Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия нативного и модифицированного генов иммунного интерферона быка в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия нативного и модифицированного генов иммунного интерферона быка в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ГРАДОБОЕВА Анастасия Евгеньевна

На правах рукописи

□□3493638

ЭКСПРЕССИЯ НАТИВНОГО И МОДИФИЦИРОВАННОГО ГЕНОВ ИММУННОГО ИНТЕРФЕРОНА БЫКА В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ БАССНАЯОЖСЕБ СЕЯЕУШАЕ И РЮША РАБТОШБ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010

- 4 /14 А О ?Щ

003493638

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете в лаборатории биохимической генетики кафедры генетики и селекции

Научный руководитель: доктор биологических наук

Падкина Марина Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, академик

РАСХН, профессор, директор Всероссийского НИИ сельхозмикробиологии Тихонович Игорь Анатольевич;

доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник отдела молекулярной генетики НИИЭМ СЗО РАМН Мандельштам Михаил Юрьевич

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН

Защита состоится « Я » ~_2010 г. в часов на

заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан « 40 » 20 Юг.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За последнее десятилетие иммунология претерпела глубокие изменения в связи с доказательством того, что иммунная система регулируется пептидными гормонами - цитокинами, действия которых подчиняются тем же закономерностям, что и процессы с участием классических гормонов и их рецепторов (Завьялов, 1993). На данный момент известна первичная структура нескольких десятков цитокинов, обеспечивающих дистанционное взаимодействие иммунокомпетентных клеток между собой. Изучение цитокинов имеет не только теоретическое, но и прикладное значение (Кетлинский, 1992).

Наиболее широкое применение в клинической практике получили интерфероны (ИНФ), представляющие собой естественную систему противовирусной защиты организма, а также оказывающие иммуностимулирующее, противовоспалительное, противоопухолевое и антимитотическое действие (Ершов и др., 1996). ИФН-у, иммунный, синтезируется Т-лимфоцитами после стимуляции их митогенами, антителами, интерлейкином-2.

Иммунные интерфероны млекопитающих повышают бактерицидную и фунгицидную активность макрофагов и являются эффективными препаратами для лечения и профилактики различных заболеваний животных. Использование интерферонов в качестве лекарственного средства имеет существенные преимущества по сравнению с антибиотиками и химиотерапевтическими препаратами за счет широкого спектра действия, обусловленного активацией иммунной системы, и из-за отсутствия побочных эффектов.

С разработкой методов работы с ДНК in vitro появилась возможность клонировать и экспрессировать чужеродные гены в различных прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах и получать рекомбинантные белки в значительных количествах. Впервые препараты рекомбинантных цитокинов были получены из бактерий Escherichia coli (Дебабов, 1985). Однако E.coli являются условно патогенными микроорганизмами, и получаемый белок не удается полностью очистить от продуктов жизнедеятельности бактерий, поэтому препарат в той или иной степени является токсичным, что ограничивает применение его в медицине (Primrose, 1986). Использование непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не содержащих токсических и пирогенных факторов, в качестве продуцентов рекомбинантных цитокинов млекопитающих позволяет использовать эти белки в ветеринарии.

Используя системы экспрессии различных видов дрожжей, а также подбирая условия культивирования, можно добиться достаточно высокого уровня выхода рекомбинантного белка. Однако следует отметить, что целью подобных экспериментов является, в основном, повышение продукции гетерологичных белков. При этом мало внимания уделяется самим продуцентам и процессам, происходящим в клетках микроорганизмов во

время синтеза чужеродных белков. Очевидно, что такие исследования необходимы для успешного решения основной задачи биотехнологии -увеличения выхода целевого продукта.

Целью данной работы являлось получение штаммов дрожжей Басскаютусез сегеУ1Ч1ае и Р1сЫа рахЮш - продуцентов биологически активного ИФН-у быка и изучение особенностей продукции гетерологичного белка клетками двух видов дрожжей.

В задачи исследования входило:

- получение вектора экспрессии, обеспечивающего синтез нативного и модифицированного у-интерферона быка в клетках дрожжей Р.

получение штаммов-продуцентов биологически активного ИФН-

у быка на основе дрожжей & сегеу'тае и Р. рая1о№;

изучение протеолитической стабильности нативного и

модифицированного белков;

- сравнение эффективности дрожжей сегеушае и Р. ра$1от в качестве систем экспрессии гетерологичных генов;

- изучение влияния экспрессии гетерологичного гена на клетку-хозяина.

Научная новизна исследования. Впервые получен штамм дрожжей Р. разгопз - продуцент модифицированного ИФН-у быка, обладающего повышенной протеолитической стабильностью. Впервые показано, что продукция рекомбинантного ИФН-у быка приводит к повышению количества карбонилированных белков в клетках дрожжей и вызывает изменения, подобные оксидативному стрессу. Установлено, что дрожжи Р. раз1оп$ являются более устойчивыми к различным стрессорным факторам. Показано, что в клетках дрожжей Р. раМог'м синтезированный белок находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в случае сегйУ«;ае он образует так называемые «тельца включения». Впервые показано, что сигнал ядерной локализации ИФН-у млекопитающих обеспечивает транспорт гетерологичного белка в ядро дрожжевой клетки, что свидетельствует об эволюционной консервативности этого процесса.

Практическая значимость. Штаммы дрожжей & сегт'.уме и Р. рая1опз, синтезирующие и аккумулирующие рекомбинантный ИФН-у быка внутри клеток, могут быть использованы в качестве иммунопробиотической кормовой добавки для профилактики различных заболеваний животных. Штамм - продуцент модифицированного ИФН-у может быть использован для получения рекомбинантного белка и создания на его основе лекарственного препарата, аналоги которого в настоящее время в России отсутствуют.

Положения, выносимые на защиту:

1. Продукция рекомбинантного ИФН-у быка оказывает на клетки

дрожжей негативное влияние, подобное оксидативному стрессу. Различная устойчивость дрожжей 5. сегеушяе и Р.

pastoris к негативному воздействию продукции чужеродного белка обусловлена особенностями метаболизма.

2. Деления десяти аминокислот на С-конце молекулы ИФН-у быка повышает устойчивость белка к протеолитической деградации, не оказывая влияния на его биологическую активность.

3. В молекуле ИФН-у быка имеется сигнал ядерной локализации, который выполняет свою функцию в клетках дрожжей.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Московском международном конгрессе «Биотехнология -состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), на XXII международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Словакия, Братислава, 2005), в работе Школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, Пущино, 2006), на Седьмой международной научно-практической конференции «Исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 1 статья, 2 патента и 4 тезисных сообщения.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 131 машинописной странице, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 194 наименования, и приложения. Работа содержит 3 таблицы и 29 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы. В работе использованы следующие штаммы дрожжей S. cerevisiae: 1-GRF18 (МАТа his3-ll,15 Ieu2-31,1I pho3-l); 2P4-GRF18 (МАТа his3-ll,15 Ieu2-31,11 pep4)\ D576 (85-D600X62-D563: МАТа leu2 arg4 HIS3 pho3X MATa leu2 ARG4 his3 pho3) из коллекции лаборатории биохимической генетики, а также штамм дрожжей Р. pastoris GS115 (his4) (Invitrogen).

Плазмиду pYGIB, содержащую ген bIFNG под контролем промотора и терминатора гена РН05 дрожжей S. cerevisiae (Мясников и др., 1989), использовали для создания штаммов дрожжей-сахаромицетов - продуцентов ИФН-у быка.. В данной работе были получены плазмиды pBIG, pPIC9/BIGdl0, pBIG/GFP и pBIGdlO/GFP которые содержали нативный (bIFNG) или модифицированный (bIFNGA30) структурные гены ИФН-у быка, или эти гены, сшитые с геном GFP, под контролем промотора и терминатора гена АОХ1 дрожжей Р. pastoris. (рис.1).

Рис.1. Схема плазмид pYGIB, pBIG, pBIGdlO, pBIG(pBIGdlO)/GFP.

Плазмиды pBIG, pBIGdlO были использованы для получения штаммов метилотрофных дрожжей - продуцентов рекомбинантных белков. Плазмиды pBIG/GFP и pBIGdlO/GFP использовали при изучении локализации рекомбинантного белка в дрожжевой клетке.

Методы. Выделение плазмидной ДНК из бактерий и хромосомной ДНК из дрожжей, рестрикционный анализ, электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из геля, лигирование, ПЦР, трансформацию бактерий и дрожжей проводили в соответствии со стандартными методиками (Birnboim а Doli, 1979; Маниатис и др., 1984; Fujimura, 1997).

Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1992). Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Иммунобллотинг проводили по стандартному методу (Bidwai, 1992). Биологическую активность рекомбинантного ИФНу определяли по подавлению цитопатической активности вируса везикулярного стоматита в культуре фибробластов трахеи эмбрионов коров (FBT) в соответствии с фармакологической статьей ФС 42-3433-97.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание штамма дрожжей S. cerevisiae - продуцента ИФН-у быка

Для создания штамма дрожжей S. cerevisiae - продуцента рекомбинантного ИФН-у быка плазмидой pYGIB (Мясников и др., 1989) трансформировали гаплоидные штаммы 1-GRF18, 2P4-GRF18 и диплоидный штамм D576, в которых экспрессия генов, клонированных под контролем промотора гена РН05, регулируется неорганическим фосфатом. На необходимость такой регуляции указывали ранее полученные данные о том, что продукция чужеродных белков негативно влияет на клетки дрожжей, снижая выход биомассы и, следовательно, значительно снижает количество полученного белка. Использование регулируемой экспрессии позволило уменьшить отрицательное воздействие ИФН-у на рост дрожжей продуцентов, но не повлияло на митотическую стабильность рекомбинантной плазмиды.

Штамм-продуцент на основе диплоидного штамма накапливал больше биомассы, но сравнение профилей элюции внутриклеточных белков диплоидного и гаплоидного штаммов при хроматографии на сефакриле S-200 показало наличие у диплоида большого количества примесных белков в области предполагаемого выхода ИФН-у, что существенно осложнило бы очистку рекомбинантного белка.

Уровень продукции ИФН-у быка был низким и не превышал 10 мг/л клеточной культуры даже у штамма 2P4-GRF18/pYGIB, у которого отсутствовала вакуолярная аспартилпротеаза А, принимающая участие в расщеплении гетерологичных белков (Woolford et al., 1986). Эти результаты позволили предполагать, что ИФН-у является токсичным для дрожжей S. cerevisiae.

Одним из путей снижения отрицательного воздействия чужеродного белка на жизнедеятельность клетки-хозяина является его секреция. Однако, ИФН-у является гликопротеином, а структура углеводных компонентов секретируемых белков дрожжей S. cerevisiae и млекопитающих различна (Schultz et al., 1987), что не позволяет использовать данный вид дрожжей для создания секреторного продуцента ИФН-у.

Особенности метаболизма дрожжей S. cerevisiae также создают неудобства использования их в качестве продуцентов рекомбинантных белков. В качестве конечного продукта усвоения углеводов образуется этанол, который ингибирует рост культуры, что также приводит к снижению продукции гетерологичного белка.

Как альтернативный организм-продуцент ИФН-у быка нами были выбраны дрожжи Р. pastoris, которые успешно используются для гетерологичного синтеза различных белков. Дрожжи Р. pastoris способны использовать метанол в качестве единственного источника углерода. Сильный промотор гена АОХ1, кодирующего структуру алкогольоксидазы -первого фермента утилизации метанола, регулируется источником углерода. (Cereghino а. Cregg , 2000).

2. Создание штамма дрожжей Р. раНош - продуцента рекомбинантного ИФН-у быка. Возможность получения штамма дрожжей Р. рая^ш, обеспечивающего продукцию рекомбинантного ИФН-у быка и секрецию синтезированного белка в культуральную жидкость была продемонстрирована ранее (Николаев и др., 2002). Было показано, что скорость роста штамма-продуцента не отличалась от исходного штамма, что говорило об отсутствии негативного влияния продукции рекомбинантного белка. Такие результаты могли быть связаны со снижением токсичности белка за счет секреции, или могли быть обусловлены особенностями самого штамма-продуцента.

Для выяснения этого вопроса получили штамм дрожжей Р. раз^пэ, обеспечивающий внутриклеточное накопление ИФН-у быка. Ген ЫРМС клонировали в векторе экспрессии рР1С9, предварительно удалив из него сигнальную область альфа-фактора дрожжей & сегеуи/ае ( МБа ), отвечающую за секрецию рекомбинантного белка в культуральную среду. Полученной плазмидой рВЮ трансформировали штамм дрожжей Р. р^от СБ 115. При сравнении скорости роста исходного штамма и штамма-продуцента в условиях индукции обнаружили, что синтез чужеродного белка не подавляет рост дрожжей Р. раяЮт, в отличие от 5". сегеу/яяе. При этом уровень продукции составлял около 20 мг/л.

Полученные данные позволяют говорить о том, что гетерологичный ИФН-у оказывает негативное влияние на жизнедеятельность дрожжей & сегеушае, но не влияет на Р. ра81оп$, даже при внутриклеточном накоплении. Кроме того выяснилось, что в клетках дрожжей Р. ра.Мопя значительная часть ИФН-у находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в клетках дрожжей 5. сегеушае рекомбинантный белок накапливается в виде так называемых «телец включения» и экстрагируется только с помощью детергентов (рис.2 ).

М 1 2 3 4 М '12 3 4

А В

Рис. 2. Иммуиоблот внутриклеточных белков штаммов 2Р4-СКП8/рУ(ЛВ (А) и С8115/рВ1С (В).

М - маркеры молекулярной массы; 1 - водорастворимые белки;

2,3,4 - экстракция 1%, 2,5% и 5% ДСН, соответственно.

Эти данные, свидетельствующие о том, что форма нахождения гетерологичного белка и степень его влияния на жизнедеятельность организма-продуцента зависят от вида используемых дрожжей, стали основанием для изучения влияния экспрессии гетерологичного гена на клетки дрожжей S. cerevisiae и Р. pastoris. Подобные исследования проводили для бактериальных клеток и обнаружили, что синтез гетерологичных белков вызывает в клетках бактерий Е. coli изменения, подобные оксидативному стрессу (Remaut et al, 1986). Однако, до настоящего времени отсутствовали данные о том, как изменяется физиологическое состояние дрожжей - продуцентов чужеродных белков.

3. Исследование адаптивной способности дрожжей S. cerevisiae и Р. pastoris к стрессорным воздействиям.

Одним из показателей оксидативного стресса является увеличение числа карбонилированных белков. Измерение содержания карбонильных групп в белках штаммов-продуцентов обоих видов дрожжей продемонстрировало их увеличение относительно исходных штаммов, выращенных в тех же условиях, приблизительно в 1,5 раза (рис.3).

IWDmo

0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 О

4P-GRF18 4P-GRF18/pYGIB GS115 GS115/pBIG

Рис. 3. Содержание карбонильных групп в клеточных белках исходных штаммов и штаммов-продуцентов.

(Относительное содержание карбонильных групп определяли как соотношение поглощения при длине волны 366 нм к поглощению при длине волны 280 нм).

Полученные данные свидетельствуют о том, что продукция ИФН-у является стрессорным фактором для обоих видов дрожжей и вызывает изменения, подобные оксидативному стрессу. Однако у P. pastoris не наблюдается негативного влияния рекомбинантного белка и не происходит подавления роста дрожжей-продуцентов.

Таким образом, дрожжи P. pastoris являются более устойчивыми к продукции гетерологичных белков, чем S. cerevisiae. Возможным объяснением этого явления может служить то, что метилотрофные дрожжи являются аэробными организмами, а дрожжи-сахаромицеты относятся к факультативным анаэробам, что обусловливает определенные особенности метаболизма, в частности, утилизация источников углерода у дрожжей Р. pastoris происходит за счет аэробного окисления, а у дрожжей S. cerevisiae, в основном, за счет брожения. Известно, что в клетках аэробных организмов в качестве побочных продуктов дыхания образуются активные формы кислорода (АФК), которые могут вызывать повреждения нуклеиновых кислот, белков, липидов и снижать жизнеспособность клеток (Cadenas, 1989). Штаммы-продуценты дрожжей P. pastoris растут на несбраживаемых источниках углерода, поэтому в течение всего периода культивирования у них активно функционируют митохондрии, вырабатываются АФК и увеличивается количество шаперонов и других белков, обеспечивающих защиту клеток от оксидативного стресса. В связи с этим, к началу синтеза гетерологичного белка в клетке дрожжей P. pastoris уже будет содержаться достаточно большое количество шаперонов, и, следовательно, они изначально оказываются более устойчивыми к стрессовым воздействиям, с которыми сталкивается клетка в процессе продукции чужеродного белка. Об этом свидетельствуют и наши данные о том, что уровень карбонилирования белков у исходного штамма P. pastoris превышает таковой у S. cerevisiae.

В работах по изучению влияния оксидативного стресса на клетки дрожжей было показано, что воздействие стрессорного фактора в небольшой дозе приводит к тому, что в дальнейшем клетка становится более устойчивой как к тому же виду стресса, так и к воздействиям других негативных факторов (Estruch, 2000). Если рассматривать продукцию рекомбинантных белков у штаммов-продуцентов рекомбинантного ИФН-у как процесс, являющийся стрессом для клетки хозяина, можно было ожидать, что будет наблюдаться устойчивость к другим видам стрессорных факторов. Действительно, клетки дрожжей-продуцентов рекомбинантного ИФН-у быка демонстрировали большую устойчивость к перекиси водорода, чем клетки исходных штаммов (рис. 4, 5). При этом рост дрожжей S. cerevisiae прекращался при меньших концентрациях Н202, чем рост дрожжей Р. pastoris, то есть дрожжи-сахаромицеты оказались менее приспособленными к воздействию оксидативного стресса, что, очевидно, объясняется особенностями метаболизма обоих видов дрожжей (Градобоева, Падкина, 2008).

1

2 3

Вр •

у.' 1 7 V 47 / / . \

А.

Рис. 4. Зависимость роста штаммов дрожжей Л", сетеу/я'ае 2Р4-СКГ18/р\'С1В (А) и 2Р4-С1Ш8 (В) от концентрации Н202.

1 пс ..л/1 о г*.

1 - 0,5 мМ Н20

2 - 1 мМ Н202

3 - 1,5 мМ Н202

Рис. 5. Зависимость роста штаммов дрожжей Р. ра$1от 15/рВ1С (А) и С8115 (В) от концентрации Н202.

