Рекомбинантный антиген эхинококка EgF

Одоевская, Ирина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Рекомбинантный антиген эхинококка EgF
ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинантный антиген эхинококка EgF"

На правах рукописи

Одоевская Ирина Михайловна

РЕКОМБИНАНТНЫЙ АНТИГЕН ЭХИНОКОККА EgF (ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА)

Специальность 03.00.19 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии им.К.И.Скрябина и кафедре молекулярной биологии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

БЕНЕДИКТОВ Игорь Иванович кандидат биологических наук АСЕЕВ Виктор Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

ТЕРЕНИНА Надежда Борисовна (ИНПаРАН)

доктор ветеринарных наук, профессор ДАУГАЛИЕВА Эмма Хасановна (Нижегородская ГСХА)

Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии

Защита диссертации состоится « » июня 2005 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 006.011.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС)

Адрес: 117218, Москва, Б. Черемушкинская ул., д. 28 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС Автореферат разослан «_» апреля 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук _____Бережко В.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эхинококкоз распространен повсеместно, является серьёзной медицинской, социально-экономической и ветеринарной проблемой (Бессонов A.C., 1997; Геллер,1989), в связи с чем в настоящее время во многих странах мира ведутся интенсивные исследования ларвальных гидатидозов (Fasini Н.М., Hobbs R.P., 2002; Deplazes Р., Eckert J., 1996).

Прижизненная диагностика эхинококкозов основывается на эпизотологических данных и результатах иммунологических реакций со специфическим антигеном (Healt D.D.,1986; Irabiena О., Nieto A., Ferreira J.,2000), однако применение последних ограничено отсутствием доступного и стандартного антигенного материала, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью в серологических реакциях (Ito A.L et al, 1999; Jiang L.,Wen H., Ito A., 2001). Данным требованиям может отвечать антиген, кодируемый определённым геном в системе, в которой его можно наработать и очистить, т.е. антиген, получаемый генно-инженерным путём in vitro в требуемых количествах (Li J.et al., 2003). Практически ежегодно ВОЗ организует Международные рабочие встречи паразитологов, посвященные проблемам распространения, диагностики, вакцинопрофилактики и лечения ларвальных гидатидозов, причём особое внимание уделяется развитию молекулярно-биологических методов исследования эхинококкозов (Gottstein В., 1987). Во многих странах мира проводятся работы по клонированию генов гельминтов в различных векторных системах, в том числе и эхинококка (Lightowlers М. et al., 1990). Основной целью этих исследований является создание рекомбинантных ДНК, кодирующих гибридные белки-антигены, являющиеся основой для производства генно-инженерных вакцин и диагностикумов (Mamuti W. et al.,

Глобальное значение ларвальных гидатидозов, их большое влияние на экономику и здоровье населения различных стран мира неоднократно подчеркивалось в докладах Всемирной Организации Здравоохранения, на регулярно проходящих Международных конгрессах по гидатидологии. В последнее десятилетие важное место в работе этих симпозиумов занимают молекулярно-биологические аспекты изучения ларвальных гидатидозов, создания генно-инженерных вакцин и диагностикумов для профилактики и прижизненной иммунодиагностики этих опасных гельминтозов (ШвЫ А., МсМапив О., 1987; Woollard О. й а1„ 1998; ваиа С., е1 а1„ 2002; <Зопга1е2-Бар^етНа в. й а1„ 2000; \Уоо11ап10. « а!., 2000).

В последние годы в России отмечается рост заболеваемости людей и животных ларвальными гидатидозами, что связано с резко возрастающими миграционными процессами, массовым и бесконтрольным завозом продуктов из южных регионов. В связи с этим, изыскание биотехнологических способов получения неограниченных количеств стандартного и высокоэффективного антигенного материала, обеспечивающего - результативность проведения прижизненной иммунодиагностики и ва нококкоза,

2004)

является первостепенной задачей и насущной необходимостью как в научном, так и в практическом плане (Бережко В.К., 1997).

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящих исследований было получение рекомбинантных антигенов эхинококка, обладающих высокими диагностическими и протективными свойствами.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- создать представительный банк образцов суммарной ДНК E.granulosus и E.multilocularis;

- получить клонотеку генов кДНК эхинококка в экспрессирукмцем фаговом векторе и осуществить её иммунологический скрининг;

- выявить молекулярно-биологическими методами (ДНК-ДНК / гибридизацией, реакцией рестрикции эндонуклеазами, электрофорезом в агарозном геле) наличие вставки кДНК эхинококка у рекомбинантных клонов;

- подобрать оптимальную плазмидную векторную систему для экспрессии генов паразита, наработать препаративные количества плазмидной ДНК и фрагмента кДНК эхинококка;

- на основе лианеризованной ДНК векторной плазмиды и фрагмента кДНК паразита создать генно-инженерную конструкцию;

- создать продуцент гибридного белка паразита в экспрессирующей векторной системе рекомбинантная плазмида-клетки E.coli.

- повысить эффективность клонирования за счёт применения полимеразной цепной реакции (ПЦР), определить структуру олигонуклеотидных праймеров, гомологичных фрагменту уникального гена EgF E.granulosus и установить оптимальные условия проведения ПЦР;

- наработать в экспрессирующей векторной системе гибридный белок в препаративных количествах и очистить рекомбинантный антиген EgF;

- дать характеристику иммунохимических свойств рекомбинантного антигена;

- оценить диагностические и протективные свойства наработанного рекомбинантного антигена.

Исследования проведены по программе фундаментальных и прикладных исследований по научному обеспечению АПК РФ, а также по Федеральной целевой Hill Минпромнауки России «Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития науки и техники» (проект «Технологии биоконструирования препаратов для ветеринарии», № гос. регистрации 01.20.02 14534).

структура специфических олигонуклеотидных праймеров, отработаны оптимальные условия проведения ПЦР для получения неограниченного количества встройки кДНК эхинококка EgF. Создан продуцент гибридного белка паразита в экспрессирующей векторной системе рекомбинантная плазмида pQE/EgF-клетки E.coli SG-13009. На основе полученного стандартизированного рекомбинантного антигена разработан иммунноферментный диагностикум для прижизненной диагностики ларвальных гидатидозов, обладающий достаточно высокой специфичностью и чувствительностью. Показана высокая протективная эффективность антигена EgF при ларвальном эхинококкозе в опытах на лабораторных животных.

Практическая ценность работы. По результатам исследований по теме диссертации подготовлены и утверждены следующие нормативные документы:

1. Технологический регламент на выявление генома E.granulosus в реакции dot-гибридизации с использованием специфического радиоактивномеченного ДНК-зонда. Утвержден 5 февраля 1996 г. Ученым советом ВИГИС, протокол № 9.

2. Лабораторный регламент на получение рекомбинантных белков для иммунодиагностики цистного гидатидоза. Одобрен Ученым советом ВИГИС 27 октября 2000 г., протокол № 40.

3. Лабораторный регламент на модифицированный способ получения рекомбинантного белка F для иммунодиагностики цистного гидатидоза. Одобрен секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 25 мая 2001 года, опубликован в 38 томе (Труды ВИГИС).

4. Лабораторный регламент на модифицированный способ получения рекомбинантного белка EgB. Утверждён Ученым советом ВИГИС 6 июля 2003 г., протокол №14.

5. Патент на изобретение «Способ получения рекомбинантного антигена F E.granulosus» № 2234533, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.08.2004 г.

Апробация результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- научных конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 1993,2001,2003-2005 гг.);

- объединённых сессиях Координационного совещания по ветеринарной паразитологии Центрального совета Общества гельминтологов РАН и секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (1993-2005 гг.);

- заседаниях Ученого совета ВИГИС 1991-2005 гг.

Основные положения, выносимые на защиту:

- создание представительного банка геномной ДНК Е. granulosus и Е. multilocularis;

- получение клонотеки генов кДНК эхинококка в экспрессирующем векторе A.gtl 1 и иммунологический скрининг рекомбинантных клонов;

- идентификация нуклеотидной встройки кДНК эхинококка в полученных генно-инженерных конструкциях методами молекулярной биологии (ДНК-ДНК гибридизации, рестрикции эндонуклеазами, электрофорезом в агарозном и полиакриламидном гелях, иммуноблотгангом);

- создание продуцента гибридного белка EgF в экспрессирующей векторной системе рекомбинантная плазмида pQE/EgF клетки E.coli SGI 3009;

- поэтапный скрининг рекомбинантных клонов с использованием селективных сред, цветового теста и электрофореза в агарозном геле продуктов рестрикции ДНК эндонуклеазами;

- оптимизация клонирования паразитарных генов за счёт применения ПЦР, разработка структуры олигонуклеотидных праймеров и условий проведения этой реакции;

- получение и иммунохимическая характеристика рекомбинантного белка эхинококка;

- диагностические и протективные свойства рекомбинантного антигена

EgF.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 165 источников, в том числе 36 отечественных и 129 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 19 рисунками.

Обзор литературы

Представлен анализ литературы по биохимическим, молекулярным и иммунологическим аспектам паразито-хозяинных взаимоотношений при ларвальных гидатидозах, по антигенному составу и особенностям генома эхинококка, достижениям в области иммунодиагностики и вакцинопрофилактики эхинококкоза. Анализируются современные достижения учёных различных стран по клонированию генов, кодирующих синтез иммунологически значимых белков-антигенов, созданию рекомбинантных вакцин и диагностикумов при ларвальных гидатидозах человека и животных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Исследования проводились в 1991-2004 гг. в лаборатории биохимии и биотехнологии ВИГИС и на кафедре молекулярной биологии биологического факультета МГУ.

Объект исследования: ДНК из протосколексов и герминативных оболочек цист альвеолярного и цистного эхинококков, полученных от спонтанно

инвазированных сельскохозяйственных животных и человека, суммарная геномная ДНК из тканей животных - промежуточных хозяев данных гельминтов, генно-инженерные штаммы E.coli Y1088, Y1089, Y1090, JM109, SQ13009, фаг Xgtl 1, векторные плазмиды pUC 18-19, pQE, pMAL-c.

ДНК выделяли стандартньш методом с использованием протеин азы К, фенола и хлороформа в качестве депротеинизирующих агентов. Очищали ДНК с помощью многократных осаждений 70%, 80%, 96% этанолом с последующим перерастворением в ТЕ-буфере (pH 7,4).

Расщепление ДНК ресгриктазами проводили по методике Т.Маниатиса с соавторами (1984), для разделения, очистки и идентификации полученных фрагментов использовали метод электрофореза в агарозном (0,8-1,5% в зависимости от молекулярной массы анализируемых фрагментов) геле с последующим окрашиванием флуоресцирующим с ДНК красителем -бромистым этидием.

Получение препаративных количеств ДНК бактериофага Xgtll осуществляли согласно рекомендациям Т.Маниатиса с соавторами (1984).

ДНК векторной плазмиды выделяли методом щелочного лизиса (Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., 1990). Для выявления гомологичных клонированной встройки кДНК эхинококка EgF нуклеотидных последовательностей из геномов гельминтов использовали блот-гибридизацию по Саузерну с радиоактивномеченными методом ник-трансляции пробами.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе отечественного производства «Термоциклер» по стандартной методике, температурный режим и другие параметры реакции были рассчитаны и отработаны в связи с использованием уникальных специфических олигонуклеотидных праймеров. Создание рекомбинантных векторных конструкций с использованием бактериофага X.gtll и плазмид pUC18-19, pQE осуществляли согласно рекомендациям (Т.Маниатис с соавт., 1984) с некоторыми модификациями применительно к нашему объекту исследований.

Скрининг рекомбинантных клонов и реакцию трансформации компетентных клеток E.coli лигированной смесью проводили стандартными способами (Гловер Д., 1986; Щелкунов С.Н.,1986). Для повышения эффективности процесса клетки бактерий последовательно инкубировали в ледяной бане в 50 мМ растворах особо чистых солей (СаСЬ, MnCl2, MgCh) вплоть до теплового шока (43°С). Использование при выращивании трансформантов индуктора изопропилтиогалактозида (IPTG) и хромогенного субстрата X-gal в концентрациях 20мг/мл позволило отбирать рекомбинантные клоны по цветовому тесту, после чего их проверяли на наличие клонированной встройки кДНК эхинококка рестрикцией эндонуклеазами и электрофорезом в 1,5% агарозном геле.

Способ получения гибридного белка EgF в экспрессирующей векторной системе на основе рекомбинантой плазмиды подробно описан в патенте № 2234533 от 20.08.2004 г. и лабораторном регламенте (Одоевская И.М., Бенедиктов И.И., Труды Всерос.института гельминтол., т.38,2001 г.).

Иммунохимическую характеристику гибридного белка EgF проводили с использованием методов электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях, иммуноблоттинга и ракетного иммуноэлектрофореза с поливалентными сыворотками экспериментально заражённых животных.

Экспрессия гибридного белка рекомбинантной плазмидой и его очистка

Засеивали 80 мл среды LB клетками, содержащими гибридную плазмиду. Наращивали до плотности Дбоо = 0,5, отбирали 1 мл, центрифугировали и разбавляли клетки SDS-PAGE буфером. Добавляли IPTG до концентрации 0,3 мМ, инкубировали 2 часа при 3ТС. Отбирали 0,5 мл осадка клеток и делили на 2 пробирки.

Культуру центрифугировали при 4000 об/мин 10 минут. Удаляли супернатант, ресуспендировали 1-ый осадок в 5 мл лизирующего буфера, 2-ой осадок ресуспендировали в 10 мл 30 мМ трис-НС1, 20% сахарозы (рН 8,0). Осадок 1-замораживали при -20°С, осадок 2 - разрушали ультразвуком и центрифугировали при 9000 об/мин 20 минут, удаляли супернатант и ресуспендировали осадок в 5 мл лизирующего буфера. Смешивали 20 мкл экстракта 1 с 20 мкл 50% суспензии амилазы в колоночном буфере. Инкубировали 15 минут во льду. Удаляли супернатант и промывали осадок в 1 мл колоночного буфера, центрифугировали 1 минуту и ресуспендировали в 50 мкл SDS -буфера для проб.

Из клеточного лизата белки высаливали сульфатом аммония. Фракции собирали в интервале от 35% до 65% насыщения. Гельфильтрацию осуществляли на сефакриле S-300 в колонке диаметром 2 см и длинной 1 метр. При проведении хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе использовали колонку диаметром 2 см и длинной 20 см. Элюцию белков-антигенов осуществляли хлористым натрием в концентрации от 0 до 0,7 М.

Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Диагностическую эффективность рекомбинантного антигена EgF оценивали в ходе ИФР с сыворотками от людей с подтверждённым диагнозом «эхинококкоз» от условно здоровых доноров и с сыворотками крови от больных с другими паразитарными заболеваниями.

Иммуноферментную реакцию (ELIZA) ставили в непрямом варианте, в качестве твердой фазы использовали полистироловые планшеты отечественного производства фирмы «Медполимер». Сыворотки крови использовали в разведении 1:100, антивидовой конъюгат - в разведении 1:12000, окрашивание проводили субстратной смесью (на 10 мл цитратного буфера рН 5.0 вносили 8 мг ортофенилендиамина и 10 мкл 33% перекиси водорода). Останавливали реакцию добавлением 2М серной кислоты, учёт результатов проводили на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Протективную эффективность рекомбинантного антигена EgF изучали на белых беспородных мышах весом 18-20 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Создание байка геномных ДНК гельминтов

Для создания банка геномной ДНК паразита протосколексы и герминативные оболочки получали из гидатидозных цист Е granulosus и E.multilocularis, собранных на мясокомбинатах (хозяин - овцы, крупный рогатый скот), в охотохозяйствах (хозяин лось, кабан, КРС, ондатра, серые крысы, мыши-полёвки и др.) и в 7-ом хирургическом отделении Медицинской Академии им. И.М.Сеченова (операционный материал от людей). Также для проведения экспериментов проводился сбор образцов гетерологичных ДНК паразитов (T.spiralis, C.tenuicollis, O.dentatum, F.hepatica, T.hydatigena, T.solium, M.multiceps, A.suum, T.canis, T.leonina, U.stenocephala, T.pisiformis). Всего было выделено и очищено 87 образцов нативной геномной ДНК различных гельминтов, что явилось основой для создания Банка генов паразитов ВИГИС.

Получение кДНК банка генов E.granulosus

Конструирование кДНК банка осуществляли с использованием ферментных наборов фирмы Amercham в экспрессирующем векторе Xgtll. Синтез первой цепи осуществляли с помощью обратной транскриптазы вируса миелобластоза, матрицей для синтеза кДНК послужила poly(A)PHK, выделенная из протосколексов E.granulosus из печени овцы, в качестве затравки использовали oligo(dT). Продукт синтеза первой цепи служил субстратом для обработки РНК-азой Н, ДНК-полимеразой 1 E.coli и ДНК-липазой E.coli в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Образующуюся на молекуле "шпильку" расщепляли нуклеазой S1. Полученные двухцепочечные кДНК достраивали ДНК-полимеразой Т4, затем обрабатывали метилазой EcoRl и лигировали с дефосфорилированными EcoRl линкерами. Ферментом EcoRl образовывали липкие концы. Подготовленную таким образом кДНК лигировали с ДНК фага Xgt 11, предварительно расщепив вектор по сайту E.coRl и обработав щелочной фосфотазой.

Получение геномной библиотеки E.graaulosus в векторе на основе бактериофага Xgtll

Упаковку полученных рекомбинантных молекул ДНК в частицы бактериофага проводили in vitro, используя коммерческие упаковочные экстракты фирмы Amercham. Образовавшиеся фаговые частицы амплифицировали в клетках E.coli Y1088, продуцирующих 1ас-репрессор, что уменьшило процесс вытеснения рекомбинантных клонов ввиду подавления синтеза токсичных для хозяина гибридных белков, кодируемых рекомбинантными фагами EgF. Полученную клонотеку высевали на свежие

чашки с ЬВ-агаром, содержащем ампициллин (50мкг/мл), ШТв (20мкг/мл), х-(20мкг/мл). В качестве газона использовали бактерии штамма У1088.

В результате была получена представительная кДНК библиотека с эффективностью клонирования 1х105 клонов на мкг полиаденилированной РНК.

Библиотека скринирована с использованием авидин-биотиновой системы с применением белков сыворотки крови людей с подтвержденным диагнозом «эхинококкоз». Предварительно белки сыворотки крови очищали от антител к белкам Е.соИ, которые присутствуют в любой сыворотке крови человека. Очистку сывороток проводили при помощи аффинной хроматографии на колонках с СН-ЗерЬагоБе 4В, к которой были пришиты тотальные белки Е.соЬ (Остерман, 1985).

Библиотеки в высевали на чашки диаметром 95 мм, полученные

клоны переносили на нитроцеллюлозные фильтры, которые окрашивали в

реакции сЫ-БОБА.

В результате было получено несколько рекомбинантных клонов которые продуцировали белки, обладавшие антигенными свойствами эхинококка.

S S 5 8 8 2КЙК» 28*5

* = t s й 88SSS 88ЙЙ

I I 1 ПШ ffil II III

Х_-J-1 t t,M W-1 I 1 l,L

3 ' -..ТТЛ САД СТА CftG ATG Ц'ТТ ААЬ GCG.'.. 5' Ile Asn Ile Asp Val Phe Glu Ala

Рис.1 Схема клонирования фрагментов кДНК эхинококка в фаг Xgtl 1. Lac-Z - область фага, кодирующая р-галактозидазу.

Горизонтальной стрелкой обозначено направление транскрипции, вертикальной- место лигирования по сайту Eco RI.

Таким образом, был проклонирован экспрессирующийся фрагмент ДНК эхинококка, представляющий собой кДНК копию информационной РНК, транскрибирующий уникальный ген E.granulosus.

Гибридизационный анализ геномной ДНК эхинококка с полученными из рекомбинантных фагов встройками кДНК эхинококка проводили по методу Саузерна (25), для чего радиоактивным фосфором 32Pjpcp помечали ник-транслированные вставки кДНК эхинококка. Меченые Ррср пробы были денатурированы нагреванием при 95°С в течение 2-3 минут, затем помещены в лед. Удельная активность ник-транслированной пробы составляла 10 имп/мин/мкг. Геномная ДНК эхинококка, выделенная из протосколексов, была подвергнута реакции рестрикции ферментом EcoRI и фракционирована в 0,8% агарозном геле в трис-ацетатном буфере с последующим окрашиванием

бромистым этидием.

После окончания электрофореза гель несколько раз ополаскивали бидистиллированной водой. Нейлоновую мембрану, предварительно выдержанную в воде 10 минут, помещали в буфер для переноса. Агарозный гель переносили в прибор для каппилярного переноса нуклеиновых кислот, заполненный тем же буфером. Сверху гель накрывали мембраной Hybonil-N (Amersham), тщательно удаляли пузыри воздуха и поверх накладывали стопку фильтровальной бумаги толщиной не менее 12 см. Перенос проводили 20-24 часа при комнатной температуре. После этого блот промывали в буфере несколько раз, высушивали под инфракрасной лампой и выдерживали в вакуумном сушильном шкафу при 80 С в течение двух часов. Мембрану помещали в стерильный полиэтиленовый пакет, добавляли гибридизационную смесь из расчета 1 мл смеси на 1 см2 мембраны, инкубировали 5 часов при 65° С. По истечении указанного времени запаянный пакет вскрывали, буфер для предгибридизации сливали и добавляли радиоактивномеченные методом ник-трансляции вставки кДНК эхинококка (по сути являющиеся радиоактивными зондами), растворенные в гибридизационной смеси. На 1 см2 нейлоновой мембраны брали 5x106 имп/мин зонда при его койцейтрации 15x106 имп/мин/мл, гибридизацию вели при 65°С в течение 16-20 часов. По ее окончании удаляли гибридизационную смесь и тщательно отмывали мембрану от радиоактивных частиц (3 раза по 30 минут при 65°С на вортексе в термальной камере). Отмытую мембрану запаивали в полиэтиленовый пакет и подвергали авторадиографии при -7Q°C с рентгеновской пленкой РМ-В в течение 12 часов.

На основании гибридизации геномной ДНК эхинококка с радиоактивно-меченными вставками к ДНК в рекомбинантных фагах Xgtl 1 был сделан вывод о том, что эти рекомбинантные фаги содержат уникальные последовательности F, гомологичные участкам ДНК эхинококка.

Подбор оптимальной экспрессирующей векторной системы

В дальнейшей работе с экспессирующей векторной системой рекомбинантный фаг A.gtl l/EgF-клетки E.coli Y-1089 возникло много трудностей. Во-первых, фактическая экспрессия рекомбинантного пептида составляла менее 0,5% от тотальных белков, в то время как, согласно литературным данным, могла составлять от 5 до 7%. Во-вторых, огромную проблему представляла реверсия рекомбинантных фагов со встройкой к ДНК E.granulosus. Фактически через 2-3 поколения большинство фагов возвращалось к исходному, "дикому" типу. Сохранять рекомбинантов путем пересевов и перезаражений клеток-хозяев стало невозможно, поскольку трудно было предугадать, какой клон ревертировал к "дикому" типу, а какой еще имеет встройку кДНК эхинококка. В связи с этим вся клонотека рекомбинантных фагов EgF сохранялась в виде векторной ДНК, а не живых фагов. Для заражения клеток Е. coli и получения гибридных лизатов каждый

раз приходилось "упаковывать" фаговую ДНК в белковые оболочки, что обусловливало большие затраты средств и рабочего времени (рекомбинантную фаговую ДНК "упаковывали" in vitro, синтезируя белковые оболочки фага с помощью упаковочных экстрактов фирмы Amersham).

Определение нуклеотидной последовательности встройки Б в плазмиде риС-19 проводили по методу Сэнгера с использованием коммерческого набора для секвенирования. Секвенирование осуществляли по двум цепям с использованием прямого и обратного праймеров М13 и дополнительно синтезированных праймеров.

Нуклеотидная структура фрагмента Б эхинококка приведена на рис.2.

1 14 24 34 44

РЦС-скСААТТССТАС АСАТСААСАТ ТССАТСТААА СТССССвАТС ТТТССАОАА

СААТААССАО ААСАТТАСПГА СТАССвАСАА АСТСССТАСТ СТСТССАСС

144

АССТТССТТС ССААТСАСАА ААСССАССТГ СССААСТТТС ААААТОСТв

194

АСОСААССТТ СТСАТСТССА ТСАСССТАТС СССАСТСССА АААСААТТТ

244

СААТАСТСАв СТТААТАССА ССТТСАТГСА АСАТТТСААА АСТТСТТСА

294

АСАССАСОСТ ТАСССАСвСС САСАААССАА АОССААСАСТ САССАОСТТ

344

СОАСТАСАТТ ТССАСГСТСА СААСАСТААА ТТ(5ААСААТС ТААСАСгеС

394

ССААСАОААС СССААС.ТССО \ggccgacgt СССААААСАС АААСТСАСТ

444

ТССАТСвАСТ ССАССААСАА ТСТСТТАСТА ТСТТГСАСАА САСТГССААА ОААТТСтРЦС

Рис.2. Нуклеотидная структура фрагмента F кДНК E.granulosus

Размер фрагмента составляет 453 основания, подчеркнуты области затупленных Eco RI сайтов, мелким шрифтом выделены части сайта, по которому было проведено клонирование в полилинкер плазмиды pUC19. Нумерация начинается с конца EcoRI-линкера.

Субклонирование в экспрессирующую плазмндную векторную систему В течение последующих нескольких лет мы проводили работу по переклонированию встройки кДНК эхинококка в перспективные с нашей точки зрения плазмидные векторные системы, способные обеспечить экспрессию достаточного количества гибридного белка. Использование плазмидных векторов pMAL-c, pMAL-p, рКК233, pUC-18, pUC-19, pTZ-18, pTZ-19 и ряда других не смогло обеспечить должного уровня экспрессии рекомбинантных белков, хотя и существенно облегчило генно-инженерные операции.

Методом компьютерной трансляции фрагмент гена эхинококка размером 453 п.н. был переведён и прочитан как соответствующая аминокислотная последовательность. Установлено, что белки E.granulosus являются весьма токсичными для любой живой клетки по двум причинам:

1) белки эхинококка имеют в своем составе крупные гидрофобные блоки, отрицательно воздействующие на клеточную мембрану, что вызывает подавление роста клеток штамма продуцента и даже их гибель;

2) в состав получаемых гибридных белков эхинококка входят блоки заряженных аминокислот, обладающих сильными сорбирующими свойствами. Последние прочно связываются с нуклеиновыми кислотами, что приводит к угнетению или полному торможению процесса размножения клеток хозяина.

Эти особенности были учтены при выборе системы векгор-хозяин, пригодной для молекулярного синтеза рекомбинантных белков и создания плазмидного суперпродуцента антигенов эхинококка.

1 30

GaattcGTA GAC АТС ААС АТГ GCA TCT AAA GTC GCG GAT GCT TTC Val Asp Ile Asp Пе Ala Ser Lys Val Ala Asp Ala Phe

CAG AAG AAT AAG GAG AAG ATT ACT ACT ACC GAC AAA CTG Gin Lys Asn Lys Glu Lys Пе Thr Thr Thr Asp Lys Leu 90

GCT ACT GCT CTC GAC CAG GTT GCT TCC CAA TCA GAA AAG Gly Thr Ala Leu Glu Gin Val Ala Ser Gin Ser Glu Lys

120 ISO

GCA GCT CCC CAA CTT TCT AAA ATG CTG ACG GAA GCT TCT Ala Ala Pro Gin Leu Ser Lye Met Leu Thr Glu Ala Ser

ISO

GAT GTC CAT CAG CGT ATG GCC ACT GCC AGA AAG AAT TTC Asp Val His Gin Arg Met Ala Tb Ala Arg Lys Asn Phe 210

AAT ACT GAG GTT AAT ACC ACC TTC ATT GAA GAT TTG AAA Aip Ser Glu Val Asn Thr Thr Phe De Ghi Asp Leu Lys 240 270

ААС TTC TTG ААС ACC ACG CTT AGC GAG GCC CAG AAA GCA Asn Phe Leu Asn Thr Thr Leu Ser Glu Ala Gin Lys Ala

300

AAG CCA AGA CTG GAG GAG GTT CGA СТА GAT TTG GAC ТСГ Lys Pro Arg Leu Ghi Glu Val Arg Leu Asp Leu Asp Ser 330

GAC AAG ACT AAA TTG AAG AAT GCT AAG ACT GCG GAA CAG Asp Lys Thr Lys Len Lys Asn Ala Lys Ihr Ala Glu Gin 360 390

AAG GCC AAG TGG GAC GCC GAC GTG CGA AAA GAC GAA AGT Lys AU Lys Tip Glu Ala Ghi Val Arg Lys ' Àsp Glu Ser

420

GAC TTC GAT CGA GTG CAC CAA GAA TCT CTT ACT АТС TCT Asp Phe Asp Arg Val His Gin Glu Ser Leu Thr lie Phe 444

GAG AAG ACT TGC AAA gaa ttc Glu Lys Thr Cys Lys

Рис.3. Аминокислотная структура белка E.granulosus, транслируемого последовательности клона F.

Мелким шрифтом выделены EcoRI линкеры.

Для получения препаративных количеств антигенно-активных белков эхинококка была выбрана система суперэкспрессии генов, клонированных в векторах серии pQE, в клетках E.coli штамма SG13009 (pREP4). В этой системе полностью подавлена экспрессия клонированных генов в отсутствии индуктора. Полученный белок содержит дополнительный пептид из 6 остатков гистидина и может быть легко очищен хроматографией на никелевых носителях при наличии таковых.

Различные представители плазмид pQE позволяют получить гексагистидиновый пептид на "С" или " N" конце и экспрессировать гены, находящиеся в любой из трех возможных рамок считывания. Кроме того, этот вектор содержит сильный промотор, индуцируемый IPTG, и участок прочного связывания рибосом, что обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков. Штамм-продуцент клеток Е. coli SG13009 позволяет поддерживать рекомбинантные плазмиды pQE даже в том случае, если в них клонированы гены токсичных для клетки белков, так как они содержат самый высокий уровень "lac" репрессора.

Так как вставка кДНК рекомбйнантного фага была проклонирована по сайту рестрикции EcoRI, а в векторах экспрессии pQE клонирование по этому сайту невозможно, возникла дополнительная необходимость промежуточного клонирования в синтетический полилинкер, в котором сайт EcoRI окружен сайтами других рестриктаз, по которым возможно осуществить клонирование в данной плазмиде.

Для повышения эффективности клонирования и облегчения получения препаративных количеств фрагмента ДНК E.granulosus нами была применена полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время этот метод широко используется для наработки препаративных количеств отдельных генов или их фрагментов, так как он позволяет избежать сложной и длительной работы по получению библиотеки кДНК, используя расшифрованные нуклеотидные последовательности начала и конца этих генов. Обработка имеющихся данных по иммунологически активным генам E.granulosus на основании компьютерных программ "DNAsis" и "Oligos" позволила нам разработать программу синтеза олигонуклеотидных праймеров, гомологичных структурам уникальных генов, кодирующих антигены эхинококка по структуре фрагмента F ДНК эхинококка размером 453 пар нуклеотидов.

К концам специфических праймеров были добавлены синтезированные сайты рестрикции для ферментов BamHI (прямой праймер) и HindIII (обратный праймер). Структура соответствующих праймеров приведена на рис.4. Синтез праймеров проведен в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Прямой

5' CGGGATCCGTAGACATCAACATTQCATC 3'

Обратный

5' CAAGCTTTGCAAGTCTTCTCAAAGATAG З1 Рис.4. Структура олигонуклеотидных праймеров EgF E.granulosus.

Выделение эукариотической геномной ДНК гельминтов

Процедура выделения геномной ДНК паразитов проводилась постоянно для проведения гибридизации, клонирования, полимеразной цепной реакции, идентификации геномов паразитов.

Для проведения ПЦР были наработаны следующие количества нативной геномной ДНК эхинококка от различных хозяев: лося - 30 мкг, овцы 8 мкг, свиньи 12 мкг. Кроме того, для проведения ПЦР было выделено 18 мкг ДНК рекомбинантных плазмид рС^ЕЛ7 и 20 мкг ДНК фага А^П 1.

С аликвотами различных образцов геномной ДНК эхинококка и синтезированными уникальными праймерами к клонированному фрагменту гена Р были проведены реакции амплификации. Полимеразная цепная реакция проводилась в объеме 25 мкл инкубационной смеси в течение 4-х часов.

Режим амплификации геномной ДНК эхинококка

1 цикл денатурация ДНК при 95° С -120 сек

S циклов денатурация ДНК при 95° С - 60 сек отжиг праймеров при 53е С -120 сек элонгация цепи (синтез фрагмента) при 72° С -120 сек

30 циклов денатурация ДНК при 95° С - 30 сек отжиг праймеров при 53° С -120 сек элонгация цепи (синтез фрагмента) при 71° С - 90 сек

Поскольку продукты амплификации гена F с геномной и с клонированной ДНК эхинококка, полученной из различных источников, имели одинаковый размер, можно было предположить, что этот ген не содержит интронов, по крайней мере, в его кодирующей части.

Благодаря тому, что полученные в ПЦР фрагменты имели на концах участки узнавания для рестриктаз Ваш HI и Hind III, клонирование в полилинкер плазмиды pQe прошло успешно. Фрагмент F был встроен в экспрессионную плазмиду pQE.

Последующее клонирование в векторной системе pQE-SG 13009 позволило создать продуцент белка F эхинококка.

Субклонирование фрагмента EgF в экспрессирующий плазмидный вектор.

С целью получения препаративных количеств гибридного антигена EgF было осуществлено субклонирование вставки кДНК E.granulosus в экспрессирующую векторную систему pQE-SG13009.

Способ получения гибридного антигена EgF включал следующие этапы:

- выделение эукариотической геномной ДНК E.granulosus из протосколексов паразита;

- получение препаративных количеств фрагмента ДНК F эхинококка с помощью ПЦР;

- получение препаративных количеств ДНК векторной плазмиды pQE;

- конструирование рекомбинантной плазмиды pQE-F E.granulosus;

- проведение реакции трансформации клеток E.coli рекомбинантной плазмидой и скрининг положительных клонов;

- экспрессию гибридного белка рекомбинантной плазмидой и его очистку;

определение диагностической эффективности полученного рекомбинантного антигена EgF.

Проведение реакции трансформации клеток E.coli рекомбинантной плазмидой

Проведение реакции трансформации компетентных клеток E.coli лигирующей смесью позволяет оценить жизнеспособность рекомбинантной конструкции. В качестве контроля используют ДНК нативной векторной плазмиды для трансформации тех же компетентных клеток.

Получение культуры компетентных клеток штамма JM-109.

Из музейной культуры пригодного для этих целей бактериального штамма приготавливается 5 мл «ночной культуры». В колбу Эрленмейера объёмом 250 мл с LB-средой вносили полученную суспензию клеток в количестве 5% от объёма среды. Наращивание биомассы клеток проводили при 37°С и усиленной аэрации до достижения средней логарифмической фазы роста при Д600=)0,5. Клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин (40°С, 5 минут). Полученный осадок ресуспендировали в охлаждённом буфере (50 мМ СаCU, 10 мМ RbCl, 100 шМ MOPS) и инкубировали во льду 15 минут. Клетки вновь осаждали центрифугированием в том же режиме и суспендировали в 5 мл буфера. Суспензию клеток расфасовывали по 200 мкл в стерильные охлаждённые пробирки и замораживали в жидком азоте.

Трансформация компетентных клеток векторной плазмидной ДНК

Извлечённую из жидкого азота пробирку с замороженными клетками оттаивали во льду 30-40 минут и, не вынимая пробирки изо льда, добавляли в суспензию клеток 5-10мкг векторной ДНК. Осторожно покачивая, смесь инкубировали во льду ещё 40 минут, после чего проводили тепловой шок, перенеся пробирки в водяную баню с температурой 42-43°С. При этом создаются условия для расширения пор в клеточной мембране и плазмидные ДНК в суперскрученной форме могут проникать внутрь клетки. Последующая инкубация длилась 1,5 часа при 37°С. Этого времени достаточно, чтобы в бактериях прошёл процесс восгановления и началась экспрессия подконтрольных плазмиде генов устойчивости к антибиотикам. Подросшие клетки концентрировали 15-20 секундным центрифугированием, к осадку добавляли 100 мМ IPTG, 0,25% x-gal и высевали на твердый LB-arap с ампициллином (50 мкг/мл).

Получаемая при использовании этого метода эффективность трасформации дикой (исходной) плазмидой составляла 105 или 10 колоний на 1 мкг векторной ДНК, рекомбинантной - 102 или 103 колоний на 1 мкг конструированной ДНК.

Скрининг положительных клонов

Трехступенчатый скрининг (тесты: на устойчивость к антибиотикам с применением селективных сред, изменеие цвета рекомбинантных клонов из-за нарушения экспрессии продукта бетга-галактозидазы, увеличение молекулярной массы ДНК гибридной плазмиды на величину клонированной встройки) рекомбинантных клонов осуществляли по модифицированным применительно к нашим условиям методикам (Т.Маниатис,1984; Гловер Д., 1986; Мазин А.6., Кузнеделов К.Д.,1990). Отобранные с чашек рекомбинантные клоны' повторно проверяли на наличие в них вставки ДНК эхинококка на молекулярном уровне, проводя реакции рестрикции соответствующими ферментами с последующим электрофорезом в 0,8% агарозном геле и ДНК-ДНК гибридизации, используя радиоактивномеченные зонды на основе фрагментов генов эхинококка.

В дальнейшем белковые продукты всех клонов, содержащих встройку кДНК эхинококка, были проанализированы с помощью иммунологических методов: ИФР, ракетного иммуноэлектрофореза, иммуноблоттинга или реакции иммунопреципитации по Оухтерлони.

В результате проведённого скрининга было выявлено 18 антигенположительных клонов, используемых в дальнейшей работе в качестве продуцентов иммунологически значимых белков эхинококка.

Отобранные клоны использовали для получения белка Р эхинококка.

В результате проведенной работы был наработан в препаративных количествах (1800 мг) и очищен белок Б из рекомбинантного штамма Е.соЬ.

Методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле установлена гомогенность полученного антигена и его молекулярная масса, равная 16,7 кД.

Для оценки диагностической эффективности активности гибридного белка Б в ИФА использовали 93 пробы сывороток крови человека, в состав которых входили: 62 сыворотки крови пациентов с подтвержденным диагнозом "эхинококкоз" из факультетской хирургической клиники Московской медицинской академии им, И.М. Сеченова и 24-й городской клинической больницы. В качестве гетерологичных проб использовали сыворотки крови 20 условно здоровых пациентов и 11 больных следующими заболеваниями: альвеококкозом (3), описторхозом (1), язвой желудка (1), токсокарозом (3), трихинеллезом (1), амебиозом (1), дифиллоботриозом (1).

Результаты комиссионного испытания выявили следующее:

а) из 62 сывороток с подтвержденным диагнозом эхинококкоз очищенный белок показал положительные результаты с 52, а отрицательные - с 10 сыворотками (чувствительность теста составила 83,8%);

б) из 31 сыворотки условно здоровых и с гетерологичными инвазиями и инфекциями очищенный гибридный белок F показал отрицательную реакцию с 25, положительную с 6 пробами сывороток. Таким образом, специфичность ИФА с очищенным гибридным белком F составила 77,4%.

Оценка протективной эффективности рекомбинантного антигена EgF эхинококка была проведена на 146 белых беспородных мышах массой 18-20 г.

Опытные животные были распределены на 4 группы: 2 опытных и 2 контрольных. Иммунизацию мышей проводили трехкратно, дважды подкожно, один раз внутрибрюшинно с интервалом 10 дней в дозе (в объёме) 0,5 мл каждого препарата:

1-я группа (опытная): иммунизация антигеном EgF, эмульгированым с масляным адъювантом ВНИИЗЖ (1:1);

2-я группа (опытная): иммунизация антигеном EgF;

3-я группа (контроль): иммунизация масляным адъювантом ВНИИЗЖ с равным объёмом физиологического раствора;

4-я группа (контроль): инъецирована физиологическим раствором в дозе 0,5 мл.

Каждое иммунизированное животное в общей сложности получило по 150 мкг белка-антигена Eg F. По истечению 14 дней после последней иммунизации животных всех 4-х групп подвергли заражению ацефалоцистами и протосколексами альвеолярного эхинококка в количестве 300 экземпляров на 1 животное внутрибрюшинно в физиологическом растворе с антибиотиками. Убой животных и учет результатов опыта проводили через 90 дней после заражения.

Паталогоанатомическим вскрытием мышей было установлено: у животных опытных групп обнаружены ларвоцисты альвеолярного эхинококка в незначительном количестве (у мышей 1-й группы оказались заражены 2 особи, второй - 3). Это составило соответственно 7,1 (I группа) и 11,7% (II группа).

У животных контрольных групп выявлено множественное поражение внутренних органов ларвоциетами альвеолярного эхинококка размером от 1 до 14 мм в диаметре. В единичных пузырях обнаружены сформировавшиеся протосколексы.

Таким образом, было показано, что испытанный рекомбинантный белок-антиген EgF обладает выраженным протективным действием на развитие ларвоцист E.multilocularis и может быть использован в качестве основы для создания вакцины против эхинококкоза животных.

В результате многолетней работы по клонированию нуклеотидных последовательностей эхинококка в различных экспрессирующих векторных системах удалось получить препаративные количества рекомбинантного белка-антигена F паразита, пригодного для создания на его основе диагностикума и вакцины при ларвальном эхинококкозе.

ВЫВОДЫ

1. Получена библиотека генов E.granulosus на основе бактерофага Xgtll с представительностью 1,5х105. Методом гибридизации in situ выявлены фаги, содержащие нуклеотидные последовательности ДНК, кодирующие синтез иммунологически значимых белков-антигенов эхинококка.

2. Разработан способ выявления генома эхинококка методом dot-гибридизации радиоактивномеченным (32Р) зондом на основе клонированной вставки E.granulosus EgF в реакции ДНК-ДНК гибридизации с суммарными про- и эукариотическими ДНК различных организмов. Полученные радиоавтографы свидетельствуют, что клонированные встройки к ДНК эхинококка не гибридизируются с ДНК отрицательных контролей (ДНК из тканей животных-хозяев гельминтов, клеток бактерий, трансформированных нерекомбинантными фагами и плазмидами), но гибридизируется с суммарными геномными ДНК цистного и альвеолярного эхинококка, генно-инженерными конструкциями, имеющими кДНК эхинококка. Аналогичный результат был получен при проведении полимеразной цепной реакции.

3. Секвенирована нуклеотидная последовательность EgF эхинококка размером 453 п.н. Уникальность клонированного фрагмента паразита и отсутствие гомологии с клонированными в других странах нуклетидными последовательностями эхинококка подтверждены результатом проведенного компьютерного аналаза по программе «.ZJNAsis» фирмы «Фармация» (патент РФ № 2234533 от 20.08.2004 г.).

4. Амплификацией нуклеотидной последовательности EgF в полимеразной цепной реакции с образцами геномной ДНК эхинококка и ДНК рекомбинантных клонов показано, что этот клонированный фрагмент гена не содержит интронов, по крайней мере, в кодирующей части, т.к. при электрофоретической детекции продуктов ПЦР все получаемые фрагменты имеют одинаковую молекулярную массу.

5. Проведенный анализ аминокислотной последовательности антигена EgF показал наличие токсических свойств получаемого рекомбинантного белка: а) белки эхинококка имеют в своём составе крупные гидрофобные блоки, отрицательно воздействующие на клеточную мембрану, что вызывает подавление роста клеток и даже их гибель; б) в состав белков эхинококка входят блоки заряженных аминокислот, имеющих сорбирующие свойства. Они прочно связываются с нуклеиновыми кислотами, что угнетает или вовсе тормозит размножение клетки-хозяина. Полученные данные были учтены при выборе системы вектор-хозяин, пригодной для молекулярного синтеза рекомбинантных белков паразита.

6. Повышена эффективность клонирования фрагмента гена эхинококка за счет использования полимеразной цепной реакции со специфическими олигонуклеотидными праймерами. Получено и очищено 68 мкг нуклеотидной вставки.

7 Создан продуцент рекомбинантного белка эхинококка в экспрессирующей векторной системе pQE/EgF-клетки E.coli SG-13009 и получен очищенный рекомбинантный белок EgF в количестве 1800 мг. Синтезируемый под контролем рекомбинантной плазмиды pQE/EgF белок-антиген эхинококка гомогенен и имеет молекулярную массу 16,7 кДа.

8. Разработаны методы анализа иммунологических свойств синтезируемых в векторных системах гибридных белков с использованием иммуноблоттинга, денатурирующего электрофореза и ракетного иммуноэлекгрофореза, а также способы физико-химической характеристики рекомбинантного белка.

9. Диагностическая эффективность рекомбинантного антигена EgF в ИФР (ELISA) с использованием сывороток крови людей с подтвержденным диагнозом «эхинококкоз» составила по чувствительности 84,9 % и по специфичности 86,1 %.

10. Проведённые испытания иммунопрофилактических свойств рекомбинантного антигена на белых беспородных мышах выявили высокую степень защиты при ларвальном гидатидозе.

11. Полимеразная цепная реакция с различными олигонуклеотидными прайм ерами, гомологичными участкам геномной ДНК альвеолярного и цистного эхинококка, кодирующим иммуногенные белки обоих паразитов, выявила высокую степень сходства участков геномов этих двух гельминтов. Полученные данные подтверждают правомочность использования лабораторной модели альвеолярного эхинококкоза для изучения антигенных свойств при цистном гидатидозе.

Практические предложения

Модифициованный способ получения рекомбинантного антигена эхинококка одобрен секцией «Инвазионные болезни животных» отделения ветеринарной медицины РАСХН 25 мая 2001 г., рекомендован для получения стандартизированного антигена, пригодного для иммунодиагностики цистного гидатидоза, и включен в сборник «Современные методы исследований в ветеринарии» (РАСХН, 2005 г, в печати).

Материалы диссертации могут быть использованы в ветеринарных и медицинских лабораториях, проводящих иммунологические исследования на основе паразитарных антигенов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Одоевская И.М., Качурина Л.И. Получение препаративных количеств вставок кДНК E.granulosus в системе клеток Е.соИ У1088 - рекомбинантный фаг 1 //Матер.докл.науч.конф. «Гельминтозоонозы-меры борьбы и профилактики»-М.-1994.-С.111-113.

2.0доевская И.М. Клонированная вставка кДНК эхинококка - уникальный зонд для ДНК-ДНК гибридизации // Матер.докл. 5-ой Всерос. научн. конф. «Актуальные проблемы медицинской паразитологии»-С-П.-1998.-С.25-26. З.Бережко В.К., Одоевская И.М., Клименко В.В., Качурина Л.И. Оценка диагностической эффективности гибридного белка E.granulosus в клеточном лизате E.coli //Матер, докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями»- М.-1999.- С.32-34.

4.0доевская И.М., Бенедиктов И.И. Амплификация ДНК гена F, кодирующего высокоспецифичный белок-антиген E.granulosus, в полимеразной цепной реакции // Матер, докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями»-М.-1999,- С.201-202.

5. Одоевская И.М. Получение молекулярных антигенов эхинококка II Матер.докл. 5-ой Всерос. научн. конф. «Актуальные проблемы медицинской паразитологии»-С-П.-1998.-С.25-26.

б.Одоевская И.М., Бенедиктов И.И. Подходы к получению клонированных антигенов эхинококка, пригодных для диагностики и профилактики эхинококкоза // Матер, докл. 5-ой научн. конф. «Актуальные проблемы медицинской паразитологии»- С-П.-1998.-С. 46.

7.0доевская И.М., Бенедиктов И.И., Мусаев Г.Х. Оценка диагностической эффективности очищенного белка F E.granulosus, продуцируемого рекомбинантными клонами E.coli // Матер, докл. 6-ой научн. конф. «Актуальные проблемы медицинской паразитологии»- С-П.-1998.-С. 157. 8.0доевская И.М., Бенедиктов И.И., Мусаев Г.Х. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) для получения фрагментов генов Echinococcus granulosus, кодирующих белки-антигены паразита // Матер, докл. 6-ой научн. конф. «Актуальные проблемы медицинской паразитологии»- С-П.-1998.-С. 158. 9. Одоевская И.М., Бенедиктов И.И. Получение нуклеотидных последовательностей эхинококка, кодирующих антигенные детерминанты паразита, с помощью ПЦР// Матер, докл. научн.-практ. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» М., 2001- С 186-188. Ю.Одоевская И.М., Бенедиктов И.И., Золкин Е.Е., Иваненко И.В. Получение рекомбинантного антигена E.granulosus EgB и оценка его диагностических и протективных свойств. // Матер, докл. науч.-практич.конф. « Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» М., 2003 - Вып.4,- С 297-300. 11 .Одоевская И.М., Бенедиктов И.И. Опыт получения рекомбинантных белков-антигенов E.granulosus //Тр. Всерос.ин-та гельминтол.-2004.-т.40.- С .256-274. 12.Курбацкая В.И., Одоевская И.М., Андреянов О.Н. Пассирование природных изолятов Е. multilocularis на лабораторных животных// М,- 2004,- С.207-211. 1 З.Одоевская И.М., Бенедиктов И.И., Курносова О.П., Курочкина К.Г., Руденская Ю.А. Гуморальный и клеточный иммунный ответ при экспериментальном трихинеллёзе и альвеолярном гидатидозе // М.-2004.-С.278-281.

14. Одоевская И.М., Бережко В.К., Ястреб В.Б. Диагностические и иммунопрофилактичекие свойства рекомбинантного антигена Е.granulosus EgB//M.-2004.-€.281-286.

15. Одоевская И. М., Асеев В.В., Курбацкая В.И.,Апарин П.А., Бенедиктов И.И. Выявление сходных нуклеотидных последовательностей ДНК Е.granulosus и E.multilocularis полимеразной цепной реакцией//Матер. докл. научн.-практ. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» М.-2005.-С262-265.

16. Одоевская И.М., Бенедиктов И.И., Асеев В.В., Руденская Ю.А. Создание продуцента рекомбинантного белка Е. granulosus в экспрессирующей векторной системе и оценка иммуногенных свойств антигена EgB//MaTep. докл. научн.-практ. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» М,-2005.-С.266-268.

17.0доевская И.М., Бенедиктов И. И., Асеев В.В. Руденская Ю.А. Получение рекомбинантных антигенов эхинококка и сценка их иммуногенных свойств//Матер. 7-й международной научно-практич. конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» М.-2005.-С.279-284.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.06.2000 г. Подписано в печать 28.04.2005 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,38

Печать авторефератов 730-47-74,778-45-60

р - S 5 4 4

РНБ Русский фонд

2006-4 7883

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Одоевская, Ирина Михайловна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Биологические и морфологические особенности эхинококка.

1.2. Антигенный состав эхинококка. 1.3. Иммодиагностика ларвального гидатидоза.

1.4. Особенности строения генома эхинококка.

1.5. Использование методов молекулярной биологии для оптимизации экспрессии клонированных генов.

1.5.1. Амплификация генов в составе рекомбинантных плазмид.

1.5.2. Конструирование "генов гибридных белков" как метод оптимизации трансляции.

1.5.3. Стабилизация мРНК чужеродного гена.

1.5.4. Стабилизация чужеродных белков в E.coli.

1.5.5. Применение методов генной инженерии в гельминтологии.

1.5.6. Генно-инженерные антигены в диагностике и вакцинопрофилактике цистных гидатидозов.

2.Собственные исследования.

2.1. Материалы.

2.2. Используемые реактивы.

2.3. Методы исследований.

2.3.1. Выделение геномной ДНК E.granulosus из протосколексов паразита.

2.3.2. Выделение ДНК векторного бактериофага X,gtl 1.

2.3.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.3.4. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле.

2.3.5. Получение препаративных количеств ДНК векторной плазмиды.

2.3.6. Проведение ДНК- ДНК гибридизации.

2.3.7. Амплификация гомологичных фрагментов из генома эхинококка синтезированными олигонуклеотидными праймерами.

2.3.8. Лигирование плазмидной векторной ДНК с фрагментом эукариотического гена.

2.3.9. Проведение реакции трансформации.

2.3.10. Скрининг рекомбинантных клонов.

2.3.11. Экспрессия гибридного белка рекомбинантной плазмидой.

2.3.12. Электрофорез в денатурирующих условиях.

2.3.13. Электроперенос.

2.3.14. Постановка иммуноферментной реакции.

2.3.15. Иммунное выявление антигенов на фильтре.

2.3.16. Изучение протективных свойств рекомбинантного антигена EgF.

3. Результаты исследований

3.1. Наработка препаративных количеств ДНК Echinococcus granulosus для создания банка генов паразита.

3.1.1.Создание и амплификация библиотеки E.granulosus в фаге Xgtl 1.

3.1.2. Элюция фрагмента кДНК эхинококка из геля легкоплавкой агарозы.

3.1.3. Клонирование фрагмента гена Е. granulosus EgF в векторной системе фаг Xgtl 1- клетки Е. coli Y -1088, Y-1090.

3.1.4. Проведение ДНК-ДНК гибридизации.

3.1.5. Особенности экспрессии рекомбинантых белков в векторной системе X-gtl l/EgF-клетки E.coli Y1089.

3.1.6. Анализ рекомбинантных белков, синтезированных в векторной системе клетки E.coli штамма Y 1089-рекомбинантный фаг Xgtl 1/F.

3.1.7. Иммунологический анализ рекомбинантных белков, получаемых в векторной системе на основе рекомбинантного фага Xgtll/EgF методом Western-blot анализа.

3.1.8. Синтез генно-инженерных белков в векторной системе на основе рекомбинантного фага Xgtl 1/EgF.

3.1.9. Переклонирование фрагмента кДНК эхинококка в плазмидные векторные системы.

3.1.10. Определение нуклеотидной и аминокислотной последовательности клонированного фрагмента EgF.

3.1.11. Конструирование рекомбинантных плазмид EgF с использованием векторов семейства pGEX и pQE.

3.1.12. Векторы семейства pGEX.

3.1.13. Клонирование фрагмента гена EgF E.granulosus в плазмидной векторной системе pQE/SQ 13009.

3.1.14. Использование ПЦР при получении фрагментов генов, кодирующих антигены эхинококка для оптимизации создания плазмидных векторных систем.

3.1.15. Создание продуцента рекомбинантных белков в векторной системе плазмида pQE - клетки Е. coli SQ-13009.

3.1.16. Протективная эффективность рекомбинантного антигена EgF.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рекомбинантный антиген эхинококка EgF"

Актуальность проблемы. Эхинококкоз распространен повсеместно, является серьёзной медицинской, социально-экономической и ветеринарной проблемой (Бессонов А.С., 1979; Геллер Ю.И.,1989), в связи с чем в настоящее время во многих странах мира ведутся интенсивные исследования ларвальных гидатидозов (Fasihi Н.М., Hobbs R.P., Adams P.J., Mobedi I., Morgan-Ryan U.M.,Thompson R.C.A., 2002; Deplazes P., Eckert J., 1996).

Прижизненная диагностика эхинококкозов основывается на эпизотологических данных и результатах иммунологических реакций со специфическим антигеном (Heath D.D., 1986; Irabiena О., Nieto A., Ferreira J.,2000), однако применение последних ограничено отсутствием доступного и стандартного антигенного материала, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью в серологических реакциях (Ito A.L et al, 1999; Jiang L.,Wen H., Ito A., 2001). Данным требованиям может отвечать антиген, кодируемый определённым геном в системе, в которой его можно наработать и очистить, т.е. антиген, получаемый генно-инженерным путём in vitro в требуемых количествах (Li J. et al., 2003). Практически ежегодно ВОЗ организует Международные рабочие встречи паразитологов, посвященные проблемам распространения, диагностики, вакцинопрофилактики и лечения ларвальных гидатидозов, причём особое внимание уделяется развитию молекулярно-биологических методов исследования эхинококкозов (Gottstein В., 1987). Во многих странах мира проводятся работы по клонированию генов гельминтов в различных векторных системах, в том числе и эхинококка (Lightowlers М. et al., 1990). Основной целью этих исследований является создание рекомбинантных ДНК, кодирующих гибридные белки-антигены, являющиеся основой для производства генно-инженерных вакцин и диагностикумов (Mamuti W., Yamasaki Н., Sako Y. et al, 2004).

Глобальное значение ларвальных гидатидозов, их большое влияние на экономику и здоровье населения различных стран мира неоднократно подчеркивалось в докладах Всемирной Организации Здравоохранения, на регулярно проходящих Международных конгрессах по гидатидологии. В последнее десятилетие важное место в работе этих симпозиумов занимают молекулярно-биологические аспекты изучения ларвальных гидатидозов, создания генно-инженерных вакцин и диагностикумов для профилактики и прижизненной иммунодиагностики этих опасных гельминтозов (Rishi А.К., McManus D.P., 1987; Gauci С., Merli М., Muller V., Chow С., Yagi К., Mackenstedt U, Lightowlers M.W., 2002; Woollard D. J., Gauci C., Merli M., Muller V., Chow C., Yagi K., Mackenstedt U, Lightowlers M.W., 2002; Gonzalez-Sapienza G., Lorenzo C., Nieto A., 2000).

В последние годы в России отмечается рост заболеваемости людей и животных ларвальными гидатидозами, что связано с резко возрастающими миграционными процессами, массовым и бесконтрольным завозом продуктов из южных регионов. В связи с этим, изыскание биотехнологических способов получения неограниченных количеств стандартного и высокоэффективного антигенного материала, обеспечивающего результативность проведения прижизненной иммунодиагностики и вакцинопрофилактики эхинококкоза, является насущной необходимостью как в научном, так и в практическом плане (Бережко В.К., 1990).

Использование методов молекулярной биологии, в частности технологий рекомбинантных ДНК, позволяет решить эту задачу путем клонирования генов, кодирующих основные антигены эхинококка и экспрессии их in vitro с целью получения стандартных высокоспецифичных белков-антигенов. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) значительно ускоряет процесс клонирования генов или их фрагментов в оптимальных векторных системах и получения белков-антигенов E.granulosus.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- создать представительный банк образцов суммарной ДНК E.granulosus и E.multilocularis;

- получить клонотеку генов кДНК эхинококка в экспрессирующем фаговом векторе и осуществить её иммунологический скрининг; выявить молекулярно-биологическими методами (ДНК-ДНК гибридизацией, реакцией рестрикции эндонуклеазами, электрофорезом в агарозном геле) наличие вставки кДНК эхинококка у рекомбинантных клонов;

- дать характеристику иммунохимических свойств рекомбинантного антигена;

- оценить диагностические и протективные свойства наработанного рекомбинантного антигена.

Исследования проведены по программе фундаментальных и прикладных исследований по научному обеспечению АПК РФ, а также по Федеральной целевой НТП Минпромнауки России «Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития науки и техники» (проект «Технологии биоконструирования препаратов для ветеринарии», № гос. регистрации 01.20.02 14534).

Научная новизна. Впервые в России клонирован фрагмент гена паразита, кодирующий синтез родоспецифического антигена Echinococcus, определены нуклеотидная и аминокислотная последовательности EgF и изучены свойства рекомбинантного белка. Уникальность полученной нуклеотидной последовательности подтверждена патентом РФ. Рассчитана структура специфических олигонуклеотидных праймеров, отработаны оптимальные условия проведения ПЦР для получения неограниченного количества встройки кДНК эхинококка EgF. Создан продуцент гибридного белка паразита в экспрессирующей векторной системе рекомбинантная плазмида pQE/EgF-клетки E.coli SG-13009. На основе полученного стандартизированного рекомбинантного антигена разработан иммунноферментный диагностикум для прижизненной диагностики ларвальных гидатидозов, обладающий достаточно высокой специфичностью и чувствительностью. Показана высокая протективная эффективность антигена EgF при ларвальном эхинококкозе в опытах на лабораторных животных.

Апробация результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- научных конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 1993, 2001, 2003-2005 гг.); объединённых сессиях Координационного совещания по ветеринарной паразитологии Центрального совета Общества гельминтологов РАН и секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (1993-2005 гг.);

- заседаниях Ученого совета ВИГИС 1991-2005 гг.

Основные положения, выносимые на защиту:

- создание представительного банка геномной ДНК Е. granulosus и Е. multilocularis;

- получение клонотеки генов кДНК эхинококка в экспрессирующем векторе Agtl 1 и иммунологический скрининг рекомбинантных клонов;

- создание продуцента гибридного белка EgF в экспрессирующей векторной системе рекомбинантная плазмида pQE/EgF клетки E.coli SG13009;

- получение и иммунохимическая характеристика рекомбинантного белка эхинококка; диагностические и протективные свойства рекомбинантного антигена EgF.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Одоевская, Ирина Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Получена библиотека генов E.granulosus на основе бактерофага ^gtll с представительностью 1,5х105. Методом гибридизации in situ выявлены фаги, содержащие нуклеотидные последовательности ДНК, кодирующие синтез иммунологически значимых белков-антигенов эхинококка.

2. Разработан способ выявления генома эхинококка методом dot-гибридизации радиоактивномеченным ( Р) зондом на основе клонированной вставки E.granulosus EgF в реакции ДНК-ДНК гибридизации с суммарными про- и эукариотическими ДНК различных организмов. Полученные радиоавтографы свидетельствуют, что клонированные встройки кДНК эхинококка не гибридизируются с ДНК отрицательных контролей (ДНК из тканей животных-хозяев гельминтов, клеток бактерий, трансформированных нерекомбинантными фагами и плазмидами), но гибридизируется с суммарными геномными ДНК цистного и альвеолярного эхинококка, генно-инженерными конструкциями, имеющими кДНК эхинококка. Аналогичный результат был получен при проведении полимеразной цепной реакции.

3. Секвенирована нуклеотидная последовательность EgF эхинококка размером 453 п.н. Уникальность клонированного фрагмента паразита и отсутствие гомологии с клонированными в других странах нуклетидными последовательностями эхинококка подтверждены результатом проведенного компьютерного аналаза по программе «/JNAsis» фирмы «Фармация» (патент РФ № 2234533 от 20.08.2004 г.).

7. Создан продуцент рекомбинантного белка эхинококка в экспрессирующей векторной системе pQE/EgF-клетки E.coli SG-13009 и получен очищенный рекомбинантный белок EgF в количестве 1800 мг. Синтезируемый под контролем рекомбинантной плазмиды pQE/EgF белок-антиген эхинококка гомогенен и имеет молекулярную массу 16,7 кДа.

8. Разработаны методы анализа иммунологических свойств синтезируемых в векторных системах гибридных белков с использованием иммуноблоттинга, денатурирующего электрофореза и ракетного иммуноэлектрофореза, а также способы физико-химической характеристики рекомбинантного белка.

11. Полимеразная цепная реакция с различными олигонуклеотидными праймерами, гомологичными участкам геномной ДНК альвеолярного и цистного эхинококка, кодирующим иммуногенные белки обоих паразитов, выявила высокую степень сходства участков геномов этих двух гельминтов. Полученные данные подтверждают правомочность использования лабораторной модели альвеолярного эхинококкоза для изучения антигенных свойств при цистном гидатидозе.

Практические предложения

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Одоевская, Ирина Михайловна, Москва

1. Акматов Б.А., Кенжаев М.Г., Токбаев Н. Методы профилактики и борьбы с эхинококкозами и др. цестодозами человека и животных // Тез.докл.конф.-Москва 16-17 июня 1993 г.- M.-1993.-C.3.

2. Бережко В.К. Иммунодиагностика эхинококкозов животных //Эхинококкозы (Методы исследований, лечения, профилактики).- 1990.-М.-ИМПиТП.-С. 185.

3. Бережко В.К. Иммуноферментная реакция в диагностике эхиноккокоза животных и ее корреляция с эпизоотологической ситуацией // Тез.докл.науч. конф. «Методы профилактики и борьбы с эхинококкозами и другими цестодозами человека и животных».-М.-1993.-С.7.

4. Бережко В.К., Одоевская И.М., Клименко В.В., Качурина Л.И. Оценка диагностической эффективности гибридного белка E.granulosus в клеточном лизате E.coli //Матер, докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями»- М.-1999,- С.32-34.

5. Бессонов А.С. Эхинококкоз: распространение, клинические признаки, диагностика, лечение (по материалам симпозиума ОАЭ) // Ветеринария.-М.-1997.-№4.-С.46.

6. Бессонов А.С., Ястреб В.Б. Идентификация штаммов E.granulosus по развитию вторичных ларвоцист мышей //Тр.Всерос.ин-та гельминтол.-М.-1992.-Т.31.-С.31.

7. Брода П. Плазмиды ИМ.- Мир.-1982.-224 с.

8. Геллер Ю.И. Эхинококкозы (медико-экологические аспекты и пути ликвидации инвазии) // М.-Медицина.-1989.-209с.

9. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК // Методы. М.-Мир.-1989. -С.138-170.

10. Даугалиева Э.Х. Иммунитет при гельминтозах //Труды Всерос. ин-та гельминтол.-М.-2000.-Т.36.-С.27-50.

11. Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бактерий // М.-Мир.-1984,176с.

12. Дубинин Н.П. Общая генетика // М.- Наука.-1986.-560 с.

13. Кенжебаев С.А. Роль мелких ларвоцист эхинококка в эпизоотологии эхинококкоза // Матер.докл.науч.конф. «Актуальные вопросы теоретической и прикладной трематодологии и цестодологии».-1997.-М. 24-25 сент. 1997 г.-С.64.

14. Лежнин О.А., Прохоров А.Ф., Ермолова Р.С, Гобеджешвили В.К. Социально-экономическая значимость эхинококкоза// Диагностика и лечение эхинококковой болезни. Сборник научных трудов. Ставрополь.-1983. С.196-199.

15. Лейкина Е.С. Эхинококкозы (этиология, эпидемиология, профилактика) // Мед.паразитол.-1985.-№6.-С.62.

16. Лейкина Е.С., Яроцкий Л.С., Озерецковская Н.Н. Итоги и перспективы развития исследований по иммунологии эхинококкоза // Мед.паразитол.-1987.-№2.-С.З-7.

17. Инге-Вечтомов С.Г. Введение в молекулярную генетику //М.-Высшая школа.-1983.-343 с.

18. Курбацкая В.И., Одоевская И.М., Андреянов О.Н. Пассирование природных изолятов Е. multilocularis на лабораторных животных// Матер, докл. научн.-практ. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» М.- 2004.- С.207-211.

19. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование //.-1984.-М.- Мир.-С. 186-205.

20. Мартыненко В.Б., Лосева Т.А., Никифорова Т.П., Дарченкова Н.М. Распространение эхинококкоза в СССР //Мед.паразитол.-1988.-№.-С.84-68.

21. Методы моделирования ларвального гидатидозного эхинококкоза // Эхинококкозы: методы исследования, лечения, профилактики.-М.-ИМПиТП.- 1990.-С.215.

22. Одоевская И.М., Бенедиктов И.И. Амплификация ДНК гена F, кодирующего высокоспецифичный белок-антиген E.granulosus, вполимеразной цепной реакции // Матер, докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями»-М.-1999.- С.201-202.

23. Одоевская И.М., Бенедиктов И.И. Опыт получения рекомбинантных белков-антигенов E.granulosus //Тр. Всерос.ин-та гельминтол.-2004.-т.40.- С .256-274.

24. Одоевская ИМ., Качурина Л.И. Получение препаративных количеств вставок кДНК E.granulosus в системе клеток E.coli Y1088 рекомбинантный фаг A,gtll //Матер.докл.науч.конф. «Гельминтозоонозы-меры борьбы и профилактики»-М.-1994. - С.111-113.

25. Остерман Л.А. Активированные спейсеры // В кн.Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М,- Наука.-1985.-С.359-361.

26. Остерман Л.А. Посадка лигандов на активированные матрицы // В кн. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.-Наука.-1985.- С.375-381.

27. Пехов А.П. Плазмиды бактерий // М.-Медицина.-1986.-224 с.

28. Прозоров А.А. Генетическая трансформация и трансфекция // М.-Наука.- 1980.-248 с.

29. Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии // Пер. с англ.Под ред. Г.К.Скрябина.- М.: Мир, 1984.-172 с.

30. Сопру нов Ф.Ф. Молекулярные основы паразитизма//М.-Наука.-1987.223 с.

31. Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика //М.-Мир.-1981.-646с. Стайер Л. Биохимия // Мир.-1984.-Т.1-232 с.

32. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК // М.- Мир.-1986.286 с.

33. Хесин Р.Б. Непостоянство генома // М.- Наука.- 1985.-472 с.

34. Чобанян А.Г. О роли зелени в эпидемиологии эхинококкоза у городского населения в Армянской ССР //Материалы научн. конф. Всесоюз.об-ва гельминтол.-М.-1966.-Ч.1.-С.288.

35. Agosin М., Repetto Y. Discowsky L. RNA of E.granulosus protoscolices // Exp.Parasitology.-1971 .-V.30.-P.233-243.

36. Altintas N.: SDS-Polyacrylamide gel elektroforezi ile proteinlerin seperasyonu // T. Parazitol. Derg.-1991.-V.2.-P.l 19-129.

37. Baldock F.C., Thompson R.C.A., Kumaratilake L.M. Stain identification of E.granulosus in determining origin of infection in a case of human hydatid disease in Australia // Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.-1985.-V.79.-P.238-241.

38. Beardsell P.L., Howell M.J. Killing of T.hydatigena oncospheres by sheep neutrophils // Z.Parasitekd.-1984.-V.70.-P.337-344.

39. Bowtell D.D.L., Saint R.B., Rickard M.D., Mitchell G.F. Immunochemical analysis of T.taeniaformis antigenes expressed in E.coli // Parasitology.-1986.-V.93.-P.599-610.

40. Bryant C., Flockhart H.A. Biochemical strain variation in parasitic helminthes // Adv. ParasItol.-1987.-V.25.-P.275-319.

41. Cameron T.W.N. The incidence and diagnosis of hydatid cyst in Canada E.granulosus var. Canadensis // Parasitologia.-1960.-V.2.-P.381-390.

42. Cardozo G., Tucci P., Hernandez A. Characterization of the immune response induced by a carbohydrate enriched fraction from Echinococcus granulosus protoscoleces in patients with cystic hydatid disease // Parasitol. Res.-2002.-V.88.-P.984-990.

43. Carol H., Nieto A., Villacres-Eriksson M., Morein B. Intranasal immunization of mice with Echinococcus granulosus surface antigens iscoms evokes a strong immune response, biased towards glucidic epitopes //Parasite Immunol.-1997.-V.19.-N5.-P. 197-205.

44. Chow C., Gauci C., Cowman A. F., Lightowlers M. W. A gene family expressing a host-protective antigen of Echinococcus granulosus //Mol.Biochem. Parasitol.-2001 .-V. 18.-P.83-88.

45. Craig P. S., M. T. Rogan, J. C. Allan. Detection, screening and community epidemiology of taeniid cestode zoonosis: cystic echinococcosis, alveolar echinococcosis and neurocysticercosis // Adv. Parasitol.l996.-V.38.-P.169-250.

46. Dada B.J.O., Belino E.D. Immunization of sheep against cystic hydatidosis with homologous and heterologous metacestode antigens // Int.J.Zoonoses.-1981 .-V.8.-P.20-25.

47. Deplazes P., Eckert J. Diagnosis of Echinococcus multilocularis infection in final hosts // Appl. Parasitol.-1996.-V.37.-245-252.

48. Fadwa M.A., Knobloc J. Isolation and partial characterization of species-specific and cross-reactive antigens of Echinococcus granulosus cyst fluid // Mol. Biochem. Parasitol.-1989.-V.37.-P. 101-108.

49. Fakon В., Chamekh M., Dissous C., Carpon A. Molecular cloning of an Echinococcus granulosus protein expressing an immunogenic epitope of antigen 5 //Mol. Biochem. Parasitol.-1991.-V.45.-P.233-240.

50. Fasihi Harandi M., Hobbs R.P., Adams P.J., Mobedi I., Morgan-Ryan U.M., Thompson R.C.A. Molecular and morphological characterization of Echinococcus granulosus of human and animal origin in Iran // Parasitology.-2002.-V.125.-P.367-373.

51. Felleisen R, Gottstein B. Echinococcus multilocularis: molecular and immunochemical characterization of diagnostic antigen II/3-10 // Parasitology.-1993.-V. 107.-P.335-342.

52. Ferreira H.B., Rodriges J.J.S., Zaha A. Echinococcus granulosus recombinant antigens // Cikncia e Cultura.-1996.-V.48.-P.370-376.

53. Ferreira H.B., Zaha A. Expression and analysis of the diagnostic value of an Echinococcus granulosus antigen gen clone // Int.J.Harasitol.-1994.- V.24.-N6.-C.863-870.

54. French B.T., Maul H.M. Maul G.G. Screening: cDNA expression libraries with monoclonal and polyclonal antibodies using an amplified-biotin-avidin-peroxidase technique // Anal.Biochem.-1986.-V.156.-P.417-423.

55. Frosch P., Hartmann M., Miuhlschlegel F., Frosch M. Sequence heterogeneity of the echinococcal antigen В // Mol. Biochem. Parasitol.-1994.-V.66.-P.171-175.

56. Frosch P.M., Pfister Т., Schaad V., Bitter-Suermann D. Cloning and characterisation of an immunodominant major surface antigen of Echinococcus multilocularis // Mol. Biochem. Parasitol.-1991.-V.48.-P.121-130.

57. Frosch P. M., Siracusano A. Cloning and expression of a cDNA encoding an elongation factor Ш/5 protein from Echinococcus granulosus with immunogenic activity // Parasite Immunol.- 1999.-V.21.-P.485-492.

58. Gamble H.R., Zarlenga D.S. Biotechnology in the development of vaccines for animal parasites // Vet.Parasitol.-1986.-V.20.-Nl-3.-P.237-250.

59. Gasser R.B., Lightowlers M.W., Rickard M.D. A recombinant antigen with potential for serodiagnosis of Echinococcus granulosus infection in dogs // Int.J.Parasitol.-1990.-V.20.-N7.-P.943-950.

60. Gauci C., Merli M., Muller V., Chow C., Yagi K., Mackenstedt U., Lightowlers M.W. Molecular cloning of a vaccine antigen against infection with larval stage of Echinococcus multilocularis // Infect Immun.-2002.-V.70.-N7.-P.3969-3972.

61. Gottstein В., Eckert J., Fey H. Serological differentiation between E.granulosus and E.multilocularis infection in man 11 Z.Parasitenkd.-1983.-V. 69.-P.347-356.

62. Gottstein В., Eckert J., Michael S.A., Thompson R.C.A. E.granulosus antigens: immunoelectrophoretic and Western, blot analysis of hydatid cyst fluids // Parasito 1 .Res.-1987.-V.73 .-P. 186-189.

63. Harlow E., Lane D. Antibodies //A Laboratory Manual.-Cold Spring Harbor Laboratory. -1988.- P.483-509.

64. Heath D.D. Immunobiology of Echinococcus infections//In:The Biology of Echinococcus and Hydatid Desease. Thompson R.C.A. (ed.).-1986,-George Allen andUnwin. London.-P.164-182.

65. Heath D.D., Lawrence S.B. Antigenic polipeptides of Echinococcus granulosus oncospheres and definition of proctetive molecules // Parasite immunol.-1996.-V. 18.- P. 347-367.

66. Heath D.D., Parmeter 3.N., Osborn P J., Lawrence S.B. Resistance to E.granulosus infection in lambs //J.Parasitol.-1981.-V.67.-P.797-799.

67. Helbig M., Frosch P., Kern P., Frosch M. Serological differentiation between cystic and alveolar echinococcosis by use of recombinant larval antigens //J. Clin. Microbiol.-1993.-V.31 .-P.3211-3215.

68. Hemmings L., McManus D. P. The diagnostic value and molecular characterization of an Echinococcus multilocularis antigen gene clone // Mol. Biochem. Parasitol.-1991 .-V.44.-P.53-61.

69. Hira P.R., Hahr G.M., Shweiki H.M., Behbehani K. An enzyme-linked immunosorbent assay using an arc 5 antigen fir the diagnosis of cystic hydatid disease //Ann.Trop. Med. Parasitol.-1990.-V.2.-P.157-162.

70. Jiang L., Wen H., Ito A. Immunodiagnostic differentiation of alveolar and cystic echinococcosis using ELISA test with 18-kDa antigen extracted from

71. Echinococcus protoscoleces // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.-2001.-V.95.-P.285-288.

72. Kanwar J.R., Kaushik S.P., Sawhney I.M.,Kamboj M.S., Mehta S.K.,Vinayak V.K. Specific antibodies in serum of patients with hydatidosis recognised by immunoblotting // J. Med. Microbiol.-1992.-V.36.-P.46-51.

73. Kern P., Frosch P., Helbig M., Wechsler J.G., Usadel S., Beckh K., Kunz R., Lucius R., Frosch M. Diagnosis of Echinococcus multilocularis infection by reverse-transcription polymerase chain reaction // Gastroenterology.-1995.-V.109.-P.596-600.

74. Koksal F., Serin M.S., Kekec Y., ve Sadr Y.E. Insan ve hayvankokenli kist hidatik sivilannin SDS-PAGE metoduyla analizi ve Westernlot metodunun klinik onemi//T.Parazitol.Derg.- 1995.-V.19.-P.221-229.

75. Kumaratilake L.M., Thompson R.C.A. Biochemical characterisation of Australian strains of E.granulosus by isoelectric focusing of soluble proteins // Int.J.Parasitol.-1984.-V.14.-P.581-566.

76. Ma L., I to A., Liu Y. H., Wang X. G, Yao Y.Q., Yu D. G., Chen Y.T. Alveolar echinococcosis: Em2plus-ELISA and Eml8-Western blots for follow-up treatment with albendazole // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.-1997.-V.91.-P.476-778.

77. Maddison S.E., Slemenda S.B., Schantz P.M., Fried J.A.,Wilson M., Tsang V. A specific diagnostic antigen of Echinococcus granulosus with an apparent molecular weight of 8 kDa // Am. J. Med. Hyg.-1989.-V.40.-P.377-383.

78. Mamuti W., Yamasaki H., Sako Y. et al. Molecular cloning, expression, and serological evalution of 8-kilodalton subunit of antigen В from Echinococcus multilocularis // J. Clin. Microbiol.-2004.-P.1088.

79. March F., Enrich C., Mercader M., Sanchez F., Munoz C., Coll P., Prats G. Echinococcus granulosus, Antigen characterization by chemical treatment and enzymatic deglycosylation // Exp. Parasitol.-l991.-V.73.-P.433-439.

80. Mathis A., Deplazes P., Eckert J. An improved test system for PCR-based specific detection of Echinococcus multilocularis eggs // J. Helminthol.-1996.-V.70.-P.219-222.

81. McManus D.P., Bryant C. Biochemistry, physiology and molecular biology of Echinococcus //In: Thompson, R.C.A., Lymbery, A.J. (Eds.), Echinococcus and hydatid disease, CAB International, Wallingford.- P. 135-181.

82. McManus D.P., Knight M., Simpson A.J.G. Isolation of nucleic acides from the hydatiol organisms, Echinococcus spp. (Cestoda) //Mol.Biochem.Parasitol.-1985.-V.16.-N3.-P.251-266.

83. McManus D.P., Simpson A.J.G. Identification of the Echinococcus (hydatid disease) organisms using cloned DNA markers //Mol.Biochem.Parasito 1.-1985.-V.17.-P.171-178.

84. McManus D.P., Smyth J.D. Hydatidosis: changing concepts in epidemiology and speciation// Parasitol. Today.-1986.-V.2.-P. 163-167.

85. Mitchell G.H. An update on candidate malaria vaccines // Parasitology.-1989.-V.98.-S29-S47.

86. Morris D.L., Richardson K.S. Hydatid Disease // Butterworth-Heinemann Ltd. Linarcre House. Jordan Hill. Oxford OX2 8DP. 1992.

87. Nacane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation // J.Histochem. Cytochem.-1974.-V.22.-P.l084-1091.

88. Njeruh F.M., Okela G.B.A., Gathuma J.M. Usefulness of indirect haemoglutination (IHA) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in the diagnosis of human hydatidosis // E.Afr.Med. J.-1989.-V.66.-P.310-314.

89. Ortona E., Rigano R., Margutti P. et al. Native and recombinant antigens in the immunodiagn human cystic echinococcosis // Parasite Immunol.-2000.-V.22.-N11.-553-559.

90. Pawlowski Z.S. Epidemiological basis for chemotherapy of human echinococcosis I I IntJ.Clin.Pharmacol.Res.-1985.-V.2.-P.75-78.

91. Potter K.A., Leid R.W. Isolation and partial characterization of an eozinophil chemotactic factor from metacestodes of Taenia taeniaeformis (ECF-Tt) // J.Immunol.- 1986. -V.136.-P.1712-1717.

92. Profumo E., Ortana E., Rigano R., Gioia I., Notargiacomo S., Loppolo S., Siracusano A. Cellular and humoral responses to antigenic subunits of Echinococcus granulosus cyst fluid in hydatid patients // Parasite Immunol.-1994.-V.16.-P.393-398.

93. Rickard M.D., Lightowlers M.W. Immunodiagnosis of hydatid disease. //In:Thompson R.C.A. (ed.). The biology of Echinococcosus and hydatid disease. Allen and Unwin, London.- 1986.-P.217-249.

94. Rishi A.K., McManus D.P. Genomic cloning of human E.granulosus DNA: Isolation of recombinant plasmids and their use as genetic markers in strain characterization // Parasitology.-1987.-V.94.-369-383.

95. Rogan M.T., Horris D.L., Prichard D.I., Percins A.C. E.granulosus: the potential use of specific radiolabeled antibodies in diagnosis by immynoscintygraphy // Clinic.Exp. Immunology.-1990.-V.80.-P.225-231.

96. Rollinson D., Walker Т.К., Simpson A.J.G. New approaches to sistosome identification // Parasitology Today.-1986.-V.2.-P.24.

97. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Digesting DNA with Restriction Enzymes // In: Molecular Cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold SpringHarbor Laboratory Press.-1989.-P.528-533.

98. Sanchez F., March F., Mercader M., Coll P., Munoz C., Prats G. Immunochenical localizanion of major hydatid fluid antigens in protoscolices and cyst of Echinococcus granulosus from human origin // Parasite Immunol.-1991.-V.13.-P.83-592.

99. Schantz P.M., Schwabe C. Worldwide status of hydatid disease control // J.Am.Veter.Med.Assn. -1969 .-V.155.-N12.-P.2104-2121.

100. Schantz P.M., Van den Bossche H., Eckert J. Chemotherapy for larval echinococcosis in animals and humans: report of a workshop //Z.Parasitenkd.-1982.- V.67.-P.5-26.

101. Shepherd J.C., Aitken A., Mc Manus D.P. A protien secreted in vivo by E.granulosus inhibits elastase activity and neutrophil chemotaxis //

102. Mol.Biochem.Parasitol.-1991 .-V.44.-P.81-90.

103. Shepherd J.C., Mc Manus D.P. Specific and cross-reactive antigenes of E.granulosus hydatid cyst fluid //Mol. and Biochem. Parasitology.-1987.-V.25.-P.143-154.

104. Siles-Lucas M., Gottstein B. Molecular tools for the diagnosis of cystic and alveolar echinococcosis //Trop. Med. Int. Health.- 2001.-V. 6.-P.463-475.

105. Sim B.K.L., Piessens W.F., Wirth D.F. A DNA probe cloned in E.coli for the identification of Brugia malayi // Mol.Biochem. Parasitology.- 1986.V.19.-P.l 17-123.

106. Smith, D.B., K.S. Johnson. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase// Gene.-1988.-V.67.-P.31-40.

107. Smyth J.D., Mc Manus D.P. The Physiology and Biochemistry of Cestodes // Cambridge University Press, Cambridge.-1989.

108. Suquet C.M., Green-Edwards C., Leid R.W. Isolation and partial characterization of a Taenia taeniaeformis metacestode proteinase Inhibitor // Int. J.Parasito 1.-1984.-V. 14.-P. 165-172.

109. Tsudo S., Fukuyama K., Epstein W.L. Low molecular weight eosinophil chemotactic factor in granulomatos liver in murine schistosomiasis //

110. J.Immunol.-1979.-V.122.-P.2554-2557.

111. Vogel M., Gottstein В., Muller N., Seebeck T. Production of a recombinant antigen of Echinococcus multilocularis with high immunodiagnostic sensitivity and specificity//Mol. Biochem. Parasitol. -1988.-V.31.-P.117-125.

112. Waterkeyn J., Gauci C., Cowman A., Lightowlers M. Sequence analysis of a gene family encoding Taenia ovis vaccine antigens expressed during embryogenesis of eggs //Mol.Biochem.Parasitol.-1997.-V.86.-P.75-84.

113. Weiland G. Serology and Immunodiagnostic Methods.Echinococcus // In: Mehlhorn H. (Ed.). Parasitology in Focus. Facts and Trends. Springer-Verlag Berlin Heidelberg.-1988.-P.682.

114. Welling G.W., Wicher J.W., Zee R., Weiling-Wester S. Prediction of sequential antigenic regions in proteins // FEBS Letters.-1985.-V.188.-N2.-P.215-218.

115. Widle N.W., Carlson K.E., Manning D.R., Zigmond S.M. Chemoattractant-stimulated GTPase activity is decrease on membranes from polymorphonuclear leukocytes incubated in chemoattractant // J.Blol.Chem.-1988.-V.264.-P.190-196.

116. Woollard D.J., Gauci C.G., Heath D.D., Lightowlers M.W. Epitope specificities and antibody responses to the EG95 hydatid vaccine // Parasite Immunol. -1998.-V.20-P.535-540.

117. Woollard D.J., Heath D.D., Lightowlers M.W. Assessment of protective immune responses against hydatid disease in sheep by immunization with synthetic peptide antigens //Parasitology.-2000.-V.121.-N2.-P.145-153.

118. Yap K.W., Thompson R.C.A. Non-radioactive DMA probes as diagnostic fools for hydatiodosls/echinococcosis// 12-th Conf. of WAAVP.- 1987 a.-12-15 aug.-Montreal, Canada. Programme and Abstracts.2A-2.

119. Yap K.W., Thompson R.C.A. Isolation of cestode DNAII Parasitol. Today. -1987 b.-V.3.-P.220-227.

120. Young R.A. Davis R.W. Yeast RNA Polymerase II Genes: Isolation with Antibody Probes// Science.-1983b.-V.222.-P.778-782.

121. Zekavat S.Y., Khayat A.A.M. Echinococcus granulosus. Isolation and partial characterisation of sRNA and DNA // Israel Journal of Medicine Sciences.-1971 .-V.7.-N11.-P. 1292-1294.

122. Zhu Y., He W., Liang Y. Development of a rapid, simple dipstick dye immunoassay for schistosomiasis diagnosis // J.Immunol.Methods.-2002.-V.266.-№l-2.-P.l-5.

Информация о работе

Одоевская, Ирина Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.19

Диссертация

Рекомбинантный антиген эхинококка EgF - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы