Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли гликозилирования белков оболочки вируса гепатита C в вирусном морфогенезе с использованием бакуловирусной системы экспрессии в клетках эукариот

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли гликозилирования белков оболочки вируса гепатита C в вирусном морфогенезе с использованием бакуловирусной системы экспрессии в клетках эукариот"

На правах рукописи

Орлова Ольга Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ ОБОЛОЧКИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С В ВИРУСНОМ МОРФОГЕНЕЗЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКУЛОВИРУСНОЙ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ

03.01.03-молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 и 2014

Москва 2014

005554028

005554028

Работа выполнена в Лаборатории молекулярно-генетических основ эндокринной регуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Светлана Николаевна Белжеларская с.н.с. Лаборатории молекулярно-генетических основ эндокринной регуляции. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор,

Валерий Петрович Варламов

зав. Лабораторией инженерии ферментов. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук

доктор биологических наук, профессор, Валерий Вячеславович Носиков

зав. Лабораторией молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии. Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Защита диссертации состоится " 3 " XI* 2014 г. в {3. часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, ГСП- 1, ул. Вавилова д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Автореферат разослан "АО" О&ИлиЦуЛ 2014 г.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ Диссертационного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Вирусом гепатита С (ВГС) в настоящее время инфицировано около 200 миллионов человек (3% населения Земли) и инфекция продолжает распространяться. Гепатит С называют "тихой эпидемией", при этом, современные методы лечения ВГС не совершенны, а профилактические вакцины для вируса не созданы. В этой связи, необходимы исследования для большего понимания молекулярных механизмов, вовлеченных в вирусную инфекцию. Вирус гепатита С, относящийся к семейству Flaviviridae, отличается высоким генетическим полиморфизмом и, как следствие, наличием 6 генотипов и нескольких десятков субтипов. На территории РФ преобладающим генотипом вируса является 16. Кроме того, у инфицированных пациентов на разных стадиях инфекционного процесса, вирус существует в виде набора близкородственных геномов - квазивидов, способствующих иммунному ускользанию и развитию хронического течения инфекции.

ВГС представляет собой оболочечный РНК-содержащнй вирус. Геном вируса кодируется с единственной ORF. Трансляция полипротеинового предшественника осуществляется с IRES, расположенном в нетранслируемой области геномной РНК, который затем процессируется протеазами с образованием структурных и неструктурных вирусных белков. Максимальная гетерогенность генома регистрируется в генах, кодирующих белки оболочки ВГС, что осложняет исследование взаимодействия вируса с клетками и создание вакцин. Мишенью ВГС являются гепатоциты. Связывание вириона ВГС с клетками гепатоцитов происходит посредством взаимодействия гликопротеинов вирусной оболочки с рецепторами, расположенными на поверхности клетки. Взаимодействуя со специфическими рецепторами на поверхности клетки, белки оболочки индуцируют слияние вирусной оболочки и мембраны клетки-хозяина. Для белков, присутствующих на поверхности оболочечных вирусов, характерно N-связанное гликозилирование, которое играет главную роль в биологических функциях этих белков. Белки оболочки ВГС высокогликозилированы и содержат от 4 до 11 сайтов N-гликозилирования. Несмотря на вариабельность генотипов ВГС, сайты гликозилирования El и Е2 высококонсерватнвны. Какие сайты гликозилирования участвуют в модификации белка и все ли потенциальные сайты реализуются in vivo до сих пор не известно. Известно, что наличие N-гликанов способно стабилизировать структуру белка, влиять на специфичность белок-белковых взаимодействий и на сворачивание заякоренных в мембрану секретируемых гликопротеинов. Добавление гликанов на растущий полипротеин сопряжено с фолдингом, при котором гликопротеины специфически взаимодействуют с лектин-подобными шаперонами ЭР в кальнексин-кальретикулиновом цикле, обеспечивая его сворачивание. Гликопротеины ВГС накапливаются в люмене ЭР в виде двух форм: правильно свернутых гликопротеинов и в виде агрегатов стабилизированных дисульфидными связями. Часть белков El и Е2 дегликози-лируется, остается в цитозоле и удаляется по убиквитин-протеасомному метаболическому пути.

Обоснованно предполагается, что свойства вириона зависят от гликозилирования оболочечных белков ВГС в зараженной клетке, их взаимодействия и характера укладки. Наличие или отсутствие Сахаров на полипротеине имеет существенное значение в формировании комплексов Е1Е2, может привести к неправильной укладке димеров и, как следствие, сборке неинфекционного вириона, неспособного в да!ьнейшем инфицировать клетку мишень. Детальное строение вириона, точный механизм, посредством которого инфекционные частицы вируса формируются и покидают клетку, остаются недостаточно изученными. Из-за отсутствия приемлемых для размножения ВГС клеточных культур, до сих пор до конца не

выяснены ни природа вирусной частицы, ни роль структурных белков в морфогенезе вируса. В этой связи необходимы исследования, направленные на изучение морфогенеза ВГС. Значительный интерес представляет исследование гликозилирования гликопротеинов вируса, исследование роли Ы-связанных гликанов в функционировании белков оболочки ВГС, участвующих в формировании вирусных частиц.

Перспективным подходом к изучению морфогенеза ВГС является высокоэффективная бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых и млекопитающих, позволяющая получать самособирающиеся, нереплицирующиеся, лишенные генома частицы, морфологически сходные с интактными вирионами. Такие генетические модификации, как сайт-направленный мутагенез, ведущий к удалению сайта посадки Сахаров, позволяют уточнить влияние отдельно взятого гликана на стабильность гликопротеина, его сворачивание, гетеро-димеризацию, на сборку вирусной частицы, на способность частицы связываться с поверхностью клетки мищени, выявить роль гликана в репликации вирусного генома.

До сих пор были охарактеризованы гликаны ВГС генотипов 1а и 2а в модельных системах псевдочастиц и в системе с использованием самореплицирующейся РНК. Выявлены значительные различия в функциях отдельных гликанов в пределах различных генотипов и различных модельных систем. Данных по характеристике Сахаров гликопротеинов Е1 и Е2 ВГС генотипа 1Ь, с использованием модели формирования вирусоподобных частиц в клетках эукариот, до настоящего времени не было. Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлось исследование гликозилирования вирусных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С (генотип 16 штамм 2749331Ш), изучение роли И-связанных гликанов в функционировании белков оболочки ВГС, участвующих в формировании вирусных частиц.

Для достижения цели были сформулированы следующие задачи:

1. Создать набор векторных конструкций, содержащих точечные мутации в сайтах Ы-гликозилирования белков Е1 и Е2 вируса гепатита С, для экспрессии мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих.

2. Разработать условия эффективной экспрессии структурных белков и вирусоподобных частиц ВГС, содержащих точечные мутации в сайтах Ы-гликозилирования белков Е1 и Е2 ВГС, в клетках насекомых и млекопитающих с помощью бакуловирусной системы экспрессии.

3. Исследовать влияние ¡М-связанных гликанов гликопротеинов оболочки вируса гепатита С на их экспрессию, процессинг и формирование вирусоподобных частиц в клетках насекомых и млекопитающих.

4. Провести расчет оптимальной геометрии молекулы белка Е1, с разным количеством и расположением гликанов, методом молекулярной динамики в программе НурегСЬеш для получения компьютерных моделей пространственной структуры мутантных белков Е1. Научная новизна н практическая ценность работы.

Впервые изучена роль Ы-связанных гликанов в функционировании белков оболочки вируса гепатита С генотипа 16 штамм 2749331Ш, участвующих в формировании вирусоподобных частиц. Наши исследования роли гликозилирования белков оболочки в морфогенезе вируса гепатита С показывают, что рекомбинантные структурные белки, синтезируемые в клетках насекомых и млекопитающих, подвергаются пострансляционным модификациям и формируют вирусоподобные частицы. Полученные данные о влиянии Ы-гликанов гликопротеинов Е1 и Е2 ВГС на процесс сборки структурных белков вируса и образование нековатент-

ного гетеродимера Е1Е2, входящего в состав вириона ВГС, позволят уточнить роль постранс-ляционных модификаций оболочечных белков Е1 и Е2 ВГС в жизненном цикле вируса.

Показано, что синтезируемые в клетках белки оболочки ВГС, в том числе содержащие мутации в сайтах гликозилирования, встраиваются в мембраны ЭР, где происходит их сворачивание, образование комплекса Е1Е2 и формирование вирусоподобной частицы.

Для вируса гепатита С генотип 16 (штамм 274933RU) впервые выявлено, что нарушение единичных сайтов гликозилирования N1 и N8 белка Е2 ВГС и N1 и N5 белка Е1, ведет к снижению экспрессии этих белков в клетках млекопитающих в отличие от экспрессии в клетках насекомых.

Впервые обнаружено, что нарушение сайтов гликозилирования N1, N2 и N10 белка Е2, также как и N1 и N5 белка Е1 ВГС, влияет на образование функциональных гетеродимеров Е1Е2. В отсутствие гликанов в этих положениях происходит в основном образование непродуктивных димеров Е1Е2, но это не препятствует формированию вирусоподобных частиц ВГС, как в клетках насекомых SJ9, так и в клетках человека НЕК293Т. Сделано предположение, что образующиеся вирусоподобные частицы с неправильно свернутыми гликопротеина-ми являются дефектными, неспособными инфицировать клетки мишени.

Полученные данные свидетельствуют об образовании в клетках SJ9 и НЕК293Т вирусоподобных частиц с плотностью 1.14- 1.16г/см3, содержащих фрагменты РНК. Показано, что N-гликаны гликопротеинов ВГС не влияют на синтез РНК структурных белков в клетках насекомых и млекопитающих и, возможно, на их включение в вирусоподобные частицы.

Обнаружено, что вирусоподобные частицы ВГС, синтезирующиеся в клетках насекомых, связываются с клетками гепатомы Huh-7 независимым от рецептора CD81 образом.

Впервые проведены компьютерные расчеты, с получением моделей трехмерных структур молекулы белка Е1 ВГС с разным количеством и расположением гликанов и определено соответствие полученных результатов с экспериментальными данными. Аналогичное сочетание двух подходов - in vitro и in silico — можно использовать для изучения детального строения вирусной частицы ВГС и способа ее формирования, которые остаются мало изученными. Апробация работы.

Результаты исследования представлены на XXII зимней молодежной научной школе (Москва,

2010) и 38м Конгрессе FEBS (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано научных работ. Структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, содержит

рисунков, таблиц и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной

части, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из ссылок.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант 08-04-00281, 011-04-00231) Список использованных сокращений БОЕ - бляшкообразующая единица ВГС - вирус гепатита С ОТ - обратная транскрипция

ПААГ - полиакриламидный гель электрофорез с использованием додецилсульфат натрия ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат ЭР - эндоплазматический ретикулум

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследование роли гликозилирования белков оболочки вируса гепатита С в вирусном морфогенезе с использованием бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых и млекопитающих.

Предполагается, что белки оболочки вируса гепатита С (ВГС) Е1 и Е2 играют существенную роль в его жизненном цикле. Являясь основными компонентами вириона вируса, они участвуют в формировании инфекционных частиц. Вирусные белки оболочки содержат Ы-гликаны, которые могут непосредственно влиять на формирование вирусных частиц, связывание вируса с клеткой и патогенез гепатита С. Представленная работа посвящена изучению влияния М-гликанов гликопротеинов Е1 и Е2 ВГС генотипа 16 (штамм 2749331Ш) на их сворачивание, образование функциональных гликопротеиновых комплексов и формирование вирусных частиц в клетках насекомых и млекопитающих. Морфологически вирусный генотип 16 отличается от широко исследуемых во всем мире генотипов 1а и 2а. Это отличие выражается в наличии сайта гликозилирования N4 у гликопротеина Е1 и отсутствии сайта гликозилирования N5 в полипептидной цепи белка Е2 ВГС. Известны значительные различия в функциях отдельных гликанов в пределах различных генотипов вируса гепатита С. Исследование роли гликозилирования белков оболочки вируса гепатита С в вирусном морфогенезе анализировали с помощью сайт-направленного мутагенеза гликопротеинов в бакуловирусной системе экспрессии.

1. Создание набора векторных конструкций, содержащих точечные мутации в сайтах 1У-гликозилирования белков Е1 и Е2 вируса гепатита С, для экспрессии мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих.

В зрелом вирионе вируса гепатита С гликопротеины Е1 и Е2 высокогликозилированы и содержат 5-6 и 9-10 сайтов гликозилирования соответственно (Рис.1 А и Б). Точечные мутации вводили в сайты М-гликозилирования Е1 и Е2 ВГС с помощью олигонуклеотид-направляемого мутагенеза на двутяжевых плазмидных векторах, схема которого разработана и предложена В.Л. Друцей, и получали генетические конструкции, кодирующие ген белка Е1 ВГС с мутациями в шести сайтах гликозилирования и конструкции, кодирующие ген белка Е2 ВГС с мутациями в одиннадцати сайтах гликозилирования. Мутантные варианты белков Е1 и Е2 схематически представлены на рисунке 1А и 1Б. В результате была сконструирована серия рекомбинантных плазмид рВ1иезспр1К8Е1 и рГ^ВасНТЬЕг, несущих кДНК белка Е1 и Е2 соответственно с точечными заменами в сайтах гликозилирования.

Для введения мутаций в заданные положения нуклеотидной последовательности кДНК Е1 и Е2 использовались праймеры, представленные в Таблице 1.

Y Y Y Y Y

1 —gvs—n ss—nws— nas— ncs— 6 -gvs—gss—gws—nas—gcs—

Y Y Y Y

Z —nvs—nss—nws—nas—gcs— 7 -gvs—gss—gws—gas—gcs—

Y Y Y Y

3 —gvs—nss—nws— nas—gcs— s -gvs—gss—gws—gas—ncs—

Y Y Y Y Y Y Y Y

4 —nvs—gss—gws—gas—ncs— 9 —nvs—nss—nws—nas—ncs—nws—

Y Y Y Y Y Y

—nvs—gss—gws—gas—gcs— 1(1 —nvs—nss—nws—nas—ncs—

N1N2N3N4 * N6 N7 N8 N9 N10 W1

Ifiyij' If lyy If У If у :.

_ п

417423 430 443 532 540 556 576

Y Y Y YYYYYY 1 —ggs—nkf—nos—nas—epd—net—nni—nst—n17—nf-t—nwî— 8 Y Y Y Y YY Y Y Y —ngs—nrt—nos—nas—epd—net—nnt—gst-—ntt—nft—nwt—

Y YY YYYYYY 2 —nos—grf—nos—nas—epd—net—nnt—nst—ntt—nft—nwt— 9 Y Y Y Y YYY YY —ngs—nrt—nos—nas-№0—net—nnt—nst—gtt—nft—nwt—

YY Y YYYYYY í —ngs—nrt—gds—nas—eps>--net—nnt—nst—ntt—nft—nwt- Y Y Y YYYYYY •1 —ngs—nrt—nos—gas—epd—net—nnt—nst—ntt—nft—nwt— 10 11 Y Y Y Y Y Y Y Y Y —ngs—nrt—nos—nas-epd—net—nnt—nst—ntt—g ft—nwt— Y Y Y Y Y Y Y Y Y —ngs—nrt—nos—nas-epd—n et—nn t— nst—n п—nft—gwt—

Y Y Y Y YYYYYY 5 —ngs—nrt—nos—nas—epd—net—nnt—nst—ntt—nft—nwt— 12 Y Y Y Y —ggs—grt—gds—gas-b'i >—get—gnt—nst—ntt—nft—nwt—

Y Y Y Y Y Y Y Y Y 6 —ngs—nrt—nos—nas—epd—get—nnt—nst—ntt—nft—nwt— 13 Y Y Y Y Y Y —ngs—nrt—nd5—nas-нш—net—nnt-gsï—gtt—gfb-gwt—

Y Y Y Y Y Y Y Y Y - —ngs—nrt—nos—nas—r.pd—net—gnt—nst—ntt—nft—nwt— 14 —ggs—grt—gds—gai-epd—get—gnt—gst—gtt—gft—gw7-

Рис.1. Сайты Ы-гликозилирования структурных белков Е1 и Е2 ВГС и их мутантных вариантов. А -Схематическое изображение мутантных вариантов гликопротеина Е1 с модифицированными (нарушенными) сайтами гликозилирования: 1 - N1; 2 - N5; 3 - N1 и N5; 4 - N2, N3 и N4; 5 - N2, N3, N4 и N5; 6 — N1, N2, N3 и N5; 7 - N1 - N5; 8 — N1, N2, N3 и N4; 9 — с дополнительно введенным сайтом гликозилирования N6; 10 - исходный вариант Е1 дикого типа. Б - Схематическое изображение мутантных вариантов гликопротеина Е2 с модифицированными (нарушенными) сайтами гликозилирования: 1 - N1; 2 - N2; 3 - N3; 4 - N4; 5 - исходный вариант Е2 дикого типа, содержащий в 4% штаммах генотипа 16 сайт гликозилирования N5; 6 - N6; 7-N7; 8 - N8; 9 - N9; 10-N10; 11 - N11; 12 - N1, N2, №,N4,N6, Ш(тЬ); 13-N8, N9, N10, N1 ЦтЯ); 14 - N1 -N1100; Сайты гликозилирования отмечены знаком "У".

Таблица 1. Праймеры, используемые для сайт-специфического мутагенеза.

Праймер Ориентация Последовательность в направлении 5' —>3'

16- Haml + CCA СТА CGA CAA TAC G

15- Hamr - GAG CAA GTC GAC GTG

26- N5tl + GGA CTG CCA ATG CTC AAT СТА ТСС CG

17- N6tl + TGG TCA CTT ACA ACA GC

23-N5br - GAG CAT TGG CAG TCC TGC ACT GT

17- N6br - CTG TTG TAA GTG ACC AG

17- N7tl + GAA CTG GTC TAA GGT TC

17- N7br - AAC CTT AGA AGA CCA GTT CC

24r- Hpsr - CAG CTG CAG TTA CCC GTC AAC GCC

29-ENI m - ГТА TGA AGT GCG CCA AGT GTC CGG CAT AT

30- EN2m - AAC GAC TGC TCC CAA TCA AGC ATT GCG TAT

27- EN3m - GTT CAG GAG GGT CAA AGC TCC CGT TGC

24- EN4m - CGC GGC CAG GCA AGC CAG CGT CCC

19 Haml - CAC TAC GAC AAT ACG ACG T

18 Нашг - АОС ААв ТСв АСв ТСА СвТ

28~Е2М1т - ТО ААТ АСС САА ОвС АОС ТСС САС АТ

30- Е2М2т - ГвО САС АТС САА АвТ АСТ вСС СТА ААТ ТСС

30- Е21ЧЗт - ЭСС СТА ААТ ТСС САА ОАС ТСС СТС САА АСТ

30- Е21М4т - ЭСА САС ААв ТТС САА ТСв ТСС ООО ТСС ССО

25- Е21%т - ГОО ООО ОАО САА ОАО АСА ОАС ОТС А

30- Е21Ч7т - ОТО АТС СТС СТС САА ААС АСй СОТ ССО ССА

30- Е21М8т - ТОТ АСА ТСЮ АТС САА АОТ АСТ ООО ТТС АСТ

27- Е2К9т - ООО ОТС ОвТ САА СОС АСС ТТО АТТ ТСС

30- Е21Ч1 От - ГАС ССС ТСС АСТ СТС САА ТТТ ТТС САТ САТ

27-Е2Ш 1т - ОСС ОСА ТСС САА ТОО АСТ СОА ОвА ОАО СОС

Е2й>г + АОО ТСТ АОА АТС ТТА ТОА ТТС ТТТ ТСС ТАС

Е2 Васк + СТ АТА ОТС ТСА ССТ ААА ТСС йАА АОС ТТС ООС СТС АОС ТТС АО

Каждый праймер состоял из 16-30 нуклеотидов и содержит последовательность, кодирующую сайт Ы-гликозилирования: АэК-Х-ТИг/Бег-Х (Х-любая аминокислота, кроме пролина), в котором триплет, кодирующий Аспарагин(Азп), замещен триплетом, кодирующим Глута-мин(01п). ПЦР проводили на программируемом термостате "ЦиклоТемп ) 07" (ЗАО "Ресурс Прибор", Россия). Наличие всех заданных замен нуклеотидов подтверждали секвенированием.

Для экспрессии в клетках 5/9 и НЕК293Т, кДНК Е1 и Е2 дикого типа и с введенными мутациями, встраивали в бакуловирусные векторы рРаз1ВасНТЬ и рРа81ВасМатЮЕР. В результате получили векторные плазмидные ДНК: рРаз1ВасНТЬЕ1мутЕ2, рраэ1-ВасНТЬСЕ 1 мутЕ2, ВасМашСЕ1мутЕ2СРР, несущие кДНК Е1мут, и рРаз1ВасНТЬЕ2мут, рРаз1ВасНТЬЕ1Е2мут, рРаз1ВасНТЬСЕ1Е2мут, ВасМашСЕ1Е2мутОРР, несущие кДНК Е2мут (Рис.2).

рРайВаеНТ-Е!

рЕазШасНТ-Е2

РРН Е1 БУ40 рА

Ррн Е2 Б\т40 рА

РРа51ВасНТ-СЕ1Е2 р С Е1 Е2 5\'40 рА

рБа^ШасНТ-Е 1Е2 р ГРН Е1 Е2 БУ40 рА

рРаьШасМатЮБР

йБР

Б\Т40 рА

рРгиШасМат-СЕ 1Е20ЕР

Е1

Е2

Сигнальные последовательности гликопротеинов Е1 и Е2

Рис.2. А — Схематическое изображение плазмидных конструкций на основе бакуловирусного вектора рРаз1ВасНТ, содержащих в полилинкерной последовательности кДНК гены структурных белков ВГС: С, Е1 и Е2. Б - Схематическое изображение плазмидных конструкций на основе бакуловирусного

вектора pFastBacMamlGFP. На схемах отмечены: Ррц - промотор гена полиэдрина; Pcmv - промотор гена цитомегаловируса; заштрихованные области - сигнальные последовательности гликопротеинов Е1 и Е2; SV40 рА - полиА последовательность вируса SV40. MSC - мультиклональный сайт.

2. Экспрессия мутантиых белков Е1 и Е2 вируса гепатита С в клетках эукариот с использованием бакуловирусной системы экспрессии.

Влияние N-гликанов гликопротеинов El и Е2 ВГС на экспрессию генов мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих. Для эффективной экспрессии мутантных белков вирусной оболочки в клетках насекомых Sf9 и млекопитающих НЕК293Т и Huh-7,0, в бакуловирусной системе экспрессии, подбирали условия, соответствующие максимальному уровню синтеза гликопротеинов оболочки Е1 и Е2, димеров Е1Е2 и ВПЧ. Количество синтезирующихся белков Е1 и Е2, Е1Е2, СЕ1Е2 и их мутантных вариантов значительно увеличивалось через 72 часа после инфекции, что объясняется экспрессией под контролем позднего бакуло-вирусного промотора полиэдрина. Оптимальной величиной множественности инфекции была величина 5 БОЕ/кл для всех вариантов рекомбинантных бакуловирусов, несущих гены структурных белков Е1 и Е2 и их мутантных вариантов.

Анализ экспрессии генов мутантных вариантов белка Е1 в клетках насекомых проводили с помощью электрофореза в ПААГ и иммуноблота с антителами к Е1 ВГС(Рис.З А, Б).

А 12 34567 8 9 WT

кда шш^^шкш^шишшшшийш/^юшиш^шшвтят

26 М £ * ' ^ it -ЕР

19 Ж* » jjg

12 34567 89 WT

Í'¿Л!-

Б кДа \VT

34 щшт

26 19

IP: anti-El WB: anti-El 2 3 4 5

- El

- ЕР

WB: anti-EI

Рис.3. Анализ экспрессии генов мутантных белков El в составе Е1Е2 ВГС в клетках SJV. А - Вестерн-блоттинг в денатурирующем 12% ПААГ с антителами к El ВГС после предварительного иммунооса-ждения антителами к El. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами синтезирующих El: 1 - El дикого типа; 2 — El с дополнительным сайтом гликозилирования N6; 3 — El с мутацией в сайте гликозилирования N1; 4-N5; 5 -N1 и N5; 6-N2, N3 и N4; 7-N1, N2, N3 и N4; 8 - N2, N3, N4 и N5; 9 - во всех сайтах гликозилирования N1-N5. Б — Вестерн-блот-анализ гликозилирования мутантных белков El в комбинации с Е2 ВГС в клетках насекомых с антителами к El ВГС: 1 - El дикого типа; 2 — El дикого типа, обработанный эндогликозидазой Н; 3 — El с мутацией в сайте гликозилирования N1; 4 - Ele мутацией в сайте гликозилирования N1, обработанный эндогликозидазой Н; 5 — El с мутацией в сайте гликозилирования N1 из клеток, обработанных туникамицином; 6 - El с мутациями во всех пяти сайтах гликозилирования. WT - бакуловирусный вектор дикого типа (отрицательный контроль). Мутантные белки обозначены - El *. кДа, маркеры молекулярной массы белков.

Введение в белок El дополнительного сайта гликозилирования (N6) не влияло на синтез гликопротеина El в клетках насекомых и не изменяло его электрофоретическую подвижность по сравнению диким типом (Рис.3 А, Б). Нарушение сайтов гликозилирования в различных комбинациях белка El также не влияло на его синтез, при этом электрофоретическая подвижность мутантных белков возрастала пропорционально уменьшению числа сайтов гликозили-

рования. Однако, отсутствие углеводных цепей в сайтах N1 и N5 Е1 существенно уменьшало уровень его экспрессии в клетках млекопитающих НЕК293Т (Рис.4 А и Б).

А 1 2 3 4 5 6 7

Рис. 4. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е1 в составе ВПЧ ВГС в клетках НЕК293Т. А -Вестерн-блоттинг белков после разделения в денатурирующем 12% ПААГ с антителами к Е1 ВГС. Лизаты клеток, синтезирующих Е1: 1 - Е1 с мутациями во всех сайтах гликозилирования; 2 - Е1 дикого типа; 3 - Е1 с мутацией в сайте гликозилирования N1; 4 - Е1 с мутацией в сайте гликозилирования N5; 5 - Е1 с мутациями в сайтах гликозилирования N1 и N5; б — Е1 с мутациями в сайтах гликозилирования N2, N3 и N4; 7 - лизат клеток НЕК293Т. Мутантные белки обозначены - ЕГ. кДа, маркеры молекулярной массы белков. Б - Анализ флуоресценции зеленого белка ОРР в клетках НЕК293Т, трансфицированных рекомбинантными плазмидными ДНК рРаз1ВасМатСЕ1Е20РР с различными мутациями в гене Е1, методом проточной цитофлуориметрии. На гистограммах по оси абсцисс указан линейный размер анализируемых частиц (клеток) в относительных единицах, а по оси ординат - относительное значение интенсивности флуоресценции. 1 - Исходные клетки НЕК293Т; клетки, трансфицированные плазмидными ДНК рРаз1ВасМат СЕ1Е2СРР с геном Е1: 2 -Е1 дикого типа; 3 - Е1 с мутацией в сайте гликозилирования N1; 4 -Е1 с мутацией в сайте гликозилирования N5; 5 - Е1 с мутациями в сайтах гликозилирования N2, N3 и N4; 6 - Е1 с мутациями в сайтах гликозилирования N1 и N5; 7 - Е1 с мутациями во всех пяти сайтах гликозилирования.

Анализ экспрессии генов мутантных вариантов белка Е1 в составе полипептида СЕ1Е2 в клетках НЕК293Т показал, что мутантные белки Е1 синтезируются в этих клетках, при этом электрофоретическая подвижность белков, как и в клетках насекомых, возрастает пропорционально уменьшению числа интактных сайтов гликозилирования. Влияние модификаций сайтов гликозилирования белка Е1 на эффективность синтеза структурных белков ВГС, оценивали по уровню синтеза полипептидов СЕ1мутЕ2СЕР, используя методы флуоресцентной микроскопии (данные не показаны) и проточной цитофлуориметрии. На рис.4, показано, что отсутствие сайтов гликозилирования N1 или N5 Е1 ведет к значительному уменьшению флуоресценции вРР, что свидетельствует о снижении уровня синтеза полипептидов СЕ1мутЕ2СЕР по сравнению с СЕ1Е20ЕР.

Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в клетках насекомых 5показал, что нарушение сайтов гликозилирования в различных комбинациях (за исключением сайта N6), не влияет на его синтез, при этом электрофоретическая подвижность мутантных белков возрастает пропорционально уменьшению числа сайтов гликозилирования (Рис.5).

кДа WT N1 N2 N6 N9 N10 mL mR £N К 90 -

Е2 WB: Mab E2

Рис. 5. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в клетках Sf9. Вестерн-блоттинг в денатурирующем 12% ПААГ с антителами к Е2 ВГС. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуло-вирусами синтезирующих Е2: WT - Е2 дикого типа; Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования N1; N2; N6; N9; N10; Nl-N7(mL); N8-Nll(mR); Nl-Nl 1(SN) - во всех сайтах гликозилирования Е2; К -отрицательный контроль (Hsp90). кДа, маркеры молекулярной массы белков.

Результаты анализа экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в составе Е1Е2, также показали, что отсутствие гликанов у гликопротеина не влияет на его синтез в клетках Sf9, но исключение составляет эффективность синтеза гликопротеина Е2 с мутацией в сайте гликозилирования N6. (Рис. 6)

WT N1 N2 N3 N4 N6 N7 N8 N9 N10 N11 mL mR £N К

Е1Е2 WB-. Mab Е2

Рис. 6. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в составе Е1Е2 ВГС в клетках Sf9. Вестерн-блоттинг в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к Е2 ВГС. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами синтезирующих Е2 в составе Е1Е2: WT — Е2 дикого типа; Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования N1; N2; N3; N4; N6; N7; N8; N9; N10; N11; Nl-N7(mL); N8-Nll(mR); N1-N11Q]N) — во всех сайтах гликозилирования Е2; К — отрицательный контроль (Hsp90). кДа, маркеры молекулярной массы белков. Мутантные белки обозначены Е2*.

Экспрессию мутантного белка E2N6 сравнивали с экспрессией мутантного белка E2N1 и Е2 дикого типа в клетках Sf9 в зависимости от времени инфекции клеток. Анализ показал, что уровень экспрессии этих белков в клетках 5/9 сохраняет одинаковую зависимость от времени инфекции клеток. Очевидно, что гликан в сайте E2N6 влияет на уровень синтеза гликопротеина Е2 ВГС в клетках Sf9 (Рис.7 А и Б).

54ч 60ч 72ч 72ч

кДа 118

N1

N6

WT N1

N6

WT N1

N6

WT К

Е1Е2 WB: Mab ß-акпш

Рис. 7. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в составе Е1Е2 ВГС в клетках Sf9 в зависимости от времени инфекции клеток. А - Вестерн-блоттинг в денатурирующем 12% ПААГ с антителами к Е2 ВГС, Б - с антителами к ß-актину. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами Е1 Е2мут, синтезирующими Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования N1; N6; Е2 WT - дикого типа. К — отрицательный контроль (Hsp90). кДа, маркеры молекулярной массы белков. 54ч, 60ч, 72ч - время инфекции.

Оказалось, что интенсивность синтеза Е2 ВГС в клетках млекопитающих зависит от присутствия гликанов в определенных сайтах гликозилирования. Для анализа влияния ТЧ-гликанов гликопротеина Е2 ВГС на эффективность экспрессии белков оболочки вируса в клетках млекопитающих, были сконструированы плазмидные ДНК на основе бакуловирусно-го вектора рРа81ВасМатЮРР с экспрессирующими кассетами под контролем промотора СМУ, с последовательностями кДНК мутантных Е2. Полученными векторными ДНК рРаз1ВасМатСЕ1Е2мутОРР, кодирующими Е2 с точечными заменами в сайтах гликозилирования N1, N2, N4, N8, N10, тЦШ-Ш), тЩШ-МП) и ^(Ш-Ш1) трансфицировали клетки НЕК293Т человека. Экспрессию генов мутантных белков Е2 ВГС и эффективность их гликозилирования в клетках оценивали по уровню синтеза полипептидов СЕ1Е2мутСРР, используя методы проточной цитофлуориметрии и электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблот-тингом (Рис.8 А, Б).

N1 N2 N4 N8 N10 тЬ пЛ К

СЕ1Е2 \УВ: МаЬ Е2

Рис. 8. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в составе полипептида СЕ1Е2 ВГС в клетках млекопитающих. А - Анализ флуоресценции зеленого белка ОРР в клетках НЕК293Т, трансфициро-ванных рекомбинантными плазмидными ДНК рРаз1ВасМатСЕ1Е2мутОРР методом проточной цитофлуориметрии. На графике по оси ординат указано относительное значение интенсивности флуоресценции, по оси абсцисс указаны клетки экспрессирующие мутантные белки Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования N1, N2, N4, N8, N10, тЦЖ-М7), тЩК8-№1) и 2ЖМ1-Ы11); Б - Вестерн-блоттинг в денатурирующем 8% ПААГ с антителами к Е2 ВГС в клетках НЕК293Т, трансфицирован-ных рРа81ВаеМашСЕ1Е20РР, синтезирующими Е2: \УТ - Е2 дикого типа; Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования N1; N2; N4; N8; N10; Ы-ЩтЕ); Ы8-Ш1(тЯ); №-Ш10>1) - во всех сайтах гликозилирования Е2; К - отрицательный контроль (НврЭО); кДа, маркеры молекулярной массы белков. Мутантные белки обозначены Е2*.

Согласно результатам проточной цитофлуориметрии, отсутствие сайтов гликозилирования N1 и N8 Е2 ВГС приводит к значительному снижению флуоресценции йРР, что свиде-

тельствует о снижении синтеза Е2 в составе полипептидов CElE2MyTGFP в клетках НЕК293Т, по сравнению с исходным. К незначительному снижению синтеза гликопротеина Е2 ведет мутация в сайте N10. Электрофорез в ПААГ, с последующим иммуноблоттингом, показал, что мутантные варианты Е2 синтезируются в клетках млекопитающих, а интенсивность их синтеза зависит от присутствия гликанов в определенных сайтах гликозилирования белка. При этом электрофоретическая подвижность белков возрастает пропорционально уменьшению числа сайтов гликозилирования.

Таким образом, согласно нашим результатам, удаление единичных сайтов гликозилирования гликопротеина El и Е2 (за исключением сайта N6), не сказывается на эффективности синтеза этих белков в клетках насекомых S/9, а их электрофоретическая подвижность возрастает пропорционально снижению числа сайтов гликозилирования. Отсутствие углеводных цепей в сайтах N1 и N5 El существенно уменьшает уровень его экспрессии в клетках млекопитающих НЕК293Т, а уровень синтеза гликопротеина Е2 ВГС в клетках НЕК293Т зависит от присутствия гликанов в сайтах гликозилирования N1, N8 и N10.

Известно, что N-гликозилирование в клетках Spodoptera frugiperda, в которых могут отсутствовать соответствующие гликозилтрансферазы, не всегда происходит в полной мере так, как в клетках млекопитающих. Проблемы неадекватности гликозилирования для разных гликопротеинов иногда приходится преодолевать. Мы показали, что в клетках насекомых SJ9 происходит не только синтез белков оболочки ВГС, но и их эффективное посттрансляционное гликозилирование. Обработка мутантных гликопротеинов El эндогликозидазой EndoH с последующим вестерн-блот анализом, показала, что синтезированные в клетках насекомых мутантные гликопротеины, как и природный белок ВГС, чувствительны к последней (Рис. ЗБ). Анализ экспрессии генов гликопротеинов El и Е2 ВГС, синтезированных в инфицированных бакуловирусом bv-ElE2 клетках насекомых в присутствии и отсутствии туникамицина, с помощью вестерн-блоттинга с антителами к Е2 ВГС (Рис. 9 А и Б) также демонстрирует, что в клетках Sf9 происходит эффективное гликозилирование мутантных гликопротеинов ВГС.

А

Е1Е2

Е1Е2

кДа

ElE:\VB: МаЬЕ2

I ikJo II

WT N10 WT N10

118 90 ЯГ - -— 90 -

50 50

34 нн V „...А 54 щ.

Е2 Е2*

Е1Е2 \VB: Mab Е2

Рис. 9. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в составе Е1Е2 ВГС в клетках Sß. А - Вестерн-блот анализ экспрессии мутантных белков в клетках насекомых Sß в присутствии и отсутствии туникамицина в денатурирующем 12% ПААГ-геле с антителами к Е2 ВГС. Б - Вестерн-блот анализ гликопротеинов, обработанных эндонуклеазой Endo Н, в денатурирующем 12% ПААГ с антителами к Е2 ВГС. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами синтезирующих Е2; WT - Е2 дикого типа; N10 - Е2 с мутацией в сайте гликозилирования N10; К — отрицательный контроль (Hsp90); кДа, маркеры молекулярной массы белков.

3. Исследование роли гликозилирования белков оболочки ВГС в вирусном морфогенезе в клетках насекомых и млекопитающих.

Влияние Г^-гликанов гликопротеинов оболочки вируса гепатита С на образование продуктивного комплекса Е1Е2 в клетках 5/9. О влиянии мутаций в сайтах гликозилирования белков оболочки ВГС на их укладку и формирование комплексов Е1Е2 в клетках насекомых судили по взаимодействию с ними клеточных кальнексина и кальретикулина. Специфическое взаимодействие мутантных гликопротеинов Е1 с кальнексином, играющим важную роль в фолдинге гликопротеинов, указывает на образование правильно свернутых функциональных белков и гетеродимеров Е1Е2 в клетках насекомых (Рис.10 А и Б).

А Б

12345 12345

кДа шк,„

118 £йс

50 :

Е2*

*

1Р:ап«-Е2 1Р:апН-Е2

\\;В: апЧ-саШехт \УВ: апи-са1ге1к:и1ш

Рис.10. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е1 в составе Е1Е2 ВГС в клетках 5/9. А - Вестерн-

блоттинг в 10% ПААГ с антителами к кальнексину и Б - к кальретикулину после предварительного

иммуноосаждения с антителами к Е2. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами

синтезирующих Е1: 1 — Е1 дикого типа; 2 — Е1 с мутацией в сайте гликозилирования N3; 3 — Е1 с

мутацией в сайте гликозилирования N5; 4 - Е1 с мутациями в сайтах гликозилирования N1 и N5; 5 - Е1

с мутациями во всех пяти сайтах гликозилирования. кДа, маркеры молекулярной массы белков.

Оказалось, что сборка гликопротеиновых комплексов Е1Е2 ВГС в клетках насекомых зависит от нарушения сайтов гликозилирования N1 и N5 гликопротеина Е1, в то время как мутации остальных сайтов ее не нарушают.

Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в составе гликопротеиновых комплексов Е1Е2 в клетках насекомых 5/9 показал, что при нарушении одного из сайтов гликозилирования N3, N4, N7, или N8 формируется нековалентно связанный комплекс Е1Е2 также, как и в случае экспрессии Е2 дикого типа. Мутантные Е2, лишенные сайтов N9 и N11, проявляют промежуточный эффект на сборку гликопротеинов оболочки ВГС. По мере увеличения числа поврежденных сайтов (Ы1-К7(гпЬ) и N8-1^11(тЯ), взаимодействие гетеродимеров с кальнексином уменьшается и сборка продуктивного комплекса Е1Е2 нарушается. Агрегаты неправильно свернутых димеров Е1Е2, образованные белком Е2 с мутациями во всех сайтах гликозилирования, с кальнексином не взаимодействуют. Интересно, что сборка нековалентно связанного комплекса Е1Е2 нарушается также в результате повреждения одного из сайтов N1, N2 или N10. Мутации именно этих сайтов гликозилирования Е2, по видимому, препятствуют образованию правильной конформации белков, образующих функциональный комплекс Е1Е2 (Рис 11 А, Б и В).

E1E2 WB: Mab CRT

Рис.11. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в клетках SJ9. А - Вестерн-блоттинг в денатурирующем 12% ПААГ с антителами к кальнексину после предварительного иммуноосаждения антителами к гликопротеину Е2 ВГС. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами синтезирующих Е1Е2: WT - Е2 дикого типа; Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования N1; N2; N3; N4; N6; N7; N8; N9; N10; N11; Nl-N7(mL); N8-Nll(mR); Nl-Nll(SN) - во всех сайтах гликозилирования Е2; Б - Вестерн-блоттинг в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к кальнексину и В - к кальретикулину. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами синтезирующих Е2 с мутациями в составе Е1Е2; К - отрицательный контроль (Hsp90), кДа, маркеры молекулярной массы белков; Мутантные белки обозначены Е2*.

Таким образом, очевидно, что гликаны связанные с сайтами гликозилирования N1 и N5 Е1 и N1, N2 или N10 Е2 ВГС, играют существенную роль в образовании правильной конформа-ции этих белков при формировании функционального комплекса и продуктивной сборки вирусоподобных частиц в клетках Sf9.

Влияние N- гликанов гликопротеинов оболочки вируса гепатита С на образование вирусоподобных частиц в клетках насекомых и млекопитающих. Известно, что эффективная экспрессия структурных белков ВГС в клетках насекомых сопровождается образованием вирусоподобных частиц. Нами показано, что в клетках насекомых, зараженных рекомбинант-ным бакуловирусом bv-CElE2, образуются ВПЧ, которые локализуются в мембранах ЭР клетки и не секретируются в среду культивации (Рис.12 А, Б).

Рис. 12. А - Электронная микроскопия препаратов макросом и Б - очищенных ВПЧ. Препараты получены из клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами: 1 - bv-CAT/Gus; 2 - bv-CElE2; 3 - bv-C+El+E2 (котрансфекция).

Мы проверили, как влияет модификация сайтов гликозилирования гликопротеинов El и Е2 на образование ВПЧ ВГС в клетках насекомых и млекопитающих.

Из клеток насекомых, трансдуцированных бакуловирусными векторами pFastBacCE 1 мутЕ2, выделяли микросомы, которые затем анализировали с помощью электрофореза в ПААГ и вестерн-блоттинга с антителами к Е2 (Рис. 13А) и электронной микроскопии (Рис. 13Б). Мы обнаружили, что отсутствие гликанов в сайтах гликозилирования белка El не влияет на образование ВПЧ в клетках насекомых. Вероятно, ВПЧ образованные мутантны-ми E1N1 или EIN5, могут содержать неправильно упакованные гликопротеины.

4 5 6

Рис.13. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е1 в составе ВПЧ ВГС в клетках 5/Р. А - Вестерн-блоттинг в денатурирующем 12% ПААГ с антителами к Е2 ВГС Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами Ьу- СЕ1Е2 синтезирующие Е1: 1 — Е1 дикого типа; 2 — Е1 с мутацией в сайте гликозилирования N1; 3 - Е1 с мутацией в сайте гликозилирования N5; 4 - с мутациями в сайтах гликозилирования N2, N3, и N4; 5 — с мутациями во всех пяти сайтах гликозилирования; 6 - бакулови-русом Ьу- САТ/Ош. кДа, маркеры молекулярной массы белков. Частично дегликолизированный белок обозначен - Е2*. Б - Электронная микроскопия вирусоподобных частиц ВГС во фракциях микросом, очищенных из инфицированных рекомбинантными бакуловирусами клеток 5/9. Положение ВПЧ показано стрелками.

Влияние нарушения сайтов гликозилирования гликопротеина Е2 ВГС на экспрессию генов мутантных белков Е2 в составе СЕ1Е2 ВГС, на сборку гетеродимеров Е1Е2 и, соответственно упаковку СЕ1Е2 в составе ВПЧ, в клетках 5/9 оценивали с помощью специфического

взаимодействия мутантных гликопротеинов с кальнексином и кальретикулином, демонстрируя фолдинг гликопротеинов (Рис.14 А, Б и В).

А кД» ХУТ ш ш N>0 N1' т>- тК К

СЕ1Е2 П>: СМ'. « В к

Рис.14. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в составе СЕ1Е2 ВГС в клетках 5/9. А -Вестерн-блоттинг в денатурирующем 8% ПААГ с антителами к Е2 ВГС, Б - с антителами к Е2 ВГС после предварительного иммуноосаждения антителами к кальнексину и В - к кальретикулину. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами синтезирующих Е2 в составе СЕ1Е2: Ч/Т- Е2 дикого типа; Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования N1; N2; N3; N4; N6; N7; N8; N9; N10; N11; №-Ы7(тЬ); Н8-Ы11(шК); Ш-Ш1(£К) - во всех сайтах гликозилирования Е2; К - отрицательный контроль (Нзр90). кДа, маркеры молекулярной массы белков. Мутантные белки обозначены Е2*.

Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в составе СЕ1Е2 в клетках насекомых 5/9 показал, что нарушение сайтов гликозилирования в разных комбинациях (за исключением сайта N6), не влияет на их синтез, при этом электрофоретическая подвижность мутантных белков возрастает пропорционально уменьшению числа сайтов гликозилирования (Рис.14 А). Мутации, введенные в сайты гликозилирования N3, N4, N7, N8, N9, N11 Е2 не препятствуют укладке гликопротеинов в составе СЕ1Е2 ВГС в клетках 5/9. В то же время, повреждение сайтов N1, N2 и N10 ее нарушает, приводя к образованию непродуктивных гетеродимеров Е1Е2 и, соответственно, их неправильной упаковке в составе ВПЧ (Рис.14 Б, В). Образование агрегатов неправильно свернутых гликопротеинов не препятствует формированию ВПЧ ВГС в клетках насекомых, но, по всей видимости, приводит к образованию дефектных вирусных частиц, отличающихся от природных.

Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в составе СЕ1Е2 в клетках почки человека НЕК293Т показал, что при образовании белков Е2, лишенных одного из сайтов гликозилирования N4 или N8, не нарушается правильная упаковка гликопротеинов в составе СЕ1Е2 ВГС, также как и в клетках 5/9. При этом, по мере увеличения числа поврежденных сайтов гликозилирования Ш-К7(тЬ) или Ш~Ы11(т11) Е2, взаимодействие образованных

гетеродимеров с кальнексином уменьшается, а с капьретикулином увеличивается. С кальрети-кулином взаимодействуют димеры, образованные Е2 с мутациями во всех сайтах гликозили-рования Интересно, что сборка продуктивного комплекса Е1Е2 и его упаковка в составе

ВПЧ в клетках млекопитающих, также как и в клетках насекомых, нарушается в результате повреждения сайтов гликозилирования N1, N2 и частично N10 Е2 (Рис.15 А и Б).

А

N10 mL mR IN

118

90

50

СЕ1Е2 WB:Mab CNX

Б кДа N1 N2 N 4 N8 N10 mL mR IN WT К

118 90 —-

г—СЕ1Е2 CE1E2«

¡=СЕ1Е2 г СЕ1Е2*

СЕ1Е2 WB:Mab CRT

Рис.15. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в составе СЕ1Е2 ВГС в клетках млекопитающих НЕК293Т. А — Вестерн-блот в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к кальнексину и Б - к кальретикулину. Лизаты клеток, трансфицированные рекомбинантными плазмидными ДНК pFastBacMamCElE2GFP синтезирующими Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования: N1; N2; N4; N8; N10; Nl-N7(mL); N8-N1 l(mR); Nl-Nl 1(£N) - во всех сайтах гликозилирования; WT - Е2 дикого типа; К — отрицательный контроль (Hsp90). кДа, маркеры молекулярной массы белков. Мутантные белки обозначены Е2*.

Оказалось, что сборка продуктивного комплекса Е1Е2 в составе СЕ1Е2 ВГС в клетках млекопитающих, также как и в клетках насекомых, нарушается в результате повреждения сайтов гликозилирования N1, N2 и частично N10 гликопротеина Е2. Отсутствие углеводных цепей в сайтах N1, N2 и, в меньшей степени N10, гликопротеина Е2, по-видимому, играет существенную роль в нарушении конформации белков функционального комплекса ВПЧ ВГС, препятствуя образованию в клетках полноценных вирусных частиц.

Т.о., как следует из представленных результатов, введение мутаций в сайты гликозилирования не препятствует образованию ВПЧ ВГС в клетках, но, вероятно, ВПЧ, образованные мутантными E1N1, E1N5, E2N1, E2N2 и E2N10, могут содержать неправильно упакованные гликопротеины.

Мы показали образование ВПЧ ВГС в клетках насекомых с помощью Вестерн-блоттинга с антителами к ВГС и электронной микроскопии. Для получения биофизических характеристик ВПЧ ВГС, полученных в клетках млекопитающих, проводили их очистку и концентрирование центрифугированием через 30% сахарозную "подушку" при 230000g, а осадок ВПЧ анализировали с помощью центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы. Собранные фракции оценивали по осаждению при плотности, типичной для частиц вируса гепатита С (1,14 до 1,16 г/смЗ) и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с антителами к структурным белкам (Рис.16 А, Б и В).

Рис. 16. Анализ вирусоподобных частиц ВГС, полученных в клетках НЕК293Т, с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы. Вестерн-блоттинг ВПЧ десяти фракций, начиная с верхней, в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к Кор и Е2 ВГС. Клетки НЕК293Т трансфицированы рекомби-нантными ДНК pFastBacMamCElE2GFP: А - исходная ДНК; Б - ДНК с мутацией в сайте гликозили-рования N1 Е2; В - с мутациями во всех сайтах гликозилирования Е2; Фракции 1-10; кДа, маркеры молекулярной массы белков.

Иммуноблоттинг с антителами к белкам core и Е2 показал, что ВПЧ содержатся во фракциях с плотностью 1.14 - 1.16г/см3, что может свидетельствовать о присутствии в них фрагментов РНК.

РНК клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом Ьу-СЕ1Е2мут анализировали с помощью ОТ-ПЦР. Полученную кДНК амплифицировали методом ПЦР с праймерами к генам структурных белков core и Е2 ВГС (Рис.17 А и Б).

А

Б п.н. К+ WT WTm N1 Nlm mR mRm £N £Nm K_ 1500 I-I--————-——-Щ-|-

looo * *...'-V"»« ■^^yj.jgrgl^jig/ ■ ,X " -йлП

750 > .Л--- ■М.^тлИьЛЭВе«'' ¿1 s*trff.. -A--J... f!

Рис. 17. ОТ—ПЦР - анализ вирусной РНК клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами bv-CEl Е2мутВГС. Электрофоретическая подвижность кДНК в 1% агарозном геле: А - кДНК генов белка Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования N1, N8-N1 l(mR) и Nl-Nl I(£N) - во всех сайтах гликозилирования для клеток и Nlm, mRm, XNm для среды, полученные с праймерами к нуклеотидной последовательности гена белка кор; Б - с праймерами к нуклеотидной последовательности гена белка Е2; WT и WTm - Е2 дикого типа; - отрицательный контроль (Hsp90) К+ - положительный контроль (pFastBacHTB- СЕ1Е2); Маркеры длины фрагментов ДНК (п.н.).

ОТ-ПЦР на суммарной РНК с праймерами к последовательности генов core и Е2 ВГС, выявил фрагменты РНК структурных белков. Аналогичные результаты получены и для клеток НЕК293Т. Т.о., показано, что N- гликаны гликопротеина Е2 ВГС не влияют на синтез РНК структурных белков в клетках насекомых и млекопитающих и, возможно, на включение этих РНК в вирусоподобные частицы.

Влияние /V- гликинов гликопротеина Е2 ВГС на связывание рекомбинантных вирусоподобных частиц ВГС, полученных в модельной бакуловирусной системе, с рецептором

19

CD81 в клетках Huh-7. В настоящей работе мы изучали связывание ВПЧ ВГС, полученных в клетках насекомых, с клетками Huh—7. Клетки Huh-7, обработанные и не обработанные антителами к CD81, инкубировали с ВПЧ, несущими мутантные Е2 и анализировали связывание мутантных белков Е2 с клетками методом Вестерн-блоттинга (Рис. 18). Предварительно была определена рабочая концентрация ab-CD81 (20 мкг/мл).

WT N1 WT N1 ш N6 N1Q yN K

+AbCD81 +AbCD81

Рис. 18. Анализ мутантных белков Е2 в составе рекомбинантных ВПЧ ВГС, связавшихся с клетками Huh-7, обработанными и не обработанными антителами к CD81. Вестерн-блоттинг мутантных белков Е2 в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к Е2 ВГС. Лизаты клеток Huh-7 после инкубации с рекомбинантными ВПЧ, выделенными из клеток насекомых Sf9, зараженных рекомбинантными бакуловирусами, синтезирующих Е2 в составе СЕ1Е2: WT - Е2 дикого типа; Е2 с мутациями в сайте гликозилирования N1; N2; N6; N10; Nl-Nl 1(£N) - во всех сайтах гликозилирования Е2; WT+Ab CD81 и N1 +Ab CD81 - клетки Huh-7 после предварительного инкубирования клеток с Ab CD81; К - отрицательный контроль (Huh—7). кДа, маркеры молекулярной массы белков. Мутантные белки обозначены Е2*.

Анализ показал, что, образующиеся в клетках насекомых ВПЧ ВГС, содержащие мутантные варианты Е2, связываются с клетками Huh-7 независимо от присутствия на их поверхности рецептора CD81. Известно, что влияние рецептора CD81 на связывание вирусных частиц ВГС с различными клетками (HepG2, Huh-7, NKNT-3, Molt-4) проявляется по-разному. Показано, что вирусные частицы с мутантными белками Е2 в своем составе, связываются с клетками HepG2, Huh-7 CD81- зависимым способом. В то же время, при использовании модельных систем HCVpp и HCVcc, авторами были получены результаты, подтверждающие, что мутации в сайтах гликозилирования Е2 ВГС влияют на связывание вирусных частиц с рецептором CD8!.

4. Моделирование пространственной структуры мутантных белков Е1 ВГС.

Одним из возможных способов подтверждения результатов, полученных в биохимическом эксперименте, является математическое моделирование пространственной структуры белка, содержащего или не содержащего гликаны. С этой целью в настоящей работе, с использованием метода молекулярной динамики в программе HyperChem, проведен расчет оптимальной геометрии молекул белка Е1 и построены компьютерные модели пространственной структуры мутантных белков Е1, содержащих и не содержащих N-гликаны. Результат рассчитанных форм молекул десяти вариантов мутантного белка Е1 ВГС с разным количеством и расположением гликанов представлен на рисунке 19.

Б

20 40

MGYIPLVGAPLGGVARALAHGVRVLEDGVNYATGNI.PGCS 40

60 80

FSIFLIALLSCLTIPASAYEVRNVSGVYHVTNDCSNSSIV 40

100 120

YE AAD VIМ НТ PGCVPCVQ ESNSS RCHVALT РТ LAARNA SV 40

140 160

PTTTIRRHVDLLVG7TAAFCSAMYVGDLCGSIFLVSQLFTF 40

180 200

SPR RHQT VQDC0CSIY PGHISGHRMAB DHMMNU SLTTALV 40

VSQLLRI PQAIVDMVAG0 18

Рие.19. Модель трехмерной структуры белка Е1 ВГС с мутациями. А — Компьютерные модели мутантных вариантов гликопротеина Е1 с нарушенными сайтами гликозилирования (NI-N6): 1 —N1; 2 -N5; 3-N1 и N5; 4 —N2, N3 и N4; 5-N2, N3, N4 и NS; 6-N1, N2, N3 и N5; 7-N1 -N5; 8-N1.N2, N3 и N4; 9 - с введенным дополнительно сайтом гликозилирования N6; 10 - исходный вариант Е1 дикого типа. № - место прикрепления белка Е1 к мембране. Белок Е1 ориентирован таким образом, чтобы 0 располагался в нуле оси Оу. a [n] лежал в плоскости рисунка или в плоскости Оху. Масштаб каждого варианта белка изменяли так, чтобы размер всех атомов углерода (голубой) или азота (синий) или кислорода (красный) или серы (желтый) были одинаковы для всех десяти вариантов. Водород не показан. Зеленым выделены гликаны. Б — аминокислотная последовательность белка Е1 ВГС дикого типа с 218 а.к. Сайты присоединения гликанов подчеркнуты. первый выступающий из мембраны аминокислотный остаток. |n|- аспарагин ближайший к мембране, к которому присоединен гликан.

Согласно нашим данным, представленные формы различаются между собой и отличаются от структуры исходного варианта Е1 ВГС дикого типа (№10). Ранее in vitro мы показали, что отсутствие углеводных цепей в определенных сайтах гликозилирования Е1, в частности N1 или N5 и частично N2. приводит к неправильному сворачиванию белков и образованию непродуктивных комплексов Е1мутЕ2. что. в свою очередь, ведет к образованию дефектных вирусных частиц. Из представленных моделей видно, что полученные пространственные структуры этих белков совпадают (№1, №2. и №3), существенно отличаясь от структуры белка дикого типа (№10), содержащего все углеводные цепи. Данные моделирования свидетельствуют также в пользу того, что гликаны. связанные с сайтами NI и N5, играют наиболее существенную роль в придании Е1 правильной формы, необходимой для образования комплекса Е1Е2. Трехмерные структуры других различных вариантов мутантного белка демонстрируют различия в конфигурациях форм молекул, лишенных одного или более сайтов гликозилирования. Таким образом, результаты молекулярного моделирования формы молекул белка Е1 с мутациями, полученные в данной работе, подтверждают экспериментальные

данные и показывают, что N-связанные гликаны оказывают непосредственное влияние на сворачивание белков и могут играть определенную роль в функционировании этих белков.

ВЫВОДЫ.

1. Оптимизирована высокоэффективная бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых и млекопитающих, для синтеза рекомбинантных структурных белков вируса гепатита С, которые подвергаются постгрансляционным модификациям и формируют вирусоподобные частицы в мембранах эндоплазматического ретикулума зараженных клеток.

2. Для вируса гепатита С генотип 16 (штамм 274933RU) впервые показано, что нарушение единичных сайтов гликозилирования N1 и N8 белка оболочки вируса Е2, также как и N1 и N5 оболочечного белка Е1, ведет к снижению экспрессии этих белков в клетках млекопитающих в отличие от экспрессии в клетках насекомых.

3. Впервые обнаружено, что в отсутствие гликанов в сайтах гликозилирования N1, N2 и N10 белка Е2, как и N1 и N5 белка Е1 ВГС, происходит в основном образование непродуктивных, неправильно свернутых димеров Е1Е2, но это не препятствует формированию дефектных вирусоподобных частиц, в клетках SJ9 и НЕК293Т, возможно неспособных инфицировать клетки мишени.

4. Полученные данные свидетельствуют об образовании в клетках 5/9 и НЕК293Т ВГС-подобных частиц плотностью 1.14 - 1.16г/см3, содержащих фрагменты РНК структурных белков. Показано, что N-гликаны гликопротеина Е2 не влияют на синтез и, возможно, на включение этих РНК в вирусоподобные частицы.

5. Показано, что ВПЧ ВГС, полученные в модельной бакуловирусной системе, связываются с клетками Huh-7 независимо от присутствия на их поверхности рецептора CD-81, при этом на связывание не влияет нарушение сайтов гликозилирования Е2 ВГС.

6. При исследовании влияния гликанов на трехмерную структуру молекул гликопротеина Е1 ВГС впервые проведены компьютерные расчеты, с получением 3-D моделей трехмерных структур молекулы мутантного белка Е1. Подтверждена существенная роль углеводных цепей в сайтах N1 и N5 для наблюдаемой конформации белка Е1. Т.о., выявлено соответствие полученных результатов с экспериментальными данными.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. С.Н. Белжеларская, Н.Н. Королева, В.В. Попенко, B.JI. Друца, О.В. Орлова, П.М. Рубцов, С.Н. Кочетков. 2010. Характеристика структурных белков и вирусоподобных частиц вируса гепатита С, синтезированных в клетках насекомых с помощью бакуловирусной системы экспрессии. Молекулярная биология. 44 (1), с 107-119.

2. Y.V. Lyupina, O.G. Zatsepina, A.V. Timokhova, O.V. Orlova, M.V. Kostyuchenko , S.N. Belje-larskaya, M.B. Evgen'ev, V.S. Mikhailov. 2011. New insights into the induction of the heat shock proteins in baculovirus infected insect cells. Virology. 421(1), p 34-41.

3. О.В. Орлова, В.Л. Друца, П.В. Спирин, В.И. Попенко, B.C. Прасолов, П.М. Рубцов, С.Н. Кочетков, С.Н. Белжеларская. 2013. Роль N-гликанов гликопротеина Е1 вируса гепатита С в процессе сборки структурных белков вируса и формировании вирусных частиц. Молекулярная биология. 47(1), с 147-156.

4. Y.V. Lyupina, S.B. Abaturova, Р.А. Erokhov, O.V. Orlova, S.N. Beljelarskaya, V.S. Mikhailov.

2013. Proteotoxic stress induced by Autographa californica nucleopolyhedrovirus infection of Spodoptera frugiperda 5/9 cells. Virology. 436(1), p 49-58.

5. О.В. Орлова, B.A. Орлов, С.Н. Кочетков, С.Н. Белжеларская. 2014. Компьютерные модели пространственной структуры мутантных белков оболочки вируса гепатита С, влияющих на формирование вирусных частиц. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 16(3), с 168-173.

6. Y.V. Lyupina*, O.V. Orlova*, S.B. Abaturova, S.N. Beljelarskaya, A.N. Lavrov, V.S. Mikhailov.

2014. Egress of budded virions of Autographa californica nucleopolyhedrovirus does not require activity of Spodoptera frugiperda HSP/HSC70 chaperones. Virus Research. 192, 1-5.

* Оба автора внесли одинаковый вклад в подготовку данной работы.

ТЕЗИСЫ КОНФЕРЕНЦИЙ

1. Н. Н. Королева, О. В. Орлова, В. И. Попенко, С. Н. Белжеларская. 2010. Синтез и характеристика структурных белков и вирусоподобных частиц вируса гепатита С с помощью бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых. Тезисы XXII Зимней школы молодых ученых, "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Институт биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова, Москва, с. 52.

2. О. Orlova, A. Timokhova, V. L. Drutsa, A. Zinin, P. Spirin, V. Popenko, V. Prasolov, P. Rubtsov, S. Kochetkov and S. Belzhelarskaya. 2013. Glycosylation of envelope proteins of hepatitis С virus and their effects on the formation of virus particles. FEBS Journal 280 (Suppl. 1 Special Issue: 38th FEBS Congress, Saint Petersburg, Russia), p 529.

Заказ № 20-Р/10/2014 Подписано в печать 07.10.14 Тираж 100 экз. усл. пл. 1,0

ООО "Цифровичок", г. Москва, Большой Чудов пер., д.5

тел. (495)649-83-30 (С^у'/ www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru