Разработка системы технологических решений для конструирования рекомбинантных белковых антигенов

Лунин, Владимир Глебович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка системы технологических решений для конструирования рекомбинантных белковых антигенов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы технологических решений для конструирования рекомбинантных белковых антигенов"

На правах рукописи

ЛУНИН ВЛАДИМИР ГЛЕБОВИЧ

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе, нанобиотехнологии)

О 3 0Е8 2011

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2010

4843605

На правах рукописи

ЛУНИН ВЛАДИМИР ГЛЕБОВИЧ

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе, нанобиотехнологии)

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2010

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии» Россельхозакадемии (г. Москва) и Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Москва).

Научный консультант: Карягина-Жулина Анна

доктор биологических наук Станиславовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Поляков Владимир Юрьевич доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич

доктор биологических наук, профессор Патрушев Лев Иванович Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 2.0 2011 г. в У на заседании

диссертационного совета Д 006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, г.Москва, ул. Тимирязевская, д.42; тел.: (495) 976-65-44; факс: (495) 977-09-47; e-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан « М> /l^iaj^f 20 П г.

Ученый секретарь диссертационного совета „. / Д 006.027.01, кандидат биологических наук > МеликоваС.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Получение дешевых, высокоочищенных и стабильных препаратов биологически активных белков, важных для медицинской и сельскохозяйственной практики, является одной из основных задач биотехнологии. Для эффективного решения этой задачи в качестве продуцентов целевых белков чаще всего используют лабораторные штаммы Escherichia coli. Применение генно-инженерных методов в сочетании с микробиологическим синтезом позволило получить целый ряд биологически активных препаратов: гормоны, интерфероны, цитокины, ферменты и т.д. Однако для многих белков-аитигенов, вакцшшо-ценных белков, белков различной природы, имеющих большую молекулярную массу, используемые на ранних этапах подходы генной инженерии оказались неэффективны. С их помощью не удавалось освободиться от примесей токсичных липополисахаридов, хозяйской ДНК и решить проблему рефолдинга или восстановления нативпон структуры синтезируемого бактериями белка. Эти проблемы были частично решены путем использования эукариотических систем наработки рекомбинантных белков. Однако в реальной практике белковые продукты, получаемые в культурах эукариотических клеток, обладали высокой стоимостью за счет дороговизны питательных сред, сложности оборудования для культивирования клеток эукариот, высоких требований к стерильности, медленного роста культур и т.д. Таким образом, разработка новых технологических решений и подходов, позволяющих получать различные рекомбинантные белки, является актуальной задачей современной биотехнологии.

Целью данной работы являлась разработка системы новых технологических решений для создания универсальной технологии получения рекомбинантных белковых антигенов и других белков, имеющих практическое значение для медицины и сельскохозяйственной биотехнологии, с помощью методов генной инженерии и микробиологического синтеза. Использование данных разработок должно приводить к повышению эффективности создаваемых бактериальных продуцентов, упрощению технологических подходов, снижению себестоимости и повышению качества получаемых белковых препаратов. Целью работы было также получение на основе разработанных решений новых биотехнологических продуктов, обладающих уникальными свойствами: стимуляторов роста сельскохозяйственных животных, систем доставки лекарственных препаратов, антигенов, кандидатных вакцин.

Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Разработка системы технологических решений для создания универсальной технологии получения рекомбинантных биологически активных белков, приводящей к повышению эффективности создаваемых бактериальных продуцентов, упрощению технологических подходов, снижению себестоимости и повышению качества получаемых белковых препаратов.

2. На основе разработанной системы технологических решений создание препаратов рекомбинантных двух- и мультидоменных биологически активных белков, антигенов, ферментов, в том числе, иммобилизованных на различных сорбентах за счет аффинного домена, с целью разработки проточных биореакторов, диагностикумов, кандидатных вакцин, стимуляторов роста сельскохозяйственных животных и других биотехнологических продуктов для применения в сельскохозяйственной и медицинской практике.

Основные положения, выносимые па защиту.

1. Научно-обоснованная система технологических решений, направленная на создание универсальной технологии получения рекомбинантных белковых антигенов и других белков, имеющих практическое значение для медицины и сельскохозяйственной биотехнологии, приводящая к повышению эффективности создаваемых бактериальных продуцентов, упрощению технологических подходов, снижению себестоимости и повышению качества получаемых белковых препаратов.

2. Разработка мультидоменных белковых нанотранспортеров, обеспечивающих специфичную доставку лекарственных средств в клетки-мишени, интернализацию в них, выход из внутриклеточных везикул и доставку в ядро.

3. Разработка препарата-стимулятора роста с/х животных IV поколения «САГ-Сом», основанного на использовании двухдоменного гибридного белка, включающего соматостатин и белок-носитель для иммунокоррекции.

4. Нанобиотехнологический подход, основанный на получении гибридных белков, состоящих из домена целевого белка и аффинного домена, позволяющий повысить устойчивость целевого продукта к протеазам, существенно увеличить выход целевого белка, осуществлять самопроизвольное специфическое связывание с матрицей, высокоэффективную очистку, концентрирование, иммобилизацию и рефолдинг целевого белка на поверхности сорбента.

5. Разработка препаратов рекомбинангаых двух- и мультидоменных антигенов, биологически активных белков и ферментов, иммобилизованных на различных сорбентах за счет аффинного домена, с целью создания проточных биореакторов, диагностикумов, кандидатных вакцин, и других систем для использования в сельскохозяйственной и медицинской практике.

Научная новизна работы:

В настоящем исследовании разработана система научно-обоснованных технологических решений, использование которых позволяет в минимальные сроки получать эффективные биологически активные препараты на основе рекомбинантных белков, а именно: разработаны схемы направленной контролируемой полимеризации и сборки генно-инженерных конструкций, обеспечивающих синтез белков с повторяющимися последовательностями или мультидоменных белков с заданными свойствами; создана коллекция белков-носителей и векторов, включающих гены данных белков, адаптированных для клонирования в них целевых фрагментов ДНК; разработана оригинальная технология аффинной самосборки рекомбинантных белков на полимерных матрицах, обеспечивающая высокоэффективную одностадийную очистку, рефолдинг и специфическую сорбцию целевых белков.

Практическая реализация вышеперечисленных технологических решений привела к получению ряда новых биотехнологических продуктов. Впервые генно-инженерным способом созданы мультидоменные белки (нанотранспортеры), обеспечивающие распознавание и доставку лекарственных средств, включая фотоактивные соединения, в раковые клетки. Методом микробиологического синтеза создан высокоэффективный рекомбинантный препарат - стимулятор роста сельскохозяйственных животных IV поколения «САТ-Сом», применяемый для иммунокоррекции ингибитора роста животных соматостатина. Аналогов данного препарата в России и в мире не существует. Проклонированы новые гены белков бактерий и эукариот, кодирующие аффинные домены с уникальными свойствами (высокая термостабильность, специфичность, высокая константа связывания, по параметрам приближающаяся к ковалентному взаимодействию). Полученные на основе данных технологических решений содержащие аффинные домены гибридные белки, такие, как бета-галактозидаза, различные антигены, факторы роста и цитокины, полностью сохраняют свою специфическую активность и могут быть использованы в самых различных областях практического применения.

Впервые показано, что иммобилизация вакцинно-ценных белков на полисахаридных сорбентах приводит к улучшению их иммуногенных

свойств. Используемая технология иммобилизации полностью сохраняет антигенные свойства целевого белка. При этом обеспечивается укрупнение, полимеризация антигена, полисахаридный сорбент выступает в роли адъюванта при иммунизации и стимулирует развитие более длительного и напряженного иммунного ответа на вводимые белки.

Впервые разработаны основанные на принципе самосборки подходы для получения субъединичных генно-инженерных микро- и нановакцин. На основе этих подходов впервые получены кандидатные субъединичные генно-инженерные вакцины для профилактики туберкулеза, туляремии и лептоспироза.

Научно-практическое значение работы:

1. Получены мультидоменные белки, обеспечивающие адресную доставку лекарственных соединений в раковые клетки. Практическим применением данных белков может быть создание на их основе нового поколения лекарственных препаратов, обладающих низкой токсичностью и высокой эффективностью в отношении распознавания и уничтожения опухолевых клеток.

2. Создан препарат «САГ-Сом» - высокоэффективный стимулятор роста IV поколения, обеспечивающий ускорение роста, увеличение привесов, надоев, размера шкуры и повышение коэффициента мясиости сельскохозяйственных животных.

3. Показана перспективность использования двухкомпонентных белков, обладающих способностью к аффинной сорбции на целлюлозе и ферментативной активностью термостабильной р-галактозидазы, для создания проточных реакторов, позволяющих проводить эффективный ферментативный гидролиз лактозы на глюкозу и галактозу. Полученная технология может быть внедрена и использована в пищевой промышленности для получения безлактозного молока и утилизации подсырной и творожной сывороток. Данная технология может быть адаптирована для белков с другой ферментативной (синтетазной или гидролитической) активностью.

4. Получены препараты ряда важных для медицины и сельскохозяйственной биотехнологии ростовых факторов и цитокинов: эпителиального фактора роста, фактора роста фибробластов, интерферона бета. Специфическая сорбция на аффинных матрицах обеспечивает одностадийную очистку препаратов белка до 95% чистоты.

5. Получены препараты гибридных белковых антигенов, соединенных с аффинными доменами, таких, как ESAT6, CFP10, Ag85A из Mycobacterium tuberculosis, TUL4 из Francisella tularensis, домены 1, 4 и 5 белка LigA из Leptospira interrogans, RTA и RTB рицина, иммобилизованных на аффинных матрицах. Эти препараты могут быть использованы в диагностических наборах различного формата: плашечном, сферических и планарных биочипах и т.д. На основе данных рекомбинантных антигенов разработана технология получения субъединичных генно-инженерных микро- и нановакцин. Вакцины основаны на самосборке белковых антигенов на микро- и наночастицах полисахаридных матриц, которые выполняют функцию носителя, депо и адъюванта одновременно. Полисахаридный носитель обеспечивает укрупнение и полимеризацию антигена, и стимулирует развитие более напряженного и длительного иммунного ответа на вводимые белки. Иммунизация такими кандидатными вакцинами обеспечивает индукцию синтеза цитокинов, высокий титр специфических антител и формирование эффективного Th-1 или Th-2 ответа, в зависимости от природы специфического антигена. На основе данной технологии разработаны кандидатные субъедшшчные генно-инженерные вакцины для профилактики туберкулеза, туляремии и лептоспироза.

Апробация диссертации. Разработанный препарат «САТ-Сом» -стимулятор роста сельскохозяйственных животных IV поколения на основе рекомбинантного соматостатина - в настоящее время внедрен на крупных животноводческих, свиноводческих и птицеводческих комплексах РФ. Основные результаты работы доложены на 10 всероссийских и 7 международных конференциях, конгрессах, форумах, сессиях и совещаниях по фундаментальным и прикладным аспектам биотехнологии.

Объем и структура работы. Диссертация в виде научного доклада изложена на 56 страницах, иллюстрирована 10 таблицами и 18 рисунками, состоит из разделов «Общая характеристика работы», «Результаты исследований», «Заключение», «Выводы», списка работ по теме диссертации, включающего 51 статью в ведущих российских и зарубежных рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 16 авторских свидетельств и патентов, 1 заявку на патент, на которую получено положительное решение Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Разработка системы технологических решений для повышения эффективности создаваемых продуцентов, упрощения технологических подходов, снижения себестоимости и повышения качества получаемых белковых препаратов.

Полимеризация генов или их фрагментов обеспечивает возможность получения белков, имеющих повторяющиеся участки, что может повышать иммуногенность полученных препаратов. Одним из важнейших направлений современной биотехнологии является конструирование мультидоменных белков с использованием технологии рекомбинантных ДНК посредством соединения нескольких отдельных модулей в общую конструкцию. Важным моментом при этом является необходимость полимеризации/сборки фрагментов ДНК в заданной ориентации и правильной последовательности. Это может быть достигнуто, например, при использовании несимметричных липких концов, образующихся при гидролизе некоторыми рестриктазами (например, Aval и BbvII), или при использовании специальных адапторов для полимеризации. В данном исследовании разработаны протоколы клонирования фрагментов ДНК, основанные на направленной контролируемой полимеризации/сборке фрагментов ДНК с идентичными липкими концами, которые образуются некоторыми парами эндонуклеаз рестрикции, узнающими различающиеся последовательности ДНК, например, BamHI и Bglll.

Разработанные протоколы клонирования позволяют получать любые мультимодульные конструкции генов. Конечная конструкция собирается из модулей следующей структуры:

X сайт — BamHI сайт — модуль (фрагмент ДНК) — BgHI сайт — Y

сайт.

Поскольку липкие концы ДНК, образующиеся в результате гидролиза эндонуклеазами рестрикции BamHI (5'-G|GATCC-3') и Bglll (5'-AJ.GATCT-3'), одинаковы, модули можно соединять в любой последовательности. Например, если нужно добавить новый модуль со стороны Bglll конца фрагмента ДНК, его обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Bglll. Присоединяемый фрагмент обрабатывают BamHI. После лигирования образуемый гибридный сайт Bglll/BamHI (5'-AGATCC-3') не может быть гидролизован ни Bglll, ни BamHI. Повторение этой процедуры приведет к конструированию мультимодульного гена с необходимым количеством модулей в нужной последовательности их расположения друг относительно друга.

Другие пары рестриктаз, имеющие различные сайты, но одинаковые липкие концы, которые также могут быть использованы для направленной контролируемой полимеризации фрагментов ДНК, это пары Xhol - SalGI, Nhel - Xbal и др.

При создании мультидоменного белка возможно взаимное влияние составляющих его модулей друг на друга, приводящее к нарушению третичной структуры и, как следствие, изменению исходных свойств белка: снижению или потере каталитической активности, иммуногенности, способности связываться с рецепторами и т.д. Для решения этой проблемы используются спейсерные последовательности, которые располагаются между модулями белка. В результате перебора большого количества различных спейсеров был сформирован набор спейсеров, наиболее часто обеспечивающих получение биологически активных мультимодульных белков. К ним относятся гибкие спейсеры, состоящие из чередующихся аминокислотных остатков Gly и Ser - (Gly-Ser)5 или (Gly-Gly-Gly-GIy-Ser)4, а также жесткие (Arg-Pro) 1,2,4,8 и (Lys-Pro)4. Как правило, спейсеры, которые рассматриваются как отдельный модуль при конструировании двух- и мультидомеиных конструкций, фланкированы сайтами BamHI и BglII. Для увеличения вариантов присоединения нестандартных модулей получены также варианты фланкирования спейсеров сайтами Smal и Ehel или сайтом Есо47Ш.

Необходимость получения гибридных белков, содержащих, помимо целевого белка, белок-носитель, может быть обусловлена множеством причин, таких как стабилизация целевого белка, повышение уровня экспрессии клонированного фрагмента, обеспечение возможности одностадийной очистки, повышение иммуногенности целевого белка или пептида и т.д. Решение широкого спектра разнообразных биогехпологических задач привело к созданию обширной коллекции белков-носителей и векторов, включающих гены данных белков, адаптированных для клонирования в них нужных фрагментов ДНК. Основными белками-носителями, использованными в работе, являются бета-галактозидаза, хлорамфениколацетилтрансфераза Е. coli, карбогидратсвязывающие домены: целлюлозосвязывающий домен, глюкан-связывающий домен, декстран-связывающий домен.

Векторы для получения мультидомеиных белков с белком-носителем, как правило, в основе имеют базовую часть одного из векторов системы pQE (QIAGEN, США), и содержат следующие элементы:

1. Для получения целевого домена в С-концевой ориентации относительно белка-носителя:

[Рт5] - [Мсо1 - ВатН1] - [модуль, кодирующий белок-носитель] -[спейсер] - [1^111] - [вЮр-кодон] - [сайт другой эндонуклеазы рестрикции (обычно НтсШ1, Крп21 или ХЬа1)].

2. Для получения целевого домена в Ы-концевой ориентации относительно белка-носителя:

[РТ5] - [№о1 - ВашШ] - [спейсер] - [модуль, кодирующий белок-носитель] - р^Ш] - [БЮр-кодон] - [сайт другой эндонуклеазы рестрикции (обычно НшсНП, Крп21 или ХЬа1)].

При объединении модулей получаем следующие конструкции: 1- [Ртз] - [Исо1 - ВашН1] - [модуль, кодирующий белок-носитель] -[спейсер] - [В§1П/ВатН1] - [модуль, кодирующий целевой домен] - ^Ш] -[БЮр-кодон],

2. [РтдЗ - [N001 - ВатН1] - [спейсер] - [модуль, кодирующий целевой домен] - [В§1П/ВатН1] - [модуль, кодирующий белок-носитель] -[ВёШ] - [БЮр-кодон],

где: Р*г5 - промотор бактериофага Т5, (В£Ш/ВашН1) - гибридный сайт В§111 и ВашШ, не гидролизуемый ни одним из этих ферментов.

В зависимости от конкретных особенностей собираемой конструкции для сборки могут использоваться вектора с различными модификациями: отсутствием или введением дополнительных сайтов эндонуклеаз рестрикции, удалением или заменой спейсера. Эти же вектора могут быть использованы для получения мультимодульных конструкций, введения в них дополнительных спейсеров и т.д.

Кроме того, при необходимости, вектор может содержать сайты для специфического гидролиза гибридного белка с целью получения нативного биологически активного продукта, например, сайт АврАзрАврАБрЬуБ для гидролиза энтеропептидазой.

Если белок-носитель представляет собой аффинный домен, т.е. белковый модуль, обеспечивающий самопроизвольную сорбцию белка на матрице за счет аффинного взаимодействия, гибридный белок может быть достаточно легко получен в форме иммобилизованного на матрице препарата. Эти же свойства могут быть использованы для разработки простой и эффективной схемы очистки белка на определенном носителе (матрице), применимой для широкого спектра целевых белков, соединенных с одним и тем же аффинным доменом.

Ниже приведена схема иммобилизации на матрице и очистки гибридного белка для системы целлюлозосвязывающий домен/целлюлоза, разработанная и широко используемая в данном исследовании (Рис. 1).

Рис. 1. Схема иммобилизации на матрице и очистки гибридного белка с использованием системы цсллюлозосвязывающий домен/целлюлоза.

Данная схема одностадийна, практически безынструментальна, позволяет получать белки высокой степени очистки (до 95-99%), благодаря отсутствию в Е. coli белков, способных связываться с целлюлозой. При этом могут быть получены как иммобилизованная, так и свободная формы целевых белков.

Практически та же схема сохраняется для других пар «аффинный домен/аффинная матрица», таких, как глюкан-связывагощий домен/1,3-бета глюканы (например, оболочки клеток дрожжей); декстран-связывающий домен/декстраны (например, различные сефадексы); коллаген-связывающий домен/коллаген.

Разработанные технологические решения, а именно, направленная контролируемая полимеризация/сборка фрагментов ДНК и система белков-носителей и векторов для конструирования гибридных белков, использованы при создании всех полученных в работе белковых конструкций. Универсальная схема иммобилизации на полимерной матрице и очистки белков, содержащих аффинный домен, использована при получении препаратов гибридной бета-галактозидазы и различных гибридных антигенов.

