Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клинико-биохимическое и экспериментальное изучение степени гликозилирования гликопротеинов сыворотки крови и его функционального значения

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клинико-биохимическое и экспериментальное изучение степени гликозилирования гликопротеинов сыворотки крови и его функционального значения"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

На правах рукописи УДК 612.1 -.612.398.145.3

ШИЛИНА НАТАЛИЯ МИХАЙЛОВНА

КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СТЕПЕНИ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ ГЛИКОПРОТЕИНОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ И ЕГО ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ЗНАЧЕНИЯ

(03.00.04 - биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в лаборатории по изучению питания здоровых детей Научно-исследовательского института питания РАМН

Научный руководитель

член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор И.Я. КОНЬ

Официальные оппоненты:

член-корр. PATH,

доктор биологических наук, профессор В.Б. Спиричев

доктор медицинских наук, профессор И.Н.Марокко

Ведущая организация:

Институт биологической и медицинской химии РАМН

Защита диссертации состоится .1996 г. в_ч

на заседании Диссертационного совета (Д.001.02.01) при НИИ питания РАМН по адресу: 109240 Москва, Устьинский пр., 2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ питания РАМН Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

В.М. Жминченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гликопротеины (ГП) принадлежат к числу широко распространенных в организме человека и животных соединений. Они участвуют в построении клеточных и субклеточных мембран, образуют основу гликокаликса и слизистых секретов; к ним относятся многие ферменты и гормоны [Хьюз Р, 1985; Bio) М. et al., 1987; Тутельян В.А.,1992]. ГП играют особую роль в процессах клеточного узнавания и межклеточного взаимодействия, в свою очередь лежащих в основе таких ключевых биологических процессов, как клеточная пролиферация и дифференцировка, органогенез, иммунный ответ. Изменениям ГП клеточных поверхностей приписывают важную роль в процессах канцерогенеза [Sharon N., 1981,1995: Shauer R.,1995]. Значительный интерес представляет проблема влияния на строение и метаболизм ГП алиментарных факторов, в том числе таких, как белки [Wood N. et al., 1980], углеводы [Tepperman Н.М. et al.,1981;Biol M.C. et al.,1981], жирорастворимые витамины [De Luca L., 1984,1991; Wolf G., 1984; Спиричев В.Б., Конь И.Я.,1989], микроэлементы [Philip В. et al., 1978].

Участие ГП в реализации многих биологически важных функций и изменение их метаболизма при ряде патологических состояний предопределяет значительный интерес исследователей к изучению различных аспектов проблемы ГП, выделившейся в последние годы в самостоятельный раздел биохимии - гликобиологию [Sharon N., 1981,1995; Shauer R.,1995; Dwek R. and Quiocho F., 1991; Габриэлян Н.Д., 1989,1995]. Важное место при этом занимает вопрос о структуре и функции олигосахаридных цепей ГП, которым приписывают участие в определении таких важных физико-химических свойств ГП, как поверхностный заряд их молекул, особенности конформации, растворимость, а также в защите ГП от неконтролируемого протеолиза и ошибочного процессинга, их внутриклеточном транспорте и др.[ОЫеп К. et al., 1985; Biol М. et al., 1987; Enns С. et al., 1995] Однако, функциональная роль гликановых цепей остается мало изученной, и в значительной мере сводится к представлению о том, что десиалирование ГП ведет к их захвату специфическими асиало-ГП-рецепторами печени и удалению из кровотока [Ashwell G.,1974; Gregoriadis G., 1984]. Установлено также, что при остром воспалении увеличение в крови общего содержания белков острой фазы сопряжено со снижением степени их гликозилирования [Raynes J., 1982]. Изменения степени гликозилирования ГП крови обнаружены и при таких патологических состояниях, как алкогольный цирроз печени [Jezequel М. et al., 1988], ревматоидный артрит [Raynes J., 1982], онкологические заболевания [Новикова Л.И., Алешкин В.А.,1991]. Однако, причины и возможное

функциональное значение выявленных изменений степени гликозилирования ГП крови остаются практически неизученными.

Исходя из изложенного, представляет значительный интерес оценка возможных нарушений степени гликозилирования ГП крови при некоторых физиологических и патологических состояниях у человека, связанных с изменением скорости роста и клеточной дифференцировки (беременность; гипотрофия и недоношенность у детей), а также в экспериментах на животных, сопряженных с нарушением синтеза белков и, в том числе, ГП в печени - основном органе синтеза сывороточных ГП (интоксикация бромбензолом, радиационное поражение).

Изучение ГП крови представляется особенно актуальным с учетом таких важных и разнообразных функций, которые выполняют эти биомолекулы, как участие в свертывании крови, ингибировании активности протеаз, транспорте липидов, витаминов, гормонов, металлов, лекарственных веществ и т.д.[Кухта В.К. и др., 1986; Biol M. et al., 1987), и значительных изменений в их содержании и строении при ряде патологических состояний (инфекции, наследственные энзимопатии, аллергические реакции [Martinez J., 1987; Tun J. et al.,1995; Марокко И.Н., 1989].

Среди различных ГП крови важное место занимают трансферрин и орозомукоид (ai -кислый ГП). Трансферрин играет центральную роль в транспорте железа в организме, осуществляя перенос ионов железа от участков их адсорбции в желудочно-кишечном тракте к местам депонирования (печень, костный мозг и другие кроветворные органы) и утилизации (различные периферические ткани организма) [van Eijk H.G.,De Jong G. et al., 1990, 1992]. Вместе с тем, он обладает значительной рост-стимулирующей и антиоксидантной активностью [Gutteridge J.M.C.,1986; McCarthy В.М. et al., 1987; Djeha A. et al.,1993; Hamlin G.P. et al., 1995]. Орозомукоид, относящийся к числу белков острой фазы, проявляет выраженные иммуномодулирующие свойства[Веппе!1 M. et al., 1980; Cheresh D.A., 1984; Shiyan S.D. et al., 1995]. Гликановые цепи, входящие в состав обоих белков, составляют существенный и значимый структурный компонент этих ГП. Однако, их роль в реализации функций транеферрина и ai - кислого ГП остается практически не исследованной и требует дальнейшего изучения в качестве одного из подходов к расшифровке механизмов биологической активности этих функционально важных белков крови.

Цель и задачи исследования. Цель работы: 1) исследовать степень гликозилирования суммарных ГП сыворотки крови, а также транеферрина и ai - кислого ГП при некоторых физиологических и патологических состояниях, связанных с изменением скорости роста и клеточной дифференцировки у человека, а также патологических состояниях,

сопровождающихся нарушением синтеза белка в печени, у экспериментальных животных; 2) изучить возможное функциональное значение степени гликозилирования ГП.

Исходя из этого были поставлены следующие задачи:

1. Изучить содержание и степень гликозилирования суммарных ГП сыворотки крови при беременности - физиологическом состоянии, характеризующемся перестройкой иммунной системы матери в ответ на пролиферацию и дифференцировку тканей плода; а также при недоношенности и гипотрофии у детей первых месяцев жизни - патологических состояниях, отражающих, соответственно, физиологическую незрелость и нарушения роста вследствие недостаточного питания.

2. Разработать электрофоретнческий метод, позволяющий корректно судить о содержании и степени гликозилирования трансферрина сыворотки крови.

3. Изучить влияние указанных состояний на содержание в крови и гликозилирование трансферрина и орозомукоида.

4. Изучить содержание трансферрина сыворотки крови и степень его гликозилирования в экспериментальных условиях, моделирующих токсическое (интоксикация бромбензолом) и радиационное поражение белок-синтезирующих систем печени.

5. Выделить препараты трансферрина, обладающие различной степенью сиалирования, и изучить их влияние на антиоксидантную активность и рост-стимулирующую функцию этого ГП в модельных системах in vitro (клетки костного мозга и желточные липопротеины).

Научная новизна работы.

Доказано наличие прямой корреляции между сроком беременности и содержанием в крови фракции орозомукоида, не реагирующей с конканавалином А.

Впервые показано, что у детей первых месяцев жизни с гипотрофией и недоношенных новорожденных увеличивается степень гликозилирования трансферрина по сравнению со здоровыми новорожденными.

Получены приоритетные данные о снижении гликозилирования трансферрина в позднем пострадиационном периоде и уменьшении степени гликозилирования трансферрина на фоне резкого увеличения его общего содержания под влиянием цинк-металлотионеина у мышей.

Впервые установлено, что рост-стимулирующая и антиоксидантная активность трансферрина in vitro зависит от степени его сиалирования.

На основании проведенных клинико-биохимических и экспериментальных исследований выдвинуто положение об изменении степени гликозилирования ГП сыворотки крови при ряде физиологических и патологических состояний у человека и животных (беременность;

недоношенность и гипотрофия, радиационное поражение) и относительной независимости регуляции метаболизма полипептидных и гликановых цепей ГП.

Научно-практическая значимость.

Полученные в работе данные о нарушении уровня белков и гликозилирования ГП сыворотки крови у недоношенных детей и детей с гипотрофией способствуют раскрытию механизмов патогенеза данных состояний и разработке методов их коррекции, в том числе диетической. Изучение степени гликозилирования ГП сыворотки крови может быть использовано для разработки дополнительного диагностического и прогностического теста при оценке тяжести лучевой болезни, а также гипотрофии и недоношенности у детей.

Основные положения диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре медицинской химии с курсом клинической биохимии ММСИ. Разработан количественный электрофоретический метод определения содержания и степени гликозилирования ТФ сыворотки крови, который может найти применение в клинико-диагностической практике. Получено удостоверение на рационализаторское предложение"Количественная оценка электрофореграмм, полученных после электрофореза в полиакриламидном геле" № 37/87-6 .

Обнаруженные в работе особенности антиоксидантного действия трансферрина с различной степенью сиалирования способствуют пониманию механизмов влияния трансферрина на перекисное окисление липидов.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Всероссийской конференции "Действие ионизирующей радиации на иммунную и кроветворную системы"(Москва, ноябрь 1995), на межлабораторной конференции НИИ питания РАМН и на семинаре лаборатории химии углеводов НИИ биоорганической химии РАН.

Публикации. Материалы исследований изложены в 6 печатных работах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей изложение методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего источников. Работа изложена на страницах и включает таблиц и рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинико-биохимические исследования были проведены у 93 беременных женщин г. Москвы и г. Жиздры (Калужская обл.) и 30 недоношенных новорожденных и детей первых месяцев жизни с гипотрофией (отделения хирургии новорожденных детской

городской клинической больницы Ка2 им. Русакова, недоношенных детей Института педиатрии РАМН и новорожденных детей МОНИИАГ). Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Вистар массой 300 г и мышах-самцах (CBAxCs7B1)Fi массой 24-28 г (около 200 животных), содержавшихся на натуральном общевиварном рационе. Общая схема проведения клинико-биохимических и экспериментальных исследований в условиях in vivo приведена на рис. 1.

Содержание и степень гликозилирования суммарных ГП в крови определяли с помощью горизонтального электрофореза в 3,5 % полиакриламидном геле на приборе "Multiphor" (LKB, Швеция) в 0,2 М трис-глициновом буфере, рН 8,9. Белковые зоны на электрофореграммах окрашивали амидочерным 10Б или Кумасси G-250 [Гааль Э. и др., 1982], ГП - реактивом Шиффа [Нойбергер А. и др., 1969]. Гель сканировали на приборе "Chromoscan Joyce-Loebl" (Великобритания). "Содержание белка" или "Содержание углеводов" (после окрашивания электрофореграмм амидочерным или реактивом Шиффа, соответственно) в суммарной фракции ГП сыворотки (площади пиков всех белков сыворотки за вычетом альбумина) выражали в относительных единицах: площадь пика (см!) на 1 мкг общего белка сыворотки (плазмы) крови, внесенной в трек. Степень гликозилирования суммарных ГП (в относительных единицах) рассчитывали по формуле: Содержание углеводов (отн. ед.)

Содержание белка (отн. ед.)

Для определения в аналогичных условиях содержания и степени гликозилирования трансферрина (ТФ) нами были проведены эксперименты по разработке количественного метода определения этого белка. Они включали 1) идентификацию ТФ на электрофореграммах плазмы крови крыс и мышей (литературные данные по этому вопросу отсутствуют) и 2) подтверждение возможности количественной оценки общего содержания ТФ и его углеводного компонента с помощью окрашивания электрофореграмм амидочерным 10Б или реактивом Шиффа с их последующей денситометрией. Для идентификации ТФ на электрофореграммах плазмы крови мышей мы использовали два непрямых подхода: а) сопоставление электрофоретической картины белков плазмы крови и относительной подвижности ТФ мышей и крыс по отношению к другим белкам плазмы с электрофоретической картиной белков и подвижностью ТФ плазмы крови человека; б) удаление практически всех глобулинов плазмы крови, кроме ТФ, с помощью их последовательного осаждения вначале риванолом (0,3 Io о), а затем этанолом (25° о) [Boettcher E.W. et al., 1985]. При этом ТФ оставался в растворе и его зона четко выявлялась на электрофореграммах. "Содержание белка", "Содержание углеводов" и "Степень гликозилирования" ТФ плазмы крови животных определяли так же, как в

Рис. I. СХЕМА КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКИХ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ IN VIVO.

случае суммарных ГП. Наблюдалась строгая корреляция между количеством общего белка плазмы крови, внесенного в электрофоретический трек (в диапазоне 100-600 мкг) и содержанием ТФ, а также содержанием углеводов во фракции ТФ (г=0,968 и 0,990, соответственно). При определении содержания ТФ электрофоретическим методом полученные значения "Содержания белка" пересчитывали в абсолютную концентрацию ТФ в сыворотке (плазме), в мг/мл, исходя из калибровочной кривой, построенной по стандартным коммерческим препаратам ТФ человека.

Микрогетерогенность орозомукоида (ai-кислого ГП) в сыворотке крови беременных женщин определяли методом перекрестного аффинного иммуноэлектрофореза (ПАИЭФ) с конканавалином А (Кон А) по [Bog-Hansen Т.С. et al.,1975] с модификациями [Новикова Л.И. и др., 1991]. Концентрацию а,-кГП и ТФ в сыворотке крови определяли методом РИД по [Manchini С. et al„ 1965].

Изучение поздних эффектов общего у-облучения проводили у мышей, выживших через 30 дней после облучения радиоактивным цезием (l37Cs) на установке ИГУР (мощность дозы 1,74 Гр/мин) в ГНЦ РФ - Институте биофизики. Плазму крови животных исследовали в соответствии со схемой (рис. 1).

Токсическое действие бромбензола изучали на мышах, вводя его внутрибрюшинно животным в дозе 0,5 - 2 г/кг (ЛД5о= 3,55 + 0,05 г/кг) в 0,2 - 0,4 мл вазелинового масла. Отдельной группе мышей за 10-15 минут до введения бромбензола (2 г/кг) вводили цинк-металлотионенн* (цинк-МТ) - низкомолекулярный белок из группы МТ. Эти белки обладают защитным действием при интоксикациях, вследствие способности связывать ионы тяжелых металлов и нормализовывать уровень тиоловых групп и процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях [Sharma В.К. et al., 1990; Котервв А.Н. и др.,1995]. Цинк-МТ вводили в дозе 1-4 мг/кг, в 0,2 - 0,3 мл 10 мМ трис-HCi, рН 7,4. Контрольные животные получали только цинк-МТ. Через I сутки после начала опыта животных забивали декапитацией, получали плазму крови и дальнейшие исследования проводили по схеме (рис. 1).

Экспериментальные исследования in vitro по изучению влияния степени сиалирования ТФ на его антиоксидантную активность (подавление образования ТБК**-активных продуктов с помощью апоТФ) и рост-стимулирующую функцию (стимуляция репликативного синтеза ДНК с помощью 2РеТФ) проводили на суспензиях клеток костного мозга крыс и желточных липопротеинов.

^Препарат цинк-МТ из печени крыс любезно предоставлен к.б.н. А.Н. Котеровым (Государственный Научный Центр РФ - Институт биофизики, Москва).

**ТБК - тиобарбитуровая кислота

Препараты ТФ человека с различной степенью сиалирования получали хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе по [Regoeczi Е. et al., 1977; Chung М.С.-М. et al.,1985] с модификациями. Эксперименты проводили при 4°С. Коммерческий препарат ТФ человека, предварительно насыщенный ионами Fe3t (инкубацией в 10 мМ трис-НС1 буфере, рН 8,0, содержащем 0,2 М NaHCOj, 0,1 М цитрат натрия и 10 мМ FeCb) и очищенный от избытка соли железа (диализом против "стандартного буфера " - 20 мМ трис-HCI, рН 8,0, и 10 мМ NaCl в этом же буфере), наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (4,2 х 8,2 см), уравновешенную 10 мМ NaCl в стандартном буфере. Колонку элюировали линейным градиентом концентрации NaCl в стандартном буфере. Фракции, соответствующие двум основным формам ТФ (ТФ 1 и ТФ 2), объединяли и концентрировали ультрафильтрацией. В препаратах ТФ определяли: содержание сиаловой кислоты по методу [Warren L.,1953], содержание железа - фенантролиновым методом [Балаховский С.Д. и др., 1953]. Для получения апоТФ препараты диализовали сутки против 20 мМ цитратного буфера, рН 4,4 [De Jong G. et al.,1990] и, затем, сутки против двух смен 10 мМ NaCl в стандартном буфере.

Суспензию клеток костного мозга (КМ) получали из бедренных костей крыс, гомогенизировали, пропуская через иглу № 8, от шприца и подсчитывали в камере Горяева общее число клеток КМ, а в аликвоте суспензии, помещенной в 5% уксусную кислоту, количество ядросодержащих клеток [Котеров А.Н. и др., 1993]. Жизнеспособность клеточной популяции определяли по прокрашиванию 0,1% раствором эозина. Суспензию желточных липопротеинов (ЖЛП) получали по методу [Клебанов Г.И. и др., 1988] с модификациями.

Определение репликативного синтеза ДНК в клетках КМ крыс оценивали по включению [3Н]-тимидина [Koterov A.N. et al., 1992] после инкубации проб 45 мин при 37°С. Пробы включали клетки КМ (2,5 -15 х106 ядросодержащих клеток в пробе) и 13,3 мкЮо [3Н]-тимидина.

Об интенсивности ПОЛ* судили по накоплению в исследуемых объектах ТБК-активных продуктов (МДА**)[Рошре11а A. et al.,1987; Каган В.Е. и др., 1986].

Для индукции ПОЛ в пробы, содержащие либо клетки КМ (0,75-1,8x10'/ мл) в 0,15 М NaCl, либо 100 мкл суспензии ЖЛП в стандартном буфере, добавляли ADP или аскорбат и свежеприготовленный FeCU в различной концентрации. После окончания инкубации (при 37"С) в пробы добавляли смесь антиоксидантов - 0,25М ЭДТА и 20 мМ бутилокситолуол, затем ТХУ, перемешивали и центрифугировали 15 мин при 3 000 g. В

* - ПОЛ - перекисное окисление липидов; **- МДА- малоновый диальдегид

надосадочной жидкости определяли содержание МДА , добавляя в пробы с ЖЛП 2 мл 0,9%-ого раствора ТЕК в воде, а в пробы с клетками КМ - 1,5 мл 0,9%-й ТБК в 50" о (по объему) уксусной кислоте.

Уровень ТБК-активных продуктов (МДА) исследовали спектрофотометрически при 532 нм после инкубации проб с ТБК [Jagi К., 1976]. Концентрацию веществ, реагирующих с ТБК, рассчитывали, исходя из Еззг аддукта МДА-2ТБК, равного 1,56 х105М 'х см1 [Стальная И.Д. и др., 1977].

Содержание белка определяли с кумасси G-250 [Spector Т., 1978].

Статистическую обработку результатов осуществляли по t критерию Стьюдента-Фишера [Урбах В.Ю.,1975]. На рисунках и в таблицах представлены М±ш. Расчет коэффициентов линейной корреляции производили на компьютере с использованием программы "Quattro-Pro, v. 1.0" (Borland).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клинико-биохимические исследования.

1.1. Изучение содержания суммарных гликопротеинов и степени их гликозилирования в сыворотке крови беременных женщин, недоношенных детей и детей с гипотрофией.

Результаты электрофоретического изучения содержания и степени гликозилирования суммарных ГП в крови беременных женщин, недоношенных детей (31-36 недель гестации) и детей с гипотрофией (в возрасте 1-1,5 месяца) приведены в таблице 1. Как видно из таблицы, суммарное содержание ГП значительно возрастало при беременности (на 97% по сравнению с небеременными женщинами детородного возраста) и достоверно снижалось при гипотрофии и недоношенности у детей (на 29°, о и 19% соответственно, по сравнению со здоровыми детьми). В то же время, гликозилирование суммарных ГП во всех случаях возрастало, однако, при этом, в случае беременности стецень увеличения гликозилирования отставала от степени увеличения содержания общего белка ГП, тогда как при недоношенности и гипотрофии, напротив, была существенно выше. Эти данные могут рассматриваться как новое экспериментальное доказательство возможности присутствия в крови человека ГП с измененной степенью гликозилирования.

1.2. Изучение содержания и степени гликозилирования трансферрина в сыворотке крови беременных женщин, недоношенных детей и детей с гипотрофией.

Использование того же подхода, что и в случае суммарных ГП (рис. I), для изучения сывороточного ТФ, играющего важную роль в транспорте железа и регуляции клеточного роста у младенцев, показало (таблица 2), что степень гликозилирования ТФ существенно

Таблица 1. Содержание и степень гликозилирования суммарных ГП сыворотки крови при некоторых физиологических и патологических состояниях у женщин и детей раннего возраста, относительные единицы и 0 о от контроля, (М±т).

Состояние Содержание белка во фракции суммарных ГП сыворотки крови Степень гликозилирования суммарных ГП сыворотки крови

Контроль Опыт % Контроль Опыт %

Беременность 1,47 ±0,15 2,89 ± 0,39 197 ±27** (п=9) 0.78 ±0,13 1,24 + 0,16 159 ±21* (п=7)

Недоношенные дети 0,26 ± 0,02 0,18 + 0,01 71 ± 3** (п=11) 0,48 ± 0,03 0,51 + 0,02 107 ±4 (п=7)

Гипотрофия у детей 0,19 ±0,01 0,15 ±0,01 81 ±4* (п=9) 0,45 ± 0,03 0,57 ± 0,03 128 ±7* (п=8)

* - р<0,05; ** - р<0.01 по сравнению с контролем

возрастала при беременности у женщин, у недоношенных детей и детей с гипотрофией (на 57%, 74% и 37°Ь по сравнению с контролем соответственно).

Таблица 2. Содержание и степень гликозилирования ТФ сыворотки крови у беременных _женщин, недоношенных детей и детей с гипотрофией, % от контроля_

Состояние Содержание ТФ в сыворотке крови Удельное гликозилирование ТФ

Беременность 171 ± 22* (п=10) 157 ± 18 * (п=3)

Недоношенные дети 104 ± 9 (п=24) 174 ± 17**(п=13)

Гипотрофия у детей 75 ± 3** (п= 14) 137 ± 14 * (п=7)

* - Р<0,05; ** - Р<0,01 по сравнению с контролем

Содержание ТФ было существенно выше контрольного при беременности (171° о), достоверно (на 25%) ниже такового у детей с гипотрофией и не менялось у недоношенных детей. Обращает на себя внимание идентичное изменение изученных показателей для суммарных ГП и ТФ при беременности и гипотрофии (табл.1 и 2) и его однонаправленный характер у недоношенных детей. Повышение степени гликозилирования ТФ при беременности, коррелирующее с увеличенным транспортом железа через плаценту [De Jong G. et al„ 1990], способствует, по-видимому, созданию его запасов в организме плода и предупреждению в дальнейшем железодефицитных анемий у детей. Заслуживает дальнейшего изучения впервые выявленный факт увеличения степени гликозилирования ТФ у недоношенных детей, согласующийся с известными данными о гиперсиалировании фибриногена у недоношенных [Martinez J. et а!., 1987] и позволяющий предполагать известную универсальность обнаруженных изменении в степени гликозилирования белков крови, отражающих, очевидно, их функциональную незрелость у недоношенных детей. Что касается усиления гликозилирования ГП при гипотрофии, характеризующейся существенным дефицитом белка, то в ее основе может лежать повышение активности гликозилтрансфераз в печени, обнаруженное у животных при дефиците белка в их рационе [Wood N. et ah, 1980].

1.3. Изучение микрогетерогенности орозомукоида при беременности у женщин.

Для суждения о степени гликозилирования орозомукоида (он - кислого ГП, ai -кГП) использовали ПАИЭФ с конканавалином А (Кон А), позволяющий выявлять микрогетерогенные компоненты ГП, различающиеся по их сродству к пектину (Кон А), вследствие различий в строении их углеводных цепей (Новикова Л.И. и др., 1991).

Установлено, что для небеременных женщин (контроль) характерно наличие двух пиков на иммуноаффиноэлектрофореграммах: пик 1 - фракция ai -кГП, не реагирующая с Кон А и пик 2 - фракция ГП, имеющая сродство к лектину. Срок беременности не влиял

ни на общее содержание в крови, ни на количество пиков орозомукоида, выявляемых с

помощью ПАИЭФ . В то же время, как видно из таблицы, с увеличением срока

беременности существенно меняется соотношение пиков 1 и 2.

Таблица З.Относительная доля фракций а| -кГП с различным сродством к Кон А в крови женщин на разных сроках беременности (в процентах от общей

Группы Количество образцов Пик 2 Пик 1

Контроль 6 49,6±1,0 50,4+1,0

1 триместр 7 47,8±4,9 52,2±4,8

II триместр 10 32,8±2,3* 67,1 ±1,7**

Ш триместр 10 23,6±|,5** 75,4± 1,5*

* - р<0,01; ** - р<0,001 по сравнению с контролем Пик I - фракция ai -кГП, не реагирующая с Кон А; Пик 2 - фракция ai -кГП, реагирующая с Кон А

В сыворотке небеременных женщин и женщин на I триместре беременности распределение ai -кГП между двумя фракциями примерно одинаково; ко II триместру содержание пика 2 снижается до 66% от контроля. В то же время, доля пика 1 возрастает на 33% по сравнению с контролем. В III триместре эти изменения в соотношении пиков становятся еще более выраженными. Выявлена высокая степень корреляции (г=+0,87, п=25) между сроком беременности (в неделях) и относительным содержанием фракции ai -кГП, не реагирующей с Кон А. Это позволяет предполагать существование причинной связи между беременностью и изменением олигосахаридной структуры этого ГП. Возможно, увеличение относительного содержания пика 1 говорит об усложнении строения углеводных цепей орозомукоида [Bierhuizen М. et al., 1988; Biou D., 1987]. Учитывая данные об участии углеводных компонентов ai -кГП в реализации его иммуносупрессивных свойств [Bennett М. et al.,1980; Cheresh D.A. et al., 1984], можно предположить, что обнаруженные изменения в структуре олигосахаридных цепей этого ГП вносят свой вклад в известный факт изменений иммунного ответа при беременности.

2. Экспериментальные исследования in vivo.

2.1. Изучение содержания и степени гликозилирования трансферрина в плазме крови при облучении.

ТФ, как переносчик железа, является необходимым фактором роста гем-синтезирующих клеток эритроидного ряда, которые в значительной степени

повреждаются под влиянием ионизирующего облучения. Однако, вопрос о влиянии облучения на уровень ТФ мало изучен, а сведения о возможных изменениях в пострадиационный период структуры его углеводных цепей отсутствуют вовсе. В связи с этим изучено содержание и степень гликозилирования ТФ плазмы крови мышей, выживших через 30 дней после общего гамма- облучения l3'Cs. Выживаемость для дозы 775 рад составила 59%, 825 рад - 16% и 900 рад - 7% от общего числа облученных мышей. Обнаружено существенное дозо-зависимое снижение содержания и степени гликозилирования ТФ сыворотки крови облученных мышей (рис. 2 а,б), причем из двух субфракций ТФ, выявленных на электрофореграммах у мышей, наибольшую чувствительность к действию радиации проявляла более подвижная фракция - ТФ 2 (рис. 2), содержание которой снижалось на 35% уже при облучении в дозе 775 рад; уровень ТФ 1 при этом не менялся. При максимальной дозе облучения (900 рад) уровень обеих фракций снижался в равной степени (до 29% от контроля). Содержание общего белка в сыворотке крови менялось не значительно (на 19% при максимальной дозе облучения), что указывает на существенно более высокую чувствительность ТФ, чем суммарного белка плазмы к действию облучения. Снижение гликозилирования было выражено практически одинаково в случае обеих фракций ТФ (рис.2, б). Угнетение гликозилирования ТФ под влиянием ионизирующей радиации (или нарушение его восстановления после прекращения действия облучения) происходит, следовательно, в большей степени, чем угнетение синтеза полипептидных цепей (или нарушение его восстановления): при дозе 82S рад уровень ТФ был снижен на 28% от контроля, а степень гликозилирования -более, чем на 60%. Таким образом, выявлено длительно сохраняющееся пострадиационное снижение уровня и степени гликозилирования ТФ. Можно полагать, что в основе этих нарушений лежит радиационное повреждение как синтеза белковой

контролл СЛ

Ч/ А ■ 1-si

мзэа облучения, рад Степень глш<оэ1!Лнровсания 'I'*1. Î от контроля

/ / I_1_1_

У/ '»со -

Доза облучения, рад

Рис.2. Содержание ТФ (а) и степень его гликозилирования (б) в плазме крови мышей через 30 дней после облучения.. а - содержание объединенной фракции ТФ (1); ТФ 1 (2) и ТФ 2 (3); б - степень гликозилирования объединенной фрациии ТФ (поскольку снижение гликолишрования было ыражено практически одинаково для обеих фракций ТФ, на рис. представлена только одна кривая для объединенной фракции этого белка). * - р<0,05 по сравнению с контролем

части ТФ [Кучеренко Н.Е. и др., 1975], так и процессинга его олигосахаридных цепей. Следствием снижения гликозилирования ТФ может быть нарушение его функциональных свойств, в частности, способности к транспорту ионов железа в гем-синтезирующие клетки. Можно предположить, что именно этим обусловлены отмеченные ранее пострадиационные нарушения в системе кроветворения [Чертков К.С. и др., 1994], длительно (в течение месяцев) сохраняющиеся после окончания действия облучения.

2.2. Изучение содержания трансферрина и степени его гликозилирования при интоксикации бромбензолом в сочетании с введением цинк-металлотионеина.

Введение бромбензола (ББ) - ксенобиотика, индуцирующего свободно-радикальное окисление в тканях и вызывающего угнетение синтеза белка в печени [РотреПа А. « а1., 1987; Сотрогп М., 1987], существенно (на 50% от контроля при дозе ББ 1,5 г/кг) уменьшало содержание ТФ в плазме крови мышей. Концентрация общего белка в плазме изменялась при этом незначительно, что указывает на определенную специфичность в действии ББ на ТФ крови. Введение цинк-МТ как интактным мышам (рис.3, а), так и мышам, получавшим ББ, резко повышало уровень ТФ в крови, причем содержание ТФ в крови даже у мышей, получавших бромбензол (2 мг/кг массы тела), при введении цинк-МТ существенно (почти в 2 раза) превышало его уровень у интактных мышей. Эффект

цинк-МТ не был связан с механическим объединением в его составе цинка и цистеина, поскольку введение животным с интоксикацией ББ смеси, моделирующей состав этого белка (сывороточный альбумин человека, цистеин и цинк [Котеров А.Н. и др., 1993]), в дозе, соответствующей 4 мг/кг цинк-МТ, не приводило к увеличению содержания ТФ. По-видимому, цистеин и ионы цинка обладают большей биологической активностью в составе цинк-МТ, который возможно стимулирует синтез ТФ либо через активацию

..едениЯНииК-МТ»до1е1<1),2(2)и4 цинком белков-регуляторов экспрессии генов ТФ,

мг/кг (3), к- контроль. По оси либо через донацию тиоловых групп, необходимых

ординат - уровень показателей, % от

ишакиюго контроля для синтеза ТФ.

В отличие от общего уровня ТФ, степень его гликозилирования после инъекции цинк-МТ, напротив, существенно снижалась (до 50% и 37% от контроля при дозе цинк-МТ 2 и 4

гЬ

Й

Ш.

к I г з к I г з

а п

Рис.3. Содержание ТФ (а) и степень его гликожгирования (6) вплагме крови мышей через сутки после

мг/кг, соответственно, рис. 3, б). Аналогичная ситуация была обнаружена ранее нами при изучении влияния на состав ГП дефицита витамина А, а также при изучении другими авторами степени гликозилирования белков острой фазы, уровень которых в крови существенно увеличивается при различных видах воспаления. В связи с этим можно полагать, что появление в крови при указанных состояниях слабо гликозилированного ТФ обусловлено меньшей скоростью индукции систем его гликозилирования по сравнению с системами синтеза полипептидных цепей этого ГП.

3. Изучение in vitro возможной роли гликановых цепей в реализации биологических свойств трансферрина.

Данный раздел работы был направлен на исследование возможной роли гликановых цепей ТФ в проявлении некоторых ключевых биологических функций белка, в качестве которых были избраны ростовая и антиокислительная функции. Основным методическим подходом служило хроматографическое выделение двух изоформ ТФ с различной степенью гликозилирования (сиалирования) и сравнительное изучение влияния этих форм ТФ I) на пролиферацию клеток костного мозга - как тест на ростовую активность этого белка и 2) на содержание МДА - как тест на интенсивность ПОЛ.

3.1. Выделение и характеристика препаратов трансферрина сыворотки крови человека с различной степенью гликозилирования (сиалирования).

Результаты разделения коммерческого препарата ТФ человека с помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе на изоформы с различной степенью сиалирования приведены на рис. 4. Как видно из рисунка, при элюции с колонки ТФ градиентом концентрации NaCl было выявлено два основных пика - 2Fe-T® 1 (фракции №17-20) и 2Fe-TO 2 (фракции №22-26). Электрофорез выделенных форм ТФ в присутствии Ds-Na [Laemmli U.K.., 1970] не выявил разницы в их электрофоретической подвижности по сравнению с исходным препаратом. Однако, при электрофорезе в нативных условиях отмечалась высокая степень микрогетерогенности 2Fe-TO 1 и 2Ре-ТФ 2, которая, по-видимому, объясняется различным содержанием сиаловой кислоты во фракциях ТФ [Regoeczi Е. et al. 1987; Stibler Н., 1991]. В целом, 2Fe-TO I характеризовался мень-

шие. 4. Результаты хроматографии 2Fe-T<P на

ДЭА Э-цегчю.чок.. 1 - поглощение при 289 им; 2 - концентрация NaCl и элюате, М; ТФ I и ТФ 2 - наименование фракций ТФ.

шей, а 2Ре-ТФ 2 большей электрофоретической подвижностью. Содержание сиаловой кислоты в выделенных фракциях, в среднем, составило: для ТФ1 -

3.2 моля, а даяТФ 2 - 4,2 моля сиаловой кислоты на 1 моль ГП, что хорошо согласуется с литературными данными [Wong K..-L. et al.,1977; Regoeczi E. et al.,1979; De JongG. et al.,1990]. Содержание железа, связанного с белком ТФ, в ТФ 1 равнялось 2,1, а в ТФ 2 -

2.3 г-атома на I моль ТФ, т.е. было практически одинаковым в обеих формах 2Fe -ТФ, что подтверждает литературные данные об одинаковом сродстве к ионам железа различно сиалированных молекул ТФ [Regoeczi Е. et al.,1977; van Eijk H.G. et al.,1984]. Таким образом, выделенные фракции ТФ, не отличались ни по характеру белкового компонента, исходя из данных DS-Na электрофореза, ни по способности к связыванию железа, но содержали разное количество сиаловой кислоты: ТФ 1 содержит меньшее, а ТФ 2 - большее число высокосиалированных форм.

3.2. Сравнительная оценка влияния изоформ трансферрина с различной степенью сиалирования на репликатианый синтез ДНК в клетках

Данные о сравнительном влиянии двух выделенных форм ТФ на включение [3Н]-тимидина в клетки КМ приведены на рис. 5. Как видно из рисунка, обе формы ТФ оказывали отчетливое активирующее воздействие на включение [3Н]-тимидина в клетки КМ при всех исследованных дозах, ' достигающее максимума при

концентрации ТФ 200 мкг/мл. При этом 1 активирующее действие 2Ре-ТФ 1 на j включение [3Н]-тимидина в клетки костного мозга было выражено в большей степени, чем 2Ре-ТФ 2, в особенности, при внесении ТФ в среду инкубации в дозе 200 мкг/мл (рис.5). В отличие от эффектов Fe-ТФ, неорганическая соль железа (FeCh) в низких концентрациях (2,4 мкМ FeCh),

соответствующих концентрации Fe в препарате Fe-ТФ, внесенного в инкубационную среду в концентрации 100 мкг/мл) не влияла на включение [3Н]- тимидина (рис.5), и только

костного мозга крыс.

bftWMUHf Р-'О-ГС''.

Рис.5. Влияние 2Fe-ТФ 1 (1), 2FeTO> 2 (2) и FeCh (3) на включение {'HJ-тимидиш в клетки костного мозга крыс. Горизонтальная лапгтрихованная область - юна М±т дня контроля (51Н±41 имп/мин на 10'' я:фосолержатих клеток; п=20). *- р<0,05 по сравнению с контролем

при больших концентрациях FeCh(4,8-7,2 мкМ), что соответствует 200 мкг/мл Fe-ТФ, оказывала стимулирующий эффект, но меньший, чем 2Ре-ТФ 2 (рис. 5).

Таким образом, препараты ТФ сильнее активировали включение [3Н]-тимидина в клетки КМ, чем неорганические соединения железа, причем менее сиалированная форма ТФ -2Fe-ТФ I - оказывала большее стимулирующее воздействие на включение [3Н]-тимидина в клетки КМ крыс, чем более сиалированная форма.

3.3. Сравнительное изучение влияния трансферрииа с различной степенью

гликозилирования на ПОЛ в желточных липолротеинах и клетках костного мозга .

3.3.1. Желточные липопротеины (ЖЛП).

ПОЛ инициировали в ЖЛП, внося в суспензию ионы Fe'* в конечной концентрации 100 мкМ и либо аскорбат, либо ADP, и исследовали накопление МДА. Базальный уровень МДА, а также показатель спонтанного ПОЛ (за 30 мин инкубации в отсутствие солей железа) составили не более 0,6 и 0,8 нмоль соответственно. Инкубация ЖЛП в течение 30 мин в присутствии Fe3+ /ADP приводила к накоплению в среде 2,17+0,17 нмоль МДА (п=12), а в присутствии Fe3VacKop6aTa - 2,30 ± 0,35 нмоль МДА (п=3).

Внесение в суспензию препарата ano ТФ резко (до 10% от контроля) ингибировало накопление МДА в ЖЛП, причем эффект носил четкий дозо-зависимый характер (рис.б). В основе ингибирующего действия ano ТФ лежит, очевидно, его способность связывать ноны железа. Действительно (рис. 6), эффект четко зависел от стехиометрического отношения молярных концентраций ano ТФ и железа: 50 мкМ ano ТФ, способный связать

2 моля Fe, ингибировал ПОЛ на 94%, что объясняется, по-видимому, практически полным

*

связыванием ионов Fe3+, присутствующих в среде в концентрации 100 мкМ (рис.6). Важным аргументом в пользу данного механизма служит практически полное отсутствие способности подавлять образование МДА у ТФ, предварительно полностью насыщенного ионами железа.

Сравнительное изучение способности к подавлению образования МДА в ЖЛП двух форм ano ТФ, различающихся по степени их гликозилирования, показало, что обе формы ano ТФ существенно и дозо-зависимо снижали уровень МДА в ЖЛП при индукции ПОЛ в системе Fe3*/ADP и Ре3+/аскорбат. При этом действие обеих форм ТФ практически не отличалось друг

"ШШШШ

ICO, Ш| «по!»' 4 6 8 ит/ил апоТФ

Рис. & Способность исходного препарата ano ТФ ингибировать ПОЛ, иидуцироеанное Fe'VADP в ЖЛП.

от друга и было достаточно близко к эффектам исходного апо ТФ (рис.6). Поскольку, как было отмечено, в основе антиоксидантного (АО) эффекта ТФ лежит его способность связывать железо [ЗЬагша В.К.. е( а1.,1990], то выявленное нами отсутствие различий в способности к связыванию железа между ТФ 1 и ТФ 2 (стр.14) определяет отсутствие различий и в их влиянии на уровень МДА в ЖЛП.

Таким образом, проведенный эксперимент показал, что в бесклеточной системе степень сиалирования апо ТФ не влияет на накопление МДА (как показатель ПОЛ).

3.3.2. Клетки костного мозга.

ПОЛ в суспензии клеток КМ инициировали с помощью тех же систем, что и в ЖЛП. Инкубация клеток КМ в течение 3 часов при концентрации Ре3+ 100 мкМ, АОР - 300 мкМ и аскорбата - 500 мкМ сопровождалась накоплением 1,87 ± 0,22 нмоля МДА (п=11). Это превышало спонтанное накопление МДА в 1,5-2 раза. Усиление ПОЛ, инициированное ионами Ре3+, сопровождалось снижением жизнеспособности клеток КМ, в особенности, в системе Ре,+/аскорбат.

ц», Л от

K0HTÍ ГЛЛ

а-

шшит

Прирост жизнеспособности !яо срр.впент с контролем, С от общего числа клеток)

поК, иг/мл

ело]*, мг/мл j

Рис. 7. Влияние апо ТФ 1 и апо ТФ 2 на содержание МДА и жизнеспособность клеток костного мозга при индукции ПОЛ Fei +/ш'а орОатом.

I - ТФ 1;2-ТФ2

Данные о влиянии двух форм апо ТФ на уровень МДА в суспензии клеток КМ представлены на рис. 7\а. Обе формы апо ТФ значительно снижали уровень МДА в клетках КМ при инициации ПОЛ как Fe3+/ADP, так и Ре3*/аскорбатом. Однако, в обоих случаях действие апо ТФ 2 было достоверно более выраженным, чем апо ТФ 1. Особенно существенной была эта разница в случае инициации ПОЛ

Fe3t/acK0p6aT0M (рис. 7). Различия в действии апо ТФ 1 и апо ТФ 2 проявлялись также и в их эффектах на жизнеспособность клеток КМ (рис. 7, б) - апо ТФ 2 в большей мере увеличивал число жизнеспособных клеток (по сравнению с контролем), чем апо ТФ 1. Таким образом, в

системе клеток КМ более сиалированная форма ano ТФ - ano ТФ 2 в большей мере подавляла накопление МДА, чем менее сиалированная форма - апоТФ I. Следовательно, эффекты ТФ с различной степенью сиалирования, в клеточной системе были отличны от их действия в бесклеточной системе.

Полученные нами данные о действии ТФ I и ТФ 2 в клеточной системе на ПОЛ существенно отличаются от результатов изучения влияния этих форм на клеточную пролиферацию (разд. 3.2.). Действительно, менее сиалированная форма - ТФ 1 -оказывала более выраженное влияние на включение [5Н]-тимидина в клетки КМ, но в меньшей степени подавляла ПОЛ, чем более сиалированная форма - ТФ 2.

Проведенные исследования показали, следовательно, что пролиферативная и АО активность ТФ в клеточной системе (клетках KM) in vitro проявляет существенную, хотя и полярную зависимость от степени сиалирования ТФ - АО свойства в большей степени присущи ТФ с большей степенью сиалирования, тогда как пролиферативные свойства в большей мере проявляла менее сиалированная изоформа ТФ. Причина указанных различий требует дальнейших исследований. Однако, сам факт выявления зависимости функциональных свойств ТФ от состава его гликановых цепей представляет значительный интерес для понимания механизмов реализации

биологических функций ТФ и других ГП.

* * *

Таким образом, выполненные исследования показали, что степень гликозилирования ГП и ТФ существенно меняется при различных физиологических и патологических состояниях. Характер этих изменений зависит от конкретной природы этих состояний. Обнаруженное нами разнонаправленное изменение белковой и углеводной компонент сывороточных ГП указывает на относительную независимость процессов их синтеза и метаболизма может, очевидно, рассматриваться как косвенное указание на особую функциональную роль гликановых цепей сывороточных ГП. Данное предположение представляется особенно правомерным с учетом впервые выявленной нами в условиях in vitro зависимости ключевых биологических функций ТФ - антиоксидаитной и рост-стимулирующей - от степени гликозилирования (сиалирования) его молекулы. Полученные в работе данные указывают, следовательно, на новый механизм регуляции функциональных свойств белков, обусловленный изменениями их углеводной компоненты.

ВЫВОДЫ

1. Доказано, что ряд физиологических и патологических состояний у человека и животных (беременность, недоношенность, гипотрофия, радиационное поражение) ведет к появлению в крови гликопротеинов (ГП) с измененной (по сравнению с нормой) степенью гликозилирования. Степень гликозилирования меняется независимо от изменений в общем содержании ГП, что может рассматриваться как указание на особую функциональную роль гликановых цепей сывороточных ГП.

2. Суммарное содержание ГП сыворотки крови и уровень одного из индивидуальных ГП - трансферрина, существенно возрастает при беременности, но напротив, снижается (или не меняется) у недоношенных детей и детей с гипотрофией . В то же время, степень гликозилирования и суммарных ГП, и трансферрина во всех случаях возрастает.

3. С помощью перекрестного аффинного иммуноэлектрофореза доказано увеличение содержания фракции орозомукоида, не реагирующей с Кон А, в крови беременных женщин, возрастающее с увеличением срока беременности. Установлена прямая достоверная корреляция (г=0,87) между сроком беременности и содержанием в крови беременных женщин этой фракции.

4. Общее у - облучение мышей значительно снижает в позднем пострадиационном периоде в их плазме крови содержание трансферрина (до 30% от контроля) и степень его гликозилирования (до 40% от контроля).

5. Введение мышам гепатотропного ксенобиотика бромбензола (в токсических дозах) значительно (на 50%) уменьшает общее содержание трансферрина в крови . Одновременное с бромбензолом введение животным защитного серу-содержащего белка - цинк-металлотионеина восстанавливает уровень трансферрина в крови до значений, выше исходных. Однако, степень гликозилирования трансферрина при этом существенно снижается (до 40% от контроля).

6. При исследовании in vitro действия двух форм трансферрина с различным содержанием сиаловой кислоты, полученных с помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, показано, что менее сиалированная форма трансферрина - 2Fe-T<J> 1 -оказывала большее стимулирующее воздействие на включение [3Н]-тимидина в клетки костного мозга крыс, чем более сиалированная. Однако, эта форма в меньшей степени подавляла накопление МДА в клетках костного мозга, чем более сиалированная форма апоТФ - ano ТФ 2. В модельной бесклеточной системе эффекты трансферрина с различной степенью сиалирования были одинаковы.

7. Разработан корректный количественный метод одновременного определения содержания и степени гликозилирования трансферрина в сыворотке крови человека и животных.

8. Определение степени гликозилирования ГП крови может быть использовано для разработки диагностических и прогностических тестов при оценке тяжести и течения радиационных поражений, а также гипотрофии и состояния недоношенности у детей.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. С.Я. Долецкий, К.С. Ладодо, A.B. Арапова, Е.В. Крет, И.Я. Конь, Н.В. Злыгарева, Н.М. Шилина, П.В. Оленченко. Энтеральное питание новорожденных и грудных детей с высокой врожденной непроходимостью / Тез. докл. Всесоюзного симпозиума с международным участием "Актуальные проблемы искусственного питания в хирургии", Москва, 1990, с.44-45.

2. А.Н. Котеров, М.В. Шагова, Н.М. Шилина, И.Я. Конь. Снижение уровня перекисного окисления липидов и острой токсичности бромбензола при введении мышам полимерной формы цинк-металлотионеина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, I995.T.II9, № l.c.43-45.

3. Н.М. Шилина, А.Н. Котеров, И.Я. Конь. Снижение содержания и степени гликозилирования трансферрина (как фактора роста клеток эритроидного ряда) плазмы крови мышей в поздний срок после общего гамма-облучения I Тез. докл. Всероссийской конференции "Действие ионизирующей радиации на иммунную и кроветворную системы", Москва, ноябрь 1995, с. 34-35.

4. И.Я. Конь, Н.М. Шилина, А.Н. Котеров. Исследование микрогетерогенности ai -кислого гликопротеина сыворотки крови в динамике беременности у женщин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1996, Т. 122, № 10, с.471-474.

5. N.M. Shilina, A.N. Koterov, I.Ya. Kon'. The study of transferrin biological action dependence on sialic acid contents of its moleculs / In Abstracts: XHIth International Symposium on glycoconjugates. (USA, Seattle) Glycoconjugate Journal, 1995, V.12, №4, p.400.

6. И.Я.Конь , Н.М. Шилина , А.Н. Котеров. Связь между содержанием трансферрина в плазме крови и уровнем малонового диальдегида в печени мышей И Биохимия, 1996, Т.61, вып.7, с. 1198 - 1203.