Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Инфекционная анемия: разработка диагностических тест-систем РДП и ИФА на основе антигена культурального вируса

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Люлькова, Лариса Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус инфекционной анемии.

1.1.1. Эпизоотология инфекционной анемии лошадей

1.1.2. Изучение вируса ИНАН in vitro и in vivo

1.1.3. Морфология и физико-химические свойства вируса ИНАН.

1.1.4. Структура и антигенные свойства вируса ИНАН.

1.1.5. Культивирование вируса инфекционной анемии.

1.1.6. Серологическая диагностика инфекционной анемии.

1.2. Иммуноферментный анализ

1.2.1. Общая характеристика ИФА.

1.2.2. Гетерогенный (твердофазный) ИФА.

1.2.3. Классификация методов гетерогенного ИФА.

1.2.4. Методы получения иммуноферментных конъюгатов.

1.2.5. Выбор субстрата для фермента-маркера и интерпретация результатов иммуноферментного анализа.

1.2.6. Применение методов ИФА для определения специфических антител и вируса (р26 Аг) с целью диагностики инфекционной анемии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Инфекционная анемия: разработка диагностических тест-систем РДП и ИФА на основе антигена культурального вируса"

Актуальность проблемы. Инфекционная анемия (ИНАН) лошадей до настоящего времени стоит в ряду важнейших теоретических и практических проблем ветеринарной вирусологии. Согласно принятой классификации возбудителем заболевания является вирус подсемейства Lentivirus семейства Retroviridae (45, 57, 180).

Болезнь характеризуется разнообразием форм (острая, подострая, хроническая, латентная, бессимптомная) и течения, а также неадекватностью иммунологического ответа организма на введение вируса, поэтому трудно диагностируется (126, 131,179,180, 244, 246, 247).

При вспышке или подозрении на заболевание животные подлежат выбраковке из-за отсутствия специфических средств лечения и профилактики ИНАН. Диагностика ИНАН является единственно надежным способом контроля этого заболевания. При бессимптомной форме болезни для установления точного диагноза ставят биопробу на жеребятах, результаты которой обязательно подтверждают исследованиями сыворотки крови больных животных в реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаровом геле. Результаты параллельных исследований, как правило, совпадают, однако у отдельных лошадей биопроба оказывается отрицательной ввиду циклического снижения титра вируса в крови (18, 34, 85, 93, 137, 138, 141, 144, 205).

РДП до настоящего времени является наиболее точным и надежным методом специфической диагностики ИНАН, так как позволяет обнаруживать вирусспецифические антитела в крови лошадей, инфицированных вирусом различающихся штаммов, клонов и изолятов в начале и на протяжении всей болезни (35, 37,44,45, 52, 53, 54, 85,91,93,177, 179).

На основе выявления лошадей - вирусоносителей с помощью РДП во многих странах мира разработаны и успешно претворены в жизнь Программы по ликвидации ИНАН (180, 194, 195). В нашей стране РДП официально принята для диагностики ИНАН и выпускается тест-система «Антиген - антисыворотка для диагностики инфекционной анемии в реакции диффузионной преципитации (РДП)», в состав которой входит специфический преципи-тирующий антиген из ткани селезенки экспериментально инфицированной вирусом лошади.

Препарат антигена - высокоспецифичен, однако для его производства требуется большое количество лошадей, что противоречит международным рекомендациям, изложенным в Директиве ЕЭС по защите животных, используемых в экспериментальных и научных целях (86/609/ЕЭС, 1986 г.), и приводит к значительным материальным затратам, к снижению стандартности препарата из-за большого разнообразия сырья и не исключает вероятности заболевания людей, контактирующих с инфицированными животными (44, 45,112).

Преципитирующие (р26) антигены из ткани селезенки и культурально-го вируса - иммунологически идентичны, поэтому в настоящее время во многих странах диагностический препарат антигена изготавливают из куль-турального вируса, что позволяет производить препарат со стандартными свойствами и в достаточном количестве.

РДП - высокоспецифичный метод лабораторной диагностики ИНАН, однако наряду со своими достоинствами, имеет относительно низкую чувствительность (180, 222, 223).

Новый метод диагностики ИНАН - иммуноферментный анализ основан на выявлении вирусспецифических антител в сыворотке крови больных лошадей и имеет высокую чувствительность и специфичность (63, 216, 221, 239). С 1994 г. в Японии, США и Канаде иммуноферментный анализ применяется параллельно с РДП для диагностики инфекционной анемии, а также для массового скрининга лошадей, находящихся в карантине (97, 128, 180, 191). Выявление вирусного антигена и специфических антител на ранних стадиях заболевания животных или при латентном вирусоносительстве в условиях реконваленсценции значительно повышает диагностическую ценность проведенных обследований.

Таким образом, разработка тест-систем ИФА для определения антител с целью диагностики ИНАН и индикации антигена (р26) в процессе культивирования, а также замена антигена из ткани селезенки лошади на культу-ральный для диагностической тест-системы РДП представляется своевременной и обоснованной.

Цель и задачи исследования

Цель работы - разработать диагностические тест-системы РДП и ИФА на основе группоспецифического антигена (р26), полученного из очищенного и концентрированного культурального вируса ИНАН штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ»

В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:

- разработать схему получения очищенного и концентрированного вируса ИНАН штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ», репродуцированного в культуре клеток эмбриона лошади (ЬСКЭЛ);

- изучить серологические, морфологические и некоторые физико-химические свойства культурального вируса ИНАН;

- разработать на основе антигена культурального вируса тест-систему РДП для диагностики инфекционной анемии;

- разработать на основе антигена культурального вируса ИНАН тест-системы ИФА для определения специфических антител и индикации вирусного антигена.

Научная новизна работы:

- впервые изучены серологические, морфологические и некоторые физико-химические свойства культурального вируса ИНАН, штамм «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ». Штамм депонирован 27.08.99 г. в коллекции микроорганизмов ВГНКИ, как Retroviridae «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ» в качестве производственного для изготовления антигена культурального вируса инфекционной анемии лошадей.

- на основе антигена культурального вируса ИНАН разработана тест-система «Антиген - специфическая сыворотка для диагностики инфекционной анемии (ИНАН) лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаровом геле»;

- впервые в РФ разработана технология изготовления тест-систем для индикации антител или антигена вируса ИНАН методами иммунофермент-ного анализа.

10.03.00 г. получен Патент РФ на изобретение № 2146150 «Способ изготовления антигена из вируса инфекционной анемии лошадей и набор для индикации антител или антигена вируса инфекционной анемии лошадей».

1.4. Практическая значимость

По результатам исследований разработаны:

- Паспорт производственного культурального вируса штамма «3-К-ВНИиТИБП - ВИЭВ»;

- Технологический регламент изготовления и контроля набора компонентов для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации;

- Технологический регламент изготовления и контроля «Наборов для индикации антител или антигена вируса ИНАН методами иммуноферментного анализа»;

- Технические условия (ТУ 9388-05-004979-68-00) на наборы для индикации антител или антигена вируса ИНАН методами иммуноферментного анализа и Временное наставление по применению наборов, утв. Департаментом ветеринарии РФ 19.07.00 г.;

- Технические условия (ТУ 9388-04-004979-00) на тест-систему «Антиген -специфическая сыворотка для диагностики инфекционной анемии (ИНАН) лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаровом геле» и Временное наставление по применению тест-системы, утв. Департаментом ветеринарии РФ 19.07.00 г.

1.1.1. Этиология инфекционной анемии лошадей х

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Люлькова, Лариса Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

5.1. Разработана схема получения очищенного и концентрированного препарата антигена (р26) культурального вируса ИНАН для постановки:

- РДП, включающая осветление (центрифугированием при 250С^ в течение 30 мин) и концентрирование (ультрафильтрацией через ядерные мембранные фильтры);

- ИФА, включающая дополнительно к выше перечисленным этапам, очистку ионообменной хроматографией через ДЭАЭ- Тоуреаг1 НМ/'-бО или центрифугированием в градиенте (15% - 55%) плотности сахарозы или удалением балластных белков с помощью аффинной хроматографии на активированной ВгС№сахарозе-4В.

