Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РЕКОМБИНАНТНЫЙ АНТИГЕН ЭХИНОКОККА EGF (ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА)

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "РЕКОМБИНАНТНЫЙ АНТИГЕН ЭХИНОКОККА EGF (ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА)"

На правах рукописи

Одоевская Ирана Михайловна

РЕКОМБИНАНТНЫЙ АНТИГЕН ЭХИНОКОККА БgF (ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА)

Специальность 03.00.19 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии им.К.И.Скрябина и кафедре молекулярной биологии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

БЕНЕДИКТОВ Игорь Иванович кандидат биологических наук АСЕЕВ Виктор Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

ТЕРЕНИНА Надежда Борисовна (ИНПаРАН)

доктор ветеринарных наук, профессор ДАУГАЛИЕВА Эмма Хасановна (Нижегородская ГСХА)

Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии

Защита диссертации состоится « ¿О » июня 2005 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 006,011.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС)

Адрес: 117218, Москва, Б. Черемушкинская ул., д. 28 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС Автореферат разослан « ж » апреля 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Бережко В.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эхннококкоз распространен повсеместно, является серьёзной медицинской, социально-экономической и ветеринарной проблемой (Бессонов АХ., 1997; Геллер, 1989), в связи с чем в настоящее время во многих странах мира ведутся интенсивные исследования ларвальных падатндозов (Fasini ILM., Hobbs R.P., 2002; Deplazes P., Eckert J., 1996).

Прижизненная диагностика эхннококхозов основывается на эпизотологических данных и результатах иммунологических реакций со специфическим антигеном (Heait D.D.,1986; Irabieaa О., Nieto A., Feneira J.,2000), однако применение последних ограничено отсутствием доступного и стандартного антигенного материала, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью в серологических реакциях (Ito A.L et al, 1999; Jiang L.,Wen H., Ito A., 2001). Данным требованиям может отвечать антиген, кодируемый определённым геном в системе, в которой его можно наработать и очистить, т.е. антиген, получаемый генно-инженерным путём in vitro в требуемых количествах (Li J.et al., 2003), Практически ежегодно ВОЗ организует Международные рабочие встречи паразитологов, посвященные проблемам распространения, диагностики, вакцинопрофнлакгики и лечения ларвальных гидатидозов, причём особое внимание уделяется развитию молекулярно-биологических методов исследования эхинококкозов (Gottstem В., 1987). Во многих странах мира проводятся работы по клонированию генов гельминтов в различных векторных системах, в том числе и эхинококка (Lightowlers М. et al., 1990). Основной целью этих исследований является создание рекомбинантных ДНК, кодирующих гибридные белки-антигены, являющиеся основой для производства генно-инженерных вакцин и диагностикумов (Mamuti W. et al., 2004)

Глобальное значение ларвальных падатндозов, их большое влияние на экономику и здоровье населения различных стран мира неоднократно подчеркивалось в докладах Всемирной Организации Здравоохранения, на регулярно проходящих Международных конгрессах по гидатидологии. В последнее десятилетие важное место в работе этих симпозиумов занимают молекулярно-бнологические аспекты изучения ларвальных гидатидозов, создания генно-инженерных вакцин и диагностикумов для профилактики и прижизненной иммунодиагностики этих опасных гельмннтозов (Rishi А., McManus D., 1987; Woollard D. et a!., 1998; Gauci C„ et al„ 2002; Gonzalez-Sapienta G. et al., 2000; Woollard D. et al., 2000).

В последние годы в России отмечается рост заболеваемости людей и животных ларвальными гидатидозами, что связано с резко возрастающими миграционными процессами, массовым н бесконтрольным завозом продуктов из южных регионов. В связи с этим, изыскание биотехнологнческнх способов получения неограниченных количеств стандартного и высокоэффективного антигенного материала, обеспечивающего результативность проведения прижизненной иммунодиагностики и ваюшнодрофилактнки^ахинокрккоза.

ЦНБ МСХА

фонді

№

нд научной литературы

является первостепенной задачей и насущной необходимостью как & научном, так и в практическом плане (Бережко В.К., 1997).

Целн н задачи исследования. Основной целью настоящих исследований было получение рекомбинантных антигенов эхинококка, обладающих высокими диагностическими и протектвными свойствами.

Для выполнения поставленной целн необходимо было решить следующие задачи;

- создать представительный банк образцов суммарной ДНК E-granulosus и E.multi1ocularis;

- получить клонотеку генов кДНК эхинококка в эксггрессирующем фаговом векторе н осуществить её иммунологический скрининг;

- выявить (молекулярно-биологическими методами (ДНК-ДНК гибридизацией, реакцией рестрикции эндонуклеазам и, электрофорезом в агарезном геле) наличие вставки кДНК эхинококка у рекомбинантных клонов;

- подобрать оптимальную плазмидную векторную систему для экспрессии генов паразита, .наработать препаративные количества плазмндной ДНК и фрагмента кДНК эхинококка;

• на основе лианеризованной ДНК векторной плазмнды и фрагмента кДНК паразита создать генно-инженерную конструкцию;

- создать продуцент гибридного белка паразита в экспрессирующей векторной системе рекомбинантная плазмнда-клеткн E.coli.

- повысить эффективность клонирования за сч&т применения полнмеразной цепной реакции (ПЦР), определить структуру олигонуклеотидных праймеров, гомологичных фрагменту уникального гена EgF E.granulosus и установить оптимальные условия проведения ПЦР;

- наработать в экспрессирующей векторной системе гибридный белок в препаративных количествах и очистить рекомбинантный антиген EgF;

- дать характеристику иммунохнмических свойств рекомбинантного антигена;

- оценить диагностические и протективные свойства наработанного рекомбинантного антигена.

Исследования проведены по • программе фундаментальных в прикладных исследований по научному обеспечению АПК РФ, а также по Федеральной целевой НТП Минпромнауки России «Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития науки и техники» (проект «Технологии биоконструирования препаратов для ветеринарии», № гос. регистрации 01.20.02 14534),

Научная новизна. Впервые в России клонирован фрагмент гена паразита, кодирующий синтез родоспецифического антигена Echinococcus, определены нуклеотндная и аминокислотная последовательности EgF и изучены свойства рекомбинантного белка. Уникальность полученной нуклеотидной последовательности подтверждена патентом РФ. Рассчитана

s

структура специфических олигонуклеотидных праймеров, отработаны оптимальные условия проведения ГОР для получения неограниченного количества встройки хДНК эхинококка EgF. Создан продуцент гибридного белка паразита в экспрессирующей векторной системе рекомбннантная плазмида pQE/EgF-клетки E.coli SG-13009. На основе полученного стандартизированного рекомб ннантного антигена разработан иммунноферментный днагностнкум для прижизненной диапюстики ларвальных гидатидозов, обладающий достаточно высокой специфичностью к чувствительностью. Показана высокая лротективная эффективность антигена EgF при ларвальном эхшюкоккозе в опытах на лабораторных животных.