2. Получение рекомбинантных белков - мультидоменных модульных

ианотраиспортеров противораковых лекарств, придающих им

клеточную специфичность и большую эффективность.

Направленный транспорт лекарственных веществ в очаг развития патологического процесса позволяет добиться повышения эффективности лекарственной терапии. Для нее в настоящее время используют нанокапсулы (например, липосомы) или векторы для генной терапии (вирусные и невирусные). Суть адресной доставки состоит в том, что само лекарственное вещество, а чаще - средство его доставки, вектор, содержит в своем составе специфические домены (антитела, лиганды), узнающие рецепторы на клетках-мишенях. Присутствие распознающих доменов в векторе позволяет ему сконцентрироваться в заданной области (опухоли, очаге воспаления) и доставить туда лекарственное вещество. В отличие от обычного введения лекарственного вещества и его распространения по всему организму направленная доставка позволяет снизить дозу вводимого препарата и минимизировать его воздействие на другие клетки (побочное действие). Примером лекарственных препаратов, которые необходимо доставлять в строго определенный компартмент клеток, являются фотосенсибилизаторы (ФС), используемые для фотодинамической терапии ряда болезней, особенно онкологических.

Доставить ФС в ядро можно с помощью специальных белков с заданными свойствами, несущих сигнальные последовательности, которые обеспечивают узнавание определенного типа клеток, направленное движение связанного с ними лекарственного средства в клетке и его проникновение в ядро клетки.

Принципиальная целесообразность использования модульных белков для направленной доставки лекарственных средств была доказана работами коллектива под руководством проф. А. С. Соболева (Институт биологии гена РАН, Москва). Основные работы выполнялись А. А. Розенкранцем, П. В. Гулаком и Д. Янсом (Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, Clayton, Victoria, Australia). Белковые конструкции из трех и четырех блоков получали путем соединения модулей бифункциональными кросс-сшивающими реагентами (подробнее см. Akhlynina et al., 1997; Akhlynina et al., 1999; Chopp et al., 1996; Rosenkranz et al., 2000). Эти молекулярные конструкции, обладающие заданным набором модулей, действительно, обеспечивали специфичную доставку ФС в клетки-мишени, интернализацию в них, выход из внутриклеточных везикул и доставку в ядро.

Далее с помощью разработанной в данном исследовании направленной контролируемой полимеризации/сборки фрагментов ДНК автором был спланирован и создан набор мультидоменных векторных белковых молекул, состоящих из следующих модулей: интернализуемого лигандного домена, обеспечивающего «узнавание» клетки-мишени и последующий рецептор-опосредованный эндоцитоз мультидоменного белка внутрь неё; эндосомолитического домена, обеспечивающего выход из эндосом; сигнала ядерного транспорта (NLS, Nuclear Localization Signal), обеспечивающего взаимодействие с импортинами - цитозольными белками, осуществляющими активное перемещение в ядро; домена-носителя для связывания доставляемого лекарственного вещества (Таблица 1).

Таблица 1.

Характеристика мультидоменных белков-нанотраиспортеров.

Название плаз-миды Структура мультидоменного белка Молеку лярная масса, кДа Уровень экспрессии, % Растворимость, % Биологическая активность

pR751 HMP-NLS SV40-DTOX-EGF 75,1 30 60 +

pR752 HMP-NLS SV40-DTOX-(Gly-Ser),-EGF 76,3 30 60 +

pR754 HMP-NLS SV40-DTOX-(Gly-Ser),-SOM 71,9 8 20 +

pR755 HMP-NLS SV40-DTOX-SOM 70,7 15 20 +

pR522 HMP-NLS SV40-MSH 50,1 20-30 70 +

pR523 Gala-HMP-NLS SV40-MSH 52,6 5-8 70 +

pR676 DTOX-HMP-NLS SV40-MSH 69,5 20-30 70 +

pR695 NLS VirD2-HMP-DTOX-MSH 72,1 10 30-40 +

pR914 DTOX-HMP-NLS-IL3 84,4 10 30-40 +

Примечания. Специфические лиганды: SOM - соматостатин; EGF -

эпидермальный фактор роста; MSH - а -меланоцитостимулирующий гормон; IL3 -интерлейкин. Сигналы ядерного транспорта: NLS SV40 - сигнал ядерного транспорта из Т-антигена вируса SV—40; NLS VirD2 - сигнал ядерного транспорта из белка агробактериальной трансформации VirD2. НМР - порфирин-связывающий белок - гемоглобиноподобный белок (haemoglobin-like protein) Е. coli. DTOX - эндосомолитический модуль - транслокационный домен (Т) дифтерийного токсина с прилегающим к нему природным спейсером, разделяющим Т и L домены нативного дифтерийного токсина. Gala пептид -мембраносорбирующий модуль - фрагмент белка оболочки вируса Synday. (Gly— Ser)5 - спейсер.

В качестве интернализуемых лигандных модулей в полученных конструкциях использовали а-меланоцитостимулирующий гормон (MSH) и эпидермальный фактор роста (EGF), взаимодействующие с меланокортиновыми-1 рецепторами, сверх-экспрессированными на клетках меланомы человека и мышей, или рецепторами ErbBl, сверх-экспрессированными на клетках рака головы и шеи, рака пищевода, мочевого пузыря и др., а также интерлейкин-3 (для клеток острого миелоидного лейкоза со сверхэкспрессией рецепторов к интерлейкину-3) и соматостатин (SOM) (для клеток нейробластомы со сверхэкспрессией соматостатиновых рецепторов) (Sobolev A.S., 2008).

В качестве сигнала ядерного транспорта использовали оптимизированную последовательность NLS большого Т-антигена вируса SV40. Гемоглобиноподобный белок НМР Е. coli использовали в качестве домена-носителя. В качестве эндосомолитического модуля использовали транслокационный домен дифтерийного токсина (DTox) (Rosenkranz et al., 2003; Розенкранц и др. 2003; Gilyazova et al., 2006).

Функциональность каждого из доменов полученных мультидоменных белков была исследована с помощью различных экспериментальных подходов, разработанных в лаборатории проф. A.C. Соболева (Соболев, 2009; Sobolev, 2009).

В результате проведенных экспериментов было показано, что все модули в составе мультидоменного белка сохранили заложенные в них функции, что позволило достичь основной цели - доставки мультидоменного белка в ядро клетки-мишени. Кроме того, лекарственное вещество, ФС, ковалентно присоединенное к мультидоменному белку, не утратило способность генерировать цитотоксический компонент этого типа лекарств -активные формы кислорода.

Была исследована опосредуемая мультидоменными белками внутриядерная и специфическая для заданного типа клеток доставка противоопухолевых лекарств. В опытах на клетках эпидермоидной карциномы человека А431 (Gilyazova et al., 2006), сверх-экспрессирующей рецепторы ErbBl, выявилось резкое, более чем в 1000-3000 раз, усиление цитотоксического действия ФС хлорина еб и бактериохлорина р, доставляемых мультидоменными белками в ядра клеток, по сравнению с эффектом свободных ФС; оценка была сделана по соотношению ЕСда, т.е. концентраций ФС, обеспечивающих полумаксимальный эффект. Более того, мультидоменный белок обеспечивал ФС клеточную специфичность: хлорин еб практически в одинаковой степени поражал как клетки-мишени (А431), так и клетки, экспрессирующие малое число рецепторов ErbBl (клетки NIH

ЗТЗ), тогда как в комплексе с мультидоменным белком этот ФС был неэффективен для клеток NIH ЗТЗ в диапазоне концентраций, убивающих клетки-мишени А431. Аналогичные результаты (Rosenkranz et al., 2003) были получены с использованием MSH-содержащих мультидоменных белков на клетках мышиной меланомы B16-F1, сверх-экспрсссирующих рецепторы к МСГ.

Эксперименты in vivo были проведены на мышиной модели меланомы кожи (Gilyazova et al., 2006). MSH-содержащий мультидоменный белок, введенный внутривенно мышам C57/black с сингенной меланомой B16-F1 (инокулированной подкожно), уже через 3 часа начинал накапливаться в клетках опухоли и их ядрах. Бактериохлорин р сам по себе не влиял ни на скорость роста опухоли, ни на среднюю продолжительность жизни мышей с меланомой, тогда как те же дозы этого ФС, вводимые по такой же схеме, но транспортируемые МНТ, достоверно ингибировали рост опухолей и увеличивали среднюю продолжительность жизни мышей.

Таким образом, созданы мультидоменные белки-нанотранспортеры, обеспечивающие «узнавание» нужной эукариотической клетки-мишени и последующий направленный транспорт лекарственных соединений в клеточное ядро. Полученные в работе мультидоменные белки обеспечивают клеточную специфичность и высокую эффективность противоопухолевым лекарственным веществам. Модульная система строения мультидоменных белков позволяет легко заменять одни модули на другие, обладающие другим набором свойств, и получать транспортеры с новой специфичностью в отношении лекарственных средств и клеток-мишеней.

3. Разработка стимулятора роста сельскохозяйственных животных IV

поколения, основанного на рекомбинантном гибридном белке,

включающем белок-носитель и соматостатин.

Соматостатин - биологически активный тетрадекапептид, который вырабатывается в гипоталамусе и желудочно-кишечном тракте. Соматостатин синтезируется в виде белка предшественника, который в результате созревания процессируется в две формы - соматостатин-14 и соматостатин-28. Последовательность соматостатина-14 очень консервативна у позвоночных, а у млекопитающих вообще не имеет видовой специфичности. Соматостатин оказывает сильное ингибирующее действие на широкий круг гормонов и связанные с ними функции организма: соматотропин, тиреотропный гормон, панкреатические гормоны (инсулин, глюкагон и др.), гормоны желудочно-кишечного тракта (секретин, гастрин,

пепсин и др.), липазу, секрецию желудочных кислот, абсорбцию глюкозы, триглицеридов и аминокислот.

Широкий спектр действия соматостатина на факторы, контролирующие рост и усвоение пищи, открывает значительные перспективы его использования для регуляции роста животных, снижения экономических затрат на корма и содержание животных и т.д. Необходимый эффект может быть получен в результате аутоиммунной реакции на введенный в организм препарат соматостатина, приводящей к снижению концентрации пептида в крови за счет связывания с антителами (иммунокоррекции) и, как следствие, индуцирующей анаболические процессы и ускоренный рост животных.

Подход, основанный на иммунокоррекции, позволяет получать экологически чистые продукты, т.к. он не связан с применением стероидных гормонов и антибиотиков, а основан на незначительных изменениях концентраций анаболических факторов.

Соматостатин является низкомолекулярным белком, время жизни которого в кровотоке составляет несколько минут. Поэтому для иммунизации соматостатином необходимо его применять в комплексе с носителем, например, в составе химерного белка, полученного с помощью генно-инженерного подхода.

Для эффективного воздействия стимуляторов, использующих принцип гормональной иммунокоррекции, важно добиться иммунодоминантного положения антигенной детерминанты в составе гибридного белка для иммунокомпетентных клеток. Другой важной задачей при создании таких препаратов является достижение достаточной иммуногенности целевого белка, что во многом обусловлено выбором белка-носителя антигенной детерминанты.

Одним из способов повышения выхода препарата и, как следствие, его удешевления, является высокоэффективная экспрессия белка в бактериальных клетках с его накоплением в виде малорастворимых телец включения.

Для отбора наиболее эффективного варианта химерного белка, несущего в своем составе последовательность соматостатина, обеспечивающего высокий выход целевого компонента, а также получаемого в форме нерастворимых телец включения, было синтезировано более 150 генно-инженерных конструкций, включающих различные варианты носителей, лигандов и соединяющего их спейсера (Рис. 2, А). Полученные конструкции экспрессировали в различных штаммах Е. coli, исследовали растворимость химерных белков и их устойчивость к протеолизу.

Обобщенные результаты проведенных экспериментов представлены на рис. 2, Б.

Показано, что лучшими свойствами - наименьшей растворимостью и подверженностью протеолизу в процессе выделения и очистки - обладают белки, содержащие в качестве носителя последовательность хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) с делегированными десятью аминокислотными остатками на С-конце.

спейсер t

LacZ DHFR CAT CAT m CAT (-10)m

(Arg-Pro), 248 (Lys-Pro)4 SerSerSer(Arg-Pro)7

(SOM)*M

белок-носитель

DHFR LacZ CAT CAT m CAT (-10)m

Рис. 2. Структура генно-инженерных конструкций с геном соматостатина, включающих различные варианты носителей, лигандов и соединяющих их спейсеров (А); растворимость и устойчивость к протеолизу гибридных белков, содержащих последовательность соматостатина, включающих различные домены, обеспечивающие функцию носителя (Б). * - при полимеризации последовательности, кодирующие соматостатин, разделяются спейсером SerSerSer(Arg-Pro)7. LacZ - последовательность, кодирующая ген ß-галактозидазы, DHFR - последовательность, кодирующая ген дигидрофолатредуктазы, CAT -последовательность, кодирующая ген хлорамфениколацетилтрансферазы, САТт -последовательность гена хлорамфениколацетилтрансферазы с мутацией, введенной для элиминации сайта EcoRI из гена, CAT (-10)m -хлорамфениколацетилтрансфераза без последних 10-ти аминокислотных остатков с мутацией в сайте EcoRI.

Таблица 2.

Влияние выбора промотора и штамма-продуцента Е. coli на экспрессию генно-инженерных конструкций, содержащих ген соматостатина.

Промотор Штаммы Е. coli Уровень экспрессии

Промоторы конститутивного синтеза

Peat НВ101, 8012. 8017, МКД3207 до 5%

Промоторы индуцибелыюго синтеза

PR СА161, МС1857 до 10%

Р|щ KN126 до 30%

Pps M15[pRep4], DH5-a, XL-lblue до 30%

Примечания. Pcat - промотор гена хлорамфениколацетилтрансферазы, PR -правый промотор бактериофага лямбда, Р^ - промотор триптофанового оперона Е. coli, РТ5 - промотор бактериофага Т5. Уровень экспрессии измеряли в процентах от тотального белка клетки.

Экспрессия полученных конструкций в различных штаммах Е. coli при клонировании под разными промоторами приведена в таблице 2. Максимальный уровень экспрессии - до 30% от тотального белка клетки -достигался при использовании промотора Р|гр и штамма Е. coli KN126, а также промотора Рт5 и штаммов Е. coli M15[pRep4], DH5-a, XL-lblue.

Изучение взаимодействия исследуемых белков в иммуноблоттинге со специфической САТ-соматостатиновой сывороткой фирмы Amersham (Великобритания), меченной [1251], показало наличие специфического связывания рекомбинантных белков, содержащих последовательность соматостатина, и отсутствие такого взаимодействия без соматостатина.

Для более детального анализа иммунологической активности рекомбинантных белков была разработана тест-система радиоиммунного анализа (РИА) соматостатина. В конкурентном РИА исследовалось взаимодействие меченого [1251] соматостатина, полученного пептидным синтезом, стандарта соматостатина (Вектор-Биопродукт, Россия), гибридных белков с последовательностью соматостатина и САТ-соматостатиновой сыворотки фирмы Amersham. В результате измерений в белках, полученных с помощью генно-инженерного подхода, показано наличие антигенных детерминант, проявляющих присущую соматостатину иммунореактивность.

Исследования с целью оценки возможности использования препаратов химерных белков с последовательностью соматостатина в качестве стимуляторов в животноводстве проводили на поголовье крупного рогатого скота черно-пестрой породы и поголовье свиней породы крупная белая. Иммунизацию нетелей проводили препаратами химерных белков с последовательностью соматостатина, содержащими в качестве носителя хлорамфениколацетилтрансферазу и дигидрофолатредуктазу. Полученные данные свидетельствуют о достоверном (р<0,05) повышении уровня лактации первотелок в результате введения рекомбинантных белков с последовательностью соматостатина.

Величина надоев в группе, иммунизированной белками с последовательностью соматостатина, по сравнению с неиммунизированной группой была выше в течение 60 дней со дня отела. Превышение контрольного уровня было максимальным (около 20%) на 30-35 день, далее сохраняясь на уровне 9-10%, постепенно снижаясь к 60-му дню. Максимальные надои наблюдались в группах, иммунизированных нерастворимыми белками.

Как в динамике роста, так и в абсолютной величине наблюдалось достоверное (р<0,05) увеличение веса телят, рожденных от матерей, иммунизированных химерными белками с последовательностью соматостатина по сравнению с телятами от матерей неиммунизированной группы. Превышение наблюдалось в течение 50 дней, достигая максимального значения на 25-28 день. Сходный результат получен при иммунизации супоросных свиноматок.

Во всех экспериментальных группах не наблюдалось никаких патологий протекания беременности и родов у матерей, а также мертворожденное™ и врожденных патологий у потомства. При развитии телят и поросят отклонений от физиологических норм не наблюдалось. Раздой первотелок проходил в пределах нормы.

Данные по введению белковых конъюгатов с соматостатином беременным животным хорошо согласуются с результатами других исследований (Spencer G.S.G., 1984, Fadlalla et al., 1985), где наблюдался усиленный рост потомства от иммунизированных матерей (до 20% в возрасте трех недель у коз) по сравнению с контрольными животными.

Наблюдаемые эффекты более выражены при введении нерастворимых форм рекомбинантных белков по сравнению с растворимыми, что, вероятно, обусловлено более высокой иммуногенностью, более сильным взаимодействием с иммунокомпетентными клетками и усилением адъювантных свойств препаратов белков с низкой растворимостью. Затухание эффектов примерно через 60 дней после последнего введения, вероятно, обусловлено сроком жизни иммунокомпетентных клеток и антител, т.е. эффективных компонентов иммунной системы.

Наилучшие результаты в экспериментах на крупных сельскохозяйственных животных обеспечивала конструкция САТ(-10)ш-(Arg-Pro)4-SOM. В силу малой растворимости этот белок может быть очищен с помощью простой технологической схемы. Дополнительным преимуществом данного белка является его низкая токсичность для бактерий, используемых для микробиологического синтеза, и, соответственно, повышенный выход продукта.

Крупномасштабные испытания препарата на основе конструкции CAT(-10)m-(Arg-Pro)4-SC)M, получившего название «САТ-С ом», проводились ООО "НПК "Современные биотехнологии".

В 2005-2006 годах препарат использовали для повышения молочной продуктивности коров в семи субъектах России в 27 хозяйствах различных форм собственности. В таблице 3 в качестве примера приведены результаты применения препарата САТ-Сом в семи хозяйствах Пестовского района Новгородской области.

Таблица 3.

Результаты применения препарата САТ-Сом в хозяйствах Пестовского района Новгородской области.

Наименование хозяйства Кол-во коров Выход телят, % Сервис-период, сутки Дополнительный надой на корову в год при применении САТ-Сом, кг

Всего В т.ч. с САТ-Сом Всего В тл. с САТ-Сом Всего В т.ч. с САТ-Сом

К-з «Смена» 75 20 91 95 91 90 839

К-з «Красное знамя» 175 24 73 100 87 75 893

К-з «Красная звезда» 80 8 75 89 93 70 739

К-з «Прогресс» 165 19 66 95 87 75 604

К-з «За мир» 103 36 88 100 75 70 865

К-з «Путь Ленина» 87 15 100 100 65 60 1633

КФХ «Бойцовой» 106 10 74 100 70 53 1686

Результаты применения препарата свидетельствуют о его высокой эффективности для повышения молочной продуктивности коров. Специалисты хозяйств, в которых применяли препарат САТ-Сом, указывают на существенное снижение яловости коров, иммунизированных препаратом, а также на увеличение содержания белка в молоке в среднем на 0,2%.

Всего за период 2005-2007 гг. в хозяйствах, в которых применяли препарат САТ-Сом, получено дополнительно 52000 тонн молока. Применение препарата на всем поголовье дойного стада, находящегося в животноводческих хозяйствах России, позволит увеличить эти показатели до 3,6 миллионов тонн в год.

Применение препарата в 6 хозяйствах Белоруссии и 3 хозяйствах Узбекистана повысило молочную продуктивность коров в среднем на 9% по отношению к молочной продуктивности животных контрольных групп.

Эффективность применения препарата САТ-Сом при откорме крупного рогатого скота изучалась в 5 хозяйствах Кировской, Белгородской и Калужской областей в период 2001-2004 гг. Результаты научно-производственных опытов, проведенных в 2001-2004 гг., представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Эффективность применения препарата СЛГ-Сом при откорме молодняка

КРС.

№ Хозяйства Количество животных в группах, гол. Начальный возраст животных, мес. Среднесуточные привесы Средняя живая масса животного при сдаче Дополнительно получено продукции по отношению к контролю, кг

г % кг %к контролю

1 Агрофирма «Дороничи», Ленинский р-н Кировской обл. 150 - опыт 3,0 620 112 296 112 4950

150-контроль 3,0 552 100 263 100 -

2 Учхоз ВГСХА «Чистые пруды», Ленинский р-н Кировской обл. 105 - опыт 2,0 677 109 398 107 2940

105-контроль 2,0 619 100 370 100 -

3 Колхоз им. «М.А. Гурьянова», Жуковский р-н Калужской обл. 180 - опыт 2,5 852 112 365 112 7200

180-контроль 2,5 760 100 325 100 -

4 Хозяйства Бабынинско- го р-на Калужской области 280 - опыт 3,0 702 108 301 108 6440

280-контроль 3,0 646 100 278 100 -

5 Колхоз им. «Фрунзе», Белгородский р-н Белгородской обл. 30 - опыт 5,5 (телки) 969 109 174 109 450

30-контроль 5,5 (телки) 884 100 159 100 -

Показано, что оптимальным является применение препарата САТ-Сом при выращивании животных до 12-13 месячного возраста. В течение 20052007 гг. препарат САТ-Сом применяли в животноводческих хозяйствах в различных регионах России. При откорме 129413 бычков и телок получены дополнительно десятки тонн мяса, и прибыль хозяйств составила 1200 млн. рублей.

Хорошие результаты получены также при применении препарата САТ-Сом при откорме поросят, а также в бройлерном птицеводстве. В настоящее время препарат САТ-Сом внедрен на крупных животноводческих, свиноводческих и птицеводческих комплексах. Постановлением Правительства Российской Федерации от 10 марта 2009 г. за разработку научных основ и внедрение ресурсосберегающей технологии повышения рентабельности мясного и молочного животноводства, бройлерного птицеводства, коллективу разработчиков, в том числе, автору настоящего исследования, присуждена премия Правительства Российской Федерации в области науки и техники.

4. Разработка проточного реактора для гидролиза лактозы в молочных продуктах на основе двудоменного белка, состоящего из бета-галактозидазного и целлюлозосвязывающего доменов белков термофильных микроорганизмов.

Присутствие лактозы в молочной подсырной сыворотке является основным фактором, затрудняющим ее переработку и возможность дальнейшего использования в пищевых целях. Промышленная переработка сыворотки выгодна и с экологической точки зрения, поскольку при ее сбрасывании в окружающую среду, наряду с потерей ценных пищевых веществ, возникает проблема загрязнения сточных вод.

Улучшить технологические и диетические свойства сыворотки и молока возможно путем ферментативного гидролиза лактозы на составляющие моносахариды — глюкозу и галактозу. Наиболее перспективными считаются ферментативные способы гидролиза лактозы иммобилизованными бета-галактозидазами (Nakkharat et al., 2006, Neuraus et al., 2006).

Для молочной промышленности перспективными являются бета-галактозидазы термофильных микроорганизмов, обладающие повышенной термостабильностью, высоким сродством к субстрату, способностью эффективно работать при рН молочной сыворотки (Neuhaus et al., 2006; Ladero et al., 2003). В качестве такого фермента в работе была использована бета-галактозидаза из Thermoanaerobacter ethanolicus (LAC). Для

конструирования гибридных двудоменных белков, состоящих из термостабилыюй бета-галактозидазы (LAC) и термостабилыюго целлюлозосвязывающего домена (CBD) эндоглюканазы CelD Anaerocellum thermophilum, использованы разработанные в данном исследовании векторы. Получены две двухмодульные конструкции со спейсером с различным порядком расположения доменов: pLACspCBD и pCBDspLAC, а также плазмида с геном бета-галактозидазы pLAC.

Присутствие в структуре модуля CBD позволяет проводить в одну стадию очистку, концентрирование и иммобилизацию гибридного белка на целлюлозном сорбенте. Белки LACspCBD и CBDspLAC обладают способностью необратимо связываться с целлюлозой: не элюируются с сорбента в диапазоне значений рН 4 - 11, температуры 0 - 75°С и концентраций соли 0 - 5 M NaCI. Таким образом, положение CBD в составе гибридного белка не влияет на его субстратсвязывающие свойства.

При изучении энзиматических свойств белков оказалось, что препараты LACspCBD имеют в 3 раза более высокую удельную активность, чем CBDspLAC (Таблица 5). Температурный оптимум иммобилизованного препарата фермента LACspCBD и препарата фермента CBDspLAC в растворе составляет 65 - 70°С, что несколько ниже температурного оптимума термостабильной бета-галактозидазы, не содержащей целлюлозосвязывающего домена, соответствующего 75 - 80°С. Оптимальные значения рН для всех трех ферментных препаратов одинаковы и составляют 5,7 - 6,0 в фосфатном буфере при 75°С.

Таблица 5.

Характеристика полученных продуцентов свободной бета-галактозидазы и гибридных белков.

Название белка Молекулярная масса белка (кДа) Уровень экспрессии,% Биологическая активность (Ушах, ед./мг белка)

LAC 83 5 480

CBD-sp-LAC 109 5 140

LAC-sp-CBD 109 5 440

Примечание, sp - спейсер (Gly-Ser)-;.

Для изучения термостабильности препараты иммобилизованных рекомбинантных белков инкубировали при разных температурах без добавления субстрата. Показано, что ЕАСврСВО значительно стабильнее СВОэрЕАС при 1=55°С. При 65°С препарат СВОчрЬАС сохранял низкую активность (менее 10%) в течение 6 суток, а препарат ЕАС5рСВО был активен в течение 2-х месяцев. Бета-галактозидаза в составе LACspCBD

оказалась более активной и стабильной, поэтому дальнейшие исследования проводились с этим гибридным белком.

На основе хроматографической колонки, заполненной сорбентом с иммобилизованным гибридным белком ЬАСзрСВБ, был сконструирован колоночный мини-реактор проточного типа. Была исследована зависимость превращения лактозы от скорости потока раствора субстрата (Рис. 3).

При уменьшении скорости потока происходит более глубокий гидролиз лактозы с увеличении пиков основных продуктов гидролиза — глюкозы и галактозы. Наряду с основными продуктами наблюдаются три пика, хроматографическая подвижность которых позволяет предположить, что первый из дополнительных пиков является дисахаридом, а два последних — трисахаридами. Наличие дополнительных пиков можно объяснить способностью некоторых бета-галактозидаз переносить остатки галактозы на различные акцепторы, осуществляя либо внутримолекулярное, либо межмолекулярное трансгалактозилирование (Секав V., Ьорег-Ье1уа М., 1985).

Рис. 3. Хроматографический анализ продуктов гидролиза лактозы (150 мМ, 10 мМ ацетатный буфер рН 6,5) при 45°С и различных скоростях потока (F = 0,108, 0,136, 0,166, 0,197,0,25,0,409 и 0,667 мл/мин).

Анализ продуктов гидролиза лактозы проводили также и при других температурах в диапазоне 40 — 70°С. На основе полученных данных были подобраны параметры работы реактора, обеспечивающие эффективный и достаточный для улучшения качества сыворотки и молока гидролиз лактозы. При 70°С реактор, полученный на основе белка LACspCBD, гидролизует 70% исходного раствора лактозы с концентрацией 150 мМ (5%), что соответствует концентрации лактозы в коровьем молоке, при скорости потока раствора субстрата 1,2 объема колонки в минуту. 90% исходного раствора лактозы в тех же условиях гидролизуется при скорости потока раствора субстрата 0,64 объема колонки в минуту. Пропускание через реактор 10000 объемов колонки при скорости потока 1 объем колонки в минуту и температуре 70°С не приводит к снижению эффективности расщепления лактозы. Параметры реактора не менялись при его хранении при комнатной температуре в течение 6 месяцев.

Таким образом, получен гибридный двудоменный белок, состоящий из термостабилыюй бета-галактозидазы и термостабильного целлюлозосвязывающего домена. Простой одностадийный способ иммобилизации и очистки химерной бета-галактозидазы, а также высокая удельная активность и стабильность этого фермента, делают полученную в работе гибридную термостабильную бета-галактозидазу перспективной с точки зрения ее использования в биотехнологии для гидролиза лактозы в молочных продуктах.

5. Получение двудоменных рекомбинантных антигенов. Разработка подходов к получению диагностикумов и кандидатных генно-инженерных субъединичных вакцин.

5.1. Двудоменные белки антигенов рицина.

Рицин, токсин растительного происхождения из семян клещевины обыкновенной (Ricinus communis), является одним из наиболее сильнодействующих токсинов. Минимальная летальная доза рицина для человека может составлять 5 мкг/кг (Bradberry S.M., 2003). Семена клещевины (касторовые бобы) используют для выделения касторового масла, которое применяется в промышленности, медицине и косметологии. Шрот клещевины, богатый питательными белками, входит в состав комбикормов для сельскохозяйственных животных. Присутствие рицина в семенах клещевины осложняет производство данной продукции. Рицин представляет собой гликопротеин (62 кДа), белковая часть молекулы которого построена из двух субъединиц - каталитической А-субъединицы (RTA, Ricinus Toxin A-chain) и лектиновой В-субъединицы (RTB, Ricinus Toxin B-chain),

соединенных одной дисульфидной связью. RTA (30,6 кДа) представляет собой высоко активную N-гликозидазу, отщепляющую консервативный остаток аденина в 28S рРНК эукариот. В результате отщепления остатка аденина рибосомы утрачивают способность связывать факторы элонгации, что ведёт к блокированию синтеза новых белков и, как следствие, к апоптозу и гибели эукариотических клеток. RTB (31,4 кДа) представляет собой лектин, выполняющий транспортные функции. Связываясь с остатками D-галактозы и N-ацетилгалактозамина углеводных цепей рецепторных гликопротеинов и гликолипидов поверхности эукариотических клеток, RTB обусловливает эндоцитоз и дальнейший внутриклеточный транспорт токсина (Endo Y. et al., 1987). Благодаря своей потенциальной токсичности, RTA нашла применение в создании иммунотоксинов - конъюгатов, состоящих из токсина и антитела и обладающих направленным токсическим действием, например, в противоопухолевой терапии (Olsnes S. et al., 2001) и терапии ВИЧ (Pincus S.H., 1996). На сегодняшний день не существует препаратов для профилактики и лечения отравлений рицином, поэтому чрезвычайный интерес представляет создание антидотов и вакцин, а также разработка тест-систем для экспресс-индикации рицина в окружающей среде и в организме. Наиболее перспективными представляются антидоты, полученные на основе протективных антител к рицину и тест-системы, основанные на иммунохимических методах. Производство подобных антидотов, тест-систем, а также вакцин требует получения антигенов рицина.

Работа с нативным рицином для получения его антигенов крайне сложна ввиду его высокой токсичности. Показано, что рекомбинантные RTA и RTB сохраняют многие эпитопы нативного рицина, в том числе и протективные (Carra J.H. et al., 2007; McGuinness C.R. et al., 2006; Maddaloni M. et al., 2004). Поэтому перспективным подходом к получению антигенов рицина является создание рекомбинантных RTA и RTB.

Для увеличения уровня продукции, стабилизации и устойчивости к протеолизу рекомбинантных антигенов рицина в клетках Е. coli антигены рицина были клонированы и экспрессированы с использованием разработанной в данном исследовании системы векторов. В качестве белка-носителя был использован целлюлозосвязывающий домен (CBD) эндоглюканазы CelD из A. thermophilum. Были созданы генно-инженерные конструкции pRTAspCBD и pRTBspCBD, содержащие в своем составе нуклеотидные последовательности, кодирующие аутентичные RTA или RTB и CBD, соединенные (Gly-Ser)5-cneñcepoM (sp). Индукция экспрессии рекомбинантных генов в Е. coli не привела к накоплению белков RTAspCBD и RTBspCBD ожидаемой молекулярной массы (-52 кДа), поэтому далее было

решено добиться накопления в Е. coli антигенов рицина с CBD путем их секреции в периплазму. В качестве сигнального пептида использовали сигнальную последовательность L-аспарагиназы II Е. coli (Sig), являющуюся гомологичной для клеток Е. coli, что должно обеспечивать эффективную секрецию рекомбинантных белков в периплазму и отщепление сигнального пептида. Были получены плазмиды pSigRTAspCBD и pSigRTBspCBD (Рис. 4, А), несущие гены гибридных белков, состоящих из А- или В-субъединиц рицина, (Gly-Ser)5-cneftcepa, целлюлозосвязывающего домена и сигнального пептида. Уровень продукции целевых белков в клетках Е. coli составил приблизительно 5-10% от общего клеточного белка. Целевые белки накапливались в периплазме, причем исключительно в растворимой форме. Очистку белков проводили по схеме, разработанной в данном исследовании для гибридных белков, содержащих целлюлозосвязывающий домен (см. раздел 1). Степень очистки белков RTAspCBD и RTBspCBD составляла не менее 95% (Рис. 4, Б).

pSigRTAspCBD

Afojl Ajral BojiHI Я|кЯП

-ИГ" V////////A

Promoter T5 SD Sig RTA sp CBD Teriniuator

pSigRTBspCBD

Mim I Ncol ВатШ HindiП

11 1 f. 1

Promoter T5 SD Sig RTB sp CBD Terminator

66 кДа

45 кДа

Рис. 4. Схемы генно-инженерных конструкций pSigRTAspCBD и pSigRTBspCBD и результаты очистки гибридных белков RTAspCBD и RTBspCBD на целлюлозе. А. Promoter Т5 - промотор бактериофага Т5; SD - последовательность Шайна-Дальгарно; Sig - нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид L-аспарагиназы II Е. coli\ RTA, RTB - нуклеотидные последовательности, кодирующие А- и В-субъединицы рицина; sp -спейсер (Gly-Ser)5; CBD -целлюлозосвязывающий домен; Terminator - терминатор транскрипции. Б. Электрофореграмма белков в 10% ДСН-полиакриламидном геле с окрашиванием по Кумасси. 1,3 — лизаты клеток штаммов-продуцентов RTAspCBD и RTBspCBD после индукции ИШТ; 2, 4 - препараты очищенных на целлюлозе белков RTAspCBD и RTBspCBD, соответственно. М - маркеры молекулярной массы.

Отсутствие сигнальной последовательности было подтверждено путем анализа трипсинового гидролизата продуктов с использованием МАЬЭ1-ТОР-масс-спектром етрии.

Очищенными белками КТАхрСВО и КТВхрСВП проводили иммунизацию кроликов. Анализ активности и специфичности антител в кроличьих гипериммунных сыворотках проводили методом непрямого твердофазного ИФА, где в качестве сенсибилизирующих антигенов были применены химерные белки КТАнрСВО. КТВчрСВ!) и нативный рицин.

Гипериммунные сыворотки, полученные при иммунизации кроликов КТАхрСВО и НТВврСВО, проявляли активность в разведении 1:12800 по отношению к соответствующим гибридным белкам и в разведении 1:6400 по отношению к нативному рицину при отсутствии активности предиммунной сыворотки к этим же антигенам (Рис. 5). Наблюдали незначительную перекрестную специфичность (активность в разведении 1:3200) в сыворотках, обусловленную присутствием в составе рекомбинантов общей структуры врСВБ. Полученные результаты показали, что химерные белки ЮТ^рСВО и ЯТВ5рСВВ сохранили антигенные свойства нативного рицина.

140001200010000-ь 3000-

я 6000-¡5 40002000-о-

Рис. 5. Определение титра и специфичности антител в гипериммунных сыворотках крови кролика методом непрямого ИФА: ЯТАврСЕШ, КТВврСЕШ, рицин -антигены, сорбированные на плашке; N5 - предиммунная сыворотка; аА -гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на КТАэрСВВ; аВ - гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на ЯТВврСВО. Титром антител считали обратную величину последнего разведения, в котором ОП450 исследуемого образца сыворотки в 2 раза превышает ОП45о в отрицательном контроле.

Таким образом, созданы эффективные штаммы-продуценты антигенов рицина ЯТЛ и ЯТВ в составе гибридных белков с целлюлозосвязывающим доменом и получены высокоочищенные иммуногенные препараты антигенов рицина. Полученные штаммы-продуценты рекомбинантных белков Я'ГАхрСЕШ, кТВчрСВО и разработанный метод выделения, очистки и иммобилизации этих белков на целлюлозе могут найти применение в области промышленной биотехнологии при создании вакцинных препаратов для предотвращения отравлений рицином, тест-систем индикации рицина на основе иммунохимических методов, а также для получения антидотов к рицину на основе протективных антител. В случае сохранения токсичности, связанной с каталитической активностью 11ТА выщеплять аденин из 288 рРНК эукариот, белок ИТАврСВО может найти применение в качестве компонента иммунотоксинов для борьбы со злокачественными опухолями и ВИЧ. Белок ЯТВБрСВВ может быть использован в качестве адъюванта субъединичных генно-инженерных вакцин.

5.2.Двудоменные белки основного антигена возбудителя туляремии белка ТиЬ4 и целлюлозосвязывающего домена.

Туляремия является актуальной проблемой для здравоохранения в связи с широким распространением ее природных очагов в странах умеренного климатического пояса (Мещерякова И.С., 1994, 1998; Могпег Т. 1992).

Для специфической профилактики туляремии в России применяется живая вакцина (на основе штамма Franci.Se//a пйагашв 15 НИИЭГ), использование которой позволило снизить заболеваемость этой инфекцией до спорадических случаев или небольших вспышек (Мещерякова И.С., 1998; КЬа(епс\ег Ь.М. й а1., 1943; ЗапскНот О. 1994). Данная вакцина не лишена определенных недостатков, важнейшим из которых является значительное сходство геномов вакцинного и дикого штаммов К ?м/аге/ш'.у. Поэтому применение живой вакцины для вакцинации людей нежелательно.