5.2. Использование предложенной схемы позволяет получить высокоактивный и специфический вирус (р26 Аг) ИНАН: препарат очищен по белку на 87,6% - 99,8% и имел титр в РДП 1:8 - 1:64 и в ИФА — 1:512 — 1:2048.

5.3. При комиссионной проверке свойств штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ» культурального вируса ИНАН показано, что по морфологии вирусных частиц, морфогенезу в клетках культуры тканей эмбриона лошади, по своим серологическим и физико-химическим свойствам вирус относится к семейству 11е1;гоутс1ае и обладает биологическими свойствами, соответствующими требованиям к производственным штаммам, используемым для производства диагностических препаратов.

5.4. На основе антигена (р26) культурального вируса ИНАН разработана тест-система «Антиген - специфическая сыворотка для диагностики инфекционной анемии лошадей (ИНАН) в реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаровом геле». Установлена 100% корреляция между результатами РДП, полученными при испытании тест-систем на основе культурального и тканевого антигенов. Подтверждена высокая специфичность разработанной тест-системы отсутствием перекрестной реакции с сыворотками крови здоровых лошадей.

5.5. Замена антигена из ткани селезенки на антиген культурального вируса обеспечивает следующие преимущества при производстве препарата:

- отказ от использования животных;

- уменьшение производственных затрат;

- возможность получения антигена (р26) в необходимых количествах;

- стандартизация препарата по активности и специфичности;

- экологическая безопасность для персонала и окружающей среды.

5.6. На основе антигена (р26) культурального вируса ИНАН разработана тест-система ИФА для определения вирусспецифических антител в сыворотках крови лошадей. Установлена корреляция между результатами, полученными при испытании тест-систем РДП и ИФА. Подтверждена высокая специфичность разработанной тест-системы отсутствием перекрестной реакции с сыворотками крови здоровых лошадей. Преимуществом метода ИФА является его более высокая чувствительность - в 500 раз. Разработанная тест-система для определения вирус-специфических антител может быть рекомендована для экспресс-диагностики инфекционной анемии и массового обследования лошадей.

5.7. На основе антигена (р26) культурального вируса ИНАН разработана тест-система ИФА для индикации антигена в среде культивирования инфицированных клеток эмбриона лошади. При комиссионных испытаниях установлено, что в средах культивирования инфицированных вирусом клеток методом модифицированного конкурентного ИФА антиген может быть определен: почки - на 12 день культивирования; кожи - на 10 день; мышцы - на 12 день. Антиген не был определен в средах культивирования, не инфицированных вирусом ККЭЛ, что подтверждает высокую специфичность разработанной тест-системы ИФА. Преимуществом метода ИФА является его более высокая, в сравнении с РДП, чувствительность - в 30 раз. Разработанная тест-система ИФА может быть рекомендована для индикации и контроля репродукции вируса (р26 Аг) в процессе культивирования.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

6.1. Вирус штамма «ЗК-ВНИиТИБП-ВИЭВ» рекомендован для производства диагностического препарата антигена культурального вируса ИНАН.

6.2. Тест-система «Антиген - специфическая сыворотка для диагностики инфекционной анемии лошадей (ИНАН) в реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаровом геле» рекомендована для включения в схему лабораторных исследований с целью диагностики заболевания.

6.3. Тест-система ИФА для определения вирусспецифических антител может быть рекомендована для экспресс-диагностики инфекционной анемии и массового обследования лошадей.

6.4. Тест-система ИФА для определения антигена может быть рекомендована для индикации и контроля репродукции вируса (р26 Аг) в процессе культивирования.

Заключение

Общепринятым методом лабораторной диагностики инфекционной анемии является реакция диффузионной преципитации (РДП) и геле агара (88, 89, 90). В РДП вирусспецифические преципитирующие антитела в сыворотке крови выявляются на 14-60 день после заражения лошадей, что в ряде случаев делает возможным диагностику ИНАН только на 2-3 месяце болезни (45, 56, 180, 223). Одним из недостатков РДП как диагностической тест-системы является относительно низкая чувствительность.

При диагностике вирусных и бактериальных инфекций в ветеринарии все более широкое применение находят такие современные методы, как молекулярная гибридизация, полимеразная цепная реакция и иммунофермент-ный анализ. Индикация антигенов и определение уровня специфических антител в сыворотке крови животных с помощью методов ИФА при оптимальном соотношении «себестоимость-чувствительность» остается действенным инструментом в ветеринарной практике. Возможность визуального учета реакций ИФА делает его доступным для лабораторий любого класса. Решением МЭБ иммуноферментный анализ признан референс-тестом, результаты которого определяются в основном природой и свойствами применяемой пары антиген-антитело. Поэтому при работе с каждым новым объектом возникает необходимость изучения параметров проведения иммуноферментного анализа, оптимальных для данного вируса (антигена). Высокая разрешающая способность методов ИФА обусловлена, главным образом, природой лиган-да, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих результаты анализа.

Таким образом, очистка и концентрирование вирусов, получение высокоактивных и специфичных иммунных сывороток и иммуноферментного конъюгата является необходимым условием при изготовлении диагностических тест-систем.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в лаборатории разработки промышленной технологии изготовления диагностических препаратов Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП) РАСХН в соответствии с планом НИР по темам: «Разработать и внедрить технологию изготовления культурального антигена для РДП при ИНАН» и «Индикация антител и контроль репродукции вируса ИНАН в культуре клеток лошади методами ИФА» (задание 0.сх.63.05, разделы 05.01Г и 3.2Т.1, № гос.регистрации 01.86.0031244, инв. № 02.9.00.030326); «Разработать и освоить производство диагностикумов заразных болезней животных на основе современных методов» (№ гос.регистрации 01.9.70004356, инв. № 02.20.0005657).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Вирус. Штамм «3» выделен от больного ИНАН жеребенка Юро-вым К.П. в Запорожье в 1967 г. Во ВНИТИБП вирус адаптирован к культуре лейкоцитов лошади (30 пассажей), культуре клеток почки эмбриона лошади (7 пассажей) и использован в качестве культурального под названием «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ».

2.2. Культура клеток и среды. Для репродукции вируса ИНАН применяли культуры клеток кожи, почки, мышцы эмбриона лошади.

Первично-трипсинизированнную культуру из органов и тканей эмбриона лошади получали общепринятыми методами (14). Выращивание культуры клеток проводили при (36-37)°С в стационарных условиях в 50 см3

3 2 и 1500 см флаконах с площадью поверхности соответственно 20 см и 300см2.

2.3. Питательные среды и растворы:

- диспергирующие растворы трипсина (0,25%) и версена (0,02%) (Дифко, США);

- среды ИГЛА, 199, ГЛАХ и ГЛАЭ, ФГМ (0,25% раствор ферментативного гидролизата мышечных белков), изготовленные во ВНИТИБП, ГЩБК, МНИИВПидр.;

- сыворотка крови крупного рогатого скота (КРС) Московского, Киевского, Энгельского мясокомбинатов, ГЩБК;

- диметилсульфоксид (ДМСО) различных марок;

- гепарин стандартный Московского эндокринного завода;

•у

- антибиотики пенициллин и стрептомицин в концентрации 100 ЕД/см и 100 мкг/см , соответственно.

2.4. Защитная среда для криоконсереироеания:

- ростовая среда - 50%;

- сыворотка крови крупного рогатого скота - 40%;

- ДМСО-10% (43).

2.5. Культивирование вируса

Для инфицирования клеток использовали вирус ИНАН штамма «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ».

Перед заражением из флаконов с полным монослоем клеток сливали ростовую среду и заменяли ее вируссодержащей жидкостью. После внесения вируса осуществляли его контакт с монослоем клеток в течение 1,5-2,0 ч при температуре (36-37)°С. После адсорбции инфицирующую жидкость заменяли на поддерживающую среду, содержащую 2% сыворотки крови КРС. Культивирование проводили при (36-37)°С, меняя поддерживающую среду один раз в 5 - 7 дней (38, 39, 49).

2.6. Использованные в экспериментах животные

2.6.1. Жеребят в возрасте 8-18 месяцев, проверенных на отсутствие инфекционных, кровепаразитарных и инвазионных заболеваний использовали для определения инфекционной активности (биопробы) культурального вируса.

После заражения за жеребятами вели ежедневные клинические наблюдения, а гематологические исследования проводили не реже одного раза в семь дней. Работа проводилась совместно с ГЩБК.

2.6.2. Здоровым лошадям в возрасте 2-5 лет, проверенных на отсутствие инфекционных, кровепаразитарных и инвазионных заболеваний, проводили инокуляцию вируса с целью получения иммунной сыворотки.

Беспородных кроликов-самцов весом 2,0-2,5 кг иммунизировали белками сыворотки крови КРС.

Баранов 8-9 месяцев использовали для получения антивидовой сыворотки к IgG лошади.

Все животные перед иммунизацией были выдержаны в карантине в течение 30 дней.

2.7. Схемы иммунизации

2.7.1. Заражение лошадей проводили путем подкожного введения л средняя треть шеи) 1 см освеженного вируса. Наблюдение за животными вели путем ежедневной термометрии, клинических осмотров и один раз в неделю - гематологических исследований. Через 7-14 дней после инокуляции 2 вируса у лошадей брали пробы крови (15-20 см ) на исследования по определению активности и специфичности в РДП и ИФА. Для получения специфических сывороток крововзятия проводили (только в безлихорадочные периоды) через 6-8 недель при титре антител не ниже 1:4. При титре антител ниже допустимых норм (1:4) проводили повторное введение вируса с последующим контролем сыворотки.

Работа проводилась на базе ГЩБК.

2.7.2. С целью получения антивидовой сыворотки проводили иммунизацию баранов очищенным препаратом IgG из нормальной сыворотки крови лошади по схеме Кузнецовой C.B. (20).

Иммунизацию кроликов белками сыворотки крови КРС проводили по схеме, предложенной Коу-Чин-Яном ( 19).

2.8. Физико-химические методы:

2.8.1. Концентрирование вирусного материала проводили:

- полиэтиленгликолем (ПЭГ; М.м. 6000 Д), который добавляли в концентрации 4%; 6% и 8%;

- ультрафильтрацией в установке ФМ-02-200 или ФМ-02-1000 через ядерные мембранные фильтры при давлении 0,2 - 0,4 мПа, скорости вращения мешалки 400-600 g и температуре (20-21)°С. Ячейку заполняли на % объема, устанавливали на магнитную мешалку, затем повышали давление до рабочего. Средняя скорость потока фильтрата - 0,5-0,7 см /мин, время концентрирования 13,5-14,0 час. О степени концентрирования судили по накоплению фильтрата на выходе из ячейки;

- скоростным центрифугированием, которое проводили в течение 60, 120, 180 мин при 100000 g и температуре (4-6)°С.

2.8.2. Очистку вируса (р 26 Аг) ИНАН проводили:

- центрифугированием в градиенте плотности (15% - 55%) сахарозы в течение 180 мин при 100000 g и температуре (4-6)°С (164). Во фракциях градиента определяли активность (титр) и специфичность в РДП и ИФА.

- гель-хроматографией на сефадексе G-200 («Фармация», Швеция), ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе («Фармация», Швеция) и ДЭАЭ-Toyopearl HW-60 (Тоуо, Япония) и аффинной хроматографией на ВгС1Ч-сефарозе-4В ((«Фармация», Швеция) на колонках размером 0,9 х 15 см, 2,6 х 40 см, 2,5 х 100 см (модели К-9/15, К-26/40, К-25/100 производства фирмы «Фармация», Швеция). Преформирование, промывку и перевод смол в нужную форму проводили общепринятыми методами (1,31).

Элюирование белка в процессе очистки проводили соответствующими буферными растворами. На каждой стадии очистки выход белка контролировали измерением поглощения при длине волны 280 пш на спектрофотометре СФ-26. По данным Д28о строили график разделения белков.

2.8.3. Определение молекулярной массы (М.м) вируса ИНАН проводили фракционированием на колонке 2,5 х 100 см (К-20/100) с сефадексом О-200 (8, 10). На колонку наносили пробу очищенного вирусспецифического преципитирующего антигена ИНАН. Элюирование проводили 0,01 М борат-ным буферным раствором, рН 8,4-8,6.

Выход белка контролировали поглощением при длине волны 280 пш на спектрофотометре СФ-26. Полученные фракции объединяли по характеру кривой элюирования белков, проверяли их на наличие специфической активности в серологических реакциях и по формуле (10) определяли М.м.:

М.м. = 6,698 - 0,987 (Уе/Уо), где Уе - объем выхода исследуемой фракции, Уо - (холостой) нулевой объем колонки, определенный экспериментально при ее калибровании с помощью трипсина с М.м. 24000 Д.

2.8.4. Морфологию вируса изучали методом электронной микроскопии ультратонких срезов и негативного контрастирования совместного с сотрудниками сектора электронной микроскопии (зав.сект. Блехерман Б.Е.).

Вирус концентрировали методом скоростного центрифугирования (100000 % х 120 мин) в 10-40 раз от первоначального объема. Образцы исследуемого материала наносили для адсорбции на сетки, покрытые пленкой-подложкой, и контрастировали 4,0% раствором фосфатно-вольфрамовой кислоты, рН 7,0. Препараты изучали в электронном микроскопе «Джем»-100Б (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении до 120000. Электроннограммы получали на фотопластинках МР типа «Ядерные» с последующим экспонированием на фотобумагу.

2.8.5. Фракционирование и очистка иммуноглобулинов класса в из иммунных сывороток.

Фракцию ^глобулинов из сыворотки крови получали двукратным осаждением 25% раствором сульфата аммония.

Обессоливание препарата до полного удаления сульфат-ионов проводили гель-хроматографией через сефадекс 0-25.

Иммуноэлектрофоретически чистый препарат выделяли методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или ДЭАЭ-Тоуореаг1 Н\¥-60, которую уравновешивали 0,0175 Иа-фосфатным буферным раствором рН 8,6 и переносили в колонку для храматографии типа 2,6 х 40 см (модель К-26/40 производства фирмы «Фармация», Швеция) (31). Выход белка контролировали измерением поглощения при длине волны 280 шп на спектрофотометре СФ-26. По данным Д28о строили график разделения белков.

2.8.6. Антитела из гипериммунных сывороток выделяли методом аффинной хроматографии. В качестве иммуноаффинного сорбента использовали ВгС]\[-сефарозу-4В («Фармация», Швеция), которую переносили в колонку для хроматографии типа 0,9 х 15 см (модель К-9/15, «Фармация», Швеция) (1, 31). Выход белка контролировали измерением поглощения при длине волны 280 пт на спектрофотометре СФ-26. По данным Д28о строили график разделения белков.

2.8.7. Определение качественного состава препаратов до, на стадиях и после очистки проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), используя 7,5% систему геля, трис-глициновый (рН - 8,3) электродный буферный раствор. Электрофорез проводили в приборе фирмы «Реанал» (Модель 71). По окончании белковые фракции окрашивали 1% раствором амидового черного 10В в 7% уксусной кислоте (27).

2.8.8. Гомогенность и специфичность препаратов проверяли в иммуно-электрофорезе (ИЭФ) с использованием 1% геля агара («Дифко», США), приготовленного на веронал-мединаловом буфере, рН 8,6. ИЭФ проводили при комнатной температуре в течение 2,0 - 2,5 часов при силе тока 15 мА на стекло (19).

2.8.9. Количество белка в препаратах определяли по методу Лоури (144). Для построения калибровочной кривой использовали препарат бычьего сывороточного альбумина (БСА; Merck, Германия).

2.8.10. Антиген (р26) из вируса ИНАН экстрагировали путем трехкратной обработки этиловым эфиром при (4-6)°С (165, 168).

2.9. Биологические методы

2.9.1. Индикация вируса ИНАН в культуре лейкоцитов лошади (KJIJI). Культивирование лейкоцитов лошади проводили по методу (32, 135). Кровь брали во флаконы с гепарином от клинически здоровых лошадей. Лейкоциты осаждали из плазмы низкоскоростным центрифугированием (1000 g х 10 мин). Затем промывали раствором Хэнкса и суспендировали в ростовой среде. Посевная доза клеток 2-105 -2-107в1 см3. По 10 см3 суспензии клеток помещали в пробирки и инкубировали при (36-37)°С в течение 20 часов.

Надосадок сливали и в каждую пробирку вносили по 1 см очищенного

1 2 препарата культурального вируса в десятикратных разведениях (10" , 10" , 10"3, 10"4, 10"5 и т.д.) и по 9 см3 сыворотки КРС. После 24 ч инкубации среду г заменяли. Наличие вируса в каждой из пробирок определяли по проявлению ЦПЭ («сползание» лейкоцитов).

2.9.2. Индикация культурального вируса ИНАН методом флуоресцирующих антител (МФА) (9, 91, 151). Культуру клеток эмбриона лошади готовили на покровных стеклах в пенициллиновых флаконах. Покровные стекла с монослоем клеток для исследований отбирали в разные сроки после внесения вируса. Клетки промывали физраствором (рН 7,2-7,4), сушили на воздухе и фиксировали в охлажденном до ~20°С ацетоне в течение 15-20 минут. На препарат, содержащий антиген культурального вируса ИНАН, наносили по капле нативную иммунную сыворотку крови лошади. Осторожно распределяли ее по всей поверхности стекла и инкубировали во влажной камере 30 мин при (36-37)°С. После инкубации стекла тщательно отмывали проточной водой и высушивали при комнатной температуре. Наносили на препараты по одной капле меченных флуорохромом антивидовых антител в рабочем разведении. После инкубации во влажной камере при (36-37)°С в течение 30 мин стекла тщательно отмывали проточной водой, подсушивали на воздухе и просматривали в люминисцентном микроскопе ЛЮМИНИ-1. В качестве отрицательного контроля использовали препараты культуры неинфицирован-ных вирусом клеток, которые готовили аналогично.

Результаты иммунофлуоресценции учитывали по интенсивности свечения по следующей шкале: - яркая, сверкающая флуоресценция изумрудно-зеленого цвета; +++ - яркая флуоресценция зеленого цвета; ++ - слабая флуоресценция желтовато-зеленого цвета; + - очень слабая флуоресценция неопределенного цвета;

- отсутствие флуоресценции.

2.9.3. Инфекционная активность вируса ИНАН. Определяли на жеребятах путем введения каждому из двух по 5 см3 вирусного материала в одном из разведений: цельной (исходный вирусный материал), 10"1, 10~2, 10~3, 10"4, 10"5, 10"6, 10"7.

Биопробы считали положительными, если данные клинических, гематологических и серологических исследований были характерными для ИНАН.

Работа проводилась совместно с отделением диагностикумов ИНАН ГЩБК.

2.9.4. Инфекционная активность вируса ИНАН для ККЭЛ. Параллельно с биопробой проводили инфицирование культуры клеток. Для этого из культуральных флаконов с полным монослоем удаляли питательную среду, заменяли ее вируссодержащим материалом в десятикратных разведениях и инкубировали 1,5-2 часа при (36-37)°С. После адсорбции вируса инфицирующую жидкость заменяли на поддерживающую среду, содержащую 2% сыворотки крови КРС. Культивирование проводили при (36-37)°С, меняя среду через 5-7 дней. Образцы среды культивирования инфицированных клеток для исследования серологическими методами брали через 0, 7, 14, 21, 28 и т.д. после внесения вирусного материала.

2.10. Серологические методы

2.10.1. Преципитирующую активность, специфичность антигена куль-турального вируса ИНАН, а также его идентичность с антигеном из ткани селезенки экспериментально инфицированной лошади определяли в реакции диффузионной преципитации (РДП) в геле агара («Дифко», США) (88, 89) с некоторыми изменениями.

В качестве контроля использовали:

- тест-систему «Антиген - антисыворотка для диагностики инфекционной анемии в реакции диффузионной преципитации (РДП)» производства ГЩБК;

- контрольную положительную (референс) сыворотку: (специфическая иммунная сыворотка, полученная от экспериментально инфицированной вирусом ИНАН лошади и стандартизированная по Международной рефе-ренс-сыворотке; Ветеринарная школа, Альфорт, Франция);

- контрольные отрицательные антигены: (среда культивирования неинфи-цированных вирусом ИНАН клеток эмбриона лошади; экстракт из ткани селезенки клинически здорового жеребенка);

- контрольную отрицательную сыворотку.

Об идентичности антигенов, активности и специфичности судили по характеру линий преципитаций, образующихся в РДП.

Качественно антиген в РДП оценивали по четырехбальной системе: + -низкая активность, ++ - удовлетворительная; +++ - средняя; ++++■- высокая.

Динамику накопления вируса (р26 Аг) ИНАН в процессе культивирования определяли, исследуя в РДП образцы среды культивирования, отобранные через 0, 7, 14, 21, 28, 35 и т.д. дней после инфицирования ККЭЛ.

2.10.2. Индикацию и динамику накопления вируса ИНАН в среде культивирования инфицированных клеток определяли в РГА (19, 212). Реакцию ставили в объеме 0,2 см с 1% взвесью эритроцитов хомяка или лошади на 0,85% физиологическом растворе, рН 7,2 - 7,4. Перед постановкой реакции вирусный материал концентрировали методом ультрафильтрации через ядерные мембранные фильтры.

2.11. Иммуноферментный анализ

2.11.1. Синтез иммунопероксидазных конъюгатов (181)

Для получения иммунопероксидазных конъюгатов использовали препарат пероксидазы из хрена (ПХ) с RZ > Д40з / Д280 ^ 3,0. (Олайне, Serwa).

При RZ <3,0 проводили очистку препарата ПХ методом ионообменной хроматографии через КМ- и ДЭАЭ-целлюлозу («Фармация», Швеция).

На первой стадии получения конъюгата проводили активирование пероксидазы из хрена (ПХ) ОДМ раствором перйодата натрия, на второй - присоединение белка через его аминогруппы к альдегидным группам фермента. Стабилизацию связей фермент-белок проводили, добавляя к реакционной смеси боргидрид.

Отделение несвязавшейся ПХ от конъюгата проводили гель-фильтрацией на колонке 1,8 х 150 см (К-18/150 «Фармация», Швеция), упакованной сефадексом G-200 («Reanal», Венгрия), который уравновешивали 0,01 М К-фосфатным буферным раствором, рН 7,2-7,4, с добавлением 0,15 М NaCl. Элюирование конъюгата с колонки проводили этим же буфером. Выход конъюгата контролировали при длинах волны 280 nm и 403 nm.

2.11.2. Иммуноферментный анализ для определения антител к вирусу ИНАН

Применяли схему непрямого твердофазного ИФА с использованием антивидового иммунопероксидазного конъюгата и адсорбированного в лунки полистироловых планшет антигена (96, 234).

С целью отработки параметров и условий постановки твердофазного ELISA выбирали оптимальную концентрацию антигена (р 26) для покрытия л лунок полистироловых планшет (исследовали область от 0,5 до 25 мкг/см ), величину pH адсорбционного буфера (исследовали буферные системы с pH 5,0 - 9,6), оптимальную концентрацию иммунопероксидазного конъюгата и время каждой стадии анализа (от 1 до 3 ч). Разработанную методику применяли для определения антител к вирусу (р26 Аг) ИНАН в сыворотках крови экспериментально инфицированных лошадей, а также в сыворотках крови лошадей-продуцентов гипериммунных и лечебных сывороток, полученных с биофабрик страны.

2.13. Иммуноферментньш анализ для индикации (р26) антигена вируса ИНАН

С целью разработки тест-системы ИФА для индикации антигена применяли схему модифицированного (иммуноферментометрического) конкурентного анализа (236, 238).

Отрабатывали параметры и условия постановки ИФА (по п.2.11.2). Учет результатов ферментативной реакции проводили на спектрофотометре Micro - ELISA reader MR-580 непосредственно в лунках микроплат при длине волны 490 nm после остановки ферментативной реакции путем добавления в каждую лунку 50 мкл 1N раствора H2S04.

2.12. Сублимационное высушивание

Лиофилизацию препаратов проводили на сублимационной установке «Юзифруа» (Франция) в лаборатории консервирования биопрепаратов ВНИТИБП (зав.лабораторией Нежута A.A.)

2.13. Статистическая обработка результатов исследований

Опыты ставили с числом повторностей (не менее 3) для получения достоверных результатов. Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стьюдента-Фишера (при уровне значимости р = 0,05) (23).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Люлькова, Лариса Сергеевна, Щелково

1. Аффинная хроматография. Методы // Под ред Дина П., Джонсона У. Мид-ла Ф. М. - Мир. - 1988, - 278 с.

2. Бойко A.A., Хорьков И.А. / Перспективы использования антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, в ветеринарии и животноводстве // Вест, с/х науки. 1987, - № 9. - С.96-100.

3. Васильев A.B., Непоклонова И.В. / Иммуноферментный метод в диагностике вирусных инфекций // Ветеринария. 1982, - №8. - С.63-65.

4. Введение в прикладную энзимологию. / Иммобилизованные ферменты // Под ред. И.В. Березина, И.К. Мартенека. М., МГУ, 1982, - 384 с.

5. Вишняков И.Ф., Цыбанова Л.Я. / Иммуноферментный анализ // Ветеринария. 1983, - №9. - С.68-70.

6. Венгеров Ю.Ю., Булгарина T.B., Куш A.A. и др. /Современные методы иммуноферментного анализа для диагностики вирусных инфекций // Биотехнология. 1987, - т.З. -№ 3. - С.291-295.

7. Грабар П., Буртэн П. / Иммуноэлектрофоретический анализ. Применение для исследования биологических жидкостей человека. // Под ред. Г.И. Абелева, М., Иностр. литература, 1963.

8. Гринин-А.С., Титов И.Н. / Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных. // М.: Колос, 1971, - 240 с.

9. Девришов Д.А. / Иммунофлуоресцентная диагностика вирусных респираторных инфекций телят // Ветеринария. 1985, - №3. - С.67-68.

10. Ю.Детерман Г. / Гель-хроматография // М.: Мир. 1970, 252 с.

11. Дзантиев Б.Б., Егоров М.М. / Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа // ЖНХО, 1982, - Т.27. - №4. - 443 с.

12. Дзантиев Б.Б. / Гетерогенные методы иммуноферментного анализа // Бюл. ВИЭВ, 1985, - Вып.58. - С. 10-22.

13. Дьконов Л.П. / Методические указания // М. 1978.15.3ооантропоноз, болезни, меры профилактики и борьбы // Матвиенко H.H. Инфекционная анемия лошадей. Минск, 1987, - С.44-45.

14. Иммуноферментный анализ // Под ред. Т.Т.Нго, Г.Ленхофора М.: Мир, 1988, -С.9-24.

15. Иммуноферментный анализ // Под ред. Т.Т.Нго, Г.Ленхофора М.: Мир, 1988, -С.446-475.

16. Инфекционная анемия лошадей / Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. // Диагностика вирусных болезней животных. М.: 1991, - С.308-320.

17. Иммунологические методы / Под ред. Х.Фримеля М.: Мир. - 1979, -С.518-520.

18. Кузнецова C.B., Передереев Н.И., Кузнецов П.П., Простяков А.П., Игнатьева B.C. / Метод получения антирабической сыворотки // Тр. ВГНКИ, -1975, XXII.-С.36-41.

19. Кэрстак Э. / Успехи в разработке иммуноферментных методов: получение реагентов, планирование экспериментальных исследований и интерпретации результатов // Бюл. ВОЗ. 1985, - №4. - С. 118-139.

20. Кэрстак Э., Тийсвен П., Кэрстак К., Моррисет Р. / Применение иммуноферментных и некоторых других иммунологических методов в диагностике вирусных инфекций // Бюлл. ВОЗ 1986, - №2. - С. 110-124.

21. Лакин Г.Ф. / Биометрия. 3 изд., перераб. и дополн. - М.: Высшая школа. -1980,-294 с.

22. Леонов C.B., Заколепродин Ю.А., Эггерт Г.И. / Иммуноферментная тест-система на основе (Fab)2 фрагментов антител для индикации гемагглю-тинина вируса гриппа. // Вопр. вирусол. - 1987, - №4, - С.498-502.

23. Манолов Л.Д. / Твердофазные радиоиммунные и иммуноферментные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии // ЖМЭИ, 1985, №4. - М.Медицина. - С.100-107.

24. Маренникова С.С., Хабашева H.A., Мальцева H.H., Ефремова Е.Е. / Получение и сравнительная оценка пероксидазных конъюгатов на основе чистых антител и Fab-фрагмента IgG // ЖМЭИ. 1982, - №9. - С.89-103.

25. Маурер Г. / Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в поли-акриламидном геле // М. Мир. 1971, - С. 1-24

26. Мешандин А.Г., Ванеева Л.И., Даргеева Т.А. / Хемосорбция в получении твердофазных биолигандов для гетерогенного иммуноферментного анализа // ЖМЭИ. 1994, - №5. - С.87-88.

27. Науменков В.И. / Применение иммунопероксидазного метода для индикации вирусных антигенов в культуре клеток // Ветеринария. 1984, - №7. -С.70-71.

28. Пестова Г.В., Фисенко И.П., Виногорова Г.Ф. Оптимальные условия культивирования лейкоцитов лошади // Передовой н.-п. опыт в биологической промышленности. М. 1986, - №12. - С. 13-15.

29. Пинчук Л.М. / Неспецифические эффекты в твердофазных иммуносор-бентных методах // ЖМЭИ. 1987, - №5. - С. 110-117.

30. Подобедов А.И. / Постоянство преципитирующих антител у лошадей-вирусоносителей инфекционной анемии // Труды ВИЭВ, М.: 1984, - Т.61.- С.76-80.

31. Пронина Л.И. / Серологические и физико-химические свойства группос-пецифического антигена вируса ИНАН лошадей // Автореф. дисс. канд. биол. Наук. -Владимир. 1981, - С.1-18.

32. Пронина Л.И., Татарская Т.Г., Доценко Г.В., Токарик Б.И. / Выделение группоспецифического антигена вируса ИНАН из крови больных лошадей. // Передовой научно-производственный опыт в биопромышленности. Экспресс-информация. М. 1982, - №4. - С.3-5.

33. Пронина Л.И., Токарик Б.И. / Выработка антигена ИНАН в устойчиво инфицированной клеточной линии // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. Экспресс-информация. М. -1984,-№5.-23 с.

34. Пронина Л.И., Токарик Б.И. / Размножение вируса ИНАН в культуре клеток почки лошади // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. Экспресс-информация. М. 1986, - №6. - 12с.

35. Рубцов И.В., Пименова Г.Н., Кулаков В.Н. / Методы статистической обработки результатов иммуноферментного анализа. // ЖМИ. 1985, - №6. -С.44-48.

36. Сологуб В.К., Юров К.П., Надточей Г.И. / Электронномикроскопическое изучение вируса инфекционной анемии лошадей // Доклады XX Всемирного ветеринарного конгресса. Салоники, Греция. 1975, - т.З. - С.2123-2125.

37. Сорокина Н.В. / Получение конъюгатов иммуноглобулин-пероксидаза модифицированным методом Наканэ. Методы иммуноферментного анализа в биологии и медицине, М., 1983, - С.57-61.

38. Стегний Б.Г. / Криоконсервирование первичных культур и тканей для вирусологических исследований. // Автореферат дисс., Владимир, 1982.

39. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник М.: Агропромиздат, -1991, 528 с.

40. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. / Вирусные болезни животных. М. ВНИТИБП. - 1998. - С.407-421.

41. Тарасишин JI.A. / Иммуноферментный анализ и его модификации в исследовании вирусных антигенов // Микробиол. журнал. 1986, - т.48. -№4. - С.99-104.

42. Токарик Б.И. / Получение антигена и антисыворотки для диагностики инфекционной анемии лошадей методом диффузионной преципитации в геле // Автореф. дисс. . .канд.биол.наук, Владимир. 1977, - С.14-18.

43. Токарик Б.И., Виногорова Г.Ф., Пестова Г.В., Фисенко И.П., Лысенко Н.Г. / Чувствительность клеточных культур эмбриона лошади к вирусу инфекционной анемии // Передовой н.-п. опыт в биологической промышленности. Экспресс-информация. М. 1989, - №4. - 11с.

44. Фримель X., Хольцхайдт Г. / Иммуноферментный анализ // Иммунологические методы / Под ред. Г.Фримеля. М.: Медицина, - 1987, - С. 14-16.

45. Харитоненков И.Г., Христова М.Л. / Использование иммуноферментных методов в вирусологии // Мол.генетика, микробиол. и вирусология. -1985, №6. - С.3-15.

46. Юров К.П., Крюков Н.В., Лихачев Н.В. / Вирусные болезни лошадей. М. - 1972, - С.141-143.

47. Юров К.П., Садиков В.Е. / Инфекционная анемия // В кн.: Вирусные болезни лошадей. М., Колос. - 1973, - С. 105-138.

48. Юров К.П., Сологуб В.К. / Реакция диффузионной преципитации инфекционной анемии лошадей // Ветеринария. 1976, - №1. - С. 100-102.

49. Юров К.П., Гоздняков А.А., Кычкин А.А., Крюков Н.Н. / Биология куль-турального вируса ИНАН // Ветеринария. 1980, - №6. - С.30-31.

50. Юров К.П., Седов В.А. / Диагностика и профилактика инфекционной анемии лошадей // Ветеринария. 1988, - №10. - С.39-41.

51. Юров К.П. / Инфекционная анемия лошадей модель ретровирусной инфекции // Бюлл. Всеросс. НИИ эксперим. Ветеринарии. - 1996, - вып.77. -С.37-38.

52. Юров К.П. / Инфекционные болезни лошадей // Ветеринария. 1997, -№4.-С.11-15.

53. Alberty C.F., Bodine А.В., Barnes М.А. / The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to the bovine parvovirus // J. Dairy Sei. 1981, - v.64 (Supp). - P.187-188.

54. A1-Kaissi E., Mostratos A. / Assessment of substrates for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay // J. Immunol. Meth. 1983, - v.58, - №1-2. -P.127-132.

55. Ansari A.A., Hatti-Kudur N.S., Joshi S.R., Mederia M.A. / ELISA solid phase: stability binding characteristics. // J. Immonol. Meth. 1985, - v.84, -№1-2. -P.117-124.

56. Amborski G.F., Amborski R.L., Barta V., Jeffer G., Issel G.J. / Electron mikroscopi of a persistent virus, equine infection anemia, grou in an equine dermal cell line (ATCCCI 57) // In Vitro 1977, - v.13, - №3. - 161 p.

57. Archer E.G., Growford T.B., McGuire T.C., Frazier M.E. / RNA depended DNA polymerase associated with equine infectious anemia virus // J.Virol. -1977, - v.22, - №1. - P.16-22.

58. Avrameas S. / Immunoenzyme techniques: enzyme as markers for the localization of antigens and antibodies // Int. rev. cyt. 1970, - v.27. - P.439-485.

59. Avrameas S., Ternynck T., Guesdon J.L. / Coupling of enzymes to antibodies and antigens // Scand J.Immumol. 1978, - №8, - suppl, №7. - P.7-23.

60. Avrameas S. / Enzyme immunoassays an related techniques: development and limitations // Curr. Top. Microbiol, and Immunol. 1983, - v. 104. - P.93-99.

61. Belshan M., Harris M.E., Shoemaker A.E., Hope T.J., Carpenter S. / Biological characterization of Rev variation in equine infectious anemia virus // J. Virol. -1998, v.72, - №5. - P.4421-4426.

62. Benton C.V., Brown B.I., Harshman J.S., Gilden R.V. / In vitro host range of equine infection anemia virus // Intervirol. 1981. - №16. - P.225-232.

63. Bidwell D.E., Bartlett A., Voller A. / Enzyme immunoassay for viral diseases // J. Infect. Dis. 1977, - v. 136, suppl. P.274-278.

64. Bock R.E., Burgess G.W., Douglas I.C. / Development of an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of bovine serum antibody to bovine viral diarrhola virus // Australian Veterinary Journal. 1986, - v.63, -№12. - P.406-408.

65. Boorsma D.M., Kalsbcek G.L. / A comparative study of horseradish peroxidase conjugates prepared with a one-step and a two-step method // J.Histochem. Cytochem. 1975, - v.23. - P.200-207.

66. Boorsma D.M., Steefkerk I.G. / Periodate or glutaraldehyde for preparing peroxidase conjugate? // J. Immunol. Meth. 1979, - v.30. - P.245-255.

67. Boussetta M., Chabchoud A., Ghram A., Jomaa I., Ghorbel A., Aouina T., Ben Amor H. / Enquete seroepidemiologique sur la grippe et l'anemie infectieuse des equides dans le nord-est tunisien // Rew. Elevage Med. Veter. 1994, -v.47, - №3. - p.277-281.

68. Cantarero L.A. / The adsorptive characteristics of protein for polysterene and their significance in solid-phase immunoassays // Analyt Biochem. 1980, -v.105, - №2. - P.345-382.

69. Carrier S.P., Bannister G.L., Boulanger P. / Equine infectious anemia: Activity of liquid antigen extract in the agar-gel immunodiffusion and complement-fixation test. // Can. J. Comp. Med. 1972, - v.36, - №4. - P.377-379.

70. Catt K.J., Treger G.W. / Solid-phase radioimmunoassay in antibody-coated tubes. // Scince. 1967, - v.158. - P.1570-1572.

71. Celer V. / Preparation of A.I.E. precipitinogen from tissue cultures of horse peripheral leukocytes // Acta vet., Brno. 1976, - v.45, - №1-2. - P.85-88.

72. Charman H.P., Bladen S., Gilden R.V. and Coggins I. / Equine infection of a canine thymus cell line by equine infectious anemia virus and preliminary data on the production of viral antigens // J. Virol. Meth. // 1986, - №3. - P.309-321.

73. Chevers W.P., Ackiey C.M. and Crawford T.B. / Structural proteins of equine infectious anemia virus//J. Virol. 1978, - v.28. - P.997-1001.

74. Clabough D.L. / Equine infectious anemia: The chinical sigus, transmission, and diagnostic proceduris // Veter. Med. 1990, - v.85, - №9. - P.1009-1019.

75. Clabouh D.L. / The immunopatogenesis and control of equine infectious anemia // Veter. Med. -1990, v.85, - №9. - P. 1020-1028.

76. Clements J.E., Grovin S.L., Montelaro R.C., Narayan O. / Antigentic variation in lentiviral diseases // Ann. Rew.I 1988, - v.l. - P. 139-159.

77. Coggins L., Norcross N.L. / Immunodiffusion reaction in equine infectious anemia // Jornell Vet. 1970, - №3. - P.330-335.

78. Coggins L., Norcross N.L. / Diagnosis of equine infectious anemia by immunodiffusion test // Am. J. Vet. Res. 1972, - V.33, - №1. - P.l 1-18.

79. Coggins L. / Carries of equine infection anemia virus // J. Am. Veter. Med. Assn. -1984, v. 184, - №3. - P.279-281.

80. Crawford T.B., Mcquire T.C., Henson J.B. / Detection of equine infectious anemia virus in vitro by immunofluorescence // Arch. ges. Virusforsch. 1971, - v.34, - №4. - P.332-339.

81. Davis J.L., Clements J.E. / Complex gene expression of Lentiviruses. // Microb. pathog. 1988, - v.4, - №4. - P.239-245.

82. Dawson G.J., Orsi L.M., Yates V.J., Chang P.W. and Pronovost A.D. / An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies of avian adenovirus and avian adenovirus associated virus in chicken // Avian. Dis. 1980, -v.24. - P.393-402.

83. De Saviglug D., Voller A. / The communication of ELISA data from laboratory to clinician // immunoassay. 1980, - v.l, - №1. - P.105-128.

84. Ehlers U., Paul H.L. / Binding of viruses from crude plant extracts to glutaral-dehyde treated plates for indirect ELISA // J.Virol. Meth. - 1984, - v.8, - №3. -P.217-224.

85. Engval E., Perlmann P. / Enxyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochem. 1971, - v.8. -P.871-874.

86. Equine infections anemia (EIA) disease control program in the United States of America (USA) // Proc. Am. Meet. United States Anim. Health Assn. -Richmond. - 1991, - v.96. - P.227-232.

87. Evans K., Carpenter S., Sevoin M. / Detection of equine infectious anemia virus in horse leykocyte cultures taken from horses in various stades of equine infections anemia viral infection // Amer. J. Vet. Res. 1984, - v.45. - P.20-25.

88. Farr A.G., Nakane P.K. Immunohistochemistry with enzyme-labelled antibodies: a brief review // J. Immunol. Meth. 1981, - v.47, -№2. - P. 129-144.

89. Feigner P. / A new technique of heterogenous enzyme-linked immunosorbent assay, stick ELISA. I. Description of the technique // Lbl. Bact. 1., Abt. Orig. A. - 1978. Bd 240, H.l. - S.112-117.

90. Fenner F. / The classification and nomenclature of viruses // Virology. -1976, v.71, - №3. - P.371-378.

91. Flunn S.N., Waddell G.H., Saurino V.R. / Persistent viremia in E.I.A. infected horses // Quart J. Fla Acad. Sci. 1967, - v.30, - №4. - p.301-315.

92. Gerencer M., Valpotic I., Jukic B. / Qualitative analyses of cellular immune functions in equine infectious anemia show homology with AIDS // Arch. Virol. 1989, - v.104, - №3-4. - P.249-257.

93. Gonda M.A., Charman H.P., Walker J.U., Coggins L. / Scaning and transmission electron microscopic study of equine infectious anemia virus // Amer. J. Vet. Res. 1978, - v.39, - №5. - P.371-740.

94. Gorham J.R., Henson J.B. / The pathogenesis of equine infectious anemia //th

95. World Veterinary Congress, Summuries 1975, - v.2. - 945p. (Greece).

96. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. / The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. 1979, - 27, -№10. - P.l 131-1139.

97. Hamaguche Y., Kato K., Fukui et al. / Enzyme-linked sandwich immunoassay of macromolecular antigens using the rabbit antibody-coupled glass rod as a solid phase. // Europ J.Biochem. 1976, - v.71. - P.459-467.

98. Henderson L.E., Sowder R.C., Smythers G. Wand Oroszlan S. / Chemical and immunological characterization of equine infections anemia virus gag-encoded proteins // J. Virol. 1987, - 61. - P. 1116-1124.

99. Hendry R.M., Hermann J.E. / Immobilization of antibodies on nylon for use in enzyme-linked immunoassay // J.Immunol. Meth. 1980, - v.35, -№3-4. -P.285-296.

100. Henson J.B., Mcguire T.C., Gorham J.H. / The detection of precipitating antibodies in equine infectious anemia and partial purification of the antigen // Arch. ges. Virusforsch. 1971, - v.35, - №4. - P.385-391.

101. Honach N.B., Gorham J.R., Kobayashi K. / Immunity in infectious anemia // Amer. J. Vet. Med. Assoc. 1989, - v.155, - part 2, - №2. - P.336-343.

102. Hussain K.A., Issel C.J., Schnorr K.L. / Antigenic mapping of the envelope proteins of equine infection anemia virus: identification of a neutralization domain and a conserved region on glycoprotein 90 // Arch. Virol. 1988, - v.98, -№3-4.-P.213-234.

103. Inman J.K., Dintris H.M. / The derivatization of cross-linked polyacrulamide beads. Controlled introduction of functional groups for the preparation of specialpurpose, biochemical adsorbent // Biochem: 1969, v.8, - №10. - P.4074-4082.

104. Ishikawa E., Imagawa M., Hashid S. et al. / Enzyme-labellind of antibodies and their fragments for enzyme-immunoassay and immunohistochemical staining // J.Immunoassay. 1983, - v.4, - №3. - P.209-327.

105. Ishizaki R., Green R.W. and Bolognesi D.P. / The structural polypeptides of equine infectious anemia virus // Intervirology. 1978, - v.9, - №5. - P.286-294.

106. Issel Ch.J., Rushlow K., Foil L.D., Montelaro R.C. / A perspective on equine infectious anemia with an emphasis on vector transmission and genetic analysis //J. Yet. Microbiol. 1988, - v.17, - №3. - P.251-256.

107. Jukic В., Zupancic Z., Nada Brkic, Petrovic D. / Application of gel-electrophoresis in diagnosis of equine infectious anemia. Тезисы XXI BBK, Москва: 1-7 июля 1979 г. - т.6, секция 126, 24 с.

108. Kato К., Hamaguchi Y., Okava S. et al. / Use of rabbit IgG-loaded silicone for sandwich immmunoassay of macromolecular antigens. // J.Biochem. 1987, -v.81. - P.1557.

109. Kemen M.J.J, and Coggins I. / Equine infectious anemia: Transmission from infected mares to foals // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1972, - № 161, - P.496-499.

110. Kemen M.J. / Equine infectious anemia. The controversy continues // Cornell Vet. 1977, - v. 67, - n.2. - P. 177-189.

111. Kemeny L.J., Mott L.O., Pearson J.E. / Titration of equine infectious anemia virus. Effect of dosage on incubation time and clinacal signes // Corn. Vet. -1971, v. 61, - №4. - P.687-695.

112. Kenna J.G., Major G.N., Williams R.S. / Methods for reducing nonspicific antibody bindig in enzyme-linked immunosorbent assay // J. Immunol. Meth.- 1985, v.85, - №2. - P.409-419.

113. Knowles R.C., Pearson J.E., Thomas M.A.jr. Equine infectious anemia (EIA)- a disease control program in the United States of America (USA) // Proc. / Ann. Mett. United States Anim. Healths Assn. Richmond (Va). - 1991, 95, p.227-232.

114. Kobayashi K., Kono J. / Propagation and titration of equine infectious anemia virus in horse leukocyta culture // Nat. Inst. Anim. Halth. Quart, 1967, - v.7,- №1. P.8-20.

115. Kobayashi K. / Studies on the cultivation of equine infectious anemia virus in vitro. II. Propagation of the virus in horse bone morrow cell culture // Virus. -1961, V.ll, - №3. - P.189-201.

116. Konno S., Yamomoto H. Pathology of equine infectious anemia. Proposed classification of pathologic types of disease // Cornell Vet. 1970, v.60, №3, p.393-449.

117. Kono Y. and Kobayashi K. / Complement fixation test of equine infectious anemia. II. Relationship between CF antibody response and the disease // Nat. Inst. Anim. Hlth. Quart. 1966, - №6. - P.204-207.

118. Kono Y., Yokomizo Y. / Attempts to Virological studies of equine infectious anemia in Japan // Bull. Office int. Epizoot. 1968, - v.70, - №1. - P.615-625.

119. Kono Y. and Yokomizo Y. / Attempts to cultivate the equine infectious anemia virus in various tupes of cell // Nat. Inst. Anim. Hlth. Quart. 1968, - v.8. -P.182-186.

120. Kono Y., Yochino T., Fukunaga Y. / Growth characteristics of equine infectious anemia virus: a virus in horse leukocyte culture // Arch. ges. Virusforsch.- 1970, v.30, - №2-3. - P. 252-256.

121. Kono Y., Kobayashi H., Fukuanaga Y. / Serological comparison among various strains of equine infectious anemia virus // Arch. ges. Virusforsch. 1971,- v.34, №3. - P.202-208.

122. Kono Y., Kobayashi K., Fukunaga Y. / Antigenic drift of equine infectious anemia virus in chronically infected horses // Arch. ges. Virusforsch. 1973, -v.41, - №1-2. - P.l-10.

123. Kono Y., Yoshine T. / Propagation of equine infectious anemia virus in horse Kidney cell culture // Nat. Inst. Anim. Hlth. Quart. 1974, - v.14, - №4. -P.155-162.

124. Kurstak E., Kurstak C. / Application of the immunoperoxidase technique in virology and cancer virology: light and electron microscopy // Viral Immunodiagnosis: Ed. E.Kurstak and R.Morisset. New York: Acad. Press. - 1974. -P.3-30.

125. Leroux C., Issel C.I., Montelaro R.C. / Novel and dynamic evolution of equine infectious anemia virus gemonie quasispecies associated with sequential disease cycles in an experimentally infected pony // J. Virol. 1997, - v.71, -№12. - P.9627-9639.

126. Lew A.M., Thomas L.M., Huntigton P.I. / A comparison of ELISA, FASTELISA and gel diffusion test for detecting antibody to equine infectious anemia virus // Veter. Microbiol. 1993, - v.34, - №1. - P. 1-5.

127. Lowery O.H., Rosenbrouugh N.J., Fall A.L., Randall R.J. / Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem., 1951, - v. 193, - №2. -P.265-275.

128. Lucas M.N., Davies T.H.R. / Equine infectious anemia // Equine veter. Educat 1995,-v.7,-№2.-P.89-91.

129. Maiolini R. and Masseyeff: / A sandwich method of enzyme immunoassay. I. Application to rat and human alpha fetoproteine // J. Immunol. Methods. -1975, v.8. - p.223-234.

130. Malmquist W.A., Barnett D., Becvar C.S. / Production of equine infectious anemia antigen in a persistently infected cell line // Arch. ges. Virusforsch. -1973, v.42, - №4. - P.361-370.

131. Malmquist W.A., Decvar C.S. / Identification of multiple equine infectious anemia antigens by immunodiffucion reactions // Canad. I. Comp. Med. -1975, v. 39, - №4. - P.411-415.

132. Mason T.E., Phifer H.F., Spicer S.S. et al. / An immunoglobulin enzyme bridge method for localizing tissue tissue antigens // J.histochem. - 1969, v. 17. - P. 563-569.

133. Matheka H.D., Coggins L., Shively J.N., Norcross N.L. / Purification and characterization of equine infectious anemia virus // Arch. Virol. 1976, -v.51,- №1-2. - P.107-114.

134. McGuire T.C., Crawford T.B. and Henson J.B. / Equine infectious anemia: Detection of infectious virus antibody complex in the serum // Immunological Communications. - 1972, - №1. - P.545-551.

135. McGuire T.C., Henson J.B. / Immunnofluorescent localization of equine infectious anemia virus in tissue // Am. J. Pathol. 1971, - v.62, - №2. - P.283-292.

136. McGuire T.C., Crawford T.B. and Henson J.B. / The Isolation, Characterization and Functional Proporties of Equine Irnmunoglobylin Classes and Subclasses // In Proceedings. Conf. Equine Infect. Dis. // 1972 (1973), - №3. P.364-381.

137. McGuire T.C. / Immunoglobulin G subclass IgG and IgG(T). interaction with the p25 group specific antigen of equine infectious anemia virus: immunodiffusion and complement-fixation reactions // Am. J. Vet. Ret. 1977, - №38. -P.655-658.

138. McGuire T.C., O'Rourke K.I. and Chevers W.P. / A review of antigenic variation by the equine infectious anemia virus // Contr. Microbiol. Immunol. 1987, - №8. - p.77-89.

139. Meueemans G., Halen P. / Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting infectious laryngotracheitis viral antibodies in chicken serum // Avian Pathology. 1982, - №11. - P.361-368.

140. Mia A.S., Tierney M.M. and Krevcak D.M. / Detection of equine infectious anemia antibody by a rapid microenzyme linked immunosorbent assay (ELISA) // Proc. Annu. Meet. Am. Assoc. Vet. Lab. Diagn. 1982, - №25. -P.159-166.

141. Midgley A.R., Hepburn M.R. / Use of the double-antibody method to separate antibody bound from free ligand in radioimmunoassay. // Meth. Enzymol, v.70, Part A, New-York, 1980.- P. 231-235.

142. Montelaro R.C., Lohrey N., Parekh B., Blakeney E.W. and Issrl C.Y. / Isolation and comparative biochemical properties of the major internal polypeptides of equine infectious anemia virus // J. Virol. 1982, - №42. - P. 10291038.

143. Montelaro R.C., West M., Issel C.J. / Antigenic reactivity of the major glico-protein of equine infectious anemia virus, a retrovirus // Virology. 1984, v.136, - №2. - P.368-374.

144. Morrel Y.I., Greenberger L.M., Pfaff D.W. / Comparison of horseradish peroxidase visualizayion methods: quantitative results and further technical specifics // J. Histochem. Cytochem. 1981, - v.29, - №8. - P.903-916.

145. Motie A. / An outbreak suspected equine infectious anemia in Guyana // Bruit. Veter. J. 1986, -1.142, - №1. - p.37-40.

146. Nakajima H., Tanaka S. and Ushimi C. / Fractionation of equine infectious anemia virus by diethylaminoethyl cellulose chromatography and sucrose density gradient centrifugation // Nat. Inst. Anim. Hlth. Quart. 1968, - v.8, - №2. - P.57-63.

147. Nakajima H., Tanaka S. and Ushimi C. / Physicochemical studies of equine infectious anemia virus. II. Sensitivity of the virus to trypsin // Arch. ges. Virus forsch. 1969, - v.26, - №4. - P.395-397.

148. Nakajima H., Tajima M., Tanaka S. and Ushimi C. / Physicochemical studies of equine infectious anemia virus. III. Purification and electronmicroscopic observation of the virus // Arch. ges. Virusforsch. 1969, - v.28, - №3-4. -P.348-360.

149. Nakajima H., Kono Y. and Ushimi C. / Characterization of precipitating antibody in equine infectious anemia // Y. Immunol. 1971, - v. 107, - №3. -P.889-894.

150. Nakajima H., Norcross N.L., Coggins L. Demonstration