Практическая ценность работы. По результатам исследований по теме диссертации подготовлены и утверждены следующие нормативные документы;

1. Технологический регламент на выявление генома E.granulosus в реакции dot-гибридизации с использованием специфического радиоактивномеченного ДНК-зонда. Утвержден 5 февраля 1996 г. Ученым советом ВИГИС, протокол № 9.

2. Лабораторный регламент на получение рекомбинантных белков для иммунодиагностики диетного гидатидоэа. Одобрен Ученым советом ВИГИС 27 октября 2000 г„ протокол Кг 40.

3. Лабораторный регламент на модифицированный способ получения рекомбинантного белка F для иммунодиагностики- цистного гидатндозз. Одобрен секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 25 мая 2001года, опубликован в 38 томе (Труды ВИГИС).

4. Лабораторный регламент на модифицированный способ получения рекомбинантного белка EgB. Утверждён Ученым советом ВИГИС б июля 2003 г., протокол №14,

5. Патент на изобретение «Способ получения рекомбинантного антигена F E.granuIosus» № 2234533, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.08.2004 г.

Апробация результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

• научных конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 1993,2001,2003-2005 гг.);

- объединённых сессиях Координационного совещания по ветеринарной паразитологии Центрального совета Общества гельминтологов РАН н секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (1993-2005 гг.);

- заседаниях Ученого совета ВИГИС 1991-2005 гг.

Основные положения, выносимые на защиту;

- создание представительного банка геномной ДНК Е. granulosus и Е. multilocularis; . .

- получение клонотеки. генов кДНК эхинококка в экспрессирующем векторе 11 и иммунологический скрининг рекомбинантных клонов;

- идентификация нуклеотидной встройки к ДНК эхинококка в полученных генно-инженерных конструкциях методами молекулярной биологии (ДНК-ДНК гибридизации, рестрикции эндонуклеазами, электрофорезом в агарозном и лолиакриламидном гелях, иммуноблотгангом);

- создание продуцента гибридного белка Е|»Р в экспрессирующей векторной системе рекомбинантная ппазмида рС>Е/Е|»Р клетки ЕхоН 8013009;

- поэтапный скрининг рекомбинантных клонов с использованием селективных сред, цветового теста и электрофореза в агарозном геле продуктов рестрикции ДНК эндонуклеазами;

- оптимизация клонирования паразитарных генов за счёт применения ПЦР, разработка структуры олигонуклеотидкых праймеров и условий проведения этой реакции;

- получение и иммунохимическая характеристика рекомбинантного белка эхинококка;

- диагностические и протективные свойства рекомбинантного антигена

ЕеР.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Объём и структур* работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, выводов, практических, предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает (65 источников, в том числе 36 отечественных и 129 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 19 рисунками.

Обзор литерату ры

Представлен анализ литературы по биохимическим, молекулярным и иммунологическим аспектам паразнго-хозяинных взаимоотношений при л ар вольных гидатидозах, по антигенному составу и особенностям генома эхинококка, достижениям в области иммунодиагностики и вакцинопрофилактики эхинококкоза. Анализируются современные достижения учёных различных стран по клонированию генов, кодирующих синтез нммунологнчески значимых белков-антигенов, созданию рекомбинантных вакцин и диагностикумов при ларвальных гадатидозах человека и животных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Исследования проводились в 1991-2004 гг. в лаборатории биохимии и биотехнологии ВИГИС и на кафедре молекулярной биологии биологического факультета МГУ. ,

Объект исследования: ДНК из протосколексов и герминативных ободочек цист альвеолярного и цнетного эхинококков, полученных от спонтанно

ннвазированных сельскохозяйственных животных и человека, суммарная геномная ДНК из тканей животных - промежуточных хозяев данных гельминтов, генно-инженерные штаммы Е.СОК У1088, У1059, У1090, Ш109, 8013009, фаг ЯдШ, векторные плазмиды риС 18-19, рС>Е, рМАЬ-с.

ДНК выделяли стандартным методом с использованием протеиназы К, фенола и хлороформа в качестве депротеинизирующих агентов. Очищали ДНК с помощью многократных осаждений 70%, 80%, 96% этанолом с последующим перерастворением в ТЕ-буфере (рН 7,4).

Расщепление ДНК рестриктазами проводили по методике Т.Маниатиса с соавторами (1984), для разделения, очистки и идентификации полученных фрагментов использовали метод электрофореза в агарозном (0,8-1,5% в зависимости от молекулярной массы анализируемых фрагментов) геле с последующим окрашиванием флуоресцирующим с ДНК красителем -бромистым этндием.

Получение препаративных количеств ДНК бактериофага ХаШ осуществляли согласно рекомендациям Т.Маниатиса с соавторами (1984).

ДНК векторной плазмиды выделяли методом щелочного лизиса (Мазии А.В., Кузнеделов К.Д., 1990). Для выявления гомологичных клонированной встройки кДНК эхинококка нуклеотидных последовательностей из геномов гельминтов использовали блот-гябридизащпо по Саузсрну с радиоактивномеченнымн методом ник-трансляции пробами.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе отечественного производства «Термоциклер» по стандартной методике, температурный режим и другие параметры реакции были рассчитаны и отработаны в связи с использованием уникальных специфических олигонуклеотидных праймеров. Создание рекомбинантных векторных конструкций с использованием бактериофага ХрИ и нлазмид риС18-19, р<ЗЕ осуществляли согласно рекомендациям (Т-Маниатис с соавт., 1984) с некоторыми модификациями применительно к нашему объекту исследований.

Скрининг рекомбинантных' клонов и реакцию трансформации компетентных клеток Е.соП лигированной смесью проводили стандартными способами (Гловер Д.,1986; Щелкунов С.Н.,198<5). Для повышения эффективности процесса клетки бактерий последовательно инкубировали в ледяной бане в 50 мМ растворах особо чистых солей (СаСЬ, МпСЦ, М^Ь) вплоть до теплового шока (43°С). Использование при выращивании трансформантов индуктора изопропилтиогалактозида (ТРГС) и хромогеиного субстрата Х^а) в концентрациях 20мг/мл позволило отбирать рекомбинантные клоны по цветовому тесту, после чего их проверяли на наличие клонированной встройки кДНК эхинококка рестрикцией эндонукдеазами и электрофорезом в 1,5% агарозном геле.

