Получение компонентов иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов

Семихин, Александр Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение компонентов иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение компонентов иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов"

На правах рукописи

Семихин Александр Сергеевич

ПОЛУЧЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА И ТЕХНОЛОГИИ АФФИННЫХ ДОМЕНОВ

Специальность: 03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

003493268

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Научный руководитель-.

доктор биологических наук

Карягина-Жулина Анна Станиславовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Зигангирова Наиля Ахатовна

кандидат биологических наук

Самойленко

Владимир Александрович

Ведущая организация:

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Защита состоится 26 марта 2010 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 при НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Автореферат разослан «26» февраля 2010 года. Ученый секретарь Диссертационного coi

доктор медицинских наук, профессор

Екатерина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Иммунобиологические препараты — это лекарственные средства, предназначенные для иммунопрофилактики, иммунотерапии и диагаостики инфекционных и неинфекционных болезней и аллергических состояний. К этим препаратам относятся вакцины, анатоксины, бактериофаги, эубиотики, иммуноглобулины, сыворотки, диагностические препараты, аллергены и др. Для получения таких препаратов могут быть использованы различные способы и методики: химический синтез, выделение из природных источников, синтез при помощи линий эукариотических клеток или клеток микроорганизмов. Перспективным направлением для создания белковых компонентов иммунобиологических препаратов является их синтез с помощью клеток микроорганизмов, в частности - Escherichia coli. Благодаря применению микробиологического синтеза возможно сократить срок разработки и получения нового препарата и значительно снизить его себестоимость. Синтез гетерологичных белков в клетках бактерий связан с рядом трудностей, основные из которых - это низкий уровень продукции чужеродного белка, нестабильность и сложность его очистки. Решение этих проблем является важной микробиологической и биотехнологической задачей. Одним из подходов, применяемых для повышения уровня продукции целевого белка, его стабилизации и возможности быстрой и эффективной очистки, является технология аффинных доменов [Лунин В.Г., 2006]. Основной принцип данной технологии заключается в получении двухдоменных белков, содержащих в своем составе целевой белок, обладающий биологической активностью, и различные аффинные домены, способные влиять на уровень продукции, растворимость и стабильность целевого белка. Кроме того, технология аффинных доменов позволяет решить другую важную задачу — упростить систему очистки целевого белка и, таким образом, снизить его стоимость [Тегре К., 2003].

В настоящее время с помощью микробиологического синтеза в клетках бактерий возможно получать химерные белки, содержащие аффинные домены и биологически активные пептиды (эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, ß-интерферон, костный морфогенетический белок 2).

Основным источником аффинных доменов являются различные микроорганизмы (Anaerocellum thermophilum, Clostridium cellulovorans, Staphylococcus

aureus, Streptococcus mutans, Leuconostoc mesenteroides и др.) Они населяют практически все биологические ниши и способны связывать или синтезировать различные вещества: белки, полисахариды, металлы, нуклеиновые кислоты и т.д. Благодаря широкому разнообразию встречающихся в природе аффинных доменов, полученных из различных микроорганизмов и соответствующих матриц, можно создавать препараты, имеющие важное биологическое значение. Химерный белок будет проявлять специфическую биологическую активность, а носитель, на котором он иммобилизован, может стимулировать иммунный ответ, защищать белок от действия ферментов и биологических жидкостей организма, обеспечивать пролонгированное действие иммобилизованного белка и т.д.

Большой интерес представляет создание рекомбинантных факторов роста, способствующих росту и заживлению тканей. В настоящее время в различных странах, в т.ч. и в России, широко применяются раневые покрытия, содержащие рекомбинантный эпидермальный фактор роста человека. Такие покрытия показали свою эффективность в клинике. Благодаря их использованию, повреждения кожи заживают путем первичного натяжения без образования рубцов и скорость полного восстановления ткани сокращается в 2-3 раза [Komarcevic А., 2000].

Также рекомбинантные ростовые факторы могут применяться для улучшения существующих и разработки новых систем культивирования клеток млекопитающих. Для этих целей используются эпидермальный ростовой фактор и фактор роста фибробластов, т.к. известна способность этих белков стимулировать рост клеток эукариот in vitro.

Препараты рекомбинантного ß-интерферона в настоящее время применяются в медицине для лечения широкого спектра патологий: различных вирусных инфекций, аутоиммунных заболеваний и злокачественных опухолей [Meager А., 2006].

Для производства рекомбинантного ß-интерферона сегодня используются различные системы экспрессии. Получение интерферона с помощью клеток млекопитающих позволяет получить белок, идентичный натуральному, но накопление, выделение и очистка такого белка являются сложным и дорогостоящим процессом. Более того, интерферон является токсичным для клеток-продуцентов, что дополнительно снижает эффективность технологии и повышает стоимость конечного продукта. В свою очередь, рекомбинантный ß-интерферон, синтезированный в

бактериальных клетках, может быть загрязнен токсичными белками и пирогенами клетки-продуцента [Попов В.Ф., 2002]. Благодаря использованию технологии аффинных доменов возможно очистить химерный белок, содержащий р-интерферон, на специфическом сорбенте и получить препарат белка с чистотой более 95%.

Одним из наиболее эффективных методов лечения травм и переломов костей является использование различных биокомпозитов, ускоряющих рост костной ткани. Для улучшения приживаемости металлоконструкций, имплантируемых в организм, их также покрывают композиционными препаратами. Однако не все материалы достаточно биосовместимы, и актуальной проблемой сейчас является создание новых поколений биодеградируемых и биосовместимых покрытий и матриксов, в которые введены биологически активные соединения, обеспечивающие благоприятную среду для восстановления поврежденных тканей.

Новое поколение композиционных препаратов, кроме широко используемых материалов - коллагена и гидроксиапатита, содержит биологически активные белки -факторы роста. Одним из основных факторов роста костной ткани является костный морфогенетический белок 2. Его функции в организме чрезвычайно разнообразны, но основная задача во взрослом организме - поддержание и восстановление костной ткани [Reddi А.Н., 1998]. Введение в состав композиционных препаратов рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 способно сократить время заживления переломов в 2-3 раза, а при обработке металлических имплантатов биосовместимыми покрытиями, содержащими этот белок, снизить вероятность отторжения имплантатов в 3-5 раз [Gautschi О.Р., 2007].

Цель работы: разработка подходов для получения, очистки и иммобилизации биологически активных белков на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов.

В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Клонирование в клетках Е. coli нуклеотидных последовательностей, кодирующих ряд аффинных доменов: коллаген-связывающий домен из адгезина микроорганизма Staphylococcus aureus (SAu), коллаген-связывающие декапептиды из фактора фон Виллебранда быка (vWFB) и человека (vWFHi и vWFH2), коллаген-связывающий домен из остеонектина человека (CollBD),

декстран-связывающий домен (DBD) из декстрансахаразы микроорганизма Leuconosioc mesenteroides subsp. Mesenteroides и гены биологически активных белков - цитокинов из организма человека: эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), интерферон-p (IFN-P) и костный морфогенетический белок человека 2 (ВМР-2). Выбор оптимальных аффинных доменов для создания химерных конструкций с биологически активными белками.

2. Создание штаммов Е. coli - продуцентов химерных рекомбинантных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-0 и CollBD-BMP-2.

3. Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов химерных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-p и CollBD-BMP-2.

4. Отработка методов очистки и иммобилизации химерных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-P и CollBD-BMP-2 на соответствующих сорбентах -желатин-сефарозе для белков, несущих в своем составе коллаген-связывагощий дсмгп к Ссфадсксс для белков, содержащих декстран-связывающий домен.

5. Разработка методики оценки биологической активности препаратов химерных белков DBD-EGF и CollBD-FGF при культивировании эукариотических клеток in vitro.

6. Изучение биологической активности in vitro препарата белка DBD-IFN-P, иммобилизованного на Сефадексе.

7. Изучение биологической активности препарата белка CollBD-BMP-2 in vitro.

8. Разработка методик изучения и оценки биологической активности препаратов, содержащих рекомбинантный белок CollBD-BMP-2 in vivo.

Часть работы, связанная с получением рекомбинантного белка ВМР-2 и композиционных препаратов на его основе, выполнялась в рамках государственного контракта № 02.522.12.2007 от 30 апреля 2008 года, по теме: «Разработка опытно-промышленных технологий получения гидроксиапатит/коллагеновых композиционных препаратов/покрытий имплантируемых материалов».

Научная новизна. В результате выполнения работы были впервые получены бактериальные штаммы-продуценты химерных белков, содержащие".

• эпидермальный фактор роста человека, соединенный с декстран-связывающим доменом микроорганизма L. mesenteroides;

• фактор роста фибробластов человека, соединенный с коллаген-связывающим доменом;

• шггерфсрон-р человека, соединенный с декстран-связывающим доменом микроорганизма тегел/его/б/е^;

• костный морфогенетический белок 2, соединенный с коллаген-связывающим доменом.

При этом достигнут высокий уровень продукции всех перечисленных химерных белков при микробиологическом синтезе, и созданы высокоэффективные системы выделения, очистки и иммобилизации белков на соответствующих сорбентах, основанные на способности аффинных доменов специфически связываться со своим сорбентом. Степень чистоты полученных таким образом белковых препаратов составила более 95%.

Впервые была разработана методика культивирования эукариотических клеток в объеме питательной среды на поверхности Сефадексов, покрытых препаратом рекомбинантного белка ЦВЦ-ЕОР.

Была разработана методика повышения эффективности культивирования эукариотических клеток на поверхности, покрытой коллагеном и обработанной препаратом рекомбинантного белка СоПВО-РОР.

Путем микробиологического синтеза была получена биологически активная форма рекомбинантного (5-интерферона, по своей противовирусной активности не уступающая доступным коммерческим аналогам.

Впервые в России были получены препараты, содержащие рекомбикантный белок Со11ЕШ-ВМР-2. Эффективность препаратов на основе данного белка была продемонстрирована в опытах на лабораторных животных и заключалась в ускорении заживления костного дефекта и повышении прочности врастания титановых имплантатов, покрытых химерных белком. Также была показана способность химерного белка Со11ВО-ВМР-2 снижать нейротоксическое действие титановых имплантатов, установленных в череп лабораторным животным.

Практическое значение работы. Полученные в работе аффинные домены могут быть использованы для создания химерных белков, несущих в своем составе различные биологически активные компоненты: цитокины из организма человека, биологическиценные и экономическизначимые белки из различных макро- и

микроорганизмов, бактериальные и вирусные антигены, токсины и т.д. При этом аффинной матрицей для полученных доменов, являются хорошо изученные и разрешенные к медицинскому применению вещества - коллаген и декстран.

На полученные в ходе работы рекомбинантный белок CollBD-CBD, рекомбинантную плазмиду pCollBD-CBD, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка Collbd-CBD и способ получения рекомбинантного белка Collbd-CBD было получено положительное решение о выдаче патента РФ (заявка № 2.009144489 от 02.12.2009).

Полученные с помощью микробиологического синтеза в клетках бактерий химерные белки DBD-EGF и CollBD-FGF могут применяться в научной и биотехнологической практике для интенсификации процесса выращивания эукариотических клеток.

Полученный с помощью микробиологического синтеза в клетках Е. coli химерный белок DBD-IFN-ß может применяться в медицине и биотехнологии в качестве компонента лекарственных препаратов.

Полученный с помощью микробиологического синтеза в клетках Е. coli химерный белок CollBD-BMP-2 может применяться в научной практике для исследования процессов остеогенсза, а также в медицинской промышленности для создания нового поколения препаратов для восстановления и заживления костной ткани.

На полученные в ходе работы рекомбинантный белок CollBD-BMP-2, рекомбинантную плазмиду pCollBD-BMP-2, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка CollBD-BMP-2 и способ получения рекомбинантного белка CollBD-BMP-2 было получено положительное решение о выдаче патента РФ (заявка №2009144490 от 02.12.2009).

Положения, выносимые на защиту.

1. Показана возможность получения химерных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-ß и CollBD-BMP-2 с помощью микробиологического синтеза в клетках Е. coli.

2. Подобраны оптимальный состав питательной среды, температура и время культивирования микробиологических штаммов-продуцентов химерных

белков, благодаря чему накопление биомассы и выход целевых белков был увеличен в 2-3 раза по сравнению с начальным уровнем.

3. Применение химерного белка, содержащего эпидермальный фактор роста или фактор роста фибробластов, стимулирует рост клеток эукариот in vitro.

4. Химерный белок, содержащий в своем составе декстран-связывающий домен и ¡З-интерферон способен защищать эукариотические клетки от инфицирования модельным вирусом in vitro.

5. Химерный белок, содержащий коллаген-связывающий домен и костный морфогенетический белок 2, индуцирует синтез щелочной фосфатазы в линиях эукариотических клеток С2С12 и СЗН10 и стимулирует рост костной ткани у лабораторных животных.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на II Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (Москва, 6-8, октября, 2009), где работа была удостоена I премии. Результаты работы были отмечены медалью конкурса работ молодых ученых, проводимого в рамках пятого международного конгресса Биотехнология 2009: Состояние и перспективы развития (Москва, 16-20, марта, 2009). Кроме этого, результаты работы были представлены на 4-х международных и всероссийских конференциях: Первый международный форум по нанотехнологиям, Москва, 3-5 декабря 2008; Международная конференция «Нанотехнологии в онкологии», Москва, 6 декабря 2008; Всероссийское совещание а Б но материалы в медицине»; Всероссийская научно-практическая конференция «Применение искусственных кальций-фосфатных биоматериалов в травматологии и ортопедии». Москва, 11-12 февраля 2010.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 4 работы в сборниках тезисов всероссийских и международных конференций. На разработки, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, поданы 2 заявки на патенты РФ.

Струстура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и

списка литературы. Работа изложена на 171 странице печатного текста, содержит 10 таблиц и 41 рисунок. Список литературы включает 125 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Создание бактериальных штаммов-продуцентов аффинных доменов.

После анализа литературы были выбраны б аффинных доменов. При этом 5 из них обладали сродством к коллагену: коллаген-связывающий домен адгезина микроорганизма S. aureus (SAu), коллаген-связывающие декапептиды из фактора фон Виллебранда быка (vWFB) и человека (vWFH, и vWFH2) и коллаген-связывающий домен из остеонектина человека (CollBD), и один - сродством к декстраиу -декстран-связывающий домен (DBD) из декстрансахаразы микроорганизма L. mesenleroides. Гены, кодирующие эти белки, были получены с помощью ПЦР или химикоферментативного синтеза из олигонуклеотидов. Кодонный состав синтетических генов был подобран таким образом, чтобы обеспечивать максимальный уровень экспрессии этих генов в клетках Е. cnli. R концевые последовательности генов были введены сайты рестрикции специфических эндонуклеаз, чтобы обеспечить возможность для дальнейших генно-инженерных модификаций.

Были созданы генно-инженерные конструкции, содержащие гены аффинных доменов. Гены коллаген-связывающих доменов были созданы в виде слитных генно-инженерных конструкций с целлюлозосвязывающим доменом (CBD), т.к. размеры самих коллаген-связывающих доменов чрезвычайно малы и исследовать их уровень продукции и биологические свойства без белка-носителя не представлялось возможным.

В результате данного этапа работы были получены бактериальные штаммы-продуценты, содержащие гены белков SAu, vWFB-CBD, vWFHrCBD, vWFH2-CBD, CollBD-CBD и DBD. Было показано, что в бактериальных клетках после индукции экспрессии рекомбинантных генов накапливаются белки vWFHpCBD, vWFH2-CBD, CollBD-CBD и DBD в количестве от 5% до 10% от тотального белка клетки. Накопления белков SAu и vWFB-CBD не наблюдалось.

2. Изучение аффинных свойств полученных доменов.

Была изучена способность полученных аффинных доменов связываться с субстратом, для этого были использованы различные виды Сефадексов в качестве матрицы для декстран-связывающего домена, и суспензия желатин-сефарозы в качестве матрицы для коллаген-связывающих доменов. Результаты связывания белков у\\ФНгСВО, уШРН2-СВО, СоИВБ-СВВ с целлюлозой и желатин-сефарозой представлены на электрофореграмме (рис. I).

1 2 3 4 5 6 7

Рис 1. Электрофореграмма связывания , рекомбинантных белков у\¥РН1-СВЭ,

Л '«*«• -я». ^—22 кРа vWFH2-CBD, СоПВО-СВО с целлюлозой и

К; желатин-сефарозой. 1 -у\УРНгСВР на

микрокристаллической целлюлозе; 2 -у\УРН|-СВО на желатин-сефарозе; 3 -: у\УРНг-СВО на микрокристаллической

целлюлозе; 4 - у\¥РН2-СВВ на желатин-сефарозе; 5 - СоПВО-СВО на микрокристаллической целлюлозе; 6 -СоПВО-СВО на желатин-сефарозе; 7 -контроль молекулярной массы 22 кДа.

По результатам электрофореза в ПААГ (12%) удельная концентрация белка составляла; 2 мг на 1 мл микрокристаллической целлюлозы и 1-1,5 мг на 1 мл желатин-сефарозы для белков vWFH1-CBD, у\УРН2-СВВ; 3 мг на 1 мл микрокристаллической целлюлозы и 3 мг на 1 мл желатин-сефарозы для белка СоНВО-СВО.

При изучении связывания белка уШРН2-СВО с желатин-сефарозой на электрофорезе появилась дополнительная полоса, по-видимому, свидетельствующая о частичной деградации белка.

Наиболее высокой аффинностью к коллаген-содержащему субстрату обладал химерный белок СоПВО-СВО, несущий в своем составе коллаген-связываюхций

домен из остеонектина человека, и он был выбран как основной коллаген-связывающий белок для дальнейших экспериментов.

Исследование аффинных свойств декстран-связывающего домена представлено на электрофореграмме (рис. 2).

По результатам электрофореза в ПААГ (12%) видно, что дексгран-связывающий домен хорошо связывается с различными типами Сефадексов, степень связывания зависит от размера пор Сефадекса и возрастает с их увеличением. Концентрации белка составляют: 15 мг на 1 мл сорбента Сефакрила 8-200, 5 мг на 1 мл сорбента Сефадекс й-75 и I мг на 1 мл сорбента Сефадекс 0-25.

1 2 3 4 5

Рис. 2. Электрофореграмма связывания рекомбинатного белка ОЕШ с Сефакрилом 5-200 и Сефадексом С-25 и О-75. 1 - ОЕЮ на Сефакриле 8-200; 2 - ОБО наСефадексе в-75; 3 - ОЕШ на Ссфадексе 0-25; 4, 5 - контроли молекулярной массы 13 кДа и 17 кДа.

3. Создание бактериальных штаммов-продуцентов биологически активных белков.

В качестве биологически активных белков нами были использованы хорошо изученные цитокины из организма человека: эпидремальный ростовой фактор, фактор роста фибробластов, [5-интерферон и костный морфогенетичекий белок 2. Гены этих белков были клонированы в бактериальных клетках.

Гены, кодирующие биологически активные белки, были получены методом ОТ-ПЦР из суммарной РНК скелетной мышцы человека, при этом праймеры для ПЦР были спланированы таким образом, чтобы обеспечить возможность дальнейших генно-инженерных манипуляций (в концевые последовательности генов были введены сайты рестрикции специфических эндонуклеаз).

В результате данного этапа работы были созданы бактериальные штаммы-продуценты, синтезирующие рекомбинантные белки ЕОР, РвИ, 1РК-р и ВМР-2. Было

% -—17 кОа

13кОа

показано, что после индукции экспрессии рекомбинант;ных генов данные белки накапливаются количестве от 5% до 10% от тотального белка клетки. Отсутствие продукции рекомбинантного белка по-видимому, объясняется его

токсичностью для клеток-продуцентов.

4. Создание бактериальных штаммов-продуцентов химерных белков, содержащих аффинный домен и биологически активный белок.

Следующим этапом работы стало получение генно-инженерных конструкций, состоящих из гена аффинного домена и целевого белка и клонирование их в бактериальных клетках. Для этого были взяты все полученные биологически-активные белки и отобраны три аффинных домена, продемонстрировавших наибольшую степень связывания со своей матрицей: Со111Ш, у\УРН) и 0£Ш.

Из полученных конструкций, кодирующих рекомбинантные белки, были отобраны и исследованы 4 наиболее перспективные для дальнейшего применения: СоШШ-РОР, ОВО-ЕОР, ОВ1>1га-р, Со11ВБ-ВМР-2. Уровень продукции выбранных белков в бактериальных клетках составил от 5% до 30%. Схематическое изображение, уровень продукции и растворимость химерных белков приведены в таблице 1.

Необходимо отметить, что после создания конструкции ВВО-И^-Р был достигнут высокий уровень продукции этого белка. Также были подобраны специфические условия, обеспечивающие восстановление нативной конформации белка Со11ВБ-ВМР-2, при этом количество биологически активной димерной формы составило более 60% от общего количества рекомбинантного белка.

Уровень продукции и растворимость химерных белков Со11В1)-Н,1*, ОВВ-КСК, НВВ-

1Р1Ч-р, Со11ВО-ВМР-2

Таблица 1

Химерный белок Уровень продукции Растворимость

СоНВО РСР 5% Нерастворимый

; ОБО [ ЕбР 20% Нерастворимый

ОВО . N Р 25% Нерастворимый

ш^г

" * V 30%

Нерастворимый

5. Оптимизация условий культнвирования бактериальных клеток, содержащих гены химерных белков.

Было проведено изучение влияния различных факторов на скорость роста и синтез рекомбинантных белков бактериальными клетками. Был подобран состав питательной среды, обеспечивающей увеличение накопления биомассы клеток штаммов-продуцентов химерных белков в 1,5-2 раза, по сравнению со стандартной средой ЬВ. Результаты оптимизации состава питательной среды представлены на рис. 3. Модифицированная питательная среда имеет состав: 1,5% триптона; 0,75% дрожжевого экстракта; 9,4 г К2Н Р04 и 2,2 г КН2Р04 на 1 л питательной среды.

■ Модифицированная среда

QBD-EGF CollBD-FGF DBD-IFN-3 CollBD-BMP-2

Рис. 3. Зависимость накопления биомассы от используемой питательной среды.

Также было подобрано оптимальное время культивирования каждого из штаммов-продуцентов химерных белков в лабораторном ферментере фирмы New Brunswik BioFlo 415, объемом 14 л. Оптимальное время культивирования составило: 4,5 часа для белка DBD-EGF; 5.0 часов для белка DBD-IFN-ß; 5,5 часов для белка CollBD-BMP-2 и 6,0 часов для белка ColiBD-FGF.

Кроме этого было изучено влияние температуры культивирования и времени добавления индуктора экспрессии. В результате проведенных экспериментов удалось повысить уровень продукции химерных белков в 2-3 раза по сравнению с начальным. 6. Исследование биологической активности полученных химерных белков.

Для изучения биологической активности белка CollBD-FGF in vitro была разработана модель культивирования клеток линии НЕК 293 на поверхности, покрытой коллагеном.

Было установлено, что нанесение на коллагеновую подложку препарата химерного белка CollBD-FGF увеличивает число эукариотических клеток в 1,5-2 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, полученный белковый препарат может применяться для совершенствования систем культивирования клеток млекопитающих и способен обеспечить интенсификацию их роста и, следовательно, оптимизировать производство биологически активных белков, синтезируемых этими клетками.

Для изучения биологической активности препаратов химерного белка DBD-EGF in vitro была разработана методика культивирования клеток эукариот в объеме

питательной среды на'поверхности сфер Сефадекса, покрытой рекомбинантным белком.

Было показано, что при добавлении к культуре эукариотических клеток суспензии Сефадексов клетки практически не адсорбируются на их поверхности. Также было показано, что при добавлении к питательной среде с клетками Сефадексов, предварительно проинкубированных с препаратом белка ОНО-ЕСИ, клетки значительно лучше адгезируются и растут на поверхности сфер Сефадексов.

Таким образом, полученный белковый препарат может применяться для создания новых систем для культивирования эукариотических клеток в объеме питательной среды. Данное применение его является чрезвычайно перспективным т.к. в настоящее время на рынке не существует подобных систем. Использование данной технологии может значительно повысить эффективность культивирования и, как следствие, снизить стоимость биологически активных белков, получаемых с помощью эукариотических клеток.

Было проведено исследование активности химерного белка ОВП-1РМ-(5 иммобилизованного на Сефадексе 0-75. Биологическая активность определялась по способности химерного белка защищать эукариотические клетки линии Л-41 от заражения вирусом энцефаломиокардита мышей. Результаты исследования биологической активности химерного белка 0В1>1РМ-[) представлены в таблице 2.

Биологическая активности белка В1Ш-1КМ-р и его коммерческих аналогов на модели инфицирования эукариотичсских клеток линии Л-41 вирусом энцефаломиокардита

мышей

Таблица 2

Образец Токсичность Титр в опытах (ед./мл) Активность

образца (МЕ/мл)

Химерный белок Отсутствует 640 5 000

DBD-IFN-P на 1280 10 000

Сефадексе 2560 20 000

Бетаферон Отсутствует 1280

(Schering, Ag) 1280 10 000*

1280

Человеческий Отсутствует 320

лейкоцитарный 640 1 000*

интерферон-а 320

(Биомед им. И.И.

Мечникова)

Ребиф Отсутствует 640

(Industria 640 10 000*

Farmacéutica 640

Serono S.P.A.)

Авонекс Отсутствует 1280

(Biogen B.V.) 1280 10 000*

1280

* - заявленная активность коммерческих препаратов.

Была показана активность препаратов рекомбинантного р-интерферона иммобилизованного на Сефадексе G-75, сопоставимая с референс-препаратом и коммерческими препаратами Р-интерферона, применяемыми в лечебной практике. В качестве референс-препарата использовали препарат интерферона-p: Бетаферон (104 МЕ/мл) (Schering, AG). В качестве коммерческих препаратов для сравнения активности использовались применяемые в настоящее время лекарственные средства Ребиф (104 МЕ/мл) (Industria farmacéutica serono S.p.A.) и Авонекс (104 МЕ/мл) (Biogen B.V.) и человеческий лейкоцитарный интерферон-a (103 МЕ/мл) (Биомед им. И.И. Мечникова).

Была исследована биологическая активность препарата белка CollBD-BMP-2 in vitro проводили на линиях клеток С2С12 (мышь СЗН, мышца конечности) и СЗН10Т1/2 clone 8 (мышь СНЗ, эмбрион), чувствительных к действию ВМР-2. Культивирование этих клеточных линий в питательной среде, содержащей ВМР-2, ускоряет их пролиферацию и дифференцировку в остеобласты, при этом клетки синтезируют ряд биологически активных соединений, таких как щелочная фосфатаза,

остеопонтин, коллаген I типа, остеокальцин и др. В нашей работе активность рекомбинантного белка CollBD-BMP-2 определяли по уровню синтеза щелочной фосфатазы. Результаты эксперимента приведены на рис. 5.

В результате проведенного эксперимента показана зависимость интенсивности синтеза щелочной фосфатазы культурой клеток от количества вносимого белка CollBD-BMP-2: при повышении концентрации белка в культуре клеток количество щелочной фосфатазы возрастало, при этом активность полученного химерного белка была сопоставима с активностью коммерческого препарата ВМР-2 (BioVision B.esearch Products, США). Также было изучено влияние различных способов стерилизации белка на его активность и возможность лиофильного высушивания. Препараты белка ВМР-2 стерилизовали радиационным облучением и

ультрафильтрацией (рис. 5).

250------------------------------------------------------------------—.............................-...........-...............-.................—.....—---------------------------

2.00

к 1,50+

2 s

3 a i

0> '< \ jü 0,50}

от I Í:

ё т ф

ш щг~ А I |

ü . ш ж... Шш ." . ¡ás И

о ______________

— — — — — — — — — _ — - — Jj,

q QQ4 S-A „ wt* _.*• „ mí i HL * / '

¡2 Is |8 |2 || |2 |§ fr* o

1> 12 i« ^2 I*? 12 ~

5% "t^ "i"ó "1"% Ib lé +

ч 2 3 5 S.2 S-S o. a B.20.S в, Й W ^g^ta^e^cQ^cü^ffl g ffl «

Рис. 5. Зависимость интенсивности синтеза щелочной фосфатазы клетками линии С2С12 от количества внесенного ВМР-2.

Биологическая активность химерного белка CollBD-BMP-2 in vivo изучалась с помощью двух разработанных нами совместно со специалистами Белгородского Государственного Университета модельных экспериментов на лабораторных животных.

Задачей первого исследования являлось изучение влияния

биокомпозиционного материала, содержащего химерный белок CollBD-BMP-2, на

репаративный остеогенез и установление прочности врастания титановой пластинки,

покрытой композицонньм препаратом, содержащим химерный белок Со11£Ш-ВМР-2. Для проведения эксперимента была разработана модель «силового имплантата», которая инокулировалась в большеберцовую кость крыс линии «Вистар». Исследование проводили на трех группах животных, которым устанавливали чистый титановый имплантат, титановый имплантат, покрытый композиционным препаратом, не содержащим химерного белка СоНВО-ВМР-2 и титановый имплантат, покрытый композиционным препаратом, содержащим химерный белок Со11ВО-ВМР-2. Крысы выводились из эксперимента на 30 сутки.

Рис. 6. Имплантаты, установленные в большеберцовую кость лабораторных крыс. Фотографии через 30 суток, а) титановый имплантат без покрытия, б) титановый имплантат. покрытый композиционным препаратом с белком Со11ВП-ВМР-2.

В результате проведенных испытаний было установлено, что пластины, покрытие композицонным препаратом без белка Со11ВО-ВМР-2 (рис. б, а)) имеют меньшую адгезионную прочность и легче отрываются от имплантата, по сравнению с пластинами, покрытыми композицонным препаратом с белком Со11ВВ-ВМР-2 (рис. 6 б)). При этом титановые пластины, не покрытые композиционным препаратом, через 30 суток не закреплялись в кости и отделялось из места имплантации без усилий. Также было показано, что при добавлении в композиционный препарат химерного белка Со11ВО-ВМР-2 вокруг имплантируемого титанового образца за 30 суток образуется новая пластинчатая костная ткань, что подтверждено гистологическими данными (рис. 7). В случае, когда композиционный препарат не содержал химерного белка Со11ВО-ВМР-2, имплантат покрывался соединительной тканью.

Рис. 7. Микрофотография гистологического среза новообразованной кости вокруг имплантата, покрытого композиционным препаратом с химерным белком Со11ВО-ВМР-2. Стрелками отмечена новообразованная пластинчатая костная ткань.

Задачей второго этапа исследований было установление скорости приживления титановой пластинки, покрытой композицонным препаратом, содержащим химерный белок Со11ВО-ВМР-2, и без него. Для проведения эксперимента были созданы титановые диски диаметром 5,5 мм. Диски, с нанесенным покрытием и без него имппантироняпи и искусственно созданный дефект н черепе крысы. В опыте оыло задействовано 30 лабораторных животных, разделенных на 3 равные группы: ложнопроорперированные (контрольная группа), с установленным титановым диском без покрытия, с установленным титановым диском, покрытым композиционным препартом, содержащим белок Со11ВО-ВМР-2.

Каждую группу животных дополнительно случайным образом разделили на три равные части, которые выводили из опыта через 2, 4 и 9 недель.

При макроскопическом исследовании животных контрольной группы (ложнопрооперированные) видно, что разрезы заживали путем первичного натяжения, не отмечалось выраженной воспалительной реакции.

Через 2 недели наблюдался выраженный дефект костной ткани в месте операции. Дно послеоперационного дефекта костной ткани выстланы сочными грануляциями и фрагментами оставшихся сгустков фибрина. На границе между вновь формирующейся костной тканью и твердой мозговой оболочкой наблюдалась грубоволокнистая соединительная ткань. Имеющийся костный дефект заполнен вновь формирующейся тканью на 1/3. Через 9 недель после операции дефект костной ткани был заполнен на 3/4. Ткань грубоволокнистая, с фрагментами костной ткани, преимущественно расположенными на границе со здоровой тканью. Поверхность неровная, с участками дефекта.

В группе животных, которым вводили имнлантат с композиционным покрытием или без него, так же, как и в контрольной группе, отсутствовали воспалительные реакции в месте операции. Послеоперационная рана заживала первичным натяжением с формированием послеоперационного рубца. При исследовании образцов уже визуально заметна различная выраженность репаративных процессов в исследуемых группах. Через 2 недели после операции в группе животных с имплантатом без покрытия определялось наличие единичных очагов роста соединительной ткани на поверхности имплантата, который слабо связан со здоровой костью и легко отделяется от последней в месте операции. К концу 9-ой недели определялось интенсивное «наползание» соединительной ткани от периферии к центру имплантата, который был плотно фиксирован грануляциями к неповрежденной кости. Грануляционный валик был хорошо выражен, сочный, однако в центре имплантата оставался дефект заполнения ткани. В случае использования имплантатов с покрытием, содержащим белок Со11ВО-ВМР-2, уже к началу 3-й недели отмечены множественные островки роста соединительной ткани по всей поверхности имплантата, представленные рыхлой волокнистой соединительной тканью. Сам имплантат плотно фиксировался к интактной кости по периферии. К 9-й неделе имплантат был покрыт на 4/5 поверхности зрелой соединительной тканью с множественными очагами оссификации, по центру имплантат был покрыт рыхлой волокнистой соединительной тканью в виде тонкой пленки. На поверхности, обращенной к твердой мозговой оболочке, видно полное покрытие имплантата грубой волокнистой соединительной тканью с множественными очагами неоостеогенеза. Имплантат плотно фиксирован к неповрежденной кости вновь образованной тканью.

Было проведено изучение функциональной активности центральной нервной системы животных, подвергшихся операции. Кроме изучения влияния композиционного препарата, содержащего рекомбинанатный белок Со11ВО-ВМР-2, в данном опыте исследовали влияние различных вариантов обработки поверхности титана: пескоструйная обработка и обработка методом микродугового оксидирования в растворе гидроксиапатита.

Тестирование врожденного поведения и оценка исследовательской и эмоциональной активности (норковый рефлекс, тест "открытое поле") показали, что

врожденное поведение (рефлексы хватания и переворачивания) у ложнооперированных крыс оставались в пределах нормы. Через неделю после операции все животные с имплантатами уступали по двигательной и исследовательской активности контрольным животным. Через 4 недели после операции животные с имплантатами из титана, обработанного микродуговым оксидированием (с покрытием и без него) не отличались от контрольной группы. В то же время, животные с имплантатами из титана, обработанного пескоструйным методом, восстанавливали свою активность гораздо медленнее (Рис. 7). При использовании покрытия, содержащего химерный белок Со11ВО-ВМР-2 восстановление нормальной активности нервной системы происходит на 30-50% быстрее.

•■'РУ Нм - Л .ЩТ^циз Т.СГД ".л !

я 2-ш СПо.ши накршт " ¿-зчгйеэ ЗМР-2

Ч«СЯО дней ПЖ«

Рис. 7. Результаты исследования горизонтальной двигательной активности (ГДА) прооперированных животных.

Таким образом, наилучшее приживление имплантатов во всех группах животных наблюдалось в случае покрытия, содержавшего рекомбинантный белок Со11ВО-ВМР-2. Кроме того, внесение в композиционный препарат для покрытия титановых имплантатов рекомбинантного белка Со1ШО-ПМР-2 ускоряет послеоперационную реабилитацию и снижает нейротоксичность титановых имплантатов.

выводы

1. Сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие рекомбинантные гены коллаген-связывающего домена адгезина микроорганизма Staphylococcus aureus (SAu), коллаген-связывающих декапептидов из фактора Виллебранда человека (vWFHi, vWFH2) и быка (vWFB), коллаген-связывающего домена из остеонектина человека (ColIBD), декстран-связывающего домена из дестрансахаразы микроорганизма Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides (DBD), эпидермального фактора роста человека (EGF), фактора роста фибробластов человека (FGF), ß-интерферона человека (IFN-ß) и костного морфогенетического белка 2 человека (ВМР-2).

2. Получены штаммы Е. coli - продуценты химерных рекомбинантных белков DBD-EGF, ColBD-FGF, DBD-IFN-ß и CollBD-BMP-2, имеющих в своем составе декстран-связывающий или коллаген-связывающий аффинные домены. Продукция целевых белков составляет от 5 до 30 % от тотального белка клетки.

3. Произведена оптимизация условий культивирования и экспрессии рекомбинантных белков в клетках Е. coli. При этом достигнуто увеличение уровня выхода рекомбинантных белков в 1,5-2 раза.

4. На основе технологии аффинных доменов отработаны методы очистки и иммобилизации на соответствующих сорбентах рекомбинантных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-ß и CollBD-BMP-2.

5. Показана биологическая активность препаратов рекомбинантных белков DBD-EGF, CollBD-FGF на эукариотических клетках in vitro. Белки DBD-EGF и CollBD-FGF вызывают ускорение роста культур клеток и могут быть использованы для модернизации имеющихся и разработки новых методик культивирования эукариотических клеток.

6. Биологическая активность полученных препаратов иммобилизованного па сорбенте рекомбинантного белка DBD-IFN-ß при тестировании на эукариотических клетках in vitro превышает активность исследованных коммерческих препаратов рекомбинантного ß-интерферона человека.

7. Биологическая активность полученного препарата рекомбинантного белка CollBD-BMP-2 in vitro, сравнима с активностью коммерческого препарата ВМР-2.

8. Разработаны методики исследования скорости регенерации и оценки прочности врастания в костную ткань модельных металлических имплантатов, обработанных покрытием с рекомбинантным белком CollBD-BMP-2, на экспериментальных животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Семихин A.C.. Лящук A.M., Мезенцева М.В., Трегубова М.И., Сергиенко О.В., Полетаева H.H.. Народицкий Б.С., Карягина A.C., Лунин В.Г., Гинцбург А.Л. Получение рекомбинантного интерферона-ß человека на основе технологии аффинных доменов. //Ж. молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2009. -4, с. 38-41.

2. НЕ. Шарапова, А.П. Котнова, З.М. Галушкина, H.H. Полетаева, Н.В. Лаврова, ЕМ. Аксенова, A.C. Семихин. A.C. Карягина, В.Г. Лунин. Получение и характеристика коллаген-связывающих доменов из фактора фон Виллебранда (v'VF) человек а. //Ж. молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2009.-1, с. 31-35.

3. Семихин A.C., Лунин В.Г. Создание самособирающихся наноструктур на основе коллаген-связывающих доменов и применение их в медицине. // Пятый московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 16-20 марта 2009. Материалы конгресса, с. 195-196.

4. Семихин A.C.. Котнова А.П., Лунин В.Г. Создание самособирающихся наноструктур на основе коллаген-связывающих доменов и применение их в медицине. // Первый международный форум по нанотехнологиям, Москва, 3-5 декабря 2008. Сборник тезисов докладов молодых ученых, с. 606-607.

5. Семихин A.C.. Котнова А.П., Лунин В.Г. Создание самособирающихся наноструктур на основе коллаген-связывающих доменов и применение их в медицине. // Нанотехнологии в онкологии, Москва, 6 декабря 2008. Тезисы докладов, с. 52.

6. Семихин A.C.. Лящук A.M., Лаврова Н.В., Галушкина З.М., Полетаева H.H., Мезенцева М.В., Сергиенко О.В., Тухватулин А.И., Лунин В.Г., Карягина A.C. Применение нанотехнологий для создания иммунобиологических препаратов нового поколения. Второй международный форум по нанотехнологиям,

Москва, 6-8 октября 2009. Сборник тезисов докладов молодых ученых, с. 874875.

7. Семихин A.C., Яушш В.Г., Карягина A.C., Зайцев В.В., Лукина Ю.С. Использование BMP 2 для создания композиционных препаратов нового поколения. Всероссийское совещание "Биоматериалы в медицине". Москва, 4 октября 2009. Тезисы докладов, с С.61-62.

8. Лукина Ю.С., Берченко Г.Н., Сивков С.П., Гаврюшенко Н.С., Семихин A.C.. Лаврова Н.В., Полетаева H.H., Зайцев В.В., Карягина A.C., Лунин В.Г. Предварительные данные по разработке резорбируемого кальций-фосфатного цемента на основе брушита, содержащего рекомбинантный костный морфогенетический белок (rhBMP-2). Всероссийская научно-практическая конференция «Применение искусственных кальций-фосфатных биоматериалов в травматологии и ортопедии. Москва, 11-12 февряля 2010. Сборник работ конференции, с. 7.

Подписано в печать 25.02.2010 г. Усл. печ. л. 1,56. Формат 60x90 1/16 Заказ № 398/10 Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии ООО НВП «ИНЭК» 125171, г.Москва, ленинградское шоссе, д. 18

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семихин, Александр Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Технология аффинных доменов и ее применение для получения химерных бежов.

1.2. Аффинные домены.

1.2.1. Целлюлозосвязывающие домены.

1.2.2. Коллаген-связывающие домены.

1.2.2.2. Коллаген-связывающие домены из фактора фон Виллебранда быка и человека (vWFB, vWFH, и vWFH2).

1.2.2.3. Коллаген-связывающий домен из остеонектина человека (CollBD).

1.2.2.4. Декстран-связывающий домен из декстрансахаразы микроорганизма Leuconostoc mesenteroides.

1.3. Биологически активные белки.

1.3.1. Эпидермальный фактор роста человека (EGF).

1.3.2. Фактор роста фибробластов человека (FGF).

1.3.3. Интерферон бета человека (IFN-fi').

1.3.3.1. Интерферон бета и его функции.

1.3.3.2. Производство интерферона бета.

1.3.4. Костные морфогенетические белки человека (BMP).

1.3.4.1. Методы получения BMP.

1.3.4.2. Общая характеристика BMP.

1.3.4.3. Механизм действия BMP.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.4. Материалы и реактивы.

2.4.1. Плазмидные векторы и олигонуклеотиды.

2.4.2. Бактериальные штаммы и линии клеток.

2.4.3. Лабораторные животные.

2.4.4. Питательные среды.

2.4.5. Ферменты.

2.4.6. Сорбенты.

2.4.7. Буферные растворы.

2.4.8. Другие реактивы.

2.4.9. Оборудование.

2.5. Основные методики.

2.5.1. Полимеразная цепная реакция.

2.5.2. Химико-ферментативный синтез.

2.5.3. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами.

2.5.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.5.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля.

2.5.6. Лигирование фрагментов ДНК.

2.5.7. Выделение и очистка аналитического количества. плазмидной ДНК.

2.5.8. Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК.

2.5.9. Выделение хромосомной ДНК Staphylococcus aureus и.

Leuconostoc mesenteroides.

2.5.10. Определение нуклеотидных последовательностей. плазмидных ДНК.

2.5.11. Подготовка компетентных клеток Е. coli для трансформации плазмидной ДНК электропорацией.

2.5.12. Трансформация клеток Е. coli.

2.5.13. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН.

2.5.14. Выращивание штамма-продуцента и индукция синтеза рекомбинантных белков.

2.5.15. Определение растворимости белков.

2.5.16. Выделение и очистка рекомбинантных белков на целлюлозе,. с помощью целлюлозосвязывающего домена.

2.5.17. Выделение и очистка рекомбинантных белков на сефадексе,. с помощью декстран-связывающего домена.

2.5.18. Выделение и очистка белков, содержащих. коллаген-связывающие домены.

2.5.19. Измерение биологической активности интерферона бета.

2.5.20. Измерение активности щелочной фосфатазы.

2.5.21. Получение телец включения Е. coli, содержащих ВМР2.

2.5.22. Очисткарекомбинатного BMP2 и получение биологически. активной формы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Создание бактериальных штаммов-продуцентов аффинных доменов.

3.1.1. Создание бактериального штамма-продуцента коллаген-связывающего домена (SAu).

3.1.1.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена белка SAu.

3.1.1.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка SAu в клетках Е. coli штаммов М15 и DH5a.

3.1.2. Создание бактериальных штаммов-продуцентов белков vWFB, vWFHi и vWFH2.

3.1.2.1. Клонирование нуклеотидных последовательностей генов белков vWFB, vWFH], vWFH2.

3.1.2.2. Экспрессия рекомбинантных генов белков vWFHb vWFH2, vWFB в клетках Е. coli Ml5.

3.1.3. Создание бактериального штамма-продуцента белка CollBD.

3.1.3.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена белка CollBD.

3.1.3.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка CollBD в клетках

Е. coli Ml 5.

3.1.4. Создание бактериального штамма-продуцента декстран-связывающего домена (DBD).

3.1.4.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена белка DBD.

3.1.4.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка DBD в клетках

Е. coli Ml5.

3.2. Изучение аффинных свойств полученных доменов.

3.3. Создание бактериальных штаммов-продуцентов биологически активных бежов.

3.3.1. Создание бактериального штамма-продуцента белка EGF.

3.3.1.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена белка EGF.

3.3.1.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка EGF в клетках

Е. coli Ml5.

3.3.2. Создание бактериального штамма-продуцента белка FGF.

3.3.2.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена белка FGF.

3.3.2.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка FGF в клетках

Е. coli М15.

3.3.3. Создание бактериального штамма-продуцента белка 1FN-J3.

3.3.3.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена. белка IFN-р.

3.3.3.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка IFN-p. в клетках Е. coli Ml 5.

3.3.4. Создание бактериального штамма-продуцента белка В MP2.

3.3.4.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена белка ВМР2.

3.3.4.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка ВМР2 в клетках

Е. coli Ml5.

3.4. Создание бактериальных штаммов-продуцентов химерных бежов, несущих в своем составе аффинные домены и биологически активные белки.

3.4.1. Создание бактериального штамма-продуцента химерного белка v WFHi-sp-EGF.

3.4.1.1. Клонирование гена химерного белка vWFHi-sp-EGF.

3.4.1.2. Экспрессия гена химерного белка vWFHrsp-EGF в клетках

Е. coli Ml5.

3.4.2. Создание бактериального штамма-продуцента химерного белка vWFHrsp-FGF.

3.4.2.1. Клонирование гена химерного белка vWFHrsp-FGF.

3.4.2.2. Экспрессия гена химерного белка vWFHrsp-FGF в клетках

Е. coliM 15.

3.4.3. Создание бактериального штамма-продуцента химерного белка CollBD-sp-EGF.

3.4.3.1. Клонирование гена химерного белка CollBD-sp-EGF.

3.4.3.2. Экспрессия гена химерного белка CollBD-sp-EGF в клетках

Е. coli Ml5.

3.4.4. Создание бактериального штамма-продуцента химерного белка CollBD-sp-FGF.

3.4.4.1. Клонирование гена химерного белка CollBD-sp-FGF.

3.4.4.2. Экспрессия гена химерного белка CollBD-sp-FGF в клетках

Е. coliM 15.

3.4.5. Получение спейсерной последовательности и конструкции p-sp-DBD.

3.4.6. Создание бактериального штамма-продуцента химерного белка DBD-sp-EGF.

3.4.6.1. Клонирование гена химерного белка DBD-sp-EGF.

3.4.6.2. Экспрессия гена химерного белка DBD-sp-EGF в клетках

Е. coliMIS.

3.4.7. Создание бактериального штамма-продуцента химерного. белка DBD-sp-FGF.

3.4.7.1. Клонирование гена химерного белка DBD-sp-FGF.

3.4.7.2. Экспрессия гена химерного белка DBD-sp-FGF в клетках

Е. coli М15.

3.4.8. Создание бактериального штамма-продуцента химерного. белка DBD-sp-IFNp.

3.4.8.1. Клонирование гена химерного белка DBD-sp-IFNp.

3.4.8.2. Экспрессия гена химерного белка DBD-sp-IFNp в клетках

Е. coli Ml5.

3.4.9. Создание бактериального штамма-продуцента химерного белка CollBD-sp-BMP2.

3.4.9.1. Клонирование гена химерного белка CollBD-sp-BMP2.

3.4.9.2. Экспрессия гена химерного белка CollBD-sp-BMP2 в клетках

Е. coli М15.

3.4.9.3. Подбор и оптимизация условий, способствующих восстановлению биологически активной формы ВМР-2.

3.5. Оптимизация условий культивирования бактериальных клеток, содержащих гены химерных белков.

3.5.1. Подбор условий культивирования штаммов-продуцентов рекомбинантных белкоа в колбах.

3.5.2. Наработка биомассы в ферментере New Brunswick BioFlo 415.

3.6. Исследование биологических свойств химерного белка CollBD

FGF на модели культивирования эукариотических клеток in vitro на поверхности плашек, покрытых коллагеном.

3.7. Исследование биологических свойств химерного белка DBD-sp-EGF на модели культивирования эукариотических клеток in vitro в объеме питательной среды.

3.8. Исследование биологической активности химерного белка DBD-sp-IFNb in vitro, на модели инфекции вирусом энцефаломиокардита мышей.

3.9. Исследование биологической активности химерного белка

COLLBD-sp-BMP2 in vitro, на культуре эукариотических клеток.

ЗЛО. Исследование биологической активности химерного белка CollBD-sp-BMP2 in vivo, на модели костного дефекта в болынеберцовой кости крыс.

3.11. Исследование биологической активности химерного белка CollBD-sp-BMP2 in vivo, на модели костного дефекта в черепе крыс.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение компонентов иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов"

Актуальность проблемы. Перспективным направлением развития современной медицинской науки является разработка новых технологий получения иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза. Такие технологии позволяют сократить срок разработки нового препарата и значительно снизить его стоимость. Безусловно, синтез гетерологичных белков в клетках бактерий связан с рядом трудностей, основные из них это низкий уровень продукции чужеродного белка, нестабильность и сложность его очистки. Решение этих проблем является важной биотехнологической задачей и одним из подходов, применяемых для повышения уровня продукции целевого белка, его стабилизации и возможности быстрой и эффективной очистки, является технология аффинных доменов. Основной принцип данной технологии заключается в получении двухдоменных белков, содержащих в своем составе целевой белок, обладающий биологической активностью и различные аффинные домены, способные влиять на уровень продукции, растворимость и стабильность целевого белка. Кроме того технология аффинных доменов позволяет решить другую важную задачу — упростить систему очистки целевого белка и таким образом снизить его стоимость.

Одна из наиболее важных областей применения технологии аффинных доменов - получение иммунобиологических препаратов нового поколения. Благодаря широкому разнообразию встречающихся в природе аффинных доменов и соответствующих матриц можно создавать препараты, в которых оба компонента (рекомбинантный белок и аффинная матрица) будут иметь важное биологическое значение. Химерный белок (фактор роста, вакцинный компонент, иммуномодулятор и т.д.) будет проявлять специфическую биологическую активность, а носитель, на котором он иммобилизован, может стимулировать иммунный ответ, защищать белок от действия ферментов и биологических жидкостей организма, обеспечивать пролонгированное действие иммобилизованного белка и т.д.

Большой интерес представляет создание рекомбинантных факторов роста, способствующих росту и заживлению тканей. В настоящее время в различных странах, в т.ч. и в России, широко применяются раневые покрытия, содержащие рекомбинантный эпидермальный фактор роста человека. Такие покрытия показали свою эффективность в клинике: благодаря их использованию повреждения кожи заживают путем первичного натяжения без образования рубцов и скорость полного восстановления ткани сокращается в 2-3 раза.

Также рекомбинантные ростовые факторы могут применяться для улучшения существующих и разработки новых систем культивирования эукариотических клеток. Для этих целей используются эпидермальный ростовой фактор и фактор роста фибробластов, т.к. известна их способность стимулировать рост клеток эукариот in vitro.

Препараты рекомбинантного интерферона бета в настоящее время применяются в медицине для лечения широкого спектра патологий - это, прежде всего, различные вирусные инфекции, аутоиммунные заболевания и злокачественные опухоли. Однако, несмотря на очевидную эффективность препаратов на основе интерферона-(3, существующие технологии получения этого белка не способны в полной мере удовлетворить растущие потребности медицины.

Для производства рекомбинантного интерферона-p сегодня используются различные системы экспрессии, и каждая из них обладает своими недостатками и преимуществами. Получение интерферона с помощью клеток млекопитающих позволяет получить белок идентичный натуральному, но накопление, выделение и очистка такого белка являются сложным и дорогостоящим процессом. Более того, интерферон является токсичным для клеток-продуцентов, что дополнительно снижает

12 эффективность данной технологии и повышает стоимость конечного продукта. В свою очередь рекомбинантный интерферон-p, синтезированный в бактериальных клетках может быть загрязнен различными токсичными белками и пирогенами, и также токсичен для клеток-продуцентов.

Ежегодно в России регистрируется около 20 млн. различных травм, 15% которых связаны с переломами костей. Одним из наиболее эффективных методов лечения является заполнение дефектов кости различными биокомпозитами, ускоряющими рост костной ткани. В ряде случаев необходимо использование металлоконструкций для обеспечения фиксации кости в месте перелома. Для улучшения приживаемости таких имплантатов их также покрывают композиционными покрытиями. Однако не все материалы достаточно биосовеместимы и актуальной проблемой трансплантологии сейчас является создание новых поколений биодеградируемых и биосовместимых покрытий и матриксов, в которые введены биологически активные соединения, обеспечивающие благоприятную среду для восстановления поврежденных тканей.

Новое поколение композиционных препаратов кроме широко используемых материалов - коллагена и гидроксиапатита содержит биологически активные белки - факторы роста. Одним из основных таких белков является костный морфогенетический белок 2 (Bone morphogenetic protein 2 - ВМР-2). Функции ВМР-2 в организме чрезвычайно разнообразны, но основная его задача во взрослом организме — поддержание и восстановление костной ткани. Введение в состав композиционных препаратов рекомбинантного ВМР-2 способно сократить время заживления переломов в 2-3 раза, а при обработке металлических имплантатов биосовместимыми покрытиями, содержащими ВМР-2, снизить вероятность отторжения имплантатов в 3-5 раз.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось разработка подходов для получения, очистки и иммобилизации биологически активных

13 белков на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов.

В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Клонирование в клетках Е. coli нуклеотидных последовательностей, кодирующих гены аффинных доменов: коллаген-связывающий домен из адгезина микроорганизма Staphylococcus aureus (SAu), коллаген-связывающие декапептиды из фактора фон Виллебранда быка (vWFB) и человека (vWFHl и vWFH2), коллаген-связывающий домен из остеонектина человека (CollBD), декстран-связывающий домен (DBD) из декстрансахаразы микроорганизма Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides и гены биологически активных белков — цитокинов из организма человека: эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), интерферон бета (IFN-p) и костный морфогенетический белок человека 2 (ВМР-2). Выбор оптимальных аффинных доменов для создания химерных конструкций с биологически активными белками.

2. Создание штаммов Е. coli — продуцентов химерных рекомбинантных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-p и CollBD-BMP-2.

3. Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов химерных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-P и CollBD-BMP-2.

4. Отработка методов очистки и иммобилизации химерных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-p и CollBD-BMP-2 на соответствующих сорбентах - желатин-сефарозе для белков, несущих в своем составе коллаген-связывающий домен и Сефадексе для белков, содержащих декстран-связывающий домен.

6. Изучение биологической активности препарата белка DBD-IFN-p иммобилизованного на Сефадексе in vitro.

7. Изучение биологической активности препарата белка CollBD-BMP-2 in vitro.

8. Разработка методик изучения и оценки биологической активности препаратов, содержащих рекомбинантный белок CollBD-BMP-2 in vivo. Научная новизна. В результате выполнения работы впервые были получены бактериальные штаммы-продуценты химерных белков, содержащих эпидермальный фактор роста человека, соединенный с декстран-связывающим доменом, фактор роста фибробластов человека, соединенный с коллаген-связывающим доменом, интерферон бета человека соединенный с декстран-связывающим доменом и костный морфогенетический белок 2 соединенный с коллаген-связывающим доменом.

Были достигнуты высокие уровни продукции химерных белков и созданы высокоэффективные системы выделения, очистки и иммобилизации их на соответствующих сорбентах, основанные на способности выбранных аффинных доменов специфически связываться с соответсвующим сорбентом. Степень чистоты полученных таким образом белковых препаратов составила более 95%.

Путем микробиологического синтеза была получена биологически активная форма рекомбинантного интерферона-p, по своей противовирусной активности не уступающая доступным коммерческим аналогам.

Впервые в России были созданы препараты, содержащие рекомбинантный белок CollBD-BMP-2 и показана эффективность данных препаратов в опытах на лабораторных животных.

Практическое значение работы. Результаты работы представляют не только научный, но и чрезвычайный практический интерес. Полученные в нашей работе аффинные домены могут быть использованы для создания химерных белков, несущих в своем составе различный биологически активный компонент: цитокины из организма человека, биологическиценные и экономически-значимые белки из различных макро- и микроорганизмов, бактериальные и вирусные антигены, токсины и т.д. При этом аффинной матрицей, для полученных нами доменов, являются хорошо изученные и разрешенные к медицинскому применению вещества — коллаген и декстран. Также необходимо отметить, что использование коллагенсвязывающего домена открывает широкие перспективы для создания пролонгированных форм лекарственных препаратов. Благодаря аффинному взаимодействию можно получить препарат белка иммобилизованного на коллагене (или его гидролизованной форме - желатине) или коллагенсодержащем носителе. Такой препарат может иметь инъекционную форму и при введении будет постепенно гидролизоваться протеазами организма, высвобождая новые порции химерного белка. Благодаря возможности

16 изменения физических свойств коллагена (желатина), т.е. его химической или радиационной сшивки, можно регулировать скорость деградации носителя в организме и создавать препараты, действующие от нескольких недель до нескольких месяцев. Кроме того малые размеры коллаген-связывающего домена (~ 2 кДа) практически не влияют на биологические свойства присоединяемого белка и не вызывают иммунной реакции в организме человека.

Несомненную практическую значимость представляют также полученные в работе биологически активные белки. Так химерный белок, содержащий в своем составе коллаген-связывающий домен и фактор роста фибробластов, может быть использован для интенсификации процесса культивирования клеток эукариот на поверхности, покрытой коллагеном. Благодаря аффинному взаимодействию химерный белок будет прочно закреплен на носителе и не потребует дополнительной стадии очистки, а благодаря способности FGF стимулировать рост клеток можно повысить эффективность культивирования (а, следовательно, и накопления биологически ценных продуктов, синтезируемых клетками) в 1,5-2 раза. Полученный нами белок, содержащий декстран-свзязывающий домен и эпидермальный фактор роста, также может быть использован для улучшения существующих систем культивирования клеток эукариот, но не на поверхности пластика, а в объеме питательной среды. Используя способность декстран-связывающего домена избирательно и прочно взаимодействовать с Сефадексом (химически модифицированным декстраном) такой химерный белок можно иммобилизовать на поверхности сфер Сефадекса. После этого, добавив эти сферы в питательную среду, можно значительно увеличить площадь культивирования и, следовательно, получить большее количество клеток с того же объема питательной среды.

Несомненную практическую значимость представляет полученный нами химерный белок, содержащий декстран-связывающий домен и

17 интеферон-p. Потребность в интерфероне-p в России и в мире в настоящее время велика и разработка новых простых и дешевых систем его получения является чрезвычайно актуальной биотехнологической задачей. Полученный нами рекомбинантный белок в опытах in vitro продемонстрировал способность защищать клетки от модельной вирусной инфекции не хуже существующих коммерческих аналогов. Благодаря аффинному домену выделение и очистку интерферона-Р можно проводить на недорогих сорбентах практически безинструментально и в одну стадию получить препарат с чистотой целевого белка более 95%.

Полученный химерный белок, состоящий из коллаген-связывающего домена и костного морфогенетического белка 2, позволит создавать препараты для ускорения регенерации костной ткани, не уступающие по своим характеристикам существующим мировым аналогам. ВМР-2 является основным фактором, влияющим на скорость восстановления костной ткани и введение его в препараты для регенерации переломов и повреждений кости, а также в композиционные покрытия для имплантируемых материалов, позволяет в 2-3 раза повысить скорость восстановления костной ткани и снизить вероятность отторжения имплантатов. Особое значение данной части работы придает тот факт, что в настоящее время не существует отечественных коммерческих препаратов, содержащих рекомбинантный ВМР-2, в то время как в США и странах Западной Европы препараты на его основе уже прошли клинические испытания и применяются в медицинской практике. При этом такого рода препараты являются очень дорогостоящими. Рекомбинантный белок ВМР-2, полученный в работе, может быть использован для разработки отечественных препаратов ВМР-2 и решения важнейшей задачи импортозамещения.

18 была удостоена I премии, также результаты работы были отмечены медалью конкурса работ молодых ученых, проводимого в рамках пятого международного конгресса Биотехнология 2009: состояние и перспективы развития (Москва, 16-20, марта, 2009). Кроме этого результаты работы были представлены на 4 международных и всероссийских конференциях: Первый международный форум по нанотехнологиям, Москва, 3-5 декабря 2008, международная конференция «Нанотехнологии в онкологии», Москва, 6 декабря 2008, Всероссийское совещание «Биоматериалы в медицине», Всероссийская научно-практическая конференция «Применение искусственных кальций-фосфатных биоматериалов в травматологии и ортопедии», Москва, 11-12 февраля 2010.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК, 4 работы в сборниках тезисов всероссийских и международных конференций. На разработки, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, поданы 3 заявки на патент РФ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Семихин, Александр Сергеевич

Выводы.

1. Сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие рекомбинантные гены коллаген-связывающего домена адгезина микроорганизма Staphylococcus aureus (SAu), коллаген-связывающих декапептидов из фактора Виллебранда человека (vWFHb vWFH2) и быка (vWFB), коллаген-связывающего домена из остеонектина человека (CollBD), декстран-связывающего домена из дестрансахаразы микроорганизма Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides (DBD), эпидермального фактора роста человека (EGF), фактора роста фибробластов человека (FGF), интерферона бета человека (IFN-3) и костного морфогенетического белка 2 человека (ВМР-2).

2. Получены штаммы Е. coli - продуценты химерных рекомбинантных белков DBD-EGF, ColBD-FGF, DBD-IFN-p и CollBD-BMP-2, имеющих в своем составе декстран-связывающий или коллаген-связывающий аффинные домены. Продукция целевых белков составляет от 5 до 30 % от тотального белка клетки.

4. На основе технологии аффинных доменов отработаны методы очистки и иммобилизации на соответствующих сорбентах рекомбинантных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-(3 и CollBD-BMP-2.

6. Биологическая активность полученных препаратов иммобилизованного на сорбенте рекомбинантного белка DBD-IFN-(3 при тестировании на

156 эукариотических клетках in vitro превышает активность исследованных коммерческих препаратов рекомбинантного интерферона бета человека.

7. Биологическая активность полученного препарата рекомбинантного белка CollBD-BMP-2 при тестировании на эукариотических клетках in vitro, сравнима с активностью коммерческого препарата ВМР-2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семихин, Александр Сергеевич, Москва

1. Nygren, Р.А. Engineering proteins to facilitate bioprocessing / P.A. Nygren, S. Stahl, M. ЦЫёп // Trends Biotechnol. 1994. - Vol. 12. P. 184-188.

2. Scheich, C. An automated method for high-throughput protein purification applied to a comparison of His-tag and GST-tag affinity chromatography / C. Scheich, V. Sievert, K. Bussow // BMC Biotechnol. 2003. - Vol. 3. P. 12.

3. Smith, J.C. Chemical synthesis and cloning of a poly(arginine)-coding gene fragment designed to aid polypeptide purification / J.C. Smith et al. // Gene. -1984. Vol. 32. P. 321-327.

4. Hochuli, E. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues / E. Hochuli, H. Dobeli, A. Schacher // J. Chromatogr.-1987. Vol.411. P. 177-184.

5. Blanar, M.A. Interaction cloning: identification of a helix-loop-helix zipper protein that interacts with c-Fos / M. A. Blanar, W. J. Rutter // Science. — 1992. -Vol. 256. P. 1014-1018.

6. Schmidt, T. G. M. Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin / T. G. M. Schmidt, et al. // J. Mol. Biol. -1996.-Vol. 255. P. 753-766.

7. Keefe, A. D. One-step purification of recombinant proteins using a nanomolar-affinity streptavidin-binding peptide, the SBP-Tag / A. D. Keefe, et al. // Protein Expr. Purif. 2001. - Vol. 23. P. 440-446.

8. Evan, G. 1. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product / G. I. Evan, et al. // Mol. Cell. Biol. 1985. - Vol. 5. P. 36103616.

9. Karpeisky, M. Y. Formation and properties of S-protein complex with S-peptidecontaining fusion protein / Karpeisky M. Y. et al. // FEBS Lett. 1994. -Vol. 339. P. 209-212.

10. McCormick, M., Purification and S-Tag detection of CBD fusion proteins / M. McCormick, J. Berg // Innovations. 1997. - Vol. 7. P. 12-15.

11. Porath, J. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation / J. Porath, et al. // Nature. 1975. - Vol. 258. P. 598-599.

12. Zheng, C.-F. A new expression vector for high level protein production, one step purification and direct isotopic labeling of calmodulin-binding peptide fusion proteins / C.-F. Zheng, et al. // Gene. 1997. Vol. 186. P. 55-60.

13. Stofko-Hahn, R. E. A single step purification for recombinant proteins / R. E. Stofko-Hahn, D. W. Carr, J. D. Scott // FEBS Lett. 1992. - vol. 302. P. 274-278.

14. Tomme, P. Characterization and affinity applications of cellulose-binding domains / P.Tomme, et al. // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 1998. - Vol. 715. P. 283-296.

15. Xu, Z. Heavy metal removal by novel CBD-EC20 sorbents immobilized on cellulose / Z. Xu, et al. // Biomacromolccules. 2002. - Vol. 3. P. 462^465.

16. Watanabe, T. The role of the C-terminal domain and type III domains of chitinase Al from Bacillus circulans WL-12 in chitin degradation / T. Watanabe, et al. // J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176. P. 4465-4472.

17. Morisaki, H. Analysis of a dextran-binding domain of the dextranase of Streptococcus mutans / H. Morisaki, et al. // Lett. Appl. Microbiol. 2002. - Vol. 35. P. 223-227.

18. Kaseda, K. A novel approach for purification of recombinant proteins using the dextran-binding domain / K. Kaseda. et al. // FEBS Lett. -2001. Vol. 3. P. 141144.

19. Рабинович, M. Jl. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы / М. Л. Рабинович, М. С. Мельник // Успехи биол. химии. 2000. С. 205—266.

20. Rabinovich, M. L. Materials of Soviet-Finland Seminar on Bioconversion of Plant Raw Materials by Microorganisms / M. L. Rabinovich // Pushchino: Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms. 1984. P. 31-48.

21. Рабинович, M. Л. Кинетические аспекты действия карбогидраз (лизоцим и целлюлолитические ферменты): дис. . канд. хим. наук. — М., 1977. С. 16.

22. Levy, I. Cellulose-binding domains: biotechnological applications / I. Levy, O. Shoseyov//Biotechnol. Adv. 2002. - Vol. 20. P. 191-213.

23. Гурвич, A. E. / Биохимия. 1957. - T.22, вып. 6. - С. 1028-1034.

24. Гурвич, А. Е., Кузовлева О. Б., Туманова А. Е. / А. Е. Гурвич, О. Б. Кузовлева, А. Е. Туманова // Биохимия. — 1961. — Т.26, вып.5. — С.934-942.

25. Гурвич, А. Е., Кузовлева О. Б., Орлов Г. Е. / А. Е. Гурвич, О. Б. Кузовлева, Г. Е. Орлов / Лаб. дело. 1967, №12. - С. 732-734.

26. Лунин, В. Г., Карягина-Жулина А. С., Лящук А. М. и др. / Патент РФ № 2270249 от 20 февраля 2006 г.

27. Лунин, В. Г., Карягина-Жулина А. С., Тихонова Т. В. и др. // Патент РФ №2278160 от 20 июня 2006 г.

28. Лящук, А. М., Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Биотехнология. — 2006, №5. С.23-32.

29. Лящук, А. М. Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. иммунобиол. 2006, № 4. - С.65-68.

30. Rabinovich, M. L. Materials of Soviet-Finland Seminar on Bioconversion of Plant Raw Materials by Microorganisms / M. L. Rabinovich // Pushchino: Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms. 1984. P. 31-48.

31. Рабинович, M. JI. Кинетические аспекты действия карбогидраз (лизоцим и целлюлолитические ферменты): дис. . канд. хим. наук. -М., 1977. С. 16.

32. Levy, I. Cellulose-binding domains: biotechnological applications / I. Levy, O. Shoseyov // Biotechnol. Adv. 2002. - Vol. 20. P. 191-213.

33. Гурвич, A. E. / Биохимия. 1957. - T.22, вып. 6. - C.l028-1034.

34. Гурвич, A. E., Кузовлева О. Б., Туманова А. Е. / А. Е. Гурвич, О. Б. Кузовлева, А. Е. Туманова // Биохимия. 1961. - Т.26, вып.5. - С.934-942.

35. Гурвич, А. Е., Кузовлева О. Б., Орлов Г. Е. / А. Е. Гурвич, О. Б. Кузовлева, Г. Е. Орлов / Лаб. дело. 1967, №12. - С. 732-734.

36. Лунин, В. Г., Карягина-Жулина А. С., Лящук А. М. и др. / Патент РФ № 2270249 от 20 февраля 2006 г.

37. Лунин, В. Г., Карягина-Жулина А. С., Тихонова Т. В. и др. // Патент РФ №2278160 от 20 июня 2006 г.

38. Ляшук, А. М., Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Биотехнология. 2006, №5. — С.23-32.

39. Ляшук, А. М. Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. иммунобиол. 2006, № 4. — С.65-68.

40. Ogston, A. "On Abscesses". Classics in Infectious Diseases. / A. Ogston // Rev. Infect. Dis. 1984. - Vol. 6. P. 122-28.

41. Holderbaum, D. A. L. Collagen Binding to Staphylococcus aureus / D. A. L. Holderbaum, G. S. Hall // Microbiology. 1986. - Vol. 54. P. 359-364.

42. Cruz M., et al. // The Journal of biological chemistry. 1995. Vol. 270. P. 10822-10827.

43. Hohenester, E. Structural basis of sequence-specific collagen recognition by SPARC / E. Hohenester, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. - Vol. 105. P. 18273-18277.

44. Suwannarangsee, S. Search for a dextransucrase minimal motif involved in dextran binding / S. Suwannarangsee, et al. // FEBS Letters. 2007. - Vol. 581. P. 4675-4680.

45. Monchois, V. Glucansucrases: mechanism of action and structure-function relationships / V. Monchois, R-M. Willemot, P. Monsan // FEMS Microbiology Reviews.-1999.-Vol. 23. P. 131-151.

46. Monsan P. Homopolysaccharides from lactic acid bacteria. / P. Monsan, et al. // Int. Dairy J. 2001. - V. 11. P. 675-685.

47. Kobayashi, M. Dextransu-crase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F: characterization of the enzyme bound to Sephadex gel / M. Kobayashi, K. Mihara, K. Matsuda // Agric. Biol. Chem. 1986. - Vol. 50. P. 551-557.

48. Paul, F. Production and purification of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides, NRRL В 512 (F) / F. Paul, et al. // Ann. NY Acad. Sci. 1984. -Vol. 434. P. 267-270.

49. Giffard, P.M. Definition of a fundamental repeating unit in streptococcal glucosyltransferase glucanbinding regions and related sequences / P.M. Giffard, N.A. Jacques // J. Dent. Res. 1994. Vol. 73. P. 1133-1141.

50. Miller, A.W. Milligram to gram scale purification and characterization of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F / A.W. Miller, S.H. Eklund, J.F.Robyt // Carbohyd. Res. 1986. - Vol. 147. P. 119-133.

51. McCabe, M.M. Specific method for the purification of Streptococcus mutans dextransucrase / M.M. McCabe, E.E. Smith // Infect. Immun. 1977. - Vol.16. P. 760-765.

52. Anderson, G. W. Recombinant V antigen protects against pneumonic and bubonic plague caused by F1-capsule-positive and -negative strains of Yersinia pestis / G. W. Anderson, et al. // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. P. 4580-4585.

53. Broekhuijsen, M. P. Fusion proteins with multiple copies of the major antigenic determinant of foot-and-mouth disease virus protect both the natural hostand laboratory animals / M. P. Broekhuijsen, et al. // J. Gen.Virol. 1987. - Vol. 68. P. 3137-3143.

54. Clayton, M. A. Protective vaccination with a recombinant fragment of Clostridium botulinum neuro-toxin serotype A expressed from a synthetic gene in Escherichia coli. / M. A. Clayton, et al. // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. P. 2738-2742.

55. Лящук, A. M. Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4, потенциального компонента генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины: дис. . канд. биол. наук. М., 2005. — 104 с.

56. Savage, С. R. Jr. Epidermal Growth Factor and a New Derivative. Rapid isolation procedures and biological and chemical charactrerization / C. R. Savage, S. Jr. Cohen // The journal of biological chemistry. 1972. - Vol. 247. P. 76097611.

57. Savage, C. R. Jr. The Primary Structure of Epidermal Growth Factor / C. R. Jr. Savage, T. Inagami, S. Cohen // The journal of biological chemistry. — 1972. — Vol. 23. P. 7612-7621.

58. Goodlad, R. A. Gastrointestinal epithelial cell proliferation / R. A. Goodlad // Dig Dis.-1989.-Vol. 7. P. 169-177.

59. Allen, G. Production of epidermal growth factor in Escherichia coli from a synthetic gene / G Allen, C. A. Paynter, M. D. Winther // J. Cell. Sci. Suppl. -1985. Vol. 3. P.29-38.

60. Tsang, M. W. The use of recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) in a gentleman with drug-induced Steven Johnson syndrome / M. W. Tsang, K. Y. Tsang , W. K. Wong // Dermatol. Online J. 2004. Vol. 10. P. 25.

61. Florkiewicz, R. Z. Human basic fibroblast growth factor gene encodes four polypeptides: three initiate translation from non-AUG codons / R. Z.

62. Florkiewicz, A. Sommer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86. P. 39783981.

63. Karpusas, M. The structure of human interferon-beta: implications for activity / M. Karpusas, et al. // Cell. Mol. Life Sci. 1998. - Vol. 54. P. 1203-1216.

64. Kaynor, C. Direct evidence that IFN-beta functions as a tumor-suppressor protein / C. Kaynor, et al. // J. Interferon Cytokine Res. 2002. - Vol. 22. P. 1089-1098.

65. Murata, M. A comparison of the antitumor effects of interferon-alpha and beta on human hepatocellular carcinoma cell lines / M. Murata et al. // Cytokine. -2006. — Vol. 33. P.121-128.

66. Wilderman, M. J. Intrapulmonary IFN-beta gene therapy using an adenoviral vector is highly effective in a murine orthotopic model of bronchogenic adenocarcinoma of the lung / M. J. Wilderman, et al. // Cancer Res. — 2005. -Vol. 65. P. 8379-8387.

67. Ройт, А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл // М.: Мир. 2000.

68. Попов В.Ф. Лекарственные формы интерферонов / В.Ф. Попов, О. В. Попов // М.: Триада-Х. 2002. - С. 230.

69. Urist, М. R. Bone: formation by autoinduction / M. R. Urist // Science. 1965. Vol. 150. P. 893-899.

70. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: from basic science to clinical applications / A. H. Reddi // J. Bone Joint. Surg. Am. 2001. Vol. 83-A. P. 1-6.

71. Wozney, J. M. Overview of bone morphogenetic proteins / J. M. Wozney // Spine 2002. - Vol. 27. P. 2-8.

72. Koh, J. T. Combinatorial gene therapy with BMP2/7 enhances cranial bone regeneration / J. T. Koh, et al. // J. Dent. Res. 2008. Vol. 87. P. 845-849.

73. Paralkar, V. M. Cloning and characterization of a novel member of the transforming growth factor-beta/bone morphogenetic protein family / V. M. Paralkar, et al. //J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. P. 13760-13767.

74. Reddi, A.H. Morphogenesis and tissue engineering of bone and cartilage: inductive signals, stem cells, and biomimetic biomaterials / A. H. Reddi // Tissue Eng. 2000. - Vol. 6. P. 351-359.

75. Reddi, A.H. Interplay between bone morphogenetic proteins and cognate binding proteins in bone and cartilage development: noggin, chordin and DAN / A. H. Reddi // Arthritis Res. 2001. - Vol. 3. P. 1-5.

76. Granjeiro, J. M. Bone morphogenetic proteins: from structure to clinical use / J. M. Granjeiro // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2005. P. 1463 - 1473.

77. Weber. A silent H-bond can be mutationally activated for high-affinity interaction of BMP-2 and activin type IIB receptor / Weber, et al. / BMC Structural Biology. 2007. - Vol. 7. P. 6.

78. Wang, E.A. Bone morphogenetic proteins (BMPs): therapeutic potential in healing bony defects / E. A. Wang // Trends Biotechnol. 1993. - Vol. 11. P. 379383.

79. Reddi, A.H. Role of morphogenetic proteins in skeletal tissue engineering and regeneration / A. H. Reddi // Nat. Biotechnol. 1998. - Vol.16. P. 247-252.

80. Reddi, A.H. Initiation of fracture repair by bone morphogenetic proteins/ A. H. Reddi // Clin. Orthop. Relat. Res. 1998. - Vol. 355. P. 66-72.

81. Rountree, R.B. BMP receptor signaling is required for postnatal maintenance of articular cartilage / R. B. Rountree, et al. // PLoS Biol. 2004. - Vol. 11. P. 355.

82. Jeppsson, C. A combination of bisphosphonate and BMP additives in impacted bone allografts / C. Jeppsson, et al. // Acta Orthop. Scand. 2003. - Vol. 74. P. 483-489.

83. Tsumaki, N. Bone morphogenetic protein signals are required for cartilage formation and differently regulate joint development during skeletogenesis / N. Tsumak, et al. // J. Bone Miner. Res. -2002. Vol. 17. P. 898-906.

84. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

85. Han, B. Quantitative and sensitive in vitro assay for osteoinductive activity of demineralized bone matrix / B. Han, B. Tang, M. E. Nimni // Journal of Orthopaedic Research. -2003. Vol. 21. P. 648-654.

86. Katagiri, T. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage / T. Katagiri // J. Cell Biol. 1994. Vol. 127. P. 1755-1766.

87. Kim, I. S. Synergistic action of static stretching and BMP-2 stimulation in the osteoblast differentiation of C2C12 myoblasts / I. S. Kim, et al. // J. Biomech. — 2009. Vol. 8. P. 6.

88. Long, S., et al. Protein expression and purification. 2006 - V. 46, P. 374378.

89. Fiers, W. Cloning and expression of human interferon-beta: from be to ac / W. Fiers, et al. // Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. 2009. V. 71. P. 43-50.

90. Demain, A.L. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms / A. L. Demain, P. Vaishnav // Research Institute for Scientists Emeriti, Drew University, Madison, NJ 07940, USA.

91. Williams, J.A. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production / J.A. Williams, A. E. Carnes, C. P. Hodgson // Nature Technology Corporation, Lincoln, NE 68521, USA.

92. Pltickthun, A. Antibody engineering: advances from the use of Escherichia coli expression systems / A. Pltickthun // Biotechnology. 1991. - Vol. 9. P. 545551.

93. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli / F. Baneyx // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. - Vol. 10. P. 411-21.

94. Cabrita, L.D., Bottomley S.P. Protein expression and refolding-a practical guide to getting the most out of inclusion bodies / L.D. Cabrita, S.P. Bottomley // Biotechnol. Annu. Rev. 2004. - Vol. 10. P. 31-50.

95. Long, J.Y. Refolding of recombinant proteins in vitro / J.Y. Long, H.X. Wang // Sheng Li Ke Xue Jin Zhan. 1998. - Vol. 29. P. 103-108.

96. Middelberg, A.P. Preparative protein refolding / A. P. Middelberg // Trends Biotechnol. 2002. - Vol. 20. P. 437-443.

97. Грачева M.A. Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных а- и в-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином: дис. . канд. биол. наук. М., 2008 г. 152 с.

98. Ishikawa, Т. Production of a Biologically Active Epidermal Growth Factor Fusion Protein with High Collagen Affinity / T. Ishikawa, H. Terai, T. Kitajima // J. Biochem. -2001. Vol. 129. P. 627-633.

99. Andrades J. A. A recombinant human TGF-bl fusion protein with collagen-binding domain promotes migration, growth, and differentiation of bone marrow mesenchymal cells / J. A. Andrades, et al. // Experimental Cell Research. 1999. -Vol. 250. P. 485-498.

100. Andrades, J. A. Production of a recombinant human basic fibroblast growth factor with a collagen binding domain / J. A. Andrades, et al. // Protoplasma. — 2001.-Vol. 218. P. 95-103.

101. Karsten, H., Joanne, С. // The QIAexpressionist. Qiagen GmbH, Qiagen Inc. -1992.

102. Zhou, H. Enhanced bioactivity of bone morphogenetic protein-2 with low dose of 2-N, 6-O-sulfated chitosan in vitro and in vivo / H. Zhou, et al. // Biomaterials. 2009. - Vol. 30. P. 1715-1724.

Информация о работе

Семихин, Александр Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Получение компонентов иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Получение компонентов иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы