Системы клонирования и экспрессии целевых генов и анализ биологических функций синтезированных рекомбинантных белков

Белжеларская, Светлана Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Системы клонирования и экспрессии целевых генов и анализ биологических функций синтезированных рекомбинантных белков
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Системы клонирования и экспрессии целевых генов и анализ биологических функций синтезированных рекомбинантных белков"

На правах рукописи

4841)200

БЕЛЖЕЛАРСКАЯ Светлана Николаевна

"Системы клонирования и экспрессии целевых генов и анализ биологических функций синтезированных рекомбинантных белков"

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 о МАР 2011

Москва, 2011 г.

4840266

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной эндокринологии

Учреждения Российской академии наук

Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Чумаков П.М.

чл. корр. АН Татарии, доктор биологических наук, проф. Ильинская О.Н.

доктор химических наук, проф. Тишков В.И.

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (ИБХ) Филиал ИБХ г. Пущино

Защита состоится 2011 г в ^^ часов на заседании Диссертационного

совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу 119991, г. Москва, ул.Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан

1 Г

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук .у" ^ А.М.Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Оптимизация и дальнейшее совершенствование различных используемых, а также разработка новых систем доставки и экспрессии рекомбинантных генов, в зависимости от типа клеток-мишеней и спектра задач, представляет собой важную функциональную научную задачу и имеет практическое значение в области медицины. Конструирование векторных ДНК для введения целевых последовательностей в геномы микроорганизмов, дрожжей, растений, насекомых, млекопитающих находит практическое применение для решении широкого спектра задач. На сегодняшний день используются различные методы для введения чужеродных генов в клетки про- и эукариот при помощи физико-химических способов доставки (электропорации, бомбардировки микрочастицами золота или вольфрама и т.д.) и при помощи различных вариантов биологической доставки (липидных коньюгатов - липосом, рекомбинантных вирусов и т.д). Введение рекомбинантных гибридных молекул ДНК в прокариотические и эукариотические клетки с помощью векторов имеет массу преимуществ и вышло на первый план при решении этой задачи и разработка на их основе различных систем экспрессии, обеспечивающих эффективную продукцию белков in vitro и in vivo, постоянно совершенствуется, расширяется круг задач, при решении которых они применяются.

Кишечная палочка Е. coli • наиболее генетически, биохимически и физиологически изученный микроорганизм, поэтому основные работы по гетерологичной экспрессии выполняются на этих клетках. Однако Е. coli относится к условно-патогенным для человека микроорганизмом, что может создавать определенные трудности при получении на ее основе, например, фармацевтических препаратов. Сегодня Е. coli часто используют в качестве «промежуточной» системы клонирования при конструировании гибридных молекул ДНК для других типов клеток. Так, в новых бакуловирусных системах для получения рекомбинантного вируса используются клетки Е. coli на промежуточной стадии для поддержания и размножения вирусной ДНК в виде кольцевой формы, с последующей репликацией бакуловируса в клетках насекомых.

Бактерия Bacillus subtilis по степени популярности и изученности следует за Е .coli: на ее основе также конструируют штаммы-продуценты, секретирующие чужеродные белки из клеток. В. subtilis безопасна для человека и животных и успешно освоена микробиологической промышленностью.

интенсивная разработка исследований по созданию векторной дрожжевой системы продолжает быть актуальной и в настоящее время.

Системы клеток бактерий и дрожжей имеют свои особенности при использовании в генетической инженерии и при создании векторов для клонирования и экспрессии генов, для секвенирования ДНК и в качестве модельных систем для изучения генетических процессов, которые применяются в фундаментальной и прикладной биомедицине. Получены штаммы бактерий и дрожжей, для клонирования и экспрессии генов с высокой эффективностью синтезирующие гетерологичные белки человека и животных. Каждая из систем клонирования и экспрессии имеет свои недостатки и преимущества. Системы клонирования и экспрессии генов в клетках бактерий и дрожжей не позволяют экспрессировать несплайсированные гены. Кроме того, в них невозможен сложный посттрансляционный процессинг полипептидов, происходящий в клетках млекопитающих. Поэтому все большую актуальность приобретает проблема экспрессии мультимерных белков эукариот, которые требуют для проявления своей биологической активности специфических постгрансляционных модификаций и сборки из различных субъединиц. В этих случаях используют экспрессирующие системы на основе клеток высших эукариот, которые обеспечивают синтез белков, структурно и функционально близких к своим природным аналогам. В последние два десятилетия предложено большое число векторов, в качестве которых выступают различные вирусы для введения чужеродных генов в клетки-мишени. С помощью вирусов - естественных переносчиков чужеродной ДНК в клетки млекопитающих - удается обеспечить эффективное проникновение генетического материала в клетки-мишени, достичь высокого уровня трансфекции клеток in vitro и in vivo и высокого уровня экспрессии внесеннных генов. Однако существование врожденного иммунитета у человека к большинству таких векторов может ограничить их применение.

перспективной альтернативы векторам на основе вирусов человека. Оптимизация такой системы, в зависимости от типа клеток-мишеней, является актуальной задачей современных исследований в области биомедицины.

Цель работы: Сравнительный анализ различных векторных систем, клонирование и экспрессия целевых рекомбинантных генов в клетках про- и эукариот и их применение для решения научных и прикладных задач. Оптимизация системы доставки и экспрессии генов в клетках насекомых и млекопитающих на основе бакуловирусных векторов.

Основные задачи исследования: Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. С использованием бактериальных систем клонирования и экспрессии:

Получить библиотеки бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномных РНК вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и вируса картофеля (ХВК), для изучения структуры вирусных геномов.

Разработать тест-систему для функциональной селекции библиотек мутантных рибозимов в клетках Bacillus subtilis с целью изучения механизмов функционирования синтезированных рибозимов in vivo.

2. С использованием систем экспрессии в клетках листьев табака, ооцитов:

Создать генетические конструкции для доставки и экспрессии гена серотонинового рецептора мозга мыши 5НТ1с в клетках листьев табака, ооцитах ксенопуса и клетках насекомых для изучения роли серотониновой системы в реакции различных типов клеток на стрессорные сигналы.

3. С использованием дрожжевой системы экспрессии:

Создать набор векторных конструкций, содержащих делеционные варианты промотора кислой фосфатазы РН05, для экспрессии и секреции генов в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

4. С использованием бакуловирусной системы экспрессии на основе клеток насекомых и млекопитающих:

Создать набор мультипромоторных векторов экспрессии для клеток насекомых, содержащих промоторы поздних генов вируса ядерного полиэдроза (ВЯЛ), которые обеспечивают одновременную экспрессию нескольких генов в одной инфицированной клетке насекомого.

Сконструировать трансфер-векторы на основе бакуловирусов, содержащие регуляторные элементы, используемые ферментативными системами клеток млекопитающих, для экспрессии клонированных целевых генов в культуре клеток млекопитающих.

Получить рекомбинантные вирусы и линии клеток насекомых, синтезирующие иммунологически активные а- и ß-субъединицы хорионгонадотропина (ХГ) и CD4 рецептора.

Получить рекомбинантную функционально-активную стероид-21-гидроксилазу человека и мутантный вариант этого фермента с высоким уровнем экспрессии в клетках насекомых S© и HÍ5 с использованием бакуловирусов и провести функциональный анализ мутантного фермента in vitro.

Получить структурные белки и вирусоподобные частицы вируса гепатита С (ВГС ) в клетках насекомых и клетках млекопитающих с помощью бакуловирусной системы экспрессии и исследовать их функциональные характеристики.

Исследовать морфогенез вируса гепатита С: изучить влияние гликозилирования оболочечных белков ВГС на их экспрессию и процессинг и формирование вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых.

Исследовать влияние новых синтетических ингибиторов гликозилирования белков на процессинг структурных белков и формирование вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых и млекопитающих.

Научная новизна и практическая ценность работы заключается в разработке и совершенствовании систем экспрессии, с помощью которых можно эффективно получать in vitro и in vivo гетерологичные белки, имеющие практическое значение.

Предложена схема организации фрагментированного генома вируса штриховатой мозаики ячменя, показано, что исследуемые штаммы ВШМЯ являются близкородственными. Впервые получена библиотека бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномной РНК ВШМЯ.

Предложена бактериальная система селекции рибозимов на основе В. subtilis, которая может быть применена для функционального скрининга библиотек мутантных рибозимов.

Предложенная векторная система дрожжей с использованием промотора гена РН05 может быть использована для секреции гетерологичных белков в клетках S. cerevisiae.

Разработанные условия синтеза серотонинового рецептора 5НТ1с мозга мыши в клетках растений и его функциональной активности в клетках растений и в ооцитах Xenopus laevis могут быть использованы для анализа клеточной системы преобразования внешнего стимулирования во внутриклеточные сигналы в клетках растений.

Новые дву- и трех-промоторные векторы экспрессии на основе бакуловирусов позволят в одной инфицированной клетке насекомого экспрессировать одновременно несколько генов и получать мультимерные белки, функционально близкие природным аналогам.

Предложенный роллерный метод препаративного выращивания рекомбинантных бакуловирусов может использоваться для получения штаммов-продуцентов белков, имеющих практическое значение.

Новые бакуловирусные векторы с экспрессирующими кассетами под контролем промотора, функционирующего в клетках млекопитающих, и разработанные условия доставки модифицированных векторов в клетки млекопитающих могут быть успешно использованы для эффективнго переноса и экспрессии целевых генов как in vitro, так и in vivo.

Разработанные условия синтеза CYP21A2 с большим выходом в бакуловирусной системе, могут быть использованы для функционального анализа мутаций стероид-21-гидроксилазы. Данные о влиянии мутаций на свойства стероид-21 - гидроксилазы, полученные in vitro, могут иметь важное значение для прогнозирования тяжести течения классической формы адреногенитального синдрома.

Мультисубъединичные вирусоподобные частицы вируса гепатита С (ВГС), полученные в клетках насекомых с помощью бакуловирусной системы могут использоваться для иммунологических и терапевтических исследований, для получения вакцин, для поиска новых соединений с антивирусной активностью, а также в качестве модельной системы для изучения взаимодействия ВГС с клетками, механизмов размножения вируса.

Исследование N-гликозилирования оболочечных белков El и Е2 ВГС в клетках насекомых позволит уточнить роль углеводных цепей в образовании комплекса Е1Е2 и его функционировании в инфекционном цикле вируса.

Воздействие новых синтетических N-алкилированных DNJ на вирусный морфогенез ВГС может быть использовано в качестве альтернативного подхода к существующим стратегиям блокирования вируса гепатита С.

Личный вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация работы. Результаты исследований представлены на IV Международном симпозиуме СССР-ФРГ (Ереван, 1981), VI Международном симпозиуме СССР-Франция (Цхалтубо, 1982), Всесоюзном совещании «Геном вирусов растений» (Владивосток, 1982), Международной конференции (Jena, GDR, 1983), 16 конференции FEBS ( Москва, 1984), конференции " Генная и клеточная инженерия" (Москва, 1993), Международной конференции, посвященной памяти акад. А.А.Баева (Москва, 1996), V Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (Москва, 2001), VII Международной Энгельгардтовской

конференции по молекулярной биологии (Суздаль, 2004), 30-том Конгрессе РЕВЭ (Будапешт, 2005). XVII Зимней школе для молодых ученых (Москва, 2005), XI Международной конференции для молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), на XXII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010). Отдельные материалы диссертационной работы докладывались на научных семинарах Лаборатории молекулярной эндокринологии, Лаборатории популярных основ действия физиологически активных соединений и обьединенном семинаре нескольких научных подразделений биологической направленности Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта.

Публикации. По теме диссертации, помимо тезисов конференций (20), опубликована 21 статья в рецензируемых научных журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения и выводов, списка литературы по теме диссертации. Диссертация изложена на 168 страницах, содержит 46 рисунков и 8 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В работе представлена разработка различных систем клонирования и экспрессии целевых генов и анализ биологических функций белков, полученных с использованием этих систем, начиная с бактериальных и завершая бакуловирусной системой экспрессии в клетках насекомых и млекопитающих. Наиболее полно и подробно представлена эффективная бакуловирусная система экспрессии биологически активных белков, активно используемая в современной фундаментальной и практической молекулярной биологии. Работа состоит из следующих основных разделов:

1. Изучение структурной организации геномов РПК-содержащих фитопатогенных вирусов, представляющих интерес для биотехнологии, вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и Х-вируса картофеля (ХВК).

1.1. Структурная организация генома вируса штриховатой мозаики ячменя ВШМЯ. Вирус штриховатой мозаики ячменя, представляющий группу гордеивирусов, РНК-содержащий вирус с функционально фрагментированным геномом. Различные штаммы вируса различаются по количеству вирионных РНК.

1.1.1. Анализ геномных РНК разных штаммов вируса методом олигонуклеотидного картирования.

Методом фракционирования TI-олигонуклеотидов, продуктов полного гидролиза РНК рибонуклеазой TI, в системе двумерного электрофореза в ПААГ, проведен сравнительный анализ олигонуклеотидных карт геномных вирнонных РНК ВШМЯ штаммов: Русский, Типичный, N (Norvich), ND18 (North Dakota) и AM (Argentina miJd). Олигонуклеотидный анализ выявил значительное структурное сходство тотальных вирионных РНК исследуемых штаммов вируса. Кроме гомологичных последовательностей в геномных РНК разных штаммов, обнаружены штаммоспецифические олигонуклеотиды. Препараты вирусной РНК разных штаммов ВШМЯ при электрофоретическом анализе разделяются на две, три или четыре зоны, обозначенные как РНК1, РНК2, РНКЗ и РНК4. Исходя из этих данных определили двух-, трех- и четырехкомпонентные штаммы, а анализ индивидуальных геномных РНК сравниваемых штаммов вируса выявил их степень сложности и гомологию. Показано, что РНК4 является делеционным вариантом третьего геномного компонента вируса. Наличие такой делеции впоследствии подтверждено Афанасьевым Б.Н. и Рупасовым В.В в лаборатории Ю.В.Козлова (ЙМБ РАН) при определении первичной структуры РНКЗ и РНК4, после получения клонированных ДНК-копий генома ВШМЯ. Таким образом, сравниваемые штаммы, несмотря на различия в количестве геномных компонентов, имеют высокую степень гомологии геномов и являются эволюционно близкородственными. Предложена схема организации функционально фрагментированного генома ВШМЯ (Рис.1).

РНК 1 РНК 2 1>17 рнкз

р14

Рис. 1. Схема организации генома вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ). Прямоугольниками обозначены гены, кодирующие вирусные белки. Заштрихованные участки обозначают области гомологии между вирусными белками.

1.1.2. Получение бактериальных клонов, содержащих последовательности генома ВШМЯ и их анализ.

В реакции обратной транскрипции на нативных и искусственно полиаденилированных РНК ВШМЯ синтезированы одноцепочечные кДНК, комплементарные индивидуальным РНК генома вируса. Сравнительный анализ продуктов рестрикции кДНК индивидуальных фрагментов генома вируса показал, что кДНК всех четырех компонентов генома ВШМЯ штамма Аргентинский мягкий различаются по структуре. Двуспиральные ДНК получали с помощью ДНК-полимеразы I

E. coli, встраивали в плазмидиую ДНК с помощью синтетических линкеров и трансформировали ими клетки Е. coli. В результате был получен набор бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии четырех отдельных компонентов генома ВШМЯ. Весь набор ДНК вставок охватывал последовательности 3'- концевой половины каждой из четырех вирионных РНК ВШМЯ.

Таким образом, была получена библиотека бактериальных клонов для использования их при исследовании последовательности клонированных ДНК-копий, что дает информацию о структуре отдельных участков геномной РНК. Показано, что, независимо от числа РНК-компонентов, геномы всех исследуемых штаммов ВШМЯ содержат гомологичные последовательности, что все геномные РНК вируса содержат идентичные последовательности, локализованные в З'-концевой некодирующей области, что РНК4 является делеционным вариантом третьего компонента генома ВШМЯ - РНКЗ, и что 120К белок, кодируемый геномной РНК1 ВШМЯ, имеет гомологию с неструктурными белками других РНК-содержащих вирусов.

1.2. Первичная структура и организация генома Х-вируса картофеля (ХВК). Х-вирус картофеля - типичный представитель группы потекс-вирусов, содержащих одноцепочечную (+)РНК. На 5'-конце РНК находится «кэп»-струкгура, а на З'-конце - поли(А)-последовательность. Группой авторов, при участии автора настоящей диссертации, установлена полная последовательность нуклеотидов ДНК, эквивалентных геномной РНК ХВК. По результатам компьютерного анализа этой последовательности предложена схема организации генома вируса.

Для секвенирования использовано шесть ДНК - копий клонированных фрагментов вирусной РНК, перекрывающихся между собой и комплементарных району генома ХВК, кодирующему невирионные белки и захватывающему часть гена белка оболочки. ХВК- специфические вставки из рекомбинантных плазмид или их субфрагменты клонировали в векторе М13шр19 или шр8 по Smal-сайту и секвенировали по методу Сэнгера. Кроме универсальной секвенирующей затравки, использовали синтетические 15- и 16-членные олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные или идентичные последовательностям вирионной РНК ХВК. Полученные данные позволили установить полную последовательность нуклеотидов РНК ХВК из 6435 н., не считая поли (А)-блока. Эта последовательность, а также схема предполагаемой организации генома ХВК представлены в опубликованной статье (Доклады АНСССР. 300,711-716).

2. Использование бактериальной системы селекции на основе Bacillus subtilis для отбора мутантных рибозимов, эффективно функционирующих в физиологических условиях.

Предлагаемая система селекции основана на том, что рост клеток В. subtilis в присутствии

макролидного антибиотика тилозина зависит от активности рибозима, синтезируемого в клетках бактерий. Выживаемость каждого клона зависит от того, насколько эффективно рибозим расщепит лидерную последовательность РНК гена егтС, кодирующего метилазу, придающую клеткам резистентность к тилозину. Обычно метилаза вырабатывается в клетках в количестве, недостаточном для придания устойчивости к тилозину, поскольку AUG-кодон, необходимый для инициации синтеза метилазы, скрыт во вторичной структуре лидерной последовательности РНК гена егтС. В естественных условиях резистентность к тилозину проявляется в присутствии субингибиторных концентраций другого макролидного антибиотика - эритромицина, который, связываясь с рибосомой, изменяет вторичную структуру лидерной последовательности РНК гена егтС, высвобождая AUG-кодон, что приводит к синтезу метилазы. В предложенной системе Дубноу и Крамера [170,171] реорганизация лидерной последовательности мРНК егтС происходит в результате расщепления мРНК в определенном сайте под действием мутантного рибозима, что ведет к освобождению иницирующего кодона AUG (Рис.2).

Рис. 2. Схема структурной реорганизации лидерной последовательности мРНК гена егтС под действием эритромицина (а) и при расщеплении рибозимом (б); (в) - структура рибозима, связанного с субстратом мРНК ermC; d - сайты связывания с рибосомой для синтеза метилазы.

Для изучения функционирования синтезированных мутантных рибозимов в селекционной бактериальной системе на основе Bacillus subtilis мы использовали сконструированные ранее Крамером и Лизарди рибозимные последовательности, способные расщеплять лидерную последовательность мРНК егтС, проклонированные в плазмиде и введенные в специально модифицированный штамм В. subtilis. Последовательность мутантного рибозима состоит из двух областей (Рис 2, в). Первая кодирует собственно рибозим, расщепляющий лидерную последовательность транскрипта гена егтС по встроенному участку GUC. Вторая область содержит последовательность, соответствующую терминатору транскрипции гена comG В. subtilis. Двутяжевой фрагмент ДНК, содержащий рибозим и терминатор транскрипции,

клонирован Дубнау и др. в плазмнде рНК005, которая содержит промотор SPAC, направляющий транскрипцию, и введен в В. subtilis. В качестве контроля сконструирована плазмида pHKOOl, отличающаяся от рНК005 заменами, инактивирующими каталитический домен рибозима. Была сконструирована плазмида рНК002, содержащая в гене егтС сайт EcoRI, а в участке, кодирующем лидерную последовательность мРНК егтС, встроен триплет GUC, который должен служить субстратом для расщепления рибозимом . Модификация лидерной последовательности не влияет на функционирование гена егтС. Для изучения способности синтезированного рибозима расщеплять лидерную последовательность мРНК егтС были получены штаммы В. subtilis, содержащие одну копию модифицированного гена егтС. В плазмидную ДНК рНК002 встроен триплет GUC, в участок, кодирующий лидерную последовательность мРНК егтС, который должен служить субстратом для расщепления рибозимом, и получен штамм В. subtilis, содержащий одну копию модифицированного гена егтС. Модификация лидерной последовательности не влияла на функционирование гена егтС. Штаммы В. subtilis, содержащие одну копию модифицированного гена егтС , тестировали на чувствительность к тилозину в отсутствие эритромицина и устойчивость в его присутствии. Опыты показали, что клетки штамма BD430 В. subtilis, содержащие плазмиду с немодифицированным геном егтС, а также клетки штамма НК002, содержащие плазмиду с модифицированным геном егтС, устойчивы к тилозину, при этом, клетки штаммов НК005 и НК001 чувствительны к тилозину и эритромицину, поскольку в этих клетках не вырабатывается метилаза, придающая устойчивость к макролидным антибиотикам. Для изучения способности синтезированного рибозима расщеплять лидерную последовательность мРНК егтС были получены штамм НК012 В. subtilis, в клетки которого введены плазмида с последовательностью антисмысловой РНК и плазмида с транскрибируемой мишенью, а также штамм НК014 В. subtilis, в клетки которого введены плазмида, способная индуцировать экспрессию рибозима в В. subtilis, и плазмида, содержащая модифицированный егтС ген. Клетки штамма НК014 на среде с тилозином росли существенно лучше, чем клетки штаммов НК002 и контрольного НК012. Более того, они выживали в присутствии ингибирующей концентрации тилозина 10 мкг/мл, что может косвенно свидетельствовать о функционировании синтезированного рибозима. В результате были получены бактериальные трансформанты, экспрессирующие наиболее эффективные мутантные рибозимы. Результаты исследования показали, что предложенная система может быть использована для отбора рибозимов, эффективно функционирующих in vivo.

Таким образом, клонирование в клетках Е. coli позволило создать библиотеки к ДНК геномов РНК- содержащих фитовирусов ВШМЯ и ХВК. Полученные библиотеки использованы для определения первичной структуры и выяснения организации геномов этих вирусов, демонстрируя, что клонирование различных гетерологичных генов в составе векторных

молекул, введенных в клетки бактерий, позволяют достаточно просто расшифровать структуру этих генов. С использованием систем клонирования в клетках Bacillus subtilis разработана система функциональной селекции рибозимов.

Однако, в отличие от бактериальных клеток, дрожжи, например, способны осуществлять некоторые характерные для эукариот этапы пост-трансляционной модификации и сборки белка, что позволяет получать в дрожжевой клетке чужеродный белок с посттрансляционными модификациями, близкими или идентичными его нативной форме. Поэтому дрожжевые системы экспрессии стали играть важную роль в получении гетерологичных белков.

