Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение физико-химических, иммунологических, биологических свойств рекомбинантных белков с последовательностью соматостатина-14 и оценка возможности их использования в качестве стимуляторов продуктивности сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение физико-химических, иммунологических, биологических свойств рекомбинантных белков с последовательностью соматостатина-14 и оценка возможности их использования в качестве стимуляторов продуктивности сельскохозяйственных животных"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИЙ

На правах рукописи

РГ8 ОД

ХОДУН МАРАТ-ВЛАДИМИР ЛЕОНИДОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ, БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ а ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ СОМАТОСТАТШ1А-1 4 И ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ СТИМУЛЯТОРОВ ПРОДУКТИВНОСТИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ.

Сиоциальноить 03.00.03 - молекулярная биологии

Автореферат дисивртацим на соиокашш учиной сгышьи кандидата биологических аиук

Ыоскьа - 1994 г.

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии животных ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАСХН Тихоненеко Т.И. кандидат биологических наук Лунин В.Г.

доктор медицинских наук Владимирский U.A.. кандидат биологических наук Советкин C.B.

Ведущая организация - Всероссийский Институт животноводства

РАСХН

Защита диссертации состоится " н _ 1994 г.

в _____ час. на заседании специализированного совета Д.020.40.01

при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127650 г.Москва, у л. Тимирязевская д.42.

Автореферат разослан " "_ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета р ^ кандидат биологический наук •

tCLU,

Meликова С.А.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

общая характеристика работы. Актуальность работы.

В современных условиях обеспечение населения продуктами животноводства возможно только при испольвовании высокоинтенсишшг технологий. На решение ьтих аадвч направлены оелекция животных, оптимизация условий кормления, содержания и ветеринарного контроля. Нижний частью технологии современного интенсивного животноводства »шляется применение биостимуляторов: гормоналышх препаратом, ■теневых препаратов и др. В то же время применение гормональных, препаратов сопровождается определенными сложностями, выйду опасности попадания гормонов в продукты питания.

Одним из интересных и перспективных направлений стало создашь стимуляторов негормональной природы, таких, как антисоматосгати новые сыворотки или белковые соматостатиновие конъюгаты.

Соматостатин - биологически активный тетридекапептид, вырабаты- вается в гипоталамусе и желудочно-кишечном тракте. Этот гормон бил выделен КгиНоЬ в 1968г. Соматоотатин синтеоируется в виде предшественника, который в процессе синтезы, транспорта и секреции процессирует на две формы соматостатин-I4 и соматостатин-28. Последовательность соматостатина-14 очень консервативна у позвоночных, а у млекопитающих вообще но имеет видовой специфичности. Соматоотатин оказывает сильное иигибируюцео дейстйм на широкий крут1 гормонов (и связанные с ниш Функции организма: соматотропин, .тиреотропный гормон , панкреатический гормоны (инсулин, глюкагон и др.), гормоны желудочного тракта (секретин, гастрин пепсин и др.), липазу, секрецию желудочных кислот, абсорбцию глюкозы, триглицеридов и аминокислот.

Широкий спектр действия соматостатина на факторы, контролирующие рост и утилизацию пищи, открывает значительные перс пективи его использования для регуляции роста животных, снижения экономических затрат на фураж и т.д. В опя:ш о этим большой интерес ¡тредставляет аутоиммунная реакция на соматостатин, приводящая и снижению концентрации пептида в крови за счет связывания с антити ■ лйми (иммунокоррекции) и, как следствие, индуцирующим анаболитическиэ процессы и ускоренный рост животных.

Данный подход позволяет получать экологически чистые продукт питания, т.к. не связан с применением стероидных гормонов и шпион

отиков, а основан на небольших изменениях концентраций анаболити-ческих факторов. Таким образом, социальная и народнохозяйственная значимость данной проблемы хгредставляется очевидной.

В то же время соматостатин является низкомолекулярным белком-гаптеном, время полужизни которых в кровотоке составляет несколько минут. В связи с этим ■ для иммунизации соматостатина применяются.его химические конъюгаты с различными белками.

Ооношшми путями получения соматостатина является выделение из эндокринных органов животных и химический синтез. Однако получаемые таким образом препараты очень дороги (38 долларов США за 1 мг соматостатина по каталогу фирмы Sigma, 1993г.) и экономически не позволяют реализовать данный подход на практике. Появление методов генной инженерии открыло возможности для ' производства ряда белково-пептидных гормонов путем синтеза -их в клетках бактерий. Однако, прямой микробный синтез соматостатина исключен в силу его небольших размеров, в связи с чем возникает необходимость решения проблем его синтеза в . составе химерного белка, в котором ооматоогытин находится в иммунодоминантном положении.

О-иует отметить, что на пути создания биостимуляторов с исшль.-к-ьинием генноинженерных методов стоит множество проблем. Так, например, для эффективного действия стимуляторов, использующих принцип гормональной иммунокоррекции, важно добиться доступности антигенной детерминанты в составе гибридного белка для иммунокомпетентных клеток. Составной частью этой проблемы является определение локализации интересующих эпитопов в составе белка, их доступности для иммунокомпетентных клеток и разработка методов для решения этих задач. Другой важный вопрос при создании таких препаратов - это получение достаточной .иммуногенности химерного белка, что во многом обусловлено выбором белка-носителя для специфических детерминант.

Одним из способов повышения выхода препарата и, как следствие, его удешевления, является высокоэффективная экспрессия белка е бактериальных клетках с образованием малорастворимш телец-включений. Однако, физико-химические свойства таких белков s съдэьнш с а той проблемой вопросы выделения, очистки, получени? пммуногеншх композиций и способы их применения изучены i разработаны недостаточно.

Настоящая работа посвящена изучению свойств рекомбинпнтннх белков о последовательностью соматостатина и возможности их применения в качестве биостимуляторов.

Поль и задачи работы.

Целью настоящей работы являлось изучение физико-химических и иммунологических свойств химерных белков с последовательной«V соматостатина, полученных с использованием геннолшепбрног^ подхода, создание иммуногенной формы этих препаратов, о тнкжо оценка возможности их использования в качестве стимулятороъ продуктивности сельскохозяйственных животнх.

Для достижения поставленных целей в работе были сформулироьани следующие задачи:

1. Охарактеризовать физико-химические и иммунологические сьойстнч рекомбинантных белков, содержащих соматостатин.

2. Разработать метода оценки экспонирование на поверхности рекомбинантных белков и доступности для клеточных ■ рецептором детерминанты соматостатина.

3. Основываясь на изученных свойствах и характеристиках болкок, разработать способ получения иммуногенной формы препаратом соматостатина.

4. Исоледовать возможность применения препаратов соматостатина кьк биостимуляторов в животноводстве и изучить изменения и физиологическом статусе животных в постиммунизационный период.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В настоящей работе впервые в стране создан набор дли определения соматостатина в плазме крови и определения антитил » ооматостатину в сыворотке и плазме крови кроликов, крутки ¡югатого скота ' и свиней. Разработан Сиохемилюминесцентный метоа определения доступности антигенной детерминанты малорастноримнх рекомбинантных белков для взаимодействия с клетками иммунной •системы. Впервые проведен сравнительный анализ экспонировании и доступности детерминанты соматостатина в малорастворимнх и растворимых гибридных белках с аналогичным носителем. Разработана технология выделения, очистки и ренатурации рекомбинтпиих соматостатин-содержвщих белков о целью создания иммуногенис/Л

композиции. Получена иммуногенная композиция препарата соматостатина. Показана возможность применения препаратов соматостатина, полученных микробиальшм синтезом, как стимуляторов мясной и молочной продуктивности крупного рогатого скота. Впервые показана возможность применения этих препаратов как стимуляторов лля нетелей. Проведена оценка изменений, происходящих в организме животных в постиммунизационной период.

Апробация работы.

Результаты работы были доложены и обсуждены на расширенном заседании отдела генной инженерии ВНИИ СБ. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции "Повышение мясной продуктивности в Нечерноземной зоне" (С-Петербург, ноябрь 1993г.).

Публикации.

Основные результаты диссертации отражены в трех печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.

объем л структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Результаты", "Обсуждение", выводов и списка использованой литературы. Работа изложена на 132 машинописных страницах, включая Б таблиц и 17 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В настоящей работе ставились задачи изучения физико-химических, иммунологических и биологических свойств препаратов соматостатина, полученных о использованием гошюинженерног.о подхода путем микробного синтеза и создания иммуногенной ;формы этих препаратов с целью оценки возможности их использования в качестве стимуляторов продуктивности сельскохозяйственных, животых. --•

1. Структура и некоторые физико-химические свойства .изучаемых рекомбинантных белков.

Исследуемые рекомбинантныэ белки представляли собой 1'рехкошюнентную систему, состоящую из белка-носителя, спейсерной последовательности и • соматостатина. В настоящей работе изучались

рекомбинантные белки, в которых носитель представлял собой модифицированные белки двух видов: хлорамфениколацетилтрасферазу, кодируемую нуклеотидной последовательностью транспозона TN9, и дигидрофолатредуктазу мышей, кодируемую векторной плазмидной системой pQE фирмы Diagen (США).

Исследуемые белки подразделяли на две группы. Первая группа белков (группа А) представляла из себя водорастворимые рекомбинантныебелки, в которых в качестве белка-носителя использовали нативную полноразмерную хлорамфениколацетилтрансферазу (oomplete chloramphenicolaoetyltranepheraee - СС), Обладающую ферментативной активностью. Вторая группа белков (группа Б) представляла из себя группу водонерастворимых белков-, в которых ь качестве белка-носителя использовали модифицировяну!.!

хлорамфениколацетилтрансферазу (СМ) с делецией десяти С-концеьых аминокислот и вставкой трех аминокислот (Leu-Val-Gln) в позиция'-. 73, 74 и 75 (см. Рис.1) (группа Б1) и дигидрофолатредуктазу, как полноразмерную (DO), так и модифицированную (с делецией 2С-тп С-концевых аминокислот, DM) (группа Б2). Рекомбинантные белки группы Б ферментативно неактивны, и формируют в клетках бактерии водонерастворимые, гидрофобные и инертные тельца-включения. Профиль гидрофильности-гидрофобности по Hoop Т.P. and Woods K.R. белкой группы Б нэ примере белка pCM(HP)4S представлен на Рис.1.

Спейсерная последовательность состоит из одного или нескольких повторов последовательности ' Arg-?ro (RP) или Lye-Pro (KF), нуклеотидная последовательность которой была получена химическим синтезом. Комбинация гидрофильной аминокислоты (аргинина или лизина) и пролина, обеспечивающего жесткость структуры приводит к образованию короткой, жесткой и гидрофильной структуры. Наличие такой спейсерной последовательости между гидрофобным белком -носителем и гидрофобным соматостатином должно способствовать экспонированию прилежащих к спейсеру участков на поверхности реком-бинантного белка (Рис.1). Интересно отметить, что активность имму-номодулятора тафцина обусловлена именно дипептидной группой (RP).

Аминокислотная последовательность соматостатино (ss) полностью соответствует природной последовательности соматостатшш-14. Ген соматостатина был получен олигонуклеотидным синтезом о последующим клонированием.

280

kiiiiiiiiuiiiiiiiiiiiiiiiitiiihJmmt

см

(EP)4 SS

Гис.1 Схема строения и профиль гщфофильности-гидрофобности бежа pOM(HP)4s.

IIIII- -белок-носитель (хлорамфениколацетилграсфераза);

-ЕЯ- - спейсерная последовательность (RP^);

- последовательность соматостатина-14.

Все белки были получены в результате экспресш рекомбинантных илиамид в штаммах E.coli MKD 3207 (белки группы А и группы Б1) и Ml 5 (белки группы Б2).

В настоящей работе в качестве контролей использовали конъюгаты бычьего сывороточного альбумина и соматостатина (SEB) или овольбумина и соматостатина (seo), полученных пришивкой пептида соматостатина к белку-носителю с помешаю растворимого карбодиимида.

Схемы строения исследуемых рекомбинантных белков и некоторые их характеристики приведены в Табл.1.

1.1.Электрофорвтическая подвижность рекомбинантных белков.

Электрофоретичеекая подвижность исследумых белков хорошо коррелирует с их молекулярной массой и может использоваться для идентификации рекомбинантных белков (Рис.4). Молекулярный вас исследуемых рекомбинантных белков колеблется от 20 кДа до 30 кДа.

Различие электрофоретической подвижности белков ё ПААГ-гале в восстанавливающих и невосстанавливаюцих условиях (Рио.2), снидетельствует о том, что в поддержание «информации белков группы А вносят существенный вклад дисульфидам связи, появляющиеся в процессе выделения белков.

Таблица I

Схемы строения, некоторые физико-химические свойство и характеристики исследуемых белков.

Название конструкции

Молек.^Индекс 'изоэлект-масса гидро- рическая (Да) фобности точка

К-во а.о. Схема строении в молекуле рекомбинантных (и+К)(0) белков

ББ рОО

рОСШ-рОСЗ р0013 рСО(НР)_

1639 -0,64 9,16 Груш1а А.