1 - 1 мМ Н202

2 - 1,5 мМ Н202

з-зммн2о2

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что, помимо уже известных преимуществ использования дрожжей P. pastoris для экспрессии гетерологичных генов, мы наблюдаем более выраженную адаптацию самих клеток этого вида дрожжей к различным видам стрессорных факторов, в том числе к продукции гетерологичных белков, что обусловлено особенностями метаболизма данного вида дрожжей. Этим, вероятно, и объясняется тот факт, что накапливаемый в клетках дрожжей P. pastoris гетерологичный белок в основном находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как дрожжи S. cerevisiae аккумулируют чужеродный белок в виде «телец включения».

4. Получение модифицированного ИФН-у быка

Полученные нами штаммы дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris -продуценты ИФН-у быка можно использовать как кормовую иммунопробиотическую добавку. Однако, широкий спектр действия интерферонов, возможность лечения и профилактики различных заболеваний делает необходимым получение очищенного препарата ИФН-у быка. Выделение рекомбинантного белка из клеток дрожжей P. pastoris является трудоемкой процедурой, поэтому для этой цели лучше использовать секреторных продуцентов.

Ранее было показано, что секретируемый ИФН-у подвержен протеолитической деградации. Анализ аминокислотной последовательности ИФН-у человека выявил несколько потенциальных сайтов узнавания трипсиноподобными протеазами, два из которых расположены на С-конце молекулы (Татьков и др., 1995). Известно, что замена аминокислот в этой области приводит к потере биологической активности белка, тогда как удаление 10 аминокислот с С-конца молекулы ИФН-у человека не влияет на биологическую активность белка, а напротив, ведет к повышению его стабильности, поскольку повышает устойчивость к действию протеаз (Мирошников и др., 2005).

Исходя из известной гомологии ИФН-у млекопитающих (http://au.expasy.org/sprot/), предположили, что подобная модификация может стабилизировать ИФН-у быка. Мы получили ген bIFNGA30 с делецией тридцати пар оснований на 3'-конце, который кодирует модифицированный ИФН-у(ДЮ), лишенный 10 аминокислот в С-концевой части молекулы, и сравнили устойчивость секретированного модифицированного и нативного ИФН-у к протеолгоу. Результаты показали, что ИФН-у(ДЮ) действительно обладает повышенной стабильностью, как и в случае ИФН-у человека, и при этом сохраняет биологическую активность. Секретируемый модифицированный ИФН-у быка присутствует в культуральной среде даже через 72 часа, тогда как нативный белок за это практически полностью разрушается (рис. 6). Протеолитическая стабильность модифицированного ИФН-у, очевидно, повышает выход рекомбинантного белка по сравнению с нативным. Это позволяет в дальнейшем использовать штамм GS115(pPIC9/BIGdlO) для получения очищенного препарата ИФН-у быка.

Рис. 6. Электрофореграмма и денситограмма белков культуральной среды штаммов С8115(рР1С9(1РМ-у)) (А) и (¡8115(рШС(110) (В).

М - маркеры молекулярной массы

1, 2, 3 - спектры белков культуральной среды после 24, 48 и 72 часов индукции, соответственно

5. Изучение возможности функционирования сигнальной последовательности млекопитающих в клетках дрожжей

В связи с активным использованием дрожжей для производства рекомбинантных белков, представляют бесспорный интерес процессы, происходящие с чужеродными белками в клетке-продуценте. Известно, что ИФН-у человека, кроме опосредованного действия через систему вторичных мессенджеров, способен также сам попадать в ядро клетки млекопитающих за счет двух сигналов ядерной локализации (N1^): основного, локализованного в С-концевой части молекулы, и минорного, расположенного в центральной части белка (БиЬгаташат е/ а1, 1998). Исходя из известной консервативности структуры ИФН-у и высокой степени гомологии ИФН-у человека и ИФН-у быка (http://au.expasy.org/sprot/), мы предположили наличие подобных N1^ в молекуле ИФН-у быка.

Для того, чтобы проверить это предположение, а также выяснить, будет ли сигнал ядерной локализации млекопитающих выполнять свою функцию в клетках дрожжей, создали плазмиды рВЮЛЗРР и рВЮсНО/ОБР, в которых экспрессия генов 6/РМ7 и ЬШЫС^ЗО происходит совместно с экспрессией гена СРР.

Штаммы дрожжей, трансформированные плазмидами рВЮ/ОБР и рВЮсПОЛЗРР, культивировали в условиях индукции синтеза рекомбинантного ИФН-у и определяли его локализацию в клетках дрожжей.

Результаты, приведенные на рис. 7, свидетельствовали о том, что нативный ИФН-у быка в дрожжевой клетке преимущественно находится в ядре, тогда как модифицированный ИФН-у быка, лишенный 10 аминокислот в С-конце, которые, как предполагалось, содержат сигнал ядерной локализации, равномерно распределен в цитоплазме.

Рис.7. Локализация иативного (С115/рВ1С-СРР) и модифицированного (С. 8115/рВГСс1 10-ОКР) интерферона-гамма быка в клетках дрожжей РкЫарахЮп.ч

линия 1 - поляризационио-контрастиая микроскопия (а - С115/рВЮ-СКР; б -С8115/рВ1Сс110-СКР)

линия 2 - режим эпифлюориеценции (в - С115/рВГС-СКР; г - СвШ/рВЮсПО-СРР) (стрелками указаны окрашенные ядра)

Таким образом, полученные данные подтвердили гипотезу о том, что в молекуле ИФН-у быка также имеется сигнал ядерной локализации, расположенный в С-концевой части молекулы. Кроме того, сигнал ядерной

локализации высших эукариот выполняет свою функцию в клетках низших, что свидетельствует о консервативности процесса транслокации белков. Эти сведения необходимо учитывать в работах по гетерологичной экспрессии, так как попадание чужеродного белка в ядро или другой компартмент клетки-продуцента может оказывать негативное влияние, поскольку существует вероятность его участия в различных метаболических процессах клетки хозяина.

Таким образом, в результате данной работы, нами были получены штаммы дрожжей 5. сегеушяе и Р. раНогкч, осуществляющие синтез рекомбинантного ИФН-у быка и аккумуляцию его внутри клетки. Данные штаммы могут быть использованы в качестве кормовой добавки для крупного рогатого скота.

Определение продуктивности двух полученных штаммов показало, что уровень синтеза рекомбинантного белка составляет около 10 мг/л у штамма дрожжей 5. сегехч.чше 2Р4-СЯР18/рУСШ и 15-20мг/л у штамма дрожжей Р. ра.ч1от ОБ115/рВЮ.

Сравнивая кривые роста исходных штаммов и штаммов-продуцентов, мы выяснили, что синтез чужеродного белка является метаболической нагрузкой для клеток дрожжей Б.сегеу151ае, что выражается, в первую очередь в замедлении роста культуры. В случае Р.раз^т подавления роста не происходит. В то же время, синтез чужеродного белка является для клеток дрожжей Б. сетгиае и Р. раз^пя стрессорным фактором, о чем свидетельствует повышение уровня карбонилированных белков у штаммов-продуцентов. При этом дрожжи Р. раБШпБ оказались более устойчивыми к стрессовым воздействиям, что, вероятно, обусловлено особенностями метаболизма этого вида дрожжей. Возможно, поэтому в клетках дрожжей Р. р^опя синтезированный белок, в основном, находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в случае 5. сегегк/ае он образует «тельца включения» и экстрагируется из разрушенных клеток только в присутствии детергента.

Мы показали, что удаление 10 С-концевых аминокислот в ИФН-у быка, как и в ИФН-у человека, сопровождается повышением устойчивости к протеолитической деградации. При этом внесенные изменения не приводят к потере биологической активности.

Мы продемонстрировали возможность функционирования сигнала ядерной локализации млекопитающих в клетках дрожжей и установили, что он определяет локализацию рекомбинантного белка.

выводы.

1. Синтез рекомбинантного ИФН-у быка и накопление его в клетках подавляет рост штамма дрожжей & сегеуиаде (2Р4-1-С1Ш8/рУС1В). У дрожжей Р. раМот ВКПМ У-2990 (05115/рВЮ) подавления роста не происходит, несмотря на более высокий уровень продукции.

2. В клетках дрожжей Р. рШогк гетерологичный белок находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в случае 51. сегеукгае он образует «тельца включения» и экстрагируется из клеток только в присутствии детергента.

3. Продукция гетерологичного ИФН-у сопровождается повышением уровня карбонилированных белков является стрессорным фактором у обоих видов дрожжей.

4. Штаммы-продуценты обоих видов дрожжей более устойчивы к оксидативному стрессу, чем исходные штаммы. При этом дрожжи Р. ра.ч1оп.ч оказались более адаптированными к стрессорным воздействиям, в том числе к синтезу гетерологичного белка, что обусловлено особенностями метаболизма.

5. Получен модифицированный ИФН-у быка, лишенный десяти С-концевых аминокислот, содержащих участок расщепления трипсиноподобными протеазами. Показано, что модифицированный белок, секретируемый штаммом дрожжей Р. раз1от С8115(рР1С9/ВЮс110), не подвергается протеолизу в течение 72 часов культивирования и сохраняет биологическую активность.

6. Установлено наличие сигнала ядерной локализации в молекуле ИФН-у быка. Показано, что сигнал ядерной локализации млекопитающих выполняет свою функцию в клетках дрожжей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Градобоева А.Е., Падкина М.В., Парфенова Л.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS105(pBIG) - продуцент внутриклеточного иммунного интерферона быка, рекомбинантная плазмидная ДНК рВЮ, обеспечивающая биосинтез внутриклеточного иммунного интерферона быка и способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рВЮ. Патент РФ №2231545 С1, 2002.

Градобоева А.Е., Смирнов М.Н., Падкина М.В. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris - продуцента у-интерферона быка. III Московский международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития», 2005. С.75-76.

Gradoboeva А.Е., Smirnov M.N., Padkina M.V. Yeast Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris - producers of intracellular bovine interferon-gamma. XXIIYGM Conference, Bratislava, 2005. P. 243

Градобоева A.E., Падкина M.B. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris - продуценты интерферона-гамма быка. Школа-конференция "Генетика микроорганизмов и биотехнология", Пущино, 2006. С.124-125.

Градобоева А.Е., Падкина М.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS106(pHIG), являющийся продуцентом иммунного интерферона человека, рекомбинантная плазмида pHIG и способ ее конструирования. Патент РФ № 2315806 С1, 2006.

Градобоева А.Е., Падкина М.В. Изучение влияния продукции гетерологичного белка на физиологическое состояние дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. // Вестн. С.-Петерб. Ун-та. 2008. Сер.З, Вып.2. С.58-63.

Градобоева А.Е., Падкина М.В. Оценка количества карбонилированных белков в штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris -продуцентов интерферона-гамма быка. Сборник трудов седьмой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2009.С 269.

Подписано в печать 3 февраля 2010 года. Формат 60x841/16.

Усл. Печ. Л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1749. Отпечатано в Цифровом Копировальном Центре «Средний-28» 199004, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., 28. Тел.: (812) 323 40 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Градобоева, Анастасия Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

ПРОДУКЦИЯ ИНТЕРФЕРОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ.

1. ИНТЕРФЕРОНЫ.

1.1. Классификация интерферонов.

1.2. Интерферон-гамма и его роль в системе интерферонов.

1.3. Механизм действия интерферонов.

1.3.1. МК-БТАТ путь передачи сигнала в ядро.

1.3.2. Структура рецепторов интерферонов.

1.3.3. Пути проникновения комплекса интерферон/рецептор в клетку. 19 1.3.4 Транспорт интерферонов в ядро, сигналы ядерной локализаци.

1.4.Применение интерферонов.

2. СОЗДАНИЕ ВЕКТОРОВ И ШТАММОВ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ.

2.1. Клонирование чужеродных генов в микроорганизмах.

2.2. Гетерологичная экспрессия в дрожжах.

2.2.1. Особенности роста дрожжей Б. сегеу1Б1ае и Р. раяЮггя.

2.2.2. Промоторы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии.

2.2.3. Векторы для экспрессии чужеродных генов в дрожжах.

2.2.4. Особенности секреции, гликозилирования и протеолиза белков у дрожжей.

3. ВЛИЯНИЕ ПРОДУКЦИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ БЕЛКОВ НА КЛЕТКИ ДРОЖЖЕЙ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. МАТЕРИАЛЫ.

1.1 Штаммы.

1.2 Плазмиды.

1.3 Условия культивирования штаммов.

2. МЕТОДЫ.

2.1 Трансформация бактерий Е. соН.

2.2 Трансформация дрожжей плазмидной ДНК.

2.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. соН.

2.5 Электрофорез ДНК.

2.7 Выделение хромосомной ДНК из дрожжей.

2.8 Полимеразная цепная реакция.

2.9 Количественное определение активности кислых фосфатаз.

2.10 Определение концентрации белка.

2.11 Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

2.12 Электроперенос белков с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу

2.13 Иммуноблот со специфическими антителами.

2.14 Гель-фильтрация на сефакриле 8-200.

2.15 Определение биологической активности.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. СОЗДАНИЕ ШТАММА ДРОЖЖЕЙ СЕКЕУШАЕ -ПРОДУЦЕНТА ИФН-у БЫКА.

1.1 Характеристики штаммов-реципиентов.

1.2 Измерение активности кислых фосфатаз у штаммов-реципиентов.

1.3 Получение штаммов-продуцентов ИФН-у.

1.3.1 Трансформация штаммов плазмидойрУаВ.

1.3.2 Оценка митотической стабильности плазмиды рУОШ.

1.3.3 Тестирование продукции ИФН-у.

2. СОЗДАНИЕ ШТАММА ДРОЖЖЕЙ Р1СН1А РАБТОШЗ -ПРОДУЦЕНТА ИФН-у БЫКА.

2.1. Получение рекомбинантной плазмиды рВЮ.

2.2 Получение штамма дрожжей Р. раБЮпБ - продуцента ИФН-у быка.

3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРОДУКЦИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО БЕЛКА НА КЛЕТКИ ДРОЖЖЕЙ З.СЕЯЕУШАЕ И Р. РА8ТОШ8.

3.1 Культивирование штаммов-продуцентов ИФН-у.

3.2 Идентификация ИФН-у в клетках дрожжей.

3.3 Исследование адаптивной способности дрожжей cerevisiae и Р. раБ^пБ к стрессорным воздействиям.

3.3.1. Изучение уровня карбонильных групп в клеточных белках исходных штаммов и штаммов-продуцентов.

3.3.2. Изучение реакции исходных штаммов и штаммов-продуцентов на присутствие в среде перекиси водорода.

4.ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА ДРОЖЖЕЙ Р.РАЗТОМЗ, СЕКРЕТИРУЮЩЕГО УКОРОЧЕННЫЙ ИФН-у БЫКА.

4.1. Создание вектора экспрессии модифицированного ИФН-у быка в клетках дрожжей Р.разШпз.

4.2 Сравнение уровня продукции и биологической активности нативного и модифицированного иммунных интерферонов быка.

5. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СИГНАЛЬНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ.

5.1 Получение модифицированного гена б/^Жг.

5.2. Создание плазмид, обеспечивающих экспрессию нативного и укороченного генов ИФН-у быка совместно с геном С?/7/5 в клетках дрожжей Р.разЮш.

5.3. Определение локализации нативного и укороченного рекомбинантных ИФН-у быка, сшитых с флюоресцентным белком вБР в клетках дрожжей

P.pastoris.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия нативного и модифицированного генов иммунного интерферона быка в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris"

Актуальность проблемы. За последнее десятилетие иммунология претерпела глубокие изменения в связи с доказательством того, что иммунная система регулируется пептидными гормонами — цитокинами, действия которых подчиняются тем же закономерностям, что и процессы с участием классических гормонов и их рецепторов. На данный момент известна первичная структура нескольких десятков цитокинов, обеспечивающих дистанционное взаимодействие иммунокомпетентных клеток между собой. Среди них наиболее изучены к настоящему времени интерлейкины, колониестимулирующие факторы и интерфероны.

Интерфероны (ИНФ), представляющие собой естественную систему противовирусной защиты организма, помимо этого, оказывают иммуностимулирующее, противовоспалительное, противоопухолевое и антимитотическое действие. ИФН-у, иммунный, синтезируется Т-лимфоцитами после стимуляции их митогенами, антителами, интерлейкином-2 . Он оказывает, главным образом, антипролиферативное и иммуномодулирующее действие.

Иммунные интерфероны млекопитающих повышают бактерицидную и фунгицидную активность макрофагов и являются эффективными препаратами для лечения различных заболеваний животных. Использование интерферонов для лечения заболеваний различной этиологии имеет существенные преимущества по сравнению с традиционными антибиотиками и химиотерапевтическими препаратами за счет широкого спектра действия, обусловленного активацией иммунной системы, и из-за отсутствия побочных эффектов. Есть данные, что использование гамма-интерферона цыпленка в качестве адъюванта усиливает иммунный ответ организма на вакцины (ТакеЬага К. а1., 2003). Это позволяет предположить, что бычий ИФН-у можно использовать при вакцинации крупного рогатого скота.

В связи с широким спектром действия цитокинов в терапии многих заболеваний, естественно встала проблема получения значительных количеств этих биологически активных соединений. Эта проблема не могла быть решена традиционным способом - выделением из крови — ввиду ограниченности ресурсов донорской крови, а также опасности распространения вирусов.

С разработкой методов работы с ДНК in vitro появилась возможность клонировать и экспрессировать чужеродные гены в различных прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах. Впервые препараты рекомбинантных цитокинов были получены из бактерий Escherichia coli. Однако E.coli являются условно патогенными микроорганизмами, и получаемый белок не удается полностью очистить от продуктов жизнедеятельности бактерий, поэтому препарат в той или иной степени является токсичным, что значительно усложняет применение его в медицине. Применение непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не содержащих токсических и пирогенных факторов, в качестве продуцентов рекомбинантного иммунного интерферона быка позволяет использовать этот белок в ветеринарии.

В настоящее время ген иммунного интерферона быка клонирован в составе векторов, обеспечивающих продукцию рекомбинантного белка клетками дрожжей Pichia pastoris и секрецию синтезированного белка в культуральную жидкость. Однако не менее перспективным представляется использование в ветеринарии, штаммов дрожжей, накапливающих рекомбинантный гамма-интерферон быка внутри клетки. Дрожжи, содержащие белок, можно добавлять непосредственно в пищу животным, что позволит исключить стадию очистки и повысит биологическую ценность других кормов.

Достижения в области генной инженерии позволили получать продуцентов биологически активных веществ на основе разных видов микроорганизмов. Используя различные системы экспрессии, а также подбирая условия культивирования, можно добиться достаточно высокого уровня выхода рекомбинантного белка. Однако следует отметить, что целью подобных экспериментов является, в основном, повышение подукции гетерологичных белков. При этом мало внимания уделяется самим продуцентам и процессам, происходящим в клетках микроорганизмов во время продукции чужеродных белков, хотя такие исследования также могли бы помочь в решении основной задачи биотехнологии - получении достаточных количеств необходимого вещества.

Целью данной работы является получение с помощью методов генной инженерии штаммов дрожжей Засскаготусев сеге\>1з1ае и Р1сЫа разизпБ — продуцентов биологически активного ИФН-у быка и изучение особенностей продукции гетерологичного белка клетками двух видов дрожжей. В задачи исследования входит:

- получение вектора экспрессии, обеспечивающего синтез рекомбинантного нативного и модифицированного у-интерферона быка в клетках дрожжей Р. разЮНз; получение штаммов-продуцентов биологически активного у-интерферона быка на основе дрожжей cerevisiae и Р. раз Юг ¿я; изучение протеолитической стабильности нативного и модифицированного белков;

- сравнение эффективности дрожжей 51. сегеушае и Р. раяШпБ в качестве систем экспрессии гетерологичных генов;

- изучение влияния экспрессии гетерологичного гена бТ/^А^г на клетку-хозяина выявление возможного наличия сигнала ядерной локализации в молекуле бычьего ИФН-у Научная новизна исследования. Впервые получен штамм дрожжей Р. раБ^пБ — продуцент биологически активного ИФН-у быка. Впервые показано, что продукция рекомбинантного ИФН-у быка приводит к повышению количества карбонилированных белков в клетках дрожжей и, следовательно, является для них стрессорным фактором. Впервые показано, что дрожжи Р. рахЮпБ являются более устойчивыми к стрессовым воздействиям. Показано, что в клетках дрожжей Р. раБ^пз синтезированный белок находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в случае 5*. сегеушяе он образует так называемые «тельца включения». Впервые показано, что сигнал ядерной локализации у-интерферона млекопитающих и обеспечивает транспорт гетерологичного белка в ядро дрожжевой клетки, что свидетельствует о его консервативности.

Практическая ценность. Штаммы дрожжей 5". сегел>1$гае и Р. раБ^пБ, синтезирующие и аккумулирующие рекомбинантный ИФН-у быка внутри клеток, могут быть использованы в качестве иммунопробиотической кормовой добавки для профилактики различных заболеваний животных. Штамм - продуцент модифицированного ИФН-у может быть использован для получения препарата и изучения спектра его действия. Систематические исследования спектра биологического действия ИФН-у, как и его применение в качестве лекарственного препарата затруднены, так как в настоящее время в России не существует препаратов гамма-интерферона быка.

ПРОДУКЦИЯ ИНТЕРФЕРОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ

ДРОЖЖЕЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1. ИНТЕРФЕРОНЫ

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Градобоева, Анастасия Евгеньевна

ВЫВОДЫ.

1. Синтез рекомбинантного ИФН-у быка и накопление его в клетках подавляет рост штамма дрожжей 5. cerevisiae (2Р4-1-01Ш8/рУ01В). У дрожжей Р. рсиНогк ВКПМ У-2990 (08115/рВЮ) подавления роста не происходит, несмотря на более высокий уровень продукции.

2. В клетках дрожжей Р. раБЮпя гетерологичный белок находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в случае & сегетъ'ше он образует «тельца включения» и экстрагируется из клеток только в присутствии детергента.

3. Продукция гетерологичного ИФН-у сопровождается повышением уровня карбонилированных белков является стрессорным фактором у обоих видов дрожжей.

4. Штаммы-продуценты обоих видов дрожжей более устойчивы к оксидативному стрессу, чем исходные штаммы. При этом дрожжи Р. раяШпБ оказались более адаптированными к стрессорным воздействиям, в том числе к синтезу гетерологичного белка, что обусловлено особенностями метаболизма.

5. Получен модифицированный ИФН-у быка, лишенный десяти С-концевых аминокислот, содержащих участок расщепления трипсиноподобными протеазами. Показано, что модифицированный белок, секретируемый штаммом дрожжей Р. раБ^пБ 08115(рР1С9/ВЮс110), не подвергается протеолизу в течение 72 часов культивирования и сохраняет биологическую активность.

6. Установлено наличие сигнала ядерной локализации в молекуле ИФН-у быка. Показано, что сигнал ядерной локализации млекопитающих выполняет свою функцию в клетках дрожжей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Градобоева, Анастасия Евгеньевна, Санкт-Петербург

1. Бакулина Л.Ф., Тимофеев И.В., Перминова Н.Г. и др. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии // Биотехнология.- 2001.- №2.- С.48-56.

2. Градобоева А.Е., Смирнов М.Н., Падкина М.В. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris — продуцента у-интерферона быка // III Московский международный конгресс «Биотехнология — состояние и перспективы развития». 2005. - С.75-76.

3. Градобоева А.Е., Падкина М.В. Изучение влияния продукции гетерологичного белка на физиологическое состояние дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris II Вестн. С.-Петерб. Ун-та. -2008. Сер.З, Вып.2. - С.58-63.

4. Градобоева А.Е., Падкина М.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS 106 (pHIG), являющийся продуцентом иммунного интерферона человека, рекомбинантная плазмидная ДНК pHIG и способ ее конструирования // Патент РФ №2315806. С1. 2006.

5. Дебабов В.Г., Лившиц В.А. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов // М.: Высшая школа. -1988.

6. Егорова О.Н., Балабанова P.M. Система интерферона при ревматических заболеваниях // Клиническая ревматология.- 1993. -. № 2. С.51-54.

7. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при паталогии // М.: Медицина. 1996

8. Ершов Ф.И., Новохатский A.C. Интерферон и его индукторы // М.: Медицина. 1980.

9. Ю.Завьялов В.П. Структурно-функциональная классификация и эволюция цитокинов // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. 1993. - Т.2. - С.8-9.

10. Карпищенко А.И., Пастушенков В. Л., Михалева Н.П. и др. Стресс, белки теплового шока и апоптоз // В кн.: Программированная клеточная гибель. С-Пб.: Наука. 1996. - С. 149-156.

11. Кетлинский С. А., Белов Д. А. Фактор некроза опухоли и лимфотоксин-эндогенные противоопухолевые антибиотики // Успехи современной биологии. 1989. - Т.107. - С.78-91.

12. Кетлинский С. А., Симбирцев A.C., Воробьев Ф.Ф. Эндогенные иммуно-модуляторы // Ст.-Петербург.: Гиппократ. 1992.

13. Н.Кольман Я., Рём К. Наглядная биохимия. // М., «Мир». 2000

14. Лабас Ю.А., Гордеева A.B., Фрадков А.Ф. Флюоресцирующие и цветные белки // Природа. 2002. - №3. — С.33-43.

15. Маниатис Т., Фриг Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование // М.: Мир. 1984.

16. Марстон Ф. А.О. Выделение эукароитических полипептидов, продуцируемых в клетках Е. coli II В кн.: Новое в клонировании ДНК. М.: Мир. 1989. - С. 95-137.

17. Мирошников П.Н., Лебедев Л.Р., Терещенко Т.А. Получение интерферона-гамма и его аналога дельтаферона // Биотехнология. -2005.-№1.-С.11-18.

18. Мюльберг A.A. Фолдинг белков // Издат. С.-Петербургского университета. 2004.

19. Николаев Я.В., Парфенова JI.B., Падкина М.В. и др. Использование дрожжей Pichia pastoris в качестве продуцента рекомбинантного у-интерферона быка // Цитокины и воспаление. 2002. - Т.1. - С.28-29.

20. Парфенова JI.B., Самбук Е.В., Смирнов М.Н., Падкина М.В. Продукция ß-интерферона человека в дрожжах Saccharomyces cecevisiae ведет кснижению активности цитохром с-оксидазы // Биотехнология. — 2002. -№6. С.3-10.

21. Ройт А. Основы иммунологии // М.: Мир. 1991.

22. Савельева Н.В. Получение трансгенных растений продуцентов бычьего гамма-интерферона // Дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук. - СПбГУ. - Санкт-Петербург. - 2009.

23. Смит К.Ф. Регуляция функций Т- и В-клеток лимфокинами // В кн.: Иммунология. М.: Мир. 1988. - Т.2. - С.396-425.

24. Соколовский В.Ю., Белозерская Т.А. Действие стрессоров на дифференциальную экспрессию генов в ходе развития Neurospora crassa II Успехи биол. Химии. 2000. - Т.40. - С.85-152.

25. Татьков С.И., Смирнова О.Ю., Цивковский Р.Ю. и др. Мутантные гамма-интерфероны человека с измененным С-концом и их свойства // Молекуляр. биол. -1995. NT 29. - №.5. - С. 1095-1101.

26. Тотолян Н.А. Диагностика и лечение рассеянного склероза с позиций доказательной медицины // Мир медицины.- 2000.- №5-6.

27. Чередеев А.Н., Ковальчук JI.B. Клеточные и молекулярные аспекты иммунных процессов // В кн.: Итоги науки и техники. Иммунология. ВИНИТИ. М. -1989. - Т. 19. - С. 239.

28. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия // Сибирское университетское издательство, Новосибирск. 2004.

29. Adams D.O., Hamilton Т.А. Molecular transductional mechanisms by which IFN gamma and other signals regulate macrophage development // Immunol.Rev. 1987. - V.97. - P.5-27.

30. Aggarwal B.B., Eessalu Т.Е. Induction of receptors for tumor necrosis factor-alfa by interferons is not a major mechanism for their synergistic cytotoxxic response // J.Biol.Chem. 1987. - Y.262. - P. 10000-10007.

31. Aguet M., Dembic Z., Merlin G. Molecular cloning and expression of the human interferon-y receptor // Cell. 1988. - V.55. - P.273-280.

32. Arrigo A.P. Investigation of the function of the heat shock proteins in Drosophila melanogaster tissue culture cells // Mol. Gen. Genet. — 1980. — V. 178(3). -P. 517-524.

33. Attfield P.V. Stress tolerance: the key to effective strains of industrial baker's yeast//Nat. Biotechnol. 1997. -V. 15. - P. 1351-1357.

34. Austin A.J., Jones C.E., Heeke G.V. Production of human tissue factor using the Pichiapastoris expression system // Protein Exprès. Purif. 1998.- V.13. - P.136-142.

35. Ballou C.E. A study of the immunogenicity of three yeast mannans // J.Biol.Chem. 1970. - V.245. - P. 1197-1203.

36. Bazan J.F. Structural disign and molecular evolution of cytokine receptor superfamily // Proc. nat. Acad. sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 6934-6938.

37. Beggs J.D. Transformation of yeast by a replicating hibrid plasmid // Nature. 1978. - V. 275. - P. 104-109.

38. Bidwai A.P., Hanna D.E., Glover C.V.C. Purification and characterization of casein kinase II (CK II) from AckalAcka2 S.cerevisiae rescued by Drosophila CK II subunits // J.Biol.Chem. 1992. - V.267. - P.790-796.

39. Birnboim H.C., Doly L.J. A rapid alkalin extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA//Nucleic Acids Res. 1970.-V. 7. -P. 1513.

40. Bitter G.A., Egan K.M., Koski R.A. et al. Expression and secretion vectors for yeast // Methods Enzymol. 1987. - V.153. - P.516-544.

41. Bitter G.A., Egan K.M. Expression of interferon-gamma from hybrid yeast GPD promoters containing upstream regulatory sequences from the GAL1-GAL10 intergenic region // Gene. 1988.- V.69. - P. 193-207.

42. Bradford M.A. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein-dye binding // Academic press. Virginia. — 1976.- P.10.

43. Broach J.R. Construction of high copi yeast vectors using 2- circle sequence//Methods Enzimol. 1983. - V.101. - P. 307-325.

44. Bustelo X.R., Otro A. et al. Expression of the rat protimosin alfa gene during T-limphocyte proliferation and liver regeneration // J. biol. Chem. -1991.-V.266.-P. 1443-1448.

45. Cabiscol E., Piulats E., Echave P. et al. Oxidative stress promotes specific protein damage in Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 2000. -V.275. - P.27393-27398.

46. Cadenas E. Biochemistry of oxygen toxicity // Ann. Rev. Biochem. 1989. -V.58. - P.79-110.

47. Cereghino J.L., Cregg J.M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris II FEMS Microbiol.Rev. 2000. -V.24. - P.45-66.

48. Cerretti D.P., McKereghan K., Larsen A. et al. Cloning, sequence, and expression of bovine interferon-gamma // J. Immunol.- 1986.- V.136.-P.4561-4564.

49. Cinatl J., Morgenstern B., Bauer G. et al. Treatment of SARS with human interferons // Lancet. 2003.- V.362.- P.293-294.

50. Clare J.J., Romanos M.A., Rayment F.B. et al. Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies // Gene. 1991. - V.105. - P.205-212.

51. Couderc R., Baratti J. Oxidation of methanol by yeast Pichia pastoris. Purification and properties of alcohol oxidase // Agric.BioI.Chem. 1980. -V.44. - P.2279-2289.

52. Cousens L.S., Shuster J.R., Gallegos C. et al. High level expression of proinsulin in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Gene.- 1987. V.61. -P.265-275.

53. Cregg J.M., Madden K.R. Development of the methylotrophic yeast, Pichia pastoris, as a host system for the production of foreign proteins // Dev. Ind. Microbiol. (J. Ind. Microbiol.- Suppl.3). 1988. - V.29. - P.33-41.

54. Cregg J.M., Vedvick T.S., Raschke W.C. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris II Bio/Technol. 1993. - V.l 1.- P.905-910.

55. Czarniecki C.W., Fennie C.W., Powers D.B., Estell D.A. Synergistic antiviral and antiproliferative activities of Escherichia coli-derived human alpha, beta and gamma interferons // J.Virology. 1984. - V.49. - P.490-496.

56. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustrini D. et al. Actin carbonilation from a simple marker of protein oxidation to relevant signs of severe functional impairment // Free Radic.Biol.Med. 2001. - V.31 (9). - P. 1075-1083.

57. Darnell J.E.,Jr., Kerr I.M., Stark G.R. Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signalling proteins II Science. 1994. - V.264. - P.1415-1421.

58. Doherty G.J., McMahon N.T. Mechanisms of endocytosis // Annu. Rev. Biochem. 2009. - V. 78. - P. 857-902.

59. Dul J.L., Argon Y. A single amino acid substitution in the variable region of the light chain specifically blocks immunoglobulin secretion // Proc. nat. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P.8135-8139.

60. Duman J.G., Miele R.G., Liang H. et al. O-mannosylation of Pichia pastoris cellular and recombinant proteins // Biotechnol. Appl. Biochem. 1998. -V.28. - P.39-45.

61. Ealick S.E., Cook W.J., Vijay-Kumar S. et al. Three-dimentional structure of recombinant human interferon-y // Science. 1991. - V.252. - P.698-702.

62. Ellis R.J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated // Trends Biochem. Sci. 2001. -V.26. - P.597-604.

63. Estruch F. Stress-controlled transcription factors, stress-induced genes and stress tolerance in budding yeast // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - V.24. -P.469-486.

64. Fischer J.S., Priore R.L., Jacobs L.D. et al. Neuropsychological effects of interferon beta-la in relapsing multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Collaborative Research Group // Ann. Neurol. 2000. - V48. - P.885-892.

65. Fischer R., Emans N. Molecular farming of pharmaceutical proteins // Transgenic Res. 2000. - V9. - P.279-299.

66. Fujimura H., Sakuma Y. Simplified isolation of chromosomal and plasmid DNA from yeast // Biotechniques. 1997. - V.14. - P.538-539.

67. Furlan R., Bergami A., Lang R. et al. Interferon-beta treatment in multiple sclerosis patients decreases the number of circulating T cells producing interferon-gamma and interleukin-4 // J. Neuroimmunol.- 2000.- V.lll. -P.86-92.

68. Galilov E.E., Smirnov O.Yu. Nucleotide sequence of Yersinia pestis gene encoding F1 antigen and the primary structure of the protein (putative T and B epitopes) // FeBS Lett. 1990. - V.277. - P.230-323.

69. Gasch A.P., Werner-Washburne M. The genomics of yeast responses to environmental stress and starvation // Funct. Integr. Genomics. 2002. -V.2.-P. 181-192.

70. Gemmil T.R., Trimble R.B. Overview of N- and O-linked oligosaccaride structures found in various yeast species // BBA. 1999. — V.1426. - P. 27237.

71. Godon C., Lagniel G., Lee J. et al. The H202 stimulon in Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 1998. - V.273. - P.22480-22489.

72. Gorlich D., Mattaj I.W. Nucleocytoplasmic transport // Science. 1996. -V.271. - P. 1513-1518.

73. Gray P.W., Goeddel D.V. Structure of the human immune interferon gene // Nature. 1982. - V.298. - P.859-563.

74. Greenlund A.C., Morales M.O., Viviano B.L. et al. Stat recruitment by tyrosine-phosphoiylated cytokine receptors: an ordered reversible affinity-driven process // Immunity 1995. — V.2. - P.677-687.

75. Grossberg S.E., Taylor J.L., Kurshnaryov V.M. Interferon receptors and their role in interferon action // Experientia. 1989. - V.45. - P.508-518.

76. Hagenson M.J., Holden K.A., Parker K.A. et al. Expression of streptokinase in Pichia pastoris yeast // Enzyme Microb. Technol. 1989. — V.ll. -P.650-656.

77. Halliwell B. Free radicals and antioxidants: a personal view // Nutr. Rev. -1994. V.52. - P.253-265.

78. Hannigan G.E., Fish E.N., Williams B.R.G. Modulation of human interferon-a receptor expression by human interferon-y // J.Biol.Chem. -1984. V.259. - P.8084-8086.

79. Heim J., Takabayashi K., Meyhack B. et al. C-terminal proteolytic degradation of recombinant desulfato-hirudin and its mutants in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Eur. J. Biochem.- 1994.- V.226.- P.341-353.

80. Hitzeman R.A., Chen C.Y., Hagie F.E. et al. Expression of hepatitis B virus surface antigen in yeast // Nucl. Acid Res. 1983. - V. 11.- P.2746-2763.

81. Hitzeman R.A., Hagie F.E., Levine H.L. et al. Expression of a human gene for interferon in yeast // Nature. 1981. - V.293. - P.717-722.

82. Ito H., Fucuda Y., Murata K. et al. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations // J. Bacteriol. 1983. - V153. - P.163-168.

83. Itoh Y., Hayakawa T., Fujisawa Y. Expression of hepatitis B virus surface antigen P31 gene in yeast // Bioch. and Bioph.Res.Commun. 1986. -V.138.-P. 268-274.

84. Iyer V., Struhl K. Mechanism of differential utilization of the his3 T-R and T-C TATA elements II Mol. Cell. Biol.-1995b.- V. 15.- P.7059-7066.

85. Iyer V., Struhl K. Poly(dA-dT), a ubiquitous promoter element that stimulates transcription via its intrinsic DNA structure // EMBO J.- 1995a.-V.14.- P.2570-2579.

86. Johnson H.M., Szente B.E. C-terminal peptides of interferon-y // United State Patent № 6.120.762. 2000.

87. Jurgen B., Lin H.Y., Riemschneider S. et al. Monitoring of genes that respond to overproduction of an insoluble recombinant protein in Escherichia coli glucose-limited fed-batch fermentations // Biotechnol. Bioeng. 2000. - V.70. - P.217-224.

88. Kalderon D., Roberts B.L., Richardson W.D., Smith A.E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location // Cell. — 1984. — V.39. — P.499-509.

89. Kanaya E., Higashizaki T., Ozawa F. et al. Synthesis and secretion of human growth factor by Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1989. - V.83. -P.65-74.

90. Kang H.A., Kim S.J., Choi E.S. et al. Efficient production of intact human parathyroid hormone in a Saccharomyces cerevisiae mutant deficient in yeast aspartic protease 3 (YAP3) // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998.-V.50. - P.187-192.

91. Karpusas M., Nolte M., Benton C.B. et al. The crystal structure of human interferon P at 2.2-A resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997,-V.94.- P. 11813-11818.

92. Kerry-Williams S.M., Gilbert S.C., Evans L.R. et al. Disruption of the Saccharomyces cerevisiae YAP3 gene reduces the proteolytic degradation of secreted recombinant human albumin // Yeast. — 1998. V.14. - P.161-169.

93. Kingsman S.M., Kingsman A.J., Mellor J. The production of mammalian proteins in Saccharomyces cerevisiae // Trends Biotechnol. -1987. V.5.-P.53-57.

94. Kishko I.H., Vasilenko M.I. Properties of natural animal gamma-interferons and peculiarity of their action // Mikrobiol. Z. 1998. - V.60.-P.65-70.

95. Koch K.A., Thiele D.J. Functional analysis of a homopolymeric (dA-dT) element that provides nucleosomal access to yeast and mammalian transcription factors // J. Biol. Chem.- 1999.- V.274.- P.23752-23760.

96. Kotenko S.V., Izotova L.S., Pollack B.P. et al. Interaction between the components of the interferon-receptor complex // JBC 1995. - V.270(36).-P.20915-20921.

97. Krause C.D., He W., Kotenko S. et al. Modulation of the activation of Statl by the interferon-gamma receptor complex // Cell Res. 2006. -V.16(l). —P.113-123.

98. Krause C.D., Lavnikova N., Xie J. et al. Preassembly and ligand-induced restructuring of the chains of the IFN-gamma receptor complex: the roles of Jak kinases, Statl and the receptor chains // Cell Res. 2006. - V.16(l). -P.55-69.

99. Kukurusinska M.A., Bergh M.L., Jackson B.L. Protein glycosylation in yeast // Ann.Rev.Biochem. 1987. - V.56. - P.915-944.

100. Larkin J. 3rd, Subramaniam P.S., Torres B.A. et al. Differential properties of two putative nuclear lokalization sequences found in the carboxyl-terminus of human IFN-gamma // J.Interferon Cytokine Res. -2001.-V.21(6).-P.341-348.

101. Lee S.H., Aggarwal B.B., Rinderknecht E., Assisi F., Chiu H. The synergistic anti-proliferative effect of gamma-interferon and human lymphotoxin// J.Immunol. 1984. - V.133. - P.1083-1086.

102. Legrain M., Portetelle D., Dumont J. et al. Biochemical and immunological characterization of the bovine leukemia virus (BLV) envelope glycoprotein (gp51) produced in Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1989. - V.79. - P.227-237.

103. Legrain M., Portetelle D., Dumont J. et al. Biochemical and immunological characterization of the bovine leukemia virus (BLV) envelope glycoprotein (gp51) produced in Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1989. - V.79. - P.227-237.

104. Li W.Z., Sherman F. Two types of TATA elements for the CYC1 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol.- 1991.- V.ll.-P.666-676.

105. Lilie H., Schwarz E., Rudolph R. Advances in refolding of proteins prodused in E. coli II Curr. Opin. Biotechnol. 1998. - V.9. - P. 497-501.

106. Littman S.J., Faltynek C.R., Baglioni C. Binding of human1 0 ^recombinant ~ I-interferon-y to receptors on human cells // J.Biol.Chem. -1985. V.260. - P.l 191-1195.

107. Lou J., Gasche Y., Zheng L. et al. Interferon-beta inhibits activated leukocyte migration through human brain microvascular endothelial cell monolayer//Lab. Invest.- 1999.- V.79.- P.1015-1025.

108. Lowenthal J.W., O'Neil T.E., David A. et al. Cytokine therapy: a natural alternative for disease control II Vet. Immun. Immunopathol.- 1999.- N .12-P.183-188.

109. Lucht J.M., Bremer E. Adaptation of Escherichia coli to high osmolarity environments: osmoregulation of the high affinity glycine betaine transport system ProUIIFEMS Microbiol. Rev. 1994. - V.14. - P.3-20.

110. Lussier M., Sdicu A.M., Bussereau F. The KTR and MNNJ mannosyltransferase families of Saccharomyces cerevisiae II Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V.1426. - P.323-334.

111. Maris A.F., Kern A.L., Picada J.N. et al. Glutathione, but not transcription factor Yaplp, is required for carbon source-dependent resistance to oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. -2000. V.37. -P.175-182.

112. Moir D.T., Davidow L.S. Production of proteins by secretion from Yeast//Meth. Enzymol. 1991. - V. 194. - P.491.

113. Nagatani T., Okazawa H., Kambara T. et al. Effect of natural interferonbeta on the growth of melanoma cell lines // Melanoma Res. 1998. - V.8. -P.295-299.

114. Nichols D.J., Lippincott-Schwartz J. Endocytosis without clathrin coats // Trends in Cell Biol. 2001. - V.l 1(10). - P.406-412.

115. Novick D., Cohen B., Rubinstein M. The human interferon alpha/beta receptor: characterization and molecular cloning // Cell. 1994. - V.77. -P.391-400.

116. Novick D., Orchansky P., Revel M., Rubinstein M. The human interferon-y receptor: purification, characterization ,and preparation of antibodies //J.Biol.Chem. 1987. - V.262. - P.8483-8487.

117. Ohi H., Ohtani W., Okazaki N. et al. Cloning and characterization of the Pichia pastoris PRC1 gene encoding carboxypeptidase Y // Yeast. -1996.-Y.12.-P.31-40.

118. Oshima Y. Regulatory circuits for gene expression: the metabolism of galactose and phosphate // In: The molecular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae: metabolism and gene expression.- CSHL.- N.Y.- 1982.- P.159-180.

119. Patarca R., Schartz J. et al. Rpt-1, an intracellular protein from helper/inducer T-cells that regulates gene expression of interleukin-2 receptor and human immunodificiency virus type 1 // Proc. nat. Acad. sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 2733-2737.

120. Paty D.W., Li D.K.B. Interferon beta-lb is effective in relapsing-remitting multiple sclerosis. II MRI analysis results of multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial // Neurology. 1993. -V.43. - P.662-667.

121. Pestka S., Krause.C.D. Walter M.R. Interferons, interferon-like cytokines and their receptors// Immunol.Rev. 2004. - V.202. - P.8-32.

122. Pestka S., Langer J.A., Zoon K.C., Samuel C.E. Interferons and their actions // Ann.Rev.Biochem. 1987. - V.56. - P.727-777.

123. Phadke A.P., Mehrad B. Cytokines in host defense against Aspergillus: recent advances // Medical Mycology Supplement I. 2005. - V. 43. -P.173-176.

124. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W. et al. Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Gene. — 1992. V.lll. — P.229-233.

125. Primrose S.B. The application of geneticalli engineered microorganisms in the production of drugs // J. Appl. Bacterid. 1986. - V. 61. -P. 99-116.

126. Pristie J.P., Schar H.-P. et al. Crystal structure of the cytokine interleukine-1 beta // EMBO J. 1988. - V. 7. - P. 339-349.

127. Radhakrishnan R., Walter L.J., Hruza A. et al. Zinc mediated dimmer of human interferon-alpha 2b revealed by X-ray crystallography // Structure.- 1996,- V.4.- P. 1453-1463.

128. Ramana C.V., Chaterjee-Kishore M., Nguyen H. et al. Complex roles of Statl in regulating gene expression // Oncogene — 2000. — V.19. P.2619-2627.

129. Ramana C.V., Gil M.P., Schreiber R.D. et al Statl-dependent and -independent pathways in IFN-y-dependent signaling // Trends in Immunol. — 2002. V.23(2). - P.96-101.

130. Ramana V.C., Gill M.P., Ransohoff R.M. et al. Statl-independent regulation of gene expression in response to IFN-y // PNAS — 2001. -V.98(12). -P.6674-6679.

131. Ramos J.L., Duque E., Rodriguez-Herva J.J. et al. Mechanisms for solvent tolerance in bacteria // J. Biol. Chem. 1997. - V.272. - P. 38873890.

132. Remaut E., Stansser P., Simons G. Et al. Use of the phage lambda Pi promoter for high-level expression of human interferons in Escherichia coli // Methods in enzymology. 1986.- v.l 19.- p.366-375.

133. Rinderknecht E., O'Conner B.H., Rodriguez H. Natural human interferon-gamma. Complete amino acid sequence and determination of sites of glycosylation // J. Biol. Chem. 1984. - V.259. - P.6790-6797.

134. Romanos M.A., Scorer C.A., Clare J.A. Foreign gene expression: a review // Yeast. 1992. - V.8. - P.423-488.

135. Rusconi S., Agarossi A., Ravasi L. et al. Serum 2'5'-oligoadenylate synthase levels and clinical response to interferon-beta therapy in women with genital human papillomavirus infection // J. Infect. Dis. 1994. - V.l69. - P.l 112-1115.

136. Sadir R., Lambert A., Lortat-Jacob H. et al. Caveolae and clathrin-coated vesicles: two possible internalization pathways for Ifn-gamma and IFN-gamma receptor // Cytokine. 2001. - V.l4(1). - P. 19-26.

137. Schaber M.D., Dechiara T.M., Kramer R.A. Yeast vectors for production of interferon // Methods in enzymology. 1986. - V.l 19. - P.183-192.

138. Schindler C., Darnell J.E.,Jr. Transcriptional responses to polypeptide ligands: the JAK-STAT pathway //Annu.Rev.Biochem. 1995. - V.64. -P.621-651.

139. Schindler C., Shaai K., Presioso V.R. et al. Interferon-dependent tyrosine phosphorylation of a latent cytoplasmic transcription factor // Science — 1992. V.257. — P.809-813.

140. Schneider J.C., Guarente L. Vectors for expression of cloned genes in Yeast: Regulation, Overproduction and Underproduction // Meth. Enzymol. 1991. - V.194. - P.373-387.

141. Schultz L.D., Tanner J., Hofmann K.J. et al. Expression and secretion in yeast of a 400-kDa envelope glycoprotein derived from Epstein-Barr virus // Gene. 1987.- V.54.-P.113-123.

142. Sedlacek H.-H., Moroy T. Immune reactions: headlines, overviews, tables and graphics // Springer. 1995.

143. Sekimoto T., Imamoto N., Nakajima K.et al. Extracellular signal-dependent nuclear import of Statl is mediated by nuclear pore-targeting complex formation with NPI-1, but not Rchl // EMBO J. 1997. - V.16. -P.7067-7077.

144. Sekimoto T., Nakajima K., Tachibana T. et al. Interferon-y-dependent nuclear import of Statl is mediated by the GTPase activity of Ran/TC4 // J. Biol. Chem. 1996. - V.271. - P.31017-31020.

145. Sentsui H., Murakami K., Inoshima Y. et al. Anti-viral effect of recombinant bovine interferon gamma on bovine leukaemia virus // Cytokine. 2001. - V.16.- P.227-231

146. Shen S., Suiter G., Jeffries T.W. et al. A strong nitrogen source-regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris II Gene. 1998. - V.216. - P.93-102.

147. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from luminous hydromedusan, Aequorea II J.Cell.Comp.Physiol. 1962. - V.59. - P. 223239.

148. Sigurdson D.C., Gaarder M.E., Livingston D.M. Characterization of the transmission during cytoductant formation of the 2 DNA plasmid from Saccharomyces // Mol. Gen. Genet. 1981. - V. 183. - P. 59-65.

149. Silvennoinen O., Ihle J.N., Schlessinger J., Levy D.E. Interferon-induced nuclear signalling by Jak protein tyrosine kinases // Nature. 1993. -V.366. - P.583-585.

150. Sonnleitner B. Dinamic adaptation of microbes // J. Biotechnol. -1998.-V.65.-P. 47-60.

151. Sreekrishna K.5 Potenz R.H.B., Craze J.A. et al. High level expression of heterologous proteins in methylotrophic yeast Pichia pastoris II J. Basic. Microbiol. 1988. - V.28. - P.265-278.

152. Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R. et al. How cells respond to interferons // Annu. Rev. Biochem. 1998. - V.67. - P.227-264.

153. Strahl K. Yeast transcriptional regulatory mechanisms // Annu. Rev. Genet.- 1995.- V.29.- P.651-674.

154. Subramaniam P.S., Mujtaba M.G., Paddy M.R. et al. The carboxyl terminus of interferon-y contains a functional polybasic nuclear localization sequence //J. Biol. Chem. 1998. - V.274(l). -P.403-407.

155. Sugarman B.J., Aggarwal B.B., Hass P.E., Figari I.S., Palladino M.A.,Jr., Shepard M.M. Recombinant human tumor necrosis factor-a: effects on proliferation of normal and transformed cells in vitro // Science. -1985. V230.- P.943-945.

156. Svedersky L.P., Shepard H.M., Spencer S.A., Shalaby M.R., Palladino M.A. Augmentation of human natural cell-mediated cytotoxicity by recombinant interleukin-2 // J.Immunol. 1984. - V.133. - P.714-718.

157. Tak P.P., Hart B.A., Kraan M.C. et al. The effects of interferon beta treatment on arthritis // Rheumatology. 1999. - V.38. - P.362-369.

158. Takehara K., Kobayashi K., Ruttanapumma R. et al. Adjuvant effect of chicken interferon-gamma for inactivated Salmonella Enteritidis antigen //J. Vet. Med. Sei. 2003. - V.65(12). - P. 1337-1341.

159. Taniguchi T., Ohno S., Fujii-Kriyana Y. Construction and «identification of a bacterial plasmid containing the human fibroblast interferon gene sequence // Proc. Japan. Acad. — V.55. — P.464-469.

160. Thomas J.G., Ayling A., Baneyx F. Molecular chaperones, folding catalysts, and the recovery of active recombinant proteins from E. coli to fold or to refold // Appl. Biochem. Biotechnol. - 1997. - V.66. - P.197-238.

161. Tovey M.G. Expression of the genes of interferons and other cytokines in normal and diseased tissues of man // Experientia. 1989. - V.45. - P.526-534.

162. Trent J.M., Olson S., Lawn R.M. Chromosomal localization of human leukocyte, fibroblast, and immune interferon genes by means of in situ hybridization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V.79. - P.7809-7813.

163. Trimble R.B., Atkinson P.H., Tschopp J.F. et al. Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris II J. Biol. Chem. r 1991. V.266. -P.22807-22817.

164. Uecer U., Bartsch M., Scheurich P., Berkovic D., Ertel C., Pfizenmaier K. Quantitation and characterization of y-interferon receptors on human tumor cells // Cancer Res. 1986. - V.46. - P.5339-5343.

165. Veenhuis M., van Dijken J.P., Harder W. The significance of peroxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeasts // Adv. Microbiol. Physiol. 1983. - V.24. - P. 1-82.

166. Wang B.-D., Kuo T.-T. Induction of a mitosis delay and cell lysis by high-level secretion of mouse a-amylase from Saccharomyces cerevisiae II Appl. Envir. Microbiol. 2001. - V. 67(8). - P. 3693-3701.

167. Waschutza G., Li V., Otto B. Thermostable variants of human interferon-y (IFN-y) // United State Patent № 6.046.034. 2000.

168. Waterham H.R., Digan M.E., Koutz PJ. et al. Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter // Gene. 1997. - V.186. - P.37-44.

169. Werten M.W., de Wolf F.A. Reduced proteolysis of secreted gelatin and Ypsl-mediated alfa-factor leader processing in a Pichia pastoris kex2 disruptant// Appl.Environ.Microbiol. 2005. - Y.71. - P.2310-2317.

170. Williams B.R.G. Transcriptional regulation of interferon-stimulated genes//Eur.J.Biochem. 1991. - V.200. -P.l-11.

171. Woolford C.A., Daniels L.B., Park F.J. et al. The PEP4 gene encodes an aspartyl protease implicated in the posttranslational regulation of Saccharomyces cerevisiae vacuolar hydrolases // Mol. Cell Biol. 1986. -V.6. -P.2500-2510.

172. Yano T., Takigami E., Yurimoto H., Sakai Y. Yap 1-regulated glutation redox system curtail accumulation of formaldehyde and reactive oxygen species in methanol metabolism of Pichia pastoris // Eucariotic Cell. 2009. - V.8(4). - P. 540-549.

173. Zabriskie D.W., Arcuri E.J. Factors influencing productivity of fermentation employing recombinant microorganisms // Enzyme Microb. Technol. 1986. - V. 8. - P. 706-717.

174. Zakian V.A., Brewer B.J., Fangman W.L. Replication of each copy of yeast 2 micron DNA plasmid occurs during the S phase // Cell. 1979. -V. 17.-P.923-934.

175. Zhang Z., Tong K.-T., Belew M., Pettersson T., Janson J.-C. Production, purification and characterization of recombinant human interferon-y//J. Chromatography. 1992. - V.604. - P.143-155.

176. Zhang Z.D., Hutching G., Kitching P. et al. The effects of gamma interferon on replication of foot-and-mouth disease virus in persistently infected bovine cells // Arch. Virol. 2002. - V.147. - P.2157-2167.

177. Zurbriggen B., Bohlen E., Sanglad D. et al. Controlled expression of heterologous cytochrome P450e cDNA in Saccharomyces cerevisiae. Construction and expression of a complete rat cytochrome P450e cDNA // J. Biotechnol.- 1989. V.9. - P.255-272.

178. Zwart K., Veenhuis M., van Dijken J.P. et al. Development of amine oxidase-containing peroxisomes in yeast during growth on glucose in the presence of methylamine as the sole source of nitrogen // Arch. Microbiol. -1980.-V.126.-P.117-126.