3. Создание новых векторных конструкций, содержащих делеционные варианты промотора кислой фосфатазы РН05, для экспрессии и секреции репортерных генов в клетках дрожжей S. cerevisiae.

Для решения задачи получения различных белков методами генетической инженерии создан набор дрожжевых векторов, содержащих регулируемый промотор гена кислой фосфатазы РН05 S. cerevisiae и нуклеотидные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды секретируемых белков. Эти векторы применены для получения штаммов дрожжей, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В и гормон роста человека. Для создания новых векторных конструкций, содержащих регуляторные области гена PHOS S. cerevisiae выполнены следующие этапы.

3.1. Получение набора фрагментов, содержащих регуляторные элементы транскрипции гена репрессибельной кислой фосфатазы дрожжей, кодируемой геном РН05.

Серию плазмид, содержащих делеционные варианты промотора РН05, получали путем обработки нуклеазой Ва131 фрагмента ДНК из плазмиды pBR322/PH03-PH05/HIS3, несущей полный ген РН05, и последующего субклонирования. Анализ первичной структуры плазмидных ДНК в полученных клонах показал, что точки делеций располагаются между стартом транскрипции и ATG-кодоном, а также в пределах области, кодирующей сигнальный пептид кислой фосфатазы (Рис. 3). В качестве терминатора транскрипции использовали фрагмент из 3'-концевой области гена кислой фосфатазы, клонированный в векторе pUC8. Плазмиды, содержащие кассету экспрессии, включающие промотор и терминатор РН05, вводили в челночный вектор дрожжей YEpl3 (Рис.4).

А Г Л Т А AGCGCTGAIGTTITGCTAAGICGAGGTIAGTATGG -во .so -4Q -st

"т и 11"

CT ICAT CIC Т СAT GAGA AT АAb А А CA ACAACAAATAGAGC

•29 -10 -1*1 I'4 К^ 20

■ TU 14 12* Л 1 г * * М , F К * i V V

ЛЛССЛЛДТТСС А с лттл с с д|лтс|ттт|л л д[т ct[g тт[стт|тл

+12 I т tjo Т М » М

» | L • ли л • l « n i 1 1 •!•

г саа tt|tta|gcc|gcttctt tg|gcc|aat|gcU|gg i|accatt т 7в Т t t t |

Р L С « К L

CCC|TTA|GGC[AAA|cia

Рис.3. Делеционные варианты промотора РН05: стрелками указаны положения синтетических линкеров, присоединенных к 3'- концам делений; положения оновных и минорных точек инициации транскрипции, сайта отщепления сигнального пептида приведены в соответствии с данными Хиннена и др. [181]

Н»£ор дглмцпвкых мутантов 1фом»торя FH05

Рис. 4. Схема конструирования плазмиды, содержащей регуляторные области гена кислой фосфатазы РН05 S. cerevisiae.

3.2.1. Варианты промотора (-36, -31, -18, -12), отличающиеся по положению линкера по отношению к инициаторному кодону кислой фосфатазы использовали для конструкции плазмид, содержащих различную структуру 5'-нетранслируемой области мРНК гена HBsAg, что позволило исследовать влияние этого участка на уровень синтеза HBs-белка в дрожжах. Уровень экспрессии HBsAg под контролем сконструированных плазмид YEpPH05(-36)/HBs, YEpPH05(-

31)/HBs, YEpPH05(-18)/HBs, YEpPH05(-12)/HBs различается боле чем на порядок. Максимальный синтез обеспечивает плазмида YEpPH05(-12)/HBs, в которой структура 5'-нетранслируемой области наиболее близка к соответствующей последовательности в гене РН05.[182].

3.2.2. Дделеционные варианты промотора гена PHOS (-12, -31, +54) использовали для изучения влияния лидерного пептида кислой фосфатазы, а также различных условий культивирования дрожжевых клеток на синтез гормона роста (ГР) человека, а также для изучения характера внутриклеточного распределения и экспорта гетерологичного для дрожжевой клетки белка гормона роста в зависимости от природы сигнальной последовательности. Для этого были сконструированы плазмиды, обеспечивающие синтез ГР в зрелой форме, в форме предшественника с собственной сигнальной последовательностью, с сигнальной последовательностью дрожжевой кислой фосфатазы.

Результаты исследования экспрессии ГР в дрожжах показали, что при использовании промотора РН05 наиболее эффективно экспрессирется ген ГР, не содержащий последовательности сигнального пептида. Исследование субклеточного фракционирования секретируемого гена ГР в дрожжах показало, что при использовании промотора РН05 наблюдается максимальный уровень зрелого ГР, при этом 90% гормона содержится в цитозоле. Добавление собственной СП или СП дрожжевой кислой фосфатазы приводило к значительному снижению уровня экспрессии, при этом продукты синтеза ГР в основном локализовались в периплазме и вакуолях. Показано, что СП обеспечивает не только вхождение белка в секреторный поток, но и предопределяет его конечную локализацию. Это открывает возможность экспериментально управляемой «посылки» белков в различные внутриклеточные компаргменты и за пределы клетки - в окружающую среду [183]. Таким образом, разработанная и предложенная векторная систьема дрожжей может быть использована для секреции гетерологичных белков в клетках S. cerevisiae. Дрожжи, у которых основные черты секреторного процесса схожи с таковыми у высших эукариот, могут быть использованы в качестве промышленных продуцентов рекомбинантных белков млекопитающих.

4. Роль серотоннновой системы в реакции различных типов клеток на стрессорные сигналы.

Накопленные доказательства общности основных биохимических процессов и регуляторных систем в животной и растительной клетках указывают на существование похожих клеточных механизмов передачи сигналов. Для сравнения систем передачи сигнала в растительных и животных клетках исследована роль серотониновой системы в реакции различных клеток на стрессорные сигналы. Для изучения реакции клеток растений и ооцитов Xenopus laevis на

стрессорный сигнал, активированный взаимодействием серотонинового рецептора с серотонином, мы использовали рекомбинантный рецептор серотонина 5НТ1с мозга мыши.

4.1. На основе растительных векторов экспрессии ТМУ рЛС-вС2 и рМС<12 были сконструированы рекомбинантные ДНК, содержащие ген серотонинового рецептора 5НТ1с мыши в векторе ТМУ рАС-0С2: рАОС-5Е1М и рЛСС-5ЕК-2 и в агро-векторе рМ0с!2: рМСс12-БЕЛ, способные направлять в клетках растений синтез белкового продукта серотонинового рецептора мыши, слитого с зеленым или красным флуоресцентным белком (Рис. 5).

Рис. 5. Схематическое изображение рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих ген серотонинового рецептора 5НТ1с мыши а - pAGC-SER-l; б- pAGC-SER-2; в- pMGd2-SER.

4.2. Экспрессию и активность рецептора серотонина проверяли в составе гибридных молекул.

1) Для этого мРНК гибридных белков, полученные в системе транскрипции in vitro, инъецировали в ооциты Xenopus laevis и провели электрофизиологический анализ экспрессии и функционирования гибридного белка и связанных с ним ионных каналов. Оказалось, что флуоресцентный белок встраивается в мембрану и что рецептор серотонина в составе гибрида активен. Электрофизиологические показатели регистрировали при помощи электронной аппаратуры с использованием метода «пэтч-кламп». Синтезированный в ооцитах рецептор 5НТ1с, связываясь с гормоном 5НТ, стимулировал Са2+- зависимый СГ- ионный канал, открывая поток ионов С1" и изменяя при этом проводимость канала.

2) продукты транскрипции in vitro инокулировали в листья табака, после чего в них наблюдалась флуоресценция, демонстрируя экспрессию сконструированных гибридных генов в клетках растений (Рис.6).

Рис. 6. Флуоресценция гибридных генов (5HTlc-GFP in pAGC-SER-l), экспрессирующихся в листьях табака после инокуляции продуктов транскрипции in vitro.

Совокупность полученных предварительных данных позволяет предположить, что в клеточном ответе на 5НТ рецептор серотонина 5НТ1с мозга мыши связывается с гормоном и, при участии GTP-связывающего белка, активирует фосфолипазу С, инициируя ионный поток кальция в клетке.

4.3. Клонирование и экспрессию кДНК гена серотонинового рецептора мыши в клетках насекомых проводили с использованием бакуловирусной системы экспрессии, которая позволяет синтезировать белковый продукт в количествах, достаточных для электрофизиологических исследований при изучении функционирования ионных каналов. С помощью сконструированной рекомбинантной бакмидной ДНК ген рецептора серотонина 5НТ1с переносили в геном вируса ядерного полиэдроза калифорнийской совки AcMNPV с образованием рекомбинантного бакуловируса, что обеспечивало заражение клеток насекомых Sf9 и продукцию рекомбинантного серотонинового рецептора (Рис.7).

12 3 4 Ма

MB*

^ w

Рис. 7. Характеристика рекомбинантного белка рецептора серотонина 5НТ]с в инфицированных клетках насекомых SÍ9. Электрофоретическое разделение в 12% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия; I- клетки, инфицированные вирусом дикого типа AcNPV; 2- клетки, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом; 3- выделенный и очищенный на Ni-NTA смоле рецепторный белок из клеток, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом; 4- маркерные белки.

5. Экспрессия генов хорионического гонадотропного гормона человека и рецептора CD4 в клетках насекомых, с использованием бакуловирусной системы экспрессии.

Для обеспечения синтеза белков, струк!урно и функционально близких к своим природным аналогам, применяют перенос и экспрессию трансгенов в клетках эукариот in vitro и in vivo. С этой целью нами использованы бакуловирусы в качестве экспрессирующих векторов и разработаны на их основе экспрессирующие системы в клетках насекомых и млекопитающих.

5.1. Сконструированы плазмиды на основе бакуловирусных векторов, содержащие кДНК альфа- и бета-субъединиц хориогонадотронина (ХГ) человека и рецептора CD4, под

контролем промотора гена полиэдрина вируса ядерного полиэдроза (AcMNPV) (Рис.8).

^-тр \ ЕсМ

Hindi I,1/ X

pAcYMCC4

' sCD4

У п({1>-су6ьепИ1!ида \ //

X orR\ ^ 'У

fixRV

Рис.8. Схематическое изображение рекомбинантных бакуловирусных векторов pAcYMa(P)-CG и pAcYMCD4, несущих гены альфа- или бета-субъединиц ХГЧ и рецептора CD4.

5.2. Получены рекомбинантные вирусы и линии клеток насекомых , синтезирующие иммунологически активные белки альфа-ХГ, бета-ХГ и рецептор CD4. Для очистки рекомбинантных вирусов проведено три цикла их клонирования при помощи метода бляшкообразования (Plaque hybridization). Результаты иммунодетекции полученных белков с антителами к альфа-ХГ, бета-ХГ и CD4 - рецептору ВИЧ-1 представлены на (Рис.9).

12 3 ¡2 6 Х-1

-чп---ч . \ —* |Н1Г

I. & м \ч

'Г,- • О'

Рис. 9. Иммунодот белков, синтезируемых рекомбинантными бакуловирусами; а - Ьу-аСО(а-субьединица ХГЧ (А) и bv-ßCG(ß- субъединица ХГЧ (Б), стрелками обозначены /-белки из неинфицироанных клеток Sf9, 2- белки из клеток Sf9, инфицированных диким вирусом AcNPV, 5-очищенный ХГЧ; б - bv-CD4(CD4 - рецептор ВИЧ-1), стрелкой I обозначены белки из неинфицироанных клеток Sf9, стрелкой 2- белки из клеток Sf9, инфицированных диким вирусом AcNPV.

5.3. Отработана оптимальная схема препаративного выращивания клеток насекомых для получения рекомбинантных белков. При разработке условий трансфекции культуры клеток Sß> и роллерного культивирования инфицированных клеток для получения большого количества бакулолвирусов нами была усовершенствована система получения рекомбинантного вируса ядерного полиэдроза (ВЯП). Данная система предусматривает использование структурного гена ß-галактозидазы Е. coli под контролем промотора гена полиэдрина ВЯП калифорнийской совки AcMNPV в плазмиде рАсЗбО ß-gal в качестве маркера при отборе гибридных вирусов. Из

культуральной жидкости выделяли вирус, очищали и использовали для выделения инфекционной ДНК. Из 1 л культуральной жидкости выделяли в среднем 70-100 мг очищенного вируса и 300-500 мкг вирусной ДНК. Из 200 мл клеточной культуры с помощью лизиса клеток получали около 200 мкг суммарной ДНК, из них 50 мкг -вирусной. Выделенная вирусная ДНК не теряла активности при хранении в течение 5 месяцев при 4°С.При длительном хранении в замороженном состоянии при -20°С за год активность препарата снижалась в 2 раза.

6. Оптимизация бакуловирусной системы доставки и экспрессии генов в клетках насекомых.

В этой части работы нами предложен новый набор векторов экспрессии на основе бакуловирусов насекомых, позволяющий экспрессировать одновременно несколько генов в одной инфицированной клетке насекомого и получать мультимерные белки.

6.1. Проклонированы EcoRl - S- J- и Р-фрагменты геномной ДНК вируса ядерного полиэдроза (AcMNPV), содержащие гены поздних вирусных белков р35, р39 и plO. J-фрагмент длиной 6.66 т.п.н., содержащий ген вирусного белка р39 и S-фрагмент длиной 1.38 т.п.н., содержащий ген белка рЗ5 клонировали в бактериальной плазмиде pUC18, а Р-фрагмент длиной 1.9 т.п.н., содержащий ген позднего вирусного белка р 10 - в плазмиде pUCl 18 (Рис. 10).

I R О A J KTMN F VU С WG D Q L Е II SXP В

1 III I I 111! III II 1 II II III д

6000 u

MCS S(p35)

pUCISS: S-фрагмент, 1.3S т.п.н (p.35) pUC18_

НШ EI

r , ISJ MCS Pip/O) pUC118P: Р-фрагмент, 1.90 т.п.н (plO) pUC118 шш^ -s»

НШ El El

MCS J(p39)

pUC18J: J-фрагмент, 6.66 т.п.н (p39) pUC18

1 Г

ИП1 El El

Рис. 10. Схема получения плазмид, содержащих EcoRI-фрагменты геномной ДНК AcNPV. А -EcoRI-фрагменты AcNPV, буквами I - В обозначены полученные фрагменты; Б - новые плазмидные ДНК: pUC18S содержит S-фрагмент; pUCl 18Р содержит Р-фрагмент и pUC18J несет J-фрагмент AcMNPV.

6.2. Субклонированы полученные промоторные фрагменты генов р35, р39, р10 и рИ геномной ДНК вируса ядерного полиэдроза (ВЯП) (Рис. 11).

Xhol BamHI Xtaí

orí 3226t-h.ii. П

amp

Hndlll KpniHintillI

Рис. 11. Схематическое изображение плазмид, содержащих промоторы генов белков вируса ядерного полиэдроза: а - р39, б и в - рЮ, в -полиэдрина ; ген устойчивости к ампициллину; фрагменты плазмид pUC, включающие участок orí; fl ori, lacZ промотор; единичные рестриктазные сайты.

6.3. Получены новые двух- и трех-промоторные векторы экспрессии pAcSG2pH, pAcSGpHp39, pAcSGpHplO, pAcSG2pHplO на основе бакуловирусов, с использованием субклонированных фрагментов геномной ДНК вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), содержащих промоторные последовательности генов вирусных белков PIO, Р35 и Р39 и РН (Рис. 12).

MCS

рН pIO рН рН MCS GFP

pAcSG2pH (7700т .п.н.) pAcSG2plO (5740т.п.н.) pAcSG2p39 (5768т.п.н.) AcSG2pH/plO (7930т.п.н.) AcSG2-GFP (51 Ют.п.н.)

Рис. 12. Схематическое изображение плазмидных конструкций производных вектора рАсБ02, полученных в настоящей работе. рН, рЮ, р39 -промоторы генов полиэдрина, рЮ, р39; йРР -репортерный ген, МСБ - полилинкер.

Для экспрессии гетеродимера хориогонадотропина человека (ХГЧ) в клетках насекомых с использованием полученных нами векторных плазмид на основе бакуловирусного вектора рАсУМ1 сконструирована рекомбинантная плазмида рАсУМсфСО (10670 т.п.н.) с генами а- и р-ХГЧ под контролем независимых промоторов рН и р10 (Рис.13).

Рис.13. Схематическое изображение рекомбинантной плазмиды рАсУМсфСО с генами двух субъединиц хориогонадотропина человека под контролем промоторов рН и р10.

Таким образом, проклонированы фрагменты ДНК вируса ядерного полиэдроза, содержащие гены белков рЮ, р39, р35, а также их промоторные фрагменты, амилифицированные с помощью полимеразной цепной реакции; создан набор новых мультипромоторных векторов экспрессии для клеток насекомых, содержащих промоторы поздних генов вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), на основе плазмидной ДНК рАс802 и получена конструкция, несущая кДНК обеих субъединиц ХГЧ под контролем независимых промоторов рЮ и рН, для последующего создания линий клеток насекомых, синтезирующих гетеродимеры ХГЧ.

7. Экспрессия гена стероид-21-гндроксилазы человека и ее мутантного варианта С169К в клетках насекомых. Функциональный анализ продуктов экспрессии.

Стероид-21-гидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза глюкокортикоидных и минералокортикоидных гормонов в коре надпочечников - относится к семейству микросомных цитохромов Р450. Дефицит этого фермента является наиболее частой причиной адреногенитального синдрома у человека. Нами впервые в клетках насекомых Б19 и 1П5, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами, синтезированы стероид-21-гидроксилаза (СУР21А2) человека и ее мутантный вариант (С169Я), обнаруженный ранее у больной с классической формой адреногенитального синдрома; изучено влияние мутации на активность фермента в этой системе.

7.1. Для получения функционально активной стероид 21-гидроксилазы, локализованной в мембране эндоплазматического ретикулума клеток насекомых, использовали бакуловирусный вектор рРа51ВасНТА, модифицированный путем делеции последовательности, которая кодирует шесть остатков гистидина, надстраивающихся к И-концу экспрессируемого рекомбинантного белка. Схема получения рекомбинантного бакуловирусного вектора с открытыми рамками считывания СУР21А2 и СУР21А2-С169Я представлена на (Рис. 14).

ЕсоИ

ЕсоМ ИМИ

ВагаН!

\<r Tn7L ПсЛ"0-

Г ТпЛ. ПоЯ^Ч^ SVWpA

pF«!8«HT> Д -CYP21A2

Рис. 14. Схема получения рекомбинантного бакуловирусного вектора с открытыми рамками считывания CYP21A2 и CYP21A2-C169R. кДНК гена CYP21A2 показана черной стрелкой, кДНК гена CYP21A2-C169R - серой стрелкой, промотор Pph гена полиэдрина - темной стрелкой, MCS представлен в виде белого прямоугольника, сайт полиаденилирования SV40pA и ген устойчивости к гентамицину - в виде черных прямоугольников, сайты для транспозиции в геном AcNPVTnlL и Tn7R- в виде серых прямоугольников, ген устойчивости к ампициллину и фрагменты плазмид pUC, включающие участки начала репликации ColEl и фага fl (ori) показаны белыми прямоугольниками. Отмечены единичные рестриктные сайты и сайты инициации трансляции ATG.

7.2. На основе вектора pFastBacllS'толуч ены бакуловирусы bv-CYP21A2 и bv-CYP21A2 C169R и линии клеток насекомых, синтезирующие функционально активную стероид 21-гидроксилазу и ее мутантный вариант. Оптимальные условия синтеза CYP21A2 подбирали по результатам иммуноблотинга. Синтезируемые белки, выявленные Вестерн-блот-анализом в лизатах и микросомных препаратах инфицированных рекомбинантными бакуловирусами клеток насекомых, были обнаружены в виде единственной полосы на уровне 55 кДа, что соответствует молекулярной массе CYP21A2. Идентификация CYP21A2 дикого типа и CYP21A2-C169R в микросомной фракции клеток свидетельствует о встраивании рекомбинантных белков в мембраны эндоплазматической сети клеток насекомых.

ш* сгукллг сток

Рис. 15. Иммуноблотгинг белков а - клеточных лизатов и б, в - микросом из клеток БРЭ и №5, экспрессирующих гены СУР21А2 и СУР21А2-С169Я. а-Влияние множественности заражения на продукцию СУР21А2 в клетках 8(9 (1- 6 - лизаты клеток при множественности заражения вирусом 0,1, 1, 2, 3, 4 и 8; 7- лизат ложноинфицированных клеток.) б - Сравнение содержания СУР21А2 в микросомах из клеток БЮ и №5, выращенных в среде, с добавлением Змкг/мл гемина. в - Сравнение содержания СУР21А2 и СУР21А2-С169Я в микросомах из клеток Ш5.

Как следует из результатов иммуноблотинга, СУР21А2-С169Я синтезируется столь же эффективно и так же встраивается в мембрану эндоплазматической сети, как СУР21А2 дикого типа (Рис. 15 в). Таким образом, мутация С169Я не влияет на эффективность синтеза СУР21А2 в клетках насекомых и не препятствует встраиванию фермента в мембраны эндоплазматической сети. Уровень синтеза рекомбинантной 21-гидроксилазы в клетках Я/5 значительно превышает показатели, достигнутые в системах экспрессии на основе клеток млекопитающих и дрожжей.

Т.о. предложены условия эффективной продукции (28% от суммарного белка микросом) функционально-активной 2 ¡-гидроксилазы в линии клеток №5, что делает возможным получение рекомбинантного белка для функционального анализа, а также для его кристаллизации.

7.3 Ферментативную активность СУР21А2 и СУР21А2-С169Я в препаратах макросом из клеток Ш5 определяли по отношению к двум субстратам - 170Нпрогестерону (170НП) и прогестерону (Рис.19). Известно, что содержание ЫАГ)РН-Р450-оксиредуктазы (СУРОК) в клетках насекомых недостаточно для поддержания активности рекомбинантных цитохромов Р450. Для компенсации недостатка СУРОЯ к микросомным частицам из клеток Ш5, синтезирующих 21-гидроксилазу, добавляли СУРОЯ кролика в молярном соотношении СУР21А2 : СУРОК = 1:1, что приводит к увеличению акгивности по превращению 17-ОНпрогестерона в 11-дезоксикортизол и активности реакции превращения прогестерона в дезоксикортикостерон в этих условиях (см. подпись к рис.16).

17-ОНлрогестером

Прогестерон

* Qtv i ato-

20 рМ 11—4

Рис. 16. Ферментативная активность CYP21A2 в микросомах из клеток Яг'5. Относительная активность представлена как отношение радиоактивности продукта к суммарной радиоактивности субстрата и продукта. Используемая концентрация субстратов 0.01 мкМ. Показаны средние значения ± стандартное отклонение, п - число экспериментов. Заштрихованные столбцы показывают значения активности в микросомных препаратах, серые - в микросомных препаратах, к которым добавлена НАДФ.Н-Р450-оксидоредуктазы кролика; а - Относительная активность CYP21A2 по отношению к 17-ОНпрогестерону; б - Относительная активность CYP21А2 по отношению к прогестерону.