2Б918 -0,28 6,89

-0,29 5,89

р00(ЯР)43

Груша Б1 рСМЭ

рСМ(1?Р)43

рСМ(НР),

рОМ(КР)43

рСМ(КР)

4

290Б9

27208 28998 28132 28846 27959

Группа Б2. рШ(

рОС

рБМ(ИР)4Б

-0,33

-0,24

-0,20

-0,19*

-0,20

0+2

£ЗИ А АА

27905 2008Э 27748

28553 -0,26 6,31

0,30 6,03 0,29 6,03

-0,23 6,67

Группа

6,31 7,34 6,76 7,34 7,00

СМ (КР)4 11+12 4 ШШЖШШ СМ (КР)'

7+ЙЗ 7

4 ■•->.

А л А

■' СМ (КР)4 БМ

26626 +0,14 10,21 26576 +0,20 9,76

17+10 2

ЗЕЭЕ

ОБ

Примечание. 1) Молекулярная масса, индекс гидрофоСности и изоэлектрическая точка рассчитывались на основании данных об аминокислотных последовательностях с помощью пакетов программ РШЗХБ (РЬагтао1а, Швеция) И РООЕГСЕ (Ъ^еШеепеио, США); К -лизин, И - аргинин, с ~ цистеин; Р - пролин; в.о. - аминокислотные основания; вв - соматостатин...

1> 2 а 41 _■!> _

- 30

_ - 10

Рис.2. Электрофоретическая подвижность рекомбинантных белков р00(КР)2в и роо(НР)^ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Электрофорез проведен в 12% ПААГ-геле в системе Леммли; треки 1 и 2 белок рОО(ИР)2з в восстанавливающих и

невосстанавливающих условиях, соответственно; треки 3 и 4 - белок рОО(КР)4Б в восстанавливающих, и, невосстанавливающих условиях, соответственно; трек 5 - контроль молекулярного веса.

1.2. Растворимость.и способность к агрегации химерных белков.

Растворимость белков определяли седиментационным фракционированием лизатов биомассы или выделенных и очищенных рекомбинантных белков с дальнейшим анализом полученных супернатантов и осадков ъ электрофорезе по Лэммли (Рис. 3). Агрегацию изучали по изменение оптической плотности (Х=350 нм) пробы бежа после выделения и по результатам фракционирования гельфильграцией препаратов белков, которую проводили с помощью высокоэффективной хроматографии среднего давления на колонке Бирегове-12 (Р1тгтао1а, Швеция).

Анализ изучения растворимости показал, что белки группы А хорошо растворимы и ферментативно активны, в то время каю растворимость белков группы Б крайне низка. Белки этой группы фермонтативно не активны и образуют при микробном синтезе

1 S 3 4 5 6 7 9 9 10 11 12 13

4 4*14* 44* 1*44

Г:»*- - »Л Г'

S ■ г-

1 t § 8

он

tee

G6

46 29

. Ш._ Ш —

14

Рио.З. Электрофореграмма анализа растворимости исследуемых белков, треки 1 и 2 - оупернатант и осадок клеточного липатч препарата белка pCM(RP)^ß; греки 3 и 4 оупернатант и осидок очищенного препарата бежа pOM(RP)4s; треки Б-8 - то kr дпя препарата p00(RP)4B; трек 9 - контроль молекулярного веса; треки 10 и II оупернатант и осадок очищенного препарта рШ(Ш>)4в; треки 12 и 13 оупернатант и осадок лизатя белков штамма E.ooli MI Б. Электрофорез проводили в 12% ПААГ-геле в системе Лемм™. Окраску гелеЛ проводили Нумасси R-250.

нерастворимые телыш-включения.

Изучение- растворимости белков группы Б с целый очистки с применением детергентов, таких как Triton х-100, 'Rridge, Nonldat, гуанидинхлорид, додецилсульфат натрия (ДДО) и хаотригпшх агентов (мочевины, дезоксиколата натрия) показало, что ети белки растворяются только в наиболее, жестких условия*: 2% ДДО, о, IS р-меркаптоэтаноле (р-мэт.) в карбонатном буфере рН 10,0, или гуанидинхлориде, 0,1Ж р-мэт. в карбонатном буфер» pll 1(J,f). Д/iit дальнейших исследований необходимо было получить сомнтоститин ь составе рекомбиналтных белков в нативной конформьции. Для после выделения и удаления денотурлруршшх агентов белки грушгО '

ренатурировали. денатурацию проводили на хроматографической колонке о сорбентом AG11A8 (Biorad, США) или методом ступенчатого диализа.

При удалении денатурирующих агентов препараты белков группы Б некоторое время оставались прозрачными и не образовывали осадка при центрифугировании (4000g). Однако вскоре появлялась опалесценция с последующим полным выпадением белка в осадок в виде хлопьевидных белых агрегатов. Проследив динамику изменения оптической плотности препаратов очищенных белков, коррелирующую с образованием агрегатов, было обнаружено что белки группы Б после ренатурации проявляют очень высокую способность к агрегации, в то время как растворимые белки группы А, не подвергавшиеся денатурации практически не образуют агрегатов.

Для изучения физического состояния химерных белков наиболее интересно было установить степень агрегации белка в точке, где препарат прозрачей и не образует осадка при центрифугировании (4000g). Для этого препараты белков групп А и Б анализировали гельфильтрацией. При этом, было показано, что даже при кажущемся растворении белков группы Б в препарате•присутствуют гетерогенные агрегаты, в то время как в препаратах группы А'белки находятся в основном в мономерной форме и не образуют агрегатов.

Низкую растворимость и высокую arperaтивность белков группы Б можно объяснить тем, что С-концевая' область хлорамфениколацетил-трансферазы является амфипатической а-спиралью и ее элиминирование приводит к обнажению гидрофобной платформы на поверхности белковой глобулы, которая обуславливает сильные межмолекулярные взаимодействия. Значительный вклад в ингермолекулярные взаимодействия могут вносить серосодержащие аминокислоты, способные образовывать ss-связи, прежде всего цистеин (Табл.1), о чем свидетельствует невозможность растворить гибридный белок группы Б в 6М гуанидинхлориде без присутствия р-мэт.

Гибридные белки группы Б1 менее растворимы и обладают более высокой способностью образовывать агрегаты по сравнению с белками группы Б2 (имеющими дигидрофолатредуктазу в качестве носителя), что, по-видимому, может быть объяснено полным отсутствием цистеинов в молекуле дигидрофолатредуктаэы и, соответственно, более низкой способностью образовывать межмолекулярные связи.

2.Иммунологические свойства рекомбинантных белков с последовательностью соматостатина.

2.1.Изучение иммунологических свойств рекомбинантных белков о последовательностью соматостатина in vitro.

Изучение взаимодействия исследуемых белков в иммуноблотинге со специфической антисоматостатиновой сывороткой фирмы АлшгеНагп (Великобритания), меченой [1251], показало наличие специфического связывания рекомбинантных белков, имеющих последовательность соматостатина и отсутствие такого взаимодействия с белками без соматостатина (Рис.4).

Для более детального анализа иммунологической активности рекомбинантных белков была разработана тест-система радиоиммунного анализа (РИА) соматостатина. Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы соответствеут аналогу фирмы Inoetar (США).

В конкурентном РИА исследовалось взаимодействие меченого [125lf соматостатина, полученного пептидным синтезом, стандарта соматостатина (Вектор-Биопродукт, Россия) рекомбинантных белков с последовательностью соматостатина и антисоматостатиновой сыворотки фирмы Amerehajn (Великобритания). Крийые ингибирования связывания меченого гормона рекомбинантными белками показаны на Рис.Б.

Результаты анализа кривых показали, что растворимые гибридные белки проявляют более высокую иммунологическую активность , чем нерастворимые. При этом белки, имеющие спейсерную последовательность проявляют несколько более высокую активность, присущую соматостатину, чем их аналоги без спейсера. Белок pDM(RP)4s вытесняет [1251]соматостатин несколько сильнее, чем его аналог - белок pOM(RP)4B с хлорамфениколацетилтрансферазой в качестве носителя . Это, вероятно, объясняется тем, что белки группы Б2 более растворимы. В'-частности, в силу полного отсутствия цист.еинов (Табл.1) в дигидрофолатредуктазе белок pDM(RF)4s может образовывать межмолбкулярные SS-связи толко за счет соматостатина, и поэтому количество доступных детерминант соматостатина у белков этого ряда выше, чем в белках с хлорамфениколацетилтрансферазой в качестве носителя.

Таким образом -результаты изучения иммунологических свойств рекомбинантных белков в конкурентном РИА и иммуноблотинге показало

I г ' 3 4 5 6 7 8 9 10111213 14 15

i Л i- i __£„ 1 . * * 4 4 4 4 *

. - — *« J- ■ —-

4* ■ - . «--•

«к. ~ *» fc.

с.» Ш & c: vi

Г

S-f: 11

5 5 ««

«- 94 4- 67 «- 43

30

i

20 14

1 2 Э 4 Ъ 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

4 4 4 4 4 4 .444 4 44

30

20

I'm!. 4. Электрофорез и иммуноблотинг о антиооматостатиновой тшцифичейкой сывороткой (АшегвКаш, Великобритания ), меченой [ l?f\T] .клеточных лизатов ив следующих штаммов: 1 - E.ooli MKD 3207, 2 - E.oolt MKD 3207 (pOOHI-), 3 - E.ooli MKD 3207 (pOOS), 4 -K.on'lt MKD 32.07 (pOOIS), 5 - E.oolt MKD 3207 (p00(RP)2S), 6 -E.(»II MKD 3207 (pC0(RP)4S), 7..- контроль молекулярного веса, 8 -E.oott MKD 3207 (pCM(RP)4), 9 - E.oolt MKD 3207 (pOMS), 10 - E.coii МКП ГЛП (pOH(RP)4S), 11 - E.coli MKD 3207 (pOM(KP)4S), 12 - E.oolt MKD 3P07 (pOM(KP)4), 13 - E.c oil Ml Б (pDM(RF)48), 14 - E.ooli Ml Б (poo), 1Б - E.ooli Ml 6. Электрофорез проводили в 12£ ПААГ-геле И l!H"T(iM4 Лнммли.

1.00 ^ÜL

0.80

0.60

0.40

0.20

0.00

0.01

11 "I 0.1

I lililí 1

10

[С].I

***** Kpxx&i вытеснена* меченого сочетостетнна стандартен ***** Крквак вытеопеява верастворкшш белкой pDM(RP)4S tJtlíí Kpnu вытесневва рестворжхик белкой pCC(RP)4S л л л л а Нркакх витеснеяяв яерастворншпс бешсои pCM(RP)4S > Крявак вытеснены яерастворныыя белкой pCM(RP)4

Рис.Б. Ингибирование связывания [1251] соматостатина о антисомато-отатиновой сывороткой (АтагвЬат, Великобритания) рекомбинантными белками в системе конкурентного РИЛ соматостатина.

наличие антигенных детерминант гибридных белков, проявляющих иммунореактивность, присущую соматостатину.

Однако, условия взаимодействия антител и антигенов in vitro в конкурентном РИА или лммуноблотинге сильно отличаются от взаимодействий с иммунной системой рекомбинантных белков при введении их в организм. Поэтому следующим этапом исследований были эксперименты, имеющие цель показать иммуногенность этих белков и доступность детерминант соматостатина исследуемых белков для взаимодействия с клетками, иммунной системы в условиях in vivo.

2.2. Изучение токсичности препаратов рекомбинантных белков на лабораторных животных.

Для определения токсичности введения белка были сформировали четыре группы мышей линии ВАЬВ/о по тридцать мышей в каждой груше. ■Первой группе вводили препарат p0M(RP)4S, второй p00(RP)4s, третьей SEB, четвертая группа не иммунизировалась. В каждой группе были

i—п

сформированы подгруппы по десять мышей. По литературным данным, доза препарата для экспериментов с крупными сельскохозяйственными животными, должна составлять около 50 мкг на кг живого веса. Поэтому для проверки токсичности были выбраны дозы, превышающие эту величину в 100, 300 и 800 раз. Первую и вторую инъекции делали внутрибрюшинно, третью - внутривенно в хвостовую вену с интервалом две недели. Животных наблюдали в течении 60 дней после последнего введения. Аналогичное исследование в тех же дозах было проведено не кроликах.

Никаких проявлений токсических или анафилактических эффектов в результате иммунизаций ни в одной груше не наблюдали.

2.3. Изучение антигенных и иммуногенных свойств исследуемых рекомбинантных белков на лабораторных животных.

Параллельно с определением токсичности, в этих экспериментах ставилась задача определения возможного биологического эффекта в результате введения препаратов, проявляющегося в ускоренном росте, и повышении уровня специфических антител. Для этого изучали динамику роста мышей balb/o, иммунизированных в екепериментах по определению токсичности, и динамику роста кроликов двухмесячного возраста породы "белый гигант". Группы кроликов были сформированы аналогично опыту на мышах. Кроме' того, была сформирована дополнительная группа, которой вводили препарат seo.

Ни у мышей ни у кроликов изменений в скорости роста или динамике привесов по сравнению с неиммунизированными животными не наблюдали. Это, вероятно, связано с тем, что . Ь проведенном эксперименте кроликов иммунизировали во взрослом состоянии, а мыши достигают половозрелого состония быстрее, чем формируется достаточный для элиминирования соматоствтина иммунный ответ, при этом, по литературным данным, соматостатин оказывает максимальное действие в пренэтальный период и в раннем возрасте. Относительно уровня антител у кроликов и гашей наблюдались сходные картины. У животных., иммунизированных белками группы Б титр специфических анштел практически отсутствовал, при инъекциях белков группы А -был также незначительным, но несколько выше, чем в первом'случае. В группе SEO у всех животных выявлялись антитела к соматостатину, однак;> тигр специфических антител был невысоким и очень быстро

падал. Это, вероятно, обусловлено природой ооматостатина, невидоспецифичного и дреьнего гормона. Полученные результаты согласуются с данными Buonomo et al. и Bail ьt al., н которых наблюдался биологический эффект, но не выявлялись высокие титры антител. Поэтому представлялось интересным исследовать реакцию клеток иммунной системы на вводимые рекомбинантные белки.

2.4.Изучении дийстьия иммунизации рькомбинантными белками лабораторных животных на иммуникомлетентные клетки.

Для проведения ьтого эксперимента были сформированы чишрь грушш лабораторных животных (кроликов породы "бабочка"). Первую группу иммунизировав белком грушш В (pOM(RP)<(S), вторую - белком грушш A fpOO(RP)^S), третью - коньюгатс.м иьальбумина и и&шиды оомаюогатина в качестве положительного контроля (¿ио), и чснЬортуь ipynny не иммунизировали. Из крови экспериментальных животных выделяли иммунокомпетентные клетки (макрофаги, лимфоцит и др.), для которых определяли время выхода, максимума индуцируемой биохемилюменисценции и его ьешчнну при сенсибилизации клеток раствором пептида соматостатина CGOM) или суспензией зимозана, опоонизирова1шого (адсорбированного на поверхности глобулы эимозана) соматостатином (ЗС). В качестве контрольных индукторов использовали суспензию эимозана (СЗ) 'контроль неспоцифичеокого индуцированного свечения) и суспензию зимозана сз опсонизирсьашшмч иммуноглобулинами кролика (ВИ) (положительный контроль).

Механизм возникногения биохемшшмениоцвнцш клеток нзучин недостаточно, однако показано, что свечение ьозникаит в результате дестабилизации . клеточного метаболизма. Определение величины реактивного клеточного излучения может служить адекватным, надежным и достоверным критерием степини и силы реакции клетки, поскольку свечение определяется состоянием клетки и степенью перчетройки метаболизма в результат« взаимодействия о раздрпжанапим агентом. Дишше, получывмые ь результате экспериментов доолн-очно воспроизводимы. Безусловным диптоииотвом Мотода является отгу лзтние необходимости культивировать виделанные клетки дпн постановки (экспериментов.

На Рис.6 показаны кривые СиолыЛилиминеоценции иимуичкоч--ueTeHTHUic клеток. Наиболее интеноиииов свечение пабпюдгнш в пробок

А

0.00 5.00 10.00 1 5.00 20.00 25.00 30 00 Вреш (иак)

80 00 -1

5.00

30.00

ТГТТТТТТТГГТТТТГГТТТТТГ!

10.00 15.00 20.00 25.00 Ереня (мин.) • ййИЮ Св«чевие клеток, ипдци^овашшх ЗИ Свечение кпеток, ип/^цированных ЗС 111*1 Сэечекие клеток, индуцированных акыоаавоы «седо Свечение клеток, иьдуцироввнкых С0и

Рис.в. Кривые хемилшешсценции иммунокомпетентных клеток животных, иммунизированных исследуемыми белками. А. Свечение иммунокомпетент-1шх клеток животных, иммунизированных препаратами с последовательностью соматостатина. Индуктор ЗС. Б. Свечение иммунекомпетентных клеток неиммунизировакных животных. Индукторы ЗС, СОМ.'СЗ и ЗИ.

с клетками группы seo, индуцированных вс, что moj:>jt Сыть обусловлено большей мольной долей соматостатинэ в препарате SEO по сравнений с другими препаратами. Интересно отметить, что максимум хемллюменисценции клеток животных, иммунизированных белком группы Б сравним по величине с максимумом свечения клеток животных, которым вводили белок группы А, однако время его выхода несколько меньше. Это, возможно, свидетельствует о более высокой иммуногенности препаратов белков группы Б, которая во многом обусловлена экспонированием соматостатшовой детерминанты на поверхности рекомбинантного белка и его физико-химическими свойствами. Кроме того, поскольку интенсивность суммарного свечения в основном определяется хемиляменисценцией макрофагов и полиморфноядерных нейтрофилов, малорастворимые агрегаты рекомбинантннх белков группы Б. возможно, вызывают более сильный ответ именно этих популяций фагоцитирующих клеток. При индукции свечения клеток животных, иммунизированных белками с последовательностью соматостатина, пептидом сом также наблюдался выраженный максимум свечения клеток, который, однако, бкл более поздним по времени выхода, к свечение наблюдалось менее интенсивное по сравнению с клетками, сйнсибилизированными ЗС. ото, по-видимому, объясняется тем, что короткий растворимый пептид вызывает достаточно слабую сенсибилизацию макрофагов и нейтрофилов. При индукции сз, сом и зс клеток, выделенных из крови некшунизир .ванных животных наблюдалось относительно слабое свечение. При индукции зи наблюдался яркий и хорошо выраженный максимум свечения (Рис.6).

Таким образом, рассмотренный метод является высокоспецифичным ц достаточно чувствительным для определения иммуногенности и анти-генности рекомбинентных белков, особенно нерастворимых. Нерастворимые белки достаточно сложно анализировать традиционными иммунологическими методами, например ь ттчрдофазном 1'Г-А, поскольку, в силу особенностей Физико-химических свойств, такие белки не удается сорбировать на полимерные планшеты. В случае применения методов анализа в растворе необходимо готовить белки особым образом с применением детергентов и хаотропных агентов. При этом их иммунологические свойства сильно отличаются от свойств препаратов, вводимых кивотным. Высокая специфичность предложенного метода позволит, вероятно, применять его также для иммунологической оценки вакцинных препаратов.

3.4. Изучение иммунологических свойств рекомбинантных белков с последовательностью соматостатина на сельскохозяйственных животных и оценка использования втих препаратов в качестве стимуляторов в животноводстве.

В опытах Брепвег et а1. было показано, что иммунизация животных препаратами с приштым пептидом соматостатина приводит к усилению молокоотдачи, ускоренному расту животных и крупноплодию потомства. Поьтому было целесообразно изучить динамику этих параметров у животных, иммунизированных рекомбинантными белками о послеовательносгьв соматостатина. Поскольку при введении исследуемых белков половозрелым лабораторным животным биологических эффектов не наблюдалось преположительно ввиду их возраста, дальнейшие (эксперименты были проведены с женскими особями на поздних стадиях беременности (негелями и супоросными свиноматками). Дополнительной задачей исследования являлось изучение воздействия иммунизации препаратами рекомбинантных белков на протекание беременности, отел (опорос), мертворожденность и рожденное потомство. После второй иммунизации сыворотку крови животных анализировали для определения титра антител к соматостатину

Для исследований был выбран крупный рогатый скот черно-пестрой породы и свиньи породы крупная белая, как одни из наиболее широко распространенных пород на территории страны.

Иммунизацию нетелей проводили препаратами рекомбинантных белков, содержащих в качестве носителя хлорамфениколацетилтрансферазу (группы А и Б1), а также - дигидрофолатредуктазу (группа Б2).

Для экспериментов с белками груш1 А и Б1 были сформированы пять групп нетелей черно-пестрой породы по пять животных в каждой группе, поставленных на одной ферме в одинаковых условиях кормления и содержания. Первую гру1шу животных иммунизировали препаратом нерастворимого гибридною белка грушш Б1 (рОМ(КР)4б), вторую -препаратом растворимого гибридного белка грушш А (рС018), третью -препаратом хлорамфениколацетилтрансферазы (белка-носителя роонт--), четвертую - препаратом конъюгага соматостатина (бев), полученного пептидным синтезом, и бычьего оыьороточного альбумина, приготовленного с помощью сшивки растворимым карбодиимидом, пятую группу не имуннизирпвали. Для экспериментов с рыкомбнншпными

М1

А 18 00 -,

Я р<

IU0°

<б и о

g 12.00 Я

Я о

3

10.00

ЛЛЛЛЛ Лахтадяш группы, плиувяяярояляяой рСЩRPHS иш Лахтаож 1'рушил, ящунязяромкной pCM(RP)4 00000 Лактаця* иеймиунхзироваяяой группы

16.00

S

О. Н

Я 14.00

m м о

g 12.00

s о

.....I...................I.........1НИНМЦН11

20.00 30.00 40.00 50.00 60.00

Дни после отела

afv

8 °°о.оо г ю.оо '"'гооо зо.оо 40.00 " 50.00 ' еочм. 17оло, Дни поел отела

***** Лаиацн! грушш, ииыунизкровднной SES

Лахтадвя грушш, ииыуядоированной pCCIS (растворю!.) Лактацня группы, ииыуниэироваиной pCM(RP)4S (иераствор.)

Рио.7. Динамики лак-тащш первотелок, иммунизированных. '^«^мойнши-тными'белками, использующим в качестве белка-носителя хлорамфени-колацетилтрансферазу. А. Динамика лактаци рсмои1)^, ром и неиммунизировшшой групп. Б. Сравнительная динамика лактации групп, иммунизированных белками о последовательностью сомагиот.'лпни.

белками на основе дигидрофолатредуктаэы были сформированы три груши; нетелей по десять животных в каждой группе., Первую группу кйьэтнкх иммунизировали препаратом нерастворимого гибрида д.1«ид]и»5олатр^дутвзы с последовательностью соматостатина (1'7'М(К?)4я>, вторую - препаратом дигидрофолатредуктаэы (бежа -но'',и1ел/!) (рве), треть» группу не имуннизировали. Препарат вводили з;'. 50 дцнй до отела трижды с двухнедельным интервалом.

Полученные данные свидетельствуют о достоверном (р<0,05) иоьаыении уровня лактации первотелок как по абсолютной величине, так и по динамика прироста, в результате введения рекомбинантных белков с последовательностью соматостатина.

Величина надоев в группе, иммунизированной бежами с последовательностью соматостатина по сравнению с неиммунизированной группой была выше в течение 60 дней со дня рождения теленка. Превышение контрольного уровня было значительно с первых дней лактации и достигало наибольшего значения около 2С% на 30-35 день, в дальнейшем различия сохранялись на уровне 9-10% и к 60-му дню величина различия надоев сильно уменьшалась (Рис.7, Рис.8). При этом максимальные надои наблюдались у животных в группах, иммунизированных нерастворимыми бежами (рОМ(КР)4Б и рШ(йР)4Б).

Интересно отметить, что в группах, иммунизированных растьоримым бежом р0С1Б (группы А) и бев уровень лактации приблизительно одинаков и превышает надои неиммунизированной группы на 12-15$, хотя мольная доля соматостатина в препарате бев существенно выше.

Очень интересными оказались результаты сравнения надоев групп, иммунизированных белком-носителем (роем- и рБС) и неиммунизированной групп. Оказалось, что введение белка-носителя обеспечивает прирост надоев молока на величину 8-13%. При этом введение хлорамфениколацетилтрансферазы (группа реей-) оказывает несколько более сильное стимулирующее действие, чем введение дигидрофолатредуктаэы (группа рве). Причем различия надоев животных этих груш по сравнению с неиммунизироьанными наблюдались также ь течении 1 ,5 месяцев после отелы и к 60 дан становилось менее значительным. В настоящем исследовании этот феномен можно интерпретировать как действие, аналогичное по механизму стимулирующему эффекту тканевых препаратов. Поскольку белок в

го

А

15.00

Дни после отела

Б

Дни после отела

¡110.8. Динамика лактации нервотвлок, иммунизировании* рекомбинантными белками, содержащими в качестве белкй-носителя дигидрофолатредуктазу (Группа Б2). А. Динамика лактвци контрольных и опытных груш. Б. Динамика прироста лактации контролышх и опытных групп.

процессе взаимодействия с системами иммунитета подвергается протеолизу, появляются пептида (как и в тканевых препаратах), обладающие стимулирующим действием. Другой иллюстрацией возможности такого механизма действия белка-носителя является способ получения многих биологически активных соединений из гидролизатов различной природы.

Поскольку системы, обеспечивающие молокоотдачу тесно связаны с системами анаболизма/катаболизма, увеличение надоев первотелок при иммунизации соматостатином вполне объяснимо. Подобные результаты вполне согласуются о данными Брепоег- по росту животных, выкармливаемых материнским молоком длительный период (козы, овцы). Потомство от иммунизированных белками с последовательностью соматостатина матерей растет более интенсивно, чем от контрольных животных. Этот еф$ект, вероятно, связан с тем, что динамика! приростов обусловлена не только изменением гормонального уровня в период беременности матерей или уменьшением уровня эндогенного соматостатина за очет полученного молозива, но и увеличением общего уровня молокоотдачи матерей.

Таким образом, введение рекомбинантных белков оказывает стимулирующее действие на лактацию первотелок, складывающееся из специфического действия, вызванного иммунизацией соматостатина, и неспецифического, обусловленного белком-носителем.

Результаты исследований по определению динамики увеличения веса телят, родившихся у иммунизированных рекомбинантными белками первотелок, представлены на Рис.9.

Наблюдалось достоверное (р<0,05) превышение как в динамике роста, так и в абсолютной величине увеличения веса телят, рожденных от матерей группы рБЫДО)^ по сравнению с телятами от матерей неимуннизированной группы. Превышение наблюдалось в течении 60 дней, достигая максимумального значения на 26-28 день.

Интересно отметить, что различий между ростом телят от матерей неиммунизированной группы и группы рБО не наблюдается. Это свидетельствует о том, что, во-первых, эффект стимулирования лактации или роста в результате введения носителя проявляется лишь у самих иммунизируемых животных, и, во-вторых, иммунизация белком-носителем в пренатальный период не отражается на потомстве. При этом усиление роста потомства обусловлено специфическим

s к

w ш

ОТ

Средний в dt в группе (кг)

-8

8

pj

ё 'S

я s

а й

а р-

(9 8

S-8

действием соматоотатшш в состава рекомбмнантшх Силков.

Сходный результат получен при иммунизации супоросных свиноматок. Для изучения двйотвия препаратов рекомбинантных белков на роот потомства имыунивироввнных свиноматок были сформированы пять групп (рОЫ(йР)4В, р001Б, pOORi-, BEB и группа неиммунизируемых животных)« ' аналогично эксперименту на нетелях. Иммунизацию проводили по той же схеме.

Показатели веса порооят в группе рСИ(НР)дВ на 1Б день от рождения в 1 ,Б раза выше, чем в других группах при несколько меньшем количества выкармливаемых поросят. Это различие сохраняется до 2.1 дня, а затем становится незначительным (Табл.14, Рис.9). Наблюдаемая динамика/ роста порооят позволяет предполагать, что отмеченное превышение контрольного уровня обусловлено крупноплодием при рождении.

Таблица 2.

Показатели продуктивности свиноматок опытных и контрольных групп.

Группа животных

Среднее количество поросят на гнездо

Средний вес поросенка на 16 день от рождения

I Группа pOM(RP)4B

II Группа р001В

III Группа pOORi- .

IV Группа вев

V .• Контроль (неим>Лукизироващше)

9,Б + 0,7 .10,7 + 0,48 10,Б + 0,81 10,2 + 0,Б2 10,Б + 0,64

7,73 ± 0,43 5,73 ± 0,14 6,41 + 0,16 6,71 + 0,21 5,10 + 0,18

Наблюдаемое крупноплодие у поросят от иммунизированных исследуемыми белками• свиноматок согласуется с данными Врепоег, полученными при исследовании введения белковых конъюгатов о оомотостатином оуягным овцам. При втом наблюдалось превышение веса новорожденных ягнят над весом потомства в контрольной группе. Это, мфиятио, обусловлено тем,- что наиболее- сильное действие сомш'оотптин оказывет, когда его количество в организме максимально • н пренятальный период и в первое время после рождения.

4.1. Изучение токсичности препаратов рекомбинантных белков на сельскохозяйственных животных

Во всех экспериментальных группах не наблюдалось никаких патологий протекания беременности и родов у матерей, а также мертворожденное™ и врожденных патологий или уродств у потомства, что свидетельствует о том, что введение препаратов рекомбинантных белков не оказывало никакого токсического или терратогенного эффекта. При развитии телят и поросят отклонений от физиологических норм не наблюдалось. Раздой первотелок проходил в пределах нормы. Качество мяса и молока иммунизированных животных и их потомства полностью соответствовало принятым ГОСТам, что показывает отсутствие каких-либо негативных последствий введения препаратов рекомбинантных белков с последовательностью соматостатина, хотя данные, полученные другими авторами при иммунизации дойных коров свидетельствуют о некотором снижении жирности молока.

4.3. Изучение иммунолологических свойств гибридных белков с последовательностью соматостатина на сельскохозяйственных животных

При определении наличия специфических антител к соматостатину

1 рс

по связыванию [I] соматостатина с- опытными сыворотками в различных разведениях были получены следующие результаты. В группе pCM(KP)4s антитела не обнаружены. В группах pOOiS и pDM(RP)4S обнаружено по одному животному, имеющих специфическое связывание сыворотки крови, при разведении сыворотки 1:10. В группе SEB выявлены антитела у трети животных, однако разведение сыворотки не превышало 1:£0.

Сходный эффект отсутствия антител к соматостатину, либо незначительных величин титров при наличии биологического эффекта, получен в исследованиях BUonomo P.O. et al. в которых при иммунизации цыплят наблюдался усиленный рост птиц при отсутствии значимого титра антител к соматостатину в сыворотке крови.

Этот факт, вероятно, означает, что иммунокоррекция уровня соматостатина в крови имеет сложный характер' и* не определяется' только концентрацией антител. Будучи- гидрофобным, .гизкомолекулярным, древним и эволюционно консервативным гормоном, и ч-_'й достаточно простую вторичную структуру, представляющую собой'^

шпильку пептидной цепи замкнутой s-s - связями цистеимов в 3 и 14 позициях, соматостатин является слабым иммуногеном. Это подтверждается и в опытах Balle сл.. по изучению иммуногенности гормона. Однако, поскольку в экспериментах . по определению клеточного ответа обнаруживается сильная специфическая реакция, коррекция количества соматостатини может происходить за счет клеточных реакций, в частности выявленных методом биохемилюменисценции. Кроме того, поскольку соматостатин имеет короткое время персиотенции в периферической крови, но синтезируется во многих системах организма, вероятно, он оказывает сильное действие местно в зоне синтеза. Поэтому элиминирование ех^о клеточными факторами иммунной системы в месте синтеза способно, вероятно, вызвать разнообразные биологические эффекты.

В экспериментах Qhihara S. et al И SohuscLziarra V. et al. ПО введению антител к соматостатину собакам и крысам было показано наличие биологического эффекта,, выраженного изменением уровня .гормонов соматотропина, глюкагона и др. В этих опытах измерения проводились в течение десятков минут подле введения, и, несмотря на краткость получаемых эффектов, они показывают несомненное участие периферического соматостатина в поддержании гормонального статуса. Низкие титры антител у иммунизированных животных обусловлены, вероятно, также иотощением уровня в процессе реакций с эндогенным соматоотатином.

В проведенных исследованиях наблюдается несомненный биологический эффект воздействия введения животным рекомбинантнш белков с последовательностью соматостатина, проявляющийся в виде усиления , продуктивности крупного рогатого скота и свиней. Полученные данные хорошо согласуются с результатами других исследований по введению белковых конъюгатов с соматоотатином беременным животным, проведенных Брепоег G.S.G. et аК и Van Кевве! A.G. et al, где наблюдается усиленный рост потомства oi иммунизированных матерей (до 20% в возрасте трех недель у коз) по сравнению с контрольными животными.

■ Повышение уровня наблюдаемых эффектов при ьведениг нерастворимых фэрм рекомбинантных белков по сравнению i растворимыми, вероятно, обусловлено более высокой иммуногенносты 0т,ой группы белков в результате более сильного взаимодействия ■

клеточными элементами иммунной системы. Этот факт согласуется о данными о том, что реактивность иммунокомм&гентш/х клеток животных, иммунизированных нерастворимыми белками С последовательностью соматостатина более высокая по сравнению с реактивностью клеток животных, которым вводили растворимые белки. Возможно также, что растворимость белка способствует усилению адъювйнтшх свойств вводимого препарата, и, таким образом, повышению его эффективности.

Затухание эффектов примерно через 60 дней после последнего введения, возможно, обусловлено сроком жизни иммунокомпетентных клеток и антител, т.е., эффекторных компонентов иммунной системы, поскольку среднее время жизни лимфоцитов in vivo составляет 1 ,Б-2 месяца. Вероятно, дополнительные иммунизации могут увеличить продолжительность проявления биологического эффекта.

По-видимому, эффекты, оказываемые введением животным рекомбинантных белков с последовательностью соматостатина имеют комплексную природу и обусловлены суммарным взаимодействием эндокринной, иммунной и нервной систем. Интересно отметить, что в одних случаях повышение уровня гормона роста коррелирует с увеличением титра антител, а в других нет, т.к. при увеличении веса у опытных животных в одних случаях наблюдается . повышение уровня гормона роста, инсулина и др., а в других нет. Кроме того, поскольку иммуногенность соматостатина весьма низка, то объяснить все эффекты лишь элиминированием соматостатина достаточно большим количеством специфических антител, .нельзя. Видимо, в данном случае имеет место иммунокоррекция в более широком понимании, как весь комплекс реакций иммунной системы - гуморальных, клеточных и обусловленных связью с другими регуляторными сиотемами организма -в ответ на введение препарата, с последовательностью' соматостатина. Исследуемые рекомбинантные белки обеспеспечивают запуск этих • реакций, усиливая их с помощью эффектов вызванных неспецифическим действием белка-носителя, физико-химическими свойствами препаратов, вводимой композицией, дозой и схемой иммунизации.

Таким образом, как показали эксперименты на животных наиболее перспективными стимуляторами являются препараты рекомбинантных белков группы Б. В силу низкой раотворимости эти белки могут быть очищены с помощью простой и технологичной схемы. Дополнительном преимуществом по сравнению о другой группой гибридных белков ,

Р-7

является их низкая токсичность для бактерий, используемых для микробного синтеза, и соответственно повышенный выход получаемых, препаратов белка. Все это позволяет создать технологичную, высокоэффективную и относительно недорогую схему для производства стимулятора 1 продуктивности сельскохозяйственных животных, доступного для российского рынка.

Выводы.

1. Проведено исследование физико-химических и иммунологических свойств различных вариантов химерных белков, содержащих соматостатин, спейсер и два типа белков-носителей (хлорамфеникол-ацетилтрансферазу и дигидрофолатредуктазу) с деле.циями и вставками. Элиминирование С-концевой области природной хлорамфениколацнтил-трансфервзы и вотевкв аминокислот (Ъеи-7а1-с1п) в позициях 72, 73 и 74 приводит к резкому повышению агрегативности и падению растворимости белков. Отсутствие серосодержащих аминокислот снижает способность к агрегации и повышает растворимость при элиминировании С-концавой области у дигидрофолатредуктаэы.

2. Рекомбинантные белки с последовательностью сома.тостатина проявляют иммунологическую активность со специфической антисоматостатиновой сывороткой в конкурентном РИА и иммуноблотинге, что свидетельствует о наличии доступной для взаимодействия с антителами соматостатиновой детерминанты.

■ 3. Метод определения максимума индуцированной биохемилюменисценции иммунокомпетентных клеток животных, иммунизированных рекомбинант-ными белками, является специфичным и высокочувствительным методом определения доступности- антигенной детерминанты в составе нерастворимых рекомбинантных .белков для взаимодействия с иммунной системой. Иммунизация животных препаратами рекомбинантных белков с последовательностью соматостатина приводит ^ появлению иммунокомпетентных клеток,' у которые при сенсибилизации соматостатином наблюдается яркий и хорошо выраженный максимум биохемилюменисценции. ,

4. Препараты рекомбинантных белков с последовательностью соматостатина, введенные как лабораторным, так и сельскохозяйственным животным не являются токсичными и не вызывает терратогенного эффекта. Б. Введение иммуногенной композиции рекомбинантных белков <

последовательностью сомишотитшш нетелям приводит после отела к усилению лактации до 2'Л,Ь% и ускоренному росту потомотвя иммунизированных животных до 18£ по сравнению с неиммунИаировашюй группой. Введение рекомбинантных белков а последовательностью соматостатила супоросным свиноматкам приводит к рождешпо более крупного потомства.

G. Введение нетелям препаратов белка-носителя оказывает неипецифический стимулирующий еффект на лактацию первотелок, составляя до 13% по сравнению с неиммунизированной группой, и не оказывает никакого эффекта на потомство.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Лунин В.Г., Сергиенко О.В., Ходун М.-В.Л., Бадер Л.Б., Карпов В.А., Тихоненко Т.Н. "Рекомбинантная плаэмида, кодирующая химерный белок о последовательностью соматостатина-14; штамм бактерии Eacherlohla co?i - продуцент химе|люго белка о последовательностью соматостатина-14; белок, содержащий экспонированную последовательность соматостатшт; иммуногенная композтшя для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных, включающая укаэшпшй белок." Положительное решение ВНИИГПЭ по заявка на патент 93-031166/13/031724 о датой приоритета 22.06.93.

2. Лунин В.Г., Сергиенко О.В., Ходун М.-В.Л., Бадер Л.В., Карпов В.А., Тихоненко Т.И. "Способ повышения продуктивности сельскохозяйственных животных с помощью химерного белка, содержащего соматостатин; иммуногенная композиция; факторы пови шения продуктивности." Положительное решение ВНИИГПЭ по заявке на патент 93-031157/13/031724 с датой приоритета 22*06.93.

3.- Лунин В.Г., Сергиенко О.В., Ходун М.-В.Л., Бадер Л.Б., Карпов В.А., Тихоненко Т.И. Технология повышения молочной и мясной продуктивности сельскохозяйственных животных с помощью антисоматостатиновой иммунокоррокции.// Тезисы Всероссийской научной сессии "Научные и практические аспекты увеличения мяса в Нечерноземной зоне России". Санкт-Петербург, 17-18 ноября 1993г, стр.Б1-бЗ.