / Н. Б. Медведева, А. Ю. Стельмах // Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА. - Ярославль, 2004. - С. 19-20. (авторских-0,03 п.л.)

6. Медведева, II. Б. Интенсивность гликолиза и активность ферментов энергетического обмена в печени крыс при гипогликемии на фоне аллоксанового диабета / Н. Б. Медведева // Сборник материалов докладов V научной конференции молодых ученых "Региональная медицинская наука: тенденции и перспективы развития. Аспирантские чтения" - 2004. - Самара, 2004. - С. 433-434. (авторских-0,06 п.л.)

7. Медведева, Н. Б. Интенсивность гликолиза и активность некоторых окислительных ферментов в головном мозге крыс при инсулиновой гипогликемии па фоне аллоксанового диабета / П. К. Телушкин, П. П. Потапов, Н. Б. Медведева, А. Ю. Стельмах // Материалы Всероссийской конференции "Механизмы синаптической передачи". - М., 2004. - С. 92. (авторских-0,01 п.л.)

8. Медведева, Н. Б. Активность ферментов азотистого обмена в печени крыс при инсулиновой гипогликемии / II. Б. Медведева II Сборник материалов IV Всероссийская университетская научно-практическая конференция молодых ученых и студентов по медицине. - Тула, 2005. - С. 213-214. (авторских-0,06 п.л.)

9. Медведева, Н. Б. Изменения азотистого обмена при гипогликемии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом / Н. Б. Медведева // Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА. - Ярославль, 2006. - С. 22-23. (авторских-0,06 п.л.)

10. Медведева, Н. Б. Уровень метаболитов в крови и активность ферментов азотистого обмена в сердце при гипогликемии / А. Ю. Стельмах, Н. Б. Медведева, П. П. Потапов, П. К. Телушкин, Т. Е. Шидловская // Материалы 5-й научно-практической конференции с международным участием "Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины" - Асграхань-Волгоград-Москва.: Изд-во АГМА, 2006. - С. 151-155. (авторских-0,01 п.л.)

11. Медведева, П. Б. Показатели азотистого обмена у крыс при инсулиновой гипогликемии / Н. Б. Медведева И Сборник 2-й Международный молодежный медицинский конгресс. Санкт-Петербургские научные чтения. - СПб.: Изд-во СПб. Педиатрического университета им. И.П.Павлова, 2007. - С. 192. (авторских-0,06 п.л.)

12. Медведева, Н. Б. Инсулиновая гипогликемия потенцирует нарушения азотистого метаболизма при сахарном диабете / Н. Б. Медведева, П.П. Потапов, П.К. Телушкин // Актуальные вопросы медицинской науки: Сборник научных работ сотрудников Ярославской государственной медицинской академии, посвящешшй 65-летию ЯГМА. - Ярославль: Изд-во ООО "ЯрМедиаГруп", 2009. -С.98-99. (авторских-0,02 пл.)

13. Медведева, Н. Б. Изменения азотистого обмена при гипогликемии / П. П. Потапов, Н. Б. Медведева, П. К. Телушкин, А. Ю. Стельмах // "Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии". Российская конференция, посвященная 80-летию со дня рождения Р.И. Лившица, приуроченная к 65-летию Челябинской государственной медицинской академии.- Челябинск: Изд-во ЧГМА, 2009,- С. 70-72. (авторских-0,01 п.л.)

14. Медведева, Н. Б. Активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ в печени крыс с экспериментальным сахарным диабетом при инсулиновой гипогликемии / Н. Б. Медведева // Актуальные вопросы медицинской науки: Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 65-летию Студенческого научного общества Ярославской государственной медицинской академии. - Ярославль: Изд-во ООО "ЯрМедиаГруп", 2011. - С. 17. (авторских-0,06 п.л.)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлА'Г - апанинаминотрансфераза

АМФ - аденозинмонофосфат

АМФ-Д - аденозинмонофосфатдезаминаза

АсАТ - аспартатаминотрансфераза

ГДГ- глутаматдегидрогеназа

ГЛТ - глутаминаза

ГР - глутатионредуктаза

Г6Ф - глюкозо-6-фосфат

Г6Ф-ДГ - глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

НАД - никотинамидаденипдинуклеотид

НАДН2 - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

НАД-ИЦДГ - НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотид фосфат

ПАДФН2 - никотинамидадениндшуклеотид фосфат восстановленный

СДГ- сукцинатдегидрогеназа

СЖК - свободные жирные кислоты

ТАТ - тирозинаминотрансфераза

Подписано в печать 13.02.2012 Объем 2,0 п.л., Тираж 100 экз. Заказ № 009

Отпечатано с оригинал-макета заказчика в типографии «Компас», ООО «Компас» 150054, г. Ярославль, пр-т Ленина, д. 20/53 тел.: (4852) 73-66-83, e-mail: element73@mail.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Медведева, Наталия Борисовна, Ярославль

61 12-3/705

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ярославская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития

Российской Федерации

МЕДВЕДЕВА НАТАЛИЯ БОРИСОВНА

Влияние гипогликемии на состояние энергетического и азотистого обмена в печени крыс с экспериментальным сахарным диабетом

03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор П.П.Потапов

Ярославль 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Список сокращений.....................................................................4

ВВЕДЕНИЕ................................................................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................10

1.1. Гипогликемия: распространенность, симптоматика и нарушения

физиологических функций............................................................10

1.2. Особенности метаболизма углеводов и липидов в печени................15

1.3. Азотистый метаболизм в печени...............................................23

1.4. Механизмы цитотоксичности аллоксана и использование модели

аллоксанового сахарного диабета.....................................................27

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................31

2.1. Организация и условия проведения эксперимента..........................31

2.2. Методы исследования..............................................................33

2.2.1. Определение количества субстратов....................................... 33

? (

2.2.2. Определение активности ферментов....................................... 34

2.3. Статистическая обработка результатов........................................ 37

Глава 3. ИЗМЕНЕНИЯ УРОВНЯ СУБСТРАТОВ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО И АЗОТИСТОГО ОБМЕНА............................................................ 39

3.1. Изменения уровня субстратов энергетического обмена...................39

3.1.1. Изменения концентрации глюкозы в крови.............................. 39

3.1.2. Изменения концентрации лактата в сыворотке крови....................44

3.1.3. Изменения концентрации СЖК в сыворотке крови.......................49

3.1.4. Изменения концентрации кетоновых тел в сыворотке крови...........53

3.1.5. Изменения концентрации гликогена печени...............................55

3.2. Изменения уровня субстратов азотистого обмена..........................61

3.2.1. Изменения концентрации мочевины в сыворотке крови...............61

3.2.2. Изменения концентрации мочевой кислоты в сыворотке крови.......66

3.2.3. Изменения концентрации аминоазота в сыворотке крови..............70

Глава 4. АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА В

ПЕЧЕНИ..................................................................................82

4.1. Дихотомический распад углеводов ...........................................82

4.2. Активность лактатдегидрогеназы.............................................84

4.3. Активность цитоплазматических НАДФ-зависимых ферментов........87

4.4. Активность ферментов цикла трикарбоновых кислот.....................90

Глава 5. АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ АЗОТИСТОГО ОБМЕНА

В ПЕЧЕНИ................................................................................99

5.1. Активность аминотрансфераз.................................................100

5.2. Активность глутаматдегидрогеназы.........................................104

5.3. Активность аденозинмонофосфатдезаминазы..............................104

5.4. Активность глутаминазы.......................................................107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................113

ВЫВОДЫ................................................................................124

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................126

Список сокращений

АДФ - аденозиндифосфат

АлАТ - аланинаминотрансфераза

АМФ - аденозинмонофосфат

АсАТ - аспартатаминотрансфераза

АТФ - аденозинтрифосфат

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

НАДН2 - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотид фосфат

НАДФН2 - никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный

СЖК - свободные жирные кислоты

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота, динатриевая соль

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Уровень глюкозы в крови является одним из наиболее строго регулируемых физиологических показателей (Сгуег, 2004, 2005; Briscoe, Davis, 2006; Griffin, Ojeda, 2008). Гипогликемия приводит к нарушению функций центральной и периферической нервной системы (Балаболкин, 2000; Дедов, Шестакова, 2003; Сгуег, 2007; Marty et al., 2007; Kumar, 2007; Cherrington, 2008; Телушкин и соавт. 2008 и др.) и изменяет функциональную способность миокарда (Robinson et al., 2003; Стельмах, 2008; Lee et al., 2004; Koivikko et al., 2005).

Стратегическую позицию в обеспечении метаболического гомеостазиса организма занимает печень. Именно печень обеспечивает поддержание уровня глюкозы в крови путем активации гормонзависимых процессов -мобилизации гликогена и глюконеогенеза. Роль печени в регуляции гликемии при различных физиологических и патологических состояниях, сопровождающихся изменением секреции гормонов, служила предметом многочисленных исследований (Cherrington, 1999, 2008). Инсулинодефицит приводит к развитию так называемых неалкогольных расстройств метаболизма в печени (West et al., 2006). Нарушения обмена, связанные с этим состоянием, могут приводить к уменьшению функциональных возможностей органа в отношении регуляции гликемии. С другой стороны, гипогликемия вызывает увеличение уровня контринсулярных гормонов (глюкагона, катехоламинов, адренокортикотропного гормона, соматотропного гормона, глюкокортикоидов, вазопрессина), стимулирующих катаболизм аминокислот и глюконеогенез в печени (Amiel, 1996; Inouye, 2002), и способна приводить к активации окислительного стресса и повреждению клеток (Телушкин, Ноздрачев, 1999; Телушкин и соавт., 2008).

Причиной развития гипогликемии в реальных условиях часто является увеличение уровня инсулина в крови, связанное с передозировкой гормона у пациентов с сахарным диабетом. Таким образом, гипогликемия возникает, прежде всего, в условиях предшествующего инсулинодефицита и гипергликемии (Генес, 1970; Балаболкин, 2000; Дедов, Шестакова, 2003; Сгуег, 2003, 2004; Bolli, 2003; Hirsch, 2005 и др.). Дефицит эффектов инсулина приводит к изменению доступности основных субстратов пластического и энергетического обмена и активности внутриклеточных ферментов (O'Brien et al., 1996, 2001; Bell, 2003; Griffin, Ojeda, 2008). Связанная с гипергликемией активация окислительного стресса вызывает повреждение многих ферментных систем, в частности углеводного и азотистого метаболизма (Brownlee, 2001; Du et al., 2003).

Повышение метаболической нагрузки на печень при гипогликемии может оказывать неблагоприятное воздействие на обмен в печени и в целом организме, особенно если это накладываются на уже имеющиеся нарушения, вызванные предшествующим инсулинодефицитом и гипергликемией (Балаболкин, 2000; Дедов, Шестакова, 2003; West et al., 2006).

Изменения метаболизма при тяжелой инсулиновой гипогликемии исследованы недостаточно. Практически не рассматривались особенности метаболического ответа печени на инсулиновую гипогликемию в условиях предшествующего дефицита инсулина. Это затрудняет разработку рациональных методов терапии такого тяжелого состояния, как гипогликемическая кома, особенно гипогликемической комы у пациентов с сахарным диабетом. Поэтому комплексное изучение субстратного обеспечения основных метаболических процессов и активности ферментов энергетического и азотистого обмена в печени при инсулиновой гипогликемии, развивающейся в условиях предшествующего инсулинодефицита, представляет существенный интерес.

Различные экспериментальные модели в течение многих лет успешно используются для изучения метаболизма при дефиците эффектов инсулина. Такие исследования позволяют раскрыть многие механизмы патогенеза сахарного диабета и его осложнений (Баранов и соавт., 1983; Куликов, 1994; Szkudelski, 2001; Walde et al., 2002; Волчегорский и соавт., 2008; 2009).

Цель исследования

Выявить и оценить изменения энергетического и азотистого метаболизма в печени при инсулиновой гипогликемии, развивающей в условиях предшествующего инсулинодефицита.

Задачи исследования

1. Изучить изменения содержания метаболитов энергетического и азотистого обмена в крови и печени при инсулиновой гипогликемии у первоначально здоровых животных и крыс с экспериментальным сахарным диабетом.

2. Исследовать интенсивность гликогенолиза и гликолиза, активность ферментов цикла трикарбоновых кислот и ферментов азотистого обмена в печени при гипогликемии у первоначально здоровых животных и животных с экспериментальным сахарным диабетом.

3. Исследовать указанные метаболические параметры в восстановительном периоде после купирования гипогликемической комы глюкозой у первоначально здоровых животных и крыс с предшествующим инсулинодефицитом.

Научная новизна

Получены новые комплексные данные об изменениях показателей углеводного и азотистого метаболизма в печени при инсулиновой гипогликемии у животных с предшествующим инсулинодефицитом.

Впервые установлено, что состояние гипогликемической комы у животных с инсулинодефицитом развивается при сохранении высокого уровня гликогена и в условиях снижения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и повышения активности сукцинатдегидрогеназы и не приводит к изменениям активности никотинамидадениндинуклеодид-зависимой изоцитратдегидрогеназы в печени.

Показано, что инсулиновая гипогликемия у животных с предшествующим инсулинодефицитом развивается в условиях увеличения активности ферментов катаболизма аминокислот в печени (аланин- и аспартат-аминотрансфераз, глутаминазы, глутаматдегидрогеназы) и приводит к еще большему увеличению катаболизма аминокислот и продукции мочевины в печени, а также приводит к повышению активности аденозинмонофосфатдезаминазы в печени и уровня мочевой кислоты в крови, которые наблюдаются и через 48 часов после купирования комы глюкозой.

Впервые доказано, что инсулиновая гипогликемия, развивающаяся в условиях предшествующего инсулинодефицита, потенцирует изменения азотистого метаболизма при этом состоянии и способна вносить вклад в биохимическую симптоматику сахарного диабета.

Практическая значимость

Оценена роль изменений уровня метаболитов углеводного, липидного и азотистого обмена в крови и активности ферментов окислительного и азотистого метаболизма в печени в обеспечении энергетического гомеостазиса при инсулиновой гипогликемии. Полученные данные позволяют раскрыть существенные особенности патогенеза нарушений метаболизма в печени и определить факторы, которые снижают функциональные возможности органа при гипогликемии, развивающейся в условиях предшествующего дефицита инсулина.

Результаты исследования являются основой для разработки патогенетически обоснованных мероприятий, направленных на коррекцию неблагоприятных метаболических изменений при гипогликемии у пациентов с сахарным диабетом.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При инсулиновой гипогликемии у первоначально здоровых животных развиваются метаболические эффекты, преимущественно связанные с анаболическим действием инсулина.

2. Гипогликемия у животных с инсулинодефицитом развивается в условиях увеличения катаболизма аминокислот в печени и способна потенцировать изменения азотистого метаболизма, характерные для инсулиновой недостаточности, приводит к повышению распада пуриновых нуклеотидов в печени и увеличению уровня мочевой кислоты в крови. Анаболические эффекты инсулина выражены слабо, преобладают эффекты гипогликемии и активации контринсулярного аппарата.

3. На 2-е сутки после купирования тяжелой инсулиновой гипогликемией глюкозой у первоначально здоровых животных происходит нормализация исследованных показателей и наблюдаются эффекты, связанные с анаболическим действием инсулина, а у крыс с инсулинодефицитом большинство метаболических показателей возвращаются к исходному (инсулинодефицит) состоянию, и сохраняются условия для активации процессов свободнорадикального окисления.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гипогликемия: распространенность, симптоматика и нарушения физиологических функций

Гипогликемия - широко распространенное патологическое состояние, возникающее при голодании, инсуломе поджелудочной железы, алкогольной интоксикации, заболеваниях желудочно-кишечного тракта и при неадекватной инсулинотерапии сахарного диабета (Генес, 1970; Лукьянчиков, Балаболкин, 1987; Amiel, Maran, 1993; Балаболкин, 1994, 2000; Дедов, Шестакова, 2003; Сгуег, 2004, 2006; Cryer et al., 2003). Более 90% всех пациентов, получающих инсулин, испытывают эпизоды гипогликемии (Сгуег, 1997, 2004; Briscoe, Davis, 2006).

Единых критериев гипогликемии не существует (Дедов, Шестакова, 2003), поскольку это понятие связывают не только с конкретным уровнем глюкозы в крови, но и с определенной, прежде всего неврологической, симптоматикой. Критической принято считать концентрацию глюкозы в крови менее 3,3 ммоль/л, дальнейшее снижение гликемии в большинстве случаев приводит к характерным нарушениям (Дедов, Шестакова, 2003).

Гипогликемия является одной из основных причин ухудшения состояния у пациентов с сахарным диабетом как первого, так и второго типа (Сгуег, 2005). Частота развития гипогликемической комы увеличивается в три раза при интенсивной терапии пациентов с сахарным диабетом (Сгуег, 2004; Briscoe, Davis, 2006). При этом эпизоды гипогликемии наблюдаются у пациентов с сахарным диабетом первого типа около 10 раз в неделю, а случаи тяжелой гипогликемии, требующей госпитализации - по крайней мере один раз в год (Hepburn et al., 1993; Briscoe, Davis, 2006). От 2 до 7% смертей пациентов с сахарным диабетом первого типа связано с гипогликемией (Дедов и соавт., 1995; Балаболкин, 2000; Сгуег, 2004). Одной из важнейших задач оптимизации лечения больных с инсуломой и сахарным

диабетом является уменьшение риска развития гипогликемии (Cryer et al., 2003; Bolli, 2003; Cryer, 2004; Hirsch, 2005).

Симптомы гипогликемии делятся на две категории - нейрогенные и нейрогликопенические, они начинают появляться тогда, когда концентрация глюкозы в плазме крови становится ниже 3,9 ммоль/л (менее 3,3 ммоль/л в цельной крови) (Deary et al., 1993; Towler et al., 1993).

Нейрогенные симптомы связанны с активацией симпатической нервной системы и с выделением катехоламинов окончаниями симпатических нервов и мозговым веществом надпочечников и ацетилхолина симпатическими холинергическими нервными окончаниями (Diedrich et al., 2002; Cryer et al., 2003; Zammitt, Frier, 2005). К адренергическим сиптомам относятся беспокойство, чувство тревоги, нервозность, сердцебиение, потливость, тремор, сухость во рту, бледность кожных покровов, расширение зрачков (McAuley et al., 2001; Cryer et al., 2003; Cryer, 2004). К холинергическим симптомам относится потливость, а также чувство голода и парестезии (Cryer, 2001; Cryer et al, 2003; Cryer, 2004).

Нейрогликопенические симптомы обычно начинают проявляться при гликемии ниже 2,7 ммоль/л и обусловлены снижением притока глюкозы к мозгу. Они включают в себя нарушения умственных способностей, раздражительность, головную боль, отклонения в психике, спутанность сознания, нарушения речи, диплопию, гемипарезы, расстройства координации движений, ступор, судороги. В конечном итоге развивается гипогликемическая кома (при уровне глюкозы в крови 1,0-1,5 ммоль/л), которая в отсутствии лечения приводит к смерти (Amiel et al, 1988; McAuley et al, 2001; Cryer, 2001; Cryer et al, 2003; Cryer, 2004).

Купирование гипогликемической комы предполагает введение глюкозы и в реальных условиях часто сопровождается гипергликемией (Siesjo, 1988; ; Балаболкин, 1994, 2000; Дедов, Шестакова, 2003; Suh et al, 2007).

При гипогликемии обнаруживаются нарушения функционирования сердечно-сосудистой системы. Наблюдаются нарушения ритма сердечных

сокращений, значительные колебания кровяного давления, уменьшение объема циркулирующей крови, падение вязкости крови и расширение периферических сосудов (Холодова, Мохорт, 1988). Нарушения со стороны дыхательной системы приводят к снижению насыщения крови кислородом (Камышева, 1976; Султанова, Хасанов, 1988; Балаболкин, 2000).

Нормальный физиологический ответ на гипогликемию состоит в уменьшении секреции инсулина и увеличении секреции "контринсулярных" гормонов: глюкагона, катехоламинов, глюкокортикоидов, соматотропного гормона, вазопрессина и окситоцина (Агше1, 1996; ВоШ, РапеШ, 1999; Балаболкин, 2000; Б1еёпс11 е1 а1., 2002; Дедов, Шестакова, 2003; Сгуег, 2004 и др.). Секреция контринсулярных гормонов начинает увеличиваться при уровне глюкозы около 3,8 ммоль/л (Агше1, 1996; 1£алуа е! а1., 2002; Дедов, Шестакова, 2003). Основными контринсулярными гормонами являются катехоламины и глюкагон. Эффекты гормона роста и кортизола проявляются через 4 часа от начала гипогликемии, их участие в увеличение уровня глюкозы в крови составляет не более 20% от вклада адреналина (Б1еёпсЬ ег а1., 2002).

У больных с непродолжительным инсулинодефицитом система противорегуляции при гипогликемии функционирует так же, как у здоровых лиц. С увеличением длительности сахарного диабета может происходить ее дисфункция, в первую очередь, уменьшение секреции глюкагона (Вапагег е1 а1., 2002; Яа]и, Сгуег, 2005; Соэтапоу & а1., 2005; ЬгаеПап ег а1., 2005). Выделение адреналина у таких пациентов увеличивается при меньших значениях гликемии (Сгуег, 2005). Поэтому, по мере п