Одним из перспективных направлений в области совершенствования и разработки эффективных способов защиты от туляремии является создание иммунопрофилактических препаратов нового поколения на основе антигенных компонентов бактериальной клетки .Г. 1и1аге)т$. Такими препаратами, например, могут быть субъединичные вакцины (Агпоп И. Е1 а!., 2003; ОеПгЬаий11 М.Т., 1998; Щец^ 8. е1 а1„ 1999).

Возбудитель туляремии является внутриклеточным паразитом, и основная роль в формировании невосприимчивости к туляремии отводится Т-клеточному иммунитету. Основными известными и широко используемыми в вакцинных препаратах нового поколения Т-зависимыми

антигенами возбудителя туляремии являются компоненты внешней мембраны, среди которых лучше всего изучен белок TUL4 и липополисахарид (Khlebnikov V.S. et al., 1996; Sjostedt A. et al., 1992, 1990).

Традиционный способ получения антигенных компонентов туляремии основан на фракционировании бактериальных клеток F. tularensis с помощью различных физико-химических методов. Такие препараты содержат различные примеси, а многочисленные очистки приводят к снижению протективности антигенного компонента. Попытки экспрессировать белок TUL4 в Е. coli стандартным способом привели к получению продуцентов с экспрессией целевого гена, детектировать которую было возможно лишь с использованием иммуноблоттинга (Sjostedt et al., 1989).

С целью существенного повышения выхода белка, упрощения схемы его очистки и получения высокоочищенного иммуногенного препарата TUL4 на основе системы векторов, созданной в данном исследовании, были сконструированы рекомбинантные плазмиды, экспрессирующис гены гибридных белков TUL4-sp-CBD и СBD-sp-TUL4. Данные гибридные белки состоят из последовательности зрелого белка TUL4, (Gly-Ser)5 спейсера и целлюлозосвязывающего домена из Anaerocellum thermophilum в двух возможных ориеитациях (Рис. 6).

pCBD-sp-TlTL4

Mat. Peptide

Promoter T5 SD CBD Spacer TUL4 Terminator

pTUL4-sp-CBD

Mat. Peptide

Promoter T5 SD TtTL4 Spacer CBD Terminator

Рис. 6. Гибридные плазмиды па основе вектора pQE6, контролирующие синтез химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4.

Уровень экспрессии генов гибридных белков в штамме Е. coli DH5a составляет 30% от тотального белка (Рис. 7).

Использование аффинной очистки рекомбинантных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 на целлюлозе привело к получению препаратов со степенью очистки более 95%. Препарат белка, содержащий комплекс TUL4-sp-CBD и целлюлозы, индуцировал выработку антител к исследуемому

белку у лабораторных животных (Рис. 8). Специфичность антител подтверждена с помощью метода иммуноблоттинга.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 7. Анализ экспрессии генов белков CBD-sp-TUL4 (36,4 кДа) и TUL4-sp-CBD (36 кДа) в клетках Е. coli DH5a (электрофорез в 12% ПААГ по Леммли), несущих рекомбинантные плазмиды. 1 - pTUL4-sp-CBD до индукции; 2 - pTUL4-sp-CBD. индукция 2 ч.; 3 - pCBD-sp-TUL4 до индукции; 4 - pCBD-sp-TUL4, индукция 2 ч.; 5 - контроль молекулярной массы 36 кДа; 6 - штамм DH5a до индукции; 7 -штамм DH5a, индукция 2 ч.

А Б

1 2 3 4 кДа 12 3 4

Рис. 8. Иммуноблоттинг лизатов клеток вакцинного штамма tularensis 15/10 и его вариантов 15 рАСУСР1\1Ьш14 (вариант с повышенной экспрессией белка ТиЬ4). А - иммуноблоттинг с конъюгатом козьих антикроличьих ^С с пероксидазой хрена и кроличьей сывороткой к штамму Р. Ш/агами 15/10. Б - иммуноблоттинг с тем же конъюгатом и кроличьей сывороткой к белку ТКЬ4 (разведение 1:50). 1 -лизат клеток Р. ийагепйь 15/10; лизат клеток Ь. Ш1агет1$ 15 рАСУСРЫЬ1и14, клон 1; лизат клеток Р. Ыагегшв 15 рАСУСРМЬш14, клон 2; лизат клеток Р. Ш1агепз15 15 рАСУСРЫЬшМ, клон 3. Молекулярные массы маркерных белков указаны по вертикали.

Таким образом, на основе созданной в данном исследовании системы векторов для получения конструкций с целлюлозосвязывающим доменом, создан эффективный продуцент основного белкового антигена TUL-4 возбудителя туляремии, наработан высокоочищенный белок, обладающий специфической иммуногенностью. Белок TUL4, полученный с помощью микробиологического синтеза, может быть использован для создания субъединичных вакцин для профилактики туляремии.

5.3. Двудоменные белки антигенов возбудителя туберкулеза и целлюлозосвязывающего домена.

Профилактика туберкулеза - наиболее действенная мера борьбы с этим заболеванием. В настоящее время единственной применяемой вакциной против туберкулеза является BCG (Bacillus Calmette-Guerin), которая представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Она безопасна, недорога, достаточно эффективно защищает детей от милиарного и диссеминированного туберкулеза, однако не защищает взрослых от легочного туберкулеза, а именно эта форма болезни приводит к распространению инфекции и тяжелой эпидемической ситуации. Поэтому совершенствование существующей и разработка новых вакцин для профилактики туберкулеза является актуальной задачей (Mustafa A.S., 2002).

Перспективным и технологически более совершенным направлением в разработке вакцин следует признать создание субъединичных вакцин на основе одного или нескольких белков Mycobacterium tuberculosis. К потенциально важным вакцинным антигенам относят, в частности, иммунодоминантные секретируемые антигены ESAT6, CFP10, белки комплекса 85 (Ag85A, Ag85B, Ag85C) и другие.

Белки ESAT6 и CFP10 присутствуют в разных штаммах вирулентных микобактерий, но утрачены вакцинным штаммом BCG. In vivo эти белки индуцируют синтез интерферона-гамма (ИФН-у) Т-лимфоцитами инфицированных М. tuberculosis лиц, поэтому ESAT6 и CFP10 используются для разработки различных серологических методов диагностики. Близкородственные белки Ag85 А, В и С кодируются тремя отдельными генами микобактерий многих штаммов, в том числе BCG. Эти антигены также участвуют в формировании Т-клеточного ответа (Arend S.M., 2000; Berthet F.-X., 1998; Shen H, 2010).

При разработке вакцинных препаратов на основе отдельных белковых компонентов необходимо обеспечить эффективную систему очистки, чистоту препарата от контаминации липополисахаридом и ДНК штамма-продуцента, стабильность синтезируемых белков, простоту тестирования

иммуногенности. Особенно важен выбор адъюванта, без которого белковые антигены практически неиммуногенны (Deng Y.H.. 2010; Zhang Н, 2010).

Используя созданную в данном исследовании систему векторов для получения конструкций с целлюлозосвязывающим доменом, были сконструированы двухкомпонентные гибридные белки CFP10-CBD, ESAT6-CBD и Ag85A-CBD (Рис. 9).

При выделении все белки были стабильны, при +4°С в PBS буфере с азидом натрия белки хранились в течение 2-6 мес.

На основе этих антигенов по разработанной технологии иммобилизации получили комплексные препараты - суспензии целлюлозы с иммобилизованными белками.

CFP10 CBD '

Рис. 9. Схема генно-инженерных конструкций pCFPlO-CBD, pESAT6-CBD и pAg85A-CBD: Т5 pro - промотор бактериофага Т5; ter - терминатор транскрипции; CFP10, ESAT6, Ag85A - гены соответствующих белков М. tuberculosis; Gly-Ser -спейсерная последовательность GSPGSGSGSGSGSRS; CBD - ген целлюлозо-связывающего домена A. thermophilum.

Характеристика полученных плазмидных конструкций представлена в таблице 6.

Таблица 6.

Характеристика полученных плазмидных конструкций и уровня экспрессии и растворимости гибридных белков.

Название Описание конструкции Mr белка, кДа; Уровень экспрессии белка в Е. coli, растворимость

pCFP10-CBD CFP10-sp (Gly, Ser)-CBD 32.8 10-15%; 40%

pESAT6-CBD ESAT6 - sp (Gly, Ser) - CBD 32,0 10-15%; 50%

pAg85A-CBD Ag85A - sp (Gly, Ser)-CBD 54,1 7-10%; 50%

Иммуногенность комплексных препаратов на целлюлозе в сравнении с контролями исследовали на инбредных мышах линии С57ВЬ/6. При подкожном введении препаратов через 5 недель выявляли 2-3-кратный прирост ИФН-у-положительных Т-клеток (выраженный специфический иммунный ответ) на все три антигена и 4-6-кратное усиление пролиферации Т клеток в присутствии соответствующих антигенов в культуре по сравнению с контролем (Рис. 10).

30000 25000 20000 15000 10000 5000

-KS92

■

3640

É 194.3

6460

194.3 1711 1776 1629 2474 1210 2В™ ^ 2281

1 ш ш Ш ш 11

группы

Рис. 10. Пролиферативный ответ Т-клеток паховых лимфатических узлов на антигены Ag85A, ESAT6, CFP10 после двукратной подкожной иммунизации препаратами мышей линии C57BI/6. Группы: 1,2- Ag85A-CBD + cell + НАФ (неполный адъювант Фрейнда) с и без Ag85A; 3, 4 - Ag85A-CBD + cell с и без Ag85A; 5, 6 - ESAT6-CBD + cell с и без ESAT6; 7, 8 - CFP10-CBD + cell с и без CFP10; 9, 10 - CBD + cell с и без ESAT6; 11, 12 - cell с и без ESAT6; 13, 14 -контроль с и без ESAT6.

Защитные свойства препаратов на целлюлозе по сравнению с контролем - CBD на целлюлозе - проверяли на генетически чувствительных к туберкулезу инбредных мышах линии I/St, которых после вакцинации заражали аэрозольно вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv. Через 18 дней в высевах гомогенатов легких и селезенки наблюдалось 5-7-кратное уменьшение бактериальной нагрузки по сравнению с контрольными животными. Кроме того, вакцинация достоверно продлевала срок жизни зараженных животных (Рис. 11).

Таким образом, отработана технология выделения, очистки и доклинической проверки новых вакцинных противотуберкулезных препаратов, представляющих собой гибридные белки антигенов CFP10, ESAT6 и Ag85A М. tuberculosis с целлюлозосвязывающим доменом, иммобилизованные на целлюлозе. Дальнейшие направления исследований в области разработки субъединичных вакцин для профилактики туберкулеза связаны с комбинированием антигенов и расширением круга адъювантных полисахаридных матриц.

юоеоооооо

КОЕ на легкое

(00000000

шоовоо

Количество микобактерий в легтих

целтэлоза 'СВО-целлюлоза .контроль

Г+1

гИ

Г+1

Г-Н

иипроп СВБ- КАТб-СИХ Аф5А-СВТ>-цеплюлоза целлюлоза целлюлоза

Вакцинация

Время после выживания ('дни1!

Рис. 11. Защитные свойства новых вакцинных препаратов: А) Оценка бактериальной нагрузки в легких при вакцинации мышей комплексными препаратами: Б) Оценка выживаемости животных, иммунизированных комплексными препаратами.

5.3. Двудоменные белки антигенов возбудителя лептоспироза и

целлюлоз о- и глюкан-связывающего доменов.

Лептоспирозы относятся к числу повсеместно распространенных природно-очаговых инфекций человека и животных. Действующие природные и антропургические очаги этого заболевания расположены во многих странах мира, включая Россию.

В настоящее время в России наиболее эффективным способом борьбы с лептоспирозом является специфическая профилактика с использованием инактивироваиной вакцины, содержащей культуры лептоспир основных серологических групп. Применяемая инактивированная вакцина обеспечивает развитие серовароспецифического иммунного ответа длительностью не более 1 года. В странах Западной Европы и США инактивированные вакцины используют только в ветеринарии, вакцина для профилактики лептоспирозов человека отсутствует. Поэтому получение рекомбинантных вакцинно-ценных антигенов лептоспир и изучение их свойств представляет несомненный интерес для разработки подходов к созданию кандидатных субъединичных противолептоспирозных вакцин нового поколения.

Субъединичные вакцины имеют ряд преимуществ, важнейшими из которых являются исключение возможности возникновения манифестной инфекции, низкая реактогенность и возможность создания препарата, обеспечивающего перекрестный (сероваронезависимый) иммунитет (Агпоп Е. е1 а1. 2003). Вместе с тем, основные сложности при разработке

субъединичных вакцин связаны с недостаточными сведениями о протективных антигенах лептоспир и механизмах развития иммунного ответа макроорганизма (Haake D.A. 2000, Palaniappan R.U.M. et al. 2007).

Основная роль в формировании невосприимчивости к лептоспирозу отводится гуморальному иммунному ответу. Стратегии идентификации консервативных антигенов разных сероваров лептоспир сводятся, в основном, к изучению белков наружной мембраны (ОМР) (Haake D.A. et al. 2002, Cullen P.A. et al. 2005). Важнейшим открытием среди ОМР стало обнаружение иммуноглобулиноподобных белков Lig (Leptospira) immunoglobulin-like), представляющих собой семейство нефимбрильных адгезинов лептоспир, что придало огромный импульс исследованиям, направленным на создание кандидатных субъединичных препаратов (Palaniappan R.U.M. et al. 2002, Matsunaga J. et al. 2003). В настоящее время спектр основных иммуногенных белков патогенных лептоспир окончательно не определен, однако исследователи сходятся во мнении, что из всех известных на сегодняшний день антигенов лептоспир наибольшим вакцинным потенциалом обладает белок LigA (Palaniappan R.U.M. et al.2006, Faisal S.M. et al. 2008).

Проанализировав структуру выбранного антигена LigA и гомологию аминокислотных последовательностей его отдельных модулей иммуноглобулиноподобных доменов среди разных сероваров лептоспир, были выбраны три домена из консервативной области LigA в качестве потенциальных антигенов - домены 1, 4 и 5 (Рис. 12).

trraa*' - ■ - ' - CwfoWciiEi

- А ^ А g, А

1_I-1-1

Лнпооокс Консервативные Вариабельные домены домены

Рис. 12. Схема строения иммуноглобулиноподобного белка LigA.

Были сконструированы рекомбинантные плазмиды, кодирующие гибридные белки БЬСВБ, Б4-СВО, Б5-СВБ, а также 01-СВ0, Б4-СВО и Б5-СВВ, которые содержат консервативный иммуноглобулиноподобный домен LigA (домен 1, 4 или 5) и целлюлозосвязывающий (СВБ), либо 1,3-р-глюкан-связывающий (СВБ) домен из ТНегтмо^а пеароШапа (Рис. 13).

На основе полученных плазмид впервые удалось получить эффективные штаммы-продуценты отдельных структурных модулей белка LigA в составе соответствующих химерных белков, обеспечивающие высокий уровень синтеза в клетках Е. соН (около 10-15% от тотального белка клетки) (Рис. 14).

CBD

GBD

D4 sp CBD D4 sp GBD

Л/

D5 sp CBD D5 sp GBD

Рис. 13. Схемы полученных химерных белков, содержащих рекомбинантный домен (01, 04, Э5) с аффинным доменом (СББ или ОВБ).

31,6 кДа 32,3 кДа 32 кДа мол.

массы, 35,8 кДа

Рис. 14. Анализ экспрессии рекомбинантных белков в клетках Е. coli штамма M15. Электрофорез в 12%-ном ПААГ-ДСН, окраска Кумасси R-250.

Поскольку домены 1, 4 и 5 LigA являются высококонсервативными и имеют похожую структурную организацию, в дальнейших экспериментах использовали два гибридных белка - D5-CBD и D5-GBD для проведения сравнительных исследований in vivo как самих антигенов, так и сорбентов (целлюлозы и глюкана).

Выделение и очистку белка D5-CBD проводили с использованием в качестве сорбента препарата аморфной (волокнистой) целлюлозы, приготовленной медно-аммиачным способом по методу А.Е. Гурвича (Гурвич А.Е. и др., 1961, 1981) с нашими модификациями. В результате был получен препарат D5-CBD, иммобилизованного на целлюлозе с концентрацией 3 мг белка на 1 мл сорбента, а также раствор антигена D5-CBD с концентрацией белка 4 мг/мл (Рис. 15).

Выделение и очистку белка D5-GBD проводили аналогичным способом с использованием в качестве сорбента препарата глюкана. В результате был получен препарат D5-GBD, иммобилизованный на глюкане, с концентрацией 4 мг белка на 1 мл сорбента, а также раствор антигена D5-GBD с концентрацией белка 3,5 мг/мл (Рис. 16).

32кДз —24 кДа

1 лизат клеток М15, индукция

2 лизат, фр. растворимых белков

3 лизат, фр. нерастворимы:-: белков

4 отток с колонки после сорбции В5-

СВБ

5 В 5-СВО + целлюлоза, 1 мл

6 £>5-СВО + целлюлоза, 5 мл

7 Р5-СВЕ>.-элюат 1 мл

8 С5-СВР,элюат5мп

9 контроль мол массы 24 к Да 1мг/ил

Рис 15. Анализ физико-химических свойств белка 05-СЕШ и препаратов выделенного белка Б5-СЕШ. Электрофорез в 10%-ном ПААГ-ДСН, окраска Кумасси Я-250.

1 2 3 4 5 6 7

— «М —ш ^_

—• — »

-31,6 кДа

лизат клеток М15 до индукции лизат клеток М15, индукция лизат, фр. нерастворимых белков лизат, фр растворимых белков отток с колонки, после сорбции 05-ОБО

белок 05-СВ0+ глюкан элюат05-0В0 (элюция гуанидингидро хлоридом) злюат Р5-СВ0 (элюция мочевиной) контроль мол массы 35 кДа

Рис. 16. Анализ физико-химических свойств белка Об-вВО и препаратов выделенного белка В5-СВО. Электрофорез в 12%-ном ПААГ-ДСН, окраска Кумасси Я-250.

Рекомбинантиый антиген П5-СВВ использовали для постановки непрямого иммуноферментного анализа с пулами сывороток больных лептоспирозом, вызванного разными серогруппами лептоспир: Icterohaemorrhagiae, Спрро1ур1ю8а, Сатсо1а, 8е]гое, а также четырьмя пулами сывороток, полученных от клинически здоровых доноров (коллекция лаборатории лептоспирозов ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России). Результаты исследования антигенных свойств Э5-СВО с сыворотками больных методом непрямого ИФА представлены на рис. 17.

Как видно из рис. 17, с рекомбинантным антигеном 05-СВП взаимодействовали антитела сывороток больных лептоспирозом серогрупп 1с1егоЬаетогг1^1ае (пулы 1, 2, 3) и Сатсо1а (пул 7) (ОП450> 0,250). Сыворотки здоровых доноров (Д, 21, 30 и 50), а также пулы больных, инфицированных серогруппами Спрро1ур1ю8а и 8е]гое, с антигеном Б5-СВО не взаимодействовали (значения ОП4Яо< 0,250). Полученные результаты

свидетельствуют о сохранении антигенных свойств рекомбинантных доменов 1л§А в составе полученных химерных белков. Кроме того, обнаруженная групповая специфичность 05-СВБ к антителам серогрупп 1сЧего11аетогт(^1ае и Сагнсо1а отражает близкое антигенное родство этих групп лептоспир, что согласуется с литературными данными.

2,500 2,000 I 1,500

5 1,000

0,500 0,000

Рис. 17. Определение титров специфических антител к антигену D5-CBD в сыворотках больных методом непрямого ИФА.

Для прореагировавших в нИФА сывороток определяли титр специфических airra-D5 антител. Титром считали величину, обратную последнему разведению, в котором ОП в 2 и более раз превышает ОП в отрицательном контроле. Результаты определения титров специфических антител в сыворотках больных представлены в таблице 7. Как видно из таблицы 7, титры специфических антител, определенные методом нИФА с использованием рекомбинантного антигена D5-CBD. во всех случаях, кроме пула №1, коррелируют с титрами антител, определенными в РМА, являющейся «золотым стандартом» диагностики лептоспироза.

Таблица 7.

Титры специфических анти-Б5 антител в сыворотках больных лептоспирозом.

Номер пула Серогруппа Титр PMA Титр нИФА

1 lcterohaemorrhagiae 800 400

2 lcterohaemorrhagiae 800 800

3 lcterohaemorrhagiae 400 400

7 Canicola 400 400

Полученные результаты подтверждают перспективность использования рекомбинантного антигена D5-CBD в качестве маркера для разработки диагностических тест-систем на основе нИФА (Guerreiro Н. et al. 2001, Koizumi N, Watanabe H. 2004, Croda J, Ramos J.G.R., Matsunaga J. 2007).

При изучении цитокиновых профилей, появляющихся после введения животным разработанных препаратов, было показано, что препарат рекомбинантного антигена D5-GBD, иммобилизованного на глюкане, способствовал повышенному синтезу интерлейкинов 4 и 10 - ключевых цитокинов гуморального иммунного ответа, который играет основную роль в формировании невосприимчивости к лептоспирозу (Рис. 18).

При введении инактивированной вакцины против лептоспироза в организме развивается иммунный ответ гуморального типа (Th-2), о чем свидетельствует индукция экспрессии IL-1 альфа и бета (активация АПК -макрофагов, моноцитов и В-клеток), а также высокий уровень синтеза IL-4 и IL-10 - цитокинов, поддерживающих дифференцировку Th-2. Наиболее близок к профилю вакцины цитокиновый профиль иммунного ответа на введение препарата GBD-глюкан.

Обнаруженное повышение синтеза провоспалительных цитокинов (интерлейкины 1а и р, ФНОа) в сыворотках этой же группы животных в первые дни после иммунизации свидетельствует о ранней активации иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов, моноцитов, макрофагов), что, по-видимому, также является следствием применения глюканового сорбента, и, в целом, способствует повышению иммунного ответа. Таким образом, разработанный препарат D5-GBD, иммобилизованный на глюкане, стимулирует синтез цитокинов гуморального иммунного ответа. Кроме того, благодаря неспецифическим иммуностимулирующим свойствам глюкана в первые-вторые сутки синтезируется большое количество провоспалительных цитокинов, способствующих активации макрофагов и фагоцитов, а также пролиферации и дифференцировке лимфоцитов.

Группа №11 Инактивированная вакцина

Группа №12. Живая культура

Группа №5. D5-GBD + глюкпн 2000 - 1800 -

* 1600 — с в- I4U0 —

| 1200 -2 1000 — .II -1л ■ IL-1 b

« 800 -£ 600 -е- i 400 - f 200 — iL -- т 1 „Iii

щг fiFltlmi-r

_200 1 2 15 27 2Э 58 Дни эксперимент«

Рис. 18. Цитокиновые профили иммунного ответа животных, иммунизированных инактивированной вакциной (А), живой культурой лептоспир (Б), препаратом рекомбинантного антигена 05-СЕШ+глюкан (В).

Таблица В.

Титры специфических антител после иммунизации лабораторных животных.

№ Титры специфических антител в Приме-

груп Препарат сыворотках чания

пы 15 день 27 день 29 день 58 день

1 ОВБ 400 1600 1600 3200

3 СВБ-глюкан 400 800 1600 12800

64 128 64 64

4 Б5-СВВ 128 128 128 64 Антитела к Б5

5 В5-СВВ-глюкап 128 256 1600 3200

6 СВБ 4 отриц отриц отриц

8 СВБ-целлюлоза 8 64 3200 1600

9 Б5-СВВ 4 отриц отриц 4

10 В5-СВВ-целлюлоза 8 64 128 256

11 Инактивированная Вакцина отриц отриц отриц отриц Антитела к Б5

12 Живая культура 64 64 128 128 Антитела к Б5

14 В5-СВО+Иммуномакс 128 256 256 256

Как видно из таблицы 8, иммобилизация антигенов на углеводном сорбенте, как на целлюлозе, так и на глюкане, усиливает антителообразование. Использование углеводного сорбента на основе частиц 1,3-(3-глюкана в эксперименте способствовало более значительному увеличению титра специфических антител в сыворотках крыс, по сравнению с препаратом волокнистой целлюлозы, особенно в случае рекомбинантных антигенов В5-ОВО и СВБ.

Таким образом, сконструированы двудоменные белки антигенов лептоспир с целлюлозо- и глюкан-связывающими доменами, обладающие высокой специфической иммуногенной активностью. Препараты данных белков, иммобилизованных на соответствующих аффинных матрицах, могут быть использованы для создания кандидатных субъединичных противолептоспирозных вакцин нового поколения.

5.4. Двудоменные белки с ЕОР, ГС Г и бета-интерфероном.

Несомненный интерес с точки зрения практического использования в различных областях биотехнологии, имеют гибридные белки, состоящие из биологически активного белкового домена - цитокина или фактора роста и аффинного домена. В работе получены гибридные белки, содержащие

эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, интерферон бета, с различными аффинными доменами.

Эпидермальный фактор роста (EGF - Epidermal Growth Factor, урогастрон) - полипептид с молекулярной массой около 8 кДа, был впервые выделен из слюнных желез мыши. Впоследствии он был найден во многих нормальных и патологически измененных тканях животных и человека. EGF относится к группе факторов роста и играет важную роль в регуляции обменных и восстановительных процессов в организме. Он способен специфически связываться с рецепторами на поверхности клеточных мембран, стимулирует таксис противовоспалительных клеток и дифференциацию восстанавливающихся. Показано, что EGF стимулирует деление клеток в культурах фибробластов, участвует в поддержании гастроинтестиналыюй функции и обладает ранозаживляющей активностью (Savage, С. R. Jr., 1972; Goodlad, R. А., 1989).

Семейство ростовых факторов фибробластов включает в себя, по меньшей мере, 20 различных мономерных белков с молекулярным весом от 13 до 18 кДа. Основной ростовой фактор фибробластов (bFGF) -мультифункциональный белок, который участвует в большом числе нормальных клеточных функций, таких как пролиферация, миграция и дифференцировка. Он стимулирует пролиферацию клеток мезодермалыюго и нейроэктодермалыюго происхождения, включая фибробласты, хондроциты, миобласты, некоторые типы эндотелиальных клеток сосудов и мышечной ткани, а также глиальные клетки. В культуре клеток bFGF вызывает дифференцировку эндотелиальных клеток, хондроцитов и нейронов. Он также является сильным ангиогенным фактором.

Существуют несколько изоформ человеческого bFGF (Florkiewicz, R. Z„ 1989). Все они - 18, 22, 23 и 24 кДа - могут экспрессироваться с единственного транскрипта мРНК. Эти изоформы локализуются как в ядре (22, 23 и 24 кДа-изоформы), так и в цитозоле или на клеточной поверхности (изоформа 18 кДа).

Интерфероны относятся к цитокинам (медиаторам иммунитета) и обладают противовирусной, иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью, т.е. являются полифункциональными биорегуляторами широкого спектра действия и гомеостатическими агентами.

Интерферон-Р относится к семейству интерферонов I типа, и, подобно интерферону-а, индуцирует множество биологических реакций, включая ингибирование вирусной репликации, стимуляцию иммунной системы и ингибирование пролиферации клеток. Препараты рекомбинантного интерферона-р нашли применение в медицине при широком спектре

патологий. Это, в первую очередь, лечение рассеянного склероза, различных вирусных инфекций (вирусные гепатиты, герпесвирусные заболевания), а также злокачественной меланомы, рака молочной железы и шейки матки, волосатоклеточной лейкемии и других не менее опасных заболеваний. Однако, несмотря на безусловно доказанную медицинскую значимость этого препарата, биологически активный белок интерферон-p производится в недостаточном количестве. Поэтому создание нового эффективного бактериального продуцента рекомбинантного интерферона-Р человека, а также разработка простых и практически безынструментальных методов очистки и выделения белка с высокой биологической активностью и степенью чистоты представляется актуальной задачей.

Гены, кодирующие вышеперечисленные биологически активные белки, были получены методом ОТ-ПЦР из суммарной РНК скелетной мышцы человека, при этом праймеры для ПЦР были спланированы таким образом, чтобы обеспечить возможность дальнейших генно-инженерных манипуляций (в концевые последовательности генов были введены сайты рестрикции специфических эндонуклеаз). В результате были созданы бактериальные штаммы-продуценты, синтезирующие рекомбинантные белки EGF, FGF и IFN-p. Было показано, что после индукции экспрессии рекомбинантных генов, данные белки накапливаются количестве от 5% до 10% от тотального белка клетки (Табл. 9). Отсутствие продукции рекомбинантного белка IFN-P, по-видимому, объясняется его токсичностью для клеток-продуцентов.

Были созданы слитные белки, содержащие биологически активные белки и аффинные домены: коллаген-связывающий (CollBD) и декстран-связывающий (DBD).

В качестве коллаген-связывающего домена использовали коллаген-связывающий домен белка ВМ-40 человека (другие названия - SPARC или остеонектин), внеклеточного кальций-связывающего белка размером 33 кДа, который предположительно модулирует клеточный фенотип. Показана роль этого белка в регуляции клеточной адгезии, пролиферации и миграции, а также в заживлении ран и образовании опухолей.

В качестве декстран-связывающего домена в работе был использован С-концевой участок декстрансахаразы микроорганизма Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides. Этот фермент катализирует синтез декстрана - разветвленного полимера, в котором более 90% остатков глюкозы соединены а-1,6 связями. На основе литературных данных был выбран минимальный фрагмент С-концевого участка, сохраняющий аффинное сродство к декстрану.

Гены, кодирующие эти аффинные домены, были получены с помощью ПЦР или химико-ферментативного синтеза из олигонуклеотидов. Кодонный состав синтетических генов был подобран таким образом, чтобы обеспечивать максимальный уровень экспрессии этих генов в клетках Е. coli. В концевые последовательности генов были введены сайты рестрикции специфических эндонуклеаз, чтобы обеспечить возможность для дальнейших генно-инженерных манипуляций. Уровень продукции и растворимость полученных аффинных доменов приведены в таблице 9.

Ген коллаген-связывающего домена белка ВМ-40 человека был получен в виде слитной генно-инженерной конструкции с геном целлюлозосвязывающего домена (CBD), т.к. размер самого коллаген-связывающего домена чрезвычайно мал и исследование уровня его продукции и биологических свойств без белка-носителя не представлялось возможным. Были получены также рекомбинантные плазмиды, кодирующие гибридные белки CollBD-FGF, DBD-EGF, DBD-IFN-ß. Уровень продукции и растворимость гибридных белков приведены в таблице 9.

Таблица 9.

Уровень продукции и растворимость белков.

Белок Уровень продукции Растворимость

CollBD-CBD (Collagen-binding Domain) 5% Растворимый

DBD (Dextran binding domain) 10% Растворимый

EGF (Epidermal Growth Factor) 5% Растворимый

FGF (Fibroblast Growth Factor) 10% Растворимый

IFN-ß (Interferon beta) нет продукции -

CollBD-FGF 5% Нерастворимый

DBD-EGF 20% Нерастворимый

DBD-IFNß 15% Нерастворимый

Для изучения биологической активности белка CollBD-FGF in vitro была разработана модель культивирования клеток эукариот на поверхности, покрытой коллагеном. Было показано, что нанесение на коллагеновую подложку препарата химерного белка CollBD-FGF достоверно увеличивает число адгезированных на этой подложке эукариотических клеток в 2-3 раза по сравнению с контролем. Полученный белковый препарат может применяться для совершенствования систем культивирования эукариотических клеток и оптимизации производства биологически активных белков, синтезируемых этими клетками.

Для изучения биологической активности препаратов химерного белка DBD-EGF in vitro была разработана методика культивирования клеток эукариот в объеме питательной среды на поверхности сфер Сефадекса, покрытых гибридным белком. Было показано, что при добавлении к культуре эукариотических клеток суспензии Сефадексов клетки практически не адгезируются на их поверхности. При добавлении к питательной среде с клетками Сефадексов, предварительно проинкубированных с препаратом белка DBD-EGF, клетки адгезируются и ровным слоем покрывают поверхность сфер Сефадексов. Полученный белковый препарат может применяться для создания новых систем для культивирования эукариотических клеток в объеме питательной среды. Использование данной технологии может значительно повысить эффективность культивирования и, как следствие, снизить стоимость биологически активных белков, синтезируемых эукариотическими клетками.

Было проведено исследование активности химерного белка DBD-IFN-Р, иммобилизованного на Сефадексе G-75. Биологическая активность определялась по способности химерного белка защищать эукариотические клетки линии JI-41 от заражения модельным вирусом энцефаломиокардита мышей. Результаты исследования биологической активности химерного белка DBD-IFN-P представлены в таблице 10.

Таблица 10.

Активность препаратов интерферона-р.

Образец Токсичность Титр в опытах Активность

(ел./мл) образца (МЕ/мл)

Химерный белок DBD-1FNP 640 5 000

на Сефадексе Отсутствует 1280 10 000

2560 20 000

Бетаферон 1280

(Schering, Ag) Отсутствует 1280 10000*

1280

Человеческий лейкоцитар- 320

ный интерферон-a (Биомед Отсутствует 640 1 000*

им. И.И. Мечникова) 320

Ребиф (Industria Farmacéutica 640

Serano S.P.A.) Отсутствует 640 10 000*

640

Авонекс 1280

(Biogen B.V.) Отсутствует 1280 10 000*

1280

* - заявленная активность коммерческих препаратов.

Была показана активность препаратов рекомбинантного интерферона-Р иммобилизованного на Сефадексе G-75, сопоставимая с рсфсренс-препаратом и коммерческими препаратами интерферона-p, применяемыми в лечебной практике. В качестве референс-препарата использовали препарат интерферона-Р Бетаферон (104 МЕ/мл) (Schering, AG). В качестве коммерческих препаратов для сравнения активности использовались применяемые в настоящее время лекарственные средства Ребиф (104 МЕ/мл) (Industria farmacéutica serono S.p.A.) и Авонекс (104 МЕ/мл) (Biogen B.V.), и человеческий лейкоцитарный интерферон-а (103 МЕ/мл) (ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова).

Таким образом, на основе созданной в данном исследовании системы векторов для получения конструкций с аффинным доменом, синтезированы гибридные белки, включающие коллаген-связывающнй или декстран-связывающий домены и биологически активные белковые домены со специфической активностью: EGF, FGF и интерферон-p. Наличие аффинного домена обеспечивало одностадийную очистку препаратов белков до 95% чистоты и возможность различных вариантов практического использования препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе разработанных в настоящем исследовании технологических решений получено значительное количество белковых антигенов и других белков. Помимо белков, описанных в тексте, автором также были получены разнообразные ДНК-связывающие белки и белки нуклеотидного обмена, вирусные и бактериальные белки, белки растений, многокомпонентные белки-векторы для трансформации растений, пептиды, содержащие активные центры ингибиторов циклиновых киназ для применения в онкологии и др. белки, получение и перспективы практического использования которых детально изложены в соответствующих публикациях. Разработанные технологические решения позволяют в короткие сроки конструировать белки, состоящие из двух или более модулей, а также обеспечивают эффективную очистку, концентрирование и иммобилизацию белков, что делает данные продукты перспективными для применения в сельскохозяйственной биотехнологии и медицине.

выводы

1. Разработана система научно-обоснованных технологических решений, имеющих приоритетное значение для современной сельскохозяйственной и медицинской биотехнологии, а также нанобиотехнологии. Основу этой системы составляют: способ направленной контролируемой полимеризации и сборки генно-инженерных конструкций, обеспечивающих синтез белков с повторяющимися последовательностями или мультидоменных белков с заданными свойствами, а также технология аффинной самосборки рекомбинантных белков на полисахаридных и других матрицах, обеспечивающая высокоэффективную одностадийную очистку, рефолдинг и специфическую сорбцию целевых белков. Практическая реализация данных технологических решений привела к созданию эффективных биологически активных препаратов на основе рекомбинантных белков.

2. Созданы мультидоменные рекомбинантные белки (нанотранспортеры), обеспечивающие распознавание и эффективную доставку лекарственных средств, включая фотоактивные соединения, в раковые клетки.

3. На основе микробиологического синтеза создан высокоэффективный препарат - стимулятор роста сельскохозяйственных животных IV поколения «САТ- Сом», основанный на принципах аутоиммунной коррекции ингибитора роста животных соматостатина.

4. Проклонированы новые гены белков бактерий и эукариот, кодирующие аффинные домены с уникальными свойствами (высокая термостабилыюсть, специфичность, высокая константа связывания, по параметрам приближающаяся к ковалентному взаимодействию).

5. Показано, что иммобилизация вакцинно-ценных белков на полисахаридных сорбентах приводит к улучшению их иммуногенных свойств: полисахаридный сорбент выступает в роли адъюванта и стимулирует развитие более сильного иммунного ответа на вводимые белки.

6. Разработаны основанные на принципе самосборки подходы для получения субъединичных генно-инженерных микро- и нановакцин. Получены препараты, на основе которых могут быть созданы кандидатные субъединичные генно-инженерные вакцины для профилактики туберкулеза, туляремии и лептоспироза.

проточный реактор, позволяющий проводить эффективный ферментативный гидролиз лактозы на глюкозу и галактозу. Данный подход может использоваться в пищевой промышленности для получения безлактозного молока и утилизации подсырной и творожной сывороток.

8. На основе технологии аффинных доменов получены препараты ряда важных для медицины и сельскохозяйственной биотехнологии ростовых факторов и цитокинов: EGF, FGF, бета-интерферон, обладающие специфической активностью. Наличие аффинного домена обеспечивает одностадийную очистку белков до 95% чистоты и возможность различных вариантов практического использования препаратов, в том числе, для усовершенствования методов культивирования эукариотических клеток.

БЛАГОДАРНОСТИ

Экспериментальные работы проводились на базе ГНУ ВНИИСБ Россельхозакадемии и ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России при участии О.В. Сергиенко, М.-В.Л. Ходуна, Т.В. Тихоновой, A.C. Карягиной-Жулиной, М.А. Грачевой, З.М. Галушкиной, Е.М. Рязановой, Н.В.Лавровой, H.H. Полетаевой, A.M. Лящука, О.Л. Ворониной, проф. И.С. Мещеряковой, Е.И. Аксеновой, Н.Е. Шараповой, проф. Ю.В. Ананьиной, A.C. Семихина, A.M. Лящука, А.П. Котновой, Д.Ю. Логунова, А.И. Тухватулина, М.В. Мезенцевой и других сотрудников.

Работы по оценке функциональности доменов мультидоменных белков-нанотранспортеров выполнялись на базе Института биологии гена РАН под руководством проф. A.C. Соболева совместно с A.A. Розенкранцем, П.В. Гулаком, Д.Г. Гилязовой, Ю.В. Храмцовым и другими сотрудниками лаборатории; работы с использованием атомно-силовой микроскопии -совместно с сотрудниками НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова Ю.Н. Антоненко и Т.Н. Рокицкой.

В работах по созданию препаратов соматостатина принимали участие сотрудники Института экспериментальной эндокринологии ЭНЦ РАМН Е.Т. Сазина и С.К. Карпова, в работах по исследованию свойств гибридных белков на основе термостабильной бета-галактозидазы - сотрудники Института молекулярной генетики РАН проф. Г.А.Великодворская, Н.А.Лунина и сотрудник НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова В.Н.Ташлицкий.

Работа по оценке иммуногенности и протективного эффекта препаратов на основе гибридных белков с антигенами возбудителя туберкулеза проводилась на базе лаборатории иммуногенетики Центрального научно-исследовательского института туберкулёза РАМН под руководством проф. A.C. Апта с участием сотрудников лаборатории Э.Н. Рубаковой, Т.К. Кондратьевой.

Автор выражает глубокую признательность всем коллегам, принимавшим участие в работе, обсуждении результатов, оформлении

диссертации, а также руководству институтов и лабораторий, предоставивших возможность для проведения исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных рецензируемых журналах:

1. Калинин В.Н., Лапаева И.А., Лунин В.Г., Скрипкин Е.А., Смирнов В.Д. Выделение эндонуклеазы рестрикции с //¡>и////-специфичностыо из Bordetella bronchiseptica II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1986. -№4.-С. 16-19.

2. Карягина А.С., Лунин В.Г.. Никольская И.И., Дебов С.С. Функциональная характеристика плазмид штамма S. sonnei 47 // Молекулярная генетика. - 1986. - № 10.-С. 16-21.

3. Grabko УЛ., Lunin V.G., Naroditsky B.S., Khilko S.N., Tickhonenko T.I., Makhov A.M., Karpova O.V. Study of avian adenovirus DNA infectivity in chick embryos //Acta Virol. - 1987. - Vol. 31. - P. 97-102.

4. Карягина A.C., Лунин В. Г.. Грубер И.И., Поляченко В.М., Никольская И.И., Дебов С.С. Активность рестрикционной эндонуклеазы SjoII в штаммах Escherichia coli, трансформированных плазмидами Shigella sonnei 47 // Молекулярная генетика. - 1987. - № 12. - С. 26-29.

5. Rivkina М.В., Lunin V.G.. Mahov A.M., Tikchonenko T.I., Kukain R.A. Nucleotide sequence of integrated hepatitis В virus DNA and human flanking regions in the genome of the PLC/PRF/5 cell line // Gene. - 1988. - Vol. 64. - P. 285-296.

6. Карпов B.A., Лунин В.Г., Тихоненко Т.Н. Фазированный полилинкер для клонирования и экспрессии генов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1989. - № 9. - С. 28-33.

7. Сергиенко О.В., Лунин В.Г.. Тихоненко Т.Н. Полимеризация фрагментов ДНК, кодирующих эпитопы поверхностных антигенов вируса гепатита В, в клетках Escherichia coli II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1989.-№ 10.-С. 24-29.

8. Сергиенко О.В., Лунин В.Г.. Смирнов В.Д., Тихоненко Т.Н. Синтез и экспрессия фрагментов ДНК, кодирующих эпитопы поверхностных антигенов вируса гепатита В, клетками Escherichia coli // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1989. -№ 9. - С. 39^-2.

9. Karyagina A.S., Lunin V.G., Nikolskaya I.I. Characterization of the genetic determinants of SsoII-restriction endonuclease and modification methyltransferase // Gene. - 1990. - Vol. 87. - P. 113-118.

10. Akopian T.A., Lunin V.G., Kruglyak V.A., Ruchadze G.G., Bakhutashvili V.I., Naroditsky B.S., Tichonenko T.I. Nucleotide sequence of the cDNA for porcine rotavirus VP7 gene (strain K) // Virus Genes. - 1992. - Vol. 6. - P. 393-396.

11. Karyagina A.S., Lunin V.G.. Degtyarenko K.N., Uvarov V.Y., Nikolskaya I.I. Analysis of the nucleotide and derived amino acid sequences of the SjoI restriction endonuclease and methyltransferase//Gene. - 1993.-Vol. I24.-P. 13-19.

12. Карпова C.K., Сазина E.T., Бадер Л.Б., Сергиенко О.В., Ходун М.Л., Кривцов В.Ф., Лунин В.Г.. Тихоненко Т.И., Панков Ю.А. Генетическая инженерия в бактериальном синтезе соматостатина // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. - 1994. - № 12. - С. 24-29.

13. Karyagina A.S., Lunin V.G.. Levtchenko I.Ya., Labbe D„ Brousseau R„ Lau P.C.K., Nikolskaya I.I. The SsoII and NlaX DNA methyltransferases: overproduction and functional analysis // Gene. - 1995. - Vol. 157 - P. 93-96.

14. Ларашина E.B., Сердобинский Л.А., Калле Е.Г., Лаврова Н.В., Аветисов В.А., Лунин В.Г.. Народицкий Б.С. Получение трансгенных растений рапса и томата, экспрессирующих ген дефензина редьки // Физиология растений. - 2000. -Т. 47.-С. 471.

15. Demchinskaya A.V., Shilov I.A., Karyagina A.S., Lunin V.G.. Sergienko O.V., Voronina O.L., Leiser M., Plobner L. A new approach for point mutation detection based on a ligase chain reaction H J Biochem Biophys Methods. - 2001. - Vol. 50,- P. 79-89.

16. Чалов С.E., Воронина О.Л., Сергиенко О.В., Лунин В.Г. Термостабильная ДНК-полимераза из термофильного микроорганизма archaeon Arcliaeoglobus fulgidas VC 16 и её свойства // Биохимия. - 2002. - Т. 67. - С. 366-374.

17. Чалов С.Е., Воронина О.Л., Сергиенко О.В., Лунин В.Г. Термостабильная ДНК-полимераза из archaeon Archaeoglobus fiilgidus // Доклады Академии Наук. -2002. - Т. 382.-С. 707-709.

18. Yakimovich O.Yu., Alekseev Ya.I., Voronina O.L.. Kolobova O.B., Anisimova S.S., Lunin V.G. Hot-start polymerase chain reaction using a DNA-ligand // Biotechnology in Russia. - 2002. - № 6. - C. 86-89.

19. розенкранц A.A., Лунин В.Г.. Сергиенко O.B., Гилязова Д.Г., Шумянцева М.А., Воронина О.Л., Янс Д.Э., Кофнер A.A., Миронов А.Ф., Соболев A.C. Направленная внутриклеточная доставка локально действующих лекарств: Специфическая доставка фотосенсибилизаторов в ядра клеток меланомы // Генетика. - 2003. - № 39. - С. 259-268.

20. Zhuravleva Yu.N., Lugovtsev V.Yu., Voronina O.L., Shilov I.A., Vaniusheva O.V., Lunin V.G.. Naumova M.A., Mamaeva T.A., Tikhonova N.T. Genetic analysis of wild measles virus strains isolated in the european part of the Russian Federation // Vopr Virusol. - 2003. - Vol. 48. - P. 29-35.

21. Гудим E.A., Агапов И.И., Лунин В.Г.. Комолов И.С. Клонирование и экспрессия белка NS3 вируса гепатита С // Биотехнология. - 2004. - № 5. - С. 8086.

22. Анисимова С.С., Корнеева И.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г.. Аветисов В.А. Создание многокомпонентного химерного белка для повышения эффективности трансформации томатов на основе природного опыления-оплодотворения // Биотехнология. - 2005. - № 3. - С. 35-41.

23. Анисимова С.С., Сергиенко О.В., Ванюшева О.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г. Влияние рекомбинантного белка TTRECA на специфичность, эффективность и точность ТАО ДНК-полимеразы в ПЦР // Биотехнология. - 2005. - № 3. - С. 90-96.

24. Артеменко Е.О., Гилязова Д.Г., Розенкранц A.A., Лунин В.Г.. Сергиенко О.В., Тимофеев К.Н., Грин М.А., Миронов А.Ф., Рубин А.Б., Соболев A.C. Влияние присоединения бактериохлорина р к модульным рекомбинантным транспортерам для направленной внутриклеточной доставки на эффективность его фотодинамического действия // Молекулярная медицина. - 2005. - № 3. - С. 43-47.

25. Васекина A.B., Ершов П.В., Решетова О.С., Тихонова Т.В., Лунин В.Г.. Трофимова М.С., Бабаков A.B. Вакуолярный Иа+/Н+_антипортер ячменя: идентификация и реакция на солевой стресс // Биохимия. - 2005. - Т. 70. - С. 123— 132.

26. Дмитренко O.A., Шагинян И.А., Прохоров В.Я., Матвеев С.М., Аляпкина Ю.С., Ванюшева О.В., Шилов И.А., Лунин В.Г.. Гинцбург A.JI. Исследование полиморфизма коагулазного гена методом секвенирования у метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах различных регионов России и Беларуси // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005. - № 3. - С. 27-32.

27. Кузьмина Н.С., Яковлева И.В., Свиридов В.В., Зубков A.B., Кузнецова Г.И., Кириллова Г.А., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Буркин М.А., Летаров A.B., Лаврова Н.В., Рязанова Е.М. Моноклональные антитела к человеческой пероксидазе щитовидной железы // Биотехнология. - 2005. - № 1. - С. 51-58.

28. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G, Sergienko O.V., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Sobolev A.S. Recombinant modular transporters on the basis of epidermal growth factor for targeted intracellular delivery of photosensitizers // Proc. SPIE. - 2005. - Vol. 5973. - P.101-110.

29. Ершова A.C., Лаврова H.B., Тихонова T.B., Кузнецова А.Ю., Мостовенко Е.В., Алексеевский A.B., Лунин В.Г.. Карягина A.C. Разработка модификации метода SELEX и ее использование для определения нуклеотидных последовательностей, узнаваемых гомеодоменом Antennapedia // Доклады РАСХН. -2006.-№5.-С. 5-9.

30. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G., Sergienko O.V., Khramtsov Y.V., Timofeyev K.N., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Georgiev G.P., Sobolev A.S. Targeting cancer cells by novel engineered modular transporters // Cancer Res. - 2006. - Vol. 66. - P. 10534-10540.

31. Гудов В.П., Алексеев Я.И., Варламов Д.А., Лунин В.Г., Харченко П.Н. Разработка подхода эффективного планирования флуоресцентно-меченых зондов для ПЦР в реальном времени // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2007. - № 6. - С. 7-11.

32. Насонова Д.С., Раскатов В.А., Лунин В.Г. Оценка переноса генов при выращивание трансгенных растений сои // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. - 2007. - № 2. - с. 136-138.

33. Семененко Т.А., Лунин В.Г., Гинцбург А.Л. Банк сывороток крови как компонент системы биологической безопасности // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - Ks 4. - С. 73-78.

34. Тартаковский И.С., Гинцбург А.Л., Михайлова Д.О., Бобылева З.Д., Романенко В.В., Карпова Т.И., Аляпкина Ю.С., Омон Е.П., Романова Ю.М., Воронина О.Л., Лунин В.Г.. Яцишина С.Б., Шипулин Г.А. Применение стандартов лабораторной диагностики легионеллеза во время эпидемической вспышки пневмоний в городе Верхняя Пышма Свердловской области // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2007. - Т.9. - С. 361-368

35. Харченко В.П., Кулинич Т.М., Лунин В.Г.. Филясова Е.И., Шишкин A.M., Сергеенко О.В., Рязанова Е.М., Воронина О.Л., Боженко В.К. Цитотоксические свойства химерных пептидов, содержащих активные центры ингибиторов циклиновых киназ // Вопросы онкологии. - 2007. - Т. 53. - С. 448452.

36. Воронина О.Л., Лунин В.Г. Молекулярно-генетическое типирование Legionella pneumophila серогруппы 1, выделенных в г. Верхняя Пышма, с использованием международных стандартов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - № 2. - С. 20-23.

37. Воронина O.JI., Кунда М.С., Лунин В.Г., Карпова Т.И., Тартаковский И.С. Молекулярно-генетическое типирование штаммов Legionella pneumophila и Legionella spp., выделенных на территории Российской федерации // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2008. - Т. 10. - С. 154-162.

38. Грачева М.А., Попадьин П.В., Евстифеев В.В., Галушкина З.М., Полетаева H.H., Верховская Л.В., Лунин В.Г.. Швец В.И. Экспрессия в Escherichia coli А- и В-субьединиц рицина в составе химерных белков с целлюлозосвязывающим доменом и их одностадийная аффинная очистка на целлюлозе // Вопр. биол., мед. и фармацевт, химии. - 2008. - № 3. - С. 50-56.

39. Горская Ю.Ф., Данилова Т.А., Лунин В.Г.. Грабко В. И., Шарапова Н.Е., Нестеренко В.Г. Влияние сыворотки крови мышей, иммунизированных антигенами стрептококка группы Л, на эффективность клонирования стромальных клеток-предшественников in vitro II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008.-T. 146.-С. 663-666.

40. Гришин Д.В., Гудов В.П., Сергиенко О.В., Лунин В.Г.. Харченко П.Н. Получение белковой векторной конструкции, включающей ДНК-связывающий домен SSBTNE и сигнал ядерной локализации V1RD2 // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2008. - № 5. - С. 38-41.

41. Романова Ю.М., Томова A.C., Шингарова Л.Н., Лунин В.Г.. Карягина A.C., Лупу И.П., Гинцбург А.Л. Механизм взаимодействия фактора некроза опухолей (ФНОа) макроорганизма с клетками Salmonella enterica (ser. Typhimurium) II Молекул, генетика. - 2008. - T. 4. - С. 18-22.

42. Rosenkranz A.A, Vaidyanathan G., Pozzi O.R., Lunin V.G.. Zalutsky M.R., Sobolev A.S. Engineered modular recombinant transporters: application of new platform for targeted radiotherapeutic agents to alpha-particle emitting 211 // International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. - 2008. - Vol. 72. - P. 193-200.

43. Гудов В.П., Лунин В.Г., Швец В.И. Создание модифицированных сорбентов для твердофазного синтеза зондов для ПЦР в реальном масштабе времени II Вестник МИТХ'Г им. М.В. Ломоносова. - 2009. - Т. 4. - С. 25-30.

44. Зайцев В.В., Карягина A.C., Лунин В.Г. Костные морфогенетические белки (BMP): общая характеристика, перспективы клинического применения в травматологии и ортопедии // Вестник травматологии и ортопедии им. H.H. Приорова. - 2009. - № 4. - С. 79-84.

45. Лунин В.Г., Шарапова Н.Е., Тихонова Т.В., Полетаева H.H., Галушкина З.М., Аксенова Е.И., Грабко В.И., Великодворская Г.А., Лаврова Н.В., Ананьина Ю.В. и др. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного целлюлозосвязывающего домена Anaerocellum thermophilum in vitro П Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009. - № 1. - С. 21-26.

46. Семихин A.C., Лящук A.M., Мезенцева М.В., Трегубова М.И., Сергиенко О.В., Полетаева H.H., Народицкий Б.С., Карягина A.C., Лунин В.Г., Гинцбург А.Л. Получение рекомбинантного интерферона-ß человека на основе технологии аффинных доменов //Молекул, генетика. - 2009. - № 4. - С. 38-41.

47. Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Полетаева H.H., Лаврова Н.В., Аксенова Е.И., Семихин A.C., Карягина A.C., Лунин В.Г. Получение и характеристика коллаген-связывающих доменов из факторов фон Виллебранда (vWF) человека // Молекул, генетика. - 2009. - № 1. - С. 31-35.

48. Владимирский М.А., Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Шипина Л.К., Аксенова Е. И., Сергиенко О.В., Ляшук A.M., Неретина Т.В., Карягина A.C., Лунин

В.Г., Ефремов Е.Е., Игнашенкова Г.В., Власик Т.Н., Янушевская Е.В., Каширина Н.М. Разработка и применение отечественной тест-системы диагностики туберкулезного инфицирования на основе количественного анализа индукции интерферона-гамма в образцах цельной крови in vitro с использованием специфических рекомбинантных антигенов // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2010. - №2. - С. 49-53.

49. Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Полетаева Н.Н., Тухватуллин А.Э., Семихин А.С., Громов А.В., Соболева JI.A., Ершова А.С., Зайцев В.В., Сергеенко О.В., Лунин В.Г., Карягина А.С. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo II Молекулярная биология. - 2010. - Т44. - С. 1036-1044.

50. Velikodvorskaya G.A., Tikhonova T.V., Gurvits I.D., Karyagina A.S., Lavrova N.V., Sergienko O.V., Tashlitskii V.N., Lunina N.A. and Lunin V.G. Chimeric lactase capable of spontaneous and strong immobilization on cellulose and developmrnt of continuous-flow system for lactose hydrolysis at high temperatures. Applied and Environmental Microbiology. - 2010. - V.76. Published online ahead of print on 8 October 2010.

51. Глушков A.H., Апалько C.B., Филипенко М.Л., Матвеева В.А., Бакулина А.Ю., Лунин В.Г.. Костянко М.В. Новый подход к созданию антиканцерогенных вакцин // Acta Naturae. - 2010. - Т.2. - С. 51-57.

Патенты и авторские свидетельства:

52. Калинин В.Н., Лапаева И.А., Лунин В.Г.. Золотова О.М., Тихоненко Т.И. А.С 1040794 МКИ C12N15/00, C12N9/22. Штамм Bordenella bronchiseptica-ЛШ -продуцент сайт-специфической эндонуклеазы. - №3385723/28-13, заявлено 11.01.82, опубликовано 05.30.1985 Открытия, изобретения №20. - С. 242.

53. Дебов С.С., Карягина А.С., Лунин В.Г., Лопатина Н.Г., Грубер И.М., Поляченко В.М., Никольская-Санович И.И. А.с. 1539205 от 1 октября 1989 г МКИ C12N15/00 Рекомбинантная плазмида d33, кодирующая синтез метилазы SsoII и штамм Е. coli В834, несущий плазмиду d33 - продуцент метилазы SsoII. (заявка №4394464 от 18 марта 1988 г.). опубл. 01.30.1990. Бюл. № 4. -С.72.

54. Дебов С.С., Карягина А.С., Лунин В.Г.. Лопатина Н.Г., Грубер И.М., Поляченко В.М., Никольская-Санович И.И. А.с 1532585 от 1 сентября 1989 г. МКИ C12N15/00 Рекомбинантная плазмида d24, кодирующая синтез рестриктазы и метилазы SsoII и штамм Е. coli В834, несущий плазмиду d24 - продуцент рестриктазы и метилазы SsoII. (заявка №4394643 от 18 марта 1988 г.). опубл. 30.12.89 Бюл. № 48. - С.161.

55. Лунин В.Г.. Сергиенко О.В,. Ходун М.-В. Л., Бадер Л. Б., Карпов В. А., Тихоненко Т. И. Пат. RU 2031121 С1 РФ, МПК6 C12N15/12, C12N15/70, C12N1/21. Способ получения рекомбинантных плазмидных pC(Sp)n, кодирующих химерный белок с последовательностью соматостатина-14; рекомбинантная плазмидная ДНК pC(Sp)4, кодирующая часть гена хлорамфениколацетилтрансферазы, тетрамерный спейсер и соматостатин-14; штамм бактерий Escherichia coli - продуцент химерного белка с последовательностью соматостатина-14; полипептид / - № 93031156/13; заявлено 22.06.93, опубл. 20.03.95. Бюл. № 8. - С.136.

56. Лунин В.Г.. Сергиенко О.В., Ходун М.-В., Бадер Л.Б., Карпов В.А., Тихоненко Т.И. Пат. RU 2031121 С1 РФ, МПК6 C12N15/12, C12N15/70, C12N1/21. Способ получения реомбинантных плазмидных pC(Sp)n, кодирующих химерный

белок с последовательностью соматостатина-14; рекомбинантная плазмидная ДНК pC(Sp)4, кодирующая часть гена хлорамфениколацетилтрансферазы, тетрамерный сиейсер и соматостатин-14; штамм бактерий Escherichia coli - продуцент химерного белка с последовательностью соматостатина-14; полипептид / - № 93031156/13; заявлено 22.06.93, опубл. 20.03.95. Бюл. № 8.

57. Лунин В.Г.. Сергиенко О.В., Ходун М.-В.Л., Бадер Л.Б., Тихоленко Т.И. Пат. RU 2034457 С1 РФ, МПК6 А01К67/02, А61К39/385, C12N15/16. Способ повышения продуктивности сельскохозяйственных животных и препарат для его осуществления /- № 93031157/13; заявлено 22.06.93, опубл. 10.05.95. Бюл. № 13. -С.108.

58. Народицкий Б.С., Лунин В.Г.. Анисимова С.С., Сердобинский Л.А., Лаврова Н.В., Ковалева М.В. Пат. RU 2176669 С1 РФ, МПК7 C12N15/29, C12N15/82. Ген rs-ap из Raphanus saiivus, вектор для трансформации растений и способ получения трансгенного растения / - № 2000124582/13; заявлено 28.09.00, опубл. 10.12.01. Бюл. № 34 (И ч.) - С.271.

59. Лунин В.Г., Тимофеева Т.В., Сучков А.В. Пат. RU 2207374 С1 РФ, МПК7 C12N15/51, C12N15/81, A6IK39/29, C12N1/19. Рекомбинантная плазмида, кодирующая поверхностный антиген (HBSAg) вируса гепатита В, ее получение и штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент поверхностного антигена (HBSAG) вируса гепатита В / - № 2002112447/14; заявлено 14.05.02, опубл. 27.06.03. Бюл. №18(IV ч). - С. 860.

60. Lunin V.G., Sergienko O.V., Khodin M.-V.L., Bader L.B., Karpov V.A., Tikhonenko T.I. United States Patent. 6,316,004 МПК A61K38/31, A61K39/385, C12P21/02, C07K14/655. November 13, 2001. Chimeric somatostatin containing protein and encoding DNA, plasmids of expression, method for preparing chimeric protein, strain-producers, immunogenic composition, method for increasing the productivity of farm animals - № 264042; заявлено 22.06.94. Изобретения стран мира №21/2002, выпуск 008, С. 69.

61. Лунин В.Г.. Сергиенко О.В., Воронина О.Л., Рязанова Е.М., Розенкранц А.А., Соболев А.С. Пат. RU 2265055 С2 РФ, МПК7 C12N15/62, C12N15/70, C12N1/21, С07К19/00, А61К41/00, А61К47/42, C12N1/21, C12R1:19. Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая модульный полипептид для доставки фотосенсибилизатора, и штамм Escherichia coli ВКПМ В-8356 - продуцент модульного полипептида / - № 2004100070/13; заявлено 05.01.04; опубл. 27.11.05, Бюл. №33(1 ч.). - С. 181.

62. Великодворская Г.А., Зверлов В.В., Карягина-Жулина А.С., Лаврова Н.В., Лунин В.Г., Лунина Н.А., Рязанова Е.М., Сергиенко О.В., Тихонова Т.В. Пат. RU №2278160 С2 РФ, МПК C12N9/38 (2006.01), C12N15/56 (2006.01), C12N15/72 (2006.01), C12N1/21 (2006.01), C12N11/12 (2006.01), С12Р19/00 (2006.01), C12R1/19 (2006.01). Рекомбинантный белок LACspCBD, обладающий бета-галактозидазной активностью и способностью самопроизвольно связываться с целлюлозоеодержащим сорбентами, рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез рекомбинантного белка LACspCBD, штамм Escherichia coli M15[pREP4, LACspCBD] - продуцент рекомбинатного белка LACspCBD, способ получения иммобилизованного рекомбинантного белка LACspCBD на целлюлозе и способ ферментативного расщепления лактозы / - № 2004110981/13 ; заявлено 13.04.04; опубл. 20.06.06, Бюл. № 17(11 ч.) - С.368.

63. Гинцбург A.JI., Карягина-Жулина A.C., Кормилицина М.И., Лаврова Н.В., Лящук A.M., Лунин В.Г.. Мещерякова И.С., Народицкий Б.С., Родионова И.В., Сергиенко О.В., Шмаров М.В. Пат. RU №2270249 С1 РФ, МПК C12N15/U (2006.01), C12N1/21 (2006.01), С07К19/00 (2006.01), С12Р21/00 (2006.01). Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез рекомбинантного белка TUL4spCBD, штамм Escherichia coli M15[pREP4, pTUL4spCBD] - продуцент рекомбинатного белка TUL4spCBD, рекомбинантный белок TUL4spCBD и способ его получения, способ получения специфических антител к белку TUL4spCBD / -№ 2004135849/13; заявлено 20.02.06; опубл. 20.02.06, Бюл. № 5(11 ч). - С. 399.

64. Аксенова E.H., Лунин В.Г.. Галушкина З.М., Полетаева H.H., Грабко В.И., Гинцбург А.Л. Пат. RU №2378371 С1 РФ, МПК C12N1/21 (2006.01), C12N15/00 (2006.01). Рекомбинантная плазмида (варианты), штамм Escherichia coli (варианты) - продуцент химерных белков, химерный белок (варианты), способ иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантных белков на целлюлозе, способ иммобилизации рекомбинантных белков на полистирольных носителях / - № 2008145612/13; заявлено 19.11.08; опубл. 10.01.10, Бюл. № 1 (III ч.)

- С.713—714.

65. Шарапова Н.Е., Лунин В.Г.. Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. Пат. RU № 2401302 С2 РФ, МПК C12N 15/00 (2006.01) Рекомбинантная плазмида pDlspGBD, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка D1-GBD, рекомбинантный белок D1-GBD и способ его получения, способ исследования связывания белка D1-GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D1-GBD / - № 2008146597/13; заявлено 26.11.08; опубл. 10.10.2010 Бюл. № 28.

66. Шарапова Н.Е., Лунин В.Г., Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. Пат. RU № 2401305 С2 РФ, МПК C12N15/70 (2006.01), C12N1/21 (2006.01), С12Р21/00 (2006.01), GO I N33/53 (2006.01) Рекомбинантная плазмида pD4spGBD, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка D4—GBD, рекомбинантный белок D4-GBD и способ его получения, способ исследования связывания белка D4-GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D4-GBD / - № 2008146598/13; заявлено 26.11.08; опубл. 10.10.2010 Бюл. № 28.

67. Шарапова Н.Е., Лунин В.Г.. Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. Пат. RU № 2401304 С2 РФ, МПК C12N15/70 (2006.01), C12N1/21 (2006.01), С12Р21/00 (2006.01), С12Р21/08 (2006.01), G01N33/53 (2006.01) Рекомбинантная плазмида pD5spGBD, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка D5-GBD, рекомбинантный белок D5-GBD и способ его получения, способ исследования связывания белка D5-GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D5-GBD / - № 2008146599/13; заявлено 26.11.08; опубл. 10.10.2010 Бюл. № 28.

Заявка на патент с положительным решением Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам:

1. Котнова А.П., Шарапова Н.Е., Лунин В.Г.. Карягина-Жулина A.C., Сергиенко О.В., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Гинцбург А.Л. Рекомбинантный белок Collbd-CBD, рекомбинантная плазмида pOC-Collbd, штамм Escherichia coli

- продуцент рекомбинантного белка Collbd-CBD, способ получения рекомбинантного белка Collbd-CBD. Заявка № 2009144489 от 02.12.2009.

Подписано в печать 15.12.2010 г.

Формат 60/84 1x16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. п. л. 3,5. Тираж 100 экз. Заказ № П- 365

Типография «Телер» 125130, Москва, ул. Клары Цеткин д.ЗЗ кор.50 Тел.: (495) 937-8664

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Лунин, Владимир Глебович

выводы

1. Разработана система научно-обоснованных технологических решений, имеющих приоритетное значение для современной сельскохозяйственной и медицинской- биотехнологии, а также нанобиотехнологии. Основу этой системы составляют: способ направленной контролируемой полимеризации и сборки генно-инженерных конструкций, обеспечивающих синтез белков с повторяющимися последовательностями или мультидоменных белков с заданными свойствами, а также технология аффинной самосборки рекомбинантных белков на полисахаридных и других матрицах, обеспечивающая высокоэффективную одностадийную очистку, рефолдинг и специфическую сорбцию целевых белков. Практическая реализация данных технологических решений привела к созданию эффективных биологически активных препаратов на основе рекомбинантных белков.

3. На основе микробиологического синтеза создан высокоэффективный препарат — стимулятор роста сельскохозяйственных животных IV поколения «САТ-С ом», основанный на принципах, аутоиммунной коррекции ингибитора роста-животных соматостатина.

4. Проклонированы новые гены белков бактерий и эукариот, кодирующие аффинные домены с уникальными свойствами (высокая термостабильность, специфичность, высокая константа связывания, по параметрам приближающаяся к ковалентному взаимодействию).

7. Получен двухкомпонентный белок, обладающий способностью к аффинной сорбции на целлюлозе и ферментативной активностью термо стабильной р-галактозидазы. На основе этого гибридного белка создан проточный реактор, позволяющий проводить эффективный ферментативный гидролиз лактозы на глюкозу и галактозу. Данный подход может использоваться в пищевой промышленности для получения безлактозного молока и утилизации подсырной и творожной сывороток.

Экспериментальные работы проводились на базе ГНУ ВНИИСБ Россельхозакадемии и ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России при участии О.В. Сергиенко, M.-B.JI. Ходуна, Т.В. Тихоновой, A.C. Карягиной-Жулиной, М.А. Грачевой, З.М. Галушкиной, Е.М. Рязановой, Н.В.Лавровой, H.H. Полетаевой, A.M. Лящука, О.Л. Ворониной, проф. И.С. Мещеряковой, E.H. Аксеновой, Н.Е. Шараповой, проф. Ю.В. Ананьиной, A.C. Семихина, A.M. Лящука, А.П. Котновой, Д.Ю. Логунова, А.И. Тухватулина, М.В. Мезенцевой и других сотрудников.

Работы по оценке функциональности доменов мультидоменных белков-нанотранспортеров выполнялись на базе Института биологии гена РАН под руководством проф. A.C. Соболева совместно с A.A. Розенкранцем, П.В. Гулаком, Д.Г. Гилязовой, Ю.В. Храмцовым и другими сотрудниками лаборатории; работы с использованием атомно-силовой микроскопии — совместно с сотрудниками НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова Ю.Н. Антоненко и Т.И. Рокицкой.

В работах по созданию препаратов соматостатина принимали участие сотрудники Института экспериментальной эндокринологии ЭНЦ РАМН Е.Т. Сазина и С.К. Карпова, в работах по исследованию свойств гибридных белков на основе термостабильной бета-галактозидазы — сотрудники Института молекулярной генетики РАН проф. Г.А.Великодворская, Н.А.Лунина и сотрудник НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова В.Н.Ташлицкий.

49 диссертации, а также руководству институтов и лабораторий, предоставивших возможность для проведения исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных рецензируемых журналах:

1. Калинин В.Н., Лапаева И.А., Лунин В.Г., Скрипкин Е.А., Смирнов'В.Д. Выделение эндонуклеазы рестрикции с //^¿////-специфичностью из Bordetella bronchiseptica II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1986. -№4.-С. 16-19.

2. Карягина А.С., Лунин В.Г., Никольская И.И., Дебов С.С. Функциональная характеристика плазмид штамма S. sonnei 47 // Молекулярная генетика. - 1986. - № 10. - С. 16-21.

3. Grabko V.I., Lunin V.G., Naroditsky B.S., Khilko S.N., Tickhonenko T.I., Makhov A.M., Karpova O.V. Study of avian adenovirus DNA infectivity in chick embryos // Acta Virol. - 1987. - Vol. 31. - P. 97-102.

4. Карягина A.C., Лунин В: Г., Грубер И.И., Поляченко В.М., Никольская И.И., Дебов С.С. Активность рестрикционной эндонуклеазы &о11 в штаммах Escherichia coli, трансформированных плазмидами Shigella sonnei 47" // Молекулярная генетика. - 1987. - № 12. - С. 26-29.

5. Rivkina М.В., Lunin V.G., Mahov A.M., Tikchonenko T.I., Kukain R.A. Nucleotide sequence of integrated,hepatitis В virus DNA and human flanking regions in the genome of the PLC/PRF/5 cell line // Gene. - 1988. - Vol. 64. - P. 285-296:

6. Карпов B.A., Лунин В.Г., Тихоненко Т.И. Фазированный полилинкер для' клонирования и экспрессии генов // Молекулярная генетика, микробиология- и вирусология. - 1989. - № 9. - С. 28-33.

7. Сергиенко О.В., Лунин В .Г., Тихоненко Т.И. Полимеризация фрагментов ДНК, кодирующих эпитопы поверхностных антигенов вируса гепатита В, в клетках Escherichia coli II Молекулярная,'генетика, микробиология'и вирусология. — 1989-№ 10.-С. 24-29.

8. Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Смирнов В.Д., Тихоненко Т.И. Синтез и. экспрессия фрагментов ДНК, кодирующих эпитопы поверхностных антигенов• вируса гепатита В, клетками Escherichia coli // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1989. - № 9. - С. 39-42.

9. Karyagina A.S., Lunin V.G., Nikolskaya I.I. Characterization of the genetic determinants of SsoII-restriction endonuclease and modification methyltransferase // Gene. - 1990.-Vol. 87.-P. 113-118.

10. Akopian T.A., Lunin V.G. Kruglyak V.A., Ruchadze G.G., Bakhutashvili V.I., Naroditsky B.S., Tichonenko T.I. Nucleotide sequence of the cDNA for porcine rotavirus VP7 gene (strain K) // Virus Genes. - 1992. - Vol. 6. - P. 393-396.

11. Karyagina A.S., Lunin V.G. Degtyarenko K.N., Uvarov V.Y., Nikolskaya I.I. Analysis of the nucleotide and derived amino acid sequences of the Ssol restriction endonuclease and methyltransferase // Gene. - 1993. -Vol. 124. - P. 13-19.

12. Карпова C.K., Сазина E.T., Бадер Л.Б., Сергиенко О.В., Ходун М.Л., Кривцов В.Ф., Лунин В.Г. Тихоненко Т.И., Панков Ю.А. Генетическая инженерия в бактериальном синтезе соматостатина // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. - 1994. -№12. - С. 24-29:

13. Karyagina A.S., Lunin V.G. Levtchenko I.Ya., Labbe D., Brousseau R., Lau P.C.K., Nikolskaya I.I. The &0II and NlaX DNA methyltransferases: overproduction and functional analysis // Gene. - 1995. - Vol. 157 -P. 93-96.

14. Парашина E.B., Сердобинский Л.А., Калле Е.Г., Лаврова Н.В., Аветисов В.А., Лунин В .Г. Народицкий Б.С. Получение трансгенных растений рапса и томата, экспрессирующих ген дефензина-редьки // Физиология растений. - 2000. -Т. 47.-С. 471.

15. Demchinskaya A.V., Shilov I.A., Karyagina A.S., Lunin V.G., Sergienko O.V., Voronina O.L., Leiser M., Plobner L. A new approach for point mutation detection based on a ligase chain reaction // J Biochem Biophys Methods. - 2001. - Vol. 50 - P. 79-89.

16. Чалов C.E., Воронина О.Л., Сергиенко O.B., Лунин В.Г. Термостабильная ДНК-полимераза из термофильного микроорганизма archaeon Archaeoglobus fulgidus VC16 и её свойства // Биохимия. - 2002. - Т. 67. - С. 366-374.

17. Чалов С.Е., Воронина О.Л., Сергиенко О.В., Лунин В .Г. Термостабильная ДНК-полимераза из archaeon Archaeoglobus fulgidus II Доклады Академии Наук. -2002. - Т. 382.-С. 707-709.

18. Yakimovich O.Yu., Alekseev Ya.I., Voronina O.L., Kolobova O.B., Anisimova S.S., Lunin V.G. Hot-start polymerase chain reaction using a DNA-ligand // Biotechnology in Russia. -2002. -№ 6. - C. 86-89.

19. Розенкранц A.A., Лунин В.Г., Сергиенко O.B., Гилязова Д.Г., Шумянцева М.А., Воронина О.Л., Янс Д.Э., Кофнер А.А., Миронов А.Ф., Соболев А.С. Направленная внутриклеточная доставка локально действующих лекарств: Специфическая доставка фотосенсибилизаторов в ядра клеток меланомы // Генетика. - 2003. - № 39. - С. 259-268.

20. Zhuravleva Yu.N., Lugovtsev V.Yu., Voronina O.L., Shilov I.A., Vaniusheva O.V., Lunin V.G. Naumova MA., Mamaeva T.A., Tikhonova N.T. Genetic analysis of wild measles virus strains isolated in the european part of the Russian Federation // Vopr Virusol. - 2003. - Vol. 48. - P. 29-35.

21. Гудим E.A., Агапов И.И., Лунин ВТ., Комолов И.С. Клонирование и экспрессия белка NS3 вируса гепатита С // Биотехнология. - 2004. - № 5. - С. 8086.

22. Анисимова С.С., Корнеева И.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Аветисов В. А. Создание многокомпонентного химерного белка для повышения эффективности трансформации томатов на основе природного опыления-оплодотворения // Биотехнология. - 2005. - № 3. - С. 35-41.

24. Артеменко Е.О., Гилязова Д.Г., Розенкранц А.А., Лунин В .Г., Сергиенко О.В., Тимофеев К.Н., Грин М.А., Миронов А.Ф., Рубин А.Б., Соболев А.С. Влияние присоединения бактериохлорина р к модульным рекомбинантным транспортерам для направленной внутриклеточной доставки на эффективность его фотодинамического действия // Молекулярная медицина. - 2005. - № 3. - С. 43-47.

25. Васекина А.В., Ершов П.В., Решетова О.С., Тихонова Т.В., Лунин В .Г., Трофимова М.С., Бабаков А.В. Вакуолярный 1Ча+/Н+антипортер ячменя: идентификация и реакция на солевой стресс // Биохимия. - 2005. - Т. 70. — С. 123— 132.

26. Дмитренко O.A., Шагинян И.А., Прохоров В.Я., Матвеев С.М., Аляпкина Ю.С., Ванюшева О.В., Шилов И.А., Лунин В.Г. Гинцбург A.J1. Исследование полиморфизма коагулазного гена методом секвенирования у метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах различных регионов России и Беларуси // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005. - № 3. - С. 27-32.

28. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G. Sergienko O.V., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Sobolev A.S. Recombinant modular transporters on the basis of epidermal growth factor for targeted intracellular delivery of photosensitizers//Proc. SPIE.-2005.-Vol. 5973.-P. 101-110.

29. Ершова A.C., Лаврова H.B., Тихонова T.B., Кузнецова А.Ю., Мостовенко Е.В., Алексеевский A.B., Лунин В.Г., Карягина A.C. Разработка модификации метода SELEX и ее использование для определения нуклеотидных последовательностей, узнаваемых гомеодоменом. Antennapediа // Доклады РАСХН. -2006.-№5.-С. 5-9:

31. Гудов В.П., Алексеев Я.И., Варламов Д.А., Лунин В.Г., Харченко П.Н. Разработка подхода эффективного планирования флуоресцентно-меченых зондов^ для- ПЦР Bi реальном времени* // Доклады* Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2007. - № 6. - С. 7-11.

32. Насонова Д.С., Раскатов' В.А., Лунин, В .Г. Оценка переноса генов- при выращивание трансгенных растений сои // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. - 2007. - № 2. - с. 136-138.

33. Семененко Т. А., Лунин В .Г., Гинцбург А. Л. Банк сывороток, крови как компонент системы^ биологической безопасности // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. -№ 4. - С. 73-78.

34. Тартаковский И.С., Гинцбург А.Л., Михайлова Д.О., Бобылева З.Д., Романенко В.В., Карпова Т.И., Аляпкина Ю.С., Омон' Е.П., Романова Ю.М., Воронина О .Л., Лунин В.Г., Яцишина С.Б., Шипулин Г.А. Применение стандартов лабораторной диагностики легионеллеза во время эпидемической вспышки' пневмоний в городе Верхняя Пышма Свердловской области // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2007. — Т.9. — С. 361-368

35. Харченко В.П., Кулинич Т.М., Лунин В.Г. Филясова Е.И., Шишкин A.M., Сергеенко О.В., Рязанова Е.М., Воронина О.Л., Боженко В.К. Цитотоксические свойства химерных пептидов, содержащих активные центры ингибиторов циклиновых киназ // Вопросы онкологии. - 2007. - Т. 53. - С. 448452.

37. Воронина О.Л., Кунда М.С., Лунин В .Г. Карпова Т.И., Тартаковский И.С. Молекулярно-генетическое типирование штаммов Legionella pneumophila и Legionella spp., выделенных на территории Российской федерации // Клиническая микробиология и антимикробная:химиотерапия: - 2008. - Т. 10.-С. 154-162.

38. Грачева М.А., Попадьин, П.В., Евстифеев В.В., Галушкина. З.М., Полетаева H.H., Верховская Л.В., Лунин В .Г., Швец В.И. Экспрессия^в Escherichia coli А- и В-субъединиц рицина в составе химерных белков с целлюлозосвязывающим доменом и их одностадийная аффинная; очистка на целлюлозе // Вопр. биол., мед. и фармацевт, химии. - 2008. - № 3. - С. 50-56.

39. Горская Ю.Ф., Данилова Т.А., Лунин В.Г., Грабко В. И., Шарапова Н.Е., Нестеренко В.Г. Влияние сыворотки крови мышей, иммунизированных антигенами стрептококка группы Л, на эффективность клонирования стромальных клеток-предшественников m vitro И Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 146. - С. 663-666.

40. Гришин Д.В., Гудов В.П., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Харченко П.Н; Получение- белковой векторной конструкции, включающей ДНК—связывающий домен SSBTNE и сигнал ядерной локализации VIRD2 // Доклады Российской академии*сельскохозяйственных наук. - 2008. - № 5. - С. 38-41.

41. Романова Ю.М., Томова A.C., Шингарова Л.Н., Лунин В.Г., Карягина A.C., Лупу И.П, Гинцбург А.Л- Механизм взаимодействия: фактора некроза опухолей: (ФНОа) макроорганизма с клетками Salmonella enterica (ser. Typhimurium) // Молекул, генетика. - 2008: - T. 4. - С. 18-22.

42: Rosenkranz A.A, Vaidyanathan G., Pozzi O.R. Lunin V.G. Zalutskv MiR., Sobolev A.S: Engineered.modular recombinant transporters: applicationof new platform for targeted radiotherapeutic agents to alpha-particle emitting 211 // International* Journal: of Radiation Oncology Biology Physics. - 2008. - Vol. 72. - P. 193-200.

43. Гудов В.П., Лунин В.Г., Швец В.И. Создание модифицированных сорбентов1 для? твердофазного синтеза зондов для ПЦР в; реальном масштабе времени // Вестник МИТХТ им. М.В1 Ломоносова. - 2009; -Т. 4. - С. 25-30.

44. Зайцев В.В1, Карягина A.C., Лунин В.Г. Костные морфогенетические белки (BMP): общая-; характеристика; перспективы клинического применения в травматологии и ортопедии // Вестник травматологии; и- ортопедии им. H.H. Приорова. - 2009. - № 4. - С. 79-84.

45. Лунин В.Г. Шарапова U.E., Тихонова Т.В., Полетаева H.H., Галушкина З.М:, Аксенова Е.И., Грабко В.И., Великодворская Г.А., Лаврова Н.В., Ананьина Ю.В. и др. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного целлюлозосвязывающего домена Anaerocellum thermophilum in vitro II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009. - № 1. — С. 21-26.

46. Семихин A.C., Лящук A.M., Мезенцева М.В., Трегубова М.И1, Сергиенко О.В., Полетаева H.H., Народицкий Б.С., Карягина,A.C., Лунин В.Г., Гинцбург А.Л-Получение рекомбинантного интерферона-ß человека на основе технологии аффинных доменов // Молекул, генетика. - 2009: - № 4. — С. 38-41.

47. Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Полетаева H.H., Лаврова Н.В':, Аксенова Е.И., Семихин A.C., Карягина A.C., Лунин В.Г. Получение и характеристика коллаген-связывающих. доменов из факторов фон Виллебранда (vWF) человека // Молекул, генетика. - 2009. -№ 1. - С. 31-35.

48; Владимирский; М.А., Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Шипина Л.К., Аксенова Е. И., Сергиенко О.В;, Ляшук A.M., Неретина T.B 1, Карягина A.C., Лунин

В.Г^ Ефремов Е.Е., Игнашенкова Г.В., Власик Т.Н., Янушевская-Е.В., Каширина Н.М. Разработка и применение отечественной тест-системы диагностики туберкулезного инфицирования на основе количественного анализа индукции интерферона-гамма. в образцах цельной крови in vitro с использованием специфических рекомбинантных антигенов // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2010. - №2. - С. 49-53. % 49. Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Полетаева

Н.Н., Тухватуллин А.Э:, Семихин А.С., Громов А.В., Соболева Л.А., Ершова А.С., Зайцев В.В., Сергеенко О.В., Лунин В.Г., Карягина А.С. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo II t Молекулярная биология. - 2010. - Т44. - С. 1036-1044.

1 50. Velikodvorskaya G.A., Tikhonova T.V., Gurvits I.D., Karyagina A.S.,

Lavrova N.V., Sergienko O.V., Tashlitskii V.N., Lunina N.A. and Lunin V.G. Chimeric lactase capable of spontaneous and strong immobilization on cellulose and developmrnt of continuous-flow system for lactose hydrolysis at high temperatures. Applied1 and Environmental Microbiology. - 2010. - V.76. Published online ahead of print on 8 October 2010.

51. Глушков A.H., Апалько C.B., Филипенко М.Л., Матвеева В А., Бакулина А.Ю., Лунин В .Г. Костянко М1В. Новый подход к созданию антиканцерогенных вакцин // Acta Naturae. - 2010. - Т.2. - С. 51-57.

Патенты и авторские свидетельства:

52. Калинин В.Н., Лапаева И.А., Лунин В.Г., Золотова 0:М., Тихоненко Т.И. А.С 1040794 МКИ C12N15/00, C12N9/22. Штамм Bordenella bronchiseptica-A99A -продуцент сайт-специфической эндонуклеазы. - №3385723/28-13, заявлено 11.01.82, опубликовано 05.30.1985 Открытия, изобретения №20. - С. 242.

53. Дебов- С.С., Карягина А.С., Лунин- В.Г., Лопатина Н.Г., Грубер И.М., Поляченко В:М., Никольская-Санович-И.И. А.с.1539205 от 1 октября. 1989 г МКИ C12N15/00 Рекомбинантная плазмида d33, кодирующая синтез метилазы SsoII и штамм Е. coli В834, несущий плазмиду d33 - продуцент метилазы SsoII. (заявка №4394464 от 18 марта 1988 г.). опубл. 01.30.1990. Бюл. № 4. - С.72.

54. Дебов С.С., Карягина А.С., Лунин В.Г., Лопатина Н.Г.,' Грубер И.М., Поляченко В.М., Никольская-Санович И.И. А.с 1532585 от 1 сентября 1989 г. МКИ C12N15/00 Рекомбинантная плазмида d24, кодирующая синтез рестриктазьь и метилазы SsoII и штамм Е. coli В834, несущий плазмиду d24 - продуцент рестриктазы и метилазы SsoII. (заявка №4394643 от 18 марта 1988 г.). опубл. 30.12.89 Бюл. № 48. - С.161.

55. Лунин В.Г. Сергиенко О.В,. Ходун М.-В. Л., Бадер Л. Б., Карпов Вг. А., Тихоненко Т. И. Пат. RU 2031121 С1 РФ, МПК6 C12N15/12, C12N15/70, C12N1/21. Способ получения рекомбинантных плазмидных pC(Sp)n, кодирующих химерный белок с последовательностью соматостатина—14; рекомбинантная плазмидная ДНК pC(Sp)4, кодирующая часть гена хлорамфениколацетилтрансферазы, тетрамерный спейсер и соматостатин-14; штамм бактерий Escherichia coli - продуцент химерного белка с последовательностью соматостатина-14; полипептид / — № 93031156/13; заявлено 22.06.93, опубл. 20.03.95. Бюл. № 8: - С.136.

56. Лунин ВТ. Сергиенко О.В., Ходун М.-В., Бадер Л.Б., Карпов В.А., Тихоненко Т.И. Пат. RU 2031121 С1 РФ, МПК6 C12N15/12, C12N15/70, C12N1/21. Способ получения реомбинантных плазмидных pC(Sp)n, кодирующих химерный белок с последовательностью соматостатина-14; рекомбинантная плазмидная ДНК pC(Sp)4, кодирующая часть гена хлорамфениколацетилтрансферазы, тетрамерный спейсер и соматостатин-14; штамм бактерий Escherichia coli - продуцент химерного белка с последовательностью соматостатина-14; полипептид / - № 93031156/13; заявлено 22.06.93, опубл. 20.03.95. Бюл. № 8.

57. Лунин В.Г. Сергиенко О.В., Ходун М.-В.Л., Бадер Л.Б., Тихоненко Т.И. Пат. RU 2034457 С1 РФ; МПК6 А01К67/02, А61К39/385, C12N15/16. Способ повышения продуктивности сельскохозяйственных животных и препарат для его осуществления /- № 93031157/13; заявлено 22.06.93, опубл. 10.05.95. Бюл. № 13. -С. 108.

58. Народицкий Б.С., Лунин В .Г., Анисимова С.С., Сердобинский Л.А., Лаврова Н.В., Ковалева М.В. Пат. RU 2176669 С1 РФ, МПК7 C12N15/29, C12N15/82. Ген rs-ap из Raphanus sativus, вектор для трансформации растений и способ получения трансгенного растения / - № 2000124582/13; заявлено 28.09.00, опубл. 10.12.01. Бюл. № 34 (И ч.)- С.271.

59. Лунин В.Г. Тимофеева Т.В., Сучков A.B. Пат. RU 2207374 С1 РФ, МПК7 C12N15/51, C12N15/81, А61К39/29, C12N1/19. Рекомбинантная плазмида, кодирующая поверхностный антиген (HBSAg) вируса гепатита В, ее получение и штамм», дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент поверхностного антигена (HBSAG) вируса гепатита В / - № 2002112447/14; заявлено 14.05.02, опубл. 27.06.03. Бюл. №18(1Уч). - С. 860.

60. Lunin V.G. Sergienko O.V., Khodin M.-V.L., Bader L.B., Karpov V.A., Tikhonenko T.I. United States Patent. 6,316,004 МПК A61K38/31, A61K39/385, C12P21/02, C07K14/655. November 13, 2001. Chimeric somatostatin containing protein and encoding DNA, plasmids of expression, method for preparing chimeric protein, strain-producers, immunogenic composition, method for increasing the productivity of farm animals - № 264042; заявлено 22.06.94. Изобретения стран мира №21/2002, выпуск 008, С. 69.

61. Лунин В.Г. Сергиенко О.В., Воронина О.Л., Рязанова,Е.М., Розенкранц A.A., Соболев A.C. Пат. RU 2265055 С2 РФ; МПК7 C12N15/62, C12N15/70, C12N1/21, С07К19/00, А61К41/00, А61К47/42, C12N1/21, C12R1:19. Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая модульный полипептид для доставки фотосенсибилизатора, и штамм Escherichia coli ВКПМ В-8356 - продуцент модульного полипептида / - № 2004100070/13; заявлено 05.01.04; опубл. 27.11.05, Бюл. №33(1 ч.). - С. 181.

62. Великодворская Г.А., Зверлов В.В., Карягина-Жулина A.C., Лаврова Н.В., Лунин В.Г., Лунина H.A., Рязанова Е.М., Сергиенко О.В., Тихонова Т.В. Пат. RU №2278160 С2 РФ, МПК C12N9/38 (2006.01), C12N15/56 (2006.01), C12N15/72 (2006.01), C12N1/21 (2006.01), C12N11/12 (2006.01), С12Р19/00 (2006.01), C12R1/19 (2006.01). Рекомбинантный белок LACspCBD, обладающий бета-галактозидазной активностью и способностью самопроизвольно связываться с целлюлозосодержащим сорбентами, рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез рекомбинантного белка LACspCBD, штамм Escherichia coli M15[pREP4, LACspCBD] - продуцент рекомбинатного белка LACspCBD, способ получения иммобилизованного рекомбинантного белка LACspCBD на целлюлозе и способ ферментативного расщепления лактозы / - № 2004110981/13 ; заявлено 13.04.04; опубл. 20.06.06, Бюл. № 17(11 ч.) - С.368.

63. Гинцбург А.Л., Карягина-Жулина А.С., Кормилицина М.И., Лаврова Н.В., Лящук A.M., Лунин В.Г. Мещерякова И.С., Народицкий Б.С., Родионова И.В., Сергиенко О.В., Шмаров М.В. Пат. RU №2270249 С1 РФ, МПК C12N15/11 (2006.01), C12N1/21 (2006.01), С07К19/00 (2006.01), С12Р21/00 (2006.01). Рекомбинантная плазмидная- ДНК, кодирующая! синтез рекомбинантного белка TUL4spCBD; штамм Escherichia coli M15[pREP4, pTUL4spCBD] - продуцент рекомбинатного белка- TUL4spCBD, рекомбинантный белок TUL4spCBD. и способ его получения, способ получения специфических антител к белку TUL4spCBD / -№ 2004135849/13; заявлено 20.02.06; опубл. 20.02.06, Бюл. № 5(11 ч). - С. 399.

64. Аксенова Е.И., Лунин В.Г. Галушкина З.М., Полетаева Н.Н., Грабко В.И., Гинцбург А.Л. Пат. RU №2378371 С1 РФ, МПК C12N1/21 (2006.01), C12N15/00 (2006.01). Рекомбинантная плазмида (варианты), штамм Escherichia coli (варианты) - продуцент химерных белков, химерный белок (варианты), способ иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантных белков на целлюлозе, способ иммобилизации рекомбинантных белков на полистирольных носителях/-№2008145612/13; заявлено 19.11.08; опубл. 10.01.10, Бюл. № 1 (III ч.)

- С.713-714.

65. Шарапова Н.Е., Лунин В .Г., Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. Пат. RU № 2401302 С2 РФ, МПК C12N 15/00 (2006.01) Рекомбинантная плазмида pDlspGBD, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка Dl—GBD, рекомбинантный белок Dl—GBD< и способ его получения, способ исследования связывания белка D1-GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D1-GBD / - № 2008146597/13; заявлено 26.11.08; опубл. 10.10.2010 Бюл. № 28.

66. Шарапова Н.Е., Лунин В.Г. Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. Пат. RU № 2401305 С2 РФ, МПК C12N15/70 (2006.01), C12N1/21 (2006.01), С12Р21/00 (2006.01), G01N33/53 (2006.01) Рекомбинантная плазмида pD4spGBD* штамм Escherichia coli — продуцент рекомбинантного белка D4-GBD, рекомбинантный белок D4-GBD и способ его получения, способ исследования, связывания белка D4-GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D4-GBD / - № 2008146598/13; заявлено 26.11.08; опубл. 10.10.2010 Бюл. № 28.

• 67. Шарапова-Н.Е., Лунин В.Г. Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. Пат. RU № 2401304 С2 РФ, МПК C12N15/70 (2006.01), G12N1/21 (2006.01), С12Р21/00 (2006.01), С12Р21/08 (2006.01), G01N33/53 (2006.01) Рекомбинантная плазмида pD5spGBD, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка D5-GBD, рекомбинантный белок D5-GBD и способ его получения, способ исследования связывания белка D5-GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D5-GBD / - № 2008146599/13; заявлено 26.11.08; опубл. 10.10.2010 Бюл. № 28«.

1. Котнова А.П., Шарапова Н.Е., Лунин В.Г. Карягина-Жулина А.С., Сергиенко О.В., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Гинцбург А.Л. Рекомбинантный белок Collbd-CBD, рекомбинантная плазмида pOC-Collbd, штамм Escherichia coli

- продуцент рекомбинантного белка Collbd-CBD; способ получения рекомбинантного 6enKaCollbd-CBD. Заявка № 2009144489 от 02.12.2"""

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе-разработанных в настоящем исследовании-технологических решений получено значительное количество1 белковых антигенов и других белков. Помимо белков, описанных в тексте, автором также были получены, разнообразные ДНЕС-связывающие белки и белки нуклеотидного обмена, вирусные и бактериальные белки, белки растений, многокомпонентные белки-векторы для трансформации растений, пептиды, содержащие активные* центры ингибиторов циклиновых киназ для применения в онкологии и др. белки, получение и перспективы практического использования которых детально изложены в соответствующих публикациях. Разработанные технологические решения позволяют в короткие сроки конструировать белки, состоящие из двух или более модулей, а также обеспечивают эффективную очистку, концентрирование и иммобилизацию белков, что делает данные продукты перспективными для применения в сельскохозяйственной биотехнологии и медицине.

Информация о работе

Лунин, Владимир Глебович
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка системы технологических решений для конструирования рекомбинантных белковых антигенов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы