Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез гетерологичных функционально активных GPCR в клетках метилотрофных дрожжей Pichia pastoris

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Синтез гетерологичных функционально активных GPCR в клетках метилотрофных дрожжей Pichia pastoris"

005011581

/ '

ГЕРАСИМОВ АНДРЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

Синтез гетерологичных функционально активных СРС(? в клетках метилотрофных дрожжей Р/сЛ/'а раэ^пэ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О УиО ¿ьи

Москва-2012

005011581

Работа выполнена в лаборатории готовых лекарственных форм, федерального государственного бюджетного учреждения науки Центр «Биоинженерия» РАН

Научные руководители: кандидат биологических наук

Зейналов Орхан Ахмедович кандидат биологических наук Шульга Алексей Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Чупин Владимир Викторович кандидат биологических наук Соколова Ольга Сергеевна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится «02» марта 2012 г. в_часов на заседании

Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета.

кандидат биологических наук —лл. И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Способность воспринимать и оперативно реагировать на информацию, получаемую из окружающей среды, является одним из важнейших свойств живых организмов. На сегодняшний день подробно изучены физиологические основы сигнальных механизмов, однако, их понимание невозможно без детальных биофизических и биохимических исследований всех вовлеченных молекулярных структур, к числу которых относятся рецепторы, сопряженные с в-белком.

Рецепторы, сопряженные с О-белком, (вРСЯ или 7ТМ-рецепторы) представляют собой крупнейшее семейство белков. Эти рецепторы являются ключевыми элементами механизмов молекулярного распознавания и саморегуляции эукариот. Последние исследования выявили их участие во многих и важнейших и слабо изученных внутриклеточных процессах. Важно отметить, что рецепторы семейства вРСИ. являются молекулярными мишенями для более половины известных лекарственных препаратов, поэтому закономерен интерес к ним со стороны Фарминдустрии.

Несмотря на свою уникальность и важность, на сегодняшний момент подробно изучены кристаллические структуры всего лишь нескольких представителей вРСЯ: родопсина человека и быка, бета1- и бета2-адренергических, дофаминового Б3, аденозинового А2а и хемокинового СХСЯ4, гистаминового Н1 рецепторов человека. Отсутствие прогресса в структурных исследованиях вРСЯ объясняется низким содержанием рецепторов в природном сырье, а также трудностями, связанными с поддержанием правильной пространственной структуры рецепторов вне мембранного окружения. В связи с этим, представляется целесообразным разработка гетероло-гичных систем экспрессии, которые бы обеспечивали получение любых необходимых количеств ОРСИ. в функционально активном состоянии. Как показывает практика, системы на основе Р1сЫа рав1ош идеально подходят для получения высокотоксичных трансмембранных белков, поскольку дрожжи можно выращивать в больших объемах до высоких плотностей и эффективно контро-,

лировать уровень транскрипции целевых генов, используя строго индуцибель-ные промоторы.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей диссертационной работы является создание эффективных систем гетерологичной экспрессии генов вРСЯ на основе клеток ме-тилотрофных дрожжей Р. раМот и разработка методов выделения и очистки рецепторов в функционально активном состоянии.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы и решены следующие основные задачи:

1. Разработка эффективных систем экспрессии генов представителей семейства вРС11: бета2-адренергического рецептора, рецептора-3 дофамина, рецептор-1 галанина, рецептора 174, рецептора-2 меланокортинов.

2. Разработка метода тестирования функциональной активности рецепторов.

3. Разработка эффективных протоколов выделения и очистки гетеро-логичных функционально активных рецепторов из мембранной фракции дрожжей.

Научная новизна и практическая значимость работы

%

В настоящей диссертационной работе предложены новые стратегии получения рецепторов в клетках Р./?ау/ога, позволяющие наработать миллиграммовые количества функционально активных белков для структурных и биологических исследований.

Разработана универсальная система получения адренокортикотропного гормона и его производных, содержащих специфические узнаваемые последовательности аминокислот, для молекулярно-биологических исследований.

Впервые показано, что рецептор меланокортинов (ЬМС2Я), локализованный в мембранной фракции дрожжей, способен связываться со своим ли-гандом - адренокортикотропным гормоном. Разработанный метод тестирования функциональной активности открывает путь для изучения других рецепторов с лигандами белковой природы.

Показана возможность использования рекомбинантного ЬАБШэ2 в качестве антигена для определения титра аутоантител против рецептора ЬАОЯЬ2 в

4

сыворотках крови больных миастенией и рассеянным склерозом. Изучено влияние лекарственных субстанций, применяемых в медицинской практике, на взаимодействие гетерологичного ЬАВЯЬ2 с аутоантителами, что дает возможность применения полученных результатов в фармакологии.

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Результаты работы получены лично автором или же при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на всероссийской научной школе для молодежи «Горизонты нанобиотехноло-гии». (Москва, 2009 г); научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010 г), международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них в рецензируемых журналах - 2, в российских и иностранных журналах, входящих в перечень ВАК - 2, тезисы докладов на международных конференциях и семинарах - 2, тезисы докладов на российских научных конференциях - 5.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 128 страницах машинописного текста и включают 28 рисунков и 4 таблицы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждения», «Выводы», «Список цитируемой литературы», который содержит 280 ссылок, в том числе 271 иностранный источник.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выбор объектов исследования

Для продукции рецепторов применяют различные системы гетерологич-ной экспрессии. Использование клеточной системы Е. coli позволяет наработать достаточные количества GPCR. Однако бактериальные клетки зачастую не способны синтезировать рецепторы с нативной третичной структурой, осуществлять посттрансляционные модификации, вследствие чего, уменьшается или не наблюдается функциональная активность. Длительность, трудоемкость и дороговизна являются характерными признаками систем на основе клеточных линий млекопитающих и насекомых. Перспективной является система экспрессии на основе клеток метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, которые обладают развитым субклеточным аппаратом для осуществления посттрансляционных модификаций белков и схожим с клетками млекопитающих строением цитоплазматической мембраны. К тому же клетки дрожжей отличаются простотой и удобством в работе.

В настоящей работе описана экспрессия бета2-адренергического рецептора hADRb2, рецептора-3 дофамина hDRD3, рецептора-1 галанина hGALRl, рецептора 174 hGPR174, рецептора-2 меланокортина или АСТН-рецептора hMC2R. Они являются важными участниками процессов передачи сигналов и мишенями для многих лекарственных субстанций. К тому же, их получение затруднительно или невозможно в более простых экспрессионных системах, таких как Е. coli (неопубликованные результаты). Наиболее изученными среди исследуемых объектов являются hDRD3 и hADRb2. В частности, известно, что бета2-адренергический рецептор эффективно нарабатывается в Р. pastoris. Уровень его биосинтеза составляет 4 мг/л (Noguchi et al, 2006). В исследуемую группу входят рецепторы с лигандами пептидной природы (hMC2R, hGALRl). Особо отметим практическую значимость изучаемых GPCR. К примеру, ген hGPR174 активно экспрессируется лишь в метастазирующих меланомах, что является платформой для создания противоопухолевых препаратов селективного действия.

В данном исследовании методы получения GPCR в функционально активном состоянии были разработаны только для двух рецепторов hMC2R и

6

hADRb2, в силу того объективного обстоятельства, что работы такого рода являются очень затратными и трудоемкими. Один из этих рецепторов (hMC2R) имеет лиганд пептидной природы, другой - низкомолекулярный лиганд. При выборе рецепторов также учитывались такие факторы, как доступность лиган-дов, наличие минимально необходимых сведений о свойствах рецепторов в литературе.

Позднее, если это будет востребовано практикой, опыт выделения активной формы рецепторов, накопленный в процессе выполнения данной работы, может быть применен и к другим рецепторам, биосинтез которых был налажен в дрожжах. Главное, что было продемонстрировано в данной работе, -это принципиальная возможность получения функционально активных рецепторов из метилотрофных дрожжей.

Создание эффективных систем экспрессии генов GPCR

Работа по получению дрожжевых штаммов-продуцентов рецепторов состоит из нескольких этапов. Все первоначальные генетические манипуляции проводятся в клетках Е. coli. В результате получают плазмидный вектор, содержащий все необходимые элементы для успешной экспрессии целевого гена. Затем полученной ДНК трансформируют клетки Р. pastoris. При этом происходит интеграция целевого гена в генетический аппарат клетки-хозяина посредством гомологичной рекомбинации. Количество вставок экспрессионной кассеты в геноме можно оценить по устойчивости трансформантов к различным концентрациям селективного агента. В конечном счете, следует отобрать 6-10 трансформантов для определения уровня экспрессии целевого гена.

В качестве основы для создания плазмидного вектора использовали плазмиду pVR2 (Редо и др., 2011), предоставленную ведущим научным сотрудником Центра «Биоинженерия» РАН Эльдаровым М.А. Конструкция была усовершенствована введением последовательности, кодирующей девять остатков гистидина. Полученная плазмида pVR2His служила вектором, в который по сайтам Ndel и Xhol клонировали гены исследуемых рецепторов. В итоге были получены экспрессионные кассеты pVR2GPCRHis (рис. 1), которые использовались для получения GPCR с полигистидиновой последовательностью. Для выделения таких GPCR может применяться металлохелатная аф-

7

финная хроматография (МХАХ), один из универсальных методов очистки ре-комбинантных белков.

Рисунок 1. Графическая схема экспрессионной кассеты. СРС!Ч - гены ИАОКЬ2, ЬЮРЮЗ, И6А1_К1, ИМС2Р, СРК174. Ген гЕО находится под контролем конститутивного гибридного промотора транскрипции рТЕП/ЕМ7 и терминатора ЮУС2.

Гены рецепторов в полученных векторах находятся под контролем сильного индуцибельного промотора АОХ1, который активируется в ответ на добавление в питательную среду метанола. Отбор и селекцию трансформантов осуществляли благодаря наличию экспрессионной кассеты ZEO, которая обеспечивает устойчивость к зеоцину.

Основной отличительной особенностью конструкций, используемых в настоящей работе, является отсутствие на 5'-концах целевых генов сигнальной последовательности альфа-фактора 5*. сегеушяе. Синтез вРСЯ в виде гибрида с данным пептидом широко распространен и обеспечивает транслокацию молекул рецептора по котрансляционному механизму путем последовательного процессинга в шероховатом ЭПР и компартментах Гольджи. На наш взгляд, при синтезе сложных и токсичных полипептидов нет необходимости в использовании механизма секреции. Объектами нашей работы являются интегральные трансмембранные белки, которые, благодаря своей природе, способны самостоятельно встраиваться в клеточную мембрану.

Клетки Р. раз(оп8 штамма ОЭ115 (Ыэ4, ти1+) трансформировали векторной конструкцией, предварительно гидролизованной эндонуклеазой Рте\, методом электропорации (Сг姧 е! а1, 1995). Отбор трансформантов осуществляли на плотной питательной среде УРББ, содержащей зеоцин в концентрациях от 100 до 1500 мкг/мл среды. Биосинтез рекомбинантных белков осуществляли при культивировании клеток сначала на среде ВМвУ, а затем на индукци-

онной среде BMMY, содержащей метанол в количестве 10 г/л среды. Индукцию проводили 36 часов, добавляя каждые 12 часов по 10 г/л метанола.

Уровень экспрессии целевых генов в трансформантах оценивали методом дот-блота путем нанесения фиксированного объема мембранного экстракта (Zeder-Lutz et al, 2006) на нитроцеллюлозную мембрану и выявления поли-гистидиновой последовательности, входящей в состав рецепторов, при помощи специфических моноклональных антител (рис. 2). Отметим, что в данном случае методу дот-блота нет альтернативы, поскольку он очень надежен, чувствителен, и позволяет быстро, буквально «на потоке», оценить уровень биосинтеза белка, содержащего специфический «таг». Из рис. 2 нетрудно убедиться, что экстракты дрожжевой клетки-хозяина (К(-)) не прокрашиваются в цветной реакции.

мкг 20 10 5 2,5 1,2 0,6 0,3

Стандарт ф | | | | | фк(-)

hADRb2

HDRD3 * ф « ф * # » *

hGALRI *#««•$ * #

hGPR174 4 Ф # Ф ♦ • f§ # Ц hMC2R

1 2 3 4 5 6 7 8 номера клонов

Рисунок 2. Результаты дот-блота мембранных экстрактов. Стандарт - образец белка с С-концевой полигистидиновой последовательностью известной концентрации. Сверху указаны количества стандарта для построения калибровочной прямой. К (-) - образец мембранного экстракта Р. pastoris штамма GS115. Слева указаны виды рецепторов, а внизу - номер исследуемого клона.

Наиболее высокое содержание исследуемых рецепторов отмечалось у трансформантов, выросших на плотной питательной среде с высокой концентрацией селективного агента, что, по-видимому, говорит о наличии корреляции между копийностью гена и уровнем синтеза рецепторов. Максимальная продукция целевых белков, локализованных в цитоплазматической мембране, достигалась на 25 - 30-й час индукции. Исследование клеточной культуры с

помощью световой микроскопии показывает гибель клеток на 60-й час индукционной фазы, что подтверждает высокую токсичность целевых белков, выражающуюся в деструкции клеточной мембраны.

В связи с этим были проведены работы по оптимизации условий выращивания продуцентов с целью повышения продукции рецепторов. При снижении температуры культивирования во время индукционной фазы до 20° С уровень биосинтеза GPCR значительно повысился. Данное обстоятельство можно объяснить повышенной продукцией клетками белков теплового шока, которые стабилизируют молекулы полипептидов. В свою очередь, замедление процессов миграции и встраивания гидрофобных рецепторов в цитоплазмати-ческую мембрану при пониженной температуре культивирования может обеспечить правильную конформацию молекул и их функциональную активность.

Введение гистидина в состав индукционной питательной среды влияло также положительно. Хотя его действие не достаточно изучено, считается, что данная аминокислота обладает антиоксидантным свойством (Murakami et al, 1997).

Добавление в питательную среду диметилсульфоксида (ДМСО) является распространенным подходом при культивировании клеток P. pastoris (Murata et al, 2003, Salunkhe et al, 2010). Являясь по своей природе универсальным растворителем, ДМСО способствует увеличению проницаемости и вязкости ци-топлазматической мембраны, что приводит к увеличению доли функционально активных молекул рецепторов (Andre et al, 2006). С той же целью для трех рецепторов - hADRb2, hMC2R, hDRD3 во время индукции добавляли лиганды - альпренолол, адренокортикотропный гормон, дофамина гидрохлорид.

Применение, наряду с рассмотренными подходами, дополнительного внесения биотина, тиамина и рибофлавина приводило к существенному повышению уровня биосинтеза рецепторов, локализованных в дрожжевой мембране, который, в конечном счете, составил не менее 20 мг/л среды.

Создание эффективной бактериальной системы экспрессии для гена ад-ренокортикотропного гормона и его производных.

Для выделения активной формы рецептора hMC2R и изучения его ли-ганд-связывающих характеристик необходимо было обеспечить получение его

пептидного лиганда, а также некоторых его производных, содержащих специфические узнаваемые последовательности аминокислот.

Адренокортикотропный гормон (АСТН, кортикотропин) - природный и единственный лиганд hMC2R. Для успешной реализации задач, поставленных в данном исследовании, необходимо было также получить два производных АСТН. Первое производное — это АСТН с С-концевой последовательностью BIO (MASSLRQILDSQKMEWRSNAGGS). Наличие такой последовательности дает возможность биотинилировать полипептид in vivo. Белки, меченые био-тином, являются универсальным средством для решения многих задач молекулярной биологии. Взаимодействие биотин-стрептавидин относится к разряду наиболее прочных и характеризуется константой ассоциации порядка что использовалось при получении аффинных сорбентов для выделения активной формы рецептора hMC2R.

Вторая разновидность лиганда, получение которого необходимо было наладить в данном исследовании, - это АСТН с С-концевой последовательностью эпитопа парамиксовируса V5 (GKPIPNPLLGLDST), которая распознается коммерчески доступными, высокоспецифичными моноклональными антителами. Лиганд ACTH-V5 в данной работе применялся для постановки тест-системы определения активности рецептора, локализованного в мембране дрожжей. Следует отметить, что биотинилированный лиганд не может использоваться для этих целей, поскольку в состав мембранного компартмента входит эндогенный биотин. Добавочные последовательности необходимо было размещать только на С-конце, поскольку сайт связывания с рецептором («HFRW» мотив) расположен вблизи iV-конца АСТН.

В ходе исследования обнаружено, что прямая бактериальная экспрессия гена малоэффективна (неопубликованные данные). Поэтому была применена технология гибридной экспрессии кортикотропина, слитого с белком SUMO. С этой целью в плазмиду pGEMEXl (Novagen, США) по сайтам Ndel и Egel был проклонирован ген, кодирующий SUMO с N-концевой полигистидиновой последовательностью. Затем в полученную конструкцию pTS по сайтам Egel и ВатШ клонировали гены АСТН и его производных, которые собирали из синтетических олигонуклеотидов («Евроген», Россия) методом ПЦР. В результате

были получены экспрессионные векторы рТБА, рТБВЮ и рТБАУ5 для продукции ЭиМО-АСТН, БЦМО - АС ТН-В ¡о и 8иМО-АСТ11-У5, соответственно.

ВатН I

АСТН

АСТН ВЮ

АСТН V5

Рисунок 3. Схема получения плаз-мид для синтеза АСТН и его производных.

При синтезе целевого белка в виде гибрида с SUMO заметно увеличился выход АСТН и его производных. Другим положительным качеством является простота расщепления гибридных продуктов SUMO-гидролазами, которые узнают третичную структуру белка-партнера, а не специфическую последовательность аминокислот.

Для биосинтеза SUMO-ACTH и SUMO-ACTH-V5 использовали штамм E.coli BL21(DE3), который выращивали на автоиндукционной среде ТВ-5052 при температуре 37° С. Выход гибридов составил 500 мг/л среды.

Для биосинтеза SUMO-ACTH-BIO использовали штамм Е. coli Origami (BirA), осуществляющий коэкспрессию гена биотин лигазы. Максимальная продукция гибридного белка достигалась в результате выращивания при 28° С, с добавлением 0.01 мМ ИПТГ и 0.05 мМ биотина. Уровень биосинтеза гибрида составил 100 мг/л среды.

Выделение и очистку вариантов адренокортикотропных гормонов проводили в три стадии. Вначале выделяли гибридный белок при помощи метал-лохелатной аффинной хроматографии. После расщепления его при помощи гидролазы Ulpl проводили выделение кортикотропина при помощи катионо-обменной хроматографии (рис. 4).

В конечном счете, выходы целевых гормонов (при пересчете на чистый белок) составили 100 мг/л АСТН, АСТН -У5 и не менее 15 мг /л АСТН-ВЮ. При помощи дот-блота показано, что АСТН -У5 взаимодействует с монокло-нальными антителами против эпитопа У5, а АСТН-ВЮ со стрептавидином, конъюгированным с щелочной фосфатазой (отрицательным контролем служил

Рисунок 4. Схема очистки производных АСТН и результаты ПААГ в денатурирующих условиях.

АСТН).

Получение растворимой фракции белков Е.со1г

Металлохолатная аффинная хроматография

Металлохелатная аффинная хроматография

— -

БиМО-АСТН

Расщепление гибридного белка

Очистка АСТН (ВЮ, У5) (катионообменная хроматография)

Катмонообменная хроматография

БиМО / \

АСТН ж *

Создание бактериальной системы экспрессии для генов ЬАОКЬ2 и

ьмсгг*

Важной задачей, поставленной в диссертационной работе, является сравнение бактериальной и дрожжевой экспрессионной систем на предмет продукции активных рецепторов. В ходе исследования было обнаружено, что прямая бактериальная экспрессия генов рецепторов невозможна, поскольку белковый продукт не обнаруживался ни в бактериальной цитоплазме, ни в мембране (неопубликованные данные). Очевидно, что в таком состоянии рецептор неактивен. Поэтому была применена технология гибридной экспрессии ЬМС211, слитого с белком М15Йс. Существуют работы, в которых описано ус-

пешное применение данного подхода с целью получения множества функционально активных белков, локализованных в мембране (11оо811с1 е1 а1, 2005, Бук & а1, 2009). Он основан на особенностях природы белка-партнера М1э11С, который способен автономно встраиваться в мембрану, минуя механизмы, задействованные для транспорта и интеграции других клеточных белков. Формируя особую структуру, он интегрируется в липидный бислой и «втягивает» за собой слитый с ним целевой полипептид.

С этой целью в плазмиду рЕТ32а (1Чоуа§еп, США) по сайтам Ысо1 и ШеI был проклонирован ген, кодирующий М1зйс.Затем в полученную конструкцию рЕТ32а1уПз1зс по сайтам ШеI и ХИо1 клонировали гены исследуемых рецепторов. В результате были получены экспрессионные векторы рЕТ32аМ181юМС211, рЕТ32аМ1з1юАВ11в2 для гибридной продукции рецепторов ЫУ1С211 и 1ъА1ЖЬ2 (рис. 5).

Nco\

Рисунок 5. Физические карты плазмид pET32aMisticMC2R, pET32aMisticADRB2 для продукции рецепторов в E.coli

О

Nde I

PET32aMisticMC2R \ pET32aMisticADRß2 % _Xho 1

Для экспрессии hMC2R и hADRb2 нами был выбран штамм E.coli Roset-ta2(DE3)pLysS, широко используемый для биосинтеза токсичных белков. Клетки данного штамма содержат хромосомную копию гена РНК-полимеразы фага Т7, а также плазмиду pLysS с геном лизоцима фага Т7. Лизоцим ингиби-рует Т7 РНК-полимеразу, в результате чего фоновый уровень индукции в клетках существенно снижен. Культивирование рекомбинантного штамма проводили при различных температурах и концентрациях индуктора. Максимальные выходы гибридного белка, локализованного в мембране, достигались в результате выращивания при 25° С на автоиндукционной среде и составили порядка 50 мг/л среды (определено при помощи дот-блота).

Определение функциональной активности меланокортинового рецептора, продуцируемого в дрожжевой системе экспрессии

Подтверждение активности рецептора, локализованного в клеточной мембране, является важным этапом исследования, определяющим перспективность применяемой экспрессионной системы.

Способность гетерологичного рецептора ЬМС2Я связываться с адрено-кортикотропным гормоном определяли с помощью твердофазного ИФА. Препарат дрожжевых мембран, содержащих изучаемый рецептор, сорбировали на планшете в течение 12 часов. Образцы инкубировали с АСТН-У5, затем с мо-ноклональными антителами против эпитопа У5 и антителами против Рс-фрагментов, конъюгированных с пероксидазой хрена. Результаты фиксировали хромогенным субстратом ТМВ и анализировали планшетным ридером при длине волны 450 нм. В качестве отрицательного контроля использовался препарат мембран дрожжей, содержащий бета2-адренергический рецептор.

В конечном счете, установлено, что рекомбинантный ЬМС211, находящийся в мембране дрожжей, способен связывать АСТН (рис. 6). Полученная б-образная зависимость сигнала от концентрацией гормона, похожая по характеру на взаимодействие «фермент-субстарт» кинетики Михаэлиса- Ментен, позволяет вычислить константу диссоциации рецептора, интегрированного в дрожжевую мембрану с кортикотропином.

(АСТН1, "кг

Рисунок 6. Кривые связывания образцов мембранных фракций дрожжей, содержащих рекомбинантный ИМС2Я (ЬМС2Р, Р. равШв) и 1тАОР?Ь2 (ЬАОЯЬ2, Р. раэШз) - отрицательный контроль.

Используя один из стандартных методов расчета (Loomans et al, 1995), определили, что значение константы в исследуемой системе составило 0,23 нМ. Rached с соавторами исследовали активность hMC2R, продуцируемого в различных клеточных линиях млекопитающих. В частности, величина константы связывания рецептора, продуцируемого клетками НЕК293, с АСТН составила 0,44 нМ. Следовательно, оценка полученных значений от двух независимых экспериментов позволяет судить о специфичности взаимодействия и о функциональной активности рецептора в дрожжевой мембране.

Меланокортиновый рецептор, продуцируемый в бактериальной системе экспрессии не способен связываться с АСТН

Аналогичные исследования, проведенные на рецепторе hMC2R, локализованном в мембране Е. coli, выявили его неспособность связывать лиганд. Таким образом, на примере mistic-hMC2R было показано, что при сравнимых выходах целевого белка, дрожжевая система экспрессии GPCR является более предпочтительной, нежели бактериальная система, поскольку позволяет получать активный рецептор. Рецептор, получаемый в бактериальной системе, нуждается в ренатурации in vitro, что крайне трудно осуществить для таких сложных трансмембранных белков, как GPCR. Следует отметить, что на данный момент биосинтезу функционально активного hMC2R в метилотрофных дрожжах нет альтернативы, вследствие крайне низкого уровня продукции этого белка в клетках млекопитающих (Rached et al, 2005, Герасимов и др., 2011).

Солюбилизация hMC2R и hADRb2, продуцируемых в клетках P. pastoris

Под термином «солюбилизация» понимается растворение неполярных, гидрофобных веществ в мицеллярных коллоидных водных растворах детергентов. Отметим, что экстракция рецепторов из мембраны - это сложная и тонкая процедура, поскольку неполноценная имитация мембранного окружения детергентами с неизбежностью приводит к агрегации и/или денатурации молекул GPCR. Поэтому использование мягких детергентов, а в ряде случаев в сочетании с фосфолипидами или липидоподобными веществами является

необходимым условием. К тому же, известно влияние молекул ПАВ на хрома-тографические свойства белков.

Для выбора оптимальных условий солюбилизации hMC2R и hADRb2, исходя из имеющихся знаний (Sarramegna et al, 2006), проводили скрининг 8 детергентов и их смесей: 1 - лаурил саркозин (1%); 2 - н-Додецил-в-D-мальтозид (1%); 3 - дигитонин (1%), 4 - дигитонин (1%) и холат натрия (0.5%); 5 - CHAPS (1%) и холат натрия (0.2%); 6 - н-додецил-в-Б-мальтозид (1%), CHAPS (0.6%), холестерина гемисукцинат (0.12%); 7 - смесь подобная 6, но с добавлением лигандов; 8 - CHAPS (1%), 1,2-Дипальмитоил-да-глицеро-3-фосфохолин (0.2%).

Технически это осуществлялось путем получения препарата дрожжевых мембран, его солюбилизации в исследуемых детергентах, удаления нерастворимой части при помощи центрифугирования и выделения рецептора из экстракта методом МХАХ. Целесообразность использования детергента определяли путем анализа содержания целевого белка в нерастворимой фракции и во фракции, полученной после МХАХ (элюция белка 500 мМ имидазола). Для анализа содержания рецепторов применяли метод дот-блота, который был подробно описан ранее. На рис. 7 показаны результаты такого эксперимента на примере hMC2R.

Система экстракции 1 2 3 4 5 6 7 8

Нерастворимая фракция

4 • 9 '» Ф • Ф

4 Ф • Ш т • ф • N ©

4 ф • Ф т Ф ш Ф

4 Ф • ♦ © • • • Ф

• • ф т ф ф т\

Рисунок 7. Подбор

Растворимая Ш. Ш Ж. Л » Ж. УСЛОВИЙ ЭКСТраК-

фракция * Ш • • Щ цИЦ ИМС2!Ч.

Фракция после сорбции на М-ЫТА

Отмывка №-1\1ТА 60 мМ имидазола

Элюция

500 мМ имидазола

Элюция ^ 50 мМ ЭДТА ™

Из представленных результатов следует, что для экстракции ИМС2Я из дрожжевой мембраны лучше всего подходят 1%-ный раствор н-додецил-в-Б-

мальтозида (№2), 1%-й раствор дигитонина (№3) и смесь дигитонина с хола-том натрия (№4), однако, вследствие трудностей, связанных с плохой растворимостью, токсичностью, низкой чистотой дигитонина, использовали схему -№2. Эффективность солюбилизадии мембраны, которую определяли по разнице содержания рецептора в растворимой и нерастворимой фракциях, составила 86%.

Аналогичным образом было определено, что для работы с рецептором hADRb2 оптимальной является смесь, состоящая из 1% н-додецил-в-D-мальтозида, 0.6% CHAPS, 0.12 % холестерина гемисукцината, с добавлением антагониста рецептора - альпренолола. Эффективность экстракции рецептора из мембраны составила 90%. Отметим, что использование производных холестерина повышает термостабильность и устойчивость бета2-адренорецептора в мицеллах детергента, вследствие имеющегося холестерин-связывающего мотива (Hanson et al, 2008).

Очистка hMC2R и hADRb2.

В силу присутствия в солюбилизированной фракции детергентов и экстрагированных детергентами липидных компонентов мембран процесс очистки мембранных белков крайне затруднен. Разработанные протоколы для рецеп-

Солюбилизированная фракция hADRb2

0

Металлохелатная аффинная хроматография (Ni-sepharose HP)

Ионообменная хроматография (керамический гидроксиапатит CHTII)

Аффинная хроматография альпренолол-сефароза CL4B

Препарат функционально активного hADRb2

Солюбилизированная фракций Торов hMC2R И ЬАБРЬ2 hMC2R

практически совпадают и состоят из трех стадий. На первых двух стадиях удаляются примесные белки (МХАХ и ионообменная хроматография). На последней стадии для выделения активной формы рецептора используется аффинная хроматография (рис. 8.).

Аффинная хроматография АКТГ-BIO-steptavidin-sepharose

Препарат функционально активного hMC2R

Рисунок 8. Схема очистки hMC2R и hADRb2.

Метод металлохелатной аффинной хроматографии (МХАХ) характеризуется высокой эффективностью и, кроме того, позволяет избавляться от агрегированных форм рецептора, которые обычно не связываются с сорбентом. Уже после этого этапа выделения были получены препараты рецепторов ЬАОЯЬ2 и ИМС2Я с чистотой более 80% (рис. 10).

Рисунок 9. Результаты МХАХ, проанализированные при помощи ПААГ в денатурирующих условиях (а), вес-терн-блота (б) дот-блота (в). 1 - со-любилизированная фракция, 2 - после нанесения на М-зерЬагоэе НР, 3 - отмывка буфером, содержащим 50 мМ имидазола, 4 - элюция буфером, содержащим 500 мМ имидазола, 5 -элюция буфером, содержащим 50 мМ ЭДТА. 46 и 56 - вестерн-блот элюционных фракций

3* ¡¡р

14.4

46 56

М 1 2 3 4 5

• Ф Ф 9 9

_В)_

Дальнейшая очистка производилась на гидроксиапатите, который сочетает в себе свойства ионообменного и металлохелат аффинного сорбентов. В результате были получены препараты рецепторов с чистотой более 95 % (данные не представлены). К тому же на данной стадии окончательно удаляются примеси лигандов рецепторов, которые применялись при солюбилизации.

Гомогенность белков, находящихся в растворах детергентов была подтверждена методом динамического светорассеяния. Измерение интенсивности рассеянного света при различных длинах волн позволяет оценить однородность мицелл (Гончарук и др., 2010). В результате оказалось, что в препаратах ЬАОЯЬ2 и ЬМС2Я присутствуют частицы со средним радиусом 20,3±4 нм и 18,4±3,4 нм, соответственно.

Таким образом, применение двух стадий хроматографической очистки является достаточным для получения чистых препаратов рецепторов ЬАВШз2 и ЬМС2Я. Однако, не все молекулы рецепторов в препаратах, полученных таким образом, являются функционально активными. Некоторая часть молекул

при экстракции детергентами или же при проведении хроматографических процедур утрачивает правильную конформацию. Поэтому для выделения активной формы рецепторов требуется проведение аффинной хроматографии.

Аффинная хроматография рецепторов

Разделение активной и неактивной форм молекул рецепторов осуществляли на сорбентах, к которым были присоединены лиганды, специфичные для выделяемого рецептора.

Аффинный сорбент «альпренолол-сефароза CL-4B» для выделения активной формы рецептора hADRb2 был получен путем ковалентного присоединения антагониста рецептора - альпренолола к частицам сефарозы (Tedesco et al, 1988). Элюция функционально активного белка осуществлялась буфером, содержащим 1 мМ антагониста альпренола. Потери рецептора в ходе аффинной хроматографии составили порядка 30%. Заметим, что данный метод является не только методом очистки, но также и доказательством функциональной активности молекул hADRb2. Выход очищенного белка составил свыше 1 мг/л культуры, что более чем в пять раз превышает аналогичные показатели для этого рецептора, которые можно встретить в литературе (Noguchi et al, 2006).

Для разделения активной и неактивной форм молекул рецептора hMC2R был получен сорбент «АСТН-ВЮ-streptavidin-sepharose НР». Биотинилиро-ванный АСТН инкубировали в течение ночи с «streptavidin-sepharose HP» (GE Healthcare). Затем колонку отмывали от остатков несвязавшегося лиганда и инкубировали с препаратом hMC2R. Элюция рецептора в комплексе с адрено-кортикотропным гормоном осуществлялась 5 мМ биотина. Для очистки рецептора от примесей белкового лиганда и биотина использовали концентрирование на мембранах с MCWO - 100 КДа. В результате, с 1 литра культуры удалось получить 1,5 мг очищенного hMC2R.

В результате, были получены чистые препараты функционально активных рецепторов hADRb2 и hMC2R, причем выход белка составил не менее 1 мг/л в каждом из случаев. Такие высокие выходы являются дополнительным аргументом в пользу использования метилотрофных дрожжей для получения функционально активных GPCR. Наряду с эффективными дрожжевыми

20

штаммами-продуцентами, разработанные в данной работе универсальные методы выделения и очистки активных форм рецептора закладывают надежную основу для проведения широких структурных и биологических исследований СРСЯ.

Использование ИАОКЬ2 в качестве антигена для определения титра ауто-антител

В работе использовались сыворотки пациентов НЦ «Неврологии» РАМН и 2-го неврологического отделения РДКБ Росздрава с миастенией и рассеянным склерозом. Исследование проводилось совместно с сотрудниками НЦ «Неврологии» РАМН к.б.н В.Б. Ланцовой и к.м.н Е.К. Сепп.

Миастения и рассеянный склероз - хронические инвалидирующие аутоиммунные заболевания, антигенные мишени которых охарактеризованы и используются для диагностики. Однако существуют работы, в которых обозначена определенная роль ЬАБИЬ2 в развитии данных патологий. К примеру, показано участие молекул бета2-адренергических рецепторов в патогенезе рассеянного склероза. (2оикоБ е1 а!., 2003) и миастении (Хи, 2000). Поэтому в практической медицине существует острая потребность в создании дополнительных тест-систем для более детального описания и, как следствие, эффективного лечения тяжелых полисимптомных заболеваний. В частности, в настоящей работе, был предложен метод определения титра антител к бета2-адренорецептору.

На 96-ти луночные планшеты сорбировали мембранную фракцию, содержащую рекомбинантный ЬАОШй, в концентрации 4 мкл/лунку или очищенный белок (10 мкг рецептора на лунку) и инкубировали в течение 12 часов. В качестве отрицательного контроля использовали мембранную фракцию с гетерологичным ЬМС2Я. Неспецифическое связывание блокировали 2% раствором БСА в РВ8/Твин-20. Затем вносили анализируемые сыворотки в разведении 1:100. Интенсивность взаимодействия определяли хромогенной реакцией с использованием коньюгата пероксидазы с антителами против Рс-фрагмента человека при помощи планшетного ридера при длине волны 450 нм.

При испытании новой тест-системы (ИФА) на основе гетерологичного ЬАОЯЬ2 были обнаружены аутоантитела у 12 из 40 больных миастенией и у 1 из 12 больных рассеянным склерозом, что согласуется с данными других авторов (У1 е{ а1, 1995). В контрольной группе, включающей 10 здоровых человек, антитела к ЬАОЯЬ2 не выявлялись. Таким образом, показана возможность использования гетерологического 1тА1ЖЬ2 в качестве антигена при разработке новых тест систем на основе ИФА, которые могут применяться в практической медицине.

Молекулы рецептора, находящиеся в мембранной фракции Р. раяЮт и в мицеллах детергента, были охарактеризованы по степени взаимодействия с аутоантителами в присутствии лекарственных субстанций: неселективного бе-та-адреноблокатора - альпренолола и селективных бета2-адреномиметиков сальбутамола и кленбутерола. Анализ проводился аналогичным образом. В качестве отрицательных контролей использовали мембранную фракцию дрожжей, содержащую гетерологичный ЬМС2Я (контроль взаимодействия) и лекарственный препарат, не обладающий адренергической активностью - ампициллин. Аутоантитела содержались в сыворотках больных, анализируемых ранее.

Структурные исследования показывают, что при взаимодействии АОШ>2 с его агонистом или антагонистом рецептор переходит в различные активированные состояния, которые заметно различаются по топологии трансмембранных сегментов. (Кай^сИ е1 а1, 2011). Предполагается, что данное обстоятельство будет оказывать влияние на связывание А011Ь2 с его аутоан-тителом.

Результаты опыта показали, что адреномиметики повысили аффинность аутоантител в среднем на 14 - 15%, а адреноблокатор оказал противоположный эффект (- 15,4 %) на связывание. Данный интересный факт, по-видимому, связан также с их терапевтическими эффектами, а предложенный подход можно использовать для более детального изучения лекарственных субстанций.

Реакция Мембранная фракция с hADRb2, опт. ед Фракция МХАХ hADRb2, опт. ед Мембранная фракция с MC2R, опт. ед

Сыворотка 0.32Ю.021 0.55+0.011 0.095±0.011

Сыворотка + альпренолол 0.27±0.011 (-15.4%) 0.455±0.011 (-17.2%) 0.09310.011

Сыворотка + сальбутамол 0.368±0.016 (+ 15.0%) 0.656±0.026 (+ 19.3%) 0.098±0.022

Сыворотка + кленбутерол 0.364 ±0.011 (+ 13.8%) 0.635±0.016 (+15.4%) 0.096±0.026

Сыворотка + ампициллин 0.33+0.016 0.54±0.022 0.095±0.011

ВЫВОДЫ

1. На основе клеток метилотрофных дрожжей Pichia pastoris получены эффективные системы гетерологичной экспрессии генов бета2-адренергического рецептора, рецептора-3 дофамина, рецептор-1 галанина, рецептора 174, рецептора-2 меланокортинов., обеспечивающие биосинтез целевых белков в количестве свыше 20 мг/л при оптимизированных условиях культивирования.

2. На основе клеток бактерий Е. coli разработаны оригинальные методы получения АСТН и его производных АСТН-ВЮ и ACTH-V5. Выход очищенных гормонов составил не менее 100 мг/л для АСТН и ACTH-V5 и не менее 15 мг/л для биотинилированной формы АСТН-ВЮ.

3. Разработан метод для тестирования функциональной активности мелано-кортинового рецептора. Впервые показано, что hMC2R, локализованный в мембранной фракции дрожжей, функционально активен. Измеренная величина константы диссоциации комплекса hMC2R и АСТН составила 0,23 нМ.

4. Разработаны методы аффинной хроматографии для выделения hMC2R и hADRb2 в функционально активном состоянии. Выход активного белка составил более 1 мг/л

5. Показано использование рекомбинантного hADRb2 в качестве антигена для определения титра аутоантител против бета2-АР в сыворотке больных миастенией и рассеянным склерозом, а также изучено влияние лекарственных субстанций - альпренолола, кленбутерола и сальбутамола на аффинность аутоантител к бета2-АР.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Герасимов A.C., Шульга A.A., Зейналов O.A., Скрябин К.Г. Синтез ге-терологичных GPCR в клетках метилотрофных дрожжей P.pastoris // Доклады академии наук. 2011. Т.441. №5. С. 703 - 706.

2. Герасимов A.C., Зейналов O.A., Эльдаров М.А., Шульга A.A. Биосинтез Ь2-адренергического рецептора человека в клетках метилотрофных дрожжей P.pastoris и его очистка // Молекулярная биология. 2012. Т.46. №2. С. 311 -319.

3. Герасимов A.C. GPCR как основа для создания нанодетекторов // Материалы всероссийской научной школы для молодёжи «Горизонты нанобио-технологии», 12 - 16 октября 2009. Москва. С. 25-26.

4. Герасимов A.C., Шульга A.A., Зейналов O.A., Скрябин К.Г. Новый подход для качественного и количественного определения адренокортико-тропного гормона человека // VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2010». 24 -26 ноября 2010. Москва. Сборник трудов под редакцией академика РАМН В.И. Покровского. Том IV. С. 297 - 299.

5. Герасимов A.C., Шульга A.A., Зейналов O.A., Скрябин К.Г. Рекомби-нантные рецепторы, сопряженные с G-белком, как основа для создания нанодетекторов // VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2010». 24 - 26 ноября 2010. Москва. Сборник трудов под редакцией академика РАМН В.И. Покровского. Том V.C. 137- 138.

6. Герасимов A.C., Ланцова В.Б., Сепп Е.К., Шульга A.A., Зейналов O.A., Скрябин К.Г. Разработка тест-системы на основе иммуноферментного анализа для определения уровня аутоантител р2-адренергического рецептора в сыворотках пациентов с аутоиммунными заболеваниями // VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2010». 24 - 26 ноября 2010. Москва. Сборник трудов под редакцией академика РАМН В.И. Покровского. Том IV. С. 295 - 297.

7. Герасимов A.C., Ланцова В.Б. ИФА для определения антител к ADRB2 при миастении и рассеянном склерозе // XVIII российская конференция «Нейроиммунология». 27 - 30 сентября 2011. Санкт-Петербург. Сборник тезисов. С. 50.

Заказ № 99-П/01/2012 Подписано в печать 310.01.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Герасимов, Андрей Сергеевич, Москва

61 12-3/592

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ЦЕНТР «БИОИНЖЕНЕРИЯ» РАН

На правах рукописи

Герасимов Андрей Сергеевич

Синтез гетерологичных вРС!* в клетках метилотрофных

дрожжей Р/с/?/а раБ^пэ

03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Зейналов Орхан Ахмедович Шульга Алексей Анатольевич

Москва-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ 7

Глава 1. Обзор литературы 10

1.1. Основные сведения о рецепторах, сопряженных с G-белком 10

1.1.1. Общие представления о рецепторах семейства GPCR 10

1.1.2. Механизмы активации рецепторов и трансдукции 14

1.1.3. Физиологическая роль рецепторов, сопряженных с G-белком 19

1.2. Основные подходы получения мембранных рецепторов 20

1.2.1. Получение рецепторов из природных источников 20

1.2.2. Гетерологичная экспрессия генов рецепторов семейства GPCR 21

1.2.3. Выделение и очистка мембранных белков 34

1.2.4. Основные методы восстановления липидной среды для мембранных рецепторов 42

1.3. Заключение 50

Глава 2. Материалы и методы 51

2.1. Реактивы и оборудование 51

2.2. Ферменты и коммерческие наборы 53

2.3. Штаммы используемых микроорганизмов 53

2.4. Среды для выращивания Е. coli 53

2.5. Среды для выращивания Р. pastoris . 54

2.6. ДНК манипуляции и компьютерные программы 55

2.7. Синтетические олигонуклеотиды 55

2.8. Рекомбинантные плазмиды 56

2.9. Общие методы генетической инженерии и молекулярной биологии 56

2.10. Конструирование векторов экспрессии 57

2.10.1. Конструирование векторов pVR2GPCRHis 57

2.10.2. Конструирование вектора pVR2aMC2RHis 59

2.10.3. Конструирование векторов pTSA, pTSAV5, pTSABio 60

2.10.4. Конструирование векторов pET32aMisticMC2R, pET32aMisticADR.B2 61

2.11. Трансформация векторных конструкций в P. past or is 61

2.12. Бактериальный биосинтез и очистка вариантов АСТН 62

2.13. Анализ уровня экспрессии генов GPCR 63

2.14. Культивирование штаммов-продуцентов GPCR 64

2.15. Получение препаратов мембранной фракции с гетерологичными

hADRb2 и hMC2R 65

2.16. Культивирование штаммов Е. coli - продуцентов hADRb2 и hMC2R

и получение препаратов мембранной фракции 65

2.17. Подбор условий экстракции hADRb2 и hMC2R 66

2.18. Выделение hADRb2 и hMC2R 67

2.19. Очистка hADRb2 и hMC2R 67

2.20. Оценка гомогенности препаратов солюбилизированных рецепторов

и размера полученных мицелл 68

2.21. Приготовление альпренолол-сефарозы CL-4B 68

2.22. Приготовление АСТН-ВЮ-стрептавидин сефарозы 69

2.23. Аффинная хроматография рецепторов 69

2.24. Тестирование функциональной активности hMC2R 70

2.25. Определение константы диссоциации комплекса hMC2R-ACTH 70

2.26. Определение аутоантител hADRb2 71

2.27. Статистическая обработка результатов 72

Глава 3. Результаты и обсуждения 73

3.1. Общие сведения о рецепторах, используемых в данной работе 73

3.2. Конструирование экспрессионных векторов для синтеза

GPCR и их лигандов 76

3.3. Получение штаммов-продуцентов GPCR и их общая характеристика 79

3.4. Оценка факторов, влияющих на синтез и активность GPCR 82

3.5. Получение АСТН и его производных 84

3.5.1. Разработка гибридной технологии экспрессии АСТН 84

3.5.2. Особенности бактериального синтеза 86

3.5.3. Выделение и очистка вариантов АСТН 87

3.6. Изучение функциональной активности hMC2R рецептора 89

3.6.1. Тестирование функциональной активности hMC2R рецептора 89

3.6.2. Определение константы диссоциации рецептора с АСТН 91

3.6.3. Влияние механизма транслокации рецептора на уровень экспрессии

гена hMC2R в дрожжах и функциональную активность рецептора 93

3.6.4. Сравнение АСТН-связывающей способности hMC2R рецептора, полученного в бактериальной и дрожжевой 94

3.7. Выделение и очистка hMC2R и hADRb2 95

3.7.1. Подбор условий солюбилизации рецепторов 95

3.7.2. Очистка hMC2R и hADRb2 рецепторов 97

3.7.3. Аффинная хроматография рецепторов 101

3.8. Использование гетерологиушого hADRb2 рецептора в медицинских целях 102

3.8.1. Определение аутоантител hADRb2 рецептора 102

3.8.2. Изучение взаимодействия аутоантител с hADRb2 в присутствии лекарственных субстанций 103 ВЫВОДЫ 104 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 105

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

GPCR G-protein coupled receptor, рецепторы, сопряженные (связанные) с G-белком

hADRb2 Бета2-адренергический рецептор человека

hDRD3 Рецептор-3 дофамина человека

hGALRl Рецептор-1 галанина человека

hGPR174 Рецептор 174 человека

hMC2R Рецептор-2 меланокортинов человека

кДа Килодальтон

bp Пар оснований

CHAPS 3-[(3-СЬо1ат1^ргору1)ШтеШу1аттошо]-1-ргорапе8иНгопа(е

AOX Алкоголь оксидаза

ACTH Адренокортикотропный гормон

OD Оптическая плотность

DDT дитиотреитол

a.o. Азотистое основание

БСА Бычий сывороточный альбумин

ИФА Иммуноферментный анализ

MXAX Металлохелатная аффинная хроматография

ИПТГ Изопропил-в-0-1-тиогалактопиранознд

ПЦР Полимеразная цепная реакция

ГАМК Гамма-аминомасляная кислота

ПААГ Полиакриламидный гель

ГТФ (АМФ) Гуанозинтрифосфат (аденозинмонофосфат)

цАМФ Циклический аденозинмонофосфат

ФМН Флавинмононуклеотид

ПБЛМ Плоская бислойная липидная мембрана

KKM Критическая концентрация мицеллообразования

ПАВ Поверхностно активные вещества

ГЛБ Гидрофильно-липофильный баланс

АЧ Агрегационное число

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

дмсо Диметилсульфоксид

ВВЕДЕНИЕ

Способность воспринимать и распознавать информацию, получаемую из окружающей среды, является одним из важнейших свойств живых организмов. На сегодняшний день подробно изучены физиологические основы сигнальных механизмов, однако, их понимание невозможно без детальных биофизических и биохимических исследований всех вовлеченных молекулярных структур, к числу которых относятся рецепторы, сопряженные с G-белком.

Рецепторы, сопряженные с G-белком, (GPCR или 7ТМ-рецепторы) представляют собой крупнейшее семейство интегральных трансмембранных белков человека. Эти рецепторы являются ключевыми элементами механизмов молекулярного распознавания и саморегуляции эукариот. Взаимодействуя с такими лигандами, как гормоны (адреналин, норадреналин), цитокины (лимфокины, интерлейкины), хемокины, аттрактан-ты (феромоны, различные запахи) и нейротрансмиттеры (ГАМК, допамин, серотонин), рецепторы, расположенные на специализированных клетках, участвуют в большинстве физиологических процессов в организме, а их дисфункция приводит к серьезным патологиям. Последние фундаментальные исследования в области биохимии, молекулярной и клеточной биологии показывают их важную роль во многих слабоизученных внутриклеточных механизмах.

Важно отметить, что рецепторы семейства GPCR являются молекулярными мишенями для более половины известных лекарственных препаратов, вследствие чего проявляется их терапевтический эффект. Следовательно, любые исследования, направленные на изучение структурных особенностей, свойств и механизмов функционирования GPCR, являются предпосылками для создания лекарств нового поколения.

Несмотря на уникальность, многообразие и важность рецепторов, на сегодняшний момент имеются подробнее данные о кристаллических структурах родопсинов человека и быка, бета1- и бета2-адренергических, аденозинового Агл и хемокинового CXCR4, гистаминового Hi рецепторов человека. Этот факт объясняется низким уровнем экспрессии GPCR в хозяйских клетках, гетерогенностью и нестабильностью молекул вне липидного бислоя. Применение методов генетической инженерии и подходов гетерологичной экспрессии генов помогает получить требуемое количество целевых белков для изучения молекулярных участников процесса передачи сигнала.

Использование клеточной системы Е. coli позволяет наработать достаточные количества GPCR, однако, бактериальные клетки зачастую не способны синтезировать

рецепторы с нативной третичной структурой, осуществлять их процессинг, вследствие чего, значительно уменьшается или не наблюдается их функциональная активность. Длительность, трудоемкость и дороговизна - характерные черты экспрессии при использовании клеточных линий млекопитающих и насекомых.

Перспективной является система экспрессии на основе клеток метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. Клетки низших эукариот данного вида обладают развитой системой шероховатого эндоплазматического ретикулума для осуществления разнообразных посттрансляционных модификаций белков и схожим с клетками млекопитающих строением цитоплазматической мембраны. Как показывает практика, системы на основе Р. pastoris идеально подходят для получения высокотоксичных трансмембранных белков, поскольку дрожжи можно выращивать в больших объемах до высоких плотностей и эффективно контролировать уровень транскрипции целевых генов, используя строго индуцибельные промоторы. В этой связи весьма актуальным является проведение работ, посвященных получению перспективных штаммов-продуцентов для синтеза гетерологичных GPCR, в количествах, требуемых для структурных и молекулярно-биологических исследований.

Целью настоящей диссертационной работы является разработка эффективных систем гетерологичной экспрессии генов GPCR на основе клеток метилотрофных дрожжей Р. pastoris, изучение их функциональной активности и разработку подходов для выделения и очистки функционально активных рецепторов.

Для этого в работе решались следующие задачи:

1. Получение экспрессионных конструкций, содержащих рекомбинантные гены бета2-адренергического (hADRb2), дофаминового (hDRD3), галанинового (hGALRl) рецепторов, рецептора 174 (hGPR174), рецептора-2 меланокортинов (hMC2R) человека.

2. Создание штаммов Р. pastoris - продуцентов данных интегральных мембранных протеинов и оптимизация условий их культивирования.

3. Разработка эффективных протоколов выделения и очистки гетерологичных рецепторов (на примере бета2-адренергического рецептора и рецептора - 2 меланокортинов) из мембранной фракции дрожжей, создание аффинных сорбентов для отделения функционально-активных форм молекул и изучение гомогенности полученных белковых препаратов.

4. Разработка метода тестирования функциональной активности рецепторов с лигандами пептидной природы, на примере рецептора - 2 меланокортинов,1 который

включает в себя создание эффективной системы экспрессии на основе клеток Е. coli для его природного лиганда - адренокортикотропного гормона (АСТН).

В настоящей диссертационной работе предложены новые стратегии получения рецепторов в клетках Р. pastoris, позволяющие наработать миллиграммовые количества функционально активных белков для структурных и биологических исследований.

Разработан оригинальный подход тестирования функциональной активности рецепторов с лигандами белковой природы. Впервые показано, что рецептор меланокор-тинов, локализованный в мембранной фракции дрожжей, способен связываться с адре-нокортикотропным гормоном. Специфичность взаимодействия была подтверждена расчетом величины константы связывания рецептора с АСТН. Установлено, что, hMC2R, продуцируемый в клетках Е. coli и локализованный в бактериальной мембране, не связывается с лигандом.

Разработан оригинальный метод получения адренокортикотропного гормона и его производных для решения различных молекулярно-биологических задач.

Показана возможность использования гетерологичного hADRb2 в качестве антигена при разработке тест-систем для определения антител к рецептору, что может иметь большое значение в клинической медицине, и определяет практическую значимость данной работы. Изучены особенности взаимодействия гетерологичного hADRb2 с его аутоантителом в присутствии агонистов и антагониста рецептора.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные сведения о рецепторах, сопряженных с G-белком 1.1.1. Общие представления о рецепторах семейства GPCR

Рецепторы, сопряженные с G-белком (G-protein coupled receptor, GPCR) представляют собой крупнейшее семейство белков человека (Pierce et al, 2002). Структурной особенностью интегральных трансмембранных протеинов данного класса является то, что они, состоят из семи альфа-спиральных трансмембранных сегментов, соединенных чередующимися внутри- и внеклеточными петлями. JV-конец расположен снаружи, С-конец внутри. Гидрофобные спирали в цитоплазматической мембране клеток располагаются определенным образом, образуя полость для связывания лигандов. Третья внутриклеточная петля содержит высококонсервативный мотив, требуемый для связывания с альфа-субъединицей гетеротримерного G-белка (рис. 1).

Рисунок 1. Общая модель строения рецепторов семейства GPCR.

Установлено, что геном человека содержит свыше 800 генов, кодирующих ОРС^ что составляет приблизительно треть всех белок-кодирующих генов (ЬшкЫгот, 2006). Однако, учитывая полиморфизм нуклеотидных последовательностей, субклеточные и тканеспецифичные профили экспрессии генов, а также альтернативный сплайсинг, действительное количество рецепторных молекул существенно выше.

Данные различных исследований показывают, что в-белок опосредованная передача сигналов при помощи рецепторов имеет место также и у грибов, в том числе

дрожжей, растений, простейших (Elion, 2000, Fujisawa et al, 2001, Kim et al, 1996). В данном контексте, очевидную научную важность представляет изучение сигнальных систем и их молекулярных структур, в качестве одного из факторов эволюционного процесса. К примеру, протео-, гало- и бактериородопсины, также состоящие из 7 трансмембранных альфа-спиралей, являются ключевыми участниками хлорофилл-независимого фотосинтеза соответствующих видов бактерий и определяют их способность к фототаксису (Sineshchekov et al, 2002). Светочувствительные мембранные белки прокариот подобны родопсинам животных не только топологически, но и по конфигурации активного центра, в котором расположена молекула хромофора, ковалентно связанная с рецептором (Waschuk et al, 2005). Все эти структурные и функциональные свойства родопсинов бактерий и эукариот предполагают их общее происхождение, однако, сравнительный анализ аминокислотных последовательностей не предоставляет убедительных доказательств существования эволюционной связи между ними (Soppa, 1994).

В целом, несмотря на структурную и функциональную гомологию, молекулы рецепторов заметно различаются. Данное обстоятельство позволяет их классифицировать на несколько классов.

Класс А - родопсин-подобные рецепторы (Rhodopsin-like receptor). Самый обширный и хорошо изученный класс GPCR, молекулы которых по своей структуре сходны с

! ■ ч ' < ¡ t > '

родопсином - «зрительным пурпуром» и адренергическими рецепторами (Рис. 2а). Общая гомология рецепторов класса А низка и сводится к нескольким высококонсервативным аминокислотным остаткам, в частности, аргинин в мотиве Asp/Glu-Arg-Tyr (DRY/ERY - мотивы) на цитоплазматической стороне третьего трансмембранного сегмента (Park, et al, 2008). Гликопротеины со структурными элементами родопсин-подобных GPCR были обнаружены у древних билатеральных животных и медуз, что говорит об их возникновении в протерозое приблизительно 570 - 700 млн. лет назад (Benton и Ayala, 2003, Feng et al, 1997).

К этой группе относятся рецепторы пептидных гормонов: ангиотензина, нейро-пептида Y, хемокинов (интерлейкин-8), фактора комплемента С5А, соматостатина, опио-идов, брадикининов, меланокортинов и др., а также низкомолекулярных нейротрансмит-теров - серотонина, адреналина, норадреналина. Последние, по-видимому, являются одними из самых древнейших сйгнальных белков, которые встречаются у актиний, плана-рий и нематод (Peterson и Butterfield, 2005, Bouchard et al, 2003). Отметим, что к данному

классу относятся обонятельные рецепторы, известное количество видов которых неуклонно возрастает.

Класс В - секретин-подобные peifenmopu (secretin-like receptor) представлены несколькими десятками разновидностей, имеющими в качестве лигандов разнообразные гормоны и нейропептиды, такие как вазоактивный интестинальный пептид (VIP), глюкозозависимый инсулинотропный пептид, кальцитонин, глюкагон и др. Предположительный эволюционный возраст секретин-подобных GPCR составляет 550 млн. лет и тесно связан с эволюцией билатеральных животных (Schioth et al, 2005). Кроме ди-сульфидного мостика между вторым и третьим внеклеточными участками, данные рецепторы не имеют общих черт с родопсин-подобными (рис. 26). Например, важный для подсемейства А DRY-мотив отсутствует, а консервативные пролины резко отличаются по расположению. Наиболее характерный признак GPCR класса В - это длинный (около 100 а.о.) внеклеточный TV-конец, в котором несколько цистеинов (С) формируют сеть дисульфидных мостиков. Продолжительный jV-концевой участок, по-видимому, играет одну из ключевых ролей при связывании с лигандами, что показано для секретина и глюкагона (Nordstrom et al, 2009). Однако данное взаимодействие, вероятнее всего, не является достаточным условием для активации внутриклеточных сигнальных путей. Имеются работы по изучению взаимодействий лигандов со спиральными сегментами рецепторов, но в настоящее время не получено данных рентгеноструктурного анализа, подтверждающих связывание пептида в «трансмембранном кармане» (Cardoso et al, 2006).

Класс С - метаботропные рецепторы (Metabotropic glutamate and pheromone receptors). К данной группе относятся метаботропные глутаматные рецепторы, рецепторы ГАМК, �