Изучение факторов, влияющих на секрецию и биологическую активность химерного белка "Альбумин-интерферон-альфа16", синтезируемого дрожжами Pichia pastoris

Карабельский, Александр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение факторов, влияющих на секрецию и биологическую активность химерного белка "Альбумин-интерферон-альфа16", синтезируемого дрожжами Pichia pastoris
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Изучение факторов, влияющих на секрецию и биологическую активность химерного белка "Альбумин-интерферон-альфа16", синтезируемого дрожжами Pichia pastoris"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИЗУЧЕНИЕ ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА СЕКРЕЦИЮ И БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ХИМЕРНОГО БЕЛКА "АЛЬБУМИН-ИНТЕРФЕРОН-АЛБФА16", СИНТЕЗИРУЕМОГО ДРОЖЖАМИ Р1СН1А

РЛБТОШБ

03.03.04- клеточная биология, цитология, гистология 03.01.04- биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

КАРАБЕЛЬСКИЙ Александр Владимирович

- 4 МАР 2010

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2010

003493622

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете в лаборатории биохимической генетики кафедры генетики и селекции биолого-почвенного факультета

Научный руководитель: доктор биологических наук

Марина Владимировна Падкина

Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор

Владимир Николаевич Кокряков НИИ экспериментальной медицины РАМН

доктор биологических наук Борис Александрович Маргулис Институт цитологии РАН

Ведущее учреждение:

ГОУ "Санкт-Петербургский государственный политехнический университет"

- J£ ^

Защита состоится ' ?/" ULOpto, 2010 г. в /О часов на заседании совета

Д212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при

Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034

Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный

факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке

им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан "03" q>Qg,PQ/)S) 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Л.А.Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие генной инженерии позволило получать белки медицинского назначения в различных системах экспрессии. Наибольший интерес представляют интерфероны (ИФН) - группа биологически активных белков, синтезируемых клетками в ходе защитной реакции в ответ на вирусное воздействие. Многообразие физиологических функций ИФН указывает на их контрольно-регуляторную роль в сохранении гомеостаза. ИФН обладают противовирусными, антимикробными, противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами. В геноме человека присутствуют 13 структурных генов ИФН-а (INFA) . Для некоторых генов (INFA1, INFA2, INFA4) обнаружено явление полиморфизма (Hussain et al., 1997; Pestka, 2000). Несмотря на высокую степень гомологии ИФН-а, спектр активностей может различаться. Например, ИНФ-а8 и ИНФ-а17 оказались более эффективными в лечении ряда вирусных заболеваний, чем наиболее изученный ИНФ-а2Ь (Garcia et al., 2006; Escuret et al., 2006). ИФН-а16 интересен тем, что этот белок относится к подтипу ИФН-а4, который совместно с ИФН-а1 и ИФН-а2 составляет основную фракцию интерферонов в индуцированных лейкоцитах (Hiscott et al., 1984). Доклинические испытания рекомбинантного ИФН-а 16 человека показали, что белок имеет более высокую антивирусную активность по сравнению с Реафероном® (ИФН-а2а). Изучение различных представителей семейства интерферонов-альфа позволит установить особенности происхождения генов INFA, причины многообразия свойств ИФН-а и определит наиболее эффективные области их практического использования.

В настоящее время существуют лекарственные препараты, созданные на основе Escherichia coli, основой которых являются рекомбинантные интерфероны-альфа: а2а, а2Ь, а2с. Длительное применение рекомбинантных ИФН бактериального происхождения сопровождается побочными эффектами. Поэтому улучшение фармакологических свойств рекомбинантных ИФН весьма актуально. Существуют два пути решения этой проблемы. Использование эукариотических систем экспрессии, в часности, дрожжевых, позволяет осуществлять корректную посттрансляционную модификацию рекомбинантных белков, препараты не содержат бактериальных пирогенов и эндотоксинов, что позволяет снизить спектр побочных эффектов и значительно улучшить качество жизни пациентов в период длительного лечения. Увеличение периода полужизни рекомбинантного ИФН для снижения частоты инъекций препарата достигается модификацией молекулы белка. Перспективным подходом является создание химерных молекул, содержащих ИФН-а, ковалентно сшитый с полиэтиленгликолем (ПЭГ) или альбумином. При создании химерных белков следует учитывать, что их свойства могут зависеть от выбранной системы экспрессии, способа создания "гибридного" гена и от условий выделения и очистки.

Очевидно, что оптимальным является использование двух предложенных подходов.

В последнее время для производства рекомбинантных белков различного происхождения используют метилотрофные дрожжи РгсЫа ршот, которые обеспечивают высокий уровень продукции и корректную посттрансляционную модификацию гетерологичных белков и позволяют получать секреторные белки, практически аутентичные белкам млекопитающих (Сеге§Ыпо е/ а1., 2002). Регуляция экспрессии генов, влияние особенностей метаболизма на уровень синтеза гетерологичных белков в дрожжах Р. раНопя изучены недостаточно.

Цель и задачи работы. Цель работы состояла в создании штамма метилотрофных дрожжей Р. раШг15 продуцента химерного белка "Альбумин-ИФН-а16" и изучении факторов, влияющих на уровень секреции и биологическую активность рекомбинантного белка. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Создание вектора экспрессии, обеспечивающего синтез и секрецию химерного белка "Альбумин-ИФН-а16" в дрожжах Р. раяЮт.

2. Получение штамма дрожжей Р. рскШгк, секретирующего химерный белок "Альбумин-ИФН-а16".

3. Изучение динамики синтеза химерного белка и его влияния на жизнеспособность штамма-продуцента.

4. Анализ влияния условий культивирования дрожжей на уровень секреции рекомбинантного белка и его биологическую активность.

5. Разработка схемы очистки химерного белка из культуральной среды. Научная новизна исследования. Впервые получен штамм дрожжей Р. раз/опя, продуцирующий химерный белок "Альбумин-ИФН-а16" (Альбурон16). Показано, что, в отличие от дрожжей 8асскаготусе$ сегеу1я1ае, синтез гибридного белка не оказывает токсичного действия на клетки дрожжей Р. рскЮт, при этом белок не накапливается в клетке и секретируется в биологически активной форме. Продемонстрировано, что использование 0,5 М неорганического фосфата, снижение температуры и аэрации на стадии индукции синтеза повышает уровень продукции Альбурона16. Установлено, что химерный белок способен агрегировать за счет гидрофобных взаимодействий. Обнаружено, что дрожжи Р. ра$1от в норме секретируют протеолитические ферменты, которые способны расщеплять гибридный белок. Предложена гипотеза, объясняющая возможные причины появления протеаз в культуральной жидкости и их роль в метаболизме дрожжевых клеток. Практическая ценность. Созданный штамм дрожжей Р. ра.ч1опз продуцент рекомбинантного химерного белка Альбумин-ИФН-а16 08115АЬРЫ1б может быть использован для производства отечественного препарата Альбурона16, обладающего улучшенными фармакологическими свойствами по сравнению с немодифицированными рекомбинантными интерферонами. Условия оптимизации процессов культивирования полученного штамма-продуцента и схемы очистки рекомбинантного белка могут быть положены в основу технологического регламента для такого производства. Полученные в работе данные о влиянии различных факторов на уровень секреции и биологическую активность химерного белка, а также разработанные схемы очистки могут быть

использованы для создания штаммов дрожжей P. pastoris продуцентов других сшитых с альбумином белков - ИФН-р, интерлейкин-2, и др. Положения, выносимые на защиту:

1. Присоединение альбумина к ИФН-а16 без линкерных аминокислот не снижает биологическую активность интерферона.

2. Дрожжи P. pastoris осуществляют корректный фолдинг химерного белка. Синтез гетерологичного белка не влияет на жизнедеятельность клеток.

3. Протеазы, в норме секретируемые дрожжами P. pastoris, специфически расщепляют альбумин, что необходимо учитывать при использовании данной системы экспрессии для получения сшитых с альбумином рекомбинантных белков.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на III Московском международном конгрессе "Биотехнология — состояние и перспективы развития" (Москва, 2005), международной школе-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология" (Москва, Пущино, 2006), XI международной школе-конференции "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2007), итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы" (Москва, 2007), международной конференции Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting (Торонто, 2008), V съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (Москва, 2009), III международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины" (Ростов-на-Дону, 2009).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов. Список литературы включает 306 источников (17 публикаций отечественных авторов и 289 публикаций иностранных авторов). Работа изложена на 198 страницах машинописного текста и содержит 50 рисунков и 6 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ösil 1071 1ХП751 1117890)

Рис. 1. Схема плазмиды pPIC9AbFN.

Штаммы. Для амплификации плазмид был использован штамм HB 101 Е. coli (Маниатис и др., 1984). Для получения штамма-продуцента химерного белка, состоящего из альбумина (HSA) и ИФН-а16 человека, использовали штамм дрожжей Р. pastoris GS 115 (his4) ("Invitrogcn", США).

Культивирование полученного штамма GS115AbFN16 (кроме специальных экспериментов) осуществляли в два этапа. На первом этапе на среде BMG

U-

(пептон, глицерин, дрожжевой экстракт) или BMG2 (глицерин, дрожжевой экстракт) происходил рост клеточной биомассы, а на втором на среде ВММ (пептон, метанол, дрожжевой экстракт) или ВММ2 (метанол, дрожжевой экстракт) соответственно - индукция синтеза гетерологичного белка. Плазмиды. При конструировании плазмидного вектора рР1С9дьш (рис.1) использовали плазмиды pRSAbFN (Парфенова, 2005) и pPIC9 ("Invitrogen", США).

Вектор pRSawn содержит последовательности генов HSA (1800 п.о.) и INFA16 (500 п.о.) человека.

Методы. Рестрикционный анализ, электрофорез в геле агарозы и полиакриламидном геле (ПААГ), выделение фрагментов ДНК из геля, лигирование, выделение плазмидной ДНК из бактерий и хромосомной ДНК из дрожжей, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), трансформацию бактерий и дрожжей проводили в соответствии со стандартными методиками (Маниатис и др., 1984; Fujimura a. Sakuma, 1997; Yamada et al., 1998). Для проведения ПЦР использовали Taq-полимеразу ("Силекс", г. Москва) и следующие праймеры:

5'-CGGGATCCAAACGATGAAGTGGGTACC-3' - прямой к гену HSA;

5'-GGAATTCCTCAATCCTTCCTTCTTAATCCT-3'-o6panibiñ к гену INFA16. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Электрофорез белков в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) проводили по методу Лэммли (Laemli, 1970). Для анализа электрофореграмм использовали компьютерную программу «ImageJ1.32» (URL: http:rsb.info.nih.gov/ij/): Электроперенос белков с ПААГ на нитроцеллюлозу и гибридизацию с антителами к ИФН-а2 и HSA проводили по стандартному методу (Bidwai et al., 1992). Фракцию микросом и белки клеточной оболочки дрожжей P. pastoris выделяли по методу, предложенному Салиола (Salióla et al., 2004). Гель-фильтрацию на Сефакриле S-200 проводили в 20 мМ натрий-ацетатном буфере рН 5,5 и 50 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7,0. Гель-фильтрацию на BioRad Р-300 проводили в 20 мМ натрий-ацетатном буфере рН 5,5; в отдельных экспериментах буфер дополнительно содержал 0,05% Tween-20 или 0,05% SDS. Гель-фильтрацию на Сефадексе G-25 проводили в 50 мМ буфере трис-HCl рН 7,5; фосфатном буфере (PBS) рН 6,5 и 50 мМ натрий-ацетатном буфере рН 5,5. Хроматографию на голубой сефарозе Cibacron F3GA проводили в 20 мМ натрий-ацетатном буфере рН 5,5; белки элюировали последовательно 200 мМ KSCN и 500 мМ KSCN в стартовом буфере и 50 мМ трис-HCl рН 8,5. Ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе проводили в 50 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7,0; элюцию химерного белка осуществляли 0,35 М NaCl в стартовом буфере. Хроматографию на фенил-сефарозе CL-4B проводили в 50 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7,0 с добавлением сульфата аммония до конечной концентрации 1,5 М, после чего проводили ступенчатую элюцию белков 1,0 М и 0,5 М сульфатом аммония в стартовом буфере, стартовым буфером и 30% изопропиловым спиртом (ИПС). Раствор с химерным белком после элюции с фенил-сефарозы диализовали против 20 мМ натрий-ацетатного буфера рН 5,5. Биологическую активность Альбурона16 определяли по подавлению цитопатической активности вируса везикулярного стоматита в первичной культуре L-41 кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, чувствительной к ИНФ a-типа (Liu et al., 2001). В качестве

стандарта использовали человеческий лейкоцитарный интерферон ОСО 42-2890-87 (ГИСК, Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Создание штамма дрожжей P. pastoris - продуцента химерного белка Альбурона16. Уровень синтеза химерного белка может зависеть от положения генов HSA и IFNA16 в интегративной кассете, наличия или отсутствия линкера между ними, свойств промотора и копийности клонированного гена. При конструировании химерного гена AbFNlô ген HSA соединяли с геном 1NFA16 без линкерных нуклеотидов, поскольку присутствие дополнительных аминокислот могло нарушить трехмерную структуру синтезируемого белка и привести к потере биологической активности. В предварительных экспериментах было показано, что дрожжи P. pastoris оказались более эффективными продуцентами HSA, чем ИФН-а16. Располагая HSA в N-концевой части химерного белка, мы рассчитывали увеличить уровень продукции Альбурона16, обеспечить корректное замыкание дисульфидных связей в молекуле ИФН-а16 (Cysl-Cys98) и сохранение биологической активности. Для создания вектора экспрессии рР1С9Аьш (рис.1) химерный ген AbFNlô клонировали в плазмиде рР1С9 под контролем промотора и терминатора гена алкогольоксидазы1 (АОХ1) дрожжей P. pastoris. Сигнальная последовательность фактора MFal дрожжей S. cerevisiae, которая присутствует в плазмиде, обеспечивает секрецию гетерологичного белка в культуральную среду. Использование сильного индуцибельного промотора гена AOXI позволяет регулировать экспрессию гетерологичного гена сменой источника углерода. При трансформации дрожжей штамма GS115 плазмидой рР1С9Аь™ происходило замещение экспрессионной кассетой хромосомной копии гена

АОХ1 за счет процесса гомологичной рекомбинации (рис. 2).

Полученные трансформанты приобретали фенотип

His+Muts, являлись

прототрофами по гистидину и медленно росли на среде с метанолом за счет минорного изозима Аох2р. Факт интеграции химерного гена AbFNlô в геном

трансформантов His+Muts подтверждали методом ПЦР. Для дальнейшей работы отобрали трансформанты с повышенным уровнем синтеза гетерологичного белка, что могло быть обусловлено

— ' ......■■ ...... | r.AOtti |j AbFNli g HIS4 |г*<m | ■ !

ч. ДНК-

Рис. 2. Схема интеграции экспрессионной кассеты в локус АОХ1 хромосомной ДНК Р. pastoris.

спонтанной интеграцией нескольких копий клонированного гена (Romanos et al., 1991b).

(а) (б) (в)

Рис. 3. Электрофореграмма (а) и иммуноблоттинг (б, в) белков культуральной среды штаммов (¡8115, 08115Н8Л, С8115а16 и С8115АЬР1\16 дрожжей Р. раМогк.

(а) 1 - Маркеры молекулярной массы; 2 - С8115; 3 - С8115о16; 4, 5 - С8115АЬРМ6; 6 - С8115Н8А.

(б) Антитела к ИФН-а2. 1 - С8115; 2 - С8115а16; 3 - С8115АЬРМ6; 4 - маркеры молекулярной массы.

(в) Антитела к НвА. 1 - С8115АЬКШ6; 2 - С8115Н8А; 3 - маркеры молекулярной массы.

После выращивания трансформантов анализировали культуральную среду методом электрофореза в ПААГ в присутствии ББв. В качестве контрольных штаммов в идентичных условиях выращивали исходный штамм 08115, штамм-продуцент НБА человека - СБ 115Н8А и штамм-продуцент ИФН-а16 -08115а16. Трансформанты 08115АЬРМ16 синтезировали белок, который давал положительную реакцию с моноклональными антителами к ИФН-а2 и Н8А, и имел молекулярную массу 86 кДа, что соответствует ожидаемой молекулярной массе Альбурона16 (рис. За-в).

Изучение динамики синтеза и секреции химерного белка. Достоинством системы экспрессии Р. ра81оп$ является возможность получения секреторных продуцентов рекомбинантных белков человека, поскольку секретируемые белки не оказываются гипергликозилированными, а по строению углеводных компонентов схожи с гликопротеинами высших эукариот. Сигналом транслокации химерного белка в эндоплазматический ретикулум (ЭПР), транспорта в аппарат Гольджи (АГ), к плазматической мембране и его секреции в культуральную среду является МБа1 дрожжей cerevisiae. Известно, что синтез гетерологичных белков в дрожжах сегеуг'л/'ае может негативно влиять на метаболизм штамма-продуцента (Парфенова и др., 2002). Данные о влиянии продукции гетерологичных белков на дрожжи Р. раА'1ош отсутствуют. В случае секреторных продуцентов неправильно свернутые рекомбинантные белки могут агрегировать и накапливаться в ЭПР, что вызовет развитие ответа на несвернутые белки (иРЯ) и клеточную гибель. Для того чтобы выяснить, не происходит ли задержка химерного белка в процессе секреции, изучили

Без метанола 4 часа

кДа 116

24 часа 48 часов

10 1112 13 1415 16

1 : i

динамику Альбурона16 микросомальной белках клеточной

появления в

фракции, оболочки и штамма-

I ГП"

Рис. 4. Анализ динамики секреции химерного белка методами электрофореза в ПААГ с 81)8 (а) и иммуноблогтинга (б). Стрелками указано расположение химерного белка.

1, 5, 9, 13 - маркеры молекулярной массы

2, 6,10,14 - культуральная среда

3, 7,11, 15 -белки клеточной оболочки

4, 8,12,16 - фракция микросом

культуральнои среде продуцента (рис. 4). Мы выяснили, что химерный белок появляется в

микросомальной фракции через 24 часа после начала индукции синтеза, в следовых количествах присутствует в ней через 48 часов. Следовательно, Альбурон16 не накапливается в ЭПР. В культуральной жидкости количество

рекомбинантного белка

возрастало в течение 48 часов индукции синтеза. Среди белков клеточной оболочки рекомбинантный белок не был обнаружен. Секретируемый химерный белок Альбурон16 обладал биологической

активностью и взаимодействовал с моноклональными антителами к HSA и ИФН-а2. Полученные результаты говорят о том, что в ходе своего синтеза и секреции в дрожжах P. pastoris Альбурон16 принимает пространственную структуру, обеспечивающую выполнение его биологических функций. Негативное влияние гетерологичного белка на жизнеспособность продуцентов S. cerevisiae и Е. coli может приводить к потере рекомбинантных плазмид и раннему выходу клеток на стационарную фазу роста (Remaut et al., 1986; Парфенова и др., 2002). Мы показали, что штамм GS115AbFN16 дрожжей Р. pastoris сохранял фенотип His+Muts в течение длительного времени при многократных пересевах, экспрессия чужеродного гена не влияла на параметры роста клеточной культуры.

Таким образом, синтез гетерологичного химерного белка не оказывает токсичного действия на метаболизм дрожжей Р. pastoris.

Изучение влияния условий культивирования штамма GS115AbFN16 на уровень секреции Альбурона16. Условия культивирования штаммов-продуцентов - интенсивность аэрации, время и температура, концентрация основных компонентов среды могут влиять на выход белка. Мы показали, что максимальный выход биомассы наблюдается при отношении Укуль1. ЖИДКости / У воздушной среды равном 1:4, что подтверждает важную роль процессов дыхания в метаболизме метилотрофных дрожжей. В то же время, оказалось, что на стадии индукции синтеза рекомбинантного белка оптимальным является отношение 1:1 (рис. 5а).

«О <

б) <

ч А А ч г А А 11

1 1 \ ? 1/ I 1 ! ! I /

, /V..

I /»АЛ,

1 ( п А

1 | V 11 ! У \ | 11 / 1

л/М'

Й*

'к

М.

•1»

У в)

Рис. 5. Денситограмма белков культуральной среды после культивирования штамма С8115АЬР1Ч16 в различных условиях. Черным цветом отмечены пики, соответствующие Альбурону16, серым - продукты его протеолиза. 1 - маркеры молекулярной массы.

а) Зависимость уровня продукции гетерологичного белка от отношения \/Кул1.туралыюй ЖИДКОСТИ / ^В03дуШП0й среды на стадии индукции синтеза: 2) - культуральная среда штамма С8115АЬР1\16 без добавления метанола; 3) -1:4; 4) - 2:3; 5) - 1:1.

б) Влияние концентрации фосфата в культуральной среде на уровень продукции химерного белка: 2) - культуральная среда ВМС без добавления метанола (контроль); 3) - 0,1 М натрий-цитратный буфер рН 6,0; 4) - 0,05 М калий-фосфатный буфер рН 6,0; 5) - 0,1 М калий-фосфатный буфер рН 6,0.

в) Влияние времени и температуры на выход химерного белка и его протеолиз: 2) -исходный штамм С8115; 3) - 48 часов при 30"С; 4) - 48 часов при 25°С; 5) - 48 часов при 20°С; 6) - 96 часов при 30°С; 7) - 96 часов при 25°С; 8) - 96 часов при 20°С.

Известно, что неорганический фосфат (Р^ участвует в регуляции различных процессов в клетках дрожжей 5". сегеушде (ОвЫта, 1997). Данные о регуляции фосфатом метаболизма Р. рав^Ня фрагментарны. Мы показали, что Р1 в концентрации 0,007 М, необходимой для роста клеток, не обеспечивает продукцию рекомбинантного белка. В то же время увеличение концентрации фосфата от 0,05 до 0,1 М снижает уровень секреции химерного белка (рис. 56). Полученные результаты говорят о том, что Р; может принимать участие в регуляции различных этапов синтеза и секреции белков в дрожжах Р. раяЮпя. Выход рекомбинантного белка зависит от времени культивирования и стабильности гетерологичного продукта. При изучении динамики синтеза

Альбурона16 выяснили, что продукция белка увеличивается в течение 48 часов после начала индукции метанолом (рис. 4, 5в).

Более продолжительное культивирование не приводило к увеличению количества белка в культуральной среде, что могло быть обусловлено частичным лизисом клеток и последующей деградацией рекомбинантного белка внутриклеточными протеолитическими ферментами. Мы показали, что проведение индукции синтеза Альбурона16 при температуре 25-30°С сопровождалось появлением в культуральной жидкости белков с молекулярной массой около 25 кДа, 40-45 кДа и 60 кДа (рис. 5в), которые отсутствовали в культуральной среде исходного штамма. Эти результаты позволили предположить, что данные белки могут быть продуктами протеолиза Альбурона16. Снижение температуры до 20°С на стадии индукции синтеза гетерологичного белка увеличивало количество секретируемого белка на ~20-25%, в культуральной среде штамма-продуцента отсутствовали белки с меньшей молекулярной массой (рис. 5в). Возможно, понижение температуры приводит к снижению активности протеаз (Dragosits et al., 2008). Культивирование при 20°С позволило проводить индукцию синтеза рекомбинантного белка в течение 96 часов без снижения количества химерного белка.

Изучение стабильности рекомбинантного химерного белка.

Протеолитическая деградация секретируемых рекомбинантных белков является существенной проблемой. Известно, что в дрожжах S. cerevisiae в процессе секреции белки могут подвергаться протеолитическому расщеплению, по крайней мере, двумя протеазами - Кех2р и Ypslp (Azaryan et al., 1993; Cawley et al., 1995; Lengerwood et al., 1995; Krysan et al., 2005). Ортологи этих ферментов обнаружены и в дрожжах P. pastoris, однако их свойства до конца не изучены (Werten a. Wolf, 2005). Мы показали, что протеолитическое расщепление Альбурона16 происходит в культуральной жидкости и после удаления клеток. Это говорит о том, что дрожжи P. pastoris секретируют протеолитические ферменты в культуральную жидкость. При этом секреция протеаз не являлась ответом клетки на синтез рекомбинантного белка, так как протеазы секретировали не только штаммы-продуценты, но и исходные штаммы дрожжей. Учитывая тот факт, что рекомбинантный ИФН-а16 не расщепляется протеазами в культуральной жидкости (Падкина и др., 2002), можно предположить, что деградации подвергается только альбуминовая часть химерного белка. Мы изучили влияние рН, хелатирующих агентов (ЭГТА, ЭДТА) и ингибитора сериновых протеаз (PMSF) на протеолиз Альбурона16. Протеолитическая деградация химерного белка происходила в широком диапазоне рН (5,5 - 7,5) даже при +4°С. Фрагменты, образующиеся в ходе протеолиза Альбурона16 при рН 5,5 и рН 7,5, различались по молекулярным массам (рис. 6). При рН 7,5 на электрофореграмме присутствовали фрагменты преимущественно с молекулярной массой ~60 кДа, а при рН 5,5 фрагменты с молекулярной массой ~60 кДа, ~ 40-45 кДа, и -33 кДа. В пробах с рН 6,5 спектр белков выглядел как промежуточный вариант между спектрами в пробах с кислым и более щелочным значениями рН. При рН 5,5 Альбурон16 не

кДа

Пк-IK ГрП '

№• *Г ПЫ' МТЛ ЭГТЛ

расщеплялся в пробах с ЭГТА, в то время как при рН 7,5 незначительное снижение уровня протеолиза происходило лишь в пробах с PMSF или ЭДТА. При этом фрагменты белка с молекулярной массой -40-45 кДа обладали биологической активностью, что можно объяснить присутствием в них молекулы ИФН-а16. Полученные результаты позволили предположить, что в протеолизе рекомбинантного белка Альбурона16 участвуют как минимум 2

фермента. Один из них работает в нейтральной или щелочной области рН, является металл-зависимым ферментом и, вероятно, относится к группе сериновых протеаз. Возможно, этим ферментом в дрожжах P. pastoris является ортолог протеазы Кех2р дрожжей S. cerevisiae. Кех2р локализован в АГ и его появление в культуральной жидкости можно объяснить частичным лизисом клеток дрожжей в процессе длительного культивирования. Другой фермент является Са2+-зависимым, работает в кислой области рН. Такими характеристиками обладает, в частности, ортолог аспарагиновой протеазы Ypslp (япсин) дрожжей S. cerevisiae. Япсины S. cerevisiae - это GPI-связанные белки, которые могут быть локализованы в мембране или клеточной стенке в зависимости от аминокислотной последовательности в ю-сайтах. Япсины синтезируются в виде

предшественников, которые в результате автокатализа превращаются в зрелый фермент (Azaryan et al., 1993). Процессинг и активность япсинов зависят от рН. Данные о локализации япсинов и регуляции их активности у P. pastoris недостаточны. Анализ последовательностей аминокислот Ypslp S. cerevisiae и Ypslp P. pastoris (UniProtKB) выявил отличия в m-сайте, которые могут приводить к секреции япсина Р. pastoris в культуральную жидкость. Мы показали, что молекулярная масса продуктов протеолиза Альбурона16 зависит от рН. Вероятно, изменение рН влияет не только на эффективность работы фермента, но и определяет его специфичность. Возможно, способность дрожжей P. pastoris к быстрому росту и накоплению большой биомассы обусловлена секрецией япсинов, которые обеспечивают эффективную утилизацию различных субстратов.

Таким образом, протеолиз секретируемого дрожжами P. pastoris химерного белка Альбурона16, вероятно, может осуществлять также ортолог протеазы Ypslp дрожжей S. cerevisiae. Снижение температуры культивирования,

, Ч,.Лс|>Н5.5

-28 »4 PMSF ЗДГ* ЭТА

Рис.

Влияние агентов, рН на

протеаз

хелатнрующих ингибиторов и активность экстраклеточных дрожжей Р. ра)П>г11 (120 дней инкубации). Стрелками указаны исходный

химерный белок и продукты расщепления.

использование буферных растворов с нейтральным или щелочным значением рН, добавление ЭГТА до конечной концентрации 5мМ позволяют уменьшить активность протеазы и, тем самым, повысить выход рекомбинантного белка и обеспечить сохранение биологической активности.

Выделение и очистка химерного белка Альбурона16. Использование секреторных продуцентов существенно упрощает очистку рекомбинантных белков. Выращивание дрожжей в условиях дефицита азота сопровождается усилением синтеза протеаз и, как следствие, уменьшением количества секретируемого гетерологичного продукта (КоЬауазЫ <?/ а1., 2000). Одним из способов снижения уровня протеолиза секреторных белков является использование культуральных сред с пептоном. Поэтому мы разработали схему очистки Альбурона16 из среды ВММ, включающую стадии ультрафильтрации для концентрирования и удаления низкомолекулярных белков, осаждения 75% сульфатом аммония, гель-фильтрации на Сефакриле 8-200, хроматографии на голубой сефарозе СлЬасгоп РЗОА для удаления примесных белков и гель-фильтрации на Сефадексе 0-25 для смены буферного раствора. Несмотря на 90% очистку целевого белка от примесей и 75% выход, удельная биологическая активность Альбурона16 уменьшалась (табл. 1).

Табл. 1.

Очистка Альбурона1б из культуральной среды ВММ.

Стадии очистки Объем, мл Суммарный белок, мг Биологическая активность, МЕ\мл Удельная биологическая активность, МЕ/мг

Культуральная среда ВММ 1000 90,0 2000 22200

Ультрафильтрация и осаждение 75% сульфатом аммония 20 33,0 317000 576000

Гель-фильтрация на Сефакриле 8-200 80 9,8 15000 101000

Хроматография на СШасгоп РЗСА 10 3,5 7000 65000

Известно, что рекомбинантные ИФН-а и сшитые с альбумином белки образуют агрегаты, в основном, за счет гидрофобных взаимодействий (Ruiz et al., 2003; Chou et al., 2005; Hawe a. Friess, 2007). Мы предположили, что агрегация может быть основной причиной снижения биологической активности химерного белка Альбурона16. Для проверки этого предположения провели фракционирование Альбурона16 на биогеле BioRad Р-300 в присутствии различных детергентов. Фракционирование в присутствии ионного детергента (SDS) приводило к уменьшению первого пика, соответствующего

агрегированным молекулам белка, что свидетельствует о разобщении белковых агрегатов. Добавление неионного детергента (Тшееп-20) в стартовый буфер

способствовало еще большей агрегации белка, о чем свидетельствует уменьшение объема элюции Альбурона16 (рис.

7).

Разное поведение химерного белка, возможно, обусловлено свойствами использованных детергентов. В присутствии БОБ возрастала и биологическая активность химерного белка. При этом активность была максимальной при рН 5,5 (табл. 2), что согласуется с данными о влиянии состава буфера на стабильность и биологическую активность рекомбинантного ИФН-а16 (Падкина и др., 2007). Полученные результаты подтвердили предположение о том, что агрегация химерного белка, обусловленная гидрофобными взаимодействиями, приводит к снижению биологической активности.

Табл. 2.

Зависимость биологической активности химерного белка от рН и состава буфера.

Буферные растворы Биологическая активность, МЕ/мл

Без вБв 0,05% вОв

50 мМ трис-НС1 рН 7,5 8000 40000

Фосфатный буфер (Р1№) рН 6,5 29000 200000

50 мМ натрий-ацетат рН 5,5 320000 400000

Очистка Альбурона16 из среды ВММ2. Осаждение Альбурона16 сульфатом аммония может усиливать гидрофобные взаимодействия, поэтому в дальнейшем осаждали химерный белок полиэтиленгликолем (ПЭГ). После осаждения ПЭГ Альбурон16 не агрегировал, а его биологическая активность оказалась в два раза выше, чем после осаждения сульфатом аммония. Кроме того, индукцию синтеза рекомбинантного белка проводили на среде ВММ2, которая в отличие от ВММ, не содержит пептона. Необходимость подобной модификации среды продиктована тем, что использование пептона животного происхождения при культивировании дрожжей-продуцентов белков медицинского назначения нежелательно.

мл

Рис. 7. Профиль элюции Альбурона16 при гель-фильтрации на Вш11ас1 Р-300 с добавлением и без добавления детергентов. 1-20 мМ натрий-ацетатный буфер рН 5,5; 2 - Т\уесп20 0,05%; 3 - вОЭ 0,05%.

12 3 4 5 6

кДа г^-Г:

116 "вя

66 »*»# . 45

25 .....й

Рис. 8. Электрофореграмма фракций белков после разделения на фенил-сефарозе. 1 - маркеры молекулярной массы; 2 - белки, не сорбированные на колонке; 3 -элюция 1 М (1УН4)2804; 4 - элюция 0,5 М (1ЧН4)28 04 ; 5 - элюция 50 мМ натрий-фосфатным буфером рН 7,0; 6 - элюция 30% изопропиловым спиртом.

Новая схема очистки Альбурона16 включала следующие стадии: ультрафильтрацию для

концентрирования среды и удаления примесных белков с молекулярной массой меньше 50кДа; обработку культуральной среды тетраборатом натрия для удаления полисахаридов; ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе для удаления основных примесных белков; осаждение рекомбинантного белка 25% ПЭГ 3350; гель-фильтрацию на Сефакриле 8-200 для удаления остатков ПЭГ и белков с меньшей молекулярной массой; хроматографию на фенил-сефарозе для удаления остаточных количеств примесных белков и продуктов протеолиза (рис. 8).

Использование данной схемы позволило получить на 85% очищенный препарат Альбурона16 с конечным выходом 80% без потери биологической активности (табл. 3). Удельная активность очищенного препарата гибридного белка Альбурона16 составляла 0,4-1,0x106 МЕ/мг. Учитывая, что молекулярная масса альфа16-интерферона человека 20 кДа, а молекулярная масса альбумина — 66 кДа, доля активного компонента: альфа 16-интерферона человека, в молекуле гибридного белка составляет примерно 23%. Исходя из этого, можно заключить, что присоединение альбумина не приводит к существенному снижению биологической активности

альфа16-интерферона человека, которая составляет 0,3 - 1,1x10 (Падкина и др., 2009).

МЕ/мг

Табл. 3.

Очистка Альбурона16 из культуральной среды ВММ2.

Стадии очистки Объем, мл Суммарный белок, мг Альбурон16, мг Биологическая активность, МЕ\мл Удельная биологическая активность, МЕ/мг

Культуральная среда ВММ2 1000 40,0 3,2 640 16000

Ультрафильтрация и хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 20 9,0 3,0 52000 116000

Осаждение ПЭГ и Гель-фильтрация на Сефакриле 8-200 30 6,6 2,7 35000 165000

Хроматография на фенил-сефарозе 4 3,0 2,6 286000 375000

Разработанная нами схема очистки Альбурона16 из культуральной среды ВММ2 дрожжей P. pastoris, может быть легко масштабирована и усовершенствована с помощью технологии STREAMLINE™, что может способствовать внедрению в производство технологии получения нового лекарственного препарата на основе рекомбинантного химерного белка Альбурона16.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, нами впервые получен штамм дрожжей P. pastoris продуцент гибридного рекомбинантного белка Альбурона16, состоящего из альбумина человека и лейкоцитарного интерферона-а16, защищенный патентом Российской Федерации (Падкина и др., 2009). Мы показали, что присоединение альбумина не влияет на биологическую активность ИФН-а16. Использованный способ конструирования вектора, а именно: отсутствие линкера между геном HSA и INFA16 и расположение гена HSA со стороны 5'-конца экспрессионной кассеты, способствовало правильному замыканию -S-S- связей в молекуле ИФН-а16 и сохранению конформации белка, что обеспечило выполнение им биологических функций. Изучение динамики секреции химерного белка показало, что Альбурон16 не накапливается в ЭПР и не задерживается на поверхности клетки, а его секреция происходит в течение 48 часов после начала индукции. При этом синтез чужеродного белка не влияет на параметры роста клеточной культуры, а полученный штамм-продуцент стабилен в течение длительного времени. Оптимизация условий культивирования позволила увеличить конечный выход целевого продукта на ~30%. Мы обнаружили в культуральной среде дрожжей P. pastoris как минимум две протеазы, присутствие которых не является ответом клетки на синтез гетерологичного белка. Одна из протеаз, по-видимому, относится к группе япсинов и секретируется в среду, а другая, возможно, является ортологом Кех2р S. cerevisiae. Появление Кех2р в культуральной жидкости можно объяснить частичным лизисом клеток в ходе культивирования. Изучение свойств экстраклеточных протеаз позволило снизить уровень протеолиза рекомбинантного белка за счет повышения значения рН и добавления хелатирующих соединений, связывающих ионы Са2+. Мы обнаружили, что химерный белок может агрегировать и при этом терять биологическую активность. Были предложены условия выделения и хранения белка, при которых не происходит его агрегации и сохраняется биологическая активность. Результаты наших исследований могут быть использованы для создания на основе метилотрофных дрожжей P. pastoris продуцентов новых химерных молекул (например, ИФН-Альбумин-ИФН, ИФН-АТ и др.), для оптимизации условий культивирования штаммов дрожжей продуцентов различных рекомбинантных белков и для усовершенствования способов очистки этих белков.

выводы

1. Полученный впервые штамм GS115AbFN16 дрожжей Pichia pastoris обеспечивает синтез химерного белка Альбурона16, состоящего из альбумина и ИФН-а16 человека. Присоединение альбумина не влияет на биологическую активность ИФН-а16.

2. Изучение динамики секреции химерного белка показало, что рекомбинантный белок не оказывает негативного влияния на клетки дрожжей, не накапливается в ЭПР и не остается на поверхности клетки.

3. Продукция химерного белка зависит от концентрации неорганического фосфата и увеличивается при снижении степени аэрации и температуры культивирования до 20°С на стадии индукции синтеза.

4. В культуральной жидкости дрожжей Р. pastoris присутствуют протеазы, секреция которых не является ответом клетки на синтез чужеродного белка.

5. Рекомбинантный химерный белок, секретируемый дрожжами Р. pastoris, подвергается протеолитической деградации, степень которой зависит от присутствия ионов кальция и значения pH. Совокупность данных о свойствах протеаз дрожжей и размерах фрагментов позволили предположить, что в расщеплении Альбурона16, возможно, участвует аспарагиновая протеаза Ypslp дрожжей Р. pastoris.

6. Обнаружена способность химерного белка к агрегации за счет гидрофобных взаимодействий, что приводит к значительному снижению его биологической активности.

7. Разработаны схемы очистки Альбурона16 из культуральных сред, позволяющие предотвратить его агрегацию и получать на 85% очищенный рекомбинантный белок с сохранением биологической активности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карабельский A.B., Падкина М.В. Рекомбинантные интерфероны-альфа человека пролонгированного действия // Вестник СПбГУ. 2007. сер. 3. вып. 4. С. 45-53.

2. Карабельский A.B., Зиновьева Ю.Г., Смирнов М.Н., Падкина М.В. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris продуцентов химерных белков "альбумин-интерлейкин-2" и "альбумин-интерферон-а16" // Вестник СПбГУ. 2009. сер. 3. вып. 2. С. 52-62.

3. Падкина М.В., Карабельский A.B., Зиновьева Ю.Г., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. Способ получения рекомбинантных белков, модифицированных присоединением альбумина человека, из культуральной жидкости дрожжей // Патент РФ RU 2373286 С2. 2009.

4. Падкина М.В., Доброгорская М.В., Карабельский A.B., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. Способ получения фармацевтического препарата из культуральной среды дрожжей и фармацевтический препарат на основе альфа интерферона человека (варианты) // Заявка № 2007143928. Дата приоритета 29.11.07. Решение о выдаче патента РФ 26.09.09.

5. Карабельский A.B., Парфенова J1.B., Смирнов М.Н., Падкина М.В. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris продуцента гибридного белка "Альбуферона16". III Московский международный конгресс "Биотехнология - состояние и перспективы развития". 2005. С. 74-75.

6. Карабельский A.B., Падкина М.В. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris продуцента гибридного белка "Альбурона16". Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология». 2006. С. 206-208.

7. Карабельский A.B., Зиновьева Ю.Г., Падкина М.В. Изучение протеолитического расщепления химерных рекомбинантных белков, секретируемых метилотрофными дрожжами Pichia pastoris. 11 международная школа-конференция "Биология - наука XXI века". 2007. С. 205.

8. Падкина М.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н., Градобоева А.Е., Доброгорская М.В., Карабельский A.B., и др. Получение и совершенствование штаммов дрожжей Pichia pastoris продуцентов высокоселективных лекарственных препаратов на основе альфа 16-интерферона человека и химерного белка, состоящего из целевого белка и альбумина плазмы крови человека . Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы". 2007, С. 105-107.

9. Alexander V. Karabelsky, Marina V. Padkina. The development of Pichia pastoris strain producing recombinant fiision protein "human serum albumin-IFNal6" and optimization of yeast cultivation process. Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting. 2008. P. 266.

10.Карабельский A.B., Падкина М.В. Оптимизация условий культивирования штаммов дрожжей Pichia pastoris продуцентов рекомбинантных белков. V съезд Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров. 2009. ч. 1. С. 545.

11. Карабельский A.B., Падкина М.В. Альбурон 16: противовирусный лекарственный препарат нового поколения, синтезируемый в дрожжах. III международная научно-практическая конференция "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины". 2009. С. 184-185.

Подписано в печать «25» января 2010 года. Формат 60x84 1/16.

Усл. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 236. Отпечатано в Цифровом Копировальном Центре «Средний, 28» 199004, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., 28. Тел.: (812) 323-40-44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карабельский, Александр Владимирович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. РЕКОМБИНАНТНЫЕ а-ИНТЕРФЕРОНЫ ЧЕЛОВЕКА: ПРОДУКЦИЯ И ПУТИ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ (обзор литературы).

1.1 Классификация интерферонов.

1.2 Интерферон-альфа.

1.2.1 Рецептор интерферона-альфа и сигнальная трансдукция.

1.2.2 Молекулярный механизм действия интерферона.

1.2.3 Биологическая активность интерферона-альфа и его место в иммунном ответе.

1.2.4 Клиническое применение.

1.3 Интерфероны-альфа пролонгированного действия.

1.3.1 Пегилирование.

1.3.1.1 Физико-химические свойства ПЭГ и пегилированных белков.

1.3.1.2 Фармакокинетические и фармакодинамические свойства ПЭГ-модифицированных пептидов.

1.3.1.3 Достоинства и недостатки ПЭГ-модифицированных пептидов.

1.3.2 Липидизирование.

1.3.3 Химерный белок "Альбумин-ИФН-а".

1.4 Создание продуцентов гетерологичных белков на основе микроорганизмов

1.4.1 Экспрессия гетерологичных эукариотических генов в дрожжах.

1.4.2 Производство гетерологичных белков в метилотрофных дрожжах Р. pastoris.

1.5 Секреция рекомбинантных белков в дрожжах P. pastoris.

1.5.1 Процессинг синальной последовательности.

1.5.2 Гликозилирование.

1.5.3 Фолдинг секреторных белков в ЭПР.

1.5.3.1 Шапероны ЭПР.

1.5.3.2 Формирование дисульфидных связей и цис-транс-пептидилпролин изомеризация.

1.5.3.3 Деградация неправильно сложенных белков.

1.5.3.4 UPR - Реащия несвернутых белков.

1.5.4 Внутриклеточные и экстраклеточные протеазы дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris.

1.5.4.1 Сериновые протеазы.

1.5.4.2 Аспарагиновые протеазы семейства япсинов.

1.5.4.3 Способы снижения активности протеолитических ферментов в дрожжевых системах экспрессии.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Штаммы.

2.1.2 Условия культивирования штаммов.

2.1.3 Плазмиды.

2.2 Методы.

2.2.1 Трансформация бактерий Е. coli.

2.2.2 Трансформация дрожжей по методу PLATE.

2.2.4 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.2.6 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.

2.2.8 Полимеразная цепная реакция.

2.2.9 Выделение хромосомной ДНК из дрожжей.

2.2.10 Определение концентрации белка.

2.2.11 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии SDS.

2.2.13 Выделение фракции микросом и белков клеточной оболочки из клеток дрожжей P. pastoris.

2.2.14 Осаждение белков.

2.2.15 Разделение белков в растворе. Гель-фильтрация.

2.2.16 Разделение белков путем адсорбции. Хроматографические методы.

2.2.17 Определение биологической активности Альбурона16.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.;.

3.1 Создание штамма дрожжей P. pastoris - продуцента химерного белка Альбурона16.

3.1.1 Создание вектора экспрессии pPIC9AbFN.

3.1.2 Получение трансформантов дрожжей P. pastoris, несущих химерный ген AbFN16.

3.1.3 Анализ продукции гетерологичного химерного белка трансформантами P. pastoris.

3.2 Изучение динамики синтеза и секреции химерного белка.

3.3 Изучение влияния условий культивирования штамма GS115AbFN16 на уровень секреции Альбурона16.

3.3.1 Влияние аэрации и способа культивирования на выход биомассы клеток и уровень синтеза белка.:.

3.3.2 Влияние неорганического фосфата на продукцию химерного белка.

3.3.3 Влияние температуры и времени культивирования на уровень продукции химерного белка.

3.3.4 Анализ продуктов протеолиза Альбурона16.

3.3.5 Анализ влияния рН, температуры, ЭДТА, ЭГТА, PMSF и состава культуральной среды на активность экстраклеточных протеаз дрожжей Р. pastoris.

3.4 Выделение и очистка химерного белка Альбурона16.

3.4.1 Очистка Альбурона16 из среды ВММ.

3.4.2 Очистка Альбурона16 из среды ВММ2.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение факторов, влияющих на секрецию и биологическую активность химерного белка "Альбумин-интерферон-альфа16", синтезируемого дрожжами Pichia pastoris"

Актуальность проблемы

Развитие методов клонирования ДНК способствовало появлению новых направлений в биологии: молекулярной биотехнологии, метаболической инженерии, биофармакологии и др. В основе многих исследований лежит получение с помощью микроорганизмов препаративных количеств белков медицинского назначения и изучение их свойств. На данный момент создано большое количество систем гетерологичной экспрессии, обеспечивающих синтез белков человека, в том числе и интерферонов. Интерфероны - это группа биологически активных белков, синтезируемых клеткой в ходе защитной реакции в ответ на вирусное воздействие. Благодаря своим антипролиферативным свойствам и способности подавлять репликацию, вирусов ИФН-а активно используют в терапии гепатита, стоматита, лейкемии, меланомы и саркомы. Кроме того, не исключается возможность применения ИФН и в лечении ВИЧ-инфекций. Существующие на рынке препараты рекомбинантного ИФН-а созданы на основе Escherichia coli. Длительное применение рекомбинантных ИФН бактериального происхождения сопровождается побочными эффектами. Поэтому особенно актуальной на сегодняшний день является проблема улучшения фармакологических свойств рекомбинантных интерферонов. Существуют два пути решения этой проблемы.

Первым подходом, позволяющим улучшить фармакологические свойства рекомбинантных цитокинов, является использование эукариотических систем экспрессии. Препараты, созданные на основе белков, синтезируемых дрожжами, намного легче переносятся пациентами, так как не содержат бактериальных пирогенов и эндотоксинов, что позволяет снизить спектр побочных эффектов и значительно улучшить качество жизни пациентов в период длительного лечения.

Второй путь — это модификация молекулы ИФН, направленная на увеличение периода его полужизни в плазме крови. Создание химерных молекул, например, ковалентное присоединение альбумина к молекуле ИФН-а, способно значительно улучшить его фармакокинетический профиль, что позволит осуществлять менее частые инъекции препарата, сохранив при этом его антивирусные и антипролиферативные свойства. Тем не менее, при создании химерных белков следует учитывать, что их свойства могут зависеть от выбранной системы экспрессии, способа создания "химерного" гена и от условий выделения и очистки.

Очевидно, что оптимальным является использование двух предложенных подходов.

В последнее время для производства рекомбинантных белков различного происхождения используются метилотрофные дрожжи Pichia pastoris, которые обеспечивают высокий уровень продукции и корректную посттрансляционную модификацию гетерологичных белков и позволяют получать секреторные белки, практически аутентичные белкам млекопитающих. Однако данный вид дрожжей еще не достаточно хорошо изучен по сравнению с дрожжами Saccharomyces cerevisiae, поэтому важными являются исследования, направленные на изучение влияния параметров культивирования и особенностей метаболизма дрожжей P. pastoris на уровень синтеза гетерологичных белков и их биологическую активность.

Целью работы является создание штамма метилотрофных дрожжей P. pastoris продуцента химерного белка "Альбумин-ИФН-а16" и изучение факторов, влияющих на уровень секреции и биологическую активность рекомбинантного белка.

В задачи исследования входит:

• создание вектора экспрессии, обеспечивающего синтез и секрецию химерного белка "Альбумин-ИФН-а16" в дрожжах P. pastoris;

• получение штамма дрожжей P. pastoris, секретирующего химерный белок "Альбумин-ИФН-а16";

• изучение динамики синтеза химерного белка и его влияния на жизнеспособность штамма-продуцента;

• анализ влияния условий культивирования клеток на уровень секреции рекомбинантного белка и его биологическую активность;

• разработка схемы очистки химерного белка из культуральной среды.

Научная новизна исследования Впервые получен штамм дрожжей P. pastoris, продуцирующий химерный белок "Альбумин-ИФН-а 16" (Альбурон16). Показано, что, в отличие от дрожжей S. cerevisiae, синтез гибридного белка не оказывает токсичного действия на клетки дрожжей P. pastoris, при этом белок не накапливается в клетке и секретируется в биологически активной форме. Продемонстрировано, что использование 0,5 М неорганического фосфата, снижение температуры и аэрации на стадии индукции синтеза повышают уровень синтеза Альбурона16. Показано, что химерный белок имеет тенденцию к агрегации за счет гидрофобных взаимодействий. Обнаружено, что дрожжи P. pastoris секретируют протеолитические ферменты, которые осуществляют расщепление гибридного белка. Предложена гипотеза, объясняющая механизмы секреции протеаз и их возможную роль в метаболизме дрожжевых клеток.

Практическая ценность

Созданный в настоящей работе на основе дрожжей P. pastoris штамм-продуцент рекомбинантного химерного белка "Альбумин-ИФН-а 16" GS115AbFN16, защищенный патентом Российской Федерации (Падкина и др., 2009), может быть использован для производства отечественного препарата Альбурона16, обладающего улучшенными фармакологическими свойствами, по сравнению с немодифицированными рекомбинантными интерферонами. Условия оптимизации процессов культивирования полученного штамма-продуцента и схемы очистки рекомбинантного белка могут быть положены в основу технологического регламента для такого производства. Полученные в работе данные о влиянии различных факторов на уровень секреции и биологическую активность химерного белка, а также разработанные схемы очистки могут быть использованы для создания на основе дрожжей P. pastoris продуцентов других сшитых с альбумином белков - ИФН-р, ИЛ2, и др.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Карабельский, Александр Владимирович

выводы

1. Полученный впервые штамм GS115AbFN16 дрожжей Pichia pastoris обеспечивает синтез химерного белка Альбурона16, состоящего из альбумина и ИФН-а 16 человека. Присоединение альбумина не влияет на биологическую активность ИФН-а 16.

4. В культуральной жидкости дрожжей P. pastoris присутствуют протеазы, секреция которых не является ответом клетки на синтез чужеродного белка.

5. Рекомбинантный химерный белок, секретируемый дрожжами P. pastoris, подвергается протеолитической деградации, степень которой зависит от присутствия ионов кальция и значения рН. Совокупность данных о свойствах протеаз дрожжей и размерах фрагментов позволили предположить, что в расщеплении Альбурона16, возможно, участвует аспарагиновая протеаза Ypslp дрожжей P. pastoris.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карабельский, Александр Владимирович, Санкт-Петербург

1. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004. 221 с.

2. Волков Г.Л., Андрианов С.И., Горошникова Т. В. и др. Очистка биомолекул методом адсорбционной хроматографии в расширенном слое. I. Принципы метода // Укр. Биохим. Журн. 2002. Т. 74. № 6. С. 516.

3. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология // М.: Мир, 2002. 589 с.

4. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. М.: Медицина, 1996. 240 с.

5. Ивашкин В.Т. Рациональная фармакотерапия заболеваний органов пищевариния. М.: Литерра, 2003. 1046 с.

6. Карабельский А.В., Зиновьева Ю.Г., Падкина М.В. Изучение протеолитического расщепления химерных рекомбинантных белков, секретируемых метилотрофными дрожжами Pichia pastoris. 11 международная школа-конференция "Биология наука XXI века". 2007. С. 205.

7. Курганов Б.И. Оценка активности молекулярных шаперонов в тест системах, основанных на подавлении агрегации белков // Успехи биологической химии. 2002. Т. 42. С. 89-138.

8. Маниатис Т., Фриг Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 479 с.

9. Мюльберг А.А. Фолдинг белка. СПб.: Изд-во СПбУ, 2004.155 с.

10. П.Никитин И.Г., Сторожаков Т.Н. Пегилированные лекарственныепрепараты: современное состояние проблемы и перспективы // Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы. 2001. № 3 (13). URL: http://medi.ru/doc/08hl301 .htm (дата обращения: 11.11.2009).

11. М.Падкина М.В., Карабельский А.В., Зиновьева Ю.Г. и др. Способполучения рекомбинантных белков, модифицированных присоединением альбумина человека, из культуральной жидкости дрожжей // Патент РФ RU 2373286 С2. 2009а.

12. П.Парфенова JI.B., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. и др. Продукция интерферона человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae ведет к снижению активности цитохром С-оксидазы //Биотехнология. 2002. №6. С. 3-10.

13. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. 360 с.

14. Abdul-Fattah A.M., Truong-Le V., Yee L. et al. Drying-induced variations in physic-chemical properties of amorpous pharmaceuticals and their impact on stability (I): stability of a monoclonal antibody // J. Pharm Sci. 2007. P. 1983 -2008.

15. Adolf G. R., Kalsner I., Ahorn H. et al. Natural human interferon-alpha 2 is O-glycosylated // Biochem. J. 1991. V. 276. P. 511-518.

16. Alexopoulou L., Holt A. C., Medzhitov R. et al. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor // Nature. 2001. P. 732-738.

17. Altintas E.B., Denizli A. Efficient removal of albumin from human serum by monosize dye-affinity beads // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2006. V. 832. P. 216-223.

18. Alvarado E., Ballou L., Hernandez L.M., Ballou C.E. Localization of alpha 1~ ~3-linked mannoses in the N-linked oligosaccharides of Saccharomyces cerevisiae mnn mutants // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 2471-2482.

19. Andersen J.B., Mazan-Mamczarz K., Zhan M. et al. Ribosomal protein mRNAs are primary targets of regulation in RNase-L-induced senescence // RNA Biol. 2009. V. 6. P. 305-315.

20. Anthes J. C., Zhan Z., Gilchrest H. et al. Interferon-alpha down-regulates the interleukin-6 receptor in a human multiple myeloma cell line, U266 // Biochem. J. 1995. V. 309. P. 175-180.

21. Ash J., Dominguez M., Bergeron JJ. et al. The yeast proprotein convertase encoded by YAP3 is a glycophosphatidylinositol-anchored protein that localizes to the plasma membrane // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 2084720854.

22. Auld K.L., Silver P.A. Transcriptional regulation by the proteasome as a mechanism for cellular protein homeostasis // Cell Cycle. 2006. V. 5. P. 15031505.

23. Avgerinos G.C., Turner B.G., Gorelick K.J. et al. Production and clinical development of a Hansenula polymorpha-derived PEGylated hirudin // Semin. Thromb: Hemost. 2001. V. 27. P. 357-372.

24. Baker D.E. Pegylated interferons I I Rev. Gastroenterol. Disord. 2001. V. 1. P. 87-99.

25. Balan S., Choi J.W., Godwin A. et al. Site-specific PEGylation of protein disulfide bonds using a three-carbon bridge // Bioconjug. Chem. 2007. V. 18. P. 61-76.

26. Ballou C.E. A study of the immunogenicity of three yeast mannans // J.Biol.Chem. 1970. V. 245. P. 1197-1203.

27. Barbieri G., Velazquez L., Scrobogna M. et al. Activation of the protein tyrosine kinase tyk2 by interferon Alpha / Beta // European J. of Biochemistry. 1994. V. 223. P. 427-435.

28. Belardelli F., Ferrantini M., Santini S. M. et al. The induction of in vivo proliferation of long-lived CD44hi CD8+ T cells after the injection of tumor cells expressing IFN-alphal into syngeneic mice // Cancer Res. 1998. V. 58. 5795-5802.

29. Beldarrain A., Cruz Y., Cruz O. et al. Purification and conformational properties of a human interferon a2b produced in Escherichia coli // Biotechnol. Appl. Biochem. 2001. V. 33. P. 173-182.

30. Bidwai A.P., Hanna D.E., Glover C.V.C. Purification and characterization of casein kinase II (CKII) from AckalAcka2 S. cerevisiae rescued by Drosophila CKII submits // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 790-796.

31. Biron C. A. Initial and innate responses to viral infections—pattern setting in immunity or disease // Curr. Opin. Microbiol. 1999. V. 2. P. 374-381.

32. Biron C. A. Interferons alpha and beta as immune regulators—a new look // Immunity. 2001. V. 14. P. 661-664.

33. Bobik Т. V., Vorob'ev I.I., Ponomarenko N.A. et al. Expression of human serum albumin in metylotrophic yeast Pichia pastoris and its structural and functional analysis // Bioorg. Khim. 2008. V. 34 P. 56-62.

34. Bohardi В., Gendron G., Wechsler B. et al. Efficiacy of interferon alpha in the treatment of refractory and sight-threatening uveitis: a retrospective monocentric study of 45 patients // Br. J. Ophthalmol. 2007. V. 91. P. 335-339.

35. Borden E.C. Gene Regulation and Clinical Roles for Interferons in Neoplastic Diseases // Oncologist. 1998. V. 3. P. 198-203.

36. Bourbonnais Y., Larouche C., Tremblay G.M. Production of full-length human pre-elafin, an elastase specific inhibitor, from yeast requires the absence of a functional yapsin 1 (Ypslp) endoprotease // Protein Expr. Purif. 2000. V. 20. P. 485-491.

37. Bradford M.A. A rapide and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein dye binding // Academic press. Virginia. 1976. P. 10.

38. Brassard D.L., Grace M.J., Bordens R.W. Interferon-alpha as an immunotherapeutic protein // J. Leukoc. Biol. 2002. V. 71. P. 565-581.

39. Bretthauer R.K., Castellino F.J. Glycosylation of Pichia pastoris-derived proteins //Biotechnol. Appl. Biochem. 1999. V. 30. P. 193-200.

40. Brinkmann V., Geiger Т., Alkan S., et al. Interferon alpha increases the frequency of interferon gamma-producing human CD4+ T cells // J. Exp. Med. 1993. V. 178. P. 1655-1663.

41. Brod S.A. Ingested type I interferon: a potential treatment for autoimmunity // J. Interferon Cytokine Res. 2002. V. 22. P. 1153-1166.

42. Cawley N.X., Olsen V., Zhang C-F. et al. Activation and processing of non-anchored yapsin 1 (УарЗр) // J. Biol. Chem. 1998, V. 273. P. 584-591.

43. Cawley N.X., Wong M., Pu L.P. et al. Secretion of yeast aspartic protease 3 is regulated by its carboxy-terminal tail: characterization of secreted YAP3p // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 7430-7437.

44. Cereghino G.P., Cereghino J.L., Ilgen C. et al. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris // Curr. Opin Biotechnol. 2002. V. 13. P. 329-332.

45. Cereghino G.P., Cregg J.M. Application of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis // Curr. Opin. Biotech. 1999. V. 10. P.422-427.

46. Charoenrat Т., Ketudat-Cairns M., Stendahl-Andersen H. et al. Oxygen-limited fed-batch process: an alternative control for Pichia pastoris recombinant protein processes // Bioprocess Biosyst. Eng. 2005. V. 27. P. 399-406.

47. Chemmanur A.T., Wu G.Y. Drug evaluation: Albuferon-alpha an antiviral interferon-alpha/albumin fusion protein // Curr. Opin. Investig. Drugs. 2006. V. 7. P. 750-758.

48. Chen Y.H., Bieneman A.P., Creticos P.S. et al. IFN-alpha inhibits IL-3 priming of human basophil cytokine secretion but not leukotriene C4 and histamine release // J. Allergy Clin. Immunol. 2003. V. 112. P. 944-950.

49. Chi E.Y., Krishnan S., Randolph T.W. et al. Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in normative protein aggregation // Pharm Res. 2003. № 20. P. 1325-1336.

50. Chin R., Locarnini S. New therapies for the treatment of chronic hepatitis В infection // Curr. Opin. Infect. Dis. 1998. V. 11. P. 719-726.

51. Chou D.K., Krishnamurthy R., Randolph T.W. et al. Effects of Tween 20 and Tween 80 on the stability of Albutropin during agitation // J. Pharm. Sci. 2005. V. 94. P. 1368-1381.

52. Chung J.Y., Lim S.W., Hong Y.J. et al. Effect of doxycycline-regulated calnexin and calreticulin expression on specific thrombopoietin productivity ofrecombinant Chinese hamster ovary cells // Biotechnol. Bioeng. 2004. V. 85. P. 539-546.

53. Clare J.J., Romanos M.A., Rayment F.B. et al. Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies // Gene. 1991a. V. 105. P. 205-212.

54. Constantinescu S.N., Croze E., Wang C. et al. Role of interferon alpha/beta receptor chain 1 in the structure and transmembrane signaling of the interferon alpha/beta receptor complex // PNAS. 1994. V. 91. P. 9602-9606.

55. Cool D.R., Louie D.Y., Loh Y-P. Yeast aspartic protease 3 is sorted to secretory granules and activated to process proopiomelanocortin in PC 12 cells //Endocrinology. 1996. V. 137. P. 5441-5446.

56. Cos O., Ramon R., Montesinos J. L., et al. Operational strategies, monitoring and control of heterologous protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters: a review // Microb. Cell Fact. 2006. V. 5. P. 17.

57. Cregg J.M., Barringer K.J., Hessler A.Y. et al. Pichia pastoris as a host system for transformations //MoL Cell Biol. 1985. V. 5. P. 3376-3385.

58. Cregg J.M., Madden K.R., Barringer KJ. et al. Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris // Mol. Cell Biol. 1989. V. 9. P. 1316-1323.

59. Cregg J.M., Tschopp J.F., Stillman C.A. et al. High level expression and efficient assembly of hepatitis В surface antigen in the methylotrophic yeast Pichia pastoris // Bio. Technol. 1987. V.5. P. 479-485.

60. Croze E., Russell-Harde D., Charis T. et al. The human type I interferon receptor //Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 33165-33168.

61. Cummings R.D., Doering T.L. Fungi. Essentials of glycobiology // Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2008. 2nd ed. Part 3-21.

62. D'Cunha J., Ramanujam S., Wagner R. J. et al. In vitro and in vivo secretion of human ISG15, an IFN-induced immunomodulatory cytokine // J. Immunol. 1996. V. 157. P. 4100-4108.

63. Daly R., Hearn M.T. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: A useful experimental tool in protein engineering and production // J. Mol. Recognit. 2005. Y. 18. P. 119-138.

64. Damasceno L.M., Anderson K.A., Ritter G. et al. Cooverexpression of chaperones for enhanced secretion of a single-chain antibody fragment in Pichia pastoris // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 56. P. 157-164.

65. Darnell J.E. Jr., Kerr I.M., Stark G.R. Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signalling proteins // Science. 1994. V. 264. P. 1415-1421.

66. Delgado C., Francis G.E., Fisher D. The uses and properties of PEG-linked proteine // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1992. V.9. P. 249-304.

67. Dhalluin C., Ross A., Leuthold L.A. et al. Structural and biophysical characterization of the 40 kDa PEG-interferon-alpha2a and its individual positional isomers // Bioconjug. Chem. 2005. V. 16. P. 504-517.

68. Dorner A.J., Kaufman R.J. Analysis of synthesis, processing, and secretion of proteins expressed in1 mammalian cells // Methods Enzymol. 1990. V. 185. P. 577-596.

69. Dorner A.J., Wasley L.C., Kaufman R.J. Increased synthesis of secreted proteins induces expression of glucoseregulated proteins in butyrate-treated Chinese hamster ovary cells // J. Biol. Chem. 1989. Y. 264. P. 20602-20607.

70. Dragosits M., Stadlmann J., Albiol J. et al. The effect of temperature on the proteome of recombinant Pichia pastoris // J. Proteome Res. 2009. V. 8. P. 1380-1392.

71. Dubois A., Francis C., Descamps. Y. et al. Enhanced anti-HCV activity of interferon alpha 17 subtype // Virol. J. 2009. V. 6. P. 70.

72. Duman J.C., Miele R.G., Liang H. et al. O-Mannosylation of Pichia pastoris cellular and recombinant proteins // Biotechnol .Appl. Biochem. 1998. V. 28. P. 39-45.

73. Eid P., Langer J.A., Bailly F. et al. Localization of a receptor nonapeptide with a possible role in the binding of the type I interferons // Eur. Cytokine Netw. 2000. V. 11. P. 560-573.

74. Elazar M., Liu M., McKenna S.A. et al. The anti-hepatitis С agent nitazoxanide induces phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation // Gastroenterology. 2009. V. 137. P. 1827-1835.

75. Felix A.M., Bandaranayake R.M. Synthesis of symmetrically and asymmetrically branched pegylating reagents // J. Pept. Res. 2004. V. 63. P. 85-90.

76. Finkelman, F.D., Svetic A., Gresser I. et al. Regulation by interferon alpha of immunoglobulin isotype selection and lymphokine production in mice // J. Exp. Med. 1991. V. 174. P. 1179-1188.

77. Fleer R., Chen X.J., Amellal N., et al. High-level secretion of correctly precessed recombinant human interleukin-1 beta in Kluyveromyces lactis // Gene. 1991. V. 107. P. 285-295.

78. Fleer R., Foournier A., Guitton J-D. et al. Fusion polypeptides comprising human serum albumin, nucleic acids encoding same, and recombinant expression thereof// United States Patent. 5,876,969. 1999. Mar. 2.

79. Forde K.A., Reddy K.R. Hepatitis С virus infection and immunomodulatory therapies // Clin. Liver Dis. 2009. V. 13. P. 391-401.

80. Foser S., Renwanz I., Ebeling M., et al. Interferon-alpha and transforming growth factor-beta co-induce growth inhibition of human tumor cells // Cell Mol. Life Sci. 2006. V. 63. P. 2387-2396.

81. Francis G.E., Fisher D., Delgado C. et al. PEGylation of cytokines and other therapeutic proteins and peptides: the importance of biological optimisation of coupling techniques // Int. J. Hematol. 1998. V. 68. P. 1-18.

82. Frand A.R., Kaiser C.A. Erolp oxidizes protein disulfide isomerase in a pathway for disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum // Mol. Cell. 1999. V. 4. P. 469-477.

83. Frieman M.B., Cormack B.P. The w-site sequence of glycosylphosphatidylinositolanchored proteins in Saccharomyces cerevisiae can determine distribution between the membrane and the cell wall // Molecular Microbiology. 2003. V. 50. P. 883-896.

84. Fujimura H., Sakuma Y. Simplified isolation of chromosomal and plasmid DNA from yeast //Biotechniques. 1997. V. 14. P. 538-539.

85. Fuller R.S., Sterne R.E., Thorner J. Enzymes required for yeast prohormone processing // Ann. Rev. Physiol. 1988. V. 50. P. 345-362.

86. Gad H.H., Dellgren C., Hamming O.J. et al. Interferon-{lambda} Is Functionally an Interferon but Structurally Related to the Interleukin-10 Family // J. Biol. Chem. 2009. V. 284 P. 20869-20875.

87. Gagnon-Arsenault I., Tremblay J., Bourbonnais Y. Fungal yapsins and cell wall: a unique family of aspartic peptidases for a distinctive cellular function // FEMS Yeast Res. 2006. V. 6. P. 966-978.

88. Gagnon-Arsenault I., Parise L., Tremblay J. et al. Activation mechanism, functional role and shedding of glycosylphosphatidylinositol-anchored Ypslp at the Saccharomyces cerevisiae cell surface // Mol. Microbiol. 2008. V. 69. P. 982-93.

89. Garcia J.C.S., Ariza A.M., Lassa A.M. et al. Over-expression and single-step purification of human IFNa8 and human IFNa2b reveals the highest antiviral activity of human IFNa8 // Microbial Cell Factories. 2006. V. 5(Suppl I). P. 73.

90. Gasser В., Maurer M., Gach J., et al. Engineering of Pichia pastoris for improved production of antibody fragments // Biotechnol. Bioeng. 2006. V. 94. P. 353-361.

91. Gauss R., Jarosch E., Sommer Т., Hirsch C. A complex of Yos9p and the HRD ligase integrates endoplasmic reticulum quality control into the degradation machinery // Nat. Cell Biol. 2006a. V. 8. P. 849-854.

92. Gauss R., Sommer Т., Jarosch E. The Hrdlp ligase complex forms a linchpin between ER-lumenal substrate selection and Cdc48p recruitment // EMBO J. 2006b. V. 25. P. 1827-1835.

93. Gemmill T.R., Trimble R.B. Overview of N- and O-linked oligosaccharide structures found in various yeast species // Biochimica et Biophysica Acta. 1999. V. 1426. P. 227-237.

94. Gennaro D.E., Hoffstein S.T., Marks G. et al. Quantitative immunocytochemical staining for recombinant tissue-type plasminogen activator in transfected Chinese hamster ovary cells // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1991. V. 198. P. 591-598.

95. Genu V., Godecke S., Hollenberg C.P. et al. The Hansenula polymorpha MOX gene presents two alternative transcription start points differentially utilized and sensitive to respiratory activity // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P. 2467-2475.

96. Gerlach N., Gibbert K., Alter C. et al. Anti-retroviral effects of type I IFN subtypes in vivo // Eur. J. Immunol. 2009. V. 39. P. 136-146.

97. Germain R.N. The biochemistry and cell biology of antigen presentation by MHC class I and class II molecules. Implications for development of combination vaccines // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1995. V. 754. P. 114-125.

98. Gertien J., Ende H., Klis F. Differential regulation of cell wall biogenesis during growth and development in yeast // Microbiology. 2001. V.147. P. 781794.

99. Glue P., Fang J.W., Rouzier-Panis B. et al. Pegylated interferon-alpha2b: pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety, and preliminary efficacy data. Hepatitis С intervention therapy group // Clin. Pharmacol. Ther. 2000. V. 68. P. 556-567.

100. Grossberg S.E., Taylor J.L., Kurshnaryov V.M. Interferon receptors and their role in interferon action // Experientia. 1989. V. 45. P. 508-518.

101. Hadziyannis S.J. New developments in the treatment of chronic hepatitis B. // Expert Opin. Biol. Ther. 2006. Sep. V.6. P. 913-921.

102. Hagenson M.J., Holden K.A., Parker K.A. et al. Expression of streptokinase in Pichia pastoris yeast // Enzyme Microb. Technol. 1989. V.l 1. P. 650-656.

103. Harada H., Fujita Т., Miyamoto et al. Structurally similar, but functinally distinct factors, IRF-1 and IRF-2, bind to the same regulatory elements of IFN and IFN-inducible genes // Cell. 1989. V. 58. P. 729-739.

104. Harding H.P., Zhang Y., Zeng H. et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress // Mol. Cell. 2003. V. 11. P. 619-633.

105. Haroche J., Amoura Z., Trad S.G. et al. Variability in the efficacy of interferon-alpha in Erdheim-Chester disease by patient and site of involvement: Results in eight patients // Arthritis Rheum. 2006. V. 54. P. 33303336.

106. Hartner F.S., Ruth C., Langenegger D. et al. Promoter library designed for fine-tuned gene expression in Pichia pastoris // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. 76-80.

107. Hawe A., Friess W. Development of HSA-free formulations for a hydrophobic cytokine with improved stability // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2008. V. 68. P. 169-182.

108. Hawe A., Friess W. Stabilization of a hydrophobic recombinant cytokine by human serum albumin // J. Pharm. Sci. 2007. V. 96. P. 2987-2999.

109. Haynes C.M., Titus E.A., Cooper A.A. Degradation of misfolded proteins prevents ER-derived oxidative stress and cell death // Mol. Cell. 2004. V. 15. P. 767-776.

110. Heinicke L.A., Wong С J., Lary J., et al. RNA dimerization promotes PKR dimerization and activation // J. Mol. Biol. 2009. V. 390. P. 319-338.

111. HGSI Press Release, официальный сайт. Human Genome Sciences Completes Enrollment Ahead of Schedule in Second Phase 3 Albuferon Trial. November 1. 2007. URL: http://www.hgsi.com (дата обращения 11.10.2009).

112. HGSI Press Release, официальный сайт. Human Genome Sciences Completes Enrollment in a Phase 2 Clinical Trial of Albuferon in Treatment-Naive Patients with Chronic Hepatitis C. February 16. 2005. URL: http://www.hgsi.com (дата обращения 11.10.2009).

113. HGSI Press Release, официальный сайт. Human Genome Sciences Completes Patient Enrollment in Phase 3 Albuferon Trial Ahead of Schedule. August 28. 2007. URL: http://www.hgsi.com (дата обращения 11.10.2009).

114. HGSI Press Release, официальный сайт. Human Genome Sciences Reports Positive Results of Phase 2 Clinical Trial of Albuferon in Treatment-Naive Patients with Chronic Hepatitis C. April 14. 2005. URL: http://www.hgsi.com (дата обращения 11.10.2009).

115. Hiscott J., Ryals J., Dierks P. et al. The expression of human interferon alpha genes // Philos. Trans. R. Soc. (Biol. Sci). 1984. V. 307. P. 217-226.

116. Hjorth R., Kampe S., Carlsson M. Analysis of some operating parameters of novel adsorbents for recovery of proteins in expanded beds // Bioseparation. 1995. V. 5. P. 217-223.

117. Holmes W., Smith R., Bill R. Evaluation of antifoams in the expression of recombinant FC fusion protein in shake flask cultures of Saccharomyces cerevisiae anl Pichia pastoris // Microbial Cell Factories. 2006. V. 5. P. 30.

118. Honda S. Separation of neutral carbohydrates by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1996. V. 720. P. 337-351.

119. Huang Y.S, Chen Z.5 Yang Z.Y. et al. Preparation and characterization of a potent, long-lasting recombinant human serum albumin-interferon-alpha2b fusion protein expressed in Pichia pastoris // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2007. V. 67. P. 301-308.

120. Hung C.H., Lee C.M., Lu S.N. et al. Anemia associated with antiviral therapy in chronic hepatitis C: incidence, rick factors, and impact on treatment response // Liver Int. 2006. V. 26. P. 1079-1086.

121. Hunter T. Prolyl isomerases and nuclear function // Cell. 1998. V. 92. P. 141-143.

122. Hussain M., Gill D.S., Liao M,J. Both variant forms of interferon-alpha4 gene (IFNA4a and IFNA4b) are present in the human population // J. Interferon Cytokine Res. 1997. V. 17. P. 559-566.

123. Hussain M., Ni D., Gill D. et al. IFN-alphala gene is the major variant in the North American population // J. Interferon Cytokine Res. 2000. V. 20. P. 763-768.

124. Improta Т., Pine R., Pfeffer L.M. Interferon-gamma potentiates the antiviral activity and the expression of interferon-stimulated genes induced by interferon-alpha in U937 cells // J. Interferon Cytokine Res. 1992. V. 12. P. 8794.

125. Inan M., Meagher M.M. Non-repressing carbon sources for alcohol oxidase (AOX1) promoter of Pichia pastoris // J. Biosci. Bioeng. 2001. V. 92. P. 585-589.

126. Isaacs A., Lindenmann J. Virus interference. I. The interferon // Proc. R. Soc. Lond. B. 1957. № 147. P. 258-267.

127. Jahic M., Gustavsson M., Jansen A. et al. Analysis and control of proteolysis of a fusion protein in Pichia pastoris fed-batch processes // J. Biotechnol. 2003. V. 102. P. 45-53.

128. Jahic M., Knoblechner J., Charoenrat T. et al. Interfacing Pichia pastoris cultivation with expanded bed adsorbtion // Microbial Cell Factories. 2006. V. 5. P. 24.

129. Jonson L., Rehfeld J.F., Johnsen A.H. Enhanced peptide secretion by gene disruption of CYM1, a novel protease in Saccharomyces cerevisiae // J. Biochem. 2004. V. 271. P. 4788-4797.

130. Jungmann J., Munro S. Multi-protein complexes in the cis Golgi of Saccharomyces cerevisiae with al,6-mannosyltransferase activity // EMBO J. 1998. V.17.P. 423-434.

131. Kang H.A., Kim S.J., Choi E.S. et al. Efficient production of intact human parathyroid hormone in a Saccharomyces cerevisiae mutant deficient in yeast aspartic protease 3 (YAP3) // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 50. P. 187-192.

132. Kanyshkova T.G., Babina S.E., Semenov D.V. et al. Multiple enzymic activities of human milk lactoferrin // Eur. J. Biochem. 2003. V.270. P. 33533361.

133. Karabelsky A.V., Padkina M.V. The development of Pichia pastoris strain producing recombinant fusion protein "human serum albumin-IFNal6" and optimization of yeast cultivation process. Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting. 2008. P. 266.

134. Katano Y., Kumada Т., Nakano I. et al. Comparison of biochemical safety between PEG-IFN alpha-2a and PEG-IFN alpha-2b // Hepatogastroenterology. 2009. V. 56. P. 485-91.

135. Kawakami Т., Matsumato M., Sato M. et al. Possible involvement of the transcription factor ISGF3gamma in virus-induced expression of the IFN-beta• gene // FEBS. 1995. V. 358. P. 225-229.

136. Kim M.D., Han K.C., Kang H.A. et al. Coexpression of BiP increased antithrombotic hirudin production in recombinant Saccharomyces cerevisiae // J. Biotechnol. 2003. V. 101. P. 81-87.

137. Kimata Y., Oikawa D., Shimizu Y. et al. A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-sensing protein Irel // J. Cell Biol. 2004. V. 167. P. 445-456.

138. Kisseleva Т., Bhattachaiya S. Braunstein J. et al. Signalling through the JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges // Gene. 2002. № 285. P. 1-24.

139. Klaus W., Gsell В., Labhardt A.M. et al. The three-dimensional high resolution structure of human interferon alpha-2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution // J. Mol. Biol. 1997. V. 274. P. 661-675.

140. Klis F.M., Boorsma A., Groot P.W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae // Yeast. 2006. V. 23. P. 185-202.

141. Knauft M.J., Bell D.P., Hirtzer P. et al. Relationship of effective molecular size to systemic clearance in rats of recombinant interleukin-2chemically modified with water-soluble polymers // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 15064-15070.

142. Kobayashi K., Kuwae S., Ohya T. Addition of oleic acid increases expression of recombinant human serum albumin by the AOX2 promoter in Pichia pastoris // J. Biosci. Bioeng. 2000. V. 89. P. 479-484.

143. Kobayashi K., Kuwae S., Ohya T. et al. High-level expression of recombinant human serum albumin from the methylotrophic yeast Pichia pastoris with minimal protease production and activation // J. Biosci. Bioeng. 2000. V. 89. P. 55-61.

144. Komano H., Rockwell N., Wang G.T. et al. Purification and characterization of the yeast glycosylphosphatidylinositol-anchored, monobasic-specific aspartyl protease yapsin 2 (Mkc7p) // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 24431-24437.

145. Kornischka J., Burtscheidt W., Gaebel W. Interferon-induced paranoid psychosis//Nervenarzt. 2002. V. 72. P. 463-467.

146. Kotenko S.V., Gallagher G., Baurin V.V. et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex // Nat. Immunol. 2003. № 4. P. 69-77.

147. Krizhanovsky V., Yon M., Dickins R.A. et al. Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis // Cell. 2008. V. 134. P. 657-667.

148. Krysan D.J., Ting E.L., Abeijon C. et al. Yapsins are a family of aspartyl proteases required for cell wall integrity in Saccharomyces cerevisiae // Eucaryotic Cell. 2005. V. 4. P. 1364-1374.

149. Kukuruzinska M.A, Bergh M.L., Jackson B.L. Protein glycosylation in yeast//Ann.Rev.Biochem. 1987. V. 56. P. 915-944.

150. Kushibiki Т., Matsuoka H., Tabata Y. Synthesis and physical characterization of poly(ethylene glycol)-gelatin conjugates // Biomacromolecules. 2004. V. 5. P. 202-208.

151. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

152. Leatherbarrow R.J., Peter D.G. Studies of the mechanism of binding of serum albumins to immobolized Cibacron blue F3GA // Biochem. J. 1980. V. 189. P. 27-34.

153. Lederkremer G.Z., Glickman M.H. A window of opportunity: timing protein degradation by trimming of sugars and ubiquitins // Trends Biochem. Sci. 2005. V. 30. P. 297-303.

154. Ledgerwood E.C., George P.M., Peach R.J. et al. Endoproteolytic processing of recombinant proalbumin variants by the yeast Kex2 protease // J. Biochem. 1995. V. 308. P. 321-325.

155. Levy D.E., Lew D.J., Decker T. et al. Synergistic interaction between interferon-alpha and interferon-gamma through induced synthesis of one subunit of the transcription factor ISGF3 // EMBO J. 1990. V. 9. P. 1105-1111.

156. Li B.L., Xhao X.X., Liu X.Y. et al. Alpha-interferon structure and natural killer cell stimulatory activity // Cancer Res. 1990. V. 59. P. 53285332.

157. Lipke P.N., Ovalle R. Cell wall architecture in yeast: new structure and new challenges // J. Bacterid. 1998. V. 180. P. 3735-3740.

158. Liu P.T., Та T.V., Villarete L.H. High-yield expression and purification of human interferon a-1 in Pichia pastoris // Protein Expr. Purif. 2001. V. 22. P. 381-387.

159. Loftis J.M., Wall J.M., Pagel R.L. et al. Administration of pegylated interferon-alpha-2a or -2b does not induce sickness behavior in Lewis rats // Psychoneuroendocrinology. 2006. V. 31. P. 1289-1294.

160. Long W.F., Burke D.C. Interferon production by double-stranded RNA -P. a comparison of induction by reovirus to that by a synthetic double — stranded polynucleotide//J. Gen.Virol. 1971. №12. P. 1-11.

161. Lyman S.K., Schekman R. Interaction between BiP and Sec63p is required for the completion of protein translocation into ER of Saccharomyces cerevisiae//J. Cell Biol. 1995. V. 131. P. 1163-1171.

162. Macauley-Patrick S., Fazenda L.M., McNeil B. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system // Yeast. 2005. V. 22. № 4. P. 249-270.

163. Mattanovich D., Gasser В., Hohenblum H. et al. Stress in recombinant protein producing yeasts // J. Biotechnol. 2004. V. 113. P. 121-135.

164. McCormick D.K. Expanded bed adsorption // Biotechnology (N Y). 1993. V. 11. P. 1059.

165. McCullough K.D., Martindale J.L., Klotz L.O. et al. Gaddl53 sensitizes cells to endoplasmic reticulum stress by down-regulating Bcl2 and perturbing the cellular redox state // Mol. Cell Biol. 2001. V. 21. P. 1249-1259.

166. Menendez J., Valdes I., Cabrera N. The ICL1 gene of Pichia pastoris, transcriptional regulation and use of its promoter // Yeast. 2003. V. 20. P. 1097-1108.

167. Mennechet F.J., Uze G. Interferon-lambda-treated dendritic cells specifically induce proliferation of FOXP3-expressing suppressor T cells // Blood. 2006. V. 107. P. 4417-4423.

168. Mertani H.C., Raccurt M., Abbate A. et al. Nuclear translocation and retention of growth hormone // Endocrinology. 2003. V. 144. P. 3182-3195.

169. Meurs E.F., Galabru J., Barber G.N. Tumor supressor function of the interferon-induced double-stranded RNA-activated protein kinase // PNAS-1993. V. 90. P. 232-236.

170. Molineux G. Pegylation: engineering improved pharmaceuticals for enhanced therapy // Cancer Treat. Rev. 2002. V. 28. P. 13-16.

171. Moraga I., Harari D., Schreiber G. et al. Receptor density is key to the alpha2/beta interferon differential activities // Mol. Cell Biol. 2009. V. 29. P. 4778-4787.

172. Mori K., Ogawa N., Kawahara T. et al. mRNA splicing-mediated C-terminal replacement of transcription factor Haclp is required for efficient activation of the unfolded protein response // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 4660-4665.

173. Mori S., Jewett A., Cavalcanti M. et al. Differential regulation of human NK cell-associated gene expression following activation by IL-2, IFN-alpha and PMA/ionomycin//Int. J. Onkol. 1998. V. 12. P. 1165-1170.

174. Muller D., Bayer K., Mattanovich D. Potentials and limitations of prokaryotic and eukaryotic expression systems for recombinant protein production a comparative view // Microbial Cell Factories. 2006. V. 5. P. 61.

175. Nakagawa Т., Mukaiyama H., Yurimoto H. et al. Alcohol oxidase hybrid oligomers formed in vivo and in vitro // Yeast. 1999. V. 15. P. 1223-1230.

176. Nakagawa Т., Inagaki A., Ito T. et al. Regulation of two distinct alcohol oxidase promoters in the methylotrophic yeast Pichia methanolica // Yeast. 2006. V. 23. P. 15-22.

177. Naveau S., Emilie D., Borotto E. et al. Interleukin-1 receptor antagonist plasma concentration is specifically increased by alpha-2A-interferon treatment //J. Hepatol. 1997. V. 27. P. 272-275.

178. Ng D.T.W., Spear E.D., Walter P. The unfolded protein response regulates multiple aspects of secretory and membrane protein biogenesis and endoplasmic reticulum quality control // J. Cell Biol. 2000. V. 150. P. 77-88.

179. Novick D., Cohen В., Rubinstein M. The human interferon alpha/beta receptor: characterization and molecular cloning // Cell. 1994. V. 77. P. 391400.

180. Ogawa Т., Kawada N., Ikeda K. Effect of natural interferon alpha on proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells // Hepatol. Int. 2009. V. 3. P. 497-503.

181. Ohi H., Okazaki N., Uno S. et al. Chromosomal DNA patterns and gene stability of Pichia pastoris // Yeast. 1998. V. 14. P. 895-903.

182. Ohoka N., Yoshii S., Hattori T. et al. TRB3, a novel ER stress-inducible gene, is induced via ATF4-CHOP pathway and is involved in cell death // EMBO J. 2005. V. 24. P. 1243-1255.

183. Oishi H., Morimoto Т., Watanabe Y. et al. Purification and characterization of phospholipase В from Kluyveromyces lactis, and cloning of phospholipase В gene // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. V. 63. P. 83-90.

184. Olsen V., Cawley N-X., Brandt J. T al. Identification and characterization of Saccharomyces cerevisiae yapsin 3, a new member of the yapsin family of aspartic proteases encoded by the YPS3 gene // J. Biochem . 1999. V. 339. P. 407-411.

185. Osborn B.L., Olsen H.S., Nardelli B. et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomolgus monkeys // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002. V. 303. P. 540-548.

186. Oshima Y. The phosphatase system in Saccharomyces cerevisiae // Genes Genet. Syst. 1997. V. 72. P. 323-334.

187. Otagiri M., Chuang V.T. Pharmaceutical^ important pre- and posttranslational modifications on human serum albumin // Biol. Pharm. Bull. 2009. V. 32. P. 527-534.

188. Ozcan U., Cao Q, Yilmaz E. et al. Endoplasmic reticulum stress links obesity, insulin action, and type 2 diabetes // Science. 2004. V. 306. P. 457461.

189. Paul S., Ricour C., Sommereyns C. et al. Type I interferon response in the central nervous system // Biochimie. 2007. V. 89. P. 770-778.

190. Pawlotsky J.M., Gish R.G. Future therapies for hepatitis С // Antivir. Ther. 2006. V. 11. P. 397-408.

191. Pedder S.C. Pegylation of interferon alfa: structural and pharmacokinetic properties // Semin. Liver Dis. 2003. V. 23. P. 19-22.

192. Pestka S. The human interferon alpha species and receptors // Biopolymers. 2000. V. 55. P. 254-287.

193. Pestka S., Baron S. Definition and classification of the interferons // Meth. Enzymol. 1981. V. 78. P. 3-14.

194. Peters T.P. All about albumin. New York: Academic Press. 1996. 258 p.

195. Pfeffer L.M., Dinarello C.A., Herberman R.B. et al. Biological properties of recombinant alpha-interferons: 40th anniversary of the discovery of interferons // Cancer Res. 1998. V. 58. P. 2489-2499.

196. Piskova J., Greiner K., Muckersie E. et al. Interferon-alpha: a key factor in autoimmune disease? // Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 2006. V. 47. P. 39463950.

197. Pomova N.I., Ivanikov I.O., Siutkin V.E. Use of peg-intron in combined treatment of chronic liver disease caused by HIV infection // Eksp. Klin. Gastroenterol. 2003. № 1. P. 42-45,182.

198. Pratap J., Rajamohan G., Dikshit K.L. Characteristics of glycosylated streptokinase secreted from Pichia pastoris: enhanced resistance of SK to proteolisis by glycosylation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 53. P. 469-475.

199. Primrose S.B. The application of geneticalli engineered microorganisms in the production of drugs // J. Appl. Bacteriol. 1986. V. 61. P. 99116.

200. Radhakrishnan R., Walter L.J., Hruza A. et al. Zinc mediated dimer of human interferon-alpha 2b revealed by X-ray crystallography // Structure. 1996. V. 4. P. 1453-1463.

201. Raymond C.K., Bukowski Т., Holderman S.D. et al. Development of the methylotrophic yeast Pichia methanolica for the expression of the 65 kilodalton isoform of human glutamate decarboxylase // Yeast. 1998. V. 14. P. 11-23.

202. Redding K., Holcomb C., Fuller R.S.Immunolocalization of Kex2 protease identifies a putative late Golgi compartment in the yeast Saccharomyces cerevisiae // J. Cell Biol. 1991. V. 113. P. 527-538.

203. Remaut E., Stansser P., Simons G. et al. Use of the phage lamda Pi promoter for high-level expression of human interferons in Echerichia coli // Methods in enzymology. 1986. V. 119. P. 366-375.

204. Riesenberg D., Guthke R. High-cell-density cultivation of microorganisms // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51. P. 422-430.

205. Roberts M.J., Bentley M.D., Harris J.M. Chemistry for peptide and protein PEGylation // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. V. 54. P. 459-476.

206. Roberts M.J., Harris J.M. Attachment of degradable poly(ethylene glycol) to proteins has the potential to increase therapeutic efficacy // J. Pharm. Sci. 1998. V. 87. P. 1440-1445.

207. Roche M., Rondeau P., Singh N.R. et al. The antioxidant properties of serum albumin// FEBS Lett. 2008. V. 582. P. 1783-1787.

208. Roh V., Laemmle A., Von Holzen U., et al. Dual induction of PKR with E2F-1 arid IFN-alpha to enhance gene therapy against hepatocellular carcinoma// Cancer Gene Ther. 2008. V. 15. P. 636-644.

209. Romanos M.A., Clare J.J., Beesley K.M. Recombinant Bordetella pertussis pertactin (P69) from the yeast Pichia pastoris: hign level production and immunological properties // Vaccine. 1991. V.9. P. 901-906.

210. Romanos M.A., Scorer C.A., Clare J.A. Foreign gene expression: a review // Yeast. 1992. V. 8. P. 423-488.

211. Rosser M.F., Trotta B.M., Marshall M.R. et al. Adenosine nucleotides and the regulation of GRP94-client protein interactions // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 8835-8845.

212. Ruddock L.W., Molinari M. N-glycan processing in ER quality control // J. Cell Sci. 2006. V. 119. P. 4373-4380.

213. Ruiz L., Reyes N., Duany L. et al. Long-term stabilization of recombinant human interferon alpha 2b in aqueous solution without serum albumin // Int. J. Pharm. 2003. V. 264. P. 57-72.

214. Runkel L., Meier W., Pepinsky R.B. et al. Structural and functional differences between glycosylated and non-glycosylated forms of human interferon-beta (IFN-beta) //Pharm. Res. 1998. V. 15. P. 641-649.

215. Rustgi V.K. Albinterferon alfa-2b, a novel fusion protein of human albumin and human interferon alfa-2b, for chronic hepatitis С // Curr. Med.Res. Opin. 2009. V. 25. P. 991-1002.

216. Saliola M., Bartoccioni P.C., De Maria I. et al. The deletion of the succinate dehydrogenase gene K1SDH1 in Kluyveromyces lactis does not lead to respiratory deficiency // Eukaryot. Cell. 2004. V. 3. P. 589-597.

217. Samuel C.E. Interferon induction of the antiviral state proteins induced by inteferons and their possible roles in the antiviral mechanismes of action. / Interferon Action. Ed. Pfeffer L.M. CRC Press. Boca Raton FL. 1987. P.l 10130.

218. Sareneva Т., Julkunen I., Matikainen S. IFN-alpha and IL-12 induce IL-18 receptor gene expression in human NK and T cells // J. Immunol. 2000. V. 165. P. 1933-1938.

219. Schaefer S., Michael Piontek M., Ahn S-J. et al. Recombinant hepatitis В Vaccines Disease Characterization and Vaccine Production. / Hansenula polymorpha - Biology and applications. Ed. Gelllissen G. Wiley-VCH, Weinheim. 2005. P. 319-359.

220. Schindler C., Darnell J.E. Jr. Transcriptional responces to polypeptide ligands: The JAK-STAT Pathway // Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 64. P. 621651.

221. Schroder M. The cellular response to protein unfolding stress. / Exploitation of fungi. British mycological society symposium series Eds. Robson G.D., van West P., Gadd G.M. Cambridge University Press, Cambridge. 2007. V. 26. P. 117-139.

222. Schroder M., Kaufman R.J. The mammalian unfolded protein response // Annu. Rev. Biochem. 2005. V. 74. P. 739-789.

223. Sekellick M.J., Marcus P.I. Interferon induction by viruses. XXII. Vesicular stomatitis virus-Indiana: M-protein and leader RNA do not regulate interferon induction in chicken embryo cells // J. Interferon Res. 1993. V. 13. P. 413-418.

224. Shahangian A., Chow E.K., Tian X. et al. Type I IFNs mediate development of postinfluenza bacterial pneumonia in mice // J. Clin. Invest. 2009. V. 119. P. 1910-1920.

225. Shaw P.E. Peptidyl-prolyl isomerases: a new twist to transcription // EMBO reports . 2002. V. 3 P. 521-526.

226. Shen J.S., Snapp E:L., Lippincott-Schwartz J. et al. Stable binding of ATF6 to BiP in the endoplasmic reticulum stress response // Mol. Cell Biol. 2005. V. 25. P. 921-932.

227. Shilton B.H., Li Y., Tessier D. et al. Crystallization of a soluble form of the Kexlp serine carboxypeptidase from Saccharomyces cerevisiae // Protein Sci. 1996. V. 5. 395-397.

228. Shizamaki К., Nishio N. Interacting properties of bovine lactoferrin with immobilized Cibacron blue F3GA in column chromatography // J. Dairy Sci. 1991. V. 74. P. 404-408.

229. Siebeck N., Hurley D J., Garcia M. et al. Effects of human recombinant alpha-2b interferon and feline recombinant omega interferon on in vitro replication of feline herpesvirus-1 // Am. J. Vet. Res. 2006. V. 67. P. 14061411.

230. Silberstein S., Schlenstedt G., Silver P.A. et al. A role for the DnaJ homologue Scjlp in protein folding in the yeast endoplasmic reticulum // J.Cell Biol. 1998. V. 143. P. 921-933.

231. Sommereyns C, Paul S, Staeheli P, Michiels T. IFN-lambda (IFN-lambda) is expressed in a tissue-dependent fashion and primarily acts on epithelial cells in vivo // PLoS Pathog. 2008. V. 4. el000017.

232. Song Y., Sata J., Saito A. et al. Effects of calnexin deletion in Saccharomyces cerevisiae on the secretion of glycosylated lysozymes // J. Biochem. 2001b. V. 130. P. 757-764.

233. Sorensen H.P., Mortensen K.K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli // J. Biotechnol. 2005. V. 115. P. 113-128.

234. Sreekrishna K., Brankamp R.G., Krop K.F. et al. Strategies for optimal synthesis and secretion of heterologous proteins in the methylotriphic yeast Pichia pastoris // Gene. 1997. V. 190. P. 55-62.

235. Sreekrishna K., Nelles L., Potenz R. et al. High level expression, purification, and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized in the methylotrophic yeast Pichia pastoris // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 4117-4125.

236. Sreekrishna K., Potenz R.H., Cruze J.A. et al. High level expression of heterologous proteins in methylotrophic yeast Pichia pastoris // J. Basic Microbiol. 1988. V. 28. P. 265-278.

237. Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R. et al. How cells respond to interferons//Annu. Rev. Biochem. 1998. №67. P. 227-264.

238. Steel G.J., Fullerton D.M., Tyson J.R. et al. Coordinatedactivation of Hsp70 chaperones // Science. 2004. V. 303. P. 98-101.

239. Steimle V., Siegrist, C.A., Mottet A. et al. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA // Science. 1994. V. 265. P. 106-109.

240. Steinberg F.M., Raso J. Biotech pharmaceuticals and biotherapy: an overview//J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 1998. V. 1. P. 48-59.

241. Strudwick N., Schroder M. The unfolded protein response. / Systems biology. Cell engineering. Eds. Al-Rubeai M., Fussenegger M. Springer Verlag, Dordrecht, 2007. V. 5. P. 69-157.

242. Subramaniam P.S., Johnson H.M. The IFNAR1 subunit of the type IIFN receptor complex contains a functional nuclear localization sequence // FEBS Lett. 2004. V. 578. P. 207-210.

243. Subramaniam P.S., Torres B.A., Johnson H.M. So many ligands, so few transcription factors: a new paradigm for signaling through the STAT transcription factors // Cytokine. 2001. V. 15. P. 175-187.

244. Sumi A., Okuyama K., Kobayashi K. et al. Purification of recombinant human serum albumin efficient purification using STREAMLINE // Bioseparation. 1999. V. 8. P. 195-200.

245. Sung C., Nardelli В., LaFleur D.W. et al. An IFN-beta-albumin fusion protein that displays improved pharmacokinetic and pharmacodynamic properties in nonhuman primates // J. Interferon Cytokine Res. 2003. V. 23. P. 25-36.

246. Syed S., Schuyler P.D., Kulczycky M. et al. Potent antithrombin activity and delayed clearance from the circulation characterize recombinant hirudin genetically fused to albumin // Blood. 1997. V. 89. P. 3243-3252.

247. Taub D.D., Lloyd A.R., Conlon K. et al. Recombinant human interferon-inducible protein 10 is a chemoattractant for human monocytes and T lymphocytes and promotes T cell adhesion to endothelial cells // J. Exp. Med. 1993. V. 177. P. 1809-1814.

248. Taylor J.L., Grossberg S.E. The effects of interferon-alpha on the production and action of other cytokines // Semin. Oncol. 1998. V. 25. P. 2329.

249. Travis J., Bowen J., Tewksbury D. et al. Isolation of albumin from whole human plasma and fractionation of albumin-depleted plasma // Biochem. J. 1976. V. 157. P. 301-306.

250. Trentmann O., Khatri N.K., Hoffmann F. Reduced oxygen supply increases process stability and product yield with recombinant Pichia pastoris // Biotechnol. Prog. 2004. V. 20. P. 1766-1775.

251. Tretter Т., Aman M.J., Bug G. et al. Hematopoietic growth factors are differentially regulated in monocytes and CD4+ T lymphocytes: influence of IFN-alpha and interleukin-4 // J. Interferon Cytokine Res. 1998. V. 18. P. 95102.

252. Trimble R.B., Atkinson P.H., Tschop J.F. et al. Structure oligosacharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 22807-22817.

253. Tsai В., Rodighiero C., Lencer W.I. t al. Protein disulfide isomerase acts as.a redox-dependent chaperone to unfold cholera toxin // Cell. 2001. V. 104. P. 937-948.

254. Tu B.P, Weissman J.S. Oxidative protein folding in eukaryotes: mechanisms and consequence // J. Cell Biol. 2004. V. 164. P. 341-346.

255. Valkonen M., Penttila M., Saloheimo M. Effects of inactivation and constitutive expression of the unfoldedprotein response pathway on protein production in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Appl. Environ. Microbiol. 2003a. V. 69. P. 2065-2072.

256. Vervecken W., Callewaert N., Kaigorodov V. et al. Modification of the N-glycosylation pathway to produce homogeneous, human-like glycans using GlycoSwitch plasmids // Methods Mol. Biol. 2007. V. 389. P. 119-138.

257. Volberding P.A., Mitsuyasu R.T., Golando J.P. et al. Treatment of Kaposi's sarcoma with interferon alfa-2b (Intron A) // Cancer. 1987. V. 59. P. 620-625.

258. Vyas K., Brassard D.L., DeLorenzo M.M. et al. Biologic activity of polyethylene glycol 12000-interferon-alpha2b compared with interferon-alpha2b: gene modulatory and antigrowth effects in tumor cells // J. Immunother. 2003. V. 26. P. 202-211.

259. Walsh G. Biopharmaceutical benchmarks-2003 // Nat. Biotechnol. 2003. V.21.P. 865-870.

260. Wandlinger S.K., Richter K., Buchner J. The HSP90 chaperone machinery // The journal of biological chemistry. 2008. V. 283. P. 1847318477.

261. Wang.P., Heitman J. The cyclophilins // Genome Biol. 2005. V. 6. P. 226.

262. Watanabe H., Yamasaki K., Kragh-Hansen U. et al. In vitro and in vivo properties of recombinant human serum albumin from Pichia pastoris purified by a method of short processing time // Pharm. Res. 2001. V. 18. P. 17751781.

263. Weerapana E., Imperiali B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems // Glycobiology. 2006. V. 16. P. 91101.

264. Wenner C. A., Guler, M. L. Macatonia S. E. et al. Roles of IFN-gamma and IFN-alpha in IL-12-induced T helper cell-1 development // J. Immunol. 1996. V. 156. P. 1442-1447.

265. Werten M., Wolf F.A. Reduced proteolysis of secreted gelatin and Ypsl-mediated alpha-factor leader processing in a Pichia pastoris kex2 disruptant // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 2310-2317.

266. Wetzel R. Assignment of the disulphide bonds of leukocyte interferon // Nature. 1981.V. 289. P. 606-607.

267. Weydemann U., Keup P., Piontek M. et al. High-level secretion of hirudin by Hansenula polymorpha—authentic processing of three different preprohirudins // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V. 44. P. 377-385.

268. Wildt S., Gerngross T.U. The humanization of N-glycosylation pathways in yeast // Nature Reviews Microbiology. 2005. V. 3. P. 119-128.

269. Wilkinson В., Gilbert H.F. Protein disulfide isomerase // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1699. P. 35^14.

270. Winter J., Jakob U. Beyond transcription—new mechanisms for the regulation of molecular chaperones // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2004. V. 39. P. 297-317.

271. Woo J.H., Liu Y.Y., Neville D.M. Jr. Minimization of aggregation of secreted bivalent anti-human T-cell immunotoxin in Pichia pastoris bioreactor culture by optimizing culture conditions for protein secretion // J. Biotechnol. 2005. V. 121. P. 75-85.

272. Xu X., Kanbara K., Azakami H. et al. Expression and characterization of Saccharomyces cerevisiae Cnelp, a calnexin homologue // J. Biochem. 2004. V. 135. P. 615-618.

273. Yamada K., Wang J.C., Osawa H. et al. Efficient large-scale transformation ofyeast//Biotechniques. 1998. V.24. P. 596-598.

274. Yao X.Q., Zhao H.L., Xue C. et al. Degradation of HSA-AX15(R13K) when expressed in Pichia pastoris can be reduced via the disruption of YPS1 gene in this yeast // J. Biotechnol. 2009. V. 139. P. 131-136.

275. Yeh P., Landais D., Lemaitre M. et al. Design of yeast-secreted albumin derivatives for human therapy: biological and antiviral properties of a serumalbumin-CD4 genetic conjugate // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 1904-1908.

276. Yilmaz S., Akar Cimen K. Pegylated interferon alfa-2B induced lupus in a patient with chronic hepatitis В virus infection: case report // Clin. Rheumatol. 2009. V. 28. P. 1241-1243.

277. Yin Z., Hatton L., Brown A.J. Differential post-transcriptional regulation of yeast mRNAs in response to high and low glucose concentrations //Mol. Microbiol. 2000. V. 35. P. 553-565.

278. Yoshida H. ER stress and diseases // FEBS J. 2007. V. 274. P. 630-658.

279. Yoshida H., Matsui Т., Hosokawa N. et al. A time-dependent phase shift in the mammalian unfolded protein response // Dev. Cell. 2003. V. 4. P. 265271.

280. Yoshimoto H., Saltsman K., Gasch A.P. et al. Genome-wide analysis of gene expression regulated by the calcineurin/Crzlp signaling pathway in Saccharomyces cerevisiae // J. Biol Chem. 2002. V. 277. P. 31079-31088.

281. Yuan L., Wang J., Shen W.C. Lipidization of human interferon-alpha: a new approach toward improving the delivery of protein drugs // J. Control Release. 2008. V. 129. P. 11-17.

282. Zabriskie D.W., Arcuri E.J. Factors influencing productivity of fermentation employing recombinant microorganisms // Enzyme Microb. Technol. 1986. V. 8. P. 706-717.

283. Zang K., Kumar R. Interferon-a inhibits cycline E- and cycline DI-dependent CDK-2 kinase activity associated with RB protein and E2F in Daudi cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 200. P. 522-528.

284. Zapun A., Jakob C.A., Thomas D.Y. et al. Protein folding in specialized compartment: the endoplasmic reticulum // Structure. 1999. V. 7. P. 173-182.

285. Zeuzem S., Feinman S.V., Rasenack J. et al. Peginterferon alfa-2a in patients with chronic hepatitis С // N. Engl. J. Med. 2000. V.343. P. 16661672.

286. Zeuzem S., Welsch C., Herrmann E. Pharmacokinetics of peginterferons // Semin. Liver Dis. 2003. V.23. P. 23-28.

287. Zhang X., Sun S., Hwang I. et al. Potent and selective stimulation of memory-phenotype CD8+ T cells in vivo by IL-15 // Immunity. 1998. V. 8. P. 591-599.

288. Zhao H.L., Yao X.Q., Xue C. et al. Increasing the homogeneity, stability and activity of human serum albumin and interferon-alpha2b fusion protein by linker engineering // Protein Expr. Purif. 2008. V. 61. P.73-77.

289. Zhou A., Hassel B.A., Silverman R.H. Expressing cloning of 2-5'A-dependend RNAase: a uniquely regulated mediator of interferon action // Cell. 1993. V. 72. P. 753-765.

Информация о работе

Карабельский, Александр Владимирович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Изучение факторов, влияющих на секрецию и биологическую активность химерного белка "Альбумин-интерферон-альфа16", синтезируемого дрожжами Pichia pastoris - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы