Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генно-инженерные подходы к бактериальному синтезу соматостатина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Генно-инженерные подходы к бактериальному синтезу соматостатина"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЭНДОКРИНОЛОГИИ ВЭНЦ

1 I 0 V н На правах рукописи

3 п ОПТ 1035

САЗИНА Елена Титовпа

ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ПОДХОДЫ К БАКТЕРИАЛЬНОМУ СИНТЕЗУ

СОМАТОСТАТИНА

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена с лаборатории молекулярной эндокринологии Института вксперименталыюЛ эндокринологии Эндокрннолопгческого Научного Центра РАМН. Директор - академик РАМН И.И. Дедов Научный руководитель: академик РАМН 10.А. Панков Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, профессор Рубцов П.М.

- доктор биологических наук, профессор Липкий В М.

Ведущее учреждение - ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится '¿$3' 1995 г.

в час. на заседании диссертацношюго совета/Д002.79.01/ при ИМБ им В.А.Энгельгардта РАН по адресу - 117984 Москва, ул.Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ РАН

Автореферат разослан

26^М^т г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А.М.Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из актуальных проблем практической вндокршюлогин является получение биологически активных препаратов белково-пептидных гормонов. Широкие перспективы в этом направлении открывает область геннс инженерной биотехнологии, связанная с микробным синтезом белков человека, перспективных для клинического применения. Одним из таких соединений является соматостатин (ББТ) - тетрадекапептид, имеющий циклическую структуру благодаря днеульфидной связи между 3 и 14 остатками Сув. В организме ББТ-М синтезируется специализированными клетками пшоталамуса, поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта, а также нейронами центральной и периферической нервной системы. 5БТ участвует в регуляции метаболических процессов и оказывает иншбирующее действие на секрецию ряда гормонов (соматсггрошш, тиреотропин, инсулин, глкжагон, кальцитоннн, гастрин), подавляет экзокрннную функцию поджелудочной железы, желчного пузыря, желудка и слюнных желез, а также -угнетает всасывание питательных веществ в тоиком кганеч1шке.

В настоящее время БЭТ-14 применяют в клинической практике для терапнн нейроэндокришгых заболевают, вызванных повышенной секрецией гормонов (СТГ при акромегалии, АКТГ при болезни Аддисона и синдроме Нельсона), в качестве дополнительной терапии ннсулш[зависимого сахарного диабета и ряда патологий желудочно-кишечного тракта (острый панкреатит, желудочно-кишечные кровотечения и эрозии, диарреи и др.), для снятия клинических симптомов, вызванных эндокринными опу.юлгхи, при операциях на поджелудочной железе. В психиатрии этот гормон используют д.'я лечения депрессий, некоторых форм шизофрении, болезни Альцгеймера и эпилепсии, при которых наблюдается снижение уровня циркулирующего ББТ-Н. Полифункциональность БЭТ в организме и возможность применения его в практической медицине объясняют интерес к исследованиям, направленным на получение биологически активного БЭТ и разработке на его основе лекарственных препаратов и диагностических систем.

Традиционно при выделении белюово-пептндных гормонов используют животное сырье - ткани, органы и биологические жидкости. Однако, применительно к соматостатину, такой подход оказывается нерентабельным из-за низкого содержатся пептида в организме. Кроме того, современные методы биохимической очистки не гарантируют абсолютного освобождения от вирусов (СПИД, гепатит и L др.). В связи с этим, практически приемлемы два способа получения SST - химический и. микробиологический, из которых первый - .вердофазныГ/метод синтеза не j 1

нашел должного распространения в России из-за дороговизны закупаемых имлорт-ных исходных материалов. Таким образом, второй путь - с использованием гашо-ниженерных технологий является наиболее реальным и перспективным способом получения очищенного препарата SST в больших количествах.

' Цель и задачи исследовартя. Целью настоящей работы было: 1) создание вариантов конструю(ий зкспрессирующих плазмидных векторов, 2) осуществление бактериального синтеза SST в комплексе с бактериальш im белком-носителем в клетка?. E.cc'i, 3) получение высокоочищешюго препарата биологически активного рекомбинантного SST.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить несколько конкретных задач:

t: Подобрать белки-носители, промоторы, штаммы E.coli;

2. Осуществить конструирование экспресскрующих плазмидных векторов с различным расположением гена sst по отношению к гену белка-носителя;

3. Отработать варианты экспрессии гетерологичных генов с последовательностью sst в условиях конститутивного и индуцируемого синтеза;

4. Разработать способ выделения и очистки целевого продукта из биомассы создашюго штамма-продуцекга E.coli-,

6. Решить проблему реиатурации молекулы рекомбинантного SST;

7. Провести физико-химическую характеристику рекомбинантного SST:

8. Изучить биологическую и иммунологическую активности рекомбинантного SST.

Научная новизна и практическая значимость работы. С использованием генно-инженерных подходов в комплексе с биохимическими методами впервые в нашей стране получен биологически агспдагый препарат рекомбннантного соматостатипа-14.

Сконструировшгы векторные системы, обеспечивающие эффективную экспрессию клонировашюго гена sst в комплексе с бактериальными генами белков-носителей под контроле»! прокариопгческих промоторов в клетках кишечной палочки E.coli. Предложены 3 варианта присоединения гена sst к гену-носителю: 3'- и 5'-концевое, и интеграция в ci руктурную область гена-носителя, расширяющие области применения данного подхода от создания линейных мультимеров гена sst с целью увеличения выхода целевого продукта, до создания иммуногенных форм гибридных белков, несущих последовательность sst в иммунодомзшантных областях белка-носителя. Создан новый штамм-продуцент соматостатина на основе плазмндного вектора pCCSt и рецютгентного штамма E.coli МКД3207 (патент Российской Федерации №2009199.5557), который не уступает по продуктивности зарубежным образцам, и позвол -ет получать 1мг рекомбннантного горм' ta из литра бактериальной культуры. Предложенные генно-инженерные конструкции могут быть использованы для получения других биологически активных пептидов или белковых фрагментов, не содержащих Met.

Предложен эффективный, способ выделения и очистки SST из бактериальной массы, позволяющий получать препарат 95-98% чистоты, идентичного по физико-химическим, биологическим и иммунологическим свойствам химически синтезированным коммерческим препаратам фирм "Serva" и "Sigma". Полученный нами рекомбинантный SST может быть использован как в научно-исследовательской практике, так и для разработки лекарственной формы, а также для создания специфических диагностикумов по определению концентрации SST в крови.

Апробания работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на расширенном межлабораторном заседании Института экспериментальной эндокринологии ЭНЦ РАМН, на научной конференции посвященной 80-летию академика

Юдлеиа H.A. /Москва 1993/ и на IX Международном Эндокринологическом конгрессе /Ница, Франция 1992/.

Публикации. Основные результаты диссертации отражены в четырех печатных работах, список которых приводится в коше автореферата.

!

Обьем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, вывод 3 и списка использованной литературы /155 ссылок/. Работа изложена на 107 страница-машинописного текста и включает 34 рисунка и 5 таблиц.

Вклад соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Всем коллегам автор приносит благодарность за участие в совместной работе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы E.coli МС1857 (lacZ, D trpEA2,l Nam7, Nam53, Q185J Dili)-, CA161 (Hfr4, thii, reit, lac 122, lacZ13, supC70, I C1857. хШ); C600 (Ш1, thrl, leuB6, lacYJ, tonA21, supE44), 8012 и 8017, имеющие дефектный ген протедзы Ion, любезно предоставлены к.б.н. Луниным В.Г. (Инсппуг с/х биотехнологии РАСХН). Штамм MKD3207 (F", lacY, зирЕ, gal6, argil, his, opr24, malAI, Ion', rpl) со снижешюй деградацией аномальных оелков, получен от к.б.н. Каляевой Э.С. (Институт молекул!.¿шой генетики РАН).

Молекулярное клонирование, трансформацию ц анализ плазмилных ДНК проводили Но стандартным методикам, изложенным Маниатис Т. (1984) и Гловер Д. (1988), с некоторыми модификациями. Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов проводили по методу Maxam & Gilbert (1980). Синтез и фосфорилирование олигонукл коти лов выполняли по методу, предложенному Карповым В.А. и соавт. (1989).

Аналц? фрагментов ДНК проводили с помощью электрофор! ä в агарозном (0,81.5% агарозьг, Sigma, США в буфере 0.05М трис-HCl, pH 8.0, 0.05М ацетат натрия.

5мМ ЭДТА) и полиакриламидном (5-8% ПАА) гелях. Фрагменты ДНК идентифицировали окрашиванием гелей бромистым этидием или авторадиографией. Инпукинта экспрессии гибридного белка SST-fV-галактозилаза проводили по модифицировашгай методике Zabeau et. al.(1982). Культуру клеток E.coli MCI857 или CA1G1 с плазмндами, несущими правый промотор фага к, выращивали в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) в течетк 3-4 часов при 30°С до плотности 0,6-0,8 ОЕ. Затем продолжали культивирование при температуре 42°С в течение 2-5 часов. Динамику экспрессии контролировали, измеряя фермеитатнвнуг активность ß-галшсгозидазы, или с помощью ПААГ электрофореза по методу Laemmly (1970). Экспрессию. гибридных белкоп SST-CAT осуществляли в условиях конститутивного бшсшггеза. Культуру клеток E.coli с плазлшдными ДНК, несущими промотор гена cat, выращивали в среде LB с ампициллшюм при 37°С до плотности od550 4.0-5.0.

Продукты экспрессии анализировал« с помощью электрофореза в ДДС-№-ПААГ (лшгешгыи градие!гт акриламида 10-20%, Зч.).

Выделение н очистка гибридных белков на основе СДТ выполняли путем инкубации клеточной суспензии (1г в 10 мл буфера: 50мМ трис-НС1,рН 8.0, 100мМ NaCl, 1мМ EDTA) с лизоцимом (2 мг/мл, 25°С, 15 мин.) и обработки ультразвуком при 0°С. Осадок, содержащий гибридный белок, трижды промывали (1% тритон Х-100, 50мМ трнс-НС1,рН 8.0, 10мМ EDTA, 25мМ NaCI) и хранили при -35°С. Количество пептидного материала определяли с помощью наборов фирмы "Sigma" (Protein assay kit. Cat.,N?P5636) микро-метс ом Lowry в модификации Peterson (1977).

с небольшими модификациями при концентрациях гибридного белка 10мг/мл и бромциана 2мг/мг белка при 20°С, 20ч. По завершении реакции смесь разбавляли 5-10 объемами воды и лиофилизировали.

Выделение рекомбинантного ББТ проводили с помощью: 1) гельфильтрации гидролизата гибридного белка на колонке (2.6x100см) с 8ерЬас1ех 050 в 0.02М трис-НС1(рН 8.0), в присутствие 6М мочевины и 1 чМ 2-меркаптоэтанол"; 2) ионно-обменной хроматографии иммунореактивной фракции 5БТ на колонке с

осуществляли по методу Gross et al. (1967)

катиоинтом "SP-Toyopearl"( 1x10см) в 0.1М Na-фосфатньгм буфере, рН 5.7, в градиенте NaCl 0-0.6М/4 ч.; 3) офВЭЖХ на колош<е "Днасорб 130 Cjg"

(10x150мм, НПП "Элснко", Москва) в 0.1% TFA с градиентом концентрации ацетошггрила 0-25% за 5 mioi и 25-34% за 36 мш со скоростью потока 2 мл/мин. Ренатурацню и очистку рекомбннантного SST выполняли по методу Rivjer (1974) о. модификации Notani et al. (1989). Пул фракций, содержащих SST, освобождали от ацетошприла и разбавляли 0.01 М nh4hco3 рН 6,8 до концентрации белка 100

с

мкг/мл. После инкубации при +8°С в течешш 48 ч. рН раствора доводили до 8.0 и интенсивно перемешивали ( 20°С, 4ч.). Рекомбшиигпшй SST очищали на колонке "Nucleosil Cíe" (4,6x150мм, НПП "Элсико", Москпа) в 0.1% TFA с градиентом

концентрации ацетошггрила 10-28% за 2 мин и 28-34% за 36 шш со скоростью эдюции 1 мл/мин. Сравнение хроматографической подвшшюсти и гомогенности препаратов рекомбииа1тюго к сшггетаческого SST ("Serva" ФРГ) проводили на колонке "Nucleosil-1000 pst" (3x150мм, НПП "Элсико",Москва) в 0.1% TFA с градиентом концентрации ацетошприла 10-26% за 2 мин, 26-30% за 24 шш со скоростью потока 0,6 мл/мин.

Аминокислотный «НГШ РСКРМбинантното SST определяли на аминокислотном анализаторе Biotronic LC-7000 (Германия),

N-кониепую аминокислоту идентифицировали дансильным методом Gray et.al. (1963) с помощью тонкослойной хроматохрафин на полиамидных пластинах 3.5 ж 3.5см в 4-ех системах растворителей по методу Wood (1S67).

'Ралиоцммунологическос тестирование рекомбннантного SST выполняли с помощью коммерческих наборов фирмы "Incstar "(США).

Определение биологической активности рекомбннантного SST проводили на первичных культурах клеток соматотротшомы человека или аденоптофиза взрослых самок крыс, а также па изолировашшх клетках поджелудочной железы новорождешилх крысят. Биологическое тестирование выполняли совместно с Д.б.и. Комоловым И.С., к.б.н. Елизаровой Г.П., к.б.н. Садовннковой Н.В., к.6.и. Абрамовой В.В., к.б.н. Гудошликовым В.И. (ЭНЦ РАМН).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

СИНТЕЗ И КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ СОМАТОСТАТИНА.

Структура синтетических генов SST (wi-l, sst-2) была спланирована с учетом специфики биосшггеза эукарнотических генов, в бактериальных клетках и предполагала, во-первых - соответствие сшггезировашюй нуклсотндиой последовательности аминокислотной последовательности SST и, во-вторых - наличие на 5'- и З'-юнщах участков для встранвшшя генов sit-1 и sst-2 d векторные молеку л.

Сшгтез полтпгеклеогилных дуплексов н сборка гена sst.

Нуклеотиднуго пойледолателыюсть каждого из генов в транслируемой.и комплементарной цепях (по 54 нуклеотнда) собирали из десяти синтезированных олигонуклеотидов, восемь из которых одинаковые для обоих генов, а два (№5 и №10) различаются иа 3 нуклеотнда. На концах полшгуклесгтида были предусмотрены полу сайты рестршсгаз EcoRI и Bam III для встраивания в плазмндный вектор в заданной ориентации.

Синтезированы два варианта гена: ген мМ, фланкированный кодонами Met с 5 - и 3 -ко1щов, и ген sst-2, имеющий на 5''-коте кодон Met, а на З -конце кодон терминацни трансляции (рис.1), что предполагало различную локализацию этих генов в . .уклеотидиой последовательности белка-носителя.

Сборку полинуклеотндных дуплексов выполняли с помощью ДНК-лигазной реакции. Каждую из цепей гена sst-1 собирали отдельно и очищали с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Нуклеотидный материал, соответствующий цепям гена 5si-l экстрагировали из геля, смешивали и подвергали отжигу при 65°С, после чего использовали для введения б плазмндный вектор. Анализ первичной структуры гена isi-1 проводили методом Махащ & Gilbert. Сборку гена sst-2 выполняли смешиванием синтезированных олигонуклеотидов 1-10 с гидролизованной рестриктазами EcoRI и BamHI векторной ДНК в присутствии ДНК-лигазы с последующей трансформацией реакционной смеси в бактериальный штамм. Проверку сохранности клонированного гена sst-2 проводили сравнением

размеров собранного гена с ранее полученным геном sst-l. Для этого плазмидную ДНК яз селективно отобранных трансформантов гндролизовалн рестриктазами EcoRI-Вш..Ш. Образовавшиеся липкие концы рестриктов метили [p32]-a-dATP с помощью фрагме1гга Кленова и анализировали в 12% ПААГ в натнвных и денатурирующих условиях. Радиоавтография гелей выявила два клона, имеющих размер вставки идентичный контрольному гену ssi-1.

SSt-1

Me tAlaGl yCys LysAsnPhePhe TrpLys ThrPhe Th rSerCysMo t 12 3 4 5

ftKTTCATGGCTGGTTGCAAAAACTTCTTCTGGAAAACCTTCACGTCTTGCATGG

GTACCGACCAACGTTTTTGAAGAAGACCTTTTGGAAGTGCAGAACGTACCCTAG 6 7 8 9-10

EcoR1 BamHt

.SSt-2

MetAleGlyCysLyaAsnPhePheTrpLysThrPheThrSorCysStop 1 2 3 4 5

AATTCATGGCTGGTTGCRAAAACTTCTTCTGGAAAACCTTCACGTCTTGCTGAG

GTACCGACCAACGXTTTTGAAGAAGACCTTTTGGAAGTC.CAGAACGACTCCTAG 6 7 .8 9 10

EcoRI BamH1

Pjic. l. Аминокислотная последовательность и первичная структура сшгтетнческих генов соматостатина. Цифрами обозначены номера олигонуклеотидных блоков.

Сшгтез олигонуклеотидов для сборки генов sst осуществлен к.х.н. Шишкшюй A.A., Гусевой Е.Д. и к.х.н. Тихоновым Ю.Н. (ЭНЦ РАМН, зав.лаб. д.х.н. Швачкин Ю.П.). ферментативная сборка полннуклеотндных дуплексов выполнена совместно с к.б.н. Луниным В.Г. (ВНИИСХБ РАСХН, зав.лаб. чл.-корр. РАСХН Тихоненко Т.И. )

Клонирование синтетических генов s?t. Для клонирования генов sii-1 и sst-2 использовали вектор pBR325. Эта плазмида содержит гены устойчивости к ампициллину Ша), тетрациклину (tet) и хлорамфениколу (cat), обеспечквающие удобную селекцию получаемых рскомби-

г

нантных клонов, а также имеет уникальные сайты рестриктаз EcoRI и BamHI, по которым осуществляли клонирование генов sst (рнс.2). Трансформанты E.coll

HBIOt отбирали по фенотипу AprCmsTcs. Скрининг плазмндной ДНК выявил клоны, содержащее плазмиды pSST-1 и pSST-2 с искомым молекулярным весом <4,1 кД) и рестрнкниошюй картиной. Секвенироваиие фрагмента плазмндной ДНК в районе вставки подтвердило правильную ориентацию гена Sit и сохранность его нуклытидной последовательности.

Векторы pSST-1 н pSST-2 использовали для получения рекомбиншпных

рБИ325 .. ^ 5.4 kb

Ыа

on

rcat

cat

tet

.ивриви rp

EcoRI НЫШ BnsHI

1. EcoRI, B*raHI, Hiwfm

2. ДНК л*гв»а

pSST

EcoRI

sst

BdsHI

гея соматосгатнна

bJt ^tL cat sst tet

0Г» -1;

4.1 kb

EcoRI BnsHI

Рис.2. Схема клонирования синтетического гена соматостатина.

плазмид, кодирующих соматостатин в виде гибридных белков с бактериальными белками-носителями (З^галактозидазой » хлорамфениколацетилтрансферазой с нативной (CAT) ю модифицированной (САТ(т)> структурой.

КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА SST.

Ьлжструнрррзше плззмнли pF5L. Вектор pPSL (рис.3) предназначен для получения гибрид) го белка: продукт фрагмента гена его (8 a.k.)-Met- соматостатин (14 a.k.)-Met- р-галактозндаза (1005' а.к.). Данная плазмнда содержит сильный промотор бактериофага к (Рг), направляющий индуцируемый температурой синтез химерно, > полипептида, а тают« две

kuiiiih терминатора трансляции фага fd, геи Ыа, обеспечивающий устойчивость к ампициллину и ori- участок начала репликации плазмиды.

Рис.3. Структура плазмиды pPSL.

Сборку вектора pPSL проводили в два этапа. На первом этапе (рис.4) на основе плазмид pCL471 н pLK53 была сконструирована промежуточная конструкция pLIO, несущая правый промотор бактериофага X (Рг) с фрагментом гена его,

ковалентно связанный с геном lacZ E.coli, кодирующим ферментатнвно активную ß-

галактозидазу. На "тором этапе (рис.5) в плазилде pSST-1 по сайгу EcoRI встроили

синтетический адаптер из смеси двух олигонуклеотидов 5'-GATCTATGC-3'

3-ATACGTTAA-5',

создающих сайт рестрнкт&зы Bgill, необходимый для дальнейшего переклоииро-вания гена SST.

В результате рекомбюшровашш исходных векторов - источников генов sst и lacZ, геи соматостатииа встраивали между кодирующими последовательностями его-[acZ гибрида, что не меняло рамки считывания и позволило получить SST в составе химерного нолинептнда. Созданная таким образом плазмиды pPSL содержит гнбрид-

pCU71

Аирг q,

or-ii

É3

Irnos

Uoy

r-I.,

P s

R Л

pLKSS

Aap* P

ori ö ■ I

tt

5.3K

9

RBHI

3.0Kb

V

1. pCL471 - Pstl, EcoRI

2. pLK53 - Pstl, EcoRI

3. ДНК - лигаза

pLll

ort i

Ampi" P,

TP r*r

laca

tt

PS

-4-

<fd)

44-

R В H X

5.6Kb

1. pLll - EcoRI, BamHI, Hindlll

2. линкер 5'aattccccggga3'

5'agcttcccgggg^'

3. ДНК - лигаза

pLlt(Saal)

Аирг E.

laca

orl»-+-

PS

3-

tt

В

Rf-вН X pCU71

56Kb

Аир** E. -, Д->сго

ort +-

m

laoz

~l ,r

lacy

IL

P S

R А

t. pLll(Smal) - EcoRI-Smal

2. pCL471 - EcoRI, Haelll

3. ДНК - лигаза

pU8

Ашрг p ^_l Д^сго ibci

ori o-

tt

а

PS

R H X

5.7Kb

5 3K b

Рис.4. Схема конструирования плазмиды pLlü. Ухазано положение сайтов рестриктгз (В-ВашШ, H-HindIH, R-EcoRI, X-Xbal, S-Scal, Sm-Smal, А-НаеШ). 't(fd) - терминаторы транскрипции из фага fd.

|Ш-1

ог1

Ар»

I 3

РоаЪ к^

й В

4.1КЬ

1. рБЗТЧ - ЕсоШ

2. лш1кер З'САТСТАТССЗ'

З'ааттссатаЗ'

3. ДНК - лигаза

р«М (ВцШ)

АрГ'

-в—

ог1

РВ

РояЪ

Ввв

р1Л1

АгарГ р ОГ1«-Ч I .1 -'-Е

1аов

-ЕС

т_

<1КЬ

РВ

них

3.7КЬ

1. рББТ-КВйШ) - Ре«. ВатН!

2. рЫО - РЙ1, ВашШ

3. ДНК - лигаза

ОГ1<

Апргроаъ ввг

р о

I , ьзд

1аоо

tt

Сд В

Я Н X

з.вкь

рШ

ОГ1в—(-4-Рв

Аир-Г Р

«-- Х>сго

С-СЦ

1аог

-в-в-

Л Н X

5 7КЬ

1. рБЬ - Р$и, ВбШ

2. рЫО • ВашШ

3. ДНК - лигаза

рКИ.

ог!

.ГП ГгН-

1юк

р а

> 1 I м

п н х

5.8КЬ

Рис.5. Конструирование плазмиды р'РБЬ. Указано положение сайтов рестриктаз (В8-Вй1Н, В-ВашШ, К-ЕсоШ, Ь-РвН, Б-Бса!,' Н-ЖпсИН, X -ХЬа!) '

в

ный ген с 5'-концевой ориентацией гена иг-1 по отношению к нуклеотидной последовательности 1ас2, п также имеет все структурные элементы, необходимые для ею экспрессии. Клетки МСТ875, трансформированные этой плазмндой, изучали в условиях температурной индукции на оптимальный уровень синтеза гибридного белкя р-галактозидаза-ЗБТ и использовали для наработки гибридного белка.

Плазмида pCSC (рис.6) была сконструирована для экспрессии гена ssí-1, шгтегрироваиного в центральную часть структурной области гена cat по сайту рестриктазы EcoRI, с пол> чением гибридного белка: N-концевой фрагмент CAT (66 а.к.) -Met- соматосташн (14 а.к.) -Met- С-концевой фрагмент С Vi (153 а.к.). Для регуляции экспрессии гибридного гена 5'-cat-sst-cat-3' в состав вектора входит конститутивный промотор гена cal (Рcat) и тандем терминаторов трансляции фага fd. Эта плазмида содержит также маркерный ген btт, сообщающий клетко устойчивость к ампициллину и on - участок инициации репликации плазмиднои ДИК.

Конструирование плазмиды pCSC,

Willi

Рис.6. Структура плазмиды pCSC.

pLK 53

ori

■ —t-

tt,

pbr325

арг

Oit

RBHX 3,0 кь

1 , r*ff

P S R

сег

1. pLK 53- BamHl

2. pBR 325 - Sau3A

3. ДНК - литаза

s нв

5.4Kb

pCAT

AP

orí ■—*

PL Pcat

ÜE^

tt

(fd)

11» •

KX

3.6 Kb

1. pCAT-EcoRl

2. линкер

5'AATTGCATA3'

3. ДНК-лигаза

PSST-I pCATtoaiiX)

Ар«" Po«t Арг P,

*--1 Г»г...... *-1 Г^п-г__ <fd)

orí •-1—1-1-1--orí в-1—I-1 ^Lbiáiiii и » »,

P R В P DglII HZ

4.1Kb 3,3 Kb

1. pCAT(BglII) - Pstl.BglII

2. pSST-1 - Pstl, ВашШ

3. ДНК - литаза

pese

Ар*

ог1 1

tt ,

Pottt

r»C«t (f<l)

J_mtwirai i,, «

HZ

3,3 Kb

Рис.7 Схема конструирования нлазмиды рСБС. Указано положение сайтов рестрнктаз (R-EcoRl, В-ВафН1, Н-НМЩ. Х-ХЬаШ, Р-РзМ, Б-БаиЗАО. Ген соматостатина выделен черным цветом.

Сборку вектора pCSC осуществляли а основе плазмид pSST-1, pLK53 н pBR325 (рис. 7). Ген 5Jt-l внедряли в середину гена cat по EcoRI сайту. В отличие от результатов Betz [Betz 19811 в нашем случае это привело к утрате ферментативной активности CAT и, тем самым, ограничило возможность фенотипической селекчии рекомбт!антных клонов. Рестрикционный анализ Репрессирующего вектора pCSC рестриктазами EcoRI-BamHl и Pstl-PvuII, в сравнении с одной из исходных плазмид рСАТ, подтвердил правильность сборки конечной конструкции и сохратюсть его структуры.

Конструирование плазмнлы pCCSt.

Рис.8. Структура плазмиды pCCSt.

Вектор pCCSt (рис.8), имеющий в своем составе ген sst-2 ьстроеный взамен 26 и.о. из З'-конневой части модифицированного гена cat, предназначен для экспрессии гибридного белка: CAT (2tb а.к.) - Trp-GIu-Phe-Met- соматостатин (14 а.к.). Синтез рекомбинантного полипеНтида CAT-SST направляется конститутивным

рИК

orl

К 81 РВА HZaSmR -+-H-1—I—I—t—

p в

2.6Kb

Ap*

ort —

PS

Р»с»г »»г

r в

4.1Kb .

1. pRK- Seal, EcoRl

2. pSST-2 - Seal, EcoRl

3. ДНК - лигаза

pBR 325 АрГ pcat

«С-1 г-» cat tot

oriJTJ-L-J^l ГГЛ

P R S HB 54Kb

PLK 53 ¿L Л

* I Г* (f a)

в—i—I-1—If i l ♦ ♦

p RBHX з.окь

1 1. pBR32$-Pstl, Hindlll * 2. pLK53 - Pstl, Hind HI 3. ДНК: лигаза

ori

V

рем

ОГ1

Apr Pc»t

Г7ПГ*

оаЬ

имрцрл |

tt

<fd>

Р 8

R В НХ

4.1Kb

1. pCM-EcoRl

2. линкер

3-CCACGTTAA5'

3. ДНК-лигаза

рЯЛ

ОГ1

X 81 РВАН XaSmR

pCCSt Крт *-

orl »

-Ь-Н р й

penni

Apr Poet

СП

tt

СМ»

4.5Kb

P 3

в KX

1. pCMRI- - Seal

2. pRS - Seal, Smal

3. ДНК - лигаза

Po«t

£Ln

c»t «»t t*

(fd)

HX

4.9Kb

4.2Kb

Рис.9. Схема конструирования шшзмиды рССБ^ Указаны положение сайтов рестриктаз (R-EcoRI, В-ВашН1, Н-НЫШ, Х-ХЬаШ, Рч'бН, 5-5са1, БЬБаИ, 5ш-Бта!, А-АзиН, Хш-Хта). Ген соматосгатина выделен черным советом.

а)

б)

71 72 73 74 75 Pro Glu Phe Arg Met ...CCG GAA TTC CGT ATG . ...GGC CTT AAG GCA TAC

EcoRI

71 72 73 74 75 76 77 78 Pro Glu Leu Val Gin Phe Arg Met .CCG GAA TTG GTG CAA TTC CGT ATG .GGC CTT AAC CAC GTT AAG GCA TAC

II a)

212 213 214 215 222 Gin Gin Tyr Cys Ala stop

...CAA CAG TAC TGC.....GCG TAA

...GTT°GTC ATG ACG.....CGC ATT

I---------1

Seal

6)

CAT...---->|<—адаптер--->| (---->...SST

212 213 1 2 3 14

GLn Gin Met Ala Gly Cys........Cys stop f

...CAA CAG TGG GAA TTC ATG GCT GGT TGC.......TGC TGA GGA TCC...

...GTT GTC ACC CTT AAG TAC CGA CCA ACG.......ACG ACT CCT AGG...

(-------1 [----------)

EcoRI Bamlll

Рнс.Ю. 1 - фрагменты пуклеотндных последовательностей гена cat в области EcoRI сайта: а) природная структура гена cat; б) после введения синтетических линкеров по сайту рестриктазы EcoRI. Три дополнительных к природной структуре кодона выделены жирным шрифтом. II - фрагменты пуклеотндных последовательностей, кодирующих С-концевые участки: а) модифицированного CAT; б) гибридного белка CAT(m)-SST.

промотором гена cat (Pca() и останавливается терминаторами транскрипции из фага fil и "stop" кодоном трансляции в гене sst-2. ,

Конструирование вектора pCCSt осуществляли с использованием полуденных нами промежуточных плазмид pCMRI" и pRS (рис.9). pCMRI* получали рекомбшю-цней фрагментов ДНК плазмид pBR325 и pLK53, с последующим удалением сайта рестрнктазы EcoRI в гене cat (рис. 9). Образующийся при этом модифицированный геи cat' отличается от природного наличием трех дополнительных кодонов 73-75, не меняющих рамку трансляции этого гена (рис.10-1). pRS констру!гровали на основе плазмид pSST-2, содержащей ген sst-2 и pRK, несущий полилинкерную последоьа-тельность с сайтом рестрнктазы Smal. На заключительном этапе конструирования нз плазмиды pCMRI", имеющей 2 сайта рестрик^зы Seal, выщепляли малый фрагмент, содержащий укоро«, нный с З' гонца на 26 н.о. ген cat. Плазмиду pRS гндролнзова-лн рестриктазами Scal-Smal и выделяли большой фрагмент t. геном sst-2.

Рестрикционное картирование готового вектора pCCSt подтвердило соответствие размеров фрагментов щдролизатов контрольным с известным молекулярным весом, что свидетельствовало о сохранности его нуклеотидной структуры., Анализ нуклеотндной последовательности в области узнавания рестриктазой EcoRI показал, что соединение места расщепления рестриктазой Seal в З'-концевой области гена cat со Smal сайтом из полилинкера плазмиды pRK позволило получить единую фазу трансляции для экспрессии гибридного гена cat -sst. Фрагменты этих нуклеотидных последовательностей представленны на рис. 10-11.

« I

ЭКСПРЕССИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕНА СОМАТОСТАТИНА.

Экспрессия гибридного гена cro-sst-lacZ. Для экспрессии гибрида cro-sst-lacZ в плазмиде pl'SL использовали методику Zabeau (1982). Условия температурной индукции Рг промотора подбирали для

плазмиды pLIO, содержащей полноразмериый ген IgcZ, в штамме МС1875. Кинетику этого процесса контролировали измерением удельной активности iJ-галакгозидазы в

зависимости от времени культивирования и обновления питательной среда. Наибольший уровень экспрессии проявлялся после 1 часа инкубации при 42°С.

Использованный нами Рг промотор (Я) активировался повышением температуры, так как регуляция его функции осуществляется термолабильным белком-репрессором, кодируемым геном rib E.coii МС1875. Этот штамм мы применяли для трансформации плазмидой pPSL.

Количественные параметры экспрессии cro~sst~lacZ гибридов определяли с помощью электрофореза клеточных лизатов в 7% ДДС-Na-ilAA геле. Контролем служил клон МС1875 pLIO, кодирующий белок-носитель. Электрофоретический анализ бе.;;овых фракций показал, что молекулярная масса индуцируемого с ллазмиды pPSL белка увеличена по сравнению с ß-галактозидазой, что свидетельствовало о синтезе рекомбинантного продукта, уровень экспрессии которого составил около 10% от суммарных клеточных белк./в.

Экспрессия гибридного гена V-cat-sst-cat-3'.

Экспрессию гибридного гена b'-cat-sst-cat-З' в ллазмиде pCSC осуществляли и условиях конститутивного биосинтеза иод контролем собственного промотора гена cat. Первоначально экспрессию этого гибридного гена проводили в штамме E.coii НВ101, однако электрофоретический анализ клеточных лизатов не выявил наличия соответствующего продукта. Положительный результат удалось получить лишь в клетках E.coii 8012, 8017 и МКД3207 со сниженной протеолитической активностью. Максимальный уровень экспрессии химерного полипеьгида в штамме МКД3207 по данным электрофореза в ДДС^Ыа-ПААГ составил 15% от суммарных клеточных белков. Сравнение электрофоретнческих подвижностей CAT-SST и носителя выявило более высокую молекулярную массу гибридного белка, соответствующую 24кД,

Экспрессия гибридного п i 5'-cat-sst-3'.

Экспрессию гибридного гена b'-cat—sst-З' проводили с использованием конститутивного промотора PCat 8 составе плазмндного вектора pCCSt в штамме

МКД3207 (Ion'), имеющем мутации в генах внутриклеточных протеаз, и обладаю-

mem, ) ледствие этого, сниженной протеолитической активностью по отношению к •гужг(юлиым белкам. Анализ суммарной белковой фракции с помощью ДДС-Na-ПААГЭ в градиенте полиакриламида 10-20% выявил присутствие домшшрующей полосы с молекулярной массой 24кД, соответствующей гибриду CAT(m)-SST, уровень экспрессии которого составил 10% от суммарных белков бактериальной клетки. В результате сопоставления трех ллазмидных векторов pPSL, pCSC и pCCSt, для создания продуцента рекомбинантного SST была выбрана конструкция pCCSt, которая обеспечивает высокую экспрессию химерного белка с последовательностью SST, а первичная структура синтезируемого рекомбинантного гормона тождественна нативному соматостатину.

ВЫДЕЛЕНИЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА И ЕЮ ХИМИЧЕСКОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ.

Выделение гибридного белка.

Для наработки гибридного белка использовали штаммы E.coli МКД3207, содержащие плазмнды pCSC и pCCSt. Культуру клеток наращивали либо в орбитальном шейкере (суммарный разовый объем 2л), либо в лабораторном ферментере (объем Юл). Биомассу лизировали, центрифугировали'и полученные фракции анализировали на присутствие CAT-SST с помощью электрофореза в ДДС-Ыа-ПААГе. Оказалось, что рскомбинантный полипептид находился полностью в осадочной фракции и отсутствовал в супернатанте. На основании этих данных был сделан вывод о том, что гибридные белки, содержащие лоследовательность соматостатнна в центральной или в С-концевой части CAT, накапливаются в клетке в виде нерастворимых агрегатов, т.п. "тельцах включения". Последовательные 4-х кратная промывка и центрифугирование осадочной фракции раствором Тритон Х-100, растворяющем примесные белки, позволила получить препарат CAT(m)-^ST 70-80% чистоты.

Свойство CAT(m)-SST накапливаться в цитоплазме в виде дискретных гидрофобных комплексов является весьма распространенным явлением при экспрессии гетерологнчных генов в клетках микроорганизмов. Однако Лунин В.Г. и

согат.( 1D93) получили водорастворимые гибридные белки с последовательностью SST на С-конце полноразмерного немодифицнрованного CAT.

Пысокую нгрегалазиость гибридного белка на основе САТ(ш) можно объяснить структурными изменениями, связанными, с одной стороны, с введением дополнительных аминокислот Leu73-Va!74-Gln75 в центральную часть носителя, а с другой стороны, с заменой 6 С-концевых ам.к. на последовательность SST. Вследствие . этого могла произойти элиминация амфнпатической а-спирали С-концевой области СЛТ(т) и обнажение гидрофобных участков на поверхности белковой глобулы. Но все-таки, доминирующую роль в формировании агрегатов играет, по-видимому, медналы(Ы.( участок CAT. На это указывает плохая растворимость рекомбинантиых белков со вставкой SST между 72 и 73 остатками-и нативной структурой С-юищевой области.

Методы выделения "телец включения", состоящих преимущественно из рекомбкиантного белка, различаются между собой составом и концентрацией солюбиднзирующих агентов и детергентов, в присутствии которых происходит растворение баластных нолипеитндов, а также режимом центрифугирования. В некоторых случаях для очистки агрегированного с белком-носителем соматостатина используют хроматографическне методы. Canosi et al. (1984), выделяя ' ибрид ТгрЕ-SST, растворяли "тельца включения" и фракционировали раствор на колонке с "Sepharose 4В". Очистка гибридного белка достигалась за счет высокого молекулярного веса агрегата, который выходил со свободным объемом колонки, существенно

опережая по подвижности примесные компоненты.

о

Схема выделения и очистки CAT(m)-SST разработана исходя из его физико-химических свойств и включала следующие этапы:

I. БИОМАССА II. "ТЕЛЬЦА ВКЛЮЧЕНИЯ* III. ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК

1. разрушение клеток 1. дезагрегация 1. BrCN гидролиз

2. центрифугирование 2. диализ 2. лнофнлизацня

3. отмывка осадка

Еасшеплекие гибридного бедка,

SST выщепляли из состава гибридного белка гидролизом карбоксильной группы остатка Met, расположенного перед N-концевым аланином SST с помощью BrCN в 80% СНСООН. Однако, нам не сразу удалось добиться необходимой фраг-ме|ггации гибридного белка. Известно, что белки цитоплазмы E.coli находятся В

восстановленном состоянии. Контакт содержимого разрушаемой клетки с кислоро-

t

дом воздуха вызывает автоокисление SH-групп цистениа, а высокая локальная концентрация гибридного белка в "тельцах включения" способствует хасггичиому образованию как внутри-, так и межмолекулярных дисульфидных связей. Поэтому для более эффективного расщепления гибрг ,а мы проводили предварительное восстанавленне ai ^егированоого CAT(m)-SST в присутствие сильного хасггропного агента - гуанидингидрохлорида и дитиотрейтола. В этих условиях происходило полное раствор«ние CAT(m)-SST. Диализ против 0,01 М nh4hco3 приводил к

формированию хлопьевидного осадка, который собирали центрифугированием и обрабатывали BrCN. Оптимизация условий расщепления позволила подобрать минимально необходимое соотношение коицентра-ций белка (Юмг/мл) и BrCN (2мг/мг белка). Качество гидрюлиза контролировали с помощью 10-20% ДДС-Na-ПААГЭ по исчезновению исходной полосы 24 кД.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНА.НТНОГО СОМАТОСТАТИНА.

После выделения "телец включения" и расщепления гибридного белка BrCN лиофилизированный гидролизат подвергали хроматографическому разделению методами гельфильтрации, ионио-обменной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Исходя из известной структуры CAT б случае гидролиза гибридного белка по всем остаткам Met можно было ожидать обргзовогая 10 фрагментов, причём в 5 кз •лих присутствовали остатки Cys. Во избежании формирования аномальные дисульфидных связей между фрагментами бромцианового гкдролизата первую

стадию хроматографнческой очистки - эксклюзивную хроматографию проводили в восстанавливающих условиях.

Гельфильташа BrCN гндролиэата.

Разделение BrCN гндролнзата гибридного белка проводили на колонке с "Sepbadex G-50" о 6№ мочевине с меркалтоэтанолом. Профиль гельфильтрацин представлен на рис. 11. SST в элюиро ванных фракциях идентифицировали с помощью радионммунологического анализа после их предварительного обессоливаиня. Фракции, содержащие SST, объединяли и последующую очистку вели двумя путями. В первом варианте выделения SST непосрел^твенно за гельфильтрацней выполняли офВЭЖХ в препаративном режиме, во втором - ионно-обменную хроматографию с последующей офВЭЖХ.

^60

Рис.11. Гельфильтрация BrCN гидролизата шбридного белка на колонке с "Sephadex G-50". Иммунореактивная фракция SST заштрихована.

РФ ВЭЖХ препаратов соматостатнна. . В результате проведения офВЭЖХ объединенного пула иммунореактивного

25

Рис.12. офВЭЖХ на колонке 'Диасорб 130 Cjg" иммуиореактивной фракции SST, полученой в результате гельфнльтрации. ,

SST на колонке "Диасорб 130 Cjg" элюцией в градиенте ацетонитрила было получено три пика, незначительно различающихся по времени удерживания на обращенной фазе, пептидный материал которых имел одинаковый аминокислотный состав и концевую аминокислоту, соответствующие SST (рис.12). Пептидный материал.и» пика №2 имел то же время удержания на колонке, что и нативная форма SST. Восстановление лиофилнзированного пула из трех пиков привело к исчезновению пика №2, сохранив неизменным время удержания материала из пика Ml. Таким 1 образом, обнаруженная хроматографическая гетерогенность при постоянстве и сходстве аминокислотного состава и N-концевон аминокислоты могла быть вызвана только конформационными различиями в молекуле SST, обусловлетплми состоянием сульфгидрилышх групп остатков Cys. Один из этих конформеров (кик №2) соответствует циклической форме SST, самопроизвольно образующейся п процессе выделения, второй (пцк №3) - восстановленной, а третий (тек Nsl), по-видимому,

является нзоформой SST, В031шкающей в результате необратимого окисления остатков цистеина до циетеиковой кислоты в ходе гидролиза бромцнаном в муравьиной кислоте. Сходная картина последовательности удерживашм конформеров рекомби-иаитиого соматомедина С на оф-сорбеитах показана Meng et al. (1988). Авторы демонстрируют существенное отставание элюцин фракции восстановленного соматомедина С от его циклических изомеров.

' Ионио-обменнзя хроматография.

Во втором варианте очистки соматостатиновуг фракцию наносили на колонку с шишо-обметшй смолой "SP-Toyopearl". Элюирование SST проводили в градиенте хлористого натрия. Профиль элюцин представлен на рис.13-а. SST во фракциях идентифицировали с помощью офВЭЖХ. Введение хроматографической стадии на катиоино-обменном сорбенте неожиданно привело к существенному увеличению выхода циклического SST, спонтанно ренатурирующего в ходе элюци. . Последующий анализ фракции SST на колонке "Диасорб 130 Cjq" выявил два пика, находящихся в зоне выхода конформеров SST и идентичных между собой по аминокислотному составу и N-концевой аминокислоте (рис.13-6). Причем первый из них, по времени удержания совпадающий с циклической формой, имел явно доминирующие размеры. Материал пика №2, на основании полученного опыта, был классифицирован как линейный н подлежал дальнейшей ренатурацни. '

Ренатурацня рекомбинантного соматостзтина,

i

Полученные в результате офВЭЖХ и нонно-обменной хроматограф»» очшцеи-о

ные фракции восстановленного SST подвергали окислению кислородом воздуха Динамику процесса кошролировали офВЭЖХ в аналитическом режиме, используя в качестве стандарта как циклический, так и восстановленный нами для этой цели коммерческий препарат SST, при этом переход \ .нейиой формы SST в циклическую осуществлялся полиостью.

Мы использовали два варианта очистки рекомбинантного SST из BrCN

гидрол>..шта гибридного белка:

ГИДРОЛИЗАТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА 1. гельфильтращш

ИММУНОРЕЛКТИВНАЯ ФРАКЦИЯ 35Т

.вариант 1 вариант 2

1. офВЭЖХ (преп.) 1. иогаго-обменпая хроматография

2. окислительный рефоддашг 2. офВЭЖХ

3. офВЭЖХ 3. окислительный рефолдгапг

4. офВЭЖХ

РЕКОМБИНАНТНЫЙ ИТ

Обе схемы 1ф1шодили к получению гомогенны?: препаратов БЭТ, различая -щихся лишь конформацией молекул, обусловлетой состошшем тиольных Групп остатков цистеииа. Сравнение двух вариантов очистки рекомб1шантного ББТ выявило некоторые преим"щества использования иотю-обменной хроматографии вслед за , эксклюзивной, так как это позволшшо не только разделить с ожную смесь низкомоЛекулярных фрагментов гибридного белка, но и избавиться от солевых компонентов гельфильтрацпонного буфера, в частности, от высоких концентраций мочевины, ' отрицательно влияющих на обращешю-фазовые сорбенты и вызывающих быструю деструкцию используемых колонок. Кроме того, процесс ренатурацни в условиях ' иотю-обменной хроматографии происходит гораздо активнее, что обеспечивает • доминирование циклического ББТ. Однако величина суммарного (самопроизвольно и "насильспенно" ренатурнровашюго) ББТ в обоих схемах очистки была одинаковой и конечный выход препарата составил 1мг/л бакп,шальной культуры. Отмечишая нами спонтанная ренатурация рекомбинантного ББТ находится в прямой зависимости от времени аэрации разбавленного белкового раствора в процессе выполнения хрома-тографических процедур в отсутствие тиоловых реагентов. Одним из параметров, определяющих успех реакции ренатурации является концентрация белка, поскольку необходимо создать условия, при которых внутримолекутярные взаимодействия преобладали бы над межмолекулярными. Ориентируясь на дашгые, ИоЬаш е(; ¿1. (1989), в наших экспериментах Концентрация восстановленного ББТ не превышала 100мг/мл.

а)

сст

СН3СН,* 1»

Ю 130 (ни)

(9 (км)

4

0.4

а220 , •

0.3

о.г

0.1.,

п

_J

90

70 • VI

$0 ао

8Г

30

10

5

15

25 35 (мин)

Рис. 13. а). Ионо-обменная хроматография иммунореактивной фракции рекомбшшгпюго ББТ на колонке с "БР-ТвуореагГ. б). офВЭЖХ на колонке "Диа£срб-130 С}(з" фракции БЭТ, полученной в результате ионно-обменной хроматографии. в).офВЭЖХ препарата циклического рекомбинантного ББТ на аналитической колонке "Мис1еозП 1000-р5Ь"

дополнительного объяснения требует расхождение между величинами теоретического и фактического выхода рекомбииантиого SST. Теоретически из 1г САТ(ш)-SST можно выделить 67мг SST, нам же из того же количества гибридного белка удалось выделить 2-3 мг (по Лоури). Подобное расхождешге объясняется потерями, скорее всего, возникающими на стадии BrCN расщепления и последующего растворения лиофилизмровашшго гидролизата.

, ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТА РЕКОМБИНАНТНОГО СОМАТОСТАТИЦА.

Опенка гомогенности препарата циклического &ST с помошыо офВЭЖХ. Полученные препараты, соответствующие циклической форме SST, объединяли н рехроматографировалн на колонке "Nucleosil-lOOOpst". Профиль элюшш показан на рис.13-в Симметр! . ность единственного пика прн высокой оптической чувствительности (А220 * ^.4) и пологом градиенте ацетошп^ила свидетельствуют о

гомогенности данного препарата.

Определение аминокислотного состава н N-кониепой аминокислоты рек. SST Сравнение аминокислотных составов рекомбиншггного SST и коммерческого препарата фирмы "Sigma" (таблица t) показало их идентичность. Защищенное содер-жанис цистенна вызвано окислением одного из остатков в процессе солянокислого гидролиза и превращением его в цистеиновую кислоту. N-концевой аминокислотой в препарате рекомбиншггного SST выявлен остаток аланина.

На основании тестов, приведешшх выше и выполненных в сравнении с коммерческим препаратом фирмы "Serva", мы определили степень чистоты нашего препарата на уровне 95-98%.

Биологическая активность рекомбинантного соматостатина. Биологическую активность полученных препаратов рекомбинантного SST оценивали с помощью биотестов на первичных кулкоурах клеток аденогипофиза и соматотрошшомы челопека по торможению продукции гормона роста и пролактина,

Таблица 1. Аминокислотный состав рекомбинантного и комерческого препаратов

соматостатнна

Аминокислота Рекомбннантный соматостатнн Соматостатнн "Sigma"

ко!щ. (нм) количество а.о Koiui. (нм) количество а.о

Asp 3.06 1.35 2.51 1.33

Thr 4.13 1.82 4.48 2.38

Ser 1.49 0.66 1.49 0.79

Glu 0.12 0.07 0.12 0.07

Pro 0.18 0.07 0.16 0.08

Gly 2.68 1.18 2.72 1.44

Ala 2.48 1.10 2.07 1.10 •

Cys 0.91 0.40 1.27 0.68

Val 1.08 0.48 0.18 0.09

Met 0.32 0.14 0.19 0,10

I. Leu 0.57 0.25 0.14 0.07 ?

Leu 0.82 0.36 0.19 0.10

Туr 0.24 0.11 0.04 0.02

Phe 5.91 2.61 6.09 3.23

Hys 1.17 С.52 0.24 0.13

Lys 3.29 1.46 3.78 2.01

Arg 0.24 0.12 0.30 0.16

Totals 28.69 25.97

а также на монослойных культурах островковых клеток поджелудочной железы по ннтнбированию секреции инсулина. Исследованные препараты обладали высокой специфической активностью, сравнимой с активностью стандартного препарата БЗТ. Результаты бнотестнрованил приведены в табл. 2-5. Статистическая обработка данных выполнена с использованием ^теста Стьюдента. М + ш - средняя велнчииа ± стандартная ошибка. Р -;-остоверность различия показателей у экспериментальной группы культуры клеток по отношению к контрольной группе. В скобках указано количество культур.

Таблица 2. Секреция СТГ в культуре клеток аденомы гипофиза _(соматотропиномы) человека под влиянием ББТ в дозе 10 нг/мл

Экспериментальные группы Содержали' СТГ в среде (нг/мл/24 часа) М + т % ингнби-рования Р<

Контроль 1482 ± 54 (4 )*

Ресомбпнантный соматостатнн 722 ± 60 (4 ) 51.2 0.001

Стандарт соматостатнна 606 + 32 (4 ) 59.1 0.001

Габлица 3. Секреция инсулина в культуре островковых клеток поджелудочной

Экспериментальные группы Содержание инсу.чша в среде (мкЕд/мл/2часа) М ± ш % ингибн- роВШШЯ Р<

Контроль 91.0+8.5 (8)

Рекомбинантный соматостатин 38.5 ± 4.0 (8) 57.7 0.001

Стандарт соматостатнна 44.0 ± 8.5 (8) 51.7 0.02

Таблица 4. Секреция СТГ в культуре клеик аденогипофиза взрослых самок крыс

Экспериментальные группы Содержание СТГ в среде (нг/мл/2 часа)' М ± ш % ингиби-рования Р<

Контроль 65.9 + 7.6 (15)

Рекомбинантный соматостатин 36.7 ± 6.2 (7) 44.3 0.01

Стандарт соматостатнна 46.0 ± 7.4 (6) 30.2 0.1

Таблица 5. Секреция пролактина в культуре клеток аденогипофиза взрослых самок _крыс Под влияний. SST в дозе 200 иг/мл._

Экспериментальные группы Содержание пролакпша г среде (мкг/мл/2 часа) М ± ш % ннгибн-ровапия Р<

Контроль 16.46 ± 1.7 (16)

Рекомбинантный соматостатин 2.62 ± 0.66 (6) 84.1 0.001

Стандарт соматостатнна 5.30 + 0.91 (8) 67.8 0.001

Результаты многопланового тестирования показали аналогичную пли даже более высокую активность рекомбинантного SST. по сравнению с контрольным, химически синтезированным препаратом. Хорошая выживаемость клеточных культур (до 24 часовЗ также может быть косвенным свидетельством чистоты рекомбинантного SST и отсутствия следов химических реагенгов, BrCN, двухвалентных ионов.

Радиоиммунологнчекнй анализ рекомбинантного SST.

При исследовании иммунологических свойств рекомбинантного SST с помощью коммерческих наборов фирмы "Incstar" было показано сходство характера взаимодействия с антителами синтетического и рекомбинантного SST. Об этом свидетельствует почти одинаковый наклон кривых вытеснения меченого [125l]Tyi4'-SST немеченными лигандами (рис. 14). Наблюдаемые расхождения статистически не достоверны. Таким образом RIA показал высокую степень идентичности конформа-

У1

шЛ II антигенных детерминант, полученного нами рекомбннантного ББТ и химически синтезированного комерческого препарата.

Рис.14. Иммунореактивность рекомбннантного (1) и сиитетического (2) Б8Т в радионммунологнческой системе.

выводы

1. Осуществлена сборка и клонирование синтетического гена соматостатина-14 в клонирующем векторе pBR325. обеспечивающем стабильную репликацию гибридной ДНК в клетках E.coli НВ101.

2. Сконструирован экспрессирующий векгор pPSL с N-концевой локализацией гена sst по отношению к носителю, обеспечивающий индуцируемый стггез гибридного полииептида: продукт фрагмента гена его (8 aM.K.)-Met- соматостатин (14 ам.к.)-Met- ß-галактозидаза (1005 ам.к.) на уровне 10% от суммарных белков клетки.

3. Сконструирован экспрессирующий векгор pCSC, конститутивно направляющий экспрессию гена sst, интегрированного в центральную часть структурной области гена cat с получением гибридного белка: N-концевой фрагмент CAT (66 ам.к.) -Met-соматостатин (14 ам.к.) -Met- С-концевой фрагмент CAT (153 ам.к.) на уровне 15%

от общею белкового пула.

4. Сконструирован векгор pCCSt, имеющий в своем составе ген sst, остроеный взамен 26 и.о. из З'-концевой части моднфицировашшго гена cat и предназначен для экспрессии гибридного белка: CAT (210 ам.к.) - Trp-Glu-Phe-Met- соматостатин (14 ам.к.) под контролем конститутивного промотора Peat и терминаторов транскрипции из фага fd. Уровень экспрессии составил 10% от общих клеточных белков.

5. Создан новьа"! штамм-продуцент соматостатииа на основе плазмидного вектора pCCSt и реципиентного штамма E.coli МКД3207, проявляющего сниженную протеолитическую активность. Штамм депонирован во Всесоюзной Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ В 5557. На данное изобретение получен патент Российской Федерации №2009199 с датой приоритета 26.03.1991г. Штамм-продуцент соматостатина ВКПМ В 5557 не уступает по продуктивности зарубежным образцам, запатентованным западными фирмами, и позволяет получать 1мг рекомбинантного гормона из литра бактериальной культуры.

G. Разработана схема выделения гибридного белка и получения соматостатнна из бактериальной массы, предусматривающая комплексную очистку целевого пептида по молекулярной массе, заряду и гидрофобностп, позволяющая получать соматосга-тин 95-98% чистоты.

7. Показаны физико-химическое тождество к идентичность биологических и иммунологических характеристик рекомбинантного соматостатнна н химически синтезированного коммерческого препарата фирмы "Serva".

Список работ, опубликовшшых по теме диссертации:

1. Панков Ю.А., Тихоненко Т.Н., Лушш В.Г., Карпова С.К., Сазииа Е.Т., Бадер Л.Б., Карасев В.С.,Серп1еико О.В., Каляева Э.С., Север И.С. Рекомбинаитная плазнндная ДНК pCCS, кодирующая соматостатни-14, и штамм бактерии Escherichia coli • продуцент соматостатнна-14. - Патент РФ RU 2009199 С1, 1991.

2. Pankov Y., Tikhonenko Т., Lunin V., Karpova S., Sazina E., Karasev V., Bader L., Scrgienko O. Expression of biologically active recombinant somatostatin In Escherichia coli. - Abst. P-08.01.085, p.300, in "Ninth International Congress of End» :rinology", Francc, Nice, 1992.

3. Карпова С.К., Сазнна Е.Т., Карасев B.C., Бадер Л.Б., Сергиетсо О.В., Шишкина A.A., Швачкин Ю.П., Лунин В.Г., Тнхонекко Т.И., Панков 10.А. Синтез соматостатнна в клетках Escherichia coli; выделеш« к характеристика. Бноорг.химия, 1993, т. 19, №6, с.612-622.

4. Карпова С.К., Сазнна Е.Т., Бадер Л.Б., СергиеикЬ О.В., Ходун М.Л., Кривцов. В.Ф., Лунин В.Г., Тнхонеико Т.И., Панков Ю.А. Генно-инженерные подходы к бактериальному синтезу соматостатнна. - Весь.ик РАМН, 1994, М?12, с.24.

_Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Подл, к печати 10. 3. 95г. Заказ Л 03 Тираж /00

35