Способ получения гибридного белка ЕеИ в экспрессирующей векторной системе на основе рекомбнпаитой плазмиды подробно описан в патенте № 2234533 от 20.08.2004 г. и лабораторном регламенте (Одоевская И.М., Бенедиктов И.И., Труды Всерос.иястнтута гельминтол., т.38,2001 г.).

Иммунохимическую характеристику гибридного белка EgF проводили с использованием методов электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях, мммуноблоттиига и ракетного иммунозяеетрофореза с поливалентными сыворотками экспериментально заражённых животных. ; г

Экспрессия гибридного белка рекомбинантной шіазмилой и его очистка

Засеивали 80 мл среды LB клетками, содержащими гибридную плазмиду. Наращивали до плотности Да» = 0,5, отбирали 1 мл, центрифугировали и разбавляли клетки SDS-PAGE буфером. Добавляли IPTG до концентрации 03 мМ, инкубировали 2 часа при 37 С. Отбирали 0,5 мл осадка клеток и делили на 2 пробирки.

Культуру центрифугировали при 4000 об/мин 10 минут. Удаляли супернатант, ресуспеидировали )-ый осадок в 5 мл лизнрутощего буфера, 2-оЙ осадок ресуспеидировали в 10 мл ЗО мМ трис-НСІ, 20% сахарозы (рН 8,0). Осадок 1-замораживали при -200С, осадок 2 - разрушали ультразвуком и центрифугировали при 9000 об/мин 20 минут, . удаляли супернатант и ресуспеидировали осадок в 5 мл лизирующего буфера. Смешивали 20 мкл экстракта 1 с 20 мкл 50% суспензии амилазы в колоночном буфере. Инкубировали 15 минут во льду. Удаляли супернатант и промывали осадок в 1 мл колоночного буфера, центрифугировали 1 минуту н ресуспенцировалн в 50 мкл SDS-буфера для проб.

Из клеточного лизага белки высаливали сульфатом аммония« Фракции собирали в интервале от 35% до 65% насыщения. Гельфильтрацию осуществляли на сефакриле S-300 в колонке диаметром 2 см и длинной 1 метр. При проведении хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе использовали колонку диаметром 2 см и длинной 20 см, Элюцию бел ков-антигенов осуществляли хлористым натрием в концентрации от 0 до ОД М.

Концентрацию белка определяли спектро фотометрически при длине волны 280 іш.

..Диагностическую эффективность рекомбинантного антигена EgF оценивали в ходе ИФР с сыворотками от людей с подтверждённым диагнозом «эхинококкоз» от условно здоровых доноров и с сыворотками крови от больных с другими паразитарными заболеваниями.

Иммуноферментную реакцию (ELIZA) ставили в непрямом варианте, в качестве твердой фазы использовали полистироловые планшеты отечественного производства фирмы «Медполимер». Сыворотки крови использовали в разведении 1:100, антивидовой конъюгат - в разведении 1:12000, окрашивание проводили субстратной смесью (на 10 мл нитратного буфера рН 5.0 вносили 8 мг ортофенилендиамина и 10 мкл 33% перекиси водорода). Останавливали реакцию добавлением 2М серной кислоты, учёт результатов проводили на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Протектнвную эффективность рекомбинантного антигена EgF изучали на белых беспородных мышах весом 18-20 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Создание банка геномных ДНК гельминтов

Для создания банка геномной ДНК паразита протосколексы н герминативные оболочки получали из гидатидозных цист Б granulosus и E.multilocularis, собранных на мясокомбинатах (хозяин - овцы, крупный рогатый скот), в охотохозяйствах (хозяин лось, кабан, KVC, ондатра, серые крысы, мыши-полёвки и др.) и в 7-ом хирургическом отделении Медицинской Академии им. И.М.Сеченова (операционный материал or людей). Также для проведения экспериментов проводился сбор образцов гетерологичных ДНК паразитов (T.spiralis, C-tenuicollis, O.dentatum, Fiiepatica, TJiydatigcna, T.solium, M.multiceps, A.smim, T.canis, T.Ieonina, U.stenocepbala, T.pisiformis). Всего было выделено и очищено 87 образцов нативноЙ геномной ДИК различных гельминтов, что явилось основой для создания Банка генов паразитов ВИГИС.

Получение кДНК банка генов E.granulosus

Конструирование кДНК банка осуществляли с использованием ферментных наборов фирмы Amercham в экспрессирующем векторе Xgtl 1. Синтез первой цепи осуществляли с помощью обратной траискриптазы вируса миелобластоза, матрицей для синтеза кДНК послужила ро1у(А)РНК, выделенная из протосколексов E.grartulosus из печени овцы, в качестве затравки использовали oligo(dT). Продукт синтеза первой цепи служил субстратом для обработки РНК-азой Н, ДНК-полимеразой I E.coli и ДНК-липазой E.coli в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Образующуюся на молекуле "шпильку" расщепляли нуклеаэой S1. Полученные двухцепочечные кДНК достраивали ДНК-полимеразой Т4, затем обрабатывали метилазой EcoRl и лигировали с дефосфорилнроваквыми EcoRl линкерами. Ферментом EcoRl образовывали липкие концы. Подготовленную таким образом кДНК лигировали с ДНК фага Xgt 11, предварительно расщепив вектор по сайту E.coRl и обработав щелочкой фосфотазой.

Получение геномной библиотеки E.granulosus в векторе на основе бактериофага Igtll

Упаковку полученных рекомбинантных молекул ДНК в частицы бактериофага проводили in vitro, используя коммерческие упаковочные экстракты фирмы Amercham. Образовавшиеся фаговые частицы ампянфицировалн в клетках E.coli Y1088, продуцирующих lac-penpeccop, что уменьшило процесс вытеснения рекомбинантных клонов ввиду подавления синтеза токсичных для хозяина гибридных белков, кодируемых рекомбинантными фагами EgF. Полученную клонотеку высевали на свежие

чашки с LB-агаром, содержащем ампициллин (50мкг/мл), IPTG (гомкг/мл), х-gal (20мкг/мл). В качестве газона использовали бактерии штамма Y1088,

В результате была получена представительная кДНК библиотека с эффективностью клонирования 1x10s клонов на мет пояиаденилированной

РНК. * к .

Библиотека скринирована с использованием авидин-оиотиновои системы

с применением белков сыворотки крови людей с подтвержденным диагнозом

«эхинококкоз». Предварительно белки сыворотки крови очищали от антител к

белкам Е.СОІІ, которые присутствуют в любой сыворотке крови человека.

Очистку сывороток проводили при помощи аффинной Хроматографии на

колонках с CH-Scpharose 4В, к которой были пришиты тотальные белки E.coli

(Остерман, 1985).

Библиотеки в Xgtll высевали на чашки диаметром 95 мм, полученные клоны переносили на тпроцеллюлозные фильтры, которые окрашивали в

реакции dot-ELlSA.

В результате было получено несколько рекомбинантных клонов Agtll, которые продуцировали белки, обладавшие антигенными свойствами эхинококка.

о * 3 SSSSS SSva S Й й 8

? iiХЙЙЙ йгі SSS

___

s J is inmzi 5Ш mil I

; * ' * ' рж ч (t л-,

-,.ЦД CAA'CTA CAG ATG ^,ТТ'"ЛЛЬ CGG-'. • 5' lie Asnlle Asp Yftl Phe CluAIa

Рис.1 Схема клонирования фрагментов кДНК эхинококка в фаг *gtl I.

Lae-Z - область фага, кодирующая р-галаггозидязу.

Горизонтальной стрелкой обозначено, направление транскрипции.

вертикальной- место пигароьакия по сайту Его RI-

Таким образом, был проклоиировая экспрессируюишйся фрагмент ДНК эхинококка, представляющий собой кДНК копию информационной РНК, транскрибирующий уникальный ген E.granulosus.

Гибрндизационный анализ геномной ДНК эхинококка с полученными из рекомбинантных фагов встройками кДНК эхинококка проводили по методу Саузерна (25), для чего радиоактивным фосфором 52Ррср помечали ннк-транслированные вставки кДНК эхинококка. Меченые Ррср пробы были денатурированы нагреванием ори 95°С в течение 2-3 минут, затем помешены в лед. Удельная активность ник-транслированной пробы составляла 10 имп/мин/мкг. Геномная ДНК эхинококка, выделенная из протосколексов, была подвергнута реакции рестрикции ферментом EcoRI и фракционирована в 0,S% агарозном геле в трис-зцетатном буфере с последующим окрашиванием

бромистым этцдием.

После окончания электрофореза гель несколько раз ополаскивали бидистилл ированноЙ водой. Нейлоновую мембрану, предварительно выдержанную в воде 10 минут, помещали в буфер для переноса. Агарозньш гель переносили в прибор для каппилярного переноса нуклеиновых кислот, заполненный тем же буфером. Сверху гель накрывали мембраной НуЬопіІ-К (АшегзЬагп), тщательно удаляли пузыри воздуха и поверх накладывали стопку фильтровальной бумаги толщиной не менее 12 см. Перенос проводили 20-24 часа при комнатной температуре. После этого блот прбмывалм в буфере несколько раз, высушивали под инфракрасной лампой и выдерживали в вакуумном сушильном шкафу при 80 С в течение двух часов. Мембрану помещали в стерильный полиэтиленовый пакет, добавляли гибридизационную смесь из расчета 1 мл смеси на 1 см1 мембраны, инкубировали 5 часов при 65° С. По истечении указанного времени запаянный пакет вскрывали, буфер для лредгибридизации сливали и добавляли радиоактивномеченные методом ник-трансляции вставки кДНК эхинококка (по сути являющиеся радиоактивными зондами), растворенные в гибридизационной смеси. На І ■ см1., нейлоновой мембраны брали 5x10е имп/мин зонда при его концентрации 15x104 имп/мнн/мл, гибридизацию вели при 65°С в течение-16-20 часов. По ее окончании удаляли гибридизационную смесь и тщательно отмывали мембрану от радиоактивных частиц (3 раза по 30 минут при 65°С на вортексе в термальной камере). Отмытую мембрану запаивали в полиэтиленовый пакет и подвергали авторзднографин при -7С>0С с рентгеновской пленкой РМ-В в течение 12 часов.

На основании гибридизации геномной ДНК эхинококка с радиоактивно-меченными вставками кДНК в рекомбинантных фагах Х^ІП был сделан вывод о том, что эти рекомбннантные фаги содержат уникальные последовательности Р, гомологичные участкам ДНК эхинококка.

Подбор оптимальной экспреесирующей векторной системы

В дальнейшей работе с экспедирующей векторной системой рекомбинантный фаг А^П 1/Е&Р-клетіси Е.соїі У-1089 возникло много трудностей. Во-первых, фактическая экспрессия. рекомбинантного пептида составляла менее 0,5% от тотальных белков, в то время как, согласно литературным данным, могла составлять от 5 до 7%. Во-вторых, огромную проблему представляла реверсия рекомбинантных фагов со встройкой кДНК Е.&апіі1о£и$. Фактически через 2-3 поколения большинство фагов возвращалось к исходному, "дикому" типу. Сохранять рекомбинантов путем пересевов и перезаражений клеток-хозяев стало невозможно, поскольку трудно было предугадать, какой клои ревертировал к "дикому" типу, а какой еще имеет встройку кДНК эхинококка. В связи с' этим вся клонотека рекомбинантных фагов Е^Д7 сохранялась в виде векторной ДНК, а не живых фагов. Для заражения клеток Б. соН и получения гибридных лизатов каждый

раз приходилось "упаковывать" фаговую ДНК в белковые оболочки, что обусловливало большие затраты средств и рабочего времени (рекомбинантную фаговую ДНК "упаковывали" in vitro, синтезируя белковые оболочки фага с помощью упаковочных экстрактов фирмы Amersham).

Определение нуклеотидной последовательности встройки F в плазм и де pUC-19 проводили по методу Сэнгера с использованием коммерческого набора для секвеннрования. Секвенированне осуществляли по двум цепям с использованием прямого и обратного праймеров М13 и дополнительно синтезированных праймеров.

Нуклеотидная структура фрагмента F эхинококка приведена на рис.2.

I 14 24 34 44

mC-atgVnVCtAC АСАТСААСАТ TGCATCTAAA GTCGCGGATG TTTCCAGAÀ

M

CAATAAGGAG AAGATTACTA CTACCGACAA ACTGGGTACT CTCTCGAGC

144

aogttgcttc ссаатсасаа aaggcagctc сссаастттс aaaatgctg

194

ACGGAAGCTT CTGATCTCCA TCAGCGTATG GCCACTGCCA AAAGAATTT

244

CAATAGTGAG GTTAATACCA CCTTCATTGA AGATTTCAAA ACTTCTTGA

294

ACACCACCCT TAGCGAGGCC CACAAAGCAA AGCCAAGACT GAGGAGGTT

344

CGACTAGATT TGGACICTGA СААСАСГААА TTGAAGAATC TAAGACTGC

394

GGAACAGAAG GCCAAGTGGG AGGCCGACGT CCGAAAAGAC AAACTGACT

• ' 444

TCCATCGAGT GCACCAAGAA TCTCTTACTA TCTTTGAGAA GACTTGCAAA

GAATTCg^Pl'C

Рис.2. Нуклеотидная структура фрагмента F кДНК E.granulosus

Размер s фрагмента составляет 453 основания, подчеркнуты области затупленных Eco RI сайтов, мелким шрифтом выделены части сайта, по которому было проведено клонирование в полилинкер плазмиды pUC19. Нумерация начинается с комка EcoRI-лянкера.

Субклонированне в экспрессируюцдую плазмндпую векторную систему В течение последующих нескольких лет мы проводили работу по переклонированию встройки кДНК эхинококка в перспективные с нашей точки зрения плазмидные векторные системы, способные обеспечить экспрессию достаточного количества гибридного белка. Использование ллазмндных векторов pMAL-c, pMAL-p, рКК233, pUC-18, pUC-19, pTZ-18, pTZ-19 и ряда других не смогло обеспечить должного уровня экспрессии рекомбинантных белков, хотя н существенно облегчило генно-инженерные операции.

Методом компьютерной трансляции фрагмент гена эхинококка размером 453 п.н. был переведён и прочитан как соответствующая аминокислотная последовательность. Установлено, что белки E.granutosus являются весьма токсичными для любой живой клетки по двум причинам:

: 1) белки эхинококка имеют в своем составе крупные гидрофобные блоки, отрицательно воздействующие на клеточную мембрану, что вызывает подавление роста клеток штамма продуцента и даже их гибель;

2) в состав получаемых гибридных белков эхинококка входят блоки заряженных аминокислот, обладающих сильными сорбирующими свойствами. Последние прочно связываются с нуклеиновыми кислотами, что приводит к угнетению или полному торможению процесса размножения клеток хозяина.

Эти особенности были учтены при выборе системы вектор-хозяин, пригодной для молекулярного синтеза рекомбинантных белков и создания плазмидного суперпродуцента антигенов эхинококка.

I Î0

Glitte СТА GAC АТС АЛС AIT GCA ТСГ AAA GTC GCG GAT ОСТ TTC Vil Asp Пс Asp tte Ali Ser lys Val Ala Asp AI« Phe

60

CAO AAO AAT AAG ОАО AAO ATT ACT ACT ACC OAC AAA СТО Ch Lys Asn Lys Glu Lys Пе ТЫ Ihr Thr Asp Lys Un 90

GCT ACT OCT СГС GAC CAO OTT OCT TOC CAA TCA GAA AAG Gty Un AU loi Ohl Gbi Vri AU Ser Gin Ser Glu Lys

m m

OCA GCT CCC CAA CTT TCT AAA ATO СШ ACO GAA ОСТ ТСГ All Ala Pro Gin Leu Set Lya Met Leu Thr Ghi Al» Ser

Ш

■ ¡ " " GAT OTC CAT CAG COT ATO QCC ACT OCC AGA AAG AAT TIC ' Asp V«1 Hi) Gin Arg Met Ali Ihr Ala Aig Lys Am Phe

210 : . «., •

AAT А ОТ GAG GTTAAT ACC ACC TTC ATT GAA OAT TTG AAA Atp Ser Glu Val Asn Thr Thr РЬе Пе Glu Asp Leu Lys 2« -Г—-. 270

AAC TTC TTG AAC ACC AOG CTT AGC GAG GOC CAG AAA GCA Aid Phe Leu Am Tbl Thr Leu Ser Ghj Ali Gl» Lys All ■ 300

AAG OCA ; AGA CTG GAG GAG GIT COA СТА GAT TTO OAC TCT Ly* Pro Arg Leu Glu Chi Vil Arg Leu Asp Leu Asp Ser 330

GAC AAG ACT AAA TTG AAG AAT OCT AAG ACT GCG GAA CAG 1 Asp Lyi Thr Lys Leu Lys An All Lyi Thr All Glu G la

Ш 390

AAG GCC AAG TOG GAC OCC GAC GTO CGA AAA GAC GAA AGT Lys Ala Lys Trp Cht Ala Ohl Val Arg Lys Asp Glu Set

420

GAC TTC GAT COA GIG CAC CAA GAA ТСГ СГГ ACT АТС ТГГ Asp Phe Asp Arg Val Hû Ota Glu Ser Leu Thr Ile Phe 444

GAG AAG ACT TGC AAA gaa tte Ghi Lys Thr Cys Lys

Рис.3, Аминокислотная структура белка E.granulosus, транслируемого последовательности клона F.

Мелким шрифтом выделены EcoRI линкеры.

Для получения препаративных количеств антигенно-активных белков эхинококка была выбрана система суперэкспресснн генов, клонированных в векторах серии pQE, в клетках E.coli штамма SG13009 <pREP4). В этой системе полностью подавлена экспрессия клонированных генов в отсутствии индуктора. Полученный белок содержит дополнительный пептид из б остатков гнстиднна и может быть легко очищен хроматографией на никелевых носителях при наличии таковых.

Различные представители ллаэмид pQE позволяют получить гексагистндиновый пептид на "С" или " К** конце и экспрессировать гены, находящиеся в любой из трех возможных рамок считывания. Кроме того, этот вектор содержит сильный промотор, индуцируемый IPTG, и участок прочного связывания рибосом, что обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков. Штамм-продуцент клеток Б. coli SGI 3009 позволяет поддерживать рекомбинангные плазмнды pQE даже в том случае, если в них клонированы гены токсичных для клетки белков, так как они содержат самый высокий уровень "tac" репрессора.

Так как вставка кДНК рекомбииантного фага была проклоннрована по сайту рестрикции ЕсоШ, а в векторах экспрессии pQE клонирование по этому сайту невозможно, возникла дополнительная необходимость промежуточного клонирования в синтетический полилинкер, в котором сайт EcoRl окружен сайтами других рестриктаз, по которым возможно осуществить клонирование в данной плазмиде.

Дня повышения эффективности клонирования и облегчения получения препаративных количеств фрагмента ДНК ¿.granulosus нами была применена полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время этот метод широко используется для наработки препаративных количеств отдельных генов или их фрагментов, так как он позволяет избежать сложной и длительной работы по получению библиотеки кДНК, используя расшифрованные нуклеотидные последовательности начала и конца этих генов. Обработка имеющихся данных по иммунологнчески активным генам E.granulosus на основании компьютерных программ "DNAsis" и "Oligos" позволила нам разработать программу синтеза олигонуклеотидных праймеров, гомологичных структурам уникальных генов, кодирующих антигены эхинококка по структуре фрагмента F ДНК эхинококка размером 453 пар нуклеотидов.

К концам специфических праймеров были добавлены синтезированные сайты рестрикции для ферментов BamHI (прямой праймер) и HindlII (обратный праймер). Структура соответствующих праймеров приведена на рис.4. Синтез праймеров проведен в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Прямой

5' CGGGATCCGTAGACATCAACATTGCATC У

Обратный

5' CAAGCnTOCAAOTCTTCTCAAAGATAG У Рис.4. Структура олигонуклеотидных праймеров EgF E.granulosus.

Выделение эукартотической гец^ной ДНК гельминтов

Процедура выделения геномной ДНК паразитов проводилась постоянно для проведения гибридизации, клонирования, полимеразной цепной реакции, идентификации геномов паразитов.

Для проведения ПЦР были наработаны следующие количества нативнон геномной ДНК эхинококка от различных хозяев: лося - 30 мкг, овцы 8 мкг, свиньи 12 мкг. Кроме того, для проведения ПЦР было выделено 18 мкг ДНК рекомбинантных плаэмид рОЕЯ1 и 20 мкг ДНК фага

С аликвотами различных образцов геномной ДНК эхинококка и синтезированными уникальными праймерами к клонированному фрагменту гена Р были проведены реакции амплификации. Полинеразная цепная реакция проводилась в объеме 25 мкл инкубационной смеси в течение 4-х часов.

Режим амплификации геномной ДНК эхинококка

1 цикл денатурация ДНК при 95"С -120 сек

3 ЦИКЛОВ денатурация ДНК при 95" С -бОсск отжиг прайнеро» при 33° С -120 сек элонгация цепи (синтез фмгмента) при 73? С -120 сек

30 циклов деншурацн" ДНК при С - 30 сек отжиг пройм ерол при 53® С -120 сек элоигаии* цели (синтез фрагмента) при 71* С - 90 сек

: Поскольку продуты амплификации гена F с геномной н с клонированной ДНК эхинококка, полученной нз различных источников, имели одинаковый размер, можно было предположить, что этот ген не содержит нитронов, по крайней мере, в его кодирующей части.

Благодаря тому, что полученные в ПЦР фрагменты имели на концах участей узнавания для рестрнктаз Bam Ш и Hind 111, клонирование в полилинкер плазмиды pQe прошло успешно. Фрагмент F был встроен в экспрессионную плазм иду pQE.

Последующее клонирование в векторной системе pQE-SG 13009 позволило создать продуцент белка F эхинококка.

Субклонирование фрагмуцта EeF в экспресс ирующий длазмилный вектор.

С целью получения препаративных количеств гибридного антигена EgF было осуществлено су б клонирование вставки кДНК E.granulosus в экспрессирующую векторную систему pQE-SG13009.

Способ получения гибридного антигена EgF включал следующие этапы:

- выделение эукариотической геномной ДНК Б. granulosus нз протосколексоа паразита;

- получение препаративных количеств фрагмента ДНК F эхинококка с помощью ПЦР;

- получение препаративных количеств ДНК векторной шшмиды pQE;

- конструирование рекомбинантной плазмиды pQE*F E.granulosus;

- проведение реакции трансформации клеток E.coli рекомбинантной плазмидоЙ и скрининг положительных клонов;

- экспрессию гибридного белка рекомбинантной плазмидой и его очистку;

определение диагностической эффективности полученного рекомбинанткого антигена EgF.

Проведение реакция трансформации клеток E.coli рекомбинантной плязмндой

Проведение реакции трансформации компетентных клеток E.coli лнгирующей смесью позволяет оценить жизнеспособность рекомбинантной конструкции. В качестве контроля используют ДНК нативной векторной плазмиды для трансформации тех же компетентных клеток.

Получение культуры крмпететггиых клеток штамма JM-109.

Из музейной культуры пригодного для этих целей бактериального штамма приготавливается 5 мл «ночной культуры». В колбу Эрленмейера объёмом 250 мл с LB-средой вносили полученную суспензию клеток в количестве 5% от объёма среды. Наращивание биомассы клеток проводили при ЭТС и усиленной аэрации до достижения средней логарифмической фазы роста при Д600=*)0,5. Клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин (40°С, 5 минут). Полученный осадок ресуспенднровали в охлаждённом буфере (50 мМ СаС12,10 мМ RbCl, 100 тпМ MOPS) и инкубировали во льду 15 минут. Клетки вновь осаждали центрифугированием в том же режиме и суспендировали в 5 мл буфера. Суспензию клеток расфасовывали по 200 мкл в стерильные охлаждённые пробирки и замораживали в жидком азоте.

Трансформация компетентных клеток векторной плазмидной ДНК

Извлечённую из жидкого азота пробирку с замороженными клетками опаивали во льду 30-40 минут и, не вынимая пробирки юо льда, добавляли в суспензию клеток 5-Юм кг векторной ДНК. Осторожно покачивая, смесь инкубировали во льду ещё 40 минут, после чего проводили тепловой шок, перенеся пробирки в водяную баню с температурой 42-43°С, При этом создаются условия для расширения пор в клеточной мембране и плазмидные ДНК в суперскрученной форме могут проникать внутрь клетки. Последующая инкубация длилась 1,5 часа при 37°С. Этого времени достаточно, чтобы в бактериях прошёл процесс восгановления и началась экспрессия подконтрольных плазмиде генов устойчивости к антибиотикам. Подросшие клетки концентрировали 15-20 секундным центрифугированием, к осадку добавляли 100 мМ IPTG, 0,25% x-gal и высевали на твердый LB-arap с ампициллином (50 мкг/мл).

Получаемая при использовании этого метода эффективность трасформации дикой (исходной) плазмидой составляла 10* или 10 колоний на 1 мкг векторной ДНК, рекомбинантной - Ю1 или 101 колоний на 1 мкг ковструированной ДНК.

Скрининг положительных клонов

Трехступенчатый скрининг (тесты: на устойчивость к антибиотикам с применением селективных сред, изменеие цвета рекомбииантных клонов из-за нарушения экспрессии продукта бетта-галактозидазы, увеличение молекулярной массы ДНК гибридной плазмиды на величину клонированной встройки) рекомбннантных клонов осуществляли по модифицированным применительно к нашим условиям методикам (Т.МаннатисД984-, Гловер Д., 1986; Мазин A.B., Кузнеделов К.Д.,1990). Отобранные с чашек рекомбинантные клоны повторно проверяли на наличие в них вставки ДИК эхинококка на молекулярном уровне, проводя реакции рестрикции соответствующими ферментами с последующим электрофорезом в 0,8% агарозном геле и ДНК-ДНК гибридизации, используя радноактивномеченные зонды на основе фрагментов генов эхинококка.

В дальнейшем белковые продукты всех клонов, содержащих встройку кДНК эхинококка, были проанализированы с помощью иммунологических методов: ИФР, ракетного иммуноэлектрофореза, иммуноблотганга или реакции имму нопреципитацин по Оухтерлони.

В результате проведённого скрининга было выявлено 18 антигенположительных клонов, используемых в дальнейшей работе в качестве продуцентов иммунологически значимых белков эхинококка.

Отобранные клоны использовали для получения белка F эхинококка.

В результате проведенной работы был наработан в препаративных количествах (1800 мг) и очищен белок F из рекомбннашного штамма E.coli.

Методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле установлена гомогенность полученного антигена и его молекулярная масса, равная 1б,7хД.

Для оценки диагностической эффективности активности гибридного белка F в ИФА использовали 93 пробы сывороток крови человека, в состав которых входили: , 62 сыворотки крови пациентов с подтвержденным диагнозом "эхинококкоз" из факультетской хирургической клиники Московской медицинской' академии нм. И.М. Сеченова и 24-й городской клинической больницы. В качестве гетерологичных проб использовали сыворотки крови 20 условно здоровых пациентов и 11 больных следующими заболеваниями: альвеококкозом (3), описторхозом (I), язвой желудка (IX токсокарозом (3), трихинеллезом (1), амебиозом (I), дифиллоботриозом (1).

Результаты комиссионного испытания выявили следующее:

а) из 62 сывороток с подтвержденным диагнозом эхинококкоз очищенный белок показал положительные результаты с 52, а отрицательные - с 10 сыворотками (чувствительность теста составила 83,8%);

б) из 31 сыворотки условно-здоровых и с гетерологичными инвазиями и инфекциями очищенный гибридный белок F показал отрицательную реакцию с 25, положительную с б пробами сывороток. Таким образом, специфичность ИФА с очищенным гибридным белком F составила 77,4%.

Оценка протективной эффективности рекомбииантного антигена EgF эхинококка была проведена на 146 белых беспородных мышах массой 18-20 г.

Опытные животные были распределены на 4 группы: 2 опытных и 2 контрольных. Иммунизацию мышей проводили трехкратно, дважды подкожно, один раз внутрибрюшинно с интервалом 10 дней в дозе (в объёме) 0,5 мл каждого препарата:

1-я группа (опытная):, иммунизация антигеном EgF, эмульгированым с масляным адъювантом ВНИИЗЖ(1:1);

2-я группа (опытная): иммунизация антигеном EgF;

3-я группа (контроль): иммунизация масляным адъювантом ВНИИЗЖ с равным объёмом физиологического раствора;

4-я группа (контроль): инъецирована физиологическим раствором в дозе 0,5 мл.

Каждое иммунизированное животное в общей сложности получило по 150 мкг белка-антигена Eg F, По истечению 14 дней после последней иммунизации животных всех 4-х групп подвергли заражению ацефалоцистами и протосколексамн альвеолярного эхинококка в количестве 300 экземпляров на I животное внутрибрюшинно в физиологическом растворе с антибиотиками. Убой животных и учет результатов опыта проводили через 90 дней после заражения.

Паталогознатомическим вскрытием мышей было установлено: у животных опытных групп обнаружены ларвоцисты альвеолярного эхинококка в незначительном количестве (у мышей 1-й труппы оказались заражены 2 особи, второй - 3). Это составило соответственно 7,1 (I группа) и 11,7% (П группа).

У животных контрольных групп выявлено множественное поражение внутренних органов ларвоцнстами альвеолярного эхинококка размером от 1 до 14 мм в диаметре. В единичных пузырях обнаружены сформировавшиеся протосколексы.

Таким образом, было показано, что испытанный рекомбннантный белок-антиген EgF обладает выраженным протектнвным действием на развитие ларвоцист E.multilocularis и может быть использован в качестве основы для создания вакцины против эхинококкоза животных.

В результате многолетней работы по клонированию нуклеотидных последовательностей эхинококка в различных экспрессирующих векторных системах удалось получить препаративные количества рекомбииантного белка-антигена F паразита, пригодного для создания на его основе диагностикума и вакцины пря ларвалъном эхннококкозе.

ВЫВОДЫ

1. Получена библиотека генов E,granu1osus на основе бахтерофага Xgtll с представительностью 1,5x10s. Методом гибридизации in situ выявлены фаги, содержащие нуклеотидные последовательности ДНК, кодирующие синтез иммунологически значимых белков-антигенов эхинококка.

2. Разработан способ выявления генома эхинококка методом dot-гибридизации радиоактивиомеченным (МР) зондом на основе клонированной вставки Е.granulosus EgF в реакции ДНК-ДНК гибридизации с суммарными про- и эукариотическими ДНК различных организмов. Полученные радиоавтографы свидетельствуют, что клонированные встройки кДНК эхинококка не гибрндизируютея с ДНК отрицательных контролей (ДНК из тканей животных-хозяев гельминтов, клеток бактерий, трансформированных нерекомбянантными фагами и плазмндами), но гибридизируется с суммарными геномными ДНК цистного и альвеолярного эхинококка, генно-инженерными конструкциями, имеющими кДНК эхинококка. Аналогичный результат был получен при проведении полимеразной цепной реакции.

3. Секвенирована нуклеотиднал последовательность EgF эхинококка размером 453 п.н. Уникальность клонированного фрагмента паразита и отсутствие гомологии с клонированными в других странах нуклетидными последовательностями эхинококка подтверждены результатом проведенного компьютерного аналаза по программе «.UNAsis» фирмы «Фармация» (патент РФ № 2234533 от 20.08.2004 г.).

4. Амплификацией нуклеотидной последовательности EgF в полимеразной цепной реакции с образцами геномной ДНК эхинококка и ДНК рекомбинантных клонов показано, что этот клонированный фрагмент гена не содержит интронов, по крайней мере, в кодирующей части, т.к. при электрофоретической детекции продуктов НЦР все получаемые фрагменты имеют одинаковую молекулярную массу.

5. Проведенный анализ аминокислотной последовательности антигена EgF показал наличие токсических свойств получаемого рекомбинантного белка: а) белки эхинококка имеют в своём составе крупные гидрофобные' блоки, отрицательно воздействующие на клеточную мембрану, что вызывает подавление роста клеток и даже их гибель; б) в состав белков эхинококка входят блоки заряженных аминокислот, имеющих сорбирующие свойства. Они прочно связываются с нуклеиновыми кислотами, что угнетает или вовсе тормозит размножение клетки-хозяина. Полученные данные были учтены при выборе системы вектор-хозяин, пригодной для молекулярного синтеза рекомбинантных белков паразита.

6. Повышена эффективность клонирования фрагмента гена эхинококка за счет использования полимеразной цепной реакции со специфическими олигонуклеотидными праймерами. Получено и очищено 68 мкг нуклеотидной вставки.

7. Создан продуцент рекомбинантного белка эхинококка в экспрессирующей векторной системе pQE/EgF-клетки Е.соИ SG-13009 и получен очищенный рекомбинантный бедок. EgF в количестве 1800 мг. Синтезируемый под контролем рекомбинантной плазм иды pQE/EgF белок-антиген эхинококка гомогенен и имеет молекулярную массу 16,7 кДа.

8. Разработаны методы, анализа иммунологических свойств синтезируемых в векторных системах гибридных белков с использованием иммуноблоттинга, денатурирующего электрофореза и ракетного им муноэлектрофореза, а также способы физико-химической характеристики рекомбинантного белка.

9. Диагностическая эффективность рекомбинантного антигена EgF в ИФР (ELISA) с использованием сывороток крови людей с подтвержденным диагнозом <охинококкоз» составила по чувствительности 84,9 % и по специфичности 86,1 %.

10. Проведённые испытания иммунопрофилактнческих свойств рекомбинантного антигена на белых беспородных мышах выявили высокую степень защиты при ларвальном гидатндозе.

1!. Полимеразная цепная реакция с различными олигонуклеотнднымя праймерами, гомологичными участкам геномной ДНК альвеолярного н цистного эхинококка, кодирующим иммуногенные белки обоих паразитов, выявила высокую степень сходства участков геномов этих двух гельминтов. Полученные данные подтверждают правомочность использования лабораторной модели альвеолярного эхинококкоза для изучения антигенных свойств при цистном гидатндозе.

Практические предложения

Модифициованный способ получения рекомбинантного антигена эхинококка одобрен секцией «Инвазионные болезни животных» отделения ветеринарной медицины РАСХН 25 мая 2001 г„ рекомендован для получения стандартизированного антигена, пригодного для иммунодиагностики цистного гидатндоза, и включен в сборник «Современные методы исследований в ветеринарии» (РАСХН, 2005 г, а печати).

Материалы диссертации могут был использованы в ветеринарных и медицинских лабораториях, проводящих иммунологические исследования на основе паразитарных антигенов.

Список робот, опубликованных по теме диссертации

1.Одоевская И.М., Качурина JUL Получение препаративных количеств вставок кДНК E.granulosus в системе клеток E-coli Y1088 - рекомбинантный фаг Xgtl 1 //Матер.докл.науч.конф. «Гельминтозоонозы-меры борьбы и профилактики». М.-1994. - С.111-113. г г

2.Одоевская И.М. Клонированная вставка кДНК эхинококка — уникальный зонд для ДНК-ДНК гибридизации // Матер.докп. 5-ой Всерос. научн. конф, «Актуальные проблемы медицинской параэнтологии»-С-П.-1998.-С.25-2 б.

3.Бережко В.К., Одоевская И.М., Клименко В.В., Качурина Л.И. Оценка диагностической эффективности гибридного белка Е.granulosus в клеточном лизате Exoli //Матер, докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями»- М.-1999.- С.32-34.

4. Одоевская И.М., Бенедиктов И.И. Амплификация ДНК гена Р, кодирующего высокоспецифичный белок-антиген ^granulosus, в полимеразной цепной реакции // Матер, докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнямшьМ.-1999.- С .201-202.

5. Одоевская И.М. Получение молекулярных антигенов эхинококка // Матер.докл, 5-ой Всерос. научн. конф. «Актуальные проблемы медицинской паразитолопш»-С-П.-1998.-С.25-26.

б.Одоевская И.М., Бенедиктов И.И. Подходы к получению клонированных антигенов эхинококка, пригодных для диагностики и профилактики эхинокоюсоза // Матер, докл. 5-ой научн. конф. «Актуальные проблемы медицинской паразитологии»-С-П.-1998.-С. 46.

7.0доевская И.М., Бенедиктов И.И., Мусаев Г.Х. Оценка диагностической эффективности очищенного белка F Е. granulosus, продуцируемого рекомбинантиыми клоками E.coli // Матер, докл. 6-ой научн. конф. «Актуальные проблемы медицинской паразитологии»- С-П,- 1998.-С. 157. 8.0доевская И.М., Бенедиктов ИИ., Мусаев Г.Х. Использование полимеразной цепной реакции (ПНР) для получения фрагментов генов Echinococcus granulosus, кодирующих белки-антигены паразита // Матер, докл. 6-ой научн. конф. «Актуальные проблемы медицинской паразитологии»- С-П.-1998.-С. 158. 9. Одоевская И.М., Бенедиктов ИИ. Получение нуклеотндных последовательностей эхинококка, кодирующих антигенные детерминанты паразита, с помощью ПЦР// Матер, докл. научп.-практ. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» М., 2001-С 186-188. Ю.Одоевская И.М., Бенедиктов И.И., Золкин Е.Е., Иваненко И.В. Получение рекомбинантного антигена Е. granulosus EgB и оценка его диагностических и протективных свойств, // Матер, докл. науч.-практич.конф.« Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» М., 2003 - Вып.4,- С 297-300, И.Одоевская И.М., Бенедиктов И.И. Опыт получения рекомбинантиых белков-антигенов ^granulosus //Тр. Всерос.нн-та гельминтол.-2004.-Т.40.- С .256-274. 12-Курбацкая В.И., Одоевская И.М., Андреянов О.Н. Пассирование природных изолятов Е. multilocularis на лабораторных животных// М.- 2004.- С.207-211. 13,Одоевская И.М., Бенедиктов И.И., Курносова О.П., Курочкина К.Г., Руденская Ю.А. Гуморальный и клеточный иммунный ответ при экспериментальном трихинеллёзе и альвеолярном гидатидозе // М.-2004.-С.278-281.

14.0доевская ИМ., Бережко В.К., Ястреб В.Б. Диагностические и иммунопрофнлактичекие свойства рекомбинантного антигена E.granuIosus EgB// М.-2004.-С.281 -286,

15. Одоевская И. М., Асеев В.В., Курбадкая В.К,Апарин ILA., Бенедиктов И.И. Выявление сходных нуклеотндных последовательностей ДНК E.granuIosus и Emultilocularis полимеразиой цепной реакцнеЙ//Матер. докл. научн.-практ. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» М.-2005.-С262-265.

16. Одоевская И.М., Бенедиктов И.И., Асеев В.В.} Руденская Ю.А. Создание продуцента рекомбинантного белка Е. granulosus в экспрессирующей векторной системе и оценка иммуногенных свойств антигена EgBZ/Матер. докл. научн.-практ. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» М,-2005.-С.266-268.

17-Одосвская И.М., Бенедиктов И. И, Асеев BJB. Руденская Ю.А. Получение рекомбинантных антигенов эхинококка и сценка их иммуногенных свойствУУМатер. 7-й международной научно-практич. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» М.-2005.-С.279-284.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.06.2000 г. Подписано в печать 28.04.2005 Тираж 100 экз. Усл. псч. л. 1,38

Печать авторефератов 730-47-74,778-45-60