Активность по отношению к 170Нпрогестерону составила 10.45±0.8 пмоль/мг микросомного белка в мин, а активность к прогестерону составила 1.43±1.05 пмоль/мг микросомного белка в мин. Мутантный вариант C169R оказался полностью неактивным в отношении обоих субстратов. Данные по измерению каталитической активности CYP21A2 и мутантного фермента в системе in vitro с добавлением НАДФН-Р450-оксидоредуктазы кролика свидетельствуют о практически полном отсутствии каталитической активности мутантного белка по отношению к двум субстратам CYP21A2 - прогестерону и 17- гидроксипрогестерону, что согласуется с данными, полученными на клетках COS-7.

Наши результаты позволяют считать экспрессию в бакуловирусной системе удобным способом синтеза CYP21A2 с большим выходом, что очень важно для функционального анализа мутаций. Данные о влиянии мутаций на свойства 21-гидроксилазы in vitro могут иметь важное значение для прогнозирования тяжести заболевания в случае их выявления у детей при молекулярно-генетической диагностике в неонатальном периоде.

8. Бакуловнрусные векггоры для эффективной доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих.

Конструирование векторов для переноса экзогенных ДНК в клетки млекопитающих является актуальным направлением современной молекулярной биологии. Успешное применение бакуловирусной векторной системы в качестве эффективного метода доставки генетической информации в клетки эукариот in vitro открывает возможности ее использования для доставки генов in vivo.

Для направленной доставки и экспрессии клонированных генов в культивируемых клетках млекопитающих НЕК293, COS-7 и Huh7 нами использован модифицированный бакуловирус

АсМ1ЧРУ, получивший название ВасМагп-вирус. Он содержит экспрессионную кассету с промотором цитомегаловируса и репортерным геном зеленого или цианового флуоресцентного белка. Сконструированы бакуловирусные векторы с экспрессирующими кассетами под контролем промотора СМУ, содержащие репортерные гены С?/7/5 или ¿ис, сайт полиаденилирования вируса 5У40 (5У40рА) и полилинкер (МСБ). В качестве исходной плазмиды использовали бакуловирусный вектор рРаз1ВасНТа (Рис.17).

pFasiBacMaml GFP

pFaslBacMam2GFP

_ г х — > -

j GFP I [ SV40pA

pFastBacMaml GFP

GFP I SVJOpA

pFasiBacMam2GFP

H P^ori [-( Awp I-1 no* j-J X^p^Tj--

pFastBacMam3GFP

MCS pEGFPNI Pi

pFas tBacMamLuc

_ ^ = n

GFP I SV40pA

a> 5_ ? й с о -= = - _ . _ _

jz с s: .E v> <o и с. re и а о £ cn.£ «. 2й.<1<ШШ«йИО2><(012

« s о с ^ .а и f о. Q..E х а. х /л ы х

pFas tBacMam3GFP

pUCorl

I LUC SV40pA

Гх

pFastBacMamLuc pUCiai~|-1 Amp I-1 flori

Рис. 17. Схематическое изображение рекомбинантных бакуловирусных векторов Вас-CMV-GFP. а -Бакуловирусный трансфер-вектор pFastBacMam 1 GFP; б -Бакуловирусный трансфер-вектор pFastBacMam2GFP; в - Бакуловирусный трансфер-вектор pFastBacMam3GFP; г - бакуловирусный трансфер-вектор pFastBacMamLuc, содержащий репортерный ген люциферазы; Pcmv - промотор CMV; SV40pA - сигнал полиаденилирования; pUCori и Я ori - ori-репликации pUC и fl соответственно; Amp и Gm - гены устойчивости соответственно к ампициллину и гентамицину; Tn7R и Tn7L - элементы транспозона Тп7.

8.1. Для получения pFastBacMamlGFP в исходную плазмидную ДНК pFastBacHTa по сайтам SnaBI и NotI встраивали промотор CMV-IE с GFP-геном, полученным из плазмиды pcDNA3.1GFP, предварительно удалив бакуловирусный полиэдриновый промотор.

8.2. Для конструирования pFastBacMam2GFP фрагмент ДНК с промотором цитомегаловируса клонировали в бакуловирусном векторе pFastBacHTa по сайтам SnaBI и NotI, с образованием промежуточнуой формы pFastBacHT- CMV. В полученную плазмидную ДНК встраивали фрагмент, содержащий участок кДНК модифицированного гена CFP (кодирующего циановый флуоресцирующий белок), полученный из плазмидного вектора pMGd2.

8.3. Трансфер-вектор pFastBacMam3GFP конструировали в два этапа. Первый этап заключался в получении промежуточной плазмидной ДНК, содержащей промотор CMV, полилинкер MCS и EGFP на основе плазмиды pcDNA3.1. На втором этапе после рестрикции промежуточной плазмидной ДНК рестриктазами Nrul и NotI фрагмент, содержащий NruI-(CMV - MCS - EGFP)-NotI, клонировали в бакуловирусном векторе pFastBacHTa по сайтам SnaBI -NotI.

8.4. Эффективность экспрессии флуоресцентных белков оценивали непосредственно в клетках COS-7, Huh7 и НЕК293, трансфицированных полученными конструктами. После трансфекции клетки инкубировали в течение 48 ч в среде DMEM, обогащенной глютамином и содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка и антибиотики. Флуоресценцию GFP выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа и проточной цитофлуориметрии (Рис. 18,19).

! i, - J • . i

. ; ».-vi

Рис. 18. ОБР-специфическая флуоресценция в клетках млекопитающих; а - Клетки С08-7, трансфицированные плазмидной ДНК рра51ВасМатШРР; б - Клетки С08-7, трансфицированные плазмидной ДНК рра$1ВасМатЗОРР; в - Клетки НЕК-293, трансфицированные плазмидной ДНК рРавгВасМаггйСРР.

а 6 в

ТЗ..Д «■n Е* =1г

sü----- 'J- а

Рис. 19. Анализ флуоресценции зеленого белка GFP в клетках НЕК293 методом проточной флуориметрии (А) и флуоресцентной микроскопии (Б). На гистограммах и фотографиях представлены клетки Нек293, нетрансдуцированные (а), трансдуцированные рекомбинантным вектором bv-FastBacMamlGFP (б) или bv-FastBacMam-ElE2GFP (в). На гистограммах по оси абсцисс указан линейный размер анализируемых частиц (клеток) в относительных значениях , по оси ординат -относительное значение интенсивности флуоресценции (1фJ).

8.5. Новый трансфер-вектор pFastBacMamLuc с экспрессирующей кассетой под контролем промотора CMV, содержащей репортерный ген люциферазы, сигнал

полиаденшшрования (SV40pA) и полилинкер (MCS), конструировали с использованием в качестве исходной плазмиды бакуловирусный вектор pFastBacHTa. При конструировании pFastBacMamLuc, фрагмент ДНК NruI - BamHI с промотором CMV, полученный в результате обработки pcDNA3.1 рестриктазами NruI и BamHI, клонировали в бакуловирусном векторе pFastBacHTa по сайтам SnaBI и BamHI с образованием промежуточной плазмиды pFastBacHT-CMV. Ген

Luc из плазмиды pGL- 3 Basic Vector, предварительно встраивали по сайтам Xhol и Xbal в плазмиду pcDNA 3.1, затем по сайтам Notl и Xbal в pFastBacHTa. В новом трансфер-векторе два полилинкера, расположенные до и после репортерного гена люциферазы, предназначены для клонирования целевого гена под контролем промотора CMV.

8.6. Эффективность экспрессии люциферазы оценивали непосредственно в клетках НЕК293, трансфицированных полученной конструкцией, используя Luciferase Assay System.

Табл. 1. Эффективность экспрессии люциферазы в клетках НЕК293

Образец Величина люминесценции

НЕК 293 237.7

PcMvHTaLuc.l 114269.0

PcMvHTaLuc.2 90933.5

Лизирующий буфер 42.0

Таким образом, созданные рекомбинантные бакуловирусные векторы pFastBacMamGFP, содержащие экспрессионную кассету с промотором CMV и репортерным геном флуоресцентных белков GFP и CFP, и pFastBacMamLuc с репортерным геном люциферазы пригодны и эффективны для направленной доставки и экспрессии клонированных генов в культивируемых клетках млекопитающих.

9. Изучение морфогенеза вируса гепатита С человека, с использованием в качестве модели вирусподобных частиц ВГС, образующихся в трансгенных клетках насекомых и млекопитающих.

Геном вируса гепатита С (ВГС) представляет собой одноцепочечную полноразмерную РНК длиной 9.6 тысяч оснований. После трансляции с единственной рамки считывания, образующийся полипротеин подвергается процессингу с образованием 10 зрелых структурных (core, El, Е2 и р7) и неструктурных (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B) белков ВГС. Три структурных белка - кор-белок С (core protein) и гликопротеины оболочки Е1 и Е2- являются основными компонентами вириона вируса гепатита С; неструктурные белки не обнаружены в вирионе, но участвуют в вирусной репликации.

Морфологические свойства ВГС, определяющие природу вириона, зависят от морфологических свойств структурных белков, способа их укладки, упаковки, белок-белковых взаимодействий. Процесс сборки вирусной частицы, роль структурных белков в морфогенезе вируса до сих пор во многом остаются неясными. Изучение взаимодействий между оболочечными белками ВГС, их пост-трансляционных модификаций и формирования вирусных частиц позволяет исследовать роль структурных белков ВГС в морфогенезе вируса. Оболочечные гликопротеины gpEl и црЕ2 могут либо димеризоваться (при нековалентном взаимодействии в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) с образованием функциональных, предшествующих почкованию, комплексов), либо образовывать, связанные дисульфидными мостиками агрегаты, содержащие неправильно свернутые нефункциональные гликопротеины. В образовании комплексов обоих типов участвуют два хозяйских белка-шаперона. Калнексин взаимодействует с гликопротеинами, участвующими в образовании функциональных комплексов, в то время как калретикулин взаимодействует с неверно упакованными гликопротеинами, образующими агрегаты.

9.1. Синтез структурных белков и вирусоподобных частиц вируса гепатита С в клетках насекомых с помощью бакуловирусной системы экспрессии и их характеристика.

Экспрессия трех структурных белков С, Е1 и Е2 ВГС в клетках насекомых сопровождается образованием вирусоподобных частиц и может служить основой модельной системы морфогенеза ВГС. Такая модельная система использована нами для изучения влияния гликозилирования структурных белков ВГС на их димеризацию и сборку и для исследования действия новых синтетических ингибиторов а - глюкозидаз на процесс сборки вирусных частиц. Клетки насекомых 819, зараженные бакуловирусом, экспрессирующим структурные белки ВГС, использованы для исследования функциональных характеристик структурных вирусных белков, их взаимодействий друг с другом, изучения процессов сборки вирусных частиц. Получение бакуловирусных конструкций, рекомбинантных бакуловирусов, синтез и анализ экспрессии рекомбинантных белков вируса гепатита С в клетках 819, анализ РНК ВГС проводили стандартными методами, описанными в инструкции Вас-Ю-Вас («1пу1п^еп»).

9.1.1. Конструирование и идентификация рекомбинантных бакуловирусов (Рис.20).

Фрагменты ДНК, содержащие кДНК генов структурных белков ВГС - кор-белка (С), гликопротеинов Е1 и Е2, укороченного Е2ббо, а также последовательностей СЕ1, Е1Е2 и СЕ1Е2, амплифицировали с помощью ПЦР, используя плазмидную ДНК рНСУ-21, содержащую последовательность генома ВГС (генотип 16). Полученные ПЦР-фрагменты клонировали в бакуловирусных плазмидах рГаз1ВасНТЬ и рРа51ВасНТс. Размер клонированной к ДНК в составе рекомбинантных плазмидных ДНК определяли с помощью рестрикционного и ПЦР-анализа.

3 5

а г

pFastBacHT-CE I П2 р Fret Пас ИТ-СШ pFaslBacl 1Т-С pFaslllacHT-EIC2 pl-astBacH T-El pFastBacl IT- E2 pFasIBacIIT-EJ^,

14 Il 1;,TT "H C Il II-1 |

"1-I.SV40pA I

[IZHL

~[~|-1 SV40 рЛ "I

Г^ПН I с II

-1 SV40 pA

| 'Ун |-1 J El 11-1 SV40pA ]

Î^THT

]]-1 SV40pA |

SV40 pA |

j 1 Сигнальные последовательности

r:iHKonpuit;HHoti El и E2

Рис. 20. Схематическое изображение плазмидных конструкций на основе бакуловирусного вектора pFastBacHT, содержащих в полилинкерной последовательности кДНК генов структурных белков ВГС: С, El и Е2. На схеме отмечены: Рщ-промотор гена полиэдрина; заштрихованные области - сигнальные последовательности гликопротеинов El и Е2; SV40 рА - поли(А)- последовательность вируса SV40.

Затем, в результате сайт-специфического переноса целевых фрагментов ДНК в бакуловирусный шаттл-вектор, получали рекомбинантные бакмиды в клетках Е. coli DHlOBac. После трансфекции клеток насекомых линии Sf9 этими бакмидными ДНК отбирали рекомбинантные бакуловирусы bv-C, bv-CEl, bv-El, bv-ElE2, bv-E2é6o, bv-CElE2 и bv-С+Е1+Е2ббо.

9.1.2. Экспрессия и взаимодействие структурных белков ВГС в клетках насекомых.

Поскольку уровень синтеза рекомбинантных белков в клетках Sf9 зависит от длительности инфекции (24-96 ч) и множественности заражения клеток рекомбинантным бакуловирусом (1-10 БОЕ/кл), оптимальные условия получения структурных белков ВГС подбирали, контролируя титр вируса методом бляшкообразования. Клетки насекомых заражали рекомбинантными бакуловирусами при множественности заражения 3-5 БОЕ/кл. Количество синтезируемых в клетках насекомых структурных белков ВГС значительно увеличивается на третий-четвертый день после заражения клеток бакуловирусом (5x108 БОЕ/мл). Электрофоретический анализ лизатов зараженных клеток насекомых, синтезирующих рекомбинантные струтурные белки вируса гепатита С, проводили в 12% ПААГ с SDS. Подвижность структурных белков ВГС соответствует белкам с Мг 21 кДа и 23 кДа (белок С), 35 кДа (белок El), 66 кДа (белок Е2) и 57 кДа (укороченный Е2). Кроме того, в области 55 кДа видна полоса, которая может соответствовать гетеродимеру CEI (Рис.21).

s щ

В л8? *

■рм

Рис. 21. Анализ экспрессии структурных белков С, Е1 и Е2 ВГС в клетках насекомых ЭР?. Электрофореграммы лизатов клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами: 1 - Ьу-Е1Е2; 2 -Ьу-Е1 ; 3 - Ьу-СЕ1 ; 4 - Ьу-Е2; 5 - Ьу-СЕ1Е2; 6 - Ьу-С +Е1+Е2; 7 - Ьу-САТ/Сиз - в 12% ПААГ с БОБ.

Взаимодействие между структурными белками ВГС исследовали, заражая клетки насекомых рекомбинантными бакуловирусами Ьу-СЕ1Е2 и Ьу-Е1Е2.Лизаты клеток ультрацентрифугировали и выделенные комплексы соосаждали с антителами против белков ВГС. Вестерн-блот анализ иммуноосажденных белков с анти-Е1 и анти-Е2 выявил белки С, Е1, Е2 и Е1Е2 в лизатах клеток, зараженных соответствующими вирусами (Рис.22).

Рис. 22, Анализ экспрессии структурных белков С, El и Е2 ВГС в клетках насекомых Sf9. Иммуноблоттинг белков, осажденных из лизата клеток, зараженных бакуловирусами bv-CElE2 (J, 5), bv-Е1Е2 (2) и bv-CAT/Gus (3, 4), сывороткой против белков ВГС, с антителами к белку: а - El ; б- Е2. M -маркеры молекулярной массы белков, кДа.

Результаты показали, что, во-первых, уровень синтеза белков составляет 25% - 35% от суммарного белка; во-вторых, что структурные белки образуют между собой комплексы СогеЕ!, Е1Е2, СогеЕ1Е2. Белок Core взаимодействует с белком El и с димером Е1Е2, образуя комплексы CEI и СЕ1Е2, экспрессируется с большей эффективностью в присутствии белков El и Е2, мигрирует в геле в виде двух полос с разной молекулярной массой 21 кДа и 23 кДа, причем преобладает белок с массой - 21 кДа; Белок El взаимодействует с белками Core и Е2, образуя комплексы CEI, СЕ1Е2 и Е1Е2, и в комплексах экспрессируется с низкой эффективностью; Белок Е2 взаимодействует с белками El и дуплексом CEI образуя комплексы Е1Е2 и СЕ1Е2, не взаимодействует с белком Core и экспрессируется с высокой эффективностью.

9.1.3. Образование и характеристика вирусоподобных частиц вируса гепатита С.

Известно, что в бакуловирусной системе экспрессии удается получать самособирающиеся, нереплицирующиеся частицы, сходные с интактными вирионами различных вирусов. Мы использовали эту систему для получения вирусоподобных частиц (ВПЧ) вируса гепатита С, для чего, на основе бакуловирусного вектора рРаз1ВасНТа сконструировали рекомбинантный бакуловирус Ьу-СЕ1Е2 и использовали его для трансфекции клеток насекомых 819. Кроме бакмидной ДНК, содержащей кДНК с последовательностью генов СЕ1Е2, проводили котрансфекцию клеток насекомых одновременно тремя бакмидными ДНК, содержащими кДНК генов структурных белков С, Е1 и Е2ббо (бакуловирус Ьу-С+Е1+Е2). В лизатах зараженных клеток оценивали электрофоретическую подвижность продуктов экспрессии генов СЕ1Е2 и С+Е1+Е2 в 12% денатурирующем ПААГ и анализировали экспрессию рекомбинантных ВПЧ в клетках насекомых 819, зараженных бакуловирусом Ьу-СЕ1Е2, используя Вестерн-блот- анализ с сывороткой крови, содержащей антитела к белкам ВГС (Рис.23).

Рис. 23. Анализ экспрессии рекомбинантных ВПЧ гепатита С в клетках насекомых Э)?. А - Анализ экспрессии рекомбинантных ВПЧ в клетках насекомых БГО, зараженных бакуловирусом Ьу-СЕ1Е2. а -Подвижность в денатурирующем 12 % ПААГ белков лизата клеток, зараженных бакуловирусами: 1 - Ьу-СЕ1Е2; 2 - Ьу-САТЛЗиз;.? -дикого типа, б - Вестерн-блот анализ продуктов экспрессии генов структурных белков ВГС в клетках, зараженных рекомбинантными бакуловирусами Ьу-СЕ1Е2 (4, 7, 9) и Ьу-САТ/Сиэ (5, 6, 8), с анти-Е2 (4, 5), анти-Е1 (б, 7) и с сывороткой против ВГС (<?, 9). Б - Вестерн-блот-анализ продуктов экспрессии генов структурных белков ВГС во фракциях микросом и ЭР - клеток, зараженных бакуловирусом Ьу-СЕ1Е2, с анти-Е1 и анти-Е2 и с сывороткой против ВГС. М - маркеры молекулярной массы белков, кДа.

Структурные белки С, Е1 и Е2 ВГС (рис. 23А) мигрируют в геле в соответствии с их молекулярной массой: 21, 32-35 и 66-68 кДа. Электрофорстическая подвижность белков комплекса СЕ1Е2 ВГС и котрансфецированных С+Е1+Е2 не отличается.

Вирусоподобные частицы (ВПЧ), очищенные двухстадийным ультрацентрифугированием, анализировали методами электронной микроскопии (Рис. 24Б). Клеточные микросомы, полученные из 6х107 клеток 819, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом Ьу-СЕ1Е2,

осаждали центрифугированием и также анализировали с помощью электронной микроскопии (Рис.24А) и Вестерн-блотинга (Рис.23Б).

Рис. 24. Электронная микроскопия препаратов микросом (А) и очищенных ВПЧ (Б). Препараты получены из клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами: / - bv-CAT/Gus; 2 - bv-CElE2; 3 -bv-C+El+E2 (котрансфекция).

Предполагаемые ВПЧ наблюдали только в микросомах зараженных клеток, секретирования их в среду культивирования обнаружено не было. Присутствие структурных белков ВГС во фракциях микросом и ЭР свидетельствует о том, что экспрессируемые в клетках насекомых рекомбинантные белки ВГС встраиваются в мембраны ЭР. Локализация поверхностных гликопротеинов ВГС (Е1 и Е2) в ЭР указывает на то, что присоединение нуклеокапсида к оболочке ЭР происходит при миграции через мембрану ЭР. Предполагается, что гликопротеины Е1 и Е2 ВГС, задерживаясь в ЭР, формируют вирусную частицу. Полученные результаты свидетельствуют о том, что внутри клетки насекомых in vitro происходит самосборка структурных белков вируса в ВПЧ без участия других компонентов ВГС, без репликативного комплекса, 5-нетранслируемой области мРНК генома и вирусного белка р7.

На основании полученных данных можно предположить, что формирование вирусных частиц, вероятнее всего, начинается с взаимодействия кор-белка С с синтезированной вирусной РНК. Однако, соответствует ли образующаяся структура вирусному нуклеокапсиду или она представляет собой относительно неспецифичный рибонуклеопротеидный комплекс, пока не понятно. Имеются данные о том, что полноразмерные кор-белки специфически взаимодействуют с вирусной РНК и склонны к олигомеризации. Полученные нами ВПЧ гепатита С содержат кор-частицы с капсидированной вирус-специфической РНК. В клетках, содержащих ВПЧ, кор-белок находится в мембране ЭР вместе с гликопротеинами Е1 и Е2; здесь же происходит N-гликозилирование последних, а затем и образованием ВПЧ.

Хотя разработанная на сегодняшний день система репликации с использованием самореплицирующихся РНК позволяет получать полиоразмерный полипротеин ВГС, частицы, морфологически подобные вирионам ВГС, в ней не образуются. Вот почему модель с

'-'"^ИИЯШЯШИ * • • » Ж'** т * ■■ . . Й! .

• -Г

использованием ВГТЧ, экспрессируемых в клетках насекомых, остается пока одной из лучших для изучения различных стадий морфогенеза ВГС, а именно - синтеза индивидуальных белков, конформационных изменений и взаимодействий между оболочечными белками, их посттрансляционных модификаций и формирования частиц, морфологически подобных вирионам ВГС.

9.1.4. Экспрессия структурных белков и вирусоподобных частиц (ВПЧ) вируса гепатита С в клетках млекопитающих. На основе плазмидного бакуловирусного вектора рРаз1ВасМатЮРР созданы генетические конструкции, содержащие последовательности кДНК генов белка С, белков оболочки Е1 и Е2 ВГС: рРа51ВасМат-ССРР, рРаз1ВасМат-Е1Е2СРР и рРа51ВасМат-СЕ1Е2СРР (рис. 28), используемые для доставки и экспрессии структурных белков и вирусоподобных частиц ВГС в клетках млекопитающих.

рраз! ВасМат 1СГР—| 1'с:МУ^)—| МС5 | СГ'Р | мем |—) ЬУ-Н) [-

S 2

Ркааш.сМ,»-сЕ1!а<;|'Р | с Щ El || Е2

pFas«BacMami-EtK2GKI> И (J1 В (Г 2

pFaitBiicMaiii-CiiFP

( I) ¡1 f. 1; 1.j) • jioc-;ie:roji;ric: i ьиости гликопротеинов El и EL2

Рис. 25. Схематическое изображение плазмидных конструкций на основе бакуловирусного вектора pFastBacMamlGFP.

Фрагменты кДНК, содержащие гены белка С и слитых белков СЕ1Е2 (соответственно 575 и 2240 п.н.), получали с помощью ПЦР, используя плазмидную ДНК pHCV-21, в которую входит последовательность генома ВГС (генотип 16, штамм 274933RU).

С использованием новых конструкций получены рекомбинантные бакуловирусы и стабильные клеточные линии млекопитающих НЕК293 и Huh7, экспрессирующие вирусоподобные частицы вируса гепатита С и структурные вирусные белки. Клонированные гены структурных белков ВГС вводили в клетки Нек293 и Huh7 с помощью транедукции рекомбинантными бакуловирусами, полученными в клетках насекомых Sf9. Эффективность доставки экспрессирующих конструкций FastBacMam-ElE2GFP в клетки млекопитающих определяли иммуноблотингом структурных белков ВГС и белка GFP (Рис. 26), а также методом флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии (Рис. 19).

А кДа 12 3 4

JHHHg ц

Е2 * V ~ ' Е,

120 кДа L .....1.............3 4... 1 2 3 4

рЦ

а 5

#Шк С

1 2 3 4 1 2 3 4

МКЁШ

.....

а 5

Рис. 26. Анализ экспрессии генов рекомбинантных структурных белков ВГС и белка GFP в клетках млекопитающих и насекомых. А - Вестерн-блот с антисывороткой к белкам ВГС, осажденных с антителами против белков Е2 (а), Е1 (б) или С (в) лизатов клеток млекопитающих Нек293, трансфицированных рекомбинантными плазмидными ДНК pFastBacMam-ElE2GFP (У), pFastBacMam-CE1E2GFP (2), pFastBacMam-CGFP (3), pFastBacMamlGFP (4). Б - Вестерн-блот анализ с поликлональными антителами к белку С лизатов клеток Нек293, трансфицированных рекомбинантными плазмидами pFastBacMam 1 GFP (!) или pFastBacMam-CGFP (2), и в клетках насекомых линии Sf9, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами bv-C (3) или bv-CAT/Gus (4)\ В -электрофоретический анализ экспрессии гена зеленого флуоресцентного белка GFP в клетках Нек293, трансфицированных (а) рекомбинантными плазмидами pFastBacMam 1GFP (/), pFastBacMam-ElE2GFP (2), pFastBacMam-CElE2GFP (3), контроль (без трансфекции, 4) или трансдуцированных (б) рекомбинантными бакуловирусами bv-FastBacMamlGFP (/), bv-FastBacMam-ElE2GFP (2), bv-FastBacMam-CElE2GFP (3), контроль (без трансдукции, 4).

Трансдукция клеток млекопитающих Нек293Т и Huh7 модифицированным бакуловирусом AcMNPV, несущим последовательности кДНК структурных генов ВГС, приводит к экспрессии клонированных генов полипротеина ВГС и их правильному процессингу с образованием продуктов генов структурных белков вируса.

9.2. Исследование посттрансляционного гликозилирования оболочечных белков ВГС.

Важным этапом морфогенеза вирусных частиц, предопределяющим правильную сборку вириона ВГС, является гликозилирование структурных белков в зараженной клетке. Гликозилирование происходит в ЭР под действием олигосахаридтрансферазы, причем с белками взаимодействуют только олигосахариды с высоким содержанием маннозы. Наличие углеводных цепей в молекулах белков Е1 и Е2 ВГС определяет их третичную структуру, стабильность, антигенность и специфику взаимодействия с другими компонентами вириона.

В зрелом вирионе гликопротеины Е1 и Е2 ВГС высокогликозилированы и содержат 5-6 и 910 сайтов гликозилирования соответственно (рис.27).

Nrt N2 N3

«fLl_L_£

Г1 i

£_JL

m 309 im :h

Mi )I5

fí

'm У ?

_í_t.

"in

Рис. 27. Схема распределения сайтов гликозилирования в молекулах белков El и Е2 ВГС.

Известно, что наличие или отсутствие N-гликанов у оболочечных белков вируса может влиять на структуру белков, их стабильность, специфичность действия, белок-белковые взаимодействия. В литературе обсуждается влияние гликозилирования на образование гликопротеинового комплекса, на сворачивание заякоренных в мембране гликопротеинов ВГС, однако, в целом, процесс сборки вирусной частицы остается малопонятным. Следует отметить, что до сих пор не известно точное число сайтов гликозилирования белка Е1, какие именно сайты гликозилирования участвуют в модифицировании белка El и все ли потенциальные сайты гликозилирования реализуются т vivo.

Для исследования эффективности гликозилирования гликопротеинов ВГС, влияния гликанов на экспрессию и процессинг El и Е2, на образование продуктивного комплекса гликопротеинов и на формирование вирусоподобных частиц ВГС мы использовали бакуловирусную систему экспрессии в клетках насекомых и мутагенез N-связанных сайтов гликозилирования.

9.2.1. Получены генетические конструкции, кодирующие 11 вариантов белка El, несущих мутации в 7 сайтах гликозилирования и обеспечивающие экспрессию в клетках насекомых для исследования влияния индивидуальных углеводных цепей в составе белка El на образование комплекса Е1Е2.

1- Е1 (N1 )Е2, с мутацией в сайте N1;

2- El(N5)E2, с мутацией в сайте N5

3- E1(N1,5)E2, с мутациями в сайтах N1 и N5;

4- E1(N2,3,4)E2, с мутациями в сайтах N2, N3 и N4

5- E1(N2,3,4,5)E2, с мутациями в сайтах N2, N3, N4 и N5;

6- E1(N1,2,3,5)E2, с мутациями в сайтах NI,N2, N3 и N5;

7- E1(N1-5)E2, с мутациями во всех сайтах N1- N5;

8- El(N5)E2, с мутацией в сайте N5;

9- El (N6)E2, с мутацией в сайте N6;

10- El(N7)E2, с мутацией в сайте N7;

11- Е1Е2 без мутаций (W)

В данной работе применяли олигонуклеотид-направленный мутагенез непосредственно на «стандартных» двутяжевых плазмидных векторах, схема которого разработана и предложена

В.Л. Друцей (МГУ). В результате была сконструирована серия рекомбинантных плазмид рВ1ие5епрЖ8-Е1, несущих кДНК белка Е1 с точечными заменами в сайтах гликозилирования N1 - N5 и двумя дополнительными сайтами гликозилирования N6 и N7, для чего синтезированы синтетические олигонуклеотидные праймеры, содержащие последовательности, кодирующие сайты Ы-гликозилирования Авп-Х-Ил/Зег (ХФ Рго), в котором триплет, коди рующий Авп, замещен триплетом, кодирующим С1п. Таким образом, был создан набор Е1-гликозилированных мутантов, в которых выключены/включены или добавлены сайты гликозилирования для анализа К-гликозилирования оболочечного белка Е1 ВГС.

9.2.2. В плазмидном бакуловирусном векторе р!'а*1КасНТа клонировали фрагменты ДНК, содержащие последовательность кДНК гена Е1 (Е1тЩ) с мутациями в сайтах гликозилирования, а также кДНК, включающую последовательность генов Е1шШЕ2.. Рекомбинантные конструкции использовали для получения бакмидных ДНК и трансфекции клеток насекомых для получения рекомбинантных бакуловирусов.

9.2.3. Экспрессию Е1-гликозилированных мутантов в клетках насекомых, а также эффективность гликозилирования белков Е1 с мутациями в потенциальных сайтах гликозилирования анализировали с помощью иммуноблотинга (Рис. 28).

М 1 2 } 4 5 6 7 8 \\Т кДа -

1Р апп-11 \ГВ .-ОШ-Е1

Рис. 28. Вестерн-блот анализ продуктов экспрессии генов мутантных белков Е1 в комбинации с Е2 ВГС в клетках насекомых 8(9 с антителами к Е1 ВГС после предварительного иммуноосаждения с апН-Е1. Клеточный лизат очищали центрифугированием через 30% сахарозную подушку. 1 - Е1Е2 дикий тип; 2 - Е1гпи1Е2 с мутацией в сайте гликозилирования N1; 3 - Е11тйЕ2 с мутацией в сайте гликозилирования N5; 4 - Е1ши1Е2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1 и N5; 5 - Е1ти1Е2 с мутацией в сайтах гликозилирования N2, N3, N4; б - Е1гтйЕ2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1, N2, N3 и N4; 7 -Е1тЩЕ2 с мутацией в сайтах гликозилирования N2, N3, N4 и N5; 8 - Е1ти1Е2 с мутацией во всех сайтах гликозилирования; \УТ- бакуловирус дикого типа.

Нарушение сайтов гликозилирования приводило, как и ожидалось, к повышению электрофоретической подвижности гликопротеина Е1 в денатурирующем 12% ПААГ.

Обработка мутантных гликопротеинов Е1 эндогликозидазой ЕпёоН с последующим вестерн-блот анализом показали, что синтезированные в клетках насекомых мутантные гликопротеины, как и природный белок, чувствительны к последней (Рис.29).

и'аа лт л * г 1 i * ' / 9 ¿з п и и

Рис. 29. Вестерн-блот анализ экспресии мутантных белков Е1 в комбинации с Е2 ВГС в клетках насекомых с антителами к Е2 ВГС. Клеточный лизат очищали центрифугированием через 30% сахарозную подушку. 1 - Е1т1ЛЕ2 с дополнительным сайтом гликозилирования N6 в позиции 325 а.к; 2-Е1Е2 дикий тип; 3- Е1Е2 дикий +Епс1оН; 4-Е1ши1Е2 с мутацией в сайте гликозилирования N1; 5 - Е1тШ:Е2 с мутацией в сайте гликозилирования Ж+Епс1оН; 6 - Е1тЩЕ2 с мутацией в сайте гликозилирования N1+ Тишсатуст; 7- Е1ти1Е2 с мутацией в сайте гликозилирования N5; 8 - Е1гпи1Е2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1 и N5; 9 - Е1Е2 с мутацией в сайтах гликозилирования N2, N3, N4; /0 - Е1ши1Е2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1, N2, N3 и N4; 11 - Е1Е2 с мутацией в сайтах гликозилирования N2, N3, N4 и N5; 12 - Е1ттЕ2 с мутацией в сайтах гликозилирования N1, N2, N3 и N5; 13 - Е1ти1Е2 с мутацией во всех сайтах гликозилирования; \УТ-бакуловирус дикого типа.

Анализ экспрессии мутантных белков Е1 в комбинации с Е2 ВГС в клетках насекомых 519 подтвержден также иммунопреципитацией с антителами к калнексину и калретикулину.

Полученные результаты показали, во-первых, что мутантные белки Е1 экспрессируются в клетках насекомых; во-вторых, нарушение сайтов гликозилирования N2, N3, N4 в различных комбинациях не влияет заметным образом на эффективность экспрессии гликопротеина Е1, но снижает эффективность формирования нековалентного продуктивного комплекса Е1Е2; в-третьих, что введение дополнительного сайта гликозилирования N7 или нарушение сайта N4 в Е1 не влияет на характер гликозилирования белка и образование продуктивного гетеродимера Е1Е2; в-четвертых, чтоповреждение сайтов гликозилирования N1 или N5 в белке Е1 нарушает сборку продуктивного комплекса Е1Е2. В результате обнаружено, что отсутствие углеводных цепей в сайтах гликозилирования N1 и N5 влияет на образование нековалентного комплекса Е1Е2 - прототипа природного комплекса, входящего в состав вириона ВГС.

Полученные нами результаты показывают, что дальнейшее исследование ¡Ч-гликозилирования оболочечных белков Е1, Е2 ВГС позволит уточнить роль углеводных цепей в образовании комплекса Е1Е2 и его функционировании в инфекционном цикле вируса.

9.3. Исследование влияния новых синтетических ингибиторов а-глюкозидазы на процессинг структурных белков вируса гепатита С и формирование вириоиа ВГС.

Вирус гепатита С инфицирует более 3% населения во всем мире. В настоящее время нет оптимальных методов лечения и вакцины для профилактики этой инфекции. Уникальные особенности вируса гепатита С, такие как, большая изменчивость, высокая геномная вариабельность, способность к преодолению иммунного ответа, но, при этом, низкая эффективность репликации вируса в культуре клеток и отсутствие подходящих клеточных культур и животных моделей затрудняют исследования жизненного цикла и репликации вируса и сдерживают поиск ингибиторов инфекции. Воздействие на вирусный морфогенез может быть использовано в качестве альтернативного подхода к существующим стратегиям блокирования вируса гепатита С.

Во время №гликозилирования белка цепь М-гликанов гликопротеина претерпевает серию модификаций внутри эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, в которых участвуют а-глюкозидаза и а-маннозидаза. Производные иминосахаров, способные блокировать действие а-глюкозидазы или а-маннозидазы, и, как следствие, нарушающие процесс внутриклеточного К-гликозилирования гликопротеинов, могут нарушать правильное складывание и сборку вирусных оболочечных белков, блокируя вирусный морфогенез и, в результате, снижать инфекционность вируса. Такие соединения могут быть потенциальными антивирусными агентами. В качестве потенциальных ингибиторов а-глюкозидазы могут быть использованы производные аналога глюкозы - дезоксиноиримицина (ЭКГ), блокирующие действие а-глюкозидазы. Для проверки этого предположения были синтезированы алкилированные производные М-пентил-ОШ и №бензил1-0№. (Бакиновский Л.В. и Зинин

Рис. 30. Иминосахара, алкилированные производные аналога глюкозы дезоксиноиримицина ИШ

Для изучения влияния этих соединений на гликозилирование структурных белков ВГС, на процесс сборки структурных белков, на инфекционность вирусных частиц и на способность вируса связываться с клеткой использовали вирусоподобные частицы ВГС, образующиеся в

А.А., ИОХ РАН) (Рис.33).

ОН

М-рейуЮШ

Веохтоо1штуст

Л-ЬепзуЮШ

клетках насекомых и млекопитающих. Отобранные в этих системах соединения могут стать основой для разработки новых противовирусных препаратов.

Для оценки ингибирующего действия новых соединений на процессинг структурных белков вируса гепатита С определяли их влияние, во-первых, на накопление gpElи gpE2 ВГС в эндоплазматическом ретикулуме и их гликозилирование; во-вторых, на взаимодействие gpElи gpE2 с калнексином, определяющим правильное сворачивание Е2 и сборку продуктивных димеров Е1Е2; и в-третьих, на взаимодействие вирусных гликопротеинов gpElи ^рЕ2 с калретикулином, определяющим неправильное сворачивание Е2 и образование непродуктивных димеров Е1Е2.

Структурные белки вируса синтезировали в бакуловирусной системе экспрессии генов в клетках 519 в отработанных нами условиях и анализировали с помощью иммуноблоттинга белков клеточного лизата с антителами к белкам - кора, Е1 или Е2. Вестерн-блот анализ экспрессии вирусоподобных частиц ВГС в инфицированных клетках насекомых после 48 ч. заражения рекомбинантным вирусом Ьу-СЕ1Е2 выявлял белки в зонах, соответствующих ожидаемой молекулярной массе: 17-22 (кор), 27-30 (Е1) и 66-68 кДа (Е2) соответственно.

я б в

Рис. 31. Вестерн-блот анализ экспрессии вирусоподобных частиц ВГС в инфицированных клетках насекомых Sf9 после 48 часов заражения рекомбинантным вирусом bv-CElE2. Иммуноблоттинг белков клеточного лизата с антителами anti-Core, anti-El и anti-E2

Установлено, что синтезированные в клетках насекомых гликопротеины Е1 и Е2, чувствительны к endoH, то есть в клетках насекомых происходит их эффективное посттрансляционное гликозилирование (Рис. 32).

А 12 В

кДа кДа

и ¿2

-Е1

ег

1Р ЕЛ 1Р

ТОВ. Е1 Е2

Рис. 32. Анализ гликопротеинов Е1 и Е2 ВГС, синтезированных в клетках насекомых, которые были инфицированы бакуловирусом Ьу-СЕ1Е2 и обработаны ЕпЛэН, с помощью вестерн-блоттинга с антителами к Е1 и Е2 ВГС, после предварительного иммуноосаждения антителами к Е1 и Е2 в денатурирующем 12%-ом ПААГ-геле; А - иммуноосаждение и иммунноблотинг с антителами к Е1 ВГС, Б - иммуноосаждение и иммунноблотинг с антителами к Е2 ВГС; I - СЕ1Е2; 2 - СЕ1Е2 + Епс1о Н 9.3.1. Для изучения влияния ингибиторов а-глюкозидазы на накопление %рЕ1и црЕ2 ВГС и их гликозилирование в эндоплазматическом ретикулуме клетки, зараженные Ьу- СЕ1Е2 при множественности заражения 20, обрабатывали КВп-ОШ и ОТп-БШ в концентрациях 0-10-2001000 рМ. Через 24 ч. после заражения клетки лизировали, белки ЭР экстрагировали и анализировали с помощью вестерн-блоттинга (Рис. 33). В качестве контроля использовали белки из клеток, обработанных М-бутил-ОШ (ЫВОШ) в концентрации 200мкМ.

1 2 3 4 3 6 7 !

Е2

Ш.-Я2

Рис. 33. Электрофореграммы лизатов клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом Ьу-СЕ1Е2 в присутствии различной конценрации производных ОМ1 в денатурирующем 12%-ом ПААГ-геле; Иммуноблотинг белков лизатов инфицированных клеток с с антителами против белка Е2 ВГС. I - СЕ1Е2; 2 - СЕ1Е2 + ЫВОШ (200 рМ)-положительный контроль; 3 - СЕ1Е2 + №пОШ (10 рМ); 4 - СЕ1Е2 + ЖпОЮ (200 рМ); 5 ~ СЕ1Е2 + ШпО№ (1 тМ); 6 - СЕ1Е2 + №пВ№(10рМ); 7 - СЕ1Е2 + ОТпЛЮ (200 рМ); 8- СЕ1Е2 + КРпОШ (1 тМ); Маркерные белки, кДа.

Под действием производных DNJ, (ЫВпОШ, NPnDNJ и ИВОШ) наблюдалось снижение подвижности ярЕ2 ВГС в клетках насекомых, зараженных рекомбинантным вирусом, по сравнению с клетками насекомых, инфицированными М>-СЕ1Е2 в отсутствии ингибиторов. В

присутствии ImM NBnDNJ и NPnDNJ снижение подвижности было более выраженым. Такой восходящий сдвиг может быть прямым результатом ингибирования а-глюкозидаз в ЭР и накопления гипергликозилированных N-гликанов в гликопротеинах ВГС. По результатам этого опыта для дальнейших экспериментов были использованы следующие концентрации ингибиторов: NPnDNJ - I rnM и NBnDNJ -1 шМ. ( концентрации сравнительно нетоксичные для клеток - процент гибели клеток за 48 часов инкубации составлял около 15%)

Наблюдали увеличение накопления и снижение подвижностей гликопротеинов gpElu gpE2 ВГС в клетках насекомых, зараженных рекомбинантным вирусом, в присутствии 1 rnM NBnDNJ, 1 mM NPnDNJ и 200 рМ NBDNJ (известным положительным контролем) по сравнению с исходным бакуловирусом bv-CElE2 (Рис.34).

кДа 12 3 4 ШШк шя

Ш SI SR и

/¡j щщщ* \ ..: - ........

v/B.E:

Рис. 34. Анализ экспрессии генов рекомбинантных структурных белков El и Е2 ВГС в клетках насекомых Sf9, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом bv-CElE2 в присутствии производных DNJ. Иммуноблотинг белков El и Е2 лизатов инфицированных клеток с с антителами против белков Е2 ВГС в денатурирующем 12 %-ом ПААГ. 1 -СЕ1Е2; 2 - СЕ1Е2 +NBnDNJ (1 mM); 3 - СЕ1Е2 + NPnDNJ (1 тМ); 4 - CEI Е2 + NBDNJ 200 дМ)-положительный контроль; Маркерные белки, кДа.

9,3.2. Взаимодействие вирусных гликопротеинов gpElu gpE2 с калнексином . Лизаты клеток Sf9, инфицированных рекомбинантным вирусом bv-CElE2 ВГС в присутствии 1 шМ NBnDNJ и 1 mM NPnDNJ, подвергали иммуноосаждению с антителами к калнексину или калретикулину, с последующим электрофорезом в денатурирующем ПААГ и анализировали с помощью вестерн-блотшнга с антителами к Е2.

кДа 1 2 3 4 ^

шшшшшж

86 IЕ1Е2

47 I , 1 Е2

ZP: CNX WB;E2

Рис. 35. Вестерн-блот анализ продуктов экспрессии генов вирусоподобных частиц ВГС в рекомбинантных клеточных линиях Sf9, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом bv-CElE2 в присутствии производных DNJ. Иммуноблотинг белков лизатов инфицированных клеток с антителами анти-Е2, после предварительного иммуноосаждения антителами к калнексину (CNX). / -CEIE2; 2 -СЕ1Е2 + NBDNJ(200 дМ); 3 -CEIЕ2 + NBnDNJ(l mM); 4-СЕ1Е2 + NPnDNJ(l mM).

12 3 4 jBB gj^CT

v/b.e:

J „ 2 3 _ 4 ——

EP: CNX WB;E2

Вестерн-блот анализ гликопротеинов Е1 и Е2 ВГС, синтезированных в клетках насекомых, зараженных рекомбинантным вирусом Ьу-СЕ1Е2 в присутствии и отсутствии ингибиторов, и осажденных антителами к калнексину показал существенное уменьшение количества gpE2, что обусловлено его неправильным сворачиванием (неправильно свернутый gpE2 нарушал его взаимодействие с §рЕ1, это приводило к образованию непродуктивных димеров Е1Е2, поэтому можно предположить, что гипергликозилированные гликаны, индуцированные ингибировапием а -глюкозидазы, подавляют продуктивную ассоциацию гликопротеинов ВГС. (Рис.35) кД & I 2 3 4

ГР:СЬЕ.

Рис. 36. Вестерн-блот анализ продуктов экспрессии генов вирусоподобных частиц ВГС в рекомбинантных клеточных линиях 8(9, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом Ьу-СЕ1Е2, в присутствии алкилированных производных ОШ. Иммуноблотинг белков лизатов инфицированных клеток с антителами анти-Е2, после предварительного иммуноосаждения антителами к калретикулину (СЬК). I -СЕ1Е2; 2 - СЕ1Е2 +ШЭШ(200 цМ)- положительный контроль; 3-СЕ1Е2 + ИВпО№ (1 гпМ); 4-СЕ1Е2 + ЫРпОШ(1 шМ); Маркерные белки, кДа.

Иммуноблотинг белков лизатов инфицированных клеток в присутствии и отсутствии ингибиторов с антителами анти-Е2, после предварительного иммуноосаждения антителами к калретикулину показал увеличение количества и снижение подвижности gpE2. Снижение подвижности §рЕ2, может указывать на присутствие гипергликозилированных гликанов в гликопротеине, усиливающих его взаимодействие с калретикулином.

Таким образом, процесс внутриклеточного Ы-гликозилирования оболочечных гликопротеинов нарушается в присутствии исследуемых М-алкилированных ОШ.

Для дальнейшего анализа сворачивания гликопротеинов ВГС и их сборки в зависимости от присутствия исследуемых ингибиторов, необходимы эксперименты с конформационно-чувствительными антителами анти-Е2 специфичными к разным эпитопам. К сожалению, на сегодняшний день, не описано ни одного конформационно-зависимого антитела анти-Е1.

Заключение

Цикл работ, представленный в настоящей диссертации, посвящен разработке систем клонирования и экспрессии геиов в клетках про - и эукариот.

Клонирование в клетках Е. coli применено для создания библиотек кДНК геномов РНК-содержащих фитовирусов - ВШМЯ и ХВК. Полученные библиотеки использованы для определения первичной структуры и выяснения организации геномов этих вирусов. С использованием систем клонирования в клетках Bacillus subtilis разработана система функциональной селекции рибозимов.

Для решения задачи получения различных белков методами генетической инженерии создан набор дрожжевых векторов, содержащих регулируемый промотор гена кислой фосфатазы и нуклеотидные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды секретируемых белков. Эти векторы применены для получения штаммов дрожжей, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В и гормон роста человека.

В заключительной части диссертации представалены результаты исследований, посвященных разработке и оптимизации бакуловируснон системы экспрессии генов в клетках насекомых. С использованием этой системы получены клетки насекомых, продуцирующие разные типы сложных белков. Это - мембранные белки рецептор CD4 человека и серотониновый рецептор 5НТ1с мыши, микросомный гем-содержащий белок стероид-21-гидроксилаза и его мутантный вариант, гликопротеидный двухсубъединичный гормон хориогонадотропин человека, структурные белки С, El и Е2 вируса гепатита С. Экспрессия трех структурных белков ВГС в клетках насекомых сопровождается образованием вирусоподобных частиц и может служить основой модельной системы морфогенеза ВГС. Эта система использована для изучения влияния гликозилирования структурных белков ВГС на их димеризацию и сборку, а также для исследования действия новых синтетических ингибитора» - глюкозидаз на процесс сборки вирусных частиц.

Для экспрессии нескольких генов одновременно в одной инфицированной клетке насекомого и получения мультимерных белков созданы новые дву- и трех-промоторные векторы экспрессии на основе бакуловирусов.

Сконструированы также новые бакуловирусные векторы для доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих.

Выводы.

1. С использованием разработанных систем клонирования и экспрессии в клетках бактерий впервые получена библиотека бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномной РНК ВШМЯ и предложена схема организации функционально фрагментированного генома фитовируса ВШМЯ; впервые предложена бактериальная тест-система, для функционального скрининга библиотек мутантных рибозимов.

2. Впервые сконструирована серия векторных плазмид, содержащих делеционные варианты регуляторных областей гена РН05, для экспрессии и секреции гетерологичных белков в культуре клеток Saccharomyces cerevisiae, которые могут быть использованы в качестве промышленных продуцентов рекомбинантных белков млекопитающих.

3. Разработаны и предложены условия синтеза серотонинового рецептора 5НТ1с мозга мыши в клетках растений, в ооцитах Xenopus laevis и в клетках насекомых для изучения его функциональной активности. Впервые показано, что рецептор серотонина в виде гибрида с GFP, в клеточном ответе на серотонин в ооцитах Xenopus laevis, связывается с гормоном и, при участии GTP-связывающего белка, активирует фосфолипазу С, инициируя поток кальция в клетке.

4. В инфицированных рекомбинантными бакуловирусами клетках насекомых впервые синтезированы стероид-21-гидроксилаза (CYP21A2) человека и ее мутантный вариант (C169R), обнаруженный у больной с классической формой адреногенитального синдрома, с уровнем экспрессии, значительно превышающим показатели, достигнутые в системах экспрессии на основе клеток млекопитающих и дрожжей, Впервые проведены исследования влияния мутаций стероид-21-гидроксилазы на ее свойства, которые могут иметь важное значение для прогнозирования тяжести заболевания классической формой адреногенитального синдрома при молекулярно-генетической диагностике у новорожденных

5. Предложены новые дву- и трех-промоторные векторы экспрессии для эукариот на основе бакуловирусов, для синтеза мультимерных белков со специфическими пост-трансляционными модификациями и корректной сборкой из различных субьединиц.в клетках насекомых.

6. Сконструированы новые модифицированные бакуловирусные векторы в форме трансфер-векторов pFastBacMamGFP и pFastBacMamLuc, с экспрессирующими кассетами под контролем промотора цитомегаловируса (CMV) для направленной доставки и экспрессии эукариотических генов в культивируемых клетках млекопитающих. Разработаны условия эффективной трансдукции и экспрессии структурных генов ВГС в клетках Нек293 и Huh-7, с помощью рекомбинантных бакуловирусов.

7. Получены линии клеток насекомых Sf9 - эффективные продуценты структурных белков и вирусоподобных частиц вируса гепатита С, структурно и иммунологически подобных вирионам вируса, использованных в качестве модели при изучении морфогенеза ВГС.

8. Для изучении морфогенеза ВГС исследовано влияние N-гликозилирования гликопротеина El вируса гепатита С на экспрессию и процессинг белков оболочки вируса, на образование комплекса Е1Е2 ВГС, влияющего на формирование частиц, морфологически подобных вирионам ВГС, с использованием вирусоподобных частиц ВГС, синтезируемых в клетках насекомых.

9. С целью разработки новых антивирусных соединений, влияющих на формирование вириона вируса гепатита С, синтезированы ингибиторы -глюкозидазы, производные иминосахара дезоксиноиримицина (DNJ) N-пентил -DNJ и N-бензил -DNJ, способные нарушать процесс внутриклеточного N-гликозилирования оболочечных гликопротеинов вируса, влияя на сворачивание гликопротеинов и, соответственно, сборку вирусных частиц.

Список публикаций по теме диссертации.

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Dolja, V., Lunina, N., Leiser, R., Stanarius, Т., Beljelarskaya, S., Kozlov, Y. and Atabekov, I. (1983) A comparative study on the in vitro translation products of individual RNAs from two-, three-, and four- component strains of Barley stripe mosaic virus. Virology 127, 1-44.

2. Белжеларская C.H., Морозов С.Ю., Доля B.B., Козлов Ю.В., Атабеков Г.И. (1984), Клонирование ДНК копий индивидуальных РНК ВШМЯ. Доклады АНСССР, 275,186-188.

3. Рупасов В., Адышев Д., Морозов С., Белжеларская С., Манкин А., Доля В., Аграновский А., Атабеков Г. и Козлов Ю. (1984) Структура З'-концевого участка РНК вируса штриховатой мозаики ячменя . Молекулярная биология 18, 140-145

4. Kozlov, Yu., Rupasov, V., Adyshev, D., Beljelarskaya, S., Agranovsky, A., Mankin, A., Morozov, S., and Dolya, V. (1984) Nucleotide sequence of the З'-terminal structure in BSMV genome. Nucleic Acids Research, 12,4001-4009.

5. Adyshev, D., Beljelarskaya, S. Kozlov, Yu.. (1987) Pecularities of structural organization: of BSMV genome. Ac. of Sci. of the Kyrghyz Rep. News, 4: 52-55.

6. Краев А., Морозов С., Лукашева Л., Розанов М., Чернов В., Симонова М., Голова Ю., Белжеларская С., Позмогова Г., Скрябин К. и Атабеков Г. (1988) Первичная структура и организация генома Х-вируса картофеля. Доклады АНСССР. 300, 711-716.

7. Циоменко А.Б., Лупашин В.В., Морзунов С.П., Карпычев И.В., Белжеларская С.Н., Рубцов П.М., Скрябин К.Г. (1990) Природа N-концевой сигнальной последовательности определяет характер внутриклеточного распределения и эффективность экспорта гормона роста человека у дрожжей Sacccharomyces cerevisiae. Молекулярная биология 24, 1126-1133.

8. Белжеларская С.Н., Орловский И В.и Никитенко С.В. (1996). Использование бактериальной селекционной системы на основе Bacillus Subtilis для отбора мутантных рибозимов, эффективно функционирующих in vivo. Доклады АНСССР. 347, 113-116.

9. Белжеларская С.Н., Сутугина Л.П., Филенко О.М., Бучацкий Л.П. и Рубцов П.М. (1996) Экспрессия кДНК хорионического гонадотропного гормона человека в культуре клеток насекомых. Молекулярная биология 30(3), 518-523.

10. Сутугина Л.П., Белжеларская С.Н., Филенко О.М., Труш Ф.М., Бучацкий Л.П. и Скрябин К.Г. (1996) Метод роллерного культивирования культуры клеток насекомых SF9, инфицированных гибридными бакуловирусами. Молекулярная биология 30,410-415.

11. Белжеларская С.Н., Сутугина Л.П., Толкачева Т.В., Рубцов П.М.и Скрябин К.Г. (1996) Экспрессия гена CD-4 рецептора ВИЧ-1 в клетк5ах насекомых с использованием бакуловирусной системы. Молекулярная биология 30, 524-528.

12. Белжеларская С.Н. (2002) Бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых, Обзор, Молекулярная биология 36(3), 371-385.

13. Белжеларская С.Н. и Сатгон Ф. (2003) Роль серотониновой системы в реакции различных типов клеток на стрессорные сигналы. Молекулярная биология 37(3), 452-457.

14. Белжеларская С.Н. и Саттон Ф. (2004) Экспрессия кДНК гена серотонинового рецептора мыши (5НТ1с) в культуре клеток насекомых. Молекулярная биология 38(3), 477-482.

15. Королева Н.Н., Грищук Ю.В., Кочеткова С.В., Прасолов B.C., Рубцов П.М. и Белжеларская С.Н. (2006) Оптимизация бакуловирусной системы доставки генов в клетки насекомых и млекопитающих. Молекулярная биология, 40(6), 1074-1081

16. Yu.Grischuk, P. Rubtsov, F. Riepe, J. Grotzinger, S. Beljelarskaya, V. Prassolov, N. Kalintchenko, T. Semitcheva, V. Peterkova, A. Tiulpakov, W. G. Sippell and N.Krone (2006). Four novel missense mutations in the CYP2I gene in Russian patients with classical form of congenital adrenal hyperplasia (САН): identification, functional characterization and structural modeling. J Clin Endocrin & Metab (JCEM), 91(1-12), 4976-4980

17. Грищук Ю.В., Рубцов П.М. и Белжеларская С.Н.(2007) Экспрессия и функциональный анализ стероид 21-гидроксилазы человека и ее мутаптного варианта в клетках насекомых. Молекулярная биология, 41(1), 77-78

18. С.Н. Белжеларская, Н.Н. Королева, В.В. Попенко, В.Л. Друца, О.В.Орлова, П.М. Рубцов, С.Н. Кочетков.(2010) Характеристика структурных белков и вирусоподобных частиц вируса гепатита С, синтезированных в клетках насекомых с помощью бакуловирусной системы экспрессии. Молекулярная биология 44(1), 107-119

19. Королева Н.Н., Спирин П.В., Тимохова А.В., Рубцов П.М., Кочетков С.Н., Прасолов B.C., Белжеларская С.Н. (2010) Бакуловирусные векторы для эффективной доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих, Молекулярная биология, 44(3), 1-13

20. Lyupina YV, Dmitrieva SB, Timokhova AV, Beljelarskaya SN, Zatsepina OG, Evgen'ev M.B., Mikhailov VS. (2010) An important role of the heat shock response in infected cells for replication of baculoviruses. Virology, 406(2), 336-341

21. Белжеларская С.Н. (2010). Бакуловирусные системы экспрессии рекомбинантных белков в клетках насекомых и млекопитающих. Обзор, Молекулярная биология,45(1), 142-159

Избранные тезисы конференций:

22. Beljelarskaya, S., Morozov, S., Dolja, V., Kozlov, Yu. and Atabekov, I.. (1982) Cloning of DNA -copies of RNA genome BSMV. Thesises on Sixth USSR-FRANCE Symposium "Proteins and Nuclear Acids Structure and Function", Tskhaltubo, p.21

23. Kozlov, Yu., Rupasov, V., Adyshev, D., and Beljelarskaya, S. (1984) Pecularities of structural organization of BSMV genome. Thesis on 16-th FEBS conference, Moscow, p.22.9

24. Beljelarskaya, S., Krajev, A., Mironova,M. and Skryabin, K. (1983) Cloning of ADE2 gene of Saccharomyces cerevisiae. Report on The International Conference" Metabolic and genetic regulation in yeast", Jena, GDR.

25. Краев А., Морозов С., Лукашева Л., Розанов М., Чернов В., Симонова М., Голова 10., Белжеларская С., Позмогова Г., Скрябин К. и Атабеков Г. (1987) Первичная структура генома X-вируса картофеля. Молекулярная генетика .3, 32

26. Рубцов П.М., Морозов H.A., Свердлова П.С., Дебабов Д. Г. и Белжеларская С.Н. (1994) Создание трансфер-векторов для экспрессии мультимерных генов в эукариотической системе экспрессии Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология. 4, 17-18.

27. Белжеларская С.Н., Свежинский Е.А., Сутугина Л.П., Трум В.М., Рубцов П.М.,. Скрябин К.Г.(1994) Экспрессия гонадотропных гормонов в клетках эукариот. Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология. 4, 16-17.

28. Белжеларская С.Н., Рубцов П.М., Сутугина Л.П., Рахимова Л.Х., Батырева Е.Р. и Скрябин К.Г.(1996) Создание эффективных систем клонирования и экспрессии эукариотических генов в клетках насекомых с использованием бакуловирусных векторов. Тезисы стендовой сессии Международной конференции, посвященной памяти акад. А.А.Баева. 109.

29. Beljelarskaya S., Holt С., Sutton F. (1999) Conservation of signal transduction pathways in plant and animal cells. Thesises on The 4th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, Moscow, 7.

30. S. N. Beljelarskaya, Yu.V. Grischuk, N.N Koroleva, S.N. Kochetkov and P.M. Rubtsov. (2004) Efficient gene transfer into insect and mammalian cells by baculovirus vectors for production of functional human steroid-21-hydroxilase and hepatitis С virus proteins in insect and mammalian cells. Thesises: 7th Interntional Engelhardt Conference on Molecular Biology, Susdal.

31. Y.V.Grischuk, D.S. Ivanov, V.S. Prassolov, S.N. Beljelarskaya and P.M.Rubtsov. (2005) Two novel disease-causing mutations in the CYP21 gene in Russian patients with 21-hydroxylase deficiency: affect on functional enzyme activity. 30th FEBS Congress-9th IUBMB Conference, Budapest, A4-023P.

Благодарности. Автор благодарит К.Г. Скрябина, который инициировал данную тему исследований, и признателен П.М. Рубцову за критические замечания при обсуждении

результатов. Автор искренне благодарен С.Н. Кочеткову за помощь и поддержку в работе. Автор выражает глубокую благодарность моим коллегам и соавторам, и особенно A.B. Тимоховой и О.В. Орловой за поддержку и помощь в работе. Автор благодарит за дружеское участие С.Г. Скуридина, сотрудников лаборатории молекулярной эндокринологии.

Заказ № 55-а/02/2011 Подписано в печать 09.02.2011 Тираж 110 экз. Усл. п.л. 2,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Белжеларская, Светлана Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. 8

ВВЕДЕНИЕ.10

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.14

1.1. Введение.

1.2. Вирусные векторы для переноса и экспрессии генов в клетках эукариот.15

1.3. Бакуловирусы.17

1.3.1. Биология бакуловирусов.17

1.3.2. Молекулярная биология бакуловирусов.18

1.4. Бакуловирусные системы экспрессии (БЭС) рекомбинантных белков в клетках эукариот.19

1.4.1. Системы экспрессирующих векторов на основе бакуловирусов.19

1.4.2. Получение функционально активных рекомбинантных белков с использованием бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых.22

1.4.3. Получение вирусоподобных частиц и вакцин в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы экспрессии.26

1.4.4. Бакуловирусы - средство введения и экспрессии гетерологичных генов у млекопитающих.28

1.4.5. Клеточные линии млекопитающих, чувствительные к бакуловирусной трансдукции.30

1.4.6. Эффективность бакуловирусной трансдукции.

1.4.7. Механизм взаимодействия бакуловируса с клетками млекопитающих.31

1.4.8. Доставка и экспрессия гетерологичных генов в клетки млекопитающих in vivo.32

Введение Диссертация по биологии, на тему "Системы клонирования и экспрессии целевых генов и анализ биологических функций синтезированных рекомбинантных белков"

Оптимизация и дальнейшее совершенствование различных используемых, а также разработка новых систем доставки и экспрессии рекомбинантных генов, в зависимости от типа клеток-мишеней и спектра задач, представляет собой важную функциональную научную задачу и имеет практическое значение в области биомедицины. Конструирование векторных ДНК для введения целевых последовательностей в геномы микроорганизмов, дрожжей, растений, насекомых, млекопитающих находит практическое применение для решении широкого спектра задач. На сегодняшний день используются различные методы для введения чужеродных генов в клетки про- и эукариот при помощи физико-химических способов доставки (электропорации, бомбардировки микрочастицами золота или вольфрама и т.д.) или при помощи различных вариантов биологической доставки (липидных коньюгатов — липосом, рекомбинантных вирусов и т.д). Введение рекомбинантных гибридных молекул ДНК в прокариотические и эукариотические клетки с помощью векторов имеет массу преимуществ и вышло на первый план при решении этой задачи. Разработка на их основе различных систем экспрессии, обеспечивающих эффективную продукцию белков in vitro и in vivo, постоянно совершенствуется, расширяется круг задач, при решении которых они применяются.

Кишечная палочка Е. coli - наиболее генетически, биохимически и физиологически изученный микроорганизм, поэтому основные работы по гетерологичной экспрессии выполняются на этих клетках. Однако Е. coli относится к условно-патогенным для человека микроорганизмом, что может создавать определенные трудности при получении на ее основе, например, фармацевтических препаратов. Сегодня Е. coli часто используют в качестве «промежуточной» системы клонирования при конструировании гибридных молекул ДНК для других типов клеток. Так, в новых бакуловирусных системах для получения рекомбинантного вируса используются клетки Е coli на промежуточной стадии для поддержания и размножения вирусной ДНК в виде кольцевой формы, с последующей репликацией бакуловируса в клетках насекомых.

Бактерия Bacillus subtilis по степени популярности и изученности следует за Е .coli: на ее основе также конструируют штаммы-продуценты, секретирующие чужеродные белки из клеток. В subtilis безопасна для человека и животных и успешно освоена микробиологической промышленностью.

Из низших эукариот хорошо изучены дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Первый штамм-продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В был создан именно на S. cerevisiae. Дрожжи представляют собой один из важнейших промышленных микроорганизмов, поэтому интенсивная разработка исследований по созданию векторной дрожжевой системы продолжает быть актуальной и в настоящее время.

Системы клеток бактерий и дрожжей имеют свои особенности при использовании в генетической инженерии и при создании векторов для клонирования и экспрессии генов, для секвенирования ДНК и в качестве модельных систем для изучения генетических процессов, которые применяются в фундаментальной и прикладной биомедицине. Получены штаммы бактерий и дрожжей для клонирования и экспрессии генов с высокой эффективностью синтезирующие гетерологичные белки человека и животных. Каждая из систем клонирования и экспрессии имеет свои недостатки и преимущества. Системы клонирования и экспрессии генов в клетках бактерий и дрожжей не позволяют экспрессировать несплайсированные гены. Кроме того, в них невозможен сложный посттрансляционный процессинг полипептидов, происходящий в клетках млекопитающих. Все большую актуальность приобретает проблема экспрессии мультимерных белков эукариот, которые требуют для проявления своей биологической активности специфических посттрансляционных модификаций и сборки из различных субъединиц. В этих случаях используют экспрессирующие системы на основе клеток высших эукариот, которые обеспечивают синтез белков, структурно и функционально близких к своим природным аналогам. В последние два десятилетия предложено большое число векторов, в качестве которых выступают различные вирусы для введения чужеродных генов в клетки-мишени. С помощью вирусов - естественных переносчиков чужеродной ДНК в клетки млекопитающих - удается обеспечить эффективное проникновение генетического материала в клетки-мишени, достичь высокого уровня трансфекции клеток in vitro и in vivo и высокого уровня экспрессии внесеннных генов. Однако существование врожденного иммунитета у человека к большинству таких векторов может ограничить их применение.

Одним из подходов к преодолению этой проблемы является создание рекомбинантных вирусов, не патогенных для человека, в качестве векторов для переноса генов. Например, у человека отсутствует врожденная гуморальная и клеточная иммунная память по отношению к бакуловирусам. Поэтому бакуловирусная система экспрессии на основе клеток насекомых отряда Spodoptera, которая обеспечивает сверхпродукцию рекомбинантных белков в эукариотических клетках, популярна в настоящее время. Бакуловирусная система (БЭС) позволяет экспрессировать несплайсированные гены, а особенности структуры капсидной оболочки бакуловирусов позволяют упаковывать в нее очень большие гены. Рост интереса к этим системам экспрессии связан также с возможностью использования бакуловирусных векторов для доставки и экспрессии гетерологичных генов в клетках млекопитающих. Экспрессионная система на основе бкуловирусов, позволяющая синтезировать полноценные эукариотические белки в различных клетках млекопитающих in vitro, ex vivo и in vivo, рассматривается в качестве перспективной альтернативы векторам на основе вирусов человека. Оптимизация такой системы, в зависимости от типа клеток-мишеней, является актуальной задачей современных исследований в области биомедицины. Целью данной работы является сравнение различных векторных систем, клонирование и.экспрессия целевых рекомбинантных генов в клетках про- и эукариот и их применение для решения научных и прикладных задач. Оптимизация системы доставки и экспрессии генов в клетках насекомых и млекопитающих на основе бакуловирусных векторов: В ходе работы был поставлен ряд задач:

1. С использованием бактериальных систем клонирования и экспрессии: а) Получить библиотеки бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномных РНК вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и вируса картофеля (ХВК), для изучения структуры вирусных геномов. б) Разработать тест-систему для функциональной селекции библиотек мутантных рибозимов в клетках Bacillus subtilis с целью изучения механизмов функционирования синтезированных рибозимов in vivo.

2. С использованием систем экспрессии в клетках листьев табака, ооцитов: Создать генетические конструкции для доставки и экспрессии гена серотонинового рецептора мозга мыши 5НТ1с в клетках листьев табака, ооцитах ксенопуса и клетках насекомых для изучения роли серотониновой системы в реакции различных типов клеток на стрессорные сигналы.

3. С использованием дрожжевой системы экспрессии:

4. С использованием бакуловирусной системы экспрессии на основе клеток насекомых и млекопитающих:

1) Создать набор мультипромоторных векторов экспрессии для клеток насекомых, содержащих промоторы поздних генов вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), которые обеспечивают одновременную экспрессию нескольких генов в одной инфицированной клетке насекомого.

2) Сконструировать трансфер-векторы на основе бакуловирусов, содержащие регуляторные элементы, используемые ферментативными системами клеток млекопитающих, для экспрессии клонированных целевых генов в культуре клеток млекопитающих.

3) Получить рекомбинантные вирусы и линии клеток насекомых, синтезирующие иммунологически активные а- и (3-субъединицы хориогонадотропина (ХГ) и CD4 рецептора.

4) Получить рекомбинантную функционально-активную стероид-21-гидроксилазу человека и мутантный вариант этого фермента с высоким уровнем экспрессии в клетках насекомых Sf9 и Hi5 на основе бакуловирусов и провести функциональный анализ мутантного фермента in vitro.

5) Получить структурные белки и вирусоподобные частицы вируса гепатита С (ВГС ) в клетках насекомых и млекопитающих с помощью бакуловирусной системы экспрессии и исследовать их функциональные характеристики.

6) Исследовать морфогенез вируса гепатита С: изучить влияние гликозилирования обо л очечных белков ВГС на их экспрессию и процессинг и формирование вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых .

7) Исследовать влияние новых синтетических ингибиторов гликозилирования белков на процессинг структурных белков и формирование вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых и млекопитающих.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Векторы для переноса чужеродных ДНК в клетки млекопитающих и эукариотические системы экспрессии, основанные на их использовании и обеспечивающие эффективную продукцию биологически активных белков in vitro и in vivo, постоянно совершенствуются. Известны разные методы введения чужеродных генов в клетки эукариот, при помощи физико-химических способов доставки ( электропорации, бомбардировки микрочастицами золота или вольфрама и т.д.), при помощи различных вариантов биологической доставки (липидных коньюгатов -липосом, рекомбинантных вирусов и т.д). В течение последних двух десятилетий предложено большое число вариантов векторов на основе различных вирусов как средства доставки чужеродных генов в клетки-мишени. С помощью вирусов -естественных переносчиков чужеродной ДНК в клетки млекопитающих - удается обеспечить проникновение генетического материала в клетки-мишени и достичь высокого уровня трансфекции клеток in vitro и in vivo и экспрессии внесеннных генов.

Экспрессирующие векторы на основе бакуловирусов позволяют синтезировать полноценные эукариотические белки в культивируемых клетках насекомых с таким выходом, уровень которого не достигнут ни в одной другой эукариотической системе гетерологичной экспрессии генов. Способность бакуловируса передавать генетическую информацию клеткам млекопитающих послужила предпосылкой для использования бакуловирусных векторов и в качестве экспрессирующих векторов для клеток млекопитающих. Так как бакуловирус, передавая эту информацию клеткам млекопитающих, сам не реплицируется, то векторы на его основе удобны и безопасны для разработки эффективных систем переноса и экспрессии чужеродных генов in vitro и in vivo. Более того, высокая емкость бакуловирусных векторов и биологическая безопасность вируса определяют интерес к этой системе и ее совершенствованию. Экспрессионная система на основе бакуловирусов, позволяющая получать эффективную продукцию полноценных эукариотических белков в широком спектре клеток млекопитающих in vitro, ex vivo и in vivo, может рассматриваться как перспективная альтернатива векторам на основе вирусов человека. В настоящем обзоре рассмотрены особенности бакуловирусов и систем экспрессии на их основе.

1.2. ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ПЕРЕНОСА И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В

КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ.

Векторы на базе вирусов млекопитающих, которые обеспечивают эффективное проникновение в клетки-мишени, позволяют использовать вирусы в качестве естественных векторов чужеродной ДНК для клеток эукариот. При выборе оптимальной системы, важны такие критерии, как простота применения, сильные и регулируемые во времени промоторы, как скорость получения значительных количеств активных эукариотических белков и т.д. Первостепенное значение имеет выбор вектора для получения белка. В зависимости от специфики решаемой проблемы, предпочтение отдается тому или иному вектору.

К сожалению, все известные in vitro и in vivo векторные системы доставки репортерных генов далеки от совершенства, хотя проблемы доставки экзогенных ДНК in vitro, в основном, решены. Системы же переноса чужеродных генов в клетки-мишени млекопитающих in vivo продолжают совершенствоваться. Например, такие характеристики векторных систем как стабильность их интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность использования все еще нуждаются в доработке. В идеале, важно достичь не только устойчивости введенного гена, но и эффективной экспрессии в течение длительного времени.

При решении задач, связанных с совершенствованием систем эффективного переноса и экспрессии трансгенов в клетках эукариот in vitro и in vivo, в основном, используют различные векторы на основе вирусов человека. Примененяются векторы на основе ретровирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса герпеса, лентивирусов, бакуловирусов. Каждая система на их основе имеет свои преимущества и недостатки. Сравнение свойств вирусных векторов, наиболее часто используемых для доставки чужеродной генетической информации в клетки эукариот, позволяет оценивать их в качестве перспектив для использования в биологической медицине. По сравнению с другими типами вирусных векторов, векторы на основе ретровирусов обладают уникальной способностью эффективно переносить чужеродные гены и стабильно их интегрировать в геном делящихся соматических клеток. Недостатки ретровирусных систем переноса и экспрессии генов -невозможность доставки генов в геном неделящихся клеток, низкие вирусные титры и небольшие размеры внедренного трансгена. При конструировании векторных конструкций на основе аденовирусов используют дефектные по репликации аденовирусы. Способность аденовируса инфицировать практически любые клетки как in vitro, так и in vivo, позволяет применять аденовирусные векторы для адресной доставки генетического материала и вводить в их состав тканеспецифические промоторы. Недостатком системы на основе аденовируса является его неспособность интегрироваться в геном клетки-хозяина. Кроме того, рекомбинантный аденовирус может рекомбинировать с природными аденовирусами. Уникальной особенностью адено-ассоциированного вируса является способность к стабильной направленной интеграции в один из районов 19 хромосомы человека. Интегрируясь в геном, вирус пребывает в латентном состоянии. Специфичность такой интеграции определяется наличием в его геноме гена Rep. Однако этот вирус имеет низкую упаковывающую способность и относительно низкую инфекционность. Крупный ДНК содержащий герпес вирус (HSV) при трансформации клеток формирует в ядрах эписомные структуры. Большая емкость (более 30 т.п.о.), высокие вирусные титры, высокая эффективность инфекции и широкий спектр клеток-хозяев определяют преимущества векторных конструкций на основе вируса герпеса. При этом, упаковка вирусных частиц происходит с низкой эффективностью, а репликационно-дефектные мутанты вируса цитотоксичны. Векторные конструкции на основе бакуловирусов образуют рекомбинантные бакуловирусы в клетках насекомых (природных хозяевах бакуловирусов) с высоким титром.

Экспрессионная система на основе бакуловирусных векторов, по сравнению с другими типами вирусных векторов, представляется наиболее удобной, поскольку ее преимущества очевидны. Среди них то, что размеры внедренных трансгенов могут достигать до 100 т.п.н., уровень их экспрессии и синтеза рекомбинантных белков высок. Вектор может одновременно экспрессировать несколько генов, включая несплайсированные. В клетках млекопитающих вирус не реплицируется, и это позволяет использовать его в качестве вектора для доставки репортерных генов в клетки млекопитающих как in vitro, так и in vivo. С его помощью можно осуществлять прямое адрессное клонирование при временной и стабильной трансдукции клеток млекопитающих. Можно трансдуцировать первичные клетки разного типа, при широком спектре клеточной специфичности. Бакуловирус может инфицировать неделящиеся клетки, нецитотоксичен, не эндемичен для человека.

Врожденный иммунитет человека к большинству вирусов человека ограничивает применение векторов на их основе. Путь к преодолению этой проблемы - создание рекомбинантных вирусов не человеческого происхождения в качестве векторов для переноса генов. Врожденной гуморальной и клеточной иммунной памяти у человека по отношению к бакуловирусам нет, поскольку они инфекционны только для насекомых, но и обладают способностью передавать генетическую информацию клеткам млекопитающих.

К недостаткам этой системы можно отнести то, что посттрансляционные модификации белков в клетках насекомых в отдельных случаях неадекватны и то, что чувствительность бакуловируса к действию системы комплемента при доставке чужеродных генов в клетки и ткани млекопитающих in vivo достаточно велика. Тем не менее, на сегодняшний день, бакуловирусная векторная система успешно применяется для доставки генетической информации в клетки эукариот in vitro и ее использование для доставки генов in vivo продолжает расширяться. Векторы на основе бакуловирусов находят все большее применение в фундаментальной и прикладной биологии, в биомедицине, для разработок, направленных на создание методов диагностики, вакцинации и генотерапии.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Белжеларская, Светлана Николаевна

Выводы:

3. Впервые разработаны и предложены условия синтеза серотонинового рецептора 5НТ1с мозга мыши в клетках растений, в ооцитах Xenopus laevis и в клетках насекомых для изучения его функциональной активности. Показано, что рецептор серотонина в виде гибрида с GFP. в клеточном ответе на серотонин в ооцитах Xenopus laevis, связывается с гормоном и, при участии GTP-связывающего белка, активирует фосфолипазу С, инициируя поток кальция в клетке.

4. Впервые в инфицированных рекомбинантными бакуловирусами клетках насекомых синтезированы стероид-21-гидроксилаза (CYP21А2) человека и ее мутантный вариант (C169R), обнаруженный у больной с классической формой адреногенитального синдрома, с уровнем экспрессии, значительно превышающим показатели, достигнутые в системах экспрессии на основе клеток млекопитающих и дрожжей. Впервые проведены исследования влияния мутаций стероид-21-гидроксилазы на ее свойства, которые могут иметь важное значение для прогнозирования тяжести заболевания классической формой адреногенитального синдрома при молекулярно-генетической диагностике у новорожденных

5. Впервые предложены новые дву- и трех-промоторные векторы экспрессии для эукариот на основе бакуловирусов, для синтеза мультимерных белков со специфическими пост-трансляционными модификациями и корректной сборкой из различных субьединиц.в клетках насекомых.

6. Впервые сконструированы новые модифицированные бакуловирусные векторы в форме трансфер-векторов рРаз1ВасМатОРР и рРаз1ВасМатЬис, с экспрессирующими кассетами под контролем промотора цитомегаловируса (СМЛ') для направленной доставки и экспрессии эукариотических генов в культивируемых клетках млекопитающих. Разработаны условия эффективной трансдукции и экспрессии структурных генов ВГС в клетках Нек293 и Ний-7, с помощью рекомбинантных бакуловирусов.

7. Получены линии клеток насекомых 81^9 - эффективные продуценты структурных белков и вирусоподобных частиц вируса гепатита С, структурно и иммунологи чески подобных вприонам вируса, использованных в качестве модели при изучении морфогенеза ВГС.

8. Для изучении морфогенеза ВГС исследовано влияние М-гликозилировапия гликопротеина Е1 вируса гепатита С на экспрессию и процессинг белков оболочки вируса, на образование комплекса Е1Е2 ВГС, влияющего на формирование часшц, морфологически подобных вприонам ВГС, с использованием вирусоподобных частиц ВГС, синтезируемых в клетках насекомых.

9. С целью разработки новых антивирусных соединений, влияющих на формирование вириона вируса гепатит а С, синтезированы ингибиторы а-глюкозидазы, производные иминосахара дезоксиноиримицина (БШ) Ы-пентил -Г)Ш и М-бепзил -БШ, способные нарушать процесс внутриклеточного М-гликозилирования оболочечных гликопротеинов вируса, влияя на сворачивание гликопротеинов и, соответственно, сборку вирусных частиц.

Работа получила финансовую поддержку Государственной научно-технической программы России «Новейшие методы биоинженерии» (№6-19), Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» 1999-2000 г.г. и 20012002 г.г. и Российского фонда фундаментальных исследований 05-04-49477а (2005-2007г.г.) , 07-04-12136 офи ( 2007-2008 г.г.) и 08-04-00281а (2008-2010 г.г.).

Список публикаций по теме диссертации.

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Dolja, V., Lunuia, N., Leiser, R., Stanarius, Т., Beljelarskaya, S., Kozlov, Y. and Atabekov,

1. (1983) A comparative study on the in vitro translation products of individual RNAs from two, three-, and four- component strains of Barley stripe mosaic virus. Virology 127, 1-44.

3. Рупасов В., Адышев Д., Морозов С., Белжеларская С., Манкин А., Доля В., Аграновский А., Атабеков Г. и Козлов Ю. (1984) Структура 3'-концевого участка РНК вируса штриховатой мозаики ячменя . Молекулярная биология 18, 140-145

4. Kozlov, Yu., Rupasov, V., Adyshev. D., Beljelarskaya, S., Agranovsky, A., Mankin, A., Morozov, S. and Dolya, V. (1984) Nucleotide sequence of the З'-terminal structure in BSMV genome. Nucleic Acids Research, 12, 4001-4009.

5. Adyshev, D., Beljelarskaya, S. Kozlov, Yu. (1987) Pecularities of structural organization of BSMV genome. Ac. of Sci. of the Kyrghyz Rep. News, 4: 52-55.

6. Краев А., Морозов С., Лукашева Л., Розанов М., Чернов В.,' Симонова М., Голова Ю., Белжеларская С., Позмогова Г., Скрябин К. и Атабеков Г. (1988) Первичная структура и организация генома Х-вируса картофеля. Доклады АНСССР. 300, 711-716.

13. Белжеларская С.Н. и Саттон Ф. (2003) Роль серотониновой системы в реакции различных типов клегок на стрессорные сигналы. Молекулярная биология 37(3), 452-457.

14. Белжеларская С.Н. и Саттон Ф. (2004) Экспрессия кДНК гена серотонинового рецептора мыши (5НТ1с) в культуре клеток насекомых. Молекулярная биология 38(3). 477482.

15. Королева Н.Н., Грищук Ю.В., Кочеткова С.В., Прасолов B.C. Рубцов П.М. и Белжеларская С.Н. (2006) Оптимизация бакуловирусной системы доставки генов в клетки насекомых и млекопитающих. Молекулярная биология, 40(6), 1074-1081

16. Yu.Grischuk. P. Rubtsov, F. Riepe, J. Grotzinger, S. Beljelarskaya, V. Prassolov, N. Kalintchenko, T. Semitcheva, V. Peterkova, A. Tiulpakov, W. G. Sippell and N.Krone (2006). Four novel missense mutations in the CYP21 gene in Russian patients with classical form of congenital adrenal hyperplasia (САН): identification, functional characterization and structural modeling. J Clin Endocrin & Metab (JCEM), 91(1-12), 4976-4980

17. Грищук Ю.В., Рубцов П.М. и Белжеларская С.Н.(2007) Экспрессия и функциональный анализ стероид 21 -гндроксилазы человека и ее мутаитного варианта в клетках насекомых. Молекулярная биология, 41(1), 77-78

19. Королева Н.Н., Спирин П.В. Тимохова А.В., Рубцов П.М., Кочетков С.Н., Прасолов B.C., Белжеларская С.Н. (2010) Бакуловирусныс векторы для эффективной доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих, Молекулярная биология, 44(3), 1-13

20. Lyupina YV, Dmitrieva SB, Tiinokhova AY, Beljelarskaya SN, Zatsepina OG, Evgen'ev M.B. Mikhailov VS. (2010) An important role of the heat shock response in infected cells for replication of baculoviruses. Virology, Aug 12,

21. Белжеларская С.Н. (2010). Бакуловирусные системы экспрессии рекомбинантных белков в клетках насекомых и млекопитающих. Обзор., Молекулярная биология,45(1), 142-159.

Избранные тезисы конференций:

22. Beljelarskaya, S., Morozov, S., Dolja, V., Kozlov, Yu. and Atabekov. I. (1982) Cloning of DNA-copies of RNA genome BSMV. Thesises on Sixth USSR-FRANCE Symposium "Proteins and Nuclear Acids Structure and Function", Tskhaltubo, p.21

23. Kozlov, Yu., Rupasov, V., Adyshev, D., and Beljelarskaya, S. (1984) Pecularities of structural organization of BSMV genome. Thesis on 16-th FEBS conference, Moscow, p.22.9

25. Краев А., Морозов С., Лукашева JI., Розанов М., Чернов В., Сшмонова М., Голова Ю., Белжеларская С., Позмогова Г., Скрябин К. и Атабеков Г. (1987) Первичная структура генома Х-вируса картофеля. Молекулярная генетика .3, 32

26. Рубцов П.М., Морозов И.А., Свердлова П.С., Дебабов Д. Г. и Белжеларская С.Н. (1994) Создание трансфер-векторов для экспрессии мультимерных генов в эукариотической системе экспрессии Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология. А, 17-18.

27. Белжеларская С.Н., Свежинский Е.А., Сутугина Л.П., Трум В.М., Рубцов П.М., Скрябин К.Г.(1994) Экспрессия гонадотропных гормонов в клетках эукариот. Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология. 4, 16-17.

31. Y.V.Grischuk, D.S. Ivanov, V.S. Prassolov, S.N. Beljelarskaya and P.M.Rubtsov. (2005) Two novel disease-causing mutations in the CYP21 gene in Russian patients with 21hydroxylase deficiency: affect on functional enzyme activity. 30th FEBS Congress-9th IUBMB Conference, Budapest. A4-023P.

Заключение

Цикл работ, представленный в настоящей диссертации, посвящен разработке систем клонирования и экспрессии генов в клетках про - и эукариот и анализу биологических функций целевых белков с использованием этих систем, начиная с бактериальных клеток и завершая, активно используемой в настоящее время, бакуловирусной системой экспрессии в клетках насекомых и млекопитающих.

Конструирование векторных ДНК и введение целевых последовательностей в геномы микроорганизмов, дрожжей, растений, насекомых, млекопитающих, в зависимости от спектра поставленных задач; разработка и оптимизация систем экспрессии генов позволили синтезировать белки разного типа, пригодные для структурных и функциональных исследований.

При выполнении представленной работы, с использованием клеток Е. coli, впервые получена библиотека бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномной РНК ВШМЯ, которая может быть использована в производстве диагностических препаратов, необходимых для селекции сортов злаков, устойчивых к этому вирусу. Предложена схема организации функционально фрагментированного генома фитовируса. Использованная нами система двумерного электрофореза дает оптимальное разрешение для олигонуклеотидов длиной свыше 10 остатков, что давало возможность анализировать значительную часть последовательностей исследуемых молекул РНК ВШМЯ. Так как олигонуклеотиды статистически распределены по всей длине исследуемой молекулы РНК, то можно допустить, что они достаточно достоверно представляют всю последовательность этой РНК. Сравнительный анализ олигонуклеотидных карт геномных РНК ВШМЯ показал, что ВШМЯ имеет ряд особенностей в устройстве генома, отличающих его от всех известных фитовирусов. Подтверждено, что необычным свойством ВШМЯ является вариабельность структуры его генома, при этом, разные штаммы ВШМЯ различаются в числе компонентов вирионной РНК. Проведенное олигонуклеотидное картирование показало, что, несмотря на различие в числе компонентов генома исследуемых штаммов ВШМЯ, они имеют высокую степень гомологии, т.е. являются близкородственными. При этом, очень близкие штаммы вируса, неотличимые серологически, имеют различия в структуре генома.

С использованием систем клонирования в клетках бацилл, определен эффект ингибирующей концентрации макролидного антибиотика тилозина на рост бактериальных клеток штамма Bacillus subtilis, индуцирующего экспрессию РНК-мишени (модифицированный ген егшС) и мутантного рибозима, расщепляющего эту мишень.

В результате разработана селекционная бактериальная система на основе В. subtilis функциональной селекции рибозимов, в которой выживание бактерий зависит от эффективности функционирования мутантного рибозима. Такая система может быть полезна при рассмотрении проблем конструирования, функционирования и селекции синтетических эндорибонуклеаз (рибозимов) способных в конечном итоге привести к созданию мощных агентов против вирусных инфекций.

С точки зрения разработки векторов, каждая система доставки генов к клеточным мишеням in vitro и in vivo имеет свои преимущества и недостатки. При выборе системы, обеспечивающей высокий уровень биологической активности продукта, важны такие критерии, как легкость применения, использование сильных и регулируемых во времени промоторов, скорость получения значительных количеств активных эукариотических белков и т.д. Первостепенное значение имеет выбор вектора для получения белка в зависимости от специфики решаемой проблемы.

При клонировании и экспрессии генов в клетках бактерий невозможен сложный посттрансляционный процессинг полипептидов, происходящий в клетках эукариот. В этой связи, дрожжевые системы экспрессии стали играть важную роль в получении гетерологичных белков для научных, промышленных и медицинских целей. В представленной работе предложены векторные конструкции, несущие регуляторные области дрожжевого гена РН05, для экспрессии и секреции гетерологичных белков в клетках Saccharomyces cerevisiae. С этой целью, впервые сконструирована серия векторных плазмид, содержащих делеционные варианты промотора кислой фосфатазы РН05 S. cerevisiae и создан набор дрожжевых векторов, содержащих регулируемый промотор гена кислой фосфатазы и нуклеотидные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды секретируемых белков. Созданная дрожжевая система экспрессии использована для получения штаммов дрожжей, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В человека, для изучения влияния гомологичных и гетерологичных лидерных пептидов на эффективность экспорта гормона роста человека из S. cerevisiae.

Интерес к фитогормонсвязывающим белкам растений обусловлен в первую очередь их возможной рецепторной функцией, их ролью в молекулярных механизмах рецепции и передачи гормонального сигнала. К настоящему времени накоплены данные по сопоставлению гормональных систем регуляции и гормонсвязывающих белков растений и животных. Для сравнения систем передачи внеклеточных сигналов на сигнальные преобразования в растительных и животных клетках в данной работе использован мембранный серотониновый рецептор 5НТ1с мозга мыши, связывающий гормон из

141 внеклеточного пространства. Исследована серотониновая система в реакции клеток растений и ооцитов Хепорт laevis на стрессорный сигнал, активированный взаимодействием серотонинового рецептора с серотонином, и связанного с ним ионного потока Са2а. Для этого, впервые разработаны, и предложены условия синтеза серотонинового рецептора 5НТ1с мозга мыши в клетках листьев табака, в ооцитах Хепорт 1аем18 и в клетках насекомых для изучения его функциональной активности. Показано, что рецептор серотонина в виде гибрида с ОБР в клеточном ответе на серотонин в ооцитах Хепорш laevis, связывается с гормоном и, при участии ОТР-связывающего белка, активирует фосфолипазу С, инициируя поток кальция в клетке. Ионный поток Са2а в клетке активирует С1" - каналы и поток СГ из клетки, который легко регистрируется. Изучение участия рецептора серотонина в регуляции передачи сигнала в различных клетках может быть полезным при исследовании клеточной системы преобразования внешнего стимулирования во внутриклеточные сигналы.

В заключительной части диссертации представлены результаты исследований, посвященных разработке и оптимизации бакуловирусной системы экспрессии генов в клетках насекомых и млекопитающих. Экспрессирующие векторы на основе бакуловирусов позволяют синтезировать полноценные эукариотические белки в культивируемых клетках насекомых с таким выходом, уровень которого не достигнут ни в одной другой' эукариотической системе гетерологичной экспрессии генов. На сегодняшний день, экспрессионная система на основе бакуловирусов привлекает внимание исследователей, благодаря ее очевидным преимуществам. Большие размеры внедренного трансгена - до 100 т.п.о., высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков, возможность одновременной экспрессия нескольких генов и экспрессии несплайсированных генов, возможность прямого адресного клонирования, временная и стабильная трансдукция клеток млекопитающих, трансдукция первичных клеток разного типа, широкий спектр клеточной специфичности. Бакуловирус инфицирует неделящиеся клетки, нецитотоксичен, не эндемичен для человека. Таким образом, векторы на основе бакуловирусов широко используются для получения гетерологичных белков в культурах клеток насекомых и млекопитающих.

Для экспрессии сложных белков, белков из нескольких субъединиц и многобелковых комплексов в клетках насекомых используют один из способов получения мультимерных белков, который заключается в совместной котрансфекции культуры клеток насекомых двумя и более типами рекомбинантных ДНК, содержащих гены субъединиц. В таких экспериментах не всегда удается получить зрелый активный продукт. В этой связи, созданы и создаются в настоящее время специальные экспрессирующие кассеты,

142 содержащие три, четыре и более промоторов поздних вирусных генов, позволяющие получать мультимерные белки. В представленной работе предложены новые дву- и трехпромоторные векторы экспрессии на основе бакуловирусов для одновременной экспрессии нескольких генов в одной инфицированной клетке насекомого, полученных с использованием субклонированных нами фрагментов геномной ДНК вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), содержащих гены поздних вирусных белков PIO, Р35 и Р39 с их промоторными последовательностями. Новые векторы экспрессии могут быть использованы для синтеза мультимерных белков, функционально близких природному аналогу.

Рекомбинантные бакуловирусы, содержащие промоторы, активные в клетках млекопитающих, широко используются в настоящее время для доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих in vitro и in vivo. На сегодняшний день показано, что бакуловирус эффективно трансдуцирует различные типы клеток, при этом, список клеточных линий млекопитающих, чувствительных к бакуловирусной трансдукции, постоянно расширяется и, в зависимости от типа клеток, эффективность трансдукции колеблется от 10 до 90%. Нами сконструированы новые модифицированные бакуловирусные векторы в форме трансфер-векторов pFastBacMaml-3GFP и pFastBacMamLuc, с экспрессирующими кассетами под контролем промотора цитомегаловируса (CMV) для направленной доставки и экспрессии эукариотических генов в культивируемых клетках млекопитающих. Векторы использованы для эффективной трансдукция клеток Hek293, COS-7 и Huh7 рекомбинантными бакуловирусами и экспрессии структурных генов вируса гепатита С. Разработаны условия эффективной трансдукция клеток млекопитающих Нек293 и Huh-7 рекомбинантными бакуловирусами, несущими последовательности структурных генов ВГС, что приводило к экспрессии клонированных генов полипротеина ВГС и их правильному процессингу с образованием продуктов генов структурных белков вируса.

С использованием бакуловирусной системы экспрессии гетерологичных генов нами были получены клетки насекомых и млекопитающих, продуцирующие разные типы сложных белков. Это - мембранные белки рецептор CD4 человека и серотониновый рецептор 5НТ1с мыши, микросомный гем-содержащий белок стероид-21-гидроксилаза и его мутантный вариант, гликопротеидный двухсубъединичный гормон хориогонадотропин человека, структурные белки С, El и Е2 вируса гепатита С.

Экспрессия трех структурных белков ВГС в клетках насекомых сопровождается образованием вирусоподобных частиц и может служить основой модельной системы морфогенеза ВГС. Эта система использована нами для изучения влияния

143 гликозилирования структурных белков ВГС на их димеризацию и сборку и для исследования действия новых синтетических ингибиторов а - глюкозидаз на процесс сборки вирусных частиц.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Белжеларская, Светлана Николаевна, Москва

1. Ayres M.D., Howard S.C. Kuzio J, Lopez-Ferber M., Possee R.D.I994. The complete DNA sequence of Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus. Virology. 202, 586-605.

2. Rohrmann G.F. Martignoni M.E., Beaudreau G.S. 1982. J. Gen. Virol. 62, 137-142.

3. Miller L.K. 1986. Biotechnology advances in invertebrate pathology and cell culture. Orlando FI: Acad. Press.

4. Miller L.K., Lingg А.Т., Bulla L.A. 1983. Bacterial, Viral and Fungal Insecticides. Science. 219, 715-721.

5. Van der Beek C. P., Saaijer Riep J. D., Vlak J.M. 1980. On the origin of the polyhedral protein of Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus. Isolation, characterization, and translation of viral messenger RNA. J. Virol. 100,326 -333.

6. Volkman L.E., Zaal K.J.M. 1990. Autographa califomica M nuclear polyhedrosis virus: Microtubules and replication. Virology. 175, 292 302.

7. Rohrmann G.F. 2008. Baculovirus Molecular Biology. NCBI. Bethesda. US. Book.

8. Kool M., Ahrens C.S., Vlak J.M., Rohrmann G.M. 1995. Replication of baculovirus DNA. J. Gen. Virol. 76, 2103 2118.

9. Mikhailov and Rohrmann G.F. 2002. The baculovirus replication factor LEF-1 is a DNA primase. Journal of Virology. 76, 2287-2297

10. Miller L.K. 1988. Baculovirus as gene expression vectors. Annv Rev. Microbiol. 42, 177-199.

11. Miller D.W., Safer P. and Miller L.K. 1986. An insect baculovirus host vector for highlevel expression of foreign genes. In Genetic Engineering. 8 (J.K.Setlow and A.Hollaender, eds.). Plenum. New York. 277-298.

12. Summers M.D., Smith G.E. 1987. A manual of method for baculovirus vectors and insect cell culture procedures. Bulletin No. J555. Texas Agricultural Experiment Station and Texas A & M University, Publishers College Station, Texas. 10-39

13. Matsuura Y., Possee R., Bishop D. 1987. Baculovirus expression vectors: the requirements for high level expression of proteins, including glycoproteins. J. Gen. Virol. 68, 1233 1250.

14. Luckow V.A., Summers M.D. 1988. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Biotechnology. 6, 47 55.

15. Smith G.E., Summers M.D., Fraser M.J. 1983. Production of human beta-interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell Biol. 3, 2156 -2165.

16. Pennock GD, Shoemaker C, Miller LK. 1984. Strong and regulated expression of Escherichia coli beta-galactosidase in insect cells with a baculovirus vector. Mol Cell Biol. 4, 399 -406.

17. Smith G.E., Summers M.D.: US4745051 (1988).

18. Smith G.E., Summers M.D.: US4879236 (1989).

19. Kitts PA, Ayres MD, Possee RD. 1990. Linearization of baculovirus DNA enhances the recovery of recombinant virus expression vectors. Nucleic Acids Res. 18, 5667 5672.

20. Kitts PA, Possee RD. 1993. A method for producing recombinant baculovirus expresson. vectors at high frequency. Biotechniques. 14, 810 817.

21. Possee RD., King L.A. : WOOl 12829 (2001).

22. Possee RD., Hitchman RH, Richards KS, et al. 2008. Generation of baculovirus vectors for the high throughput production of proteins in insect cells. Biotechnol. Bioeng. 101(6), 1115-1122.

23. Berger 1, Richmond T.J. W020055085456 (2005)

24. Fitzgerald D.J., Berger P., Schaffitzel C., Yamada K., Richmond T.J., Berger I. 2006. Protein complex expression by using multigene baculovirus vectors. Nat. Methods. 3, 1021 1032.

25. Lee, S.C., Leusch, M.S., Luckow, V.A., Olins, P.O. : US5348886 (1994).

26. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System. Version D. ed: Invitrogen Life Technologies, 2004.

27. Wells D.E., Compans R.W. 1990. Expression and characterization of a functional human immunodeficiency virus envelope glycoprotein in insect cells. Virology. 176, 575 — 584.

28. Белжеларская С.Н., Сутугина Л.П., Толкачева Т.В., Рубцов П.М.и Скрябин К.Г. 1996. Экспрессия гена CD4 -рецептора ВИЧ -1 в клетках насекомых с использованием бакуловирусной недели. Молекуляр. биология. 30, 524 — 528.

29. Белжеларская С.Н., Сутугина Л.П. Филенко О.М., Бучацкий Л.П. и Рубцов П.М. 1996. Экспрессия кДНК хорионического гонадотропного гормона человека в культуре клеток насекомых. Молекуляр. биология. 30, 518 523.

30. Lowe P.N., Page M.J et al. 1991. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. J. Biol. Chem. 226, 1672- 1678.

31. Ramer S.E., Winkler D.G., Carrera A., Roberts T.M. and Walsh Ch.T., 1991. Purification and initial characterization of the lymphoid-cell protein-tyrosine kinase p56 lek from a baculovirus expression system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6254 — 6258.

32. Kloc, M., Reddy, В., Crawford, S., and Etkin, L. D. 1991.The use of baculoviruses as expression vectors. J. Biol. Chem. 226, 8206 8212.

33. Tsao Т., Hseih J.C., M E Durkin, С Y Wu, S Chakravarti, L J Dong. M Lewis, and A E Chung. 1990. Characterization of the basement membrane glycoprotein entactin synthesized in a baculovirus expression system. J. Biol. Chem. 265, 5188-5191.

34. Белжеларская C.H., Саттон Ф. 2004. Экспрессия кДНК гена серотонинового рецептора мыши (5НТ1С) в культуре клеток насекомых . Молекуляр. биология. 38, 477-482.

35. Грищук Ю.В., Рубцов П.М., Белжеларская С.Н 2007. Экспрессия и функциональный анализ стероид 21 -гидроксилазы человека и ее мутантного варианта в клетках насекомых. Молекуляр. биология. 41, 77 78.

36. Hasemann G.A., Capra J.D. 1990. . Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 3842 3846.

37. Ermst W., GrabheiT R., Wegner D., Borth N., Grassauer A., Katinger H. 1998. Baculovirus surface display: construction and screening of a eukaryotic epitope library. Nucleic Acids Res. 26, 1717 1723.

38. Weyer U., Possee R.D. 1991. A baculovirus dual expression vector derived from the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus polyhedrin and plO promoters: coexpression of two influenza virus genes in insect cells J. Gen. Virol. 72, 2967 2974.

39. Pajot Augy E., Bozon V., Remy JJ., Couture L. and Salesse R. 1999. Critical relationship between glycosylation of recombinant lutropin receptor ectodomain and its secretion from baculovirus-infected insect cells. Eur. J. Biochem. 260, 635 -648.

40. Jarvis D.L. 1993. Book. Annals New York Academy of Sciences. 240 246.

41. Harrison R.L., Jarvis D.L. 2006. Protein N-glycosylation in the baculovirus-insect cell expression system and efforts to engineer insect cells to produce "mammalianized" recombinant glycoproteins. Adv. Virus. Res. 68, 159- 191.

42. Harrison R.L., Jarvis D.L. 2007. Transforming lepidopteran insect cells for improved protein processing. Methods Mol Biol. 388, 341 -356.

43. Shi X., Jarvis D.L. 2007. Protein N-glucosylation in the baculovirus-insect cell system. Curr. Drug. Targets. 8, 1116 1125.

44. Jarvis D.L., 2009. United States Patent Application 20090288178

45. Jarvis D.L., BeekN.V., Fraser M. Patent:-US20070067855, 2007.

46. Hollister J.R., Jarvis D.L. 2001. Engineering lepidopteran insect cells for sialoglycoprotein production by genetic transformation with mammalian pi,4 -galactosyltransferase and alpha 2,6 sialyltransferase genes. Glycobiology. 11, 1—9.

47. Hollister J.R., Grabenhorst E., Nimtz M., Conradt H., Jarvis D.L. 2002. Engineering the piotein N-glycosylation pathway in insect cells for production of biantennary, complex N-glycans. Biochemistry. 41, 15093 15104.

48. Van Patten S.M., Hughes H., Huff M.R.et al. 2007. Effect of mannose chain length on targeting of glucocerebrosidase for enzyme replacement therapy of Gaucher disease. Glycobiology 17, 467-478.

49. Aumiller J.J, Hollister J.R., Jarvis D.L. 2003. A transgenic lepidopteran insect cell line engineered to produce CMP-sialic acid and sialoglycoproteins. Glycobilogy. 13. 497 -507.

50. Seo N.S., Hollister J.R., Jarvis D.L. 2001. Mammalian glycosyltransferase expression allows sialoglycoprotein production by baculovirus-infected insect cells. Prot Exp. Purif. 22, 234-241.

51. Pajot Augy E., Bozon V., Remy J-J., Couture L., Salesse R. 1999. Critical relationship between glycosylation of recombinant lutropin receptor ectodomain and its secretion from baculovirus — infected insect cells. Eur. J Biochem. 260, 635 - 648.

52. Fath-Goodin A., Kroemer J., Martin S., Reeves K., Webb B.A. 2006. Polydnavirus genes that enhance the baculovirus expression vector system. Advances in virus research. 68, 75 90.

53. Kulakovsky P.C., Shuler M. L., Wood H.A. 1998. N glycosylation of a baculovirus-expressed recombinant glycoprotein in three insect cell lines. In Vitro Cell Dev Biol. — Anim. 34, 101 - 108.

54. Shi, Xianzong Jarvis, Donald L. 2007. Protein N-glycosylation in the baculovirus-insect cell system. Curr. Drug. Targets. 8, 1116 1125.

55. TokoyamaN. et al. 2000. Co-expression of human chaperonas Hsp70 and Hsdj or Hsp40 cofactor increase solubility of overexpressed target proteins in insect cells. Biochim Biophys. Acta. 1493, 119 124.

56. Bruns J.B., Carattino M.D., S. Sheng, Maarou A.B. 2007. Epitelial Na+ channels are fully activated by furin- and piostatin dependent release of an inhibitory peptide from the y - subunit. J. of Biol. Chem. 282, 6153-6160.

57. Hughey R. P., Bruns J. B., Kinlough C. L., Harkleroad K. L., long Q., Carattino M. D., Johnson J. P., Stockand J. D., Kleyman T. R. 2004. Epithelial Sodium Channels Are Activated by Furin-dependent Proteolysis. J. of Biol. Chem. 279(18). 18111 18114.

58. Posthaus H, Dubois C.M., Laprise M.H., Grondin F., Suter M.M., Muller E. 1998. Proprotein cleavage of E-cadherin by furin in baculovirus over-expression system: potential role of other convertase in mammalian cells. FEBS Lett. 438. 306 310.

59. Lee D-F, Chen C-C. Hsu T-A and Juang J-L. 2000. A baculovirus superinfection system: Efficient vehicle for gene transfer into Drosophila S2 cells. J. Virol. 74, 11873 11880.

60. Ailor E., Betenbbaugh M.J. 1998. O ver expression of a cytosolic chapetone to improve solubility and secietion of a lecombinant IgG protein in insect cells. Biotechnol. Bioeng. 58, 196-203.

61. Laurent S., Vautheiot J-F., Madelaine M-F., Le Call C. and Rasschaert D., 1994, Recombinant Rabbit Hemorrhagic Disease Virus Capsid Protein Expresse4d in Baculovirus Self-Assembles into Virus Particles and Induces Protection. J.Virol. 68, 6794-6798.

62. Malim M.H., Tiley L.S., McCarn D.F. Rusche J.R., Hauber J. and Bryan. 1990. HIV-1 structural gene expression requires binding of the rev /raws-activator to its RNA target sequence. Cell. 60, 675-683.

63. Angelo C., Smith G.E., Summers M.D., Krug R.M. 1987. Coexpression of three or more recombinant polymerases influences in insect cells. Virology. 67, 361-365.

64. Conner M., Zarley C., Hu B., Parsons S., Drabinski D., Greiner S., Smith R, Jiang B. 1996. Virus-like particles as a rotavirus subunit vaccine. J. Infect Dis. 174, 88-92.

65. Hu Y.C., Bentley W.E., Edwards G.H., Vakharia V.N. 1999. Chimeric infectious bursal disease virus-lije particles expressed in insect cells and purified by immobilized metal affinity chromatography. Biotechnol. Bioeng. 63, 721-729.

66. Hu Y.C., Hsu T.A., Huang J.H., Ho M.S., Ho Y.S. 2003. Formation of enterovirus-like particle aggregates by recombinant baculoviruses co-expressing PI and 3CD in insect cells. Biotechnol. Lett. 25, 919-925.

67. Mortola E., Roy P. 2004. Efficient assembly and release of SARS coronavirus-like particles by a heterologous expression system. FEBS Lett. 576, 174-178.

68. Adler S., Reay P., Roy P. 1998. Induction of T cell response by bluetongue virus corelike particles expressing a T cell epitope of the Ml protein of influenza A virus. Med. Microbiol. Immunol. 187, 91-96.

69. Luo L., Kang C.Y. 1990. Expression of gag precursor protein and secretion of virus-like gag particles of HIV-2 from recombinant baculovirus-infected insect cells. Virology. 179, 874-880.

70. Xi S.Z., Bants L.M. 1992. Site-directed mutagenesis of virtually any plasmid by eliminating a unique site. J. Gen. Virol. 72, 2991-2998.

71. Newcomb W.W., Homa F.L., Thomson D.R. Trus B.L., Cheng N., Steven A. Spencer

72. J.V. and Brown J.C. 1999. Assembly of the herpes simplex virus procapsid from purified154components and identification of small complexes containing the major capsid and scaffolding proteins J. Virol. 73, 4239 4250.

73. Touze A., Bousarghin L., Ster C„ Combita A.-L., Roingeard P., Coursaget P. 2001. Gene transfer using human polyomavirus BK virus-like particles expressed in insect cells. J. of Gen. Virology. 82, 3005-3009.

74. Notka F., Stahl-Hennig C., Dittmer U., Wolf H., Wagner F. 1999. Contraction and characterization of recombinant VLPs and Semliki-Forest virus live vectors for comparative evaluation in the SHIV monkey model. Biol Chem. 380, 341-352.

75. Casal J.I. 1999. Use of parvo virus-like particles for vaccination and induction of multiple immune responses. Biotechnol. Appl. Biochem. 29, 141-150.

76. Crawford S.E., Estes M.K., Ciailet M., Barone C., O'Neal C.M., Cohen J., Conner M.E. 1999. Heterotypic protection and induction of a broad heterotypic neutralization response by rotavirus-like particles. J. Virol. 73. 4813-4822.

77. Xiang J., Wunschmann S., George S.L., Klinzman D., Schmidt W.N., LaBrecque D.R., Stapleton J.T. 2002. Recombinant hepatitis С virus-like particles, expressed by baculovirus: utility in cell-binding and antibody detection assays. J Med Virol. 68, 53743.

78. Zhao W., Liao G.Y., Jiang Y.T., Jiang S.D. 2003. No requirement of HCV 5'NCR for HCV like particles ssembly in insect cells. J. Gastroenterol. 10, 2226-2231.

79. Bartosch В., Dubuisson J. & Cosset F.L. 2003. infectious hepatitis С virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. J. Exp Med. 197, 633642.

80. Kang C.Y., Luo L., Wainberg M.A., Li Y. 1999. Development of HIV/AIDS vaccine using chimeric gag-env virus-like particles. Biol. Chem. 380, 341-352.

81. Gronowski A.M. D. M. Hilbert, K. C. F. Sheehan, G. Garotta. 1999. Baculovirus stimulates antiviral effects in mammalian cells. J. Virol. 73, 9944-9951.

82. Schiller JT, Lowy DR. 2010. Vaccines to Prevent Infections by Oncoviruses. Annu Rev Microbiol. 64, 23-41.

83. Hofmann C., Sandig V., Jennings G„ Rudolph M., Schlag P., Strauss M. 1995. Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vcctors. Proc Natl Acad Sci USA. 92, 10099-10103.

84. Boyce F.M. Bucher N.L.R. 1996. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. . Proc Natl Acad Sci USA. 93, 2348-2352.

85. Huser A., Hofmann C. 2003. Baculovirus vector: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their application. American Journal of PharmacoGenomics. 3, 53-63.

86. Matsuura Y. Shoji I., Yap C.-C., Tani H., Ishii K. and Miyamura T. 1997. Gene transfer into mammalian cells by baculovirus vector and its applications. Virus. 47, 247-256.

87. Condreay J.P., Witherspoon S.M., Clay W.C., Kost T.A. 1999. Transient and stable gene expression in mammalian cells, transducted with a recombinant baculovirus vector. . Proc Natl Acad Sci USA. 96, 127-132

88. Shoji I., Aizaki H., Tani H., Ishii K., Chiba T., Saito I., Miyamura T., Matsuura Y. 1997. Efficient gene transfer into various mammalian cells, including non-hepatic cells, by baculovirus vectors. ,/. of Gen. Virology. 78, 2657-2664.

89. Kost T., Condreay J.P. 1999. Recombinant baculoviruses as expression vectors for insect and mammalian cells. Current Opinion in Biotechnology. 10, 428-433.

90. Hu Y.-C. 2005. Baculovirus as a high efficient expression vector in insect and mammalian cells. Acta Pharmacologica Sinica. 26, 405-416.

91. Beljelarskaya S.N. 2002. A baculovirus expression system for insect cells. Mol. Biol. 36, 281-92.

92. Fipaldini C., Bellei B., La Monica N., 1999. Expression of hepatitis C virus cDNA in human hepatoma cell line mediated by a hybrid baculovirus-HCV vector. Virology. 255, 302-11.

93. Sandig V. Hofmann C., Steinert S., Jennings G., Schlag P., Strauss M. 1996. Gene transfer into hepatocytes and human liver tissue by baculovirus vectors. Hum Gene Ther. 7, 1937-45.

94. Tani H., Limn C.K., Yap C.C., Onishi M., Nozaki M., Nishimune Y., Okahashi N., Kitagawa Y., Watanabe R., Mochizuki R., Moriishi K., Matsuura Y. 2003. In vitro and in vivo gene delivery by recombinant baculoviruses. J. Virol. 77, 9799-808.

95. Song U.S., Shin S.-H., Kim S.-Ki., Choi G.-S., Kim W.-C., Lee M.-H., Kim S.-J., Kim I.-H., Choi M.-S., Hong Y.-J. Lee K.-H. 2003. Effective transduction of osteogenic sarcoma cells by a baculovirus vector. J. Gen. Virol. 84, 697-703.

96. Palombo F. Monciotti A. Recchia A. Cortese R.„ Ciliberto G., and La Monica N. 1998. Site-specific integration in mammalian cells mediated by a new hybrid baculoviras-adeno-associated virus vector. J. Virol. 72, 5025-5034.

97. Chuang CK, Sung LY, Hwang SM, Lo WH, Chen HC, Hu YC. 2007. Baculovirus as a new gene delivery vector for stem cell engineering and bone tissue engineering. Gene Ther. 14, 1417-24.

98. Chen H.-C., Chang Y.-H., Chuang C.-K., Lin C.-Y., Sung L.- Y., Wang Y.- H„ Hu Y.-C 2009. The repair of osteochondral defects using baculovirus mediated gene transfer with de-differentiated chondrocytes in bioreactor culture. Biomaterials. 30, 674-681.

99. Королева H.H., Спирин П.В., Тимохова A.B., Рубцов П.М., Кочетков С.Н., Прасолов B.C., Белжеларская С.Н. 2010. Бакуловирусные векторы для эффективной доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих. Мол. Биол. 44, 541-550.

100. Yap С.-С., Ish.ii К., Aoki Y., Aizaki Н., Tani Н., Shimizu Н., Ueno Y., Miyamura Т., Matsuura Y. 1997. A hybrid baculovirus -T7 RNA polymerase system for recovery of an infectious virus from cDNA. Virol. 231, 192-200.

101. Barsoum J., Brown R., McKee M., Boyce F.M. 1997. Efficient transduction of mammalian cells by a recombinant baculovirus having the vesicular stomatitis G glycoprotein. Hum. Gene Ther. 8, 2011-18.

102. Tami C., Farber M., Palma E.L. and Taboga O. 2000. Presentation of antigenic sites from foot and- mouth disease virus on the surface of baculovirus and in the membrane of infected cells. Arch. Virol. 145, 1815-28.

103. Ojala K., Mottershead D.G., Suokko A. and Oker -Blom C. 2001. Specific binding of baculoviruses displaying gp64 fusion proteins to mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. 284, 777-784.

104. Sarkis J. 2000. A comparative analysis of DEA as a discrete alternative multiple criteria decision tool. Eur. J. Oper. Res. 123, 543-557.

105. Duisit G, Saleun S., Douthe S., Barsoum J., Chadeuf G., Moullier P. 1999. Baculovirus vector requires electroplastic interactions including heparin sulfate foe efficient gene transfer in mammalian cells. J Gene Med. 1, 93-102.

106. Tani H., Nishijima M, Ushijima H., Miamura T. and Matsuura Y. 2001. Characterization of cell-surface determinants important for baculovirus infection. Virol. 279, 343-53.

107. Cheshenko N., Krougliak N. , Eisensmith R.C. and Krougliak Y.A. 2001. A novel system for the production of fully deleated adenovirus vectors that does not require helper adenovirus. Gene Ther. 8, 846-854.

108. Merrinew R. V. . Clay W.C., Condreay J.P., Witherspoon S.M., W.S. Dallas and Kost T.A. 2001. Chromosomal Integration of Transducted Recombinant Baculovirus DNA in mammalian cells. J. Virol. 75, 903-909.

109. Sandig V., Hofmann C., Steinert S., ennings G., Schlag P., Strauss M. 1996. Gene transfer into hepatcytes and human liver tissue by baculovirus vectors. Hum. Gene Ther. 7, 1937-45.

110. Hofmann C., Strauss M. 1998. Baculovirus-mediated gene transfer in the presence of human serum or bood facilitated by inhibition of the complement system. Gene Ther. 5, 531-36.

111. Hofmann C., Huser A, Lehnert W, Strauss M. 1999. Protection of baculovirus-vectors against complement-mediated inactivation by recombinant soluble complement ieceptor type 1. Biol. Chem. 380, 393-95.

112. Kaikkonen M.U, Maatta A.I., Yla-Herttuala S. and Airemie K. 2010. Screening of Complement Inhibitors: Shielded Baculoviruses increase the safety and efficacy of gene deliverycomplement shielded baculoviruses. Mol Ther. 18, 987-9.

113. Kircheis R., Wightman L., Schreiber A., Robitza B., Rossler V., Kursa M. and Wagner E.,. 2001. Polyethylenimine\DNA complexes shielded by transferring target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8, 28-40.

114. Huser A. Rudolph M. and Hofmann Ch. 2001. Incorporation of decayaccelerating factor into the baculovirus envelope generates complement-resistant gene transfer vectors. Nat. Biotechnol 19, 451-455.

115. Brodbeck W.G., Liu D., Sperry J., Mold C. Medof M.E. 1996. Localization of classical and alternative pathway regulatory activity within decay-accelerating factor. J. Immunol. 156, 2528-33.

116. Ory D.S., Neugeboren B. A. and Mulligan R. C. 1996. A stable human-derived packaging cell line for production og high titer retroviius\vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 11400-06.

117. Airenne K.J., Hiltunen M. O., Turunen M.P., Turunen A-M., Laitinen O.H., Kulomaa M.S., Yla- Herttuala S 2000. Baculovirus-mediated periadventitial gene transfer to rabbit carotid artery. Gene Ther. 7, 1499-1504.

118. Liu Catherine Y.Y., Wang Ch.H., Wang J.Ch. and Chao Yu.Ch. 2007. Stimulation of baculovirus transcriptome expression in mammalian cells by baculoviral transcriptional activators. Journal of General Virology. 88, 2176-2184.

119. Jarvis D.L., Weinkauf C., Guarino L.A. 1996. Immediate-early baculovirus vectors for foreign gene expression in transformed or infected insect cells. Protein Expr. Purif. 8. 191-203.

120. Maniatis T., Fritsch E.F., Sainbrook J. Molecular cloning. A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1982.

121. Smith G.E., Summers M.D., Fraser M.J. 1983. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3, 2156-2165.

122. Mutsura Y., Possee R., Bishop D. 1987. Baculovirus expression vectors: the requirements for high level expression of proteins, including glycoproteins. J. Gen. Virol. 68, 1233-1250.

123. Summers M. D., Smith G.E. 1987. A manual for baculovirus vectors and insect ccll culture procedures. Bulletin no. 1555. Texas Agricultural Experiment Station and Texas A & M University, College Station, Texas. 10-39.

124. Mutsura Y., Possee R, Bishop D. 1987. Baculovirus expression vectors: the requirements for high level expression of proteins, including glycoproteins. J. Gen. Virol. 68, 1233-1250.

125. Molecular Biological Methods for Bacillus. 1990. Edited by Colin R. Harwood and Simon M. Cutting. 0 471 92393 1. John Wiley & Sons Ltd., Chichester. England

126. Ito H., Fukada Y., Murata K., Kimura A. 1983. J. Bacteriol. 153, 163-168.

127. Maurel C., Rezer J., Schoeder J.I., Chrispeels M.J. 1993. The vacuolar membrane protein y-type creates water specific channels in Xenopus oocytes. EMBO J. 12, 22412247.

128. Corey D.P. 1983. Patch Clamp: Current Excitement in Membrane Physiology. Neuroscience Commentaries. 1, 99-110.

129. Casper St. J., Holt A. 1996. Expression of the green fluorescent protein-encoding gene from tobacco mosaic virus-based vector. Gene. 173, 69-73.

130. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System, Instruction Manual. St. Louis, MO: Life Technologies Inc., Monsanto Corp. Res., 2003.

131. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System. Version D. ed: Invitrogen Life Technologies, 2004.

132. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature. 227. 680-685.

133. Sambrook J., Fritsch E. and Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor. NY: Cold Spring Harbor Laboratory).

134. Hanahan D. 1985. DNA Cloning . Clover D.M., Ed. Oxford; Washington: IRL Press, 1. 109-135.

135. Gruenwald S., Heitz J. Baculovirus Expression Vector System: Procedures & Methods Manual. PharMingen. 5-62.

136. Methods in Enzymology. 1990.Guide to Protein Purification. Ed. Deuscher M.P. San Diego. Califrnia: Acad. Press. 182.

137. Sanger F., Coulson A.R., 1975. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J. Mol. Biol., 94, 441.

138. Kafatos F.C., Jones C.W., Efstratiadis A. 1979. Nucleic Acids Res. 7. 1541-1552.

139. Short protocols in molecular biology. 1992. Edited by Ausubel F.M. et al. 3rd ed. Published by John Willey& Sons, Inc. USA.

140. Cruz P.E., Maranga L., Carrondo M.J. 2002. Integrated process optimization: lessons from retrovirus and virus-like particle production. J. Biotechnol. 99, 199-214.

141. Baumert T.F., Ito S., Wong D.T., Liang T.J. 1998. Hepatitis C virus structural proteins assemble into virus-like particles in insect cells. J. Virol,. 72, 3827-3836.

142. King L.A., Possee R.D. 1992. The Baculovirus Expression System: a Laboratory Guide. London: Chapman, Hall. 229.

143. Друца И.Л., Кабердин В.Р., Королева О.Н., Шилов И.О. 1991. Эффективный метод направленного введения мутации в плазмиды и клонирование однотяжевых фрагментов ДНК. Биоорг. химия. 17, 1487-1493.

144. Dolja V.V., Sokolova N.A., Tjulkina L.G., Atabekov J.G. 1979. A study of the barley stripe mosaic virus (BSMV) genome. II. Translation of individual RNA species of two BSMV strains in a homologous cell-free system. Mol Gen. Genet., 175, 93-97.

145. Jackson A.O., Brakke M.K. 1973. Multicomponent properties of barley stripe mosaic virus ribonucleic acid. Virology, 55. 483-494.

146. Lane L.C. 1974. The components of barley stripe mosaic and related viruses. Virology 58, 323-333.

147. Афанасьев Б.Н., Рупасов E.B., Федченко В.И. Доля В.В., Атабеков И.Г., "Чернов Б.К., Козлов Ю.В., Баев А.А. 1986. Первичная структура РНК 3 вируса штриховатой мозаики ячменя и образование РНК 26 и РНК 4. Докл. АН СССР. 290, 724-727.

148. Gustafson G.D., Milner J.J., McFarland J.E., Pedersen K., Larkins B.A., Jackson A.O. 1982. Investigation of the complexity of barley stripe mosaic virus RNAs with recombinant DNA clones. Virology, 120, 183-193.

149. Taliansky M.E., Boykov S.V., Kavsan V.M., Atabekov J.G. 1979. A study of the barley stripe mosaic virus (BSMV) genome. I. Determination of sequence homology between BSMV RNA species. Mol. Gen. Genet. 775, 89-92.

150. Gustafson G.D., Larkins B.A., Jackson A.O. 1981. Comparative analysis of polypeptides synthesized in vivo and in vitro by two strains of barley stripe mosaic virus Virology. Ill, 579-587.

151. McFarland J.E., Brakke M.K., Jackson A.O. 1983. Complexity of the Argentina mild strain of barley stripe mosaic virus. Virology. 130, 397-402.

152. Hsu Y.N., Brakke M.K. 1985. Cell-free translation of soil-borne wheat mosaic virus RNAs. Virology. 143, 272-279.

153. Bisaro D.M., Siegel A. 1982. Subgenomic components of tobacco rattle virus in infected tissue. Virology. 118,411-418.

154. Ahlquist P., Dasgupta R., Kaesberg P. 1981. Near identity of 3' RNA secondary structure in bromoviruses and cucumber mosaic virus. Cell. 23, 183-189.

155. Ohno Т., Takamatsu N., Meshi Т., Okada Y., Nishigushi M., Kiho Y. 1983. Single amino acid substitution in 30K protein of TMV defective in vims transport function. Virology, 131, 255-258.

156. Davies J.W., Hull R. 1982. Genome Expression of plant positive-strand RNA viruses. -J. Gen. Virol. 61, 1-14.

157. Kramer F.R., Lizardi P.M., 1989. Nature. 339, 401-402

158. Albano M., Breitting R., Dubnau D., 1989, J. Bacteriol. 171, 5386-5404.

159. Морозов С.Ю., Захарьев B.M., Чернов Б.К. и др. 1983. ДАН. 271, 211-215.

160. Морозов С.Ю., Лукашева Л.И. Чернов Б.К. и др. 1987. Молек. генет., № 3, 32-38.

161. Kramer F.R., Mills D.R. 1981. Secondary structure formation during RNA synthesis. Nucleic Acids Res. 9, 5109-5124.

162. David Dubnau. 1985. Induction of ermC requires translation of the leader peptide. The EMBO Journal. 4, 533-537.

163. Narayan C.S., Dubnau D. 1985. Evidence of the translational attenuation model: ribosome-binding studies and structural analysis with an in vitro run-off transcript of ermC. Nucleic Acids Res. 13, 7307-7326.

164. Villafane R., Bechhofer D.H., Narayan C.S., Dubnau D. 1987. Replication control genes of plasmid pE194. J. of Bacteriology. 169, 4822-4829.

165. Chu B.C.F., Kramer F.R., Orgel L.E. 1986. Synthesis of an amplifiable reporter RNA for bioassays. Nucleic Acids Res. 14, 5591-5603.

166. Meyhack В. Bajwa W., Rudolph H. et al. 1983.- EMBO J. 1, 675-680.

167. Hagenauer-Tsapis R., Hinnen A. 1984. Mol. Cell. Biol. 4, 2668-2675.

168. Hinnen A. 1983. In: Gene Expression in Yeast Proc. Of Alko Symposium, Helsinki, 1983\Eds. M. Korhala, E. Varsanen. - Foundation for Biotech. Industr. Ferment. Research., 157-163.

169. Эльдаров M.A., Морзунов С.П. И.В. Карпычев, К.Г. Скрябин, О.В.Василенко и др., 1987. Синтез поверхностных антигенов вирусов в дрожжах. Биотехнология. 3, 319-324.

170. К.Г. Скрябин, А.Б. Циоменко, С.П. Морзунов, И.В.Карпычев, В.В.Лупашин, М.А. Эльдаров, П.М.Рубцов, И.С.Кулаев, А.А.Баев.1987. Синтез и секреция гормона роста человека у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биотехнология, 3, 312-318.

171. Романов Г.А. 1989. Гормонсвязывающие белки растений и проблема рецепции фитогормонов, обзор. Физиология растений. 36.

172. MacRobbie Е.А.С. 1997. Signaling in guard cells and regulation of ion channel activity. J. Exp. Bot. 48, 515-528.

173. Dohlman H.G., Caron M.G., Lefkowitz R.J. 1987. A family of receptors coupled to guanine nucleotide regulatory proteins. Biochemistry. 26, 2657-2664.

174. Majerus P.W., Connoly T.M., Descmyn H., Ross T.S., et al. 1986. The metabolism of phosphoinositidile-derived messenger molecules. Science. 234, 1519-1526.

175. Lurin C., Geelen D., Barbier-Brygoo H., Guern J., Maurel C. 1996. Cloning and functional expression of a plant voltage-dependent chloride channel. Plant Cell. 8, 701711.

176. Leush M.S., Lee S.C., Olins P.O. 1994. A novel host vector system for direct selection of recombinant baculoviruses (bacmids) in E. coli. Gene. V.160. P. 191-194.

177. Mutsura Y., Possce R., Bishop D. 1987. Baculovirus expression vectors: the requirements for high level expression of proteins, including glycoproteins. J. Gen. Virol. 68, 1233-1250.

178. Shi Y.P., Hasnain S.E., Sacci J.B., et al. 1999. Immunogenicity and in vitro protective efficacy of a recombinant multistage Plasmodium falciparum candidate vaccine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1615-1620.

179. Takahashi R.IL, et al. 1999. Analysis of human lymphotropic T-cell virus type II-like particle production by recombinant baculovirus-infected insect cells. Virology. 256, 371378.

180. Lajic S, Nikoshkov A, Hoist M, Wedell A.1999. Effects of missence mutations and deletions on membrane anchoring and enzyme function of human steroid 21-hydroxylase. Biochem Biophys Res Commun. 257, 384-390.

181. Nelson DR, Strobel HW. 1988.On the membrane topology of vertebrate cytochrome P450 proteins. J Biol Chem. 263, 6038-6050.

182. Sakaguchi M, Tomiyoshi R, Kuroiwa T, Mihara K. Omura T.1992.Functions of signal anchor sequences are determined by the balance between the hydrophobic segment and the N-terminal charge. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 16-19.

183. Asseffa A, Smith SJ, Nagata K, Gillette J, Gelboin HV, Gonzalez FJ. 1989. Novel exogenous heme-dependent expression of mammalian cytochrome P450 using baculovirus. Arch Biochem Biophys. 274, 481-490.

184. Lee C, Kadwell S, Kost T, Serabjut-Singh CJ. 1995. Recombinant baculovirus strategy for coexpression of functional human cytochrome P450 and' P450 reductase. Meth Enzymol. 272. 86-95.

185. Paine MJI, Gilham D, Roberts GCK, Wolf R. 1996. Functional high level expression of cytochrome P450 CYP2D6 using baculoviral expression systems. Arch Biochem Biophys. 328, 143-150.

186. Chen L, Buters JTM, Hardwick JP, Tamura Sh, Penman BW, Gonzalez FJ, Crespi ChL.1997. Coexpression of cytochrome P4502A6 and NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase in the baculovirus system. Drug Methab Dispos. 25, 399-405.

187. Tusie-Luna M-T, Traktman P, White PC. 1990. Determination of functional effects of mutations in the steroid 21-hydroxylase gene (CYP21) using recombinant vaccinia virus. J Biol Chem. 265, 20916-20922.

188. Mokhonov V.V., Novikov D.Y., Samokhvalov E.I., Shatalov A.G., Selivanov N.A., Prilipov A.G. L'vov D.K. 2002. Genome analysis of Hepatitis С virus strain 274933RU isolated in Russian Federation. Vopr. Virusol. 47, 9-12.

189. Baumert T.F., Ito S., Wong D.T., Liang T.J. 1998. Hepatitis С virus structural proteins assemble into virus-like particles in insect cells. J. Virol. 72, 3827-3836.

190. Reed ICE., Rice C.M. 2000. Overview of hepatitis С virus genome structure, polyprotein.processing, and protein properties. Curr. Top. Microbiol Immunol. 242, 55— 84.

191. Иванов A.B., Кузякин A.O, Кочетков C.H. 2005. Молекулярная биология вируса гепатита С. Успехи биохимии. 45, 37-86.

192. Hoofnagle J.H. 2002. Course and outcome of hepatitis C. Hepatology. 35, 21—29.

193. Dubuisson J. and Rice C.M. 1996. Hepatitis С virus glycoprotein folding: disulfide bond formation and association with calnexin. J. Virology. 70, 778-786.

194. Choo Q.L., Kuo G., Weiner A. J., Overby L.R., Bradley D.W., Houghton M. 1989. Isolation of a cDNA clone derived from blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244, 359-362.

195. Yagi Shintaro, Mori Kenichi, Shiotf Kunio. 2006. Implications of the HCV subeenome discovery for viral pathogenesis, persistence and proliferation. Future Virology. 1, 425-433(9).

196. Eike Steinmann, Christiane Brohm, Stephanie Kallis, Ralf Bartenschlager and Thomas Pietschmann. 2008. Efficient r/ww-Encapsidation of Hepatitis C Virus RNAs into Infectious Virus-Like Particles. Journal of Virology. 82, 7034-7046.

197. Daniel M. Jones and John McLauchlan 2010 Hepatitis C Virus: Assembly and Release of Virus Particles./. Biol. Chem. 285, 22733-22739.

198. Matsumoto M., Hwang S.B., Jeng K.S., ZhuN., Lai M.M. 1996. Homotypic interaction and multimerization of hepatitis C virus core piotein. Virology. 218, 43-51.

199. Choi S.H., Kim S.Y., Park K.J., Kim Y.J., Hwang S.B. 2004. Hepatitis C virus Core protein is efficiently released into the culture medium in insect cells. J Biochem. Mol. Biol. 37, 735-740.

200. Liu Q., Tackney C., Bhat R.A., Prince A.M., Zhang P. 1997. Regulated processing of the hepatitis C virus core protein is linked to subcellular localization. J. Virol. 71, 657662.

201. Matsumoto M., Hwang S.B., Jeng K.S., Zhu N., Lai M.M. 1996. Homotypic interaction and multimerization of hepatitis C viius core protein. Virology. 218, 43-51.

202. Goffard A., Callens N., Bartosch B., Wychowski C., Cosset F.L., Montpellier C., Dubuisson J. 2005. Role of N-linked giycans in the functions of hepatitis C virus envelope glycoproteins. J. Virol. 19, 8400-8409.

203. A. Fournillier, C. Wychowski, D. Boucreux, T. F. Baumert, J.-C. Meunier, D. Jacobs,

204. S. Muguet, E. Depla, and G. Inchauspe. 2001. Induction of Hepatitis C Virus El165

205. Envelope Protein-Specific Immune Response Can Be Enhanced by Mutation of N~ Glycosylation Sites . Journal of Virology, 75(24). 12088-12097.

206. Tiffany Slater-Handshy, Deborah A. Droll, Xiaofeng Fan, Adrian M. Di Bisceglie, and Thomas J. Chambers. 2004. HCV E2 glycoprotein: mutagenesis of N-lnked glycosylation sites and its effects on E2 expression and processing. Virology, 319, 36-48.

207. Hanna, S. L., Pierson, T. C., Sanchez, M. D., Ahmed. A. A., Murtadha, M. M. Doms, R. W. 2005. N-Linked Glycosylation of West Nile Virus Envelope Proteins Influences Particle Assembly and Infectivity. J. Virol., 79, 13262-13274.

208. Brown, R. J. P., Juttla, V. S., Tarr, A. W., Finnis, R., Irving, W. L., Hemsley, S., Flower, D. R., Borrow, P., Ball, J. K. 2005. Evolutionary dynamics of hepatitis C virus envelope genes during chronic infection. J. Gen. Virol., 86, 1931-1942.

209. A Karpas, G W Fleet, R A Dwek, S Petursson, S K Namgoong, N G Ramsden, G S Jacob, and T W Rademacher. 1988, Aminosugar derivatives as potential anti-human immunodeficiency virus agents. PNAS. 85 (23), 9229-9233.

210. Durantel, D., Branza-Nichita, N., Carrouee-Durantel, S., Butters, T. D., Dwek, R. A. Zitzmann, N. 2001. Study of the Mechanism of Antiviral Action of Iminosugar Derivatives against Bovine Viral Diarrhea Virus. J. Virol., 75. 8987-8998.

211. Wu. S.-F., Lee, C.-J., Liao, C.-L., Dwek, R. A. Zitzmann, N. Lin. Y.-L. 2002. Antiviral Effects of an Iminosugar Derivative on Flavivirus Infections. ./. Virol.76, 3596-3604.

212. Краев А., Морозов С., Лукашева Л., Розанов М., Чернов В., Симонова М., Г олова Ю., Белжеларская С., Позмогова Г., Скрябин К. и Атабеков Г. (1988) Первичная структура и организация генома Х-вируса картофеля. Доклады АНСССР. 300, 711-716.

Информация о работе

Белжеларская, Светлана Николаевна
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Системы клонирования и экспрессии целевых генов и анализ биологических функций синтезированных рекомбинантных белков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы