Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Промышленная технология изготовления наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза животных (РСК, ИФА) и ИНАН лошадей (РДП, ИФА)

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Промышленная технология изготовления наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза животных (РСК, ИФА) и ИНАН лошадей (РДП, ИФА)"

На правах рукописи

ЛЮЛЬКОВА Лариса Сергеевна

ПРОМЫШЛЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ НАБОРОВ (ТЕСТ-СИСТЕМ) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА ЖИВОТНЫХ (РСК, ИФА) И ИНАН ЛОШАДЕЙ (РДП, ИФА)

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 2 ДЕК 2013

005543515

Щелково-2013 г

005543515

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный консультант: академик РАН. академик НААН Украины, доктор ветеринарных наук, профессор, лауреат Государственной премии РФ,

Заслуженный деятель науки РФ Анатолий Яковлевич Самуйленко

Официальные оппоненты:

Мельник Николай Васильевич-доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный ветеринарный врач РФ, президент ассоциации «Ветбиопром», г.Москва

Мишенко Владимир Александрович - доктор ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории эпизоотологии и мониторинга ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» г. Владимир

Цыбанов Содном Жамьянович - доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией биофизики ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» г. Покров

Ведушая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» Россельхозакадемии

О» п и ¡ffff3

Защита состоится*^/ ^ ■ ^в _на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 по

защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский района, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП; e-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности.

Автореферат разослан »hCO 13г. и размещен на сайте ВНИТИБП

Россельхозакадемии www.vnitihp.ru и на официальном сайте ВАК http://www.vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность проблемы. Для успешного лечения и своевременной профилактики инфекционных заболеваний животных необходим ранний и точный диагноз, что возможно при использовании диагностических тест-систем с высокой специфичностью и чувствительностью. Одной из актуальных задач, стоящих перед биотехнологией РФ, является совершенствование традиционных (РСК, РДП, РНГА, РГА) и разработка новых (ПЦР, ЛЦР, ДНК-гибридизация, ИФА и другие) диагностических тест-систем (Обухов И.Л., 1998; Самуйленко с соавт., 2003; Цыбанов С.Ж. с соавт., 2007; Мищенко с соавт., 2008; Гулюкин М.И., 2000-2012; Мельник Н.В., 2012).

Достоверность результатов серологической диагностики зависит от эффективности и качества тест-систем, то есть активности и специфичности компонентов реакции - специфических антигена и сыворотки, от параметров и условий проведения анализа, которые определяются экспериментально для каждой пары антиген-антитело. Поэтому необходимо использовать современные методы фракционирования, очистки и концентрирования вирусных и бактериальных антигенов; способы получения высокоактивных специфических сывороток.

Методы ИФА применяют для диагностики, мониторинга заболевания, своевременного и обоснованного прогнозирования возникновения эпизоотии среди животных. Решением МЭБ иммуноферментный анализ признан референс-тестом, результаты которого определяются в основном природой и свойствами применяемой пары антиген-антитело. Поэтому при работе с каждым новым объектом возникает необходимость изучения параметров проведения иммуноферментного анализа, оптимальных для данного микроорганизма (антигена). Высокая разрешающая способность методов ИФА обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих результаты анализа.

В связи с вступлением России в ВТО перед производителями иммунобиологических препаратов стоит задача повышения их эффективности и качества. Одним из решений этой проблемы является внедрение элементов менеджмента качества (ГОСТ Р ИСО 9001-2008) и Правил вМР (ГОСТ Р 52249-2009) в технологию производства, а именно: гармонизация технологического процесса производства и контроля с международными требованиями; обеспечение стабильности имунобиологических препаратов и технологического процесса их изготовления; проектный подход в обеспечении качества и безопасности иммунобиологических препаратов.

Все изложенное выше явились основополагающими в определении выбора темы диссертационной работы.

1.2 Обоснование выбора объектов исследования.

По данным ИАЦ Управления Ветнадзора (ФГУ ВНИИЗЖ) хламидиоз сельскохозяйственных животных и ИНАН лошадей входят в перечень 20 нозологических единиц, вносящих основной вклад (80% и более) в заболеваемость разных видов животных.

1.2.1 Хламидиозы сельскохозяйственных животных, методы диагностики.

Значительный вклад в изучение хламидиозов внесли отечественные ученые: Х.З. Гаффаров, В.Н. Сюрин, И.И. Терских, Ю.Д. Караваев, Н.И. Налетов, Р.Х. Хамадеев, А.З. Равилов, И.Л. Обухов и другие.

Хламидиозы - инфекционные заболевания, вызываемые облигатными внутриклеточными микроорганизмами семейства Chlamydiaceae (Everett K.D.E., 1999; Эйдельштейн И.А., 1999; Ямникова С.С. с соавт., 2000; Самуйленко А .Я. с соавт., 2003). Хламидиозы относятся к зооантропонозам, проявляют природную очаговость, характеризуются широким повсеместным распространением в животном мире, тяжестью патологии у людей, высокой стоимостью затрат на проведение противоэпидемических мероприятий (Токаревич К.Н., 1979; Черкасский Б.Л. и др., 1988; Обухов И.Л., 1997; Нехороших З.Н. и др., 2005; Storz J., 1971; Achaetal, 1991; Petersen Е.Е., 1994; WHO, 1999; Storz J., В.И., 2001). Экономический ущерб в животноводстве от хламидиоза складывается от снижения продуктивности животных, недополучения приплода, падежа и вынужденного убоя молодняка, массовых или спорадических абортов у коров, овец и свиней (Щербань Г.П., 1978; 1984; Бортничук В.А., 1979, 1991; Хамадеев Р.Х., 1987, 1991). В связи с этим в настоящее время всестороннее изучение хламидиозов признано ВОЗ одним из главных направлений.

В системе мер борьбы с хламидиозом наиболее актуальной признана ранняя и точная диагностика, с учетом результатов которой возможна организация ветеринарно-санитарных мероприятий по профилактике и искоренению хламидийной инфекции. Наличие общего для всех штаммов хламидий группоспецифического антигена делает возможным использовать для диагностики заболевания серологические методы (Ильинский Ю.А.,1974; Гусев Б.Н., 1991; Маликова М.В., 1995; Обухов И.Л., 1998; Белоусов В.И., 1999; Anderson I.E., 1986; Delong W.J., 1986; Acha P., 1991; Fukushi H„ 1995; Martin P.K., 1995).

Стандартным серологическим тестом для диагностики хламидиоза, рекомендуемым МЭБ, является реакция связывания комплемента (РСК). Обнаружение комплементсвязывающих антител у большинства индивидуумов в группе с клиническими признаками является предварительным доказательством наличия активной инфекции, а выявление четырехкратного увеличения титра через 14 дней - диагностическим признаком текущей инфекции.

Иммуноферментный анализ применяется параллельно с РСК для диагностики хламидиоза и прогнозирования возникновения эпизоотии среди животных.

Несмотря на успехи в изучении хламидиозов, качество ретроспективной диагностики и прогнозирование эпизоотии не всегда удовлетворяют требованиям ветеринарной медицины. Поэтому разработка и совершенствование промышленных технологий производства наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных являются своевременными и актуальными. 1.2.2 Инфекционная анемия (ИНАН) лошадей. Согласно принятой классификации возбудителем заболевания является вирус подсемейства Lentivirus семейства Retroviridae (Nakajima Н., 1994).

Большой вклад в изучение ИНАН лошадей внесли отечественные ученые: К.П. Юров (1972 - 2013), Ю.Д. Караваев (1987), Б.И. Токарик (1976 - 1989), Л.И. Пронина (1981; 1984), В.К Сологуб. (1975), В.Н. Сюрин (1991).

РДП - «золотой» стандарт - является наиболее точным и надежным методом специфической диагностики ИНАН, так как позволяет обнаруживать специфические антитела в крови лошадей, инфицированных вирусом различающихся штаммов, клонов и изолятов в начале и на протяжении всей болезни (Clabough D.L., 1990).

В России РДП официально принята для диагностики ИНАН и выпускается по технологии, разработанной во ВНИТИБП, тест-система РДП, в состав которой входит

специфический преципитирующий антиген из ткани селезенки лошади, экспериментально инфицированной вирусом.

Препарат антигена из ткани селезенки лошади - высокоспецифичен, однако для его производства требуется большое количество лошадей, что приводит к значительным материальным затратам, к снижению стандартности препарата из-за большого разнообразия разнообразия сырья и не исключает вероятности заболевания людей, контактирующих с инфицированными животными (Henson J.B., 1971; Сюрин В.Н., 1998).

Иммуноферментный анализ применяется параллельно с РДП для диагностики инфекционной анемии, а также для массового скрининга лошадей, находящихся в карантине (Proc. Am. Meet. United States Anim. Health Assn. 1991; Kenna J.G., 1985; Patricon M.C., 1981; Archambault D„ 1989; Sobiech E., 1991; Sugiura Т., 1995).

Таким образом, разработка на основе антигена культурального вируса диагностических тест-систем РДП и ИФА для определения антител с целью диагностики ИНАН и индикации антигена в процессе культивирования представляется своевременной и обоснованной.

1.3 Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований - разработка и совершенствование промышленной технологии изготовления наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза животных (РСК, ИФА) и для диагностики ИНАН лошадей (РДП, ИФА).

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Научно обосновать выбор и способ культивирования производственных штаммов микроорганизмов для изготовления компонентов наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных (РСК, ИФА) и ИНАН лошадей (РДП, ИФА).

2. Разработать промышленную технологию изготовления наборов (тест-систем) РСК я ИФА для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных:

- разработать технологические процессы получения и контроля посевных материалов хламидий штамма «Улетово-96-ВНИиТИБП», получения, очистки и концентрирования антигена, получения специфичных гипериммунных сывороток, стабилизации свойств компонентов набора методом сублимационного высушивания;

- сконструировать набор (тест-систему) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза животных;

- изготовить опытные образцы наборов (тест-систем) и провести их исследования на соответствие показателям качества (специфичность, чувствительность, воспроизводимость и др.);

- разработать нормативную документацию на наборы (тест-системы) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза животных и освоить их промышленный выпуск;

- оценить качество наборов и эффективность их применения.

3. Усовершенствовать и разработать на основе антигена культурального вируса ИНАН технологию производства тест-системы РДП для диагностики инфекционной анемии и тест-систем ИФА для определения специфических антител и индикации вирусного антигена:

- разработать технологический процесс получения и контроля посевных материалов культурального вируса ИНАН штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ»; совершенствовать тест-систему РДП;

- разработать комплексную тест-систему ИФА для диагностики ИНАН лошадей и индикации антигена вируса ИНАН;

- изготовить опытные образцы тест-систем и провести их исследования на соответствие показателям качества (специфичность, чувствительность, воспроизводимость и др.);

- разработать ИД на тест-системы РДП и ИФА для диагностики ИНАН лошадей. 1.4 Научная новизна результатов исследования.

Научно обоснован выбор и способ культивирования производственного штамма хламидий для изготовления наборов (тест-систем) РСК, ИФА для диагностики хламидиоза животных:

- методом ПЦР проведена молекулярно-генетическая идентификация штамма хламидий с использованием специфичных к Chlamydia psittaci олигонуклеотидных праймеров;

- определена нуклеотидная последовательность амплифицируемых фрагментов ompl-и отр2-генов у хламидий исследуемого штамма;

показана возможность дифференциации хламидий внутри вида путем электрофоретического разделения продуктов рестрикции амплификатов в агарозном геле;

-исследован морфогенез в желточных мешках КЭ, первично трипсинизированной КК ФЭК и КК МсСоу;

- исследована антигенная активность штамма хламидий;

Штамм хламидий по своим иммунобиологическим свойствам идентифицирован как представитель рода Chlamydophila. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ как производственный «Улетово-96-ВНИиТИБП» Ch. psittaci.

Научно обоснована и разработана технологии промышленного производства наборов (тест-систем) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза животных и тест-систем РДП и ИФА для диагностики ИНАН лошадей.

Разработан способ получения гипериммунной хламидийной сыворотки с использованием иммуностимулятора «Иммунофан».

Разработана тест-система ИФА для индикации хламидийного антигена. Научно обоснован выбор и способ культивирования производственного штамма культурального вируса ИНАН для изготовления компонентов тест-систем РДП и ИФА для диагностики ИНАН лошадей. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ как Lentivirus семейства Retroviridae «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ».

Впервые разработана технология изготовления тест-систем для определения антител к вирусу ИНАН в сыворотке крови лошадей и индикации антигена вируса ИНАН методами иммуноферменттюго анализа (Патент РФ №21461150, приоритет от 10.03.00 г. с соавтор.).

Разработана комплексная тест-система ИФА для индикации антител или антигена вируса инфекционной анемии лошадей. Усовершенствованы и разработаны:

- технологические схемы получения и контроля посевных материалов хламидий штамма «Улетово-96-ВНИиТИБП» и культурального вируса ИНАН штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ»;

- технологический процесс изготовления препарата хламидийного антигена из желточных мешков КЭ;

- тест-системы ИФА для диагностики хламидиоза овец и КРС;

- «малодозная» тест-система РДП для диагностики ИНАН лошадей.

1.5 Теоретическая и практическая ценность работы. Теоретическая значимость проведенных исследований заключается в определении методологии разработки промышленной технологии изготовления наборов (тест-систем) РСК, РДП и ИФА; изготовлении и испытании опытных серий наборов (тест-систем); внедрении в производство наборов (тест-систем) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза, РДП и ИФА для диагностики ИНАН лошадей.

С учетом требований Правил СМР (ГОСТ Р 52249-2009) разработана и утверждена в установленном порядке Нормативная документация: технологические регламенты, стандарты организации, ТУ и инструкции по применению. Результаты исследований включены в методические положения и методические рекомендации.

Разработаны технологии производства наборов (тест-систем) для диагностики: хламидиоза животных в РСК и РДСК; хламидиоза овец и КРС и индикации хламидийного антигена методом ИФА; ИНАН лошадей в РДП; комплексной тест-системы ИФА для индикации антител и антигена вируса ИНАН.

По результатам исследований разработаны паспорта производственных штаммов хламидий «Улетово-96-ВНИиТИБП» и культурального вируса ИНАН «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ». Штаммы депонированы в коллекции ВГНКИ.

При непосредственном участии автора внедрены: на базе Опытного производства ГНУ ВНИТИБП промышленная технология изготовления наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза животных в РСК, РДСК и ИФА; на базе ФГУ «ЩБК» -технология изготовления на основе антигена культурального вируса тест-системы «Антиген - специфическая сыворотка для диагностики инфекционной анемии (ИНАН) лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаровом геле». Промышленное производство осуществляется в соответствии с нормативной документацией, утвержденной в надлежащем порядке (Технологический регламент, Технические условия, Инструкция по применению. Стандарт организации).

За период 2001-2013 г.г., для практического применения в соответствии с Государственными заказами МСХ РФ и прямыми договорами на Опытном производстве ГНУ ВНИТИБП изготовлено 27584 наборов для диагностики хламидиоза животных в РСК и РДСК. Рекламаций на качество наборов не поступало.

Разработки по материалам диссертационной работы награждены: 2 золотыми медалями ВВЦ (свидет. №77 от 18.02.09 г.; свидет. №681 от 12.10.09 г.) и Дипломами 1 степени (Российская агропромышленная выставка «Золотая осень», 2012 г., золотой медалью конкурса в рамках выставки-конференции «Биоиндустрия 2011» (17 -19 мая 2011 года), г. Санкт - Петербург. Автор работы удостоен общественной медали «За развитие биологической науки и промышленности», 2009 г.

1.6 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Обоснование выбора и способа культивирования производственных штаммов хламидий для изготовления наборов (тест-систем) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза животных и культурального вируса ИНАН для изготовления тест-систем РДП и ИФА для диагностики ИНАН лошадей.

2. Промышленная технология изготовления наборов (тест-систем) РСК и ИФА для диагностики хламидиоза животных.

3.Промышленная технология изготовления тест-систем для диагностики ИНАН лошадей.

1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В работе приведены результаты исследований по специальности 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнология). Результаты научных исследований соответствуют пунктам 1, 3, 8, 11 паспорта специальности.

1.8 Апробация результатов исследования. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены: в виде ежегодных отчетов по темам заданий НИР на заседаниях Ученого совета и Методической комиссии ГНУ ВНИТИБП (1980 - 2012 г.г.); на 18 Всероссийских научно-практических конференциях (Щелково 1995-2013

г.г.); на заседаниях секции «Ветеринарная биотехнология» отделения «Ветеринарная медицина» РАСХН (2011-2013 г.г.); 10 Международных научно-практических конференциях, проводившихся в Щелково, Москве, Курске, Троицке, Покрове, Тарту, Алуште, Петербурге, Владимире, Харькове (1991 -2013 г.г.).

1.9 Публикации результатов исследований. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 56 печатных работах, в том числе 12 статей в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикаций материалов докторских диссертаций; 3 патента РФ.

1.10 Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на.... страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего .... источника, в том числе .... иностранных и ссылок на сайты Internet). Диссертация иллюстрирована... таблицами и ...рисунками.

1.11 Место выполнения работы. Работа выполнена в 1986-2013 г.г. в лаборатории разработки промышленной технологии изготовления диагностических препаратов (зав. лаб., к.б.н. Токарик Б.И), отделе обеспечения качества лекарственных средств для ветеринарии (зав. отд., д.б.н. Еремец В.И.) и на Опытном производстве ГНУ ВНИТИБП РАСХН. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с сотрудниками Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (зав. лаб., д.б.н. Ямникова С.С.), ВИЭВ (д.в.н. К.П. Юров), ФГУ «ЩБК» (д.б.н. Скичко Н.Д., Павленко B.C.,

д.в.н. Зенов Н.И.), д.б.н. В.И.Еремец - организация опытного производства.

1.12 Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач исследований, теоретическом и методологическом обосновании поставленных задач, непосредственном планировании экспериментов и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов, разработке нормативной документации. Автор принимала личное участие в апробации, внедрении разработанных технологий и промышленном производстве диагностических наборов, в подготовке научных публикаций и разработке нормативных и методических документов.

1.13 Благодарности, Автор выражает благодарность научному консультанту, директору ВНИТИБП, академику РАСХН, академику НААН Украины А .Я. Самуйленко. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали консультативную и практическую помощь сотрудники института к.б.н Б.И. Токарик, д.б.н. В.И. Белоусов, д.б.н. Э.Ф. Токарик, д.б.н. В.И. Еремец, д.б.н. A.A. Нежута, к.б.н. Т.А. Авдеева, к.б.н. Б.Е. Блехерман, к.в.н. Е.Э. Школьников, к.б.н. Н.И. Емельянов, к.б.н. Г.Ф. Виногорова, И.П. Фисенко, Г.В. Пестова, Н.Г. Лысенко, Т.Г. Татарская, к.б.н. Н.К. Еремец, д.б.н. Л.А. Неминущая, д.б.н. Т.А. Скотникова, М.А. Малышева, а также сотрудники Института вирусологии им. Д. И. Ивановского д.б.н. С.С. Ямникова, к.б.н. И.Т. Федякина, ВИЭВ - д.в.н. К.П. Юров, ФГУ «ЩБК» - д.б.н.

Н.Д. Скичко, д.в.н. Н.И. Зенов, B.C. Павленко, за что приносим им сердечную благодарность.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Научные исследования проводились в ГНУ ВНИТИБП (1986-2013 г.г.) в соответствии с планами НИР и ОКР, отраслевых научных программ, в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ на 1996-2000 г.г. «Разработать и освоить производство высокоэффективных средств и методов диагностики и профилактики инфекционных болезней животных на основе современных промышленных биотехнологий и отраслевой системы качества».

Методология работы основывалась на использовании проектного подхода (согласно требованиям ГОСТ Р ИСО 9001-2008 «Системы менеджмента качества. Требования») и включала анализ научной литературы, поисковые исследования, разработку технологии производства и внедрение в производство нового препарата; изготовление и испытание серий наборов (тест-систем); реализация наборов согласно Государственным контрактам и прямым договорам.

Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы представлена на рис 1.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследований. Производственные штаммы хламидий «Улетово-96-ВНИиТИБП» и культурального вируса ИНАН «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ».

Штаммы микроорганизмов. Хламидии штаммов «Улетово-96-ВНИиТИБП», «Лори», «250» из коллекции микроорганизмов института вирусологии им Д.И. Ивановского; культуральный вирус ИНАН штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ» из коллекции микроорганизмов ВНИТИБП.

Культура клеток и куриные эмбрионы (КЭ). Для получения биомассы, индикации хламидий использовали развивающиеся КЭ 6-7- суточного возраста из хозяйств, благополучных по болезням птиц и культуру клеток ФЭК, McCoy; для поддержания штамма и получения посевных серий M.S., W.S - SPF-эмбрионы кур (ФГУ «ЩБК»). Культивирование вируса ИНАН проводили на культуре клеток эмбриона лошади (КК ЭЛ): мышцы, кожа, почки, легкие.

Трипсинизацию тканей эмбрионов кур, лошади, приготовление культур клеток, культивирование, криоконсервирование проводили по общепринятым методам (Дьяконов Л.П., 1986; Токарик Б.И. и др., 1989). Культуры клеток выращивали при (37+1) °С в стационарных условиях.

Питательные среды и растворы для культивирования. Диспергирующие растворы трипсина (0,25%) и версена (0,02%) (Дифко, США); среды ИГЛА, 199, ГЛАХ и ГЛАЭ, 0,25% раствор ФГМ, изготовленные во ВНИТИБП, ФГУ «ЩБК», МНИИВП и др.; сыворотка крови крупного рогатого скота (КРС) Московского, Киевского, Энгельского мясокомбинатов, ФГУ «ЩБК»; диметилсульфоксид (ДМСО) различных марок; гепарин стандартный Московского эндокринного завода; антибиотики пенициллин и стрептомицин и гентамшшн в концентрации 100 ЕД/см3 и 100 мкг/см3.

Экспериментальные животные. Клинически здоровые, проверенные на отсутствие инфекционных, кровепаразитарных и инвазионных заболеваний и прошедшие карантин бараны 9 -12 месяцев, ярки 12-18 месяцев, лошади 2-5 лет,

жеребята 8-18 месяцев; а также беспородные кролики-самцы массой 2,5 - 3,0 кг; морские свинки массой 250 -300 г.; белые мыши массой 10 -12 г.

Этап разработки Исследования Форма завершения

Рис. 1 Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы

Сыворотки. В исследованиях применяли экспериментальные и коммерческие иммунные сыворотки, сыворотки крови крупного рогатого скота, овец и лошадей из хозяйств РФ, неблагополучных по хламидиозу сельскохозяйственных животных и ИНАН лошадей.

Методы. При проведении исследований руководствовались соответствующими стандартами МЭБ.

Для индикации хламидий использовали развивающиеся 6-7-суточные КЭ, мазки-отпечатки, окрашенные по Романовскому-Гимза и Стемпу, реакцию иммунофлюоресценции (ИФ). Индикацию исследуемого штамма хламидий в мазках-отпечатках при окрашивании по Романовскому-Гимза и Стемпу и в непрямом иммунофлуоресцентном анализе проводили согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных», утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 июня 1999 г.

Инфекционную активность хламидий определяли титрованием на 6-7-суточных КЭ. Патогенность хламидий определяли на морских свинках и белых мышах. Активность (титр), специфичность хламидийных антител определяли в РСК и непрямом ИФА. Молекулярно-генетические исследования для определения таксономической принадлежности хламидий исследуемого штамма проводили методом полимеразной цепной реакцией (ПЦР). ДНК хламидий экстрагировали из

лиофильно высушенной культуры штамма хламидий гуанидинизотиоцианатным методом («Рибосорб» ЦНИИЭМ, Россия). ПЦР осуществляли с использованием специфичных к Chlamydia psittaci олигонуклеотидных праймеров.

Концентрирование хламидий осуществляли скоростным центрифугированием при lOOOOOg, вируса ИНАН -ультрафильтрацией. Очистку вируса ИНАН-ионообменной на ДЭАЭ-Toyopearl HW-60 (Тоуо, Япония) хроматографией, иммуноглобулинов -аффинной на активированной ВгСЫ-сефарозе-4В (Фармация, Швеция) хроматографией. Преформирование, промывку и перевод смол в нужную форму проводили общепринятыми методами (Д.П. Джонсон, 1988; Остерман JI.A., 1985). Контроль гомогенности препаратов проводили методами диск-электрофореза в ПААГ (Маурер М., 1971), специфичности - методом иммуноэлектрофореза. Морфологию хламидий, изучали методом ультратонких срезов и негативного контрастирования с использованием электронного микроскопа JEOL-lOO СХ (Япония) при увеличении 1x36000. Работа проведена в секторе электронной микроскопии ВНИТИБП (зав.сект., к.б.н. Блехерман Б.Е.). Индикацто культурального вируса ИНАН проводили в непрямом иммунофлуоресцентном анализе. Флуоресцентное свечение регистрировали с помощью микроскопа ЛЮМИНИ-1. Активность, специфичность антигена культурального вируса, его идентичность с антигеном из ткани селезенки инфицированной лошади определяли в РДП по характеру линий преципитаций, образующихся в геле агара («Методика постановки реакции диффузионной преципитации (РДП) для серологической диагностики инфекционной анемии лошадей», рекомендованной ГУВ). Содержание белка в препаратах определяли по методу Лоури (ОФС 42 - 0053 - 07, ГФ РФ, изд. XII, Ч. -2007 г.).

Контроль термостабильности компонентов наборов для диагностикti хлаиидиоза сельскохозяйственных животных определяли в реальном времени при температуре (6±2) °С и (20±1) °С, а также методом «ускоренного старения» при температуре (37±2) °С. Контроль готовых препаратов осуществляли в соответствии с разработанными стандартами организации (СТО и ТУ). Для стандартизации условий определения показателей качества использовали лабораторный рабочий эталонный материал (ЛРЭМ), изготовленный для каждого препарата.

Синтез антивидовых илшунопероксидазных конъюгатов анти-IgG-nX осуществляли перйодатным методом (Nakane Р.К. et Kawaoi А., 1974). Илшуиофермеитньш анализ проводили в непрямом (Engvall Е., Perlmann Р., 1971) и модифицированном конкурентном (Van Weemen D.K., 1985) вариантах. Результаты ИФА учитывали на спектрофотометре MICRO-ELISA Reader MR-580 при длине волны 490 nm.

Сублимационное высушивание препаратов проводили в камерах TG-50.5 (Германия), замораживание - в низкотемпературном прилавке НС-280/75.

2.13. Статистическая обработка результатов. Степень достоверности полученных результатов подтверждена статистической обработкой достаточного количества проведенных исследований с числом повторов > 3. Цифровые данные подвергали статистической обработке величин и их ошибок (Меркурьев Е.К., 1979; Лакин Г.Ф., 1980). Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по методу Стьюдента-Фишера при уровне значимости Р > 0,05.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Обоснование выбора производственных штаммов хламидий и культурального вируса ИНАН для изготовления наборов (тест-систем) РСК, ИФА для диагностики хламидиоза животных и РДП и ИФА для диагностики ИНАН. 3.1.1 Обоснование выбора производственного штамма хламидий. Начиная с 1996 г., в ВНИЬТИБП проводилсь исследования по изучению иммунобиологических свойств нового штамма хламидий. Изолят хламидий был выделен от павшего больного теленка д.б.н. Белоусовым В.И. в совхозе «Оленгуйский» Улетовского района Читинской области. При непосредственном участии автора совместно с коллективом научных сотрудников ВНИТИБП, ВНИВВС, ВГНКИ и НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского штамм был адаптирован к КЭ, к культурам клеток Hela, L929, McCoy, ФЭК, прошел 7 пассажей. Исследуемым материалом служил сухой препарат указанного штамма, хранившегося при температуре минус (70±2) °С. В качестве эталонного препарата использовали штамм «Лори», полученный из Института вирусологии.

Индикация хламидий с помощью световой микроскопии в мазках-отпечатках желточных мешков КЭ, окрашенных по Стемпу, показала наличие хламидий, ярко-красного цвета, имеющих округлую форму и расположенных внутри или вне клеток, зеленого цвета.

Окрашенные по Романовскому-Гимза мазки-отпечатки показали наличие элементарных зрелых частиц (ЭТ) округлой кокковидной формы, имеющих красно-фиолетовый цвет и располагающихся в цитоплазме клеток или в межклеточном пространстве в виде одиночных форм или скоплений и также ретикулярных телец (РТ), имеющих темно-синий цвет, морфология типична для Chlamidia Psittaci. Методом ИФ с использованием флуоресцирующих моноклональных антител хламидии выявлялись как ярко светящиеся желто-зеленые гранулы округлой или овальной формы (в зависимости от степени созревания), расположенных одиночно (от 10 до 18 хламидий в поле зрения) или скоплением на тускло-зеленоватом фоне клеток. Электронно-микроскопические исследования показали наличие внутриклеточных включений хламидий, которые характеризуются неоднородностью по форме включений и по упаковке. Размер Ретикулярных телец равен 400-800 пш, Элементарных телец - 200-300 пш.

Штамм патогенен и вызывает гибель 100% зараженных мышей при инокуляции в мозг и интраназально, 80-90% - при заражении внутрибрюшинно. Титр патогенной активности для белых мышей ЛД5(/0,3 см3 - 10"7'5. Результаты определения патогенности штамма на беременных морских свинках показали, что при внутрибрюшинном заражении первые клинические признаки заболевания наблюдались через 2-3 суток, аборты и гибель животных на 9-12 сутки. В мазках-отпечатках из органов павших мышей и морских свинок, окрашенных по модифицированному методу Стемпа, на зеленоватом фоне выявлялись однородные мелкие красные элементарные тельца хламидий.

Титр инфекционной активности возбудителя в исходной культуре, определенный при внутримозговом заражении белых мышеи, ЛД50/ОЗ см" при

заражении желточных мешков 7-дневных куриных эмбрионов ЭД5(/0,2 см" -9'°. При подкожном введении халмидии исследуемого штамма вызывают гибель 75 % белых мышей. Титр инфекционной активности штамма, определенный на первично трипсинизированной культуре клеток ФЭК и перевиваемых линиях клеток Hela, L929,

МсСоу, был равен ИД5(/0,2 см3-10"7'5- 10"9'°. Специфическое гранулярное свечение выявлялось в цитоплазме инфицированных 70% клеток через 24-48 ч культивирования.

Методом ПЦР определена таксономическая принадлежность хламидий исследуемого штамма к роду Chlamydia (Chlamydophila) виду Chlamydia psittaci

Антигенные свойства хламидий исследуемого штамма определяли в РСК, используя, специфические хламидийные сыворотки аборта овец и пневмонии телят и контрольные (отрицательные) сыворотки от клинически здоровых животных. Группоспепифический хламидийный антиген в разведении 1:64 - 1:256 выявлял специфические антитела в хламидийных сыворотках и не реагировал с контрольными (отрицательными) сыворотками. Установлено антигенное родство с эталонным штаммом «Лори» рода Chlamydia (Chlamydophila).

При участии автора на базе Института вирусологии проведены комиссионные испытания штамма хламидий. Подтверждено, что по своей морфологии, морфогенезу в желточных мешках КЭ и культуре клеток Heia, L929, МсСоу, ФЭК, по серологическим и физико-химическим свойствам хламидии штамма «Улетово-96-ВНИиТИБП» относятся к порядку Chlamydiales семейству Chlamydiaceae, роду Chlamydophila, виду Ch. psittaci и обладают характеристиками, соответствующими требованиям к производственным штаммам. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ как Ch. psittaci штамм Улетово-96-ВНИиТИБП» производственный для производства диагностических препаратов и вакцин после аттенуации.

Результаты изучения иммунобиологических свойств штамма хламидий явились основанием для его использования в качестве производственного при разработке технологии изготовления наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза животных в РСК, РДСК, ИФА.

3.1.2 Обоснование выбора производственного штамма культурального вируса ИНАН. Проводили исследования по изучению иммунобиологических свойств культурального вируса исследуемого штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ».

Установлено, что культуральный вирус ИНАН репродуцируется в культурах клеток почки, кожи и мышцы; вирусный антиген в среде культивирования инфицированных клеток определялся - на 14-21 дни культивирования; репродукция вируса происходила в цитоплазме клеток по типу латентной инфекции без изменения ультраструктуры клеток; методом непрямой иммунофлуоресценции вирус обнаруживался в цитоплазме 70% клеток на 9-12 день культивирования; вирус репродуцировался и накапливался в КЛЛ с ярко выраженным ЦПЭ; инфекционная активность вируса, полученная на жеребятах (биопроба) и культуре клеток кожи и почек 2-5 пассажа, определена в разведении 10'5°.

Комиссионные испытания свойств штамма культурального вируса ИНАН показали, что по морфологии вирусных частиц, морфогенезу в клетках культуры тканей эмбриона лошади, по своим серологическим и физико-химическим свойствам вирус относится к семейству Retroviridae и обладает биологическими свойствами, соответствующими требованиям, предъявляемым к производственным штаммам, используемым для производства диагностических препаратов. Штамм депонирован 27 августа 1999 г. в коллекции микроорганизмов ВГНКИ как Lentivirus семейства Retroviridae штамм «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ».

3.1.3 Определение иммунологической идентичности антигенов культурального вируса ИНАН и вируса из ткани селезенки жеребейка. Преципитирующий антиген, экстрагированный эфиром из культурального вируса ИНАН, исследовали в РДП для

определения иммунологической идентичности антигену, полученному в лабораторных условиях из ткани селезенки экспериментально инфицированного жеребенка и тканевому антигену из тест-системы «Антиген и антисыворотка для диагностики инфекционной анемии в реакции диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП)», производства ГЩБК. Результаты этих исследований иллюстрирует рис. 2.

Рис.2. Идентичность в РДП npeifunumupyiouiux антигенов из кулътурального вируса ИНАН и из ткани селезенки, экспериментально инфицированного вирусом жеребенка. 1 - контрольная положительная сыворотка; 2 — контрольный отрицательный антиген из ткани селезенки здорового жеребенка; 3. 5 - преципитирующий антиген кулътурального вируса ИНАН; 4, 6 — преципитирующий антиген из тест-системы «Антиген -антисыворотка для диагностики инфекционного анемии в реакции диффузионной преципитации (РДП)» серии №2. производства ГЩБК;7 — контрольный положительный антиген из ткани селезенки инфицированного вирусом ИНАН жеребенка.

Показано, что испытуемые антигены культурального вируса ИНАН, из ткани селезенки жеребенка и из диагностической тест-системы дали четко выраженную реакцию преципитации с контрольной положительной сывороткой. Линия преципитации отсутствовала у лунки, содержащей контрольный отрицательный антиген-экстракт из ткани селезенки здорового жеребенка. Линии преципитации, образованные контрольной положительной сывороткой с исследованными материалами, имели одинаковый характер, а в месте своего соединения формировали дуги и линии идентичности.

Таким образом, данные свидетельствуют об однородности и иммунологической идентичности антигенов и. следовательно, возможности производства тест-систем РДП и ИФА для диагностики ИНАН лошадей на основе антигена культурального вируса ИНАН.

3.2 Изготовление и контроль посевного материала.

3.2.1 Изготовление и контроль посевного материала хламидий. В соответствии с требованиями ГОСТ Р 52249-2009 и ГОСТ Р 9001-2008 в технологический процесс производства включена система изготовления и методов контроля посевного материала (Seed Lot System, S.L.S.). Система состоит из главного (Master Seed, M.S.), рабочего (Working Seed, W.S.) и производственного (Production Seed. P.S.) посевного материала. Последовательность получения посевного материала: Master Seed > Working Seed > Production Seed. Хламидии (M.S., W.S., P.S.) культивировали в

желточных мешках КЭ в соответствии с условиями, указанными в паспорте на данный штамм.

Посевной материал M.S., W.S., P.S., полученный при посеве хламидий в стандартизованной системе, фасованную в ампулы единовременно в процессе одной операции, таким образом, чтобы обеспечивалась однородность, стабильность и предупреждалась контаминация посторонними микроорганизмами, контролируют по показателям качества на соответствие паспортным данным.

Серии посевного материала (M.S.) контролировали по основным показателям качества на соответствие требованиям, указанным в паспорте на штамм и использовали для получения рабочей посевной серии (W.S.).

Рабочая посевная серия (W.S.) предназначена для получения производственной серии (P.S.) и может быть использована для изготовления серии конечного продукта небольшого объема.

Производственная серия (P.S.) используется для изготовления конечного продукта - серии хламидийного антигена. Для хранения в течение 3-х лет при температуре минус (70+1) °С серии главного посевного материала M.S. высушивали в виде 10 %-ной взвеси хламидий в атмосфере инертного газа азота в объеме 0.5 см3 в ампулах. Серии рабочего посевного материала W.S. хранили в виде желточных мешков КЭ (по 2 желточных мешка/флакон) при температуре минус (70+1) °С в течение 3-4 месяцев. Серии производственного посевного материала (P.S.) хранили при температуре (6+2) °С не более 2 недель.

3.2.2 Изготовление и контроль посевного материала культурального вируса ИНАН. В технологию изготовления тест-систем РДП и ИФА для определения специфических антител и индикации антигена вируса ИНАН была включена система изготовления и методов контроля посевного материала (Seed Lot System, S.L.S.). Главный посевной материал (M.S.) получали из коллекционного образца штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ» культурального вируса ИНАН. Серией главного посевного материала (M.S.) считали суспензию культурального вируса штамма 2-го пассажа, произведенную при посеве вируса в стандартизованной системе, фасованную во флаконы (ампулы) единовременно в процессе одной операции, таким образом, чтобы обеспечивалась однородность, стабильность и предупреждалась контаминация посторонними микроорганизмами. Для длительного хранения материал главной посевной серии (М. S.) высушивали в атмосфере инертного газа азота в объеме 1,0 см3 в ампуле. Препарат хранили при температуре минус (70+1) °С.

Изготовление серии рабочего посевного материала культурального вируса ИНАН (W. S.) осуществляли не реже, чем 1 раз в 3-4 месяца, путем пассирования материала, взятого из (M.S.). Серию контролировали по основным показателям качества на соответствие требованиям, указанным в паспорте на штамм. Для приготовления серии рабочего посевного материала W.S. использовали материал не контаминированный посторонней микрофлорой, в концентрированных и обработанных эфиром пробах которого обнаружен специфический преципитирующий антиген со средней (+++) и высокой (++++) активностью в РДП. Серией рабочего посевного материала (W.S.) культурального вируса ИНАН считали вируссодержащую культурапьную жидкость, полученную за все дни культивирования. Хранили вирус рабочего посевного материала при температуре (6+2) °С не более 2 недель или в замороженном состоянии при минус (45+5) °С. Вирус использовали для изготовления небольших серий антигена культурального вируса ИНАН, а также для инфицирования культур клеток при изготовлении производственного посевного материала (P.S.).

Производственный посевной материал (P.S.) хранили при температуре (6+2) °С не дольше 2 недель, при температуре минус (45+5) °С - до 3-х месяцев. После проведения контроля на соответствие по основным показателям качества требованиям ТУ производственный посевной материал (P.S.) использовали для изготовления преципитирующего антигена культурального вируса ИНАН. 3.3 Технологический процесс изготовления хламидийного антигена. 3.3.1 Изготовление хамидийного антигена из желточных мешков КЭ. Антиген получали из производственного посевного материала P.S., оцененного по накоплению хламидий в оболочках желточных мешков на 3 и 4 креста. Отрабатывали параметры и условия экстракции антигена эфиром: время и температуру контакта, режим удаления эфира; время, температуру обработки промежуточного продукта ацетоном и режим очистки антигена от ацетона.

г-Е

I Заражение »мбряанов

Подготовка посузы

.•азгстовк* jampVMflftaa

Сбор заывзкб^ааяскашвх желточных ы

ТП1.6 Зитаивакве с ивипвоя сроой

.ФзсййАВИг полоjurrtaa oi о аятигсн»

VwvnopetaHBe цяпаквакк;}

f OIOB wo М41ернйла

3«мерахи»ая is t - въкушвдаяи« аятсгека

•БР? Пйлучеин» ■ »рандм сим•

БР8 Пркх-тяави вомс-1юй еерп хзамкзм&

^«Ншвпсзоп»»

ВР; Kj»,ji¥Pf»Sяг "= ив$1шнр9- М№ ШбЕвМЕЧ

БРА

Пиняоьзапк {ю;. о

Пазготовк» г>т«а мх tutfmy-

002 отхода».

Рис.3. Технологическая блок-схема изготовления хламидийного антигена.

Проведены исследования по подбору среды высушивания (защитная среда) и разработке режима лиофильного высушивания. В результате проведенных исследований разработан технологический процесс изготовления хламидийного антигена, технологическая блок-схема получения которого представлена на рис.3. ТП включает: 1- Заражение КЭ посевным материалом W.S.; 2 - Инкубирование инфицированных КЭ при (38+1) °С; 3 - Получение производственной серии P.S. на 4-10 сут. инкубирования КЭ; 4 - Гомогенизирование желточных мешков и инактивация хламидий (100 °С, 2 часа водяная баня); 5 - Эфирная экстракция хламидийного антигена (6+2) °С,18 час; удаление эфира d=0,2 атм., 2 час.; 6 -Экстракция липидов ацетоном (57+1) °С; 2 час.; 7 - Удаление ацетоновой фракции: d=0,2 атм. 2 час.; 8 - Ресуспендирование антигена в K.Na-фосфатном буферном растворе, рН-7.19-7,21; 9-Контроль активности (титра), специфичности, антикомплементарности, полноты инактивации; 10-Смешивание с защитной средой; 11- Фасование антигена; 12- Замораживание-высушивание антигена; 13-

Для стабилизации основных свойств методом сублимационного высушивания препарат доводили до рабочего разведения (т.е. до разведения, дающего в РСК с контрольной положительной сывороткой 100%-ную задержку гемолиза эритроцитов) стерильным физ. раствором, pH 7,6, добавляли мертиолят, стабилизировали ЗС, фасовали по 1 см" и подвергали сублимационному высушиванию, по режиму, разработанному при участии д.б.н. A.A. Нежуты.

3.3.2 Получение хламидийпого антигена из среды культивирования клеток ФЭК, McCoy. Монослой культуры клеток инфицировали в разведении Ю'-Ю"2 хламидиями рабочей посевной серии (W.S). Культивирование хламидий осуществляли при (38±1) °С в стационарных условиях. Методом флуоресцирующих антител хламидии в мазках-отпечатках выявлялись как ярко светящиеся желто-зеленые гранулы округлой или овальной формы (в зависимости от степени созревания) через 24-48 ч. Специфическое свечение было выявлено в цитоплазме 75-80% исследованных клеток через 72 ч культивирования. Полученную в эти сроки среду культивирования инфицированных клеток использовали для изготовления препарата антигена.

Технологический процесс получения антигена из среды культивирования КК ФЭК включает следующие этапы: 1. Культивирование хламидий на КК ФЭК; 2. Замораживание-размораживание матрасов с инфекционным материалом через 72 ч культивирования; 3. Сбор хламидиосодержащей культуральной жидкости; 4. Центрифугирование среды культивирования при 2500g в течение 30 мин.; 5. Инактивирование хламидий при температуре (70+1) °С в течение 30 минут (водяная баня); 6. Контроль материала на полноту инактивации хламидий; 7. Концентрирование среды культивирования методом скоростного центрифугирования; 8. Получение группоспецифического антигена методом эфирно-ацетоновой экстракции по п.3.3.1.

Изготовление антигена из культуральной жидкости инфицированной хламидиями культуры клеток McCoy проводили, как описано выше для ККФЭК.

Для концентрирования среды культивирования инфицированной хламидиями КК ФЭК или McCoy применяли метод скоростного центрифугирования при 100000 g. Экспериментально определяли время центрифугирования, необходимое для полного осаждения хламидий. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты концентрирования среды культивирования инфицированной хламидиями клеток McCoy скоростным центрифугированием при 100000 g (п=7)

Время мин Исследуемый материал Объем, (см3) Активность (титр) антигена в РСК Активность (титр) антигена в ИФА

Среда культивирования КК McCoy 100 нет 32-64

30 Ресуспендированный осадок 10 8-32 1280

60 Ресуспендиро ванный осадок 10 64-128 2560

120 Ресуспендированный осадок 10 64-128 2560

Указаны обратные значения титра в РСК и ИФА.

Как следует из данных таблицы 1, хламидии практически полностью осаждались в течение 60 мин, при этом активность (титр) хламидийного антигена возрастала в РСК до значений 1:128 и в ИФА - до 1:2560. Увеличение времени центрифугирования не приводило к возрастанию активности (титра) хламидийного антигена.

В таблице 2 представлены результаты определения активности и специфичности хламидийного антигена, полученного по разработанной технологии из желточных мешков КЭ и среды культивирования инфицированной хламидиями КК ФЭК и McCoy.

Из данных, приведенных в таблице, следует, что хламидии производственного штамма «Улетово-96-ВНИиТИБП» репродуцируются как в желточных мешках развивающихся КЭ, так и на первично трипсинизированной КК ФЭК и на перевиваемой линии клеток McCoy. Препараты хламидийного антигена, изготовленные по разработанной нами технологии, проявляют высокую активность и специфичность.

Таблица 2

Активность и специфичность хламидийного антигена в РСК

п=5

Сыворотка Хламидийный антиген из штамма «Улетово-96-ВНИиТНБП Хламидийный антиген из штамма «Лори»

желточные мешки КЭ среда культивирования ФЭК среды культивирования McCov желточные мешки КЭ

хламидийная № 1 128 128 128 64

хламидийная №2 64 64 64 64

хламидийная №3 128 128 128 128

хламидийная №4 64 64 64 64

хламидийная №3 64 64 64 64

отрицательная №1 Отрицат. Отрицат. Отрицат. Отрицат.

Хламидиипая Nsl, Nq2 - иммунные сыворотки; хламидийная Ж>3- «полевая» сыворотка крови пневмонии телят; хламидийная Ns4 —«полевая» сыворотка крови аборта овец; отрт/ательная №1 -сыворотка крови клинически здоровой овцы.

С участием автора, представителей ВНИТИБП, ВГНКИ и ЦНМВЛ проведены комиссионные испытания активности и специфичности антигенов и сывороток -компонентов набора для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных. Для сравнительной оценки использовали аналогичный набор производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (серия №2 от 05.00 г.) и «полевые» сыворотки из хозяйств, не благополучных по хламидиозу.

Подтверждено, что хламидийный антиген и иммунная сыворотка проявляли активность и специфичность в РСК и ИФА как при испытании наборов, так и при постановке реакций с компонентами набора производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и «полевыми» хламидийными сыворотками.

Таким образом, разработанный технологический процесс эффективен и обеспечивает получение хламидийного антигена с высокой активностью и специфичностью в РСК и ИФА.

Препарат антигена, изготовленный по п.п. 3.3.1-3.3.2, по показателям качества соответствующий требованиям ТУ, подвергали сублимационному высушиванию, по режиму, разработанному при участии д.б.н. A.A. Нежуты.

3.4. Технологический процесс получения антигена культурального вируса ИНАН. Преципитирующий антиген получали из среды культивирования культуры клеток почки, кожи и мышцы ЭЛ, инфицированной вирусом ИНАН. В наших исследованиях вмруссодержащую жидкость концентрировали методом ультрафильтрации и очищали методом ионообменной хроматографии на колонках с ДЭАЭ-Toyopearl HW-60.

В результате проведенных исследований разработан технологический процесс изготовления препарата антигена культурального вируса ИНАН, включающий: 1 -центрифугирование вируссодержащей среды культивирования при 2500g 10 мин; 2 -концентрирование надосадка в 10-40 раз методом ультрафильтрации; 3 - троекратная обработка концентрата этиловым эфиром с целью получения преципитирующего антигена, как компонента тест-системы РДП для диагностики ИНАН.

Таблица 3

Результаты очистки вируса ИНАН методом ионообменной хроматографии _(__на ДЭАЭ-Toyo-pearl HW-60__

Исследуемый материал Объем, (см3) Количество белка Активность (титр) антигена Очистка по белку {%)

мг/см Мг РДП ИФА

Исходный вирус 200 3.21+0.05 642,0±10 0-2 64

элюат 0,2 М NaCl 10 7,19±0,21 71,90±2,1 нет нет

элюат 1,0 М NaCl 10 0,0810,003 0,8±0,03 64-128 1024-4096 99,85±0,15

Указаны обратные значения титров в РДП и ИФА.

Для конструирования тест-системы ИФА вирусный материал дополнительно очищали методом ионообменной хроматографии в градиенте молярной концентрации (0,05; 0,2; 1,0) раствора №С1 на ЗФР, рН 7,2-7,4 ДЭАЭ-Тоуореаг1 Н\У-60. Элюирование балластных белков осуществлялось 0,05 М и 0,2 М, а вируса — 1,0 М раствором №С1. В таблице 3 представлены результаты очистки вируса методом ионообменной хроматографии.

Как следует из данных таблицы, % очистки по белку вируса ИНАН равен 99,85. Необходимо отметить, что хроматография через ДЭАЭ-Тоуореаг1 Н\У-60 позволяет разделить преципитирующий и комплементсвязывающий антигены. Белок фракции VI после его обработки этиловым эфиром имел титр в РСК 1:4. Следовательно, при использовании ДЭАЭ-Тоуореаг! Н\У-60 происходило разделение вирусного материала с максимальным выходом антигена, что свидетельствует о возможности применения этого ионообменника для очистки вируса ИНАН.

Методом диск-электрофореза в ПААГ установлена гомогенность очищенного препарата: на электрофореграмме присутствовала интенсивная полоса, идентифицированная как антиген вируса ИНАН, располагающаяся в зоне электрофоретической подвижности гамма-глобулина.

Препарат антигена, по показателям качества соответствующие требованиям ТУ, подвергали сублимационному высушиванию, по режиму, разработанному при участии д.б.н. A.A. Нежуты

3.5 Технологический процесс получения иммунных сывороток. 3.5.1 Технологический процесс получения хпамидийной сыворотки.

Специфическую хламидийную сыворотку от животных-продуцентов получали по методу, разработанному сотрудниками ГНУ ВНИТИБП, который исключает использование в качестве антигена живых хламидий. Применение для иммунизации препарата хламидийного антигена обеспечивает экологическую безопасность для персонала и окружающей среды.

Проведена серия экспериментов, целью которых являлось исследование адъювантных свойств хитозана, обладающего широким спектром воздействия на организм. Иммунизацию овец (контрольная группа) проводили по схеме, включающей грундиммунизацию и через 30 дней иммунизацию животных продуцентов. С интервалом в 10 дней проводили инокуляцию 10 см3 хламидийного антигена в смеси с ПАФ (1:1) в область предлопаточных лимфоузлов, внутрибрюшинно - в смеси с НАФ (1:1). Инъекции повторяли. Через 10 дней животным вводили с интервалом 2 дня внутривенно по 10 см3 антигена без адьюванта. Крововзятие с целью получения иммунной сыворотки проводили через 14 дней после последнего инокулирования антигена. Опытной группе животных при каждой инокуляции антигена дополнительно вводили подкожно по 1 см3 хитозана с М.м. 130 кД (ЗАО «Биопрогресс»).

Результаты проведенных исследований не показали достоверных различий в активности и специфичности гипериммунных сывороток, полученных от продуцентов опытной и контрольной групп.

С целью повышения активности иммунных хламидийных сывороток были проведены исследования по разработке эффективной схемы иммунизации с использованием иммуностимуляторов. Препарат «Иммунофан» (ООО НПП, «Бионокс») при введении в организм оказывает иммунорегулирующий эффект, усиливает реакции фагоцитоза, способствует более длительной циркуляции специфических антител, что и определило наш выбор.

Клинически здоровых овец, проверенных на отсутствие хламидийных антител, иммунизировали антигеном по схемам, различающимся по длительности курса иммунизации, дозам антигена, способам и месту его аппликации. Наиболее эффективной явилась схема, включающая: 1. Грундиммунизацию в область предлопаточных лимфатических узлов минимальным количеством антигена и внутримышечно - 1 см3 препарата «Иммунофан» (ООО НПП, «Бионокс»); 2. Гипериммунизацию через 30 дней, предусматривающую с интервалом в 10 дней инокулирование в область предлопаточных лимфоузлов в возрастающих дозах (5, 10, 15 см3) антигена и внутримышечное введение по 1 см3 «Иммунофана». Затем овцам троекратно с интервалом 2 дня внутривенно инокулировали антиген и внутримышечно - по 1 см3 «Иммунофана»

Результаты исследований представлены в таблице 4. Из данных таблицы следует, что применение в качестве иммуностимулятора «Иммунофана» позволяет получить специфические сыворотки с высокой активностью (титром) в РСК и ИФА.

Максимальный титр антител в РСК, 1:640 (2-ая группа), был определен на 60-ый день после гипериммунизации.

Высокий титр антител в сыворотках крови 90-95% овец-продуцентов без дополнительной инъекции антигена сохранялся в течение 3-х месяцев (6 крововзятий). Выход сыворотки по разработанной технологии составил 60-65 %.

Таким образом, разработана эффективная схема иммунизации овец хламидийным антигеном с применением иммуностимулятора «Иммунофан», которая позволила повысить активность гипериммунных сывороток, сократить длительность курса иммунизации и увеличить количество крововзятий без дополнительного введения антигена.

Таблица 4

Активность (титр) в РСК и ИФА хламндийных сывороток _(п^5)_

Дни крововзятий Активность (титр) иммунных хламидийных сывороток

Группа 1 Группа 2 Группа 3

РСК ИФА РСК ИФА РСК ИФА

1 Отриц. 100 Отриц. 100 Отриц. 1600

14 10 400 20 800 80 3200

28 40 1600 40 1600 160 6400

42 80 3200 80 3200 320 12800

56 160 6400 160 6400 640 25600

70 80 3200 80 3200 640 25600

84 40 1600 40 1600 320 12800

98 10 400 40 1600 160 6400

20 800 160 6400

Указаны обратные величины разведений сывороток. Группа 1 -контрольная; Группа 2 — гипериммунизация по схеме с хитозаном; Группа 3 —гипериммунпзация с «Иммунофаном».

Сыворотки, по показателям качества соответствующие требованиям ТУ, подвергали сублимационному высушиванию, по режиму, разработанному при участии д.б.н. A.A. Нежуты. Технологический контроль сухого препарата проводили по следующим показателям: растворимость, содержание массовой доли влаги по ГОСТ 24061-89, стерильность по ГОСТ 28085-89, остаточный кислород в ампулах по ГОСТ 28083-89, активность (титр) и специфичность в РСК и ИФА. Исследования проводили с использованием референс-препарата хламидийного антигена

Разработанная схема включена в технологический процесс получения хламидийной сыворотки Технологического регламента по изготовлению и контролю "Наборов для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК и РДСК". 3.5.2 Технологический процесс получения специфической к вирусу ИНАН сыворотки лошадей. В исследованиях использовали специфическую сыворотку экспериментально инфицированных вирусом ИНАН лошадей. Сыворотку получали при титре преципитирующих антител в РДП не ниже допустимых норм (1:4).

Специфическую сыворотку доводили до рабочего разведения (т.е. до разведения, дающего с контрольным положительным антигеном четкую линию преципитации) сывороткой крови здоровой лошади, разведенной 1:1 стерильным физраствором, pH 7,6, добавляли антибиотики или мертиолят (1:10000), фасовали по 1 см3 или 2 см3 в стерильные флаконы (ампулы) и подвергали- сублимационному высушиванию в атмосфере инертного газа азота.

3.6 Сублимационное высушивание иммунобиологических препаратов. Цель исследований-разработать эффективный, исключающий биодеградацию, режим сублимационного высушивания иммунобиологических препаратов, имеющих различающиеся эвтектические характеристики, температуры сублимации и досушивания, скорости охлаждения на этапах первичной и вторичной кристаллизации, время досушивания. Работа проводилась совместно с отделом сушки ГНУ ВНИТИБП (зав. отделом, д.б.н. Нежутой A.A.).

3.6.1 Сублимационное высушивание компонентов наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза животных. В качестве ЗС (среды высушивания) экспериментальным путем нами был выбран раствор Декстрана Т-70 или Т-90 на 0Д5М K-фосфатном буферном растворе, рН-7.2-7,4, который в концентрации 3% по объему добавляли к антигену и в концентрации 1,5% - к сыворотке.

Компоненты диагностических наборов (тест-систем), по показателям качества соответствующий требованиям ТУ, стабилизировали ЗС, добавляли мертиолят в конечном разведении 1:10000, фасовали по 1 см3 в ампулы ШП-5 (флаконы) и подвергали сублимационному высушиванию.

Замораживание препаратов проводили в холодильных установках НС - 280/75. Началом процесса замораживания считали момент постановки в камеру последней кассеты. В трех кассетах устанавливали в центральных ампулах ШП-5 по одному датчику контроля температуры материала в процессе сушки.

Замораживание препаратов проводили по следующей схеме: материал загружали в холодильную камеру, охлажденную до температуры минус (53+2) °С; контроль температуры в материале при замораживании осуществляли по трем ампулам, максимально удаленным от вентилятора камеры и расположенным в центре кассет; При достижении температуры полного замораживания материала (по трем точкам), равной минус (53±2) °С и выдерживании материала при этой температуре (или ниже) в течение двух часов процесс замораживания считали законченным. Время замораживания препарата в холодильной установке НС - 280/75 14-16 часов. Этап сублимации проводили в зоне эквивалентных температур: минус 39 °С - 34 °С при давлении в камере (85+5) мкм.рт.ст. в течение 12-13 час. В таблице 5 представлены характеристики препаратов, стабилизированных по разработанному режиму высушивания.

Таблица 5

Характеристика сухих компонентов диагностических наборов (тест-систем)

Препарат Характеристика препаратов

Внешний вид Растворимость (мин.) Остаточная влажность (%) Активность (ппр) в РСК

Хламидийный антиген Гомогенная аморфная масса белого цвета , 2-2,5 1:64-1:256

Контрольный, антиген Гомогенная аморфная масса белого цвета 1 2-2,5

Хламидийная сыворотка Гомогенная аморфная масса кремового цвета 1 2-2.5 1:80-1:320

Контрольная сыворотка Гомогещюя аморфная масса соломенного цвета 1 2-2.5

Высушенные компоненты диагностических наборов сохраняли свои свойства не менее 18 мес. (заявленный срок годности).

3.6.2 Сублимационное высушивание компонентов тест-систем для диагностики ИНЛНлошойей.Компоненты диагностических наборов (тест-систем) стабилизировали ЗС (среда высушивания), добавляли мертиолят в конечном разведении 1:10000, фасовали по 1 см3 во флаконы на 10 см3 (ампулы ШП-5) и подвергали сублимационному высушиванию. Для конструирования тест- системы РДП на 5, 10 и 15 определений компоненты фасовали в ампулы ШП-5 по 0,2 см3. Замораживание препаратов проводили в холодильных установках НС-280/75. Началом процесса замораживания считали момент постановки в камеру последней кассеты. В трех кассетах устанавливают в центральных флаконах по одному датчику контроля температуры материала в процессе сушки. Замораживание препаратов проводят по следующей схеме: материал загружают в холодильную камеру, охлажденную до температуры минус (48±2) °С; контроль температуры в материале при замораживании осуществляют по трем флаконам, максимально удаленным от вентилятора камеры и расположенным в центре кассет; при достижении материалом температуры минус (48±2) °С его выдерживают два часа в холодильной камере при температуре не выше минус (48±2) °С. Время замораживания препаратов в холодильной установке НС -280/75 не менее 10 часов.

После загрузки камеры подключают датчики контроля температуры полок, температуры материала, камеру герметизируют и вакуумируют до остаточного давления в пределах (50+10) мкм. рт.ст. После достижения вакуума включают нагрев полок и выводят температуру материала на уровень минус (40±2) °С, которую поддерживают в течение 10-12 часов. После сублимации влаги при температуре минус (40+2) °С материал нагревают до температуры (25+1) °С и поддерживают ее в течение 10-12 часов при давлении в камере сублиматора не выше 90 мкм. рт.ст.

Высушенные компоненты диагностических наборов сохраняли свои свойства не менее 18 мес. (заявленный срок годности).

3.7 Конструирование наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза животных в РСК, РДСК и РДП.

3.7.1 Конструирование набора для диагностики хламидиоза животных в РСК и РДСК. В качестве компонентов набора использовали высушенные в атмосфере инертного газа азота в объеме 1,0 см3 в ампуле (флаконе) препараты.

Технологический контроль сухих препаратов проводили по следующим показателям: растворимость, содержание массовой доли влаги по ГОСТ 24061-89, стерильность по ГОСТ 28085-89, остаточный кислород в ампулах по ГОСТ 28083-89, активность (титр) и специфичность в РСК и ИФА. Исследования проводили с использованием референс-препаратов хламидийного антигена и хламидийной сыворотки.

Набор для диагностики хламидиоза животных в РСК и РДСК состоит из: 1) антигена хламидийного - 10 ампул (флаконов); 2) антигена контрольного (отрицательного) - 2 ампулы (флакона); 3) сыворотки иммунной хламидийной - 5 ампул (флаконов); 4) сыворотки контрольной (отрицательной) - 3 ампулы (флакона).

По результатам троекратного исследования в РСК с референс-препаратами определяли активность (титр), рабочее разведение и эквивалентное соотношение компонентов набора: хламидийного антигена и иммунной сыворотки. За титр антигена принимали его максимальное разведение, которое с референс-препаратом сыворотки в РСК обеспечивало 100%-ную задержку гемолиза (#). За титр сыворотки принимали ее

максимальное разведение, которое с референс-препаратом антигена в РСК обеспечивало 100%-ную задержку гемолиза (#).

Испытывали препараты в последовательных двукратных разведениях: антиген — от 1:8 до 1:512 и сыворотку - от 1:5 до 1:320 по квадратной схеме титрования. В зависимости от серии антиген имел активность (титр) 1:64 -1:256, рабочее разведение -1:16 -1:64; сыворотка имела активность (титр) 1:40 до 1:320, рабочее разведение - 1:10 - 1:80. Эквивалентное соотношение для рабочих разведений антиген/специфическая сыворотка определено как 1:64/1:40, 1:128/1:80, соответственно.

Специфичность определяли путем испытания антигена с сыворотками крови клинически здоровых и больных хламидиозом овец и КРС, иммунными хламидийными и гетерологичными сыворотками. Результаты исследований показали, что антиген реагировал только с сыворотками больных хламидиозом овец и КРС и иммунными хламидийными сыворотками. Отсутствие перекрестной реакции с гетерологичными и сыворотками крови клинически здоровых животных является подтверждением высокой специфичности компонентов набора для диагностики хламидиоза.

Таким образом, изготовленные по разработанной нами технологии наборы имеют высокую активность (титр) и специфичность в РСК, на основании чего «Набор для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК и РДСК» успешно используется в ветеринарной практике РФ.

3.7.2 Конструирование тест-системы РДП на основе антигена культурального вируса для диагностики инфекционной анемии. Проводили исследования по определению в РДП активности, эквивалентного соотношения и рабочих разведений сухих компонентов тест-системы. Установлено, что в геле агара образовывалась четкая, хорошо различимая на всем протяжении между свободными лунками линия преципитации, расположенная на середине расстояния между лунками с антигеном в разведении 1:4 — 1:8 и специфической сывороткой в разведении 1:8 - 1:16. Рабочее разведение для антигена определено как 1:2-1:4, для сыворотки-1:4-1:8. Эквивалентное соотношение для рабочих разведений антиген/специфическая сыворотка определено как 1:2/1:4 и 1:4/1:8.

Специфичность и характер РДП при ИНАН определяли путем испытания тест-системы антиген — специфическая сыворотка с сыворотками крови заведомо здоровых и больных лошадей (полученные до и через 1-2 месяца после экспериментального инфицирования животных культуральным вирусом ИНАН).

Результаты исследований показали, что антиген и специфическая сыворотка образовывали четкие линии преципитации, которые являлись контрольными. Сыворотки крови здоровых лошадей не давали реакции с антигеном и не изменяли направления контрольной линии, которая под прямым углом достигала лунок с этими сыворотками. Сыворотки крови больных лошадей во всех случаях давали положительную реакцию, которая визуально выражалась в укорочении контрольной линии преципитации, в образовании идентичной с контрольной линии преципитации или в отклонении контрольной линии в сторону сыворотки.

Таким образом, тест-система является специфичной для ИНАН и позволяет выявлять в сыворотках больных лошадей преципитирующие антитела в высоких и низких концентрациях. Разработанная нами технология позволяет изготавливать тест-системы РДП для диагностики ИНАН лошадей, рассчитанные на 90, 120, 180, а также на 5, 10, 15 определений (доз).

3.8 Разработка тест-систем ИФА для определения специфических антител в сыворотках крови овец, КРС и лошади и индикации антигена.

При работе с каждым новым объектом возникает необходимость изучения параметров проведения иммуноферментного анализа, оптимальных для данного микроорганизма (антигена). Высокая разрешающая способность методов ИФА обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих результаты анализа. 3.8.1 Синтез антивидовых иммунопероксидазных конътгатов анти- 1^С-ПХ. Технологический процесс изготовления антивидовых конъюгатов анти- ^в-ПХ включает: выделение ТсО из сыворотки крови; иммунизацию животных препаратами 120 с целью получения антивидовых сывороток крови; выделение специфических антител из иммунных сывороток; синтез иммунопероксидазного конъюгата анти-^в -Пх.

Фракционирование иммуноглобулина класса в проводили методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Тоуореаг! Н\У-60. Выход очищенного иммуноглобулина класса О составил 189,15± 6,82 мг/см3(п = 5).

Гомогенность препарата проверяли методом диск-электрофореза с

использованием 7,5% системы ПААГ и трис-глициновой электродный буферный раствор, рН 8,3. На электрофореграмме присутствовала одна диффузная полоса, образуя зону «тумана», в зоне электрофоретической подвижности "у-глобулинов.

Гомогенные по своему составу, с высокой специфичностью и активностью препараты из сыворотки крови овцы, КРС и лошади использовали для

иммунизации животных-продуцентов с целью получения антивидовых сывороток.

Фракционирование антител к 1«0 из сыворотки крови осуществляли методом аффинной хроматографии на активированной ВгОЧ-сефарозе 4В по общепринятым методам. Специфические антитела элюировали с иммуносорбента 0,1 М глицин-НС1, рН 2,0 -2,2, буферным раствором. Фракции с Д28о 2 0,05 объединяли и добавляли 1 М раствор КгНР04 до значений рН 7,4 - 7,6, центрифугировали (3000 ¡>, 30 мин) и концентрировали методом ультрафильтрации до объема 5-7 см3.

Специфичность и гомогенность препарата антивидового ^О проверяли методом иммуноэлектрофореза в 1% агаре («Дифко», США), приготовленном на веронал-мединаловом буферном растворе, рН 8,6. О специфичности препарата анти-^О свидетельствовало наличие одной дуги преципитации на иммуноэлектрофореграмме, образуемой с из соответствующей сыворотки (Рис.4).

Рис. 4. Иммуноэлектрофореграмма препарата анти-1%С(6аран)

Очищенные методом аффинной хроматографии антитела использовали для синтеза конъюгата анти-IgG - ПХ методом ковалентного связывания анти-IgG с окисленной перйодатом натрия пероксидазой из хрена (Nakane Р.К., Kawaoi А., 1974; Wilson М.В., Nakane Р.К., 1978). В качестве маркера для ИФА использовали фермент ПХ с RZ > 3,0 (Serva).

Активность (концентрацию в расчете на ПХ) конъюгата анти-IgG-IIX определяли методом раститровки на контрольные гомологичные и гегерологичные сыворотки, связанные с адсорбированным в лунках планшет хламидийным антигеном.

Концентрацию рассчитывали по максимальной разнице в значениях Д490» полученной при спектрофотометрическом измерении результатов его раститровки на сыворотки. Результаты определения активности конъюгата анти-1§С(баран)-ПХ представлены в таблице 6.

Таблица б

Определение рабочего разведения конъюгата анти-IgG (баран) — ПХ

AHTH-IgG(6apaH)-IIX (нг/см*) Д490 АДя

IgG (баран) IgG (лошадь)

2000 >2,0 0,102±0,005

1000 >2,0 0,08910,002

500 1,875+0,004 0,07710,001 1,798

250 1,449±0,005 0,04810,001 1,401

125 1,047+0,008 0,029+0,002 1,018

62,5 0,817+0,001 0,014+0,004 0,803

32,25 0,390±0,005 0,023Ю,004 0,367

Как следует из данных таблицы, рабочее разведение конъюгата анти-IgG (баран)-ПХ (концентрация в расчете на ПХ) для непрямого иммуноферментного анализа составило 250 нг/см3. При этом Д490 (ОП), определенное при спектрофотометрическом измерении результатов, имело значение больше 1,40 оп.ед., а Д490 (К) - менее 0,05 оп.ед. Аналогично определяли рабочую концентрацию aHTH-IgG(6biK)-ITX, которая была равна 400 нг/см3, а Д Ддад = Д490 (ОП)-Д49о(К) >1,00 . Рабочее разведение конъюгата анти-IgG (лошадь) - ПХ составило 250 нг/см3, Д490 (ОП) имело значение больше 1,40 оп.ед., а Дш (К) - менее 0,05 оп.ед.

Конъюгаты лиофильно высушивали с добавлением в качестве стабилизатора Декстрана Т-70 в ампулах (флаконах) в объеме 0,1 см3 из расчета последующего разведения до рабочей концентрации.

3.8.2 Определение параметров и условий проведения анализа. Определяли оптимальную концентрацию антигена для адсорбции на полистироловые планшеты, рН и молярность адсорбционного буферного раствора, влияние времени и температуры инкубации на адсорбционные свойства антигена, время и температуру экспозиции контрольных и исследуемых сывороток, рабочее разведение антивидового иммунопероксидазного конъюгата, а также подбирали блокирующий белок для снижения неспецифической сорбции на полистирол.

В исследованиях использовали: специфическую хламидийную и контрольную (отрицательную) сыворотки, антивидовой иммунопероксидазный конъюгат анти-IgG(6apaH)-IIX или aHTH-IgG(6biK)-ITX.

Антиген на планшеты адсорбировали в разведениях от 1:10 до 1:1280. Оптимальную концентрацию определяли титрованием по методу "шахматной доски" с различными разведениями антигена и положительной сыворотки.

Установлено, что величина Дзд в диапазоне разведений антигена 1:320-1:640, определенная на MICRO-ELISA Reader MR-580 при длине волны 490 nm, опытной пробы, содержащей антитела, и контрольной (отрицательной) пробы имели значения, соответственно, Д^Оп) > 1,0. а Д490(К)< 0,150.

Таким образом, оптимальным разведением хламидийного антигена для адсорбции на полистироловые планшеты, обеспечивающее достоверное различие результатов, является 1:640-1:320.

В целях выбора оптимального значения рН для адсорбции хламидийного антигена испытывали ацетатную, фосфатную и Ыа-бикарбонатную буферную систему с рН 5,05,2; 7,2-7,4 и 9,4-9,6, соответственно. Результаты исследований оценивали по значениям Д490, полученными при раститровке положительной и отрицательной сывороток на иммобилизованный хламидийный антиген. Максимальное значение ДД490 = Д490 (Оп) - Лш (К)>1,0 было определено при адсорбции антигена в 0,05 М Na-бикарбонатной буферной системе, рН 9,4-9,6.

Влияние времени и температуры инкубации на адсорбционные свойства антигена изучали при продолжительности адсорбции от 6 час до 24 час при (6±2) °С и от 30 мин до 3 час при (38±1) "С. Результаты исследований показали, что насыщение адсорбционных центров полистироловых планшетов происходило при продолжительности адсорбции антигена в течение 18 час при (6±2)°С или 1,5 часа при t = (38±1) °С. При этом величины Д490 имели близкие значения: 1,52±0,07 и 1,67+0,09, соответственно. Уменьшение времени адсорбции хламидийного антигена приводило к возрастанию неспецифического фона: Д490 (К)> 0,160 + 0,08.

Для предотвращения неспецифической сорбции реагентов на полистирол эмпирическим путем подбирали детергент и блокирующий белок. Установлено, что оптимальным для промывки планшет на каждом этапе анализе является К-фосфатный буферный раствор, рН 7,2-7,4 с добавлением 0,05% детергента тритон Х-100 или твин-80 и блокирующего белка - 1% сыворотки крови лошади.

Экспериментально определены температура и время инкубации: - специфической и контрольной (отрицательной) сывороток после добавления к адсорбированному антигену - 1 час при t = (38+1) °С;

-иммунопероксидазного конъюгата после внесения в аналитическую систему- 1 час при t — (38±1)°С.

С целью разработки непрямого ИФА для определения титра антител в исследуемых сыворотках в одном разведении подбирали оптимальное разведение сывороток и устанавливали позитивно-негативный порог («Cut-off»), разграничивающий значения Д490 положительных и отрицательных сывороток (Snyder D.B., 1982; Волкова М.А. и др., 1997; Мудрак Н.С. и др., 2006; Г.С. Скитович и др., 2007; Матвеева И.Н., 2008). Исследовали сыворотки крови экспериментально инфицированных хламидийным антигеном (п=60) и заведомо здоровых (п=60) овец. Предварительно сыворотки были проверены в РСК.

Положительные в РСК сыворотки овец при исследовании в непрямом ИФА имели значения Д490 от 0,275±0.095 до 1,85+0,125. Достоверные различия титров

хламидийных и гетерологичных сьгеороток установлены, начиная с разведения 1:100. Получены отрицательные результаты (Д49о<0,150) при исследовании в ИФА нормальной (отрицательной) и гетерологичных сывороток. Аналогичные результаты были получены при исследовании сывороток крови КРС.

При непосредственном участии автора совместно с сотрудниками Института вирусологии проведены исследования в непрямом ИФА 2910 проб сывороток крови овец и 1300 проб сывороток крови КРС из хозяйств, неблагополучных по хламидиозу.

В таблице 7 представлены результаты исследования сывороток крови овец.

Таблица 7

Результаты исследования в ИФА сывороток крови овец

Группа животных Исследовано проб Реагировали положительно Средний титр М±Ш

количество %%

Абортиро вавшие овцематки 131 86 65,5 5,7+0,12

Клинически здоровые овцы 604 239 39,1 3,8+0,11

Бараны-производители 47 12 25,5 3,0+0,35

Племенные бараны 1997 59 2,5 2,6+0,25

Ярки 151 39 25,8 3,5+0,18

Всего 2910 435 15 3,7+0,34

Из данных таблицы следует, что специфические хламидийные антитела были определены в 65,5% исследованных сывороток абортировавших овец, 39,1% клинически здоровых овец, 25,5% баранов-производителей, 2,5% племенных баранов и 25,8% ярок, что составило 15% от общего количества обследованных животных.

Таблица 8

Результаты исследования в ИФА сывороток крови КРС

Группа животных Исследовано проб Реагировали положительно Средний титр М+т 1й2

количество %%

Коровы 538 143 26,6 3,3+0,14

Быки-производители 198 41 20,7 2,9+0,25

Телята 607 318 52,9 3,6+0,40

Всего 1343 502 37,3 3,5+0,21

В таблице 8 представлены результаты исследования сывороток КРС. Из данных таблицы следует, что специфические хламидийные антитела были определены в 26,6% исследуемых сывороток коров, 20,7% сывороток быков-производителей, 52,9% сывороток телят, что составило 37,3 % исследуемых сывороток.

При комиссионных испытаниях, проведенных с участием представителей ВГНКИ и ЦНМВЛ, установлена корреляция (г = 92; р < 0,05) между результатами, полученными при определении специфических антител в РСК и ИФА. Комиссионные испытания показали, что разработанные тест-системы ИФА имеют высокую чувствительность и специфичность и могут быть рекомендованы для экспресс-диагностики хламидиоза и массового скрининга овец и КРС.

Таким образом, разработаны тест-системы ИФА для определения хламидийных антител в сыворотках крови овец и КРС, характеризующиеся высокой чувствительностью и специфичностью, воспроизводимостью результатов и простотой проведения анализа. Преимуществом данных тест-систем является комплектование полистироловыми планшетами с иммобилизованным хламидийным антигеном и готовыми к применению буферными растворами.

3.8.3 Тест-системы ИФА для индикации хламидийпого антигена. Исходя из данных литературы и собственных исследований, за основу разработанной тест-системы был выбран вариант модифицированного конкурентного ИФА. С целью унификации и возможности конструирования комплексной тест-системы для индикации антигена и специфических антител нами была испытана следующая схема анализа.

Исследуемую пробу, содержащую определяемый антиген, смешивали в соотношении 1:1 со специфической иммунной сывороткой. Смесь после инкубации добавляли к антигену, иммобилизированному на планшетах. После инкубации и добавления в аналитическую систему конъюгата анти-^О-ПХ и субстрата происходила окраска раствора. Концентрацию антигена в исследуемой определяли по разнице в интенсивности окраски раствора "нулевой пробы" (отрицательный контроль) и опытной пробы, содержащей антиген.

Разработана следующая схема проведения анализа:

- параметры адсорбции хламидийного антигена в лунки полистиролового планшета, как для непрямого варианта ИФА;

-инкубация смеси антигена и иммунной сыворотки (1:1) вне аналитической системы при температуре (22+2) °С в течение 1,5-2,0 часа;

- инкубация после внесения смеси в лунки планшета - 1час. при (38±1) °С; -инкубация после добавления в аналитическую систему антивидового конъюгата анти-1§С-ПХ - 1час. при (38±1) °С.

Планшеты на каждом этапе анализа промывали К-фосфатным буферным раствором, рН 7,2-7,4 с добавлением 0,05% детергента тритон Х-100 или твин-80 и блокирующего белка - 1% сыворотки крови лошади.

Для разграничения определений результатов анализа на «положительный» и «отрицательный» при спектрофотометрическом измерении активности (титра) антигена проводили исследования в ИФА образцов антигена, проверенных в РСК (Табл.9). Для построения стандартной кривой антиген в двукратных разведениях, начиная с 1:8, соединяли (1:1) с иммунной сывороткой. После инкубации в течение 1,52,0 часа при температуре (22+2) °С смесь вносили в лунки с адсорбированным антигеном, затем в аналитическую систему добавляли антивидовой иммунопероксидазный конъюгат. Результаты ферментативной реакции учитывали после внесения субстратной смеси. За 100% принимали величину Д490 в системе, где к адсорбированному на полистирол антигену добавляли сыворотку и физиологический раствор, рН-7.4-7,6 (1:1) - "нулевая" проба.

Таблица 9

Зависимость значении Япп от концентрации хламидийного антигена (стандартная кривая)

Результаты Исследуемые образцы

1 2 3 4 5 6 Контроль

Положит. Отрицат.

РСК 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:512 1:32 -

ИФА 0,125 0,385 0.650 0,980 1,280 1,55 0,675 1,87

Наличие антигена определяли по разнице в значениях Дщо «нулевой» пробы (без определяемого антигена) и исследуемого образца. При этом Д490 отрицательной пробы не должно быть ниже 1,50 опт.ед.

Из приведенных в таблице 9 данных следует, что положительные в РСК антигены при исследовании в ИФА имели значения Д490 от 0,125 опт.ед. до 1,55 опт.ед. Положительный контроль (стандартный антиген) имел значение Д490 = 0,675 опт.ед., что соответствовало тиру антигена в РСК 1:32; отрицательный контроль («нулевая проба») - Д490 1,870 опт.ед.

Таким образом, разработана тест-система ИФА для индикации хламидийного антигена, характеризующаяся высокой чувствительностью и специфичностью. Тест-система содержит полистироловые планшеты с иммобилизованным хламидийным антигеном и готовыми к применению буферными растворами.

3.9 Тест-системы ИФА для определения антител к вирусу ИНАН и индикации антигена вируса ИНАН. В проведенных ранее исследованиях нами были разработаны тест-система для индикации антител к вирусу ИНАН методом ИФА и тест-система для индикации антигена культурального вируса ИНАН методом ИФА.

Целью исследований явилось конструирование комплексной тест-системы ИФА, которая позволяет: ставить диагноз ИНАН лошадей по индикации антител (непрямой вариант ИФА); определять антиген вируса ИНАН после его экстракции эфиром в биологических жидкостях и осуществлять контроль репродукции вируса ИНАН в процессе культивирования (вариант модифицированного конкурентного ИФА).

Отрабатывали параметры и условия проведения твердофазного ИФА для индикации специфических антител к вирусу ИНАН.

Установлено, что максимальная адсорбция антигена в лунки планшет происходила в течение 18 часов при (6+2) °С или 1 час при (38±1) °С при pH- 9,6 (0,05 М Na-бикарбонатный буферный раствор). Насыщающая концентрация антигена вируса ИНАН - 5,0 мкг/см . Концентрация конъюгата анти-^0(лошадь)-ПХ составила 250 нг/см3.

Экспериментально определены температура и время инкубации на каждом этапе. Для непрямого варианта ИФА:

- специфической и контрольной (отрицательной) сывороток после добавления к адсорбированному антигену - 1 час при t = (38+1) °С;

-иммунопероксидазного конъюгата после внесения в аналитическую систему- 1 час при t= (38+1) °С.

Для модифицированного конкурентного ИФА:

- инкубация смеси антигена и иммунной сыворотки (1:1) вне аналитической системы при температуре (22+2) °С в течение 1,5-2,0 часа;

- инкубация после внесения смеси в лунки планшета — 1час. при (38+1) °С; -инкубация после добавления в аналитическую систему антивидового конъюгата анти-IgG-ПХ - 1час. при (38+1) °С.

Концентрацию антигена в исследуемой определяли по разнице в интенсивности окраски раствора "нулевой пробы" (отрицательный контроль) и опытной пробы, содержащей антиген.

Для разграничения определений «положительный» и «отрицательный» антигены при спектрофотометрическом измерении результатов анализа проводили исследования в ИФА образцов антигена, проверенных в РДП. Установлено, что положительные в РДП антигены при исследовании в ИФА имели значения Дио от 0,250 опт.ед. до 1,450 опт.ед., отрицательные от 1,550 опт.ед. до 1,950 опт.ед. Положительный контроль (стандартный антиген) имел значение Д490 = 0,480 опт.ед., отрицательный контроль (среда культивирования неинфицированных клеток) -1,870 опт.ед.

После обработки этиловым эфиром в среде культивирования клеток кожи, мышцы, почки антиген выявлялся на 10-12 дни культивирования клеток в разведениях 1:32 -1:64. Максимальный титр антигена 1:64 -1:128 был определен на 35-40 дни культивирования. В среде культивирования неинфицированных клеток (отрицательный контроль) антиген определен не был

Определяли активность (титр) специфических антител в сыворотках крови экспериментально инфицированных вирусом ИНАН лошадей. Результат считали положительным, если значение Д4СЮ исследуемой сыворотки при спектрофотометрическом учете результатов ИФА в 2 и более раз превосходило Д49ц(К) контрольной сыворотки. Специфические антитела в сыворотках крови обнаружены через 16-28 дней после инфицирования вирусом ИНАН лошадей в разведении 1:512 -1:1024, титр антител возрастал до значения 1:2048 -1:4096 на 35-42 дни и достигал максимального значения на 70-80 дни после инфицирования. Достоверные различия титров сывороток, специфичных к вирусу ИНАН и гетерологичных, установлены, начиная с разведения 1:64. Получены отрицательные результаты (Д490 < 0,200) при исследовании в непрямом ИФА нормальной (отрицательной) и гетерологичных сывороток.

При комиссионных испытаниях установлена корреляция (г = 96; р < 0,05) между результатах™, полученными при определении специфических антител в РДП и ИФА. Преимуществом метода ИФА является более высокая - в 500 раз чувствительность. 3.10 Опытное производство наборов для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных. Опытное производство «Наборов для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК и РДСК» организовано на базе ГНУ ВНИТИБП в 1994 г. (Лицензия Правительства Московской области №00-08-1000044 от 04.07.08 г. на осуществление деятельности по производству лекарственных средств; Аттестат per. № 1236 от 07.06.07г.; Санитарно-эпидемиологическое заключение № 50.19.06.000.М.000171.05.09 от 22.05.09 г.; Свидетельство о государственной регистрации Л С для животных рег.№ПВР-1-3.5/01408 от 22.02.06 г.; Декларация о соответствии №000326). Наборы сертифицированы в Системе сертификации ГОСТ Р. При организации опытного производства учтены основные требования национальных стандартов ГОСТ Р 9001-2008, ГОСТ Р 52249-2009, ГОСТ Р 52537-2006 и Принципов ХАССП, обеспечивающие качество иммунобиологического

препарата (активность, специфичность, стабильность) и безопасность его производства.

В соответствии с требованиями ГОСТ Р 54763-2011 разработан и в соответствующем порядке утвержден комплект нормативной и технологической документации, обеспечивающей воспроизводство и проверку производственных процессов. Технологический регламент производства наборов для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК и РДСК включает общую блок-схему технологического процесса (см. рис. 5) и таблицу контрольных точек.

Блок-схема включает 5 этапов: ТП-1 - получение хламидийного антигена; ТП-2 — получение контрольного (отрицательного) антигена; ТП-3 - получение хламидийной сыворотки; ТП-4 - получение контрольной (отрицательной) сыворотки; ТП-5 -комплектование наборов.

Рис. 5. Блок-схема производства наборов для диагностики хламидиоза животных в РСК и РДСК.

В технологическую схему производства также входят: 12 этапов подготовительных работ (ПР) к основному технологическому процессу персонала, оборудования, измерительных приборов, производственных и боксовых помещений, воздуха, технологической одежды, посуды, инструментов, материалов первичной упаковки, укупоривания и этикетирования; 10 этапов вспомогательных работ (ВР), включающие получение и поддержание производственного посевного материала (Б.Ь.З.), приготовление растворов, ЗС, реактивов, подготовка эмбрионов к инкубации и заражению.

Технологический процесс изготовления наборов для диагностики хламидиоза животных в'РСК и РДСК контролировали и оценивали в контрольных точках (КТ) на

каждом этапе. Критическими, с точки зрения обеспечения качества препарата, являются следующие этапы: получение посевных материалов, культивирование хламидий в КЭ и на КК ФЭК, McCoy, приготовление антигена для иммунизации животных-продуцентов хламидийной сыворотки.

При оценке стабильности технологического процесса в качестве лабораторного рабочего образца использовали серии S.L.S. посевного материала хламидий с известной инфекционной активностью, которую определяли на развивающихся КЭ по результатам пяти исследований и в пяти повторностях (по пять эмбрионов на каждое разведение суспензии хламидий в одном разведении) после изготовления серии. В соответствии с требованиями НД инфекционная активность хламидий штамма «Улетово-96-ВНИиТИБП» должна быть в пределах от 5,5 ^ЭЛД^/см3 до 7,5 ^ЭЛД50/см3. Определены среднее значение (X) титра инфекционной активности хламидий и его среднеквадратичное отклонение (S), которые составили Х=6,5 lg ЭЛД5(1/см3 и S=±0,5 lg ЭЛД50/СМ3. Условия определения считали стандартными, технологический процесс стабильным, если титр инфекционной активности эталонной серии S.L.S. укладывался в интервал (6,5+0,5)lg ЭЛД^/см3, а полученное значение инфекционной активности в контролируемой серии хламидий - достоверным при величине ошибки определения, равной +0,5 lg ЭЛД50/см3.

В соответствии с требованиями GMP и ФЗ №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» в пострегистрационный период с целью подтверждения сроков годности и условий хранения проводили исследования стабильности компонентов наборов. Критерием опенки служила стабильность титра в РСК компонентов набора. В наших экспериментах образцы из трех серий наборов с активностью антигена 1:64, 1:128 и 1:128 и сыворотки, соответственно, 1:40, 1:80 и 1:160, а также трех ЛРЭМ с такой же активностью хранили при стандартных условиях, при (6±2) °С и (20+1) °С в течение 18 (заявленный срок годности набора) и 24 месяцев, а также в условиях опыта «ускоренного старения» при значениях температуры (37+2) °С.

Экспериментально подтверждено, что не происходит снижения активности (титра) в РСК хламидийных антигена и сыворотки в течение 24 месяцев при температуре хранения (6+2) °С и (20+1) °С, что превышает гарантированный срок годности наборов на 6 месяцев и свидетельствует о правильности рекомендованных сроков и условий хранений.

Таблица 10

Количество наборов, изготовленных на опытном производстве ГНУ ВНИТИБП

Год Изготовлено наборов Год Изготовлено наборов

Гос. заказ Прямые договора Всего Гос. заказ Прямые договора Всего

2001 2000 250 2250 2008 1877 346 2223

2002 3400 110 3510 2009 2497 235 2732

2003 2400 258 2658 2010 1300 61 1361

2004 2255 450 2705 2011 - 436 436

2005 2000 386 2386 2012 1259 621 1880

2006 549 735 1284 2013 1250 590 1840

2007 2046 273 2319

Всего за 2001-13 г.г. 27584

Методом «ускоренного старения» при повышенных температурах установлено, что компоненты набора стабильны в течение 30 суток при (37+2) °С. что является важным фактором при поставках наборов в летнее время и в южные регионы.

Как следует из данных таблицы 10, за период 2001-2013 г.г. на опытном производстве ГНУ ВНИТИБП изготовлено 27584 набора для диагностики хламидиоза животных в РСК и РДСК или в среднем 2100 наборов в год.

Экономический эффект от применения наборов составил 838,48 тыс.руб/тыс. наборов

4. ВЫВОДЫ

1. Методом ПЦР проведена молекулярно-генетическая идентификация штамма хламидий с использованием специфичных к Chlamydia psittaci олигонуклеотидных праймеров; определена нуклеотидная последовательность амплифицируемых фрагментов ompl- и отр2-генов у хламидий исследуемого штамма; показана возможность дифференциации хламидий внутри вида путем электрофоретического разделения продуктов рестрикции амплификатов в агарозном геле.

Штамм хламидий по результатам ПЦР, морфологии, морфогенезу в желточных мешках КЭ и КК ФЭК иМсСоу, по физико-химическим и серологическим свойствам относится к семейству Chlamydiaceae, роду Chlamydophila, виду Ch. psittaci и обладает характеристиками, соответствующими требованиям к производственным штаммам, используемым для производства диагностических препаратов. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ как Ch. psittaci штамм «Улетово-96-ВНИиТИБП» производственный для дианостических препаратов.

2. Штамм «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ» культурального вируса ИНАН по морфологии вирусных частиц, морфогенезу в культурах клеток ЭЛ, серологическим и физико-химическим свойствам относится к семейству Retroviridae и обладает иммунобиологическими свойствами, соответствующими требованиям к производственным штаммам, используемым для производства диагностических препаратов. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ.

Экспериментально подтверждена иммунологическая идентичность антигенов, полученных из среды культивирования КК ЭЛ и из ткани селезенки жеребенка, инфицированных вирусом ИНАН. Замена антигена из ткани селезенки на антиген культурального вируса обеспечивает возможность получения стандартизированного по активности и специфичности препарата антигена в необходимых количествах.

3. Для хламидий штамма «Улетово-96-ВНИиТИБП» и культурального вируса ИНАН штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ» разработаны технологические схемы изготовления посевного материала (S.L.S.), гарантирующие идентичность характеристик и свойств материала, используемого для изготовления конечного продукта, исходному штамму. Определены методы контроля по показателям качества; инфекционность, патогенность, стабильность, отсутствие контаминации, антигенная активность.

4. Разработана эффективная схема получения активной и специфичной хламидийной сыворотки, основанная на одновременной инокуляции антигена и иммуностимулятора «Иммунофан» и обеспечивающая высокий титр антител в сыворотках крови 90-95% овец-продуцентов без дополнительного введения антигена в течение 3-х месяцев (6 крововзятий). Применение «Иммунофана» обеспечило

повышение выхода сыворотки до 60-65 %, сокращение длительности курса иммунизации, снижение материальных затрат.

5. Разработана технология изготовления «Набора для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК и РДСК». На основе результатов производственных испытаний опытно-промышленных серий набора установлено, что его компоненты - хламидийный антиген и специфическая сыворотка проявляли высокую активность и специфичность при постановке реакции с компонентами набора производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и «полевыми» хламидийными сыворотками.

6. Разработаны тест-системы непрямого ИФА для определения хламидийных антител в сыворотках крови овец и КРС в одном разведении 1:100, в состав которых включены полистироловые планшеты с иммобилизованным хламидийным антигеном и готовыми к применению буферными растворами.

В комиссионных испытаниях тест-систем исследовано 2910 проб сывороток крови овец и 1300 проб сывороток крови КРС из хозяйств, неблагополучных по хламидиозу. Хламидийные антитела были определены в 15% исследуемых сывороток овец и в 37,3% исследуемых сывороток крови КРС. Параллельно сыворотки были проверены в РСК. Установлена корреляция результатов ИФА и РСК (г=92; р<0,05).

7. Разработана тест-система ИФА для определения хламидийного антигена в биологических жидкостях и в процессе культивирования после его предварительного экстрагирования. За основу разработанной тест-системы выбран вариант модифицированного конкурентного ИФА. С целью унификации и возможности конструирования комплексной тест-системы для индикации антигена и специфических антител нами предлагается схема анализа, предусматривающая использование антивидового иммунопероксидазного конъюгата.

В комиссионных испытаниях установлено, что в среде культивирования КК McCoy, инфицированной хламидиями, антиген может быть определен через 24 часа культивирования в разведении 1:8-1:16. Высокая специфичность разработанной тест-системы подтверждена отсутствием реакции с отрицательным контролем -неинфицированной средой культивирования.

8. На основе антигена культурального вируса ИНАН разработана технология изготовления тест-системы РДП для диагностики ИНАН лошадей. Подтверждена высокая специфичность тест-системы отсутствием перекрестной реакции с сыворотками крови здоровых лошадей. Технология позволяет производить тест-системы, рассчитанные на 90, 120,180 и на 5, 10, 15 определений.

9. Разработана технология изготовления тест-системы ИФА для определения вирусспецифических антител в сыворотках крови лошадей. В сравнительных испытаниях РДП и ИФА установлена корреляция результатов (г=92; р<0,05).

Подтверждена высокая специфичность разработанной тест-системы отсутствием перекрестной реакции с сыворотками крови здоровых лошадей. Преимуществом метода ИФА является его более высокая чувствительность - в 500 раз. Разработанная тест-система для определения вирусспецифических антител может быть

рекомендована для экспресс-диагностики инфекционной анемии и массового обследования лошадей.

10. Разработана технология изготовления комплексной тест-системы ИФА, для определения специфических к вирусу ИНАН антител (непрямой вариант) и индикации антигена вируса ИНАН в биологических жидкостях (вариант модифицированного конкурентного ИФА) и контроля репродукции вируса ИНАН в процессе культивирования. Тест-система ИФА укомплектована полистироловыми планшетами с иммобилизованным антигеном и готовыми к употреблению буферными растворами.

11. На опытном производстве ГНУ ВНИТИБП наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза животных в РСК, РДСК за период 2001-2013 г.г. для практического применения в соответствии с Государственными заказами МСХ РФ и прямыми договорами изготовлено 27584 наборов (более 2000 наборов в год), стабильное качество которых подтверждено отсутствием рекламаций.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

5.1 Для практического использования предложены следующие документы. Нормативная документация: Технологический регламент на изготовление и контроль наборов для диагностики хламидиоза животных в РСК и РДСК, утвержденный директором ВНИТИБП 25.09.2011 г.; Технологический регламент на изготовление и контроль тест-систем ИФА для диагностики хламидиоза овец и КРС, утвержденный директором ВНИТИБП 25.09.2011 г.; Технологический регламент на изготовление и контроль тест-системы РДП «Антиген - специфическая сыворотка для диагностики ИНАН лошадей», утвержденный директором ВНИТИБП 22.10.2012г.;Технологический регламент на изготовление и контроль комплексной тест-системы ИФА для индикации антител или антигена вируса ИНАН, утвержденный директором ВНИТИБП 22.10.2012 г.; Технические условия (ТУ- 9388-20 - 00497963 -05) на набор для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК и РДСК и Инструкция по применению наборов, утвержденные Департаментом ветеринарии РФ 20.02.06 г.; Стандарт организации (№9337-008-938830-12) на тест-систему ИФА для диагностики хламидиоза овец и Инструкция по применению тест-системы, утвержденные директором ВНИТИБП 14.02.12; Стандарт организации (№9337-009-938830 -12) на тест-систему ИФА для диагностики хламидиоза КРС и Инструкция по применению тест-системы ИФА, утвержденные директором ВНИТИБП 14.02.12; Стандарт организации (№9337-010-938830-12) на тест-систему ИФА для индикации хламидийного антигена и Инструкция по применению тест-системы ИФА, утвержденные директором ВНИТИБП 14.02.12;

Технические условия (ТУ-9388-05-0049763-00) на наборы для индикации антител или антигена вируса ИНАН методами иммуноферментного анализа и Временное наставление по применению наборов, утвержденные Департаментом ветеринарии РФ 19.07.00 г.; Технические условия (ТУ- 9388-04-00497963-00) на тест-систему «Антиген - специфическая сыворотка для диагностики инфекционной анемии (ИНАН)» и Временное наставление по применению тест-системы, утвержденные Департаментом ветеринарии РФ 19.07.00 г.; Стандарт организации (№9337-011-938840-13) на

комплексную тест-систему ИФА для индикации антител или антигена вируса ИНАН и Инструкция по применению тест-системы ИФА, утвержденные директором ВНИТИБП 21.02.13; Стандарт организации (№9337-012-938840-13) на тест-систему РДП для диагностики ИНАН лошадей и Инструкция по применению тест-системы РДП, утвержденные директором ВНИТИБП 21.02.13.

Методические рекомендации: по культивированию хламидий штамма «Улетово -96», утвержденные директором ВНИТИБП 16.02.08; по получению специфической хламидийной сыворотки, утвержденные директором ВНИТИБП 20.01.04г.; по изготовлению эталонных серий специфических хламидийных антигена и сыворотки, утвержденные директором ВНИТИБП 24.01.09 г.

Методические положения: по изготовлению и контролю посевных материалов (Seed Lot System, S.L.S.) производственного штамма хламидий «Улетово-96-ВНИиТИБП», утв. РАСХН 25.10.2012; по оценке стабильности технологического процесса изготовления наборов для диагностики хламидиоза животных, утв. РАСХН 25.10.2012; по культивированию производственного штамма хламидий «Улетово-96-ВНИиТИБП», утв. РАСХН .2012; по изготовлению и контролю посевных материалов (Seed Lot System, S.L.S.) производственного штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ» культурального вируса ИНАН, утв. РАСХН 2012; по культивированию на культуре клеток эмбриона лошади вируса инфекционной анемии лошадей штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ», утв. РАСХН 2012; по применению статистических методов для оценки стабильности технологического процесса производства лекарственных средств для ветеринарии, утвержденные утв. РАСХН 2011 г.; по применению компьютерной программы Microsoft Office VISIO 2010 для построения технологических схем. утв. РАСХН 22.11.2012;

6. СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИ 6.1 Статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ

1. Крыжановская Е.В. Адсорбционные и адъювантные свойства хитозана/ Крыжановская Е.В., Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Шинкарев С.М., Люлькова Л.С., Фролова М.А., Бондарева Н.А., Гринь С.А., Хабаров В.Б.// Ветеринария и кормление.-2008. -№4 - С. 31-33

2. Крыжановская Е.В. Изучение влияния хитозана на микроорганизмы/ Крыжановская Е.В., Шинкарев С.М., Фролова М.А., Еремец Н.К., Люлькова Л.С., Албулов А.И., Рубан Е.А.// Ветеринария и кормление. - 2008. - №6. - С. 34-35

3. Неминущая Л.А. Роль доклинических испытаний в обеспечении качества лекарственных средств и биологически активных добавок к кормам для животных/ Неминущая Л.А., Еремец Н.К., Люлькова Л.С., Скотникова Т.А. Токарик Э.Ф., Бобровская И.В., Самуйленко А.Я// Ветеринарная медицина. - 2010. - №5 -6. - С. 14 -16

4. Скотникова Т.А. Управление рисками в производстве иммунобиологических ветеринарных препаратов/ Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Люлькова Л.С., Еремец Н.К., Бобровская И.В.. Самуйленко А.Я.// Ветеринарная медицина-2010.- №5 -6. -С.16 - 17

5. Еремец О.В. Проектный подход в обеспечении качества и безопасности лекарственных средств для животных/ Еремец О.В., Малышева М.А., Неминущая JI.A., Люлькова Л.С., Еремец Н.К., Скотникова Т.А// Ветеринария и кормление. Спец. выпуск журнала, приуроч. к Междун. науч. практич. конфер. молодых ученых ФГУ ВНИИЗЖ - 2010. - №5-6.-С.б0- 61

6. Люлькова Л.С. Тест-система ИФА для диагностики хламидиоза овец и крупного рогатого скота/Люлькова Л.С., Еремец В.И.. Ямникова С.С.// Ветеринария и кормление. Спец. выпуск журнала, приуроч. к Междунар. научпрактич. конфер. молодых ученых ФГУ ВНИИЗЖ -2010. - №5 -6. -С.

7. Самуйленко А.Я. Вопросы экологической безопасности и ресурсосбережения в биотехнологии производства и применения препаратов для ветеринарии/ Самуйленко А.Я., Скотникова Т.А., Неминущая JI.A., Беро ИЛ., Токарик Э.Ф., Еремец Н.К., Люлькова Л.С., Бобровская И.В.// Известия Самарского науч. центра PAH.-2011.-t.13. -№5(3). - С.178 - 180

8. Скотникова Т.А. Система менеджмента ХАССП для обеспечения качества иммунобиологических ветеринарных препаратов/Т.А. Скотникова, Л.А. Неминущая, Э.Ф. Токарик, Л.С. Люлькова, Н.К. Еремец, Н.И. Ким, К.Н. Царькова//Ветеринария и кормление. -2012. - №6.-С.Ю-11

9. Люлькова Л.С. Статистические методы оценки стабильности технологического процесса изготовления наборов для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК и РДСК/Л.С. Люлькова, Т.А. Скотникова, М.А. Малышева, Н.К. Еремец, А.Я. Самуйленко// Ветеринария и кормление. - 2012. - №6. - С. 12 - 15

10. Люлькова Л.С. Изучение термостабильности компонентов набора для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК и РДСК/ Л.С. Люлькова, Т.А. Скотникова, М.А. Малышева, Н.К. Еремец, А.Я. Самуйленко// Ветеринарная медицина. -20012.-№3-4.-С.10-12

11. Люлькова Л.С. Очистка препарата антигена культурального вируса инфекционной анемии /Л.С. Люлькова, АЛ. Самуйленко//Ветеринарный врач. - 2013. - №1. — С. 17 - 19

12. Люлькова Л.С. Изучение серологических, морфологических и некоторых физико-химических свойств культурального вируса инфекционной анемии лошадей / Л.С. Люлькова, А.Я. Самуйленко// Ветеринарный врач. - 2013. - №2. - С. 10 - 12

6.2 Патенты

13. Юров К.П., Токарик Э.Ф., Галактюк А.Е., Самуйленко А.Я., Люлькова Л.С., Пестова Г.В., Уласов В.И. Способ изготовления антигена из вируса инфекционной анемии лошадей и набор для индикации антител или антигена вируса инфекционной анемии лошадей. Патент РФ №21461150, приоритетот 10.03.00 г.

14. Матвеева И.Н., Кочиш И.И., Бондарева H.A., Кузнецова C.B., Еремец Н.К., Люлькова Л.С., Барковский И.А., Салов Д.А., Рахманина Е.В., Тиско P.C. Способ получения отрицательных референс-сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота. Патент РФ №2008132387/15, приоритет от 07.08.08 г.

15. Матвеева И.Н., Кочиш И.И., Бондарева H.A., Кузнецова C.B., Еремец Н.К., Люлькова Л.С., Барковский И.А., Салов Д.А., Рахманина Е.В. Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота. Патент РФ №2008132390/13, приоритет от 07.08.08 г.

63 Публикации в других изданиях

16. Люлькова Л.С. Сравнительная оценка иммунных сывороток, полученных разными методами// Теоретические и практические вопросы ветеринарии. Материалы республиканской конференции. Ветеринарные проблемы индустриального животноводства. Том 1. - Тарту. -1983,- С. 151-152

17. Люлькова Л.С. Влияние бычьего сывороточного альбумина на чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности, Москва. - 1985. - №1. - С. 12-15

18. Люлькова Л.С. Сравнительный анализ методов очистки гипериммунных сывороток /Люлькова Л.С., Малышева О.Н., Школьников Е.Э. Копылова Л.Г., Домнина Н.И., Кравцова

Л.А., Фидря Ю.Г.// Передовой научно-пронзводственный опыт в биологической промышленности. Москва. - 1987.- №2.- С.6-10

19. Люлькова Л .С. Получение компонентов набора для определения антигена культурального вируса инфекционной анемии лошадей иммуноферментным анализом/Люлькова Л.С., Токарик Б.И.// Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов. Москва. - 1989. - С.48-54

20. Люлькова Л.С. Получение очищенного препарата антигена кулыурального вируса ИНАН для иммунологической оценки уровня антигена и специфических антител в биологических жидкостях/ Люлькова Л.С., Токарик Б.И// Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов. Щелково-1997. - С.23-26

21. Люлькова Л.С. Получение иммунной сыворотки против антигена культурального вируса ИНАН для определения уровня антител в сыворотках крови лошадей методом ИФА/ Люлькова Л.С., Токарик Б.И// Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов. Щелково.-1997. - С.26-29

22. Люлькова Л.С. Метод иммуноферментного аналнза для индикации антигена вируса ИНАН// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, Щелково. -

2000.-С. 210-211

23. Люлькова Л.С. Метод иммуноферментного анализа для диагностики инфекционной анемии// Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 30-летию ВНИТИБП. Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, Щелково. - 2000.-С. 211-213

24. Люлькова Л.С. Выявление антител к Chlamydophila в сыворотках крови сельскохозяйственных животных/Люлькова Л.С., Самуйленко А.Я., Ямникова С.С.. Токарик Э.Ф., Школьников Е.Э., Белоусов В.И., Федякина И.Т// Всероссийская научно-практич. конф., посвященная 30-летию ВНИТИБП. Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, Щелково. - 2000. - С. 195-196

25. Люлькова Л.С. Разработка методики и техники получения хламидийной сыворотки от овец доноров/ Люлькова Л.С., Евдокимов А. А., Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Ямникова С.С.// Всероссийская научно-практич. конф., посвященная 30-летию ВНИТИБП. Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, Щелково. - 2000. - С. 151-155

26. Люлькова Л.С. Выявление антител против Chlamydophila в сыворотках крови овец и крупного рогатого скота в непрямом ИФА// Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 30-летию ВНИТИБП. Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, Щелково. - 2000. - С.179-183

27.Самуйленко А.Я. Диагностика хламидийной инфекции сельскохозяйственных животных/ Самуйленко А.Я., Ямникова С.С., Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Школьников Е.Э, Люлькова Л.С., Белоусов В.И.// Науковий вюник нацюнального аграрного ушверситету. - №36. - Кшв. -

2001.-С. 180-184

28. Люлькова Л.С. Инфекционная анемия: разработка диагностических тест-систем РДП и ИФА на основе антигена культурального вируса// Авторефер. дисс. канд. биолог, наук. Щелково, 2001

29. Люлькова Л.С. Методы иммуноферментного анализа для диагностики хламидийной инфекции// Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов. Щелково. -2001. - С.121-123

30. Люлькова Л.С. Тест-система ИФА для диагностики хламвдиоза овец и крупного рогатого скота/ Люлькова Л.С., Еремец В.И., Ямникова С.С.// Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов. Щелково. - 2003. - С. 113-115

31. Люлькова Л.С. Опытное производство наборов для диагностики хламндиоза сельскохозяйственных животных в РСК (РДСК)/ Люлькова Л.С. Еремец В.И., Самуйленко А .Я.// Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов. Щелково. - 2003. - С.118-120

32. Самуйленко А.Я., Получение высокоспецифичной положительной сыворотки для диагностики хламидиоза/ Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Люлькова Л.С., Евдокимов A.A., Ямникова С.С.// Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов. Щелково. - 2003.- С.115-117

33. Самуйленко А.Я., Возможности и ограничения серодиагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных/ Самуйленко А.Я., Ямникова С.С., Токарик Э.Ф., Еремец В.И., Люлькова Л.С., Школьников Е.Э.// Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов. Щелково. - 2003. - С. 183-185

34. Люлькова Л.С. Сравнительный анализ серологических методов диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных// Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов. Щелково. - 2003. - С. 111 -113

35. Люлькова Л.С. Тест-системы для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота/Люлькова Л.С., Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Щеликов С.И., Акунова Т.А., Ковалев В.Л.// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Мат. междунар. научно-практич. конф. молодых ученых. Щелково. - 2004. - С.133-137

36. Люлькова Л.С. Набор для диагностики орнитоза в РСК/. Люлькова Л.С. Самуйленко А.Я.,Ямникова С.С., Еремец В.И.// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Мат. междун. научно-практич. конф. Щелково.-2006,- С.123-125

37. Люлькова Л.С. Применение тест-систем ИФА для диагностики хламидиоза/ Люлькова Л.С., Самуйленко А.Я., Ямникова С.С., Еремец В.И.// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Мат. междунар. научно-практич. конф. Щелково. -2006.-С. 120-123

38. Люлькова Л.С. Диагностика хламидийной инфекции у сельскохозяйственных животных/ Люлькова Л.С., Еремец Н.К., Федякина И.Т., Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Белоусов В.И., Ямникова С.С.// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Мат. междун. науч.-практич. конф. Щелково.-2006.- С.262-265

39. Самуйленко А.Я., Современные биологические процессы и иммунобиологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов/ Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Еремец В.И., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Юиокина В.И., Люлькова Л.С., Кузнецов Д.П., Кузнецова C.B., Павленко B.C., Ломакина Т.А., Лнхашерстова C.B.// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Мат. междунар. науч.-практич. конф.

- Щелково. - 2007. - С.6 - 10

40. Люлькова Л.С. Стратегия борьбы с хламидиозом сельскохозяйственных животных/Люлькова Л.С., Еремец Н.К., Самуйленко А.Я.. Еремец В.И., Ямникова С.С.// Мат. междунар. научно-практич. конф. «Актуальные проблемы ветеринарной медицины». — Курск.

- 2008, С.247-249

41. Люлькова Л.С. Совершенствование тест-системы для диагностики инфекционной анемии лошадей/Люлькова Л.С., Еремец В.И., Самуйленко А.Я// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Мат. междунар. научно-практич. конф. Щелково. -2009.-С. 271-274

42. Люлькова Л.С. Разработка диагностических тест-систем РДП и ИФА на основе антигена культурального вируса ИНАН/ Люлькова Л.С., Токарик Б.И., Самуйленко А.Я.// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Мат. междунар. научно-практич. конф. Щелково. - 2009.- С. 34-42

43. Люлькова Л.С. Диагностика хламидиоза сельскохозяйственных животных серологическими методами/ Люлькова Л.С., Еремец Н.К., Киш Л.К., Лихашерстова C.B., Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Ямникова С.С.// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Мат. междунар. научно-практич. конф. Щелково.-2009.- С.42-49

44. Еремец В.И. Совершенствование и стандартизация тест -системы ИФА и РСК для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных и пушных зверей/ Еремец В.И., Люлькова Л.С., Еремец Н.К., Самуйленко А.Я., Голотенков Д.А.// Мат. междунар. науч.-практич. конф., посвящ. 80-ле-тию каф. анатомии и гистологии с-х животных, 110-летию со

дня рожд. проф. Н.И. Акаевского и 15-летию кинологического центра,- Сб. науч. тр.-Троицк:УГАВМ. -2009. - С.222 - 224

45. Самуйленко А.Я., Актуализация нормативных и информационно справочных документов по вопросам обеспечения безопасности и качества лекарственных средств для животных/ Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Токарик Э.Ф., Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Еремец Н.К., Люлькова Л.С., Бобровская И.В., Еремец О. В.// Ветеринарна медицина. М1жвщомч. Тематич. науковий зб1рник.-Випуск 94.-2010 р. Харгав - С.346 - 347

46. Люлькова Л.С. Инфекционная анемия: разработка диагностической тест-системы ИФА на основе антигена культурального вируса» Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации, Материалы Междунар. научно-практич. конференции 16-17 марта 2011 года, Покров 2011, стр.139-142

47. Люлькова Л.С. Разработка тест-системы ИФА для диагностики хламидийной инфекции/ Люлькова Л.С., Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Малышева М.А., Ямникова С.С,.//Мат. междунар. науч.-пракич. Конф. «Актуальные аспекты разработки, изготов ления, контроля качества и использования ветеринарных иммунобиологических препаратов на основе современных биотехнологий». - 30 мая -3 июня 2011 г. - АР Крым, Алушта. - 2011. - С. 148151

48. Самуйленко А.Я. Опыт создания и применения стандартных образцов предприятия для обеспечения и контроля качества иммунобиологических препаратов для ветеринарии/ Самуйленко А.Я., Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Люлькова Л.С., Еремец Н.К., Малышева М.А., Ким Н.И., Еремец О.В., Титова Е.И.// 11 Всероссийская научно-техническая конференция с международным участием «Стандартные образцы в измерениях и технологиях - Сборник трудов. - Российская Федерация, Екатеринбург, 12-17 сентября 2011 г. С.143 - 144

49. Люлькова Л.С. Опыт изготовления и применения наборов для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК и РДСК/Люлькова Л.С., Еремец Н.К., Скотникова Т.А., Лихашерстова C.B., Самуйленко А.Я., Еремец В.И.// Научные исследования - основа модернизации сельскохозяйственного производства.- Международная научно-практич. конф. 9-11 ноября 2011 г. -Тюмень. - С.42 - 44

50. Люлькова Л.С. Вопросы обеспечения качества лекарственных средств для животных на предприятиях агропромышленного комплекса/ Скотникова Т.А., Еремец Н.К., Неминущая Л.А., Люлькова Л.С., Токарик Э.Ф., Самуйленко А.Я., Еремец О.В., Ким Н.И., Бобровская И.В., Шубина Е.А.//Материалы междун.научно-практич. конференции ВНИИВВиМ 16-17 марта «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» Покров -2011. - С.257-261

51. Малышева М.А. Разработка тест-системы ИФА для диагностики хламидийной инфекции/Малышева М.А., Люлькова Л.С., Скотникова Т.А.//Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине. Материалы П-ой конференции молодых ученых. 16- 17мая 2012г.-Покров-С.103 - 107

52. Скотникова Т.А. Вопросы обеспечения качества иммунобиологических препаратов для ветеринарии/Скотникова Т.А., Еремец В.И., Неминущая Л.А., Люлькова Л.С., Еремец Н.К., Бобровская И.В.. Ким Н.И., Самуйленко А.Я. // Ветеринарная медицина, межвщомчий темат. науковий зб1рник. - Харив, 2012 г. - №96 - С.56 - 57 (Алушта, Май 2012)

53. Еремец Н.К. Обеспечение качества иммунологических препаратов для ветеринарии /Еремец Н.К., Самуйленко А.Я., Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Люлькова Л.С., Бобровская И.В., Провоторова О.В., Шубина Е.А.//Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» - Москва 20 -22 марта 2012 г. - С. 292 - 293

54. Люлькова Л.С. Оценка стабильности технологического процесса изготовления наборов для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК и РДСК / Люлькова Л.С., Скотникова Т.А., Малышева М.А., Еремец Н.К., Самуйленко А.Я.//Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК. Материалы

международной научно-практической практической конференции, 5-7 декабря 2012 г. -Щелково 2012-С. 66-71

55. Скотникова Т.А .Принципы ХАССП для обеспечения качества иммунобиологических ветеринарных препаратов/Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Люлькова Л.С., Еремец Н.К., Ким Н.И., Царькова К.Н.// Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК Материалы международной научно-практической практической конференции, 5-7 декабря 2012 г. - Щелково 2012 - С. 49 - 54

56. Люлькова Л.С. Обеспечение качества наборов для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РС и РДСК в соответствии с требованиями ГОСТ Р 52249-2009/Люлькова Л.С., Скотникова Т.А., Еремец Н.К., Малышева М.А., Еремец В.И.. Самуйленко А.Я.// Ветеринарна медицина. -Харьгав. - 2013. - випуск 97. - С. 528 - 529

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВГНКИ - Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов

ВИЭВ - Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

РАСХН - Российская академия сельскохозяйственных наук

ЩБК - Щелковский биокомбинат

Б.С.А. - бычий сывороточный альбумин

ВР - вспомогательные работы

Д - дальтон

ЗС - защитная среда

ИА — инфекционная активность

ИАЦ — информационно-аналитический центр

ИНАН — инфекционная анемия

ИФА - иммуноферментный анализ

КТ — контрольная точка

ККТ - критическая контрольная точка

КК - культура клеток

КК ЭЛ - культура клеток эмбриона лошади КЭ — куриные эмбрионы

КК ФЭК - культура клеток фибробластов эмбрионов кур КРС - крупнорогатый скот

ЛРЭМ - лабораторный эталонный рабочий материал

ЛПС - липополисахарид

ЛС - лекарственное средство

МПА - мясо-пептонный агар

МППБ — мясо-пептонный печеночный бульон

НД — нормативная документация

НАФ — неполный адъювант Фрейнда

НИФ - непрямая иммунофлуоресценция

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ПР - подготовительные работы

ПЦР-полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПТ - промежуточное тельце

ПААГ - полиакриламидный гель

ПР - подготовительные работы

ПХ - пероксидаза из хрена

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

РГА — реакция гемагглютинации

РДП - реакция диффузионной преципитации

РСК - реакция связывания комплемента

РДСК — реакция длительного связывания комплемента

РТ - ретикулярное тельце

СТО - стандарт организации

ТУ — технические условия

ТП - основные технологические процессы

ТР - технологический регламент

ФГМ - 0,25% раствор ферментативного гидролизата мышечных белков

ФР - физиологический раствор

ЭТ - элементарное тельце

GLP - надлежащая лабораторная практика

GMP - надлежащая производственная практика

GCP -качественная клиническая практика

Ig G - иммуноглобулин G

M.s. - Master seed, главный посевной материал

P.s. - Production seed, производственный посевной материал

SPF (specific pathogen free) - свободный от специфических патогенов

S.l.s. - Seed lot system, система посевных материалов

W.s. - Working seed, рабочий посевной материал

Подписано в печать 20.11.2013г.

Усл.пл. - 2.5 Заказ №17755 Тираж: 100 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Люлькова, Лариса Сергеевна, Щёлково

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ

ПРОМЫШЛЕННОСТИ

05201450105

ЛЮЛЬКОВА Лариса Сергеевна

ПРОМЫШЛЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ НАБОРОВ (ТЕСТ-СИСТЕМ) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА ЖИВОТНЫХ (РСК, ИФА) И ИНАН ЛОШАДЕЙ (РДП, ИФА)

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

/

академик РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор, лауреат Государственной премии РФ, Заслуженный деятель науки РФ

Анатолий Яковлевич Самуйленко

Щелково - 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПК - агропромышленный комплекс

ВГНКИ - Всероссийский государственный центр качества и стандартизации

лекарственных средств для животных и кормов

ВИЭВ - Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов

ФГБУ ВНИИЗЖ - ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

РАСХН - Российская академия сельскохозяйственных наук

ЩБК - Щелковский биокомбинат

Ат - антитело

Аг - антиген

Б.С.А. - бычий сывороточный альбумин ВСМ - вируссодержащий материал В/б - внутрибрюшинно ВР - вспомогательные работы кД - килодальтон

ЖОКЭ - желточные оболочки куриных эмбрионов ЗС - защитная среда

ЗФР - забуференный фосфатами физиологический раствор

ИА - инфекционная активность

ИАЦ - информационно-аналитический центр

ИНАН - инфекционная анемия

ИФА - иммуноферментный анализ

КЛЛ - культура лейкоцитов лошади

КОЕ - колониеобразующие единицы

Кт - константа скорости инактивации при температуре, Т °С КТ - контрольная точка

ККТ - критическая контрольная точка КК - культура клеток ККЭЛ - культура клеток эмбриона лошади КЭ - куриные эмбрионы

КК ФЭК - культура клеток фибробластов эмбрионов кур КРС - крупнорогатый скот

ЛРЭМ - лабораторный рабочий эталонный материал

ЛПС - липополисахарид

ЛС - лекарственное средство

МПА - мясо-пептонный агар

МППБ - мясо-пептонный печеночный бульон

НД - нормативная документация

НИФ - непрямая иммунофлуоресценция

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ПИФ - прямая иммунофлуоресценции

ПТ - промежуточное тельце

ПААГ - полиакриламидный гель

ПР - подготовительные работы

ПХ - пероксидаза из хрена

ПЦР-полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

РГА - реакция гемагглютинации

РИГА - реакция непрямой гемагглютинации

РДП - реакция диффузионной преципитации

РСК - реакция связывания комплемента

РДСК - реакция длительного связывания комплемента

РТ - ретикулярное тельце

СТО - стандарт организации

ТУ - технические условия

ТП - основные технологические процессы

TP - технологический регламент

ФГМ - 0,25% раствор ферментативногогидролизата мышечных белков ФР - физиологический раствор ЭТ - элементарное тельце ЦПЭ - цитопатический эффект

ELISA - энзим-связанный иммуносорбентный анализ

GLP - надлежащая лабораторная практика

GMP - надлежащая производственная практика

GCP -качественная клиническая практика

IgG - иммуноглобулин класса G

IgA - иммуноглобулин класса А

IgM - иммуноглобулин класса M

M.s. - Master seed, главный посевной материал

P.s. - Production seed, производственный посевной материал

SPF (specific pathogen free) - свободный от специфических патогенов

S.l.s. - Seed lot system, система посевных материалов

W.s. - Working seed, рабочий посевной материал

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

1 ВВЕДЕНИЕ........................................................................11

1.1 Актуальность проблемы........................................................11

1.2 Обоснование выбора объекта исследований...............................12

1.3 Цели и задачи исследований...................................................15

1.4 Научная новизна результатов исследований...............................16

1.5 Теоретическая и практическая ценность работы..........................18

1.6 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту..............................................................................19

1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности..........20

1.8 Апробация результатов исследования........................................20

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................21

2.1 Биотехнология изготовления диагностических тест-систем.............21

2.2 Методы диагностики инфекционных заболеваний........................25

2.2.1 Микробиологический метод....................................................25

2.2.2 Цитологический метод............................................................25

2.2.3 Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ)..............................26

2. 2.4 Метод непрямой иммунофлюоресценции (НИФ)..........................26

2.2.5 Молекулярно-генетический анализ.............................................26

2.2.6 Иммуноферментный анализ.....................................................30

2.2.7 Серологические методы диагностики.........................................39

2.3 ХЛАМИДИИ: ТАКСОНОМИЯ, ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА........................................................................43

2.3.1 Историческая справка.............................................................43

2.3.2 Таксономия хламидий.............................................................45

2.3.3 Биологические свойства хламидий..............................................52

2.3.4 Антигенная структура хламидий.................................................57

2.4.1 ХЛАМИДИОЗЫ ЖИВОТНЫХ...................................................60

2.4.1 Хламидиоз овец и коз............................................................62

2.4.2 Хламидиоз крупного рогатого скота..........................................64

2.4.3 Хламидиоз свиней..................................................................68

2.4.4 Хламидиоз кошек.................................................................71

2.5 ДИАГНОСТИКА ХЛАМИДИОЗОВ..........................................73

2.5.1 Лабораторная диагностика хламидиозов....................................73

2.5.2 Микробиологический метод......................................................75

2.5.3 Цитологический метод...........................................................81

2.5.4 Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ).............................81

2.5.5 Метод непрямой иммунофлюоресценции (НИФ)..........................82

2.5.6 Молекулярно-генетический анализ .........................................83

2.5.7 Иммуноферментный анализ (ИФА)..........................................84

2.5.8 Серологические методы диагностики хл амидиозов......................87

2.5.8.1 Реакция связывания комплемента (РСК, РДСК)............................88

2.5.8.2 Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)...............................92

2.6 ИНФЕКЦИОННАЯ АНЕМИЯ (ИНАН) ЛОШАДЕЙ.....................94

2.6.1 Этиология инфекционной анемии............................................94

2.6.2 Биологические свойства вируса ИНАН.....................................95

2.6.3 Структура и антигенные свойства вируса ИНАН..........................97

2.6.4 Культивирование вируса ИНАН...............................................98

2.6.5 Диагностика ИНАН.............................................................100

2.7 ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ..................................................................109

2.7.1 Стабильность иммунобиологических препаратов для животных.....111

2.7.2 Оценка стабильности иммунобиологических препаратов.............113

2.7.3 Лабораторные эталонные рабочие образцы.................................115

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ............................117

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................125

3.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................125

3.1.1 Материалы........................................................................125

3.1.2 Методы............................................................................127

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.........................................139

3.2.1 Обоснование выбора производственного штамма хламидий для изготовления наборов (тест-систем) РСК и ИФА.......................139

3.2.1.1 Индикация хламидий с помощью световой микроскопии............139

3.2.1.2 Индикация хламидий методом иммунофлюоресценции................140

3.2.1.3 Электронно-микроскопические исследования ультраструктуры хламидий........................................................................141

3.2.1.4 Патогенная активность хламидий исследуемого штамма.............142

3.2.1.5 Инфекционная активность хламидий......................................142

3.2.1.6 Антигенные свойства хламидий............................................143

3.2.1.7 Молекулярно-генетический анализ........................................143

3.2.1.8 Результаты исследования иммунобиологических свойств хламидий штамма «Улетово-96-ВНИиТИБП».........................149

3.2.2 Обоснование выбора производственного штамма культурального вируса ИНАН..............................................152

3.2.2.1 Электронномикроскопическое исследование инфицированной вирусом ИНАН ККЭЛ.................................152

3.2.2.2 Идентификация вируса ИНАН непрямым иммунофлюоресцентным методом........................................153

3.2.2.3 Индикация культурального вируса ИНАН на КЛЛ....................154

3.2.2.4 Инфекционная активность культурального вируса ИНАН.............154

3.2.2.5 Определение иммунологической идентичности антигенов вируса ИНАН культурального и из ткани селезенки

жеребенка........................................................................156

3.3 Изготовление и контроль посевного материала........................158

3.3.1 Изготовление и контроль посевного материала хламидий.........158

3.3.2 Изготовление и контроль посевного материала культурального

вируса ИНАН...................................................................163

3.4 Технологический процесс изготовления хламидийного

антигена..........................................................................164

3.4.1 Изготовление хамидийного антигена из ЖОКЭ........................164

3.4.2 Изготовление контрольного антигена из ЖОКЭ........................171

3.4.3 Получение хламидийного антигена из среды культивирования клеток ФЭК, McCoy.........................................................173

3.4.4. Технологический процесс получения контрольного

(отрицательного) антигена из среды культивирования клеток ФЭК, McCoy....................................................................177

3.5 Технологический процесс получения антигена культурального вируса ИНАН..................................................................17 8

3.5.1 Технологический процесс получения преципитирующего антигена культурального вируса ИНАН.................................178

3.5.2 Технологический процесс получения контрольного

(отрицательного) антигена культурального вируса ИНАН..........183

3.6 Технологический процесс получения иммунных

сывороток........................................................................184

3.6.1 Технологический процесс получения хламидийной

сыворотки.........................................................................184

3.6.2 Технологический процесс получения контрольной (отрицательной) сыворотки..................................................191

3.6.3 Технологический процесс получения специфической

к вирусу ИНАН сыворотки лошадей.......................................194

3.6.4 Технологический процесс получения контрольной (отрицательной) к вирусу ИНАН сыворотки............................197

3.7 Сублимационное высушивание иммунобиологических препаратов.......................................................................198

3.7.1 Сублимационное высушивание компонентов наборов

(тест-систем) для диагностики хламидиоза животных................198

3.7.2 Сублимационное высушивание компонентов

тест-систем для диагностики ИНАН лошадей...........................199

3.8 Конструирование наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза животных в РСК, РДСК и ИНАН лошадей в РДП..............................................................................200

3.8 Конструирование набора для диагностики хламидиоза животных

в РСК и РДСК...................................................................200

3.8.2 Конструирование тест-системы РДП на основе антигена культурального вируса для диагностики инфекционной анемии.............................................................................201

3.9 Разработка тест-систем ИФА для определения специфических антител в сыворотках крови овец, КРС и лошади

и индикации антигена.........................................................206

3.9.1 Синтез антивидовых иммунопероксидазных конъюгатов

анти- ^О-ПХ.....................................................................207

3.9.1.1 Получение препарата из сывороток крови барана, КРС

и лошади.........................................................................207

3.9.1.2 Получение антивидовых сывороток крови...............................210

3.9.1.3 Фракционирование антител из антивидовой сыворотки аффинной хроматографией..................................................211

3.9.1.4 Получение антивидовых иммунопероксидазных конъюгатов анти-^О-ПХ..................................................................214

3.9.1.5 Сублимационное высушивание антивидовых иммунопероксидазных конъюгатов.......................................217

3.9.2 Определение параметров и условий проведения ИФА................221

3.9.2.1 Определение условий иммобилизации антигена на

полистироловые планшеты...................................................222

3.9.3. Разработка непрямого ИФА для определения титра антител

в исследуемых сыворотках в одном разведении.........................226

3.9.4 Учет результатов ИФА..........................................................227

3.9.5 Состав тест-систем ИФА для определения антител......................228

3.9.6 Исследования сывороток овец с применением сконструированных тест-систем ИФА.....................................229

3.9.7 Исследования сывороток КРС с применением сконструированных тест-систем ИФА.....................................230

3.9.8 Тест-системы ИФА для индикации хламидийного антигена.........231

3.10 Тест-системы ИФА для определения антител к вирусу

ИНАН и индикации антигена вируса ИНАН..............................233

3.11 Опытное производство наборов для диагностики

хламидиоза сельскохозяйственных животных...........................235

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..........................................249

5 ВЫВОДЫ........................................................................268

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.......................................272

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................275

8 ПРИЛОЖЕНИЯ.................................................................332

8.1 Приложение Справки о депонировании штаммов, паспорта на штаммы...........................................................................333

8.2 Приложение Технологические регламенты..............................341

8.3 Приложение Технические условия.........................................348

8.4. Приложение СТО (стандарт организации)..............................352

8.5 Приложение Инструкции.....................................................368

8.6 Приложение Временное наставление.....................................375

8.7 Приложение Методические положения..................................378

8.8 Приложение Акты............................................................391

8.9 Приложение Патенты.........................................................397

8.10 Приложение 10 Награды......................................................401

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность проблемы. Для успешного лечения и своевременной профилактики инфекционных заболеваний животных необходим ранний и точный диагноз, что возможно при использовании диагностических тест-систем с высокой специфичностью и чувствительностью. Одной из актуальных задач, стоящих перед биотехнологией РФ, является совершенствование традиционных (РСК, РДП, РИГА, РГА) и разработка новых (ПЦР, ЛЦР, ДНК-гибридизация, ИФА и другие) диагностических тест-систем [Обухов И.Л., 1998; Самуйленко с соавт., 2003; Цыбанов С.Ж. с соавт., 2007; Мищенко с соавт., 2008; Гулюкин М.И., 2000-2012; Мельник Н.В., 2012].

Достоверность результатов серологической диагностики зависит от эффективности и качества тест-систем, то есть активности и специфичности компонентов реакции - специфических антигена и сыворотки, от параметров и условий проведения анализа, которые определяются экспериментально для каждой пары антиген-антитело. Поэтому необходимо использовать современные методы фракционирования, очистки и концентрирования вирусных и бактериальных антигенов; способы получения высокоактивных специфических сывороток.

Методы ИФА применяют для диагностики, мониторинга заболевания, своевременного и обоснованного прогнозирования возникновения эпизоотии среди животных. Решением МЭБ иммуноферментный анализ признан референс-тестом, результаты которого определяются в основном природой и свойствами применяемой пары антиген-антитело. Поэтому при работе с каждым новым объектом возникает необходимость изучения параметров проведения иммуноферментного анализа, оптимальных для данного микроорганизма (антигена). Высокая разрешающая способность методов ИФА обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки

компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих результаты анализа.

В связи с вступлением России в ВТО перед производителями иммунобиологических препаратов стоит задача повышения их эффективности и качества. Одним из решений этой проблемы является внедрение элементов менеджмента качества (ГОСТ Р ИСО 9001-2008) и Правил GMP (ГОСТ Р 52249-2009) в технологию производства, а именно: гармонизация технологического процесса производства и контроля с международными требованиями; обеспечение стабильности имунобиологических препаратов и технологического процесса их изготовления; проектный подход в обеспечении качества и безопасности иммунобиологических препаратов.

Все изложенное выше явились основополагающими в определении выбора темы диссертационной работы.

1.2 Обоснование выбора объектов исследования. По данным ИАЦ Управления Ветнадзора (ФГУ ВНИИЗЖ) хламидиоз сельскохозяйственных животных и ИНАН лошадей входят в перечень 20 нозологических единиц, вносящих основной вклад (80% и более) в заболеваемость разных видов животных.

1.2.1 Хламидиозы сельскохозяйственных животных, методы диагностики.

Значительный вклад в изучение хламидиозов внесли отечественные ученые: Х.З. Гаффаров, В.Н. Сюрин, И.И. Терских, Ю.Д. Караваев, Н.И. Налетов, Р.Х. Хамадеев, А.З. Равилов, И.Л. Обухов и другие.

Хламидиозы - инфекционные заболевания, вызываемые облигатными внутриклеточными микроорганизмами семейства Chlamydiaceae [Everett K.D.E., 1999; Эйделыптейн И.А., 1999; Ямникова С.С. с соавт., 2000; Самуйленко А.Я. с соавт., 2003]. Хламидиозы относятся к зооантропонозам, проявляют природную очаговость, характеризуются широким повсеместным распространен