Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антиоксидантная защита при сахарном диабете

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антиоксидантная защита при сахарном диабете"

Р Г Б ОД ' ' ДПР 1398

На правах рукописи

ХОРОБРЫХ Ольга Юрьевна

АНТИОКСИДАНТНАЯ ЗАЩИТА ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа-1998

Работа выполнена на кафедре биохимии Пермской государственной медицинской академии.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Н.А.Терёхина

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор по курсу клинической биохимии Ижевской государственной медицинской академии П.Н.Шараев доктор медицинских наук, профессор зав. кафедрой биохимии Кировского медицинского института П.И.Цапок

Ведущая организация: Московский медицинский стоматологический институт.

Защита состоится « ОЛА^э 1998 г. в ■/ 0 часов на

заседании диссертационного совета Д.084.35.01 при Башкирском государственном медицинском университете (450000, г. Уфа, ул.Ленина. 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета. Автореферат разослан « ¿3 » 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Э.Г.ДАВЛЕТОВ

\ктуальность проблемы.

Сахарный диабет - одно из наиболее распространенных эндокринных (аболеваний, поражающее людей всех возрастов и приводящее к тяжелой ишалидизации (И. И. Дедов с соавт., 1995; М. И. Балаболкин, 1997).

По данным Всемирной организации здравоохранения )аспространенность сахарного диабета среди населения различных стран *арьирует от 1 до 5 %. Эти цифры не отражают истинного положения дел, -ак как не учитываются латентные формы и большое количество людей с крушенной толерантностью к глюкозе, заболевание у которых проявится ¡ерез несколько лет. В России около 10 миллионов больных сахарным шабетом (М.И.Балаболкин с соавт., 1997). Каждые 10-15 лет число этих 5ольных увеличивается в 2 раза (М.В.Шестакова с соавт., 1993).

Для диагностики и лечения сахарного диабета необходимо знать механизмы развития данной патологии. Биохимия сахарного диабета гзучена достаточно хорошо. В последние годы установлено усиление ¡вободнорадикального окисления при сахарном диабете как в клинике, так i в эксперименте (Ю.А.Петрович, Д.В.Гупшн, 1986; Somogie et al. 1994; )eslypere, 1994; McCusker et al. 1995; Akkus et al., 1996). Сахарный диабет шгосят к патологии со свободнорадикальным механизмом (В.И.Корчин с ;оавт., 1992; Young, 1997). Применение лекарственных препаратов, >бладающих свойствами антиоксидантов, оказалось патогенетическим и |ффекггавным в терапии сахарного диабета (А.И.Ляйфер, 1996; Packer .994; Inal et al., 1995; Roza et al., 1995).

Активные формы кислорода могут нарушить функцию и структуру побых молекул клетки. Перекиспое окисление липидов в основном страгивает фосфолипиды мембран и нарушает мембранный транспорт Н.А.Терехина, Ю.А.Петрович, 1992; Б.А.Зелинский с соавт., 1994; ШМатюшин с соавт., 1996; Ю.АБладимиров, 1997). Причины усиления :вободнорадикального окисления при сахарном диабете многочисленны, >ажнейшими из них следует считать гипергликемию, гликозилирование ¡елков, усиление сорбитолового пути (Е.А.Лебедева, 1997; Lapolla et al. 993; Napoli, 1995; Doria, 1995; Giugliano et al., 1995).

В норме процессы свободнорадикального окисления регулируются

антиоксидантпой системой. Исследования, посвященные изучению состояния антиоксидантпой системы у больных сахарным диабетом, немногочисленны (И.И.Дедов с соавт., 1995; А.И.Древаль, 1996; ГАккдо е1 а1., 1996). Авторы изучали содержание в крови одного, двух показателей антиоксидантпой защиты, не сравнивая эти значения у лиц с впервые выявленным сахарным диабетом и у длительно болеющих. В доступной литературе мы не встретили данных о сравнительной оценке активности комплекса антиоксидантных ферментов у больных сахарным диабетом I и II типа.

Состояние свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты при сахарном диабете изучается в различных биологических жидкостях: в цельной крови, в клетках и плазме крови (И.И. Дедов с соавт., 1992; Л.Н.Щербачева с соавт., 1994; Ы.Кисикаус1т а ей., 1995). Актуальным является исследование показателей антиоксидантной защиты в эритроцитах, так как состояние обмена веществ в мембранах этих клеток отражает метаболизм мембран других органов (М.В.Колосова с соавт., 1997)

Диагностика сахарного диабета, последующий контроль за состоянием больного, оценка эффективности проводимой терапии требуют постоянных заборов крови для анализа. В результате возникает реальный риск переноса вирусных заболеваний. В последние годы возросло число публикаций по биохимии слезы. Это связано с обнаружением влияния слезы на метаболизм роговицы, с выявлением диагностической ценности анализа слезы, с разработкой микрометодов. анализа и адекватных способов сбора слезы, с тем, что анализ слезы - метод неинвазивной диагностики (Н.А.Терехина, Ю.Л.Петрович, 1990). Слезная жидкость является доступным объектом для лабораторного изучения, поскольку её получение безболезненно и атравматично.

В литературе отсутствуют указания об исследовании в слезной жидкости больных сахарным диабетом процессов свободно-радикального окисления и активности антиоксидантных ферментов.

Изучение состояния антиоксидантной защиты при сахарном диабете, проведение биохимического анализа слезной жидкости перспективно не

только для фундаментальной биохимии, но может быть полезным для диагностики этого заболевания и назначения патогенетически обоснованной терапии.

Цель работы и задачи исследования. Целью работы явилось изучение показателей антиоксидантной защиты при сахарном диабете и разработка способа неинвазивной диагностики этого заболевания.

Соответственно цели были поставлены задачи:

1. Провести хемишоминесцентный анализ эритроцитов периферической крови больных сахарным диабетом и эритроцитов крыс при экспериментальном аллоксановом диабете.

2. Изучить активность антиоксидантных ферментов - каталазы, пероксидазы, супероксидцисмутазы, глугатионредукгазы в эритроцитах периферической крови больных сахарным диабетом I и П типа и крыс при аллоксановом сахарном диабете.

3. Изучить интенсивность свободнорадикального окисления и активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах периферической крови больных сахарным диабетом в зависимости от длительности заболевания.

4. Провести хемилюминесцентный анализ и исследовать активность пероксидазы в слезной жидкости больных сахарным диабетом.

5. Изучить содержание глюкозы, молочной, пировиноградной кислот, холестерина в слезной жидкости больных сахарным диабетом и разработать способ неинвазивной диагностики этого заболевания.

Научная новизна исследования.

Впервые у больных сахарным диабетом I и II типа в зависимости от длительности заболевания изучена интенсивность хемшпоминесценции и активность антиоксидантных ферментов эритроцитов периферической крови. Сопоставлено изменение активности четырех антиоксидантных ферментов: каталазы, пероксидазы, супероксиддисмутазы и глютатионредуктазы в эритроцитах периферической крови больных сахарным диабетом и крыс при аллоксановом диабете

В слезной жидкости больных сахарным диабетом исследовано содержание глюкозы, пировиноградной, молочной кислот, холестерина и разработан способ неинвазивной диагностики этого заболевания.

Впервые проведен хемщпоминесценгаый анализ слезной жидкости, изучена активность пероксидазы слезы больных сахарным диабетом.

Практическая ценность работы.

Установлена интенсификация свободнорадикального окисления и снижение ашиоксидантной защиты в организме при сахарном диабете, что обосновывает применение антиоксидантов для лечения этого заболевания.

Показано, что биохимический анализ слезной жидкости может быть использован для неинвазивной диагностики сахарного диабета. Разработан простой и быстрый способ диагностики этого заболевания путем определения в слезной жидкости содержания глюкозы, пировиноградной, молочной кислот. Сущность метода заключается в возможности диагностики сахарного диабета по регистрации повышенного содержания этих метаболитов в слезе.

Внедрение в практику.

По материалам работы написаны методические рекомендации «Неинвазивная диагностика сахарного диабета с помощью анализа слезы» предназначенные для слушателей факультета усовершенствования врачей, врачей-лаборантов клинических и биохимических лабораторий, для врачей-эндокринологов, работающих в поликлиниках и стационарах. Неинвазивный способ диагностики сахарного диабета внедрен в лаборатории городской клинической больницы № 6 г. Перми. Материалы диссертациошгой работы используются в учебном процессе кафедрой биохимии, кафедрой глазных болезней, кафедрой внутренних болезней медико-профилактического факультета Пермской государственной медицинской академией.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научной конференции по клинической биохимии в Пермской государственной медицинской академии (1994, 1995), межрегиональной учебно-методической конференции "Преподавание в медицинском ВУЗе вопросов профилактики здоровья и его реабилитации" (Пермь, 1996), научной сессии ПГМА (1996, 1997, 1998), научно-практической конференции молодых ученых ПГМА (1996, 1997), на Ш Международном симпозиуме "Неинвазивные методы диагностики" (Москва, 1997), на Всероссийской научно-практической конференции эндокринологов (Пермь, 1997), на межкафедральном заседании ПГМА (1997), на обществе врачей-лаборантов (1998).

Публикации

Основные положения диссертации освещены в 14 печапшх работах, в том числе 3 - в центральной печати.

Положения, выносимые на защиту.

1. При аллоксановом диабете в эритроцитах крыс происходит усиление процессов свободнорадикального окисления и изменяется активность антиоксидантных ферментов.

2. У больных сахарным диабетом I и II типа в эритроцитах изменяется интенсивность хемютоминесцснщга и активность антиоксидантных ферментов( -.. ; каталазы, пероксидазы, супер-оксиддисмугазы, глутатионредуктазы.

3. Слезная жидкость может быть использована для неинвазивной диагностики сахарного диабета.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописи и состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 4 глав собственных наблюдений, обсуждения, 4 выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 184 отечественных и 136 зарубежных источников. Работа

проиллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками.

Материалы и методы.

При выполнении работы использованы биохимические, биофизические, статистические методы. Исследование антеоксидантной защиты проведено, как в эксперименте, так и у больных сахарным диабетом I и II типа.

Объекты исследования: цельная кровь, сыворотка, эритроциты периферической крови, слезная жидкость 141 больного сахарным диабетом. Контролем служила слеза и кровь 137 практически здоровых доноров. Также объектами исследования явилась кровь 87 крыс с аллоксановым диабетом. Контролем служила кровь 20 здоровых крыс.

В качестве экспериментальной модели нами был избран аллоксановый диабет у крыс. Преимущество данной модели заключается в том, что диабет можно воспроизводить у мелких животных, при этом не нарушается экзокринная функция поджелудочной железы (В.Г.Баранов с соавт., 1983). Кроме того, при аллоксановом диабете также отмечено усиление свободнорадикального окисления (В.И.Корчин с соавт., 1992; В.Н.Бобырев с соавт., 1992; Бахепа е1 а1., 1993; 1лк1\%38оп й а1., 1993). Экспериментальный диабет воспроизводили при внутрибрюшинном введении крысам аллоксапа в дозе 20 мг на 100 г веса. Исследования проводили у животных через три, семь, тридцать дней после введения препарата. Сроки обследования животных обусловлены тем, что на третий и седьмой день после введения ашюксана наблюдается острая инсулиновая недостаточность (В.Г. Баранов с соавт., 1983), тридцатый день отражает хроническое течение аллоксанового диабета.

У экспериментальных животных кровь брали из хвостовой вены. У больных сахарным диабетом людей кровь получали путем пункции кубиталыюй вены. Для отделения сыворотки пробирку с кровью помещали в термостат при температуре 37°С на два часа для образования и реггракции сгустка крови. Затем проводили центрифугирование при 3000 об/мин в течение 15 минут.

Для получения эритроцитов кровь стабилизировали гепарином и

дважды отмывали физиологическим раствором хлорида натрия.

Слезотечение стимулировали поднесенным к носу комочком ваты, смоченным 10 %-ным раствором нашатырного спирта. Глазной пипеткой, не касаясь глаза, чтобы избежать даже небольшой микротравмы, собирали слезу с наружной поверхности нижнего века (Н.А.Терехина с соавт., 1989).

Для оценки состояния свободнорадикалыюго окисления проведен хемишоминесцентный анализ эритроцитов и слезной жидкости (Н.А.Терёхина с соавт., 1992).

Для изучения . состояния антиоксидантной защиты организма проводилось определение активности антиоксидантных ферментов эритроцитов. Активность каталазы исследовали по методу М.А. Королюка с соавт. (1988), пероксидазы по Т. Попову и Л. Нейковской (1971). Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по методу С. Чевари с соавт. (1985), глутатионредуктазы по Л.Б. Юсуповой (1989) с обработкой эритроцитов по методу Е.Е. Дубининой (1983).

В слезной жидкости, цельной крови изучено содержание глюкозы глюкозооксидазным методом по Ф.И.Комарову и В.В.Меньшикову (1985), содержание пировиноградной кислоты проводили по Cz.dk, ЬатргесМ (1970), молочной кислоты по НоЬоге! (1962). Определение концентрации холестерина в слезной жидкости и сыворотке крови проводили по методу Пса (1962).

Цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики. Достоверность различий оценивали с помощью критерия I Стыодента. Различия считали достоверными при значении Р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.

Интенсивность хемшпоминесцепции эритроцитов периферической крови здоровых крыс составила 393,50+35,85 импульсов за 10 секунд.

Максимальное усилепие интенсивности хемшпоминесценции наблюдалось на третий и седьмой день после введения аллоксана, в эти сроки она превышала контроль в 2,8 раза, оставалась повышенной в 2 раза на тридцатый день эксперимента.

На начальных этапах аллоксанового диабета ведущую роль играет окисление аллоксана с образованием свободных форм кислорода и активация цепной неферментативной реакции окисления биомолекул (Г.К.Парсаданян с соавт., 1989). В последующие дни абсолютный дефицит инсулина и развитие гипергликемии становится важным фактором, поддерживающим высокую интенсивность свободнорадикального окисления. Выраженная гипергликемия обусловливает гликозилирование белков, усиление сорбитолового пути, что в свою очередь ведет к усилению свободнорадикального окисления (Lapolla et al., 1992; Sinclair et al., 1992). Возможно, что именно интенсификация свободнорадикального окисления и определяет токсическое влияние аллоксана на все ткани и органы, о чем свидетельствует высокий процент гибели животных в первые дни эксперимента.

Интенсивность хемилюминесцешщи у больных сахарным диабетом I типа была повышена в 3,2 раза, у больных сахарным диабетом II типа в 2 раза по сравнению с контролем.

Наиболее значимое увеличение хемилюминесценции при сахарном диабете I типа связано с более выраженной гипергликемией, абсолютным дефицитом инсулина. В группе больных с впервые выявленным сахарным диабетом интенсивность хемилюминесценции превышала контроль в 4 раза.

Таким образом, у крыс с аллоксановым диабетом и у больных сахарным диабетом установлено достоверное повышение интенсивности хемилюминесценции эритроцитов, что свидетельствует об усилении процессов свободнорадикального окисления.

В эритроцитах периферической крови больных сахарным диабетом и крыс при аллоксановом диабете изучена активность четырех ангиоксидантных ферментов - каталазы, пероксидазы, СОД, глутатаонредуктазы (табл.1, рис 1).

Табл.1.

Активность антиоксида!гп1ых ферментов (М±т) в эритроцитах периферической крови крыс при аллоксановом диабете.

Фермент Интактные животные Опытные животные

Время после введения аллоксана

3 день 7 день 30 день

Каталаза, ммаль/мин на г НЬ 18.11+0.45 23.64+1.96 25.93+2.54 23,77+2.39

Р <0.02 <0.02 <0.05

Пероксидаза, мкмоль/мин на г НЬ 774.09+8.74 733.06+52.57 715.21+35.59 767.90+24.58

Р >0.2 >0.1 >0.5

СОД, ед. на г НЬ 65.37+2.14 82.15+2.62 81.97+2.24 80.15+1.46

Р <0.001 < 0.001 <0.001

ГР, мкмоль/мин на г НЬ 0.80+0.11 1.31+0.08 0.48+0.01 0.47+0.01

Р <0.01 <0.01 <0.01

В эритроцитах крыс при аллоксановом диабете активность катапазы была достоверно повышена весь период исследования, максимальное повышение в 1,5 раза: было отмечено па седьмой день после введения аллоксана, что позволяет предполагать продолжающееся нарастание образования пероксида водорода. По данным Gupta et al. (1993), Jiang et al. (1993) активность каталазы в эритроцитах крыс при аллоксановом диабете понижена. Отличия данных литературы и собственных результатов мы объясняем тем, что в наших исследованиях определение активности фермента проводилось в ранние сроки острой йнсулиновой недостаточности.

Активность каталазы у больных сахарным диабетом I и II типа была повышена в 1,9 и в 1,6 раза соответственно. При сахарном диабете I типа другие исследователи также выявили повышение активности каталазы в эритроцитах (О.А. Никифорова с соавт., 1996; Ш.А. Ержанова, 1994).

Каталаза

Пероксидаза

80

£

*

г

а §

г

40

до лечения

после лечения

I

600

£

■» 600

(в

X

I

^ 400

200

до лечения

после лечения

1 г

1 2

1 г

1 2

Супероксиддисмутаза

Гпутатионредуктаза

100

§

80

I 60

40

20

до лечения

после лечения

К 12 12

ё •>

(в

X

§

1

до после лечения лечения

1 2

1 2

Рис. I. Активность антмоксидантных ферментов в эритроцитах периферической крови больных сахарным диабетом. К - контроль,

1 - сахарный диабет I типа,

2 - сахарный диабет II типа,

3 - впервые выявленный сахарный диабет.

3

Активность каталазы у больных с впервые выявленным сахарным диабетом практически не отличалась от группы контроля.

Сведений об активности другого антаоксидантного фермента -пероксидазы в эритроцитах при экспериментальном сахарном диабете и у больных сахарным диабетом в доступной литературе мы не встретили. Активность пероксидазы у крыс с экспериментальным сахарным диабетом весь период исследования не отличалась от контроля (табл. 1).

Активность этого фермента у больных сахарным диабетом была достоверпо повышена в 1,5 раза (рис. 1).

Можно ли расценивать повышение активности пероксидазы как положительный вклад в общую антиоксидантнуго систему клетки, сказать трудно. В эксперименте показано, что под действием пероксидазы в мембранах эритроцитов усиливается образование синглетного кислорода и супероксиданиона, то есть, этот фермент в условиях окислительного стресса может проявлять прооксидантные свойства (В.П.Верболович с соавт., 1989; Ю.А.Владимиров 1997).

Активность СОД в эритроцитах крыс при аллоксановом диабете была достоверно повышена в 1,3 раза весь период исследования (табл. 1). Возможно, повышение активности СОД у экспериментальных животных носит компенсаторный характер в ответ на повышение свободнорадикального окисления. В доступной литературе мы не встретили данных об активности СОД в эритроцитах при аллоксановом диабете.

У длительно болеющих сахарным диабетом I и II типа активность СОД была снижена в 1,5 раза по сравнению с контролем (рис. 1). Снижение активности фермента у больных сахарным диабетом I типа соответствует литературным дагашм (Ш.А.Ержанова 1994; Akkus et al., 1996). Установлено, что активность этого фермента в группе больных с впервые выявленным сахарным диабетом практически не отличалась от контроля.

Причинами снижения активности СОД у длительно болеюншх могут быть избыточная продукция и накопление пероксида водорода в клетке, подавляющего активность фермента, а также его

гликозшшрование. Установлено, что скорость гликозилирования СОД in vitro прямо пропорциональна времени инкубации и концентрации глюкозы в растворе (Е.Е.Дубинина с соавт., 1995). Усиленное гликозшшрование СОД сопровождается снижением активности фермента на 40% (Oda et. al., 1994). У больных сахарным диабетом активность Си,7п-завискмой СОД в эритроцитах обратно пропорциональна уровню глюкозы в крови.

Наиболее чувствительным из изученных нами антиоксидантных ферментов оказалась глутатионредуктаза. У контрольных животных активность глутатионредуктазы в эритроцитах составила 0,80+0,11 мкмоль/мин на г гемоглобина. На третий день после введения аллоксана активность глутатионредуктазы повысилась до 1,31+0,08 мкмоль/мин на г гемоглобина (Р<0,01), начиная с седьмого дня наблюдалось падение активности фермента, на тридцатый день эксперимента активность глутатионредуктазы оставалась достоверно пониженной в 1,7 раза' по сравнению с контролем (табл. 1). По данным литературы при аллоксановом диабете у крыс наблюдается повышение активности глутагаонредуктазы (Gupta et al., 1990; 1993). Однако следует учесть, что исследования проводились авторами однократно.

Снижение активности глутатионредуктазы, начиная с седьмого дня эксперимента, вероятно, связано с недостатком НАДФНг и восстановленного глутатиона, поскольку пентозный путь в эритроцитах при аллоксановом диабете заторможен (В.Г.Баранов, 1983).

У всех больных сахарным диабетом активность глутатионредуктазы оказалась сниженной в 3 - 3,5 раза по сравнению с контролем. Вероятно, резкое падение активности фермента связано с истощением антиоксидантной защиты организма. Снижение активности глутатионредуктазы косвенно свидетельствует о недостатке

восстановленных эквивалентов в эритроцитах и показывает, что данное звено в антиоксидантной защите является наименее устойчивым. Также причиной снижения активности глутатионредуктазы может быть нарушение обмена витамина Вг, которое наблюдается у 54% больных, поскольку глутатионредуктаза является флавинзависимым ферментом (В.Г.Чобитько 1996).

На фоне проведенного лечения, которое было комплексным и включало диетотерапию, инсулинотерапию, сахаропонижающие препараты, витамины, состояние больных улучшилось, концентрация глюкозы в крови понизилась. Однако, активность антиоксидантных ферментов изменилась несущественно: каталаза оставалась повышенной, активность пероксидазы незначительно понизилась, активность СОД и глутатионредуктазы оставались пониженными. Тагам образом,

несмотря на снижение концентрации глюкозы нормализации в антиоксидантной системе не происходит. По-видимому, этот факт объясняется тем, что не устраняются причины, ведущие к болезни и ее обострению.

Абсолютная инсулиновая недостаточность в эксперименте и у больных сахарным диабетом I сопровождается усилением СРО. В обоих случаях активность каталазы была повышена, а активность глутатионредуктазы резко снижена. Активность пероксидазы у животных не изменялась, у больных оказалась повышена. Активность СОД в эритроцитах периферической крови крыс с аллоксановым диабетом была достоверно повышена, у больных активность этого фермента была понижена. По-видимому, у животных в условиях острого диабета более полноценно происходит обезвреживание пероксида водорода и супероксиданиона. Снижение у больных активности СОД и глутатионредуктазы является неблагоприятным, так как возникает реальная угроза накопления супероксиданиона при снижении в эритроците эндогенного водорода, что в условиях нарушения метаболизма может явиться фактором ускоренного его гемолиза.

Анализируя результаты, полученные у больных сахарным диабетом I и II типа можно проследить нарушение активности ферментов антиоксидантной защиты на фоне повышения интенсивности гвободнорадикального окисления. Общим для обеих групп больных гледует считать значительное возрастание интенсивности кемшпоминесценции, повышение активности каталазы и пероксидазы, резкое снижение активности глутатионредуктазы. Именно низкая активность этого фермента отражает тяжесть течения болезни и

наблюдается у больных с микроангиопатиями.

При исследовании активности ферментов в эритроцитах больных с впервые выявленным сахарным диабетом установлено, что активность кагал азы и СОД в эритроцитах имела тенденцию к повышению, активность пероксидазы была достоверно повышена, а активность глутатионредуктазы была снижена в 3 раза.

На этом основании, по-видимому, полезно назначение на длительный срок антиоксидантов-витаминов, способных усиливать остаточную секрецию р-клеток и защищать организм от избыточного свободнорадикального окисления.

В настоящее время наряду с традиционными методами диагностики сахарного диабета применяются и неинвазивные. Эти методы безопасны, атравматичны, возможен их мониторинг и использование пациентами для самоконхроля (В.В. Меньшиков, 1997; Ю.М. Лопухин, 1997).

Мы использовали для нешшазивной диагностики сахарного диаьбета слезную жидкость.

В слезе здоровых лиц концентрация глюкозы составила 0,32±0,05 ммоль/л, что соответствует данным литературы (Van Haeringen et al., 1977). Известно, что неповрежденный эпителий роговицы и конъюнктивы обладает барьерной функцией для глюкозы (van Haeringen, 1981).

Нами было установлено, что при сахарном. диабете содержание глюкозы достоверно повышается как в крови, так и в слезе: в слезе больных сахарным диабетом I типа глюкоза повышается в 7 раз, в слезе больных сахарным диабетом II типа в 5 раз по сравнению с контролем (рис 2). Средний коэффициент кровь / слеза у здоровых лиц - 13,5, у больных сахарным диабетом - 5,5. Таким образом, выявлено, что у здоровых лиц барьер кровь-слеза пропускает меньшую часть, содержащейся в крови глюкозы. При гипергликемии пропускная способность -этого барьера несколько повышается, но все же большая часть глюкозы не попадает в слезу.

Нами установлено, что уровни лактата и пирувата в слезе и крови здоровых лиц существенно не отличаются (рис. 3).

14 т

Кровь

12

К 1 2 К 1 2

Рис. 2. Содержание глюкозы в слезной жидкости и крови больных сахарным диабетом. К - контроль,

1 - больные сахарным диабетом I типа,

2 - больные сахарным диабетом II типа.

Пировиноградная кислота Молочная кислота

К 1 К 1 К 1 К 1

5ис. 3. Содержание пировиноградной и молочной кислот в :лезной жидкости и крови больных сахарным диабетом. < - контроль,

[ - больные сахарным диабетом.

В слезной жидкости здоровых людей содержание лактата - 1.73±0.14 мкмоль/мл. У больных сахарным диабетом содержание молочной кислоты в слезе и крови было повышенным в 2 раза. Повышение концентрации молочной кислоты свидетельствует об усилении анаэробного распада глюкозы у больных сахарным диабетом.

Содержание пировиноградной кислоты в слезной жидкости здоровых лиц - 0,13 ± 0,01 мкмоль/мл. В слезе и крови больных сахарным диабетом содержание пировиноградной кислоты было повышено почти в 2 раза. Причин повышения пировиноградной кислоты несколько. Во-первых, у больных сахарным диабетом усилен глюконеогенез, о чем свидетельствует повышение выделения пировиноградной и других кетокислот с мочой в ночные часы (АЬтаЬашоуусЬ е1 а1., 1996). Во-вторых, у больных наблюдается снижение активности пируватдегидрогеназного комплекса в крови на фоне гипергликемии (Е. В. Плешанов с соавт., 1986). Возможно, снижение активности этого мультиферментного комплекса происходит и в тканях глаза.

Анализ слезы был использован нами для неинвазивной диагностики сахарного диабета у 35 больных. На основании полученных результатов были составлены и изданы методические рекомендации «Неинвазивная диагностика сахарного диабета с помощью анализа слезы».

Нами впервые был проведен хемилюминесцентный анализ слезной жидкости больных сахарным диабетом.

У больных сахарным диабетом I типа интенсивность хемилюминесценции повышена в 7,5 раз, у больных сахарным диабетом II типа в 2 раза по сравнению с контролем. У больных сахарным диабетом П типа с ангиоретинопатией интенсивность хемилюминесценции превышает контроль в 6,5 раза. Более резкое повышение интенсивности хемилюминесценции у больных сахарным диабетом I типа связано с абсолютным дефицитом инсулина и выраженной гипергликемией. Рост интенсивности хемилюминесценции слезы свидетельствует об усилении перекисного окисления липидов и необходимости включения ангиоксидантов в курс лечения этих больных.

Усиление процессов свободнорадикального окисления в слезе может

¡ыть вызвано дефицитом инсулина, гипоксией, гипергликемией. Высокая онцентрация глюкозы в слезе неизбежно ведет к усилению процессов ликозилирования основных белков тканей глаза, а стало быть, и к силенному образованию свободных форм кислорода. Сама глюкоза при толь высоком ее содержании неизбежно подвергается окислению «ферментативным путем с образованием свободных радикалов.

Интерес представляет изучение активности антаоксидантных юрментов слезы. В слезе здорового человека не определяется активность ЮД, кагалазы, глутатионредуктазы (ТегекЫпа, 1996). Из нтиоксидантных ферментов в слезе здоровых лиц выявлена активность ероксидазы. В группе обследованных нами доноров активность :ероксидазы оказалась достаточно высокой, у больных активность >ермента имела лишь тенденцию к повышению.

В слезе здоровых доноров содержание свободного холестерина ущественно ниже, чем в крови, что соответствует данным литературы Н.А.Терехина, Ю.АЛетрович, 1994). У обследованных нами больных олестерин в слезе оказался повышенпым в 2,3 раза. У этих пациентов :аблюдалась гиперхолестеринемия. Пропускная способность барьера ровь - слеза несколько повышается при гиперхолестеринемии. 1овышение холестерина при сахарном диабете связано с нарушением глеводного и липидного обмена, усилением образования ацетил-КоА, оторый является источником синтеза холестерина. (1 Тотт й а1., 1996). 1ричиной повышения концентрации холестерина в слезной жидкости южет быть усиленная мембранодеструкция, характерная для сахарного иабета.

Таким образом, при сахарном диабете происходит резкое усиление роцессов свободнорадикального окисления и изменение нтиоксидантной защиты. Изучение активности антиоксидантных »ерментов в эритроцитах при сахарном диабете в клинике и эксперименте озволило составить впечатление об антиоксидантной защите й екомендовать для лечения антиоксиданты.

Определение глюкозы, пировиноградной, молочной кислот в лезной жидкости больных сахарным диабетом может быть использовано с

целью неиивазивной диагностики сахарного диабета.

Анализ слезы может быть использован не только для диагностики сахарного диабета, но и для расшифровки патогенетических звеньев заболевания, оценки эффективности лечения. Взятие слезы полностью безболезненно, атравматнчно для человека, снижается риск заражения вирусными инфекциями. Способ прост, надежен, доступен рядовым клинико-биохимическим лабораториям.

Особую ценность анализ слезы представляет при многократных определениях в динамике заболевания.

Выводы

1. Повышение интенсивности хемшноминесценции в эритроцитах периферической крови и слезе больных сахарным диабетом, а также в эритроцитах крыс при аллоксановом диабете свидетельствует об усилении свободнорадикалыюго окисления при сахарном диабете.

2. О глубоком нарушении антиоксидантной защиты при сахарном диабете свидетельствует изменение активности всех изученных антцоксидантных ферментов, резкое снижение активности глухатионредуктгазы в эритроцитах периферической крови как в клинике, так и в эксперименте.

3. Установлена связь активности антиоксидантных ферментов эритроцитов с длительностью сахарного диабета. У больных с впервые выявленным сахарным диабетом повышена активность пероксидазы, резко снижена активность глугатионредукгазы, но не меняется активность каталазы и супероксиддисмутазы. У лиц длительно болеющих сахарным диабетом I и II типа отмечается компенсаторное повышение активности каталазы и пероксидазы. Снижение активности супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы свидетельствует об истощении антиоксидантной защиты у этих больных и необходимости применения антиоксидантов уже в дебюте заболевания.

4. В слезной жидкости больных сахарным диабетом отмечается повышение концентрации глюкозы, молочной, пировиноградной кислот, холестерина. Разработан способ неинвазивной диагностики сахарного

иабета. Целесообразно использование слезы как объекта исследования ля неинвазивной диагностики сахарного диабета и контроля за ффективностью лечения.

Практические рекомендации.

1. Учитывая усиление свободнорадикального окисления и изменение ктивносга антиоксидантных ферментов эритроцитов периферической рови больных сахарным диабетом, полезным является включение нтиоксидантов в комплексную терапию этого заболевания.

2. Биохимический анализ слезной жидкости может быть екомендован как способ неинвазивной диагностики сахарного диабета, ля контроля за течением болезни, эффективностью лечения.

Список трудов, опубликованных по теме диссертации.

. Активность каталазы слезы при офтальмогерпесе // Тез. докладов XLI итоговой студенческой научной конференции.-М., 1993.-С. 31 (в соавт. с Сосниным Д.Ю.

. Активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах периферической крови при аллоксановом диабете // Матер, научной конф.: Достижения медбиофизики и клинической биохимии - в практику здравоохранения.-Киров, 1995.-С. 34-35 (в соавт. с Терёхиной H.A., Хоробрых Т.П.).

. Биохимический анализ слезы при сахарном диабете // Матер, научной конф.: Актуальные проблемы современной биохимии.-Киров, 1996.-С. 52.

. Активность антиоксидантных ферментов крови при экспериментальном сахарном диабете // Тез. докл.: Преподавание в медицинском ВУЗе вопросов профилактики здоровья и его реабилитации.-Пермь, 1996.-С. 69-70 (в соавт. с Терёхиной H.A., Хоробрых Т.П.). . Свободнорадикальное окисление и активность некоторых ферментов антиоксидантной защиты при экспериментальном сахарном диабете // Тез. докл. научно-практической конф. молодых ученых Пермской мед. академии.-Пермь, 1996.-С. 30-31.

6. Активность шггиоксиданшых ферментов эритроцитов у больных декомпенсированным сахарным диабетом // Тез. докл. науч. сессии 1996 г. Пермской мед. академии.-Пермь, 1996.-№ 50 (в соавт. с Хоробрых Т.П.).

7. Холестерин слезы в норме и патологии // Тез. докл. науч. сессии 1997 г. Пермской мед. академии.-Пермь, 1997.-№ 50 (в соавт. с Терёхиной H.A., Караваевым В.Г.).

8. Хемилюминесцентный анализ слезы в норме и патологии // Тез. докл. науч. сессии 1997 г. Пермской мед. академии.-Пермь, 1997 .-№ 53 (в соавт. с Соловьевой Л.И., Терёхиной H.A., Веретенниковой Л.Г.).

9. Активность глутатионредуктазы в эритроцитах периферической крови при сахарном диабете // Тез. докл. науч. сессии 1997 г. Пермской мед. академии.-Пермь, 1997,- № 73 (в соавт. с Хоробрых Т.П.).

Ю.Ннтенсивность хемилюминесценции эритроцитов периферической крови больных сахарным диабетом // Тез. докл. научно-практической конф. молодых ученых Пермской мед. академии.-Пермь, 1997.-С. 7172.

11.Анализ слезы в диагностике сахарного диабета // Тез. докл. 3-го симп.: Неинвазивная диагностика.-М., 1997.-С.11-12 (в соавт. с Терёхиной H.A.).

12.Изменение антиоксидантной защиты при сахарном диабете // Тез. докл. Всероссийской научно-пракг. конф.: Актуальные вопросы эндокринологии.-Пермь, 1997.-С.47 (в соавт. с Терёхиной H.A.).

13.Неинвазивная диагностика сахарного диабета с помощью анализа слезы / Метод. рекомендации.-Пермь, 1998.-8 с. (в соавт. с Терёхиной H.A.)

14.Неинвазивная диагностика сахарного диабета // Пермский мед. журнал.-1998.-№ 1.-С. (в соавт. с Терёхиной H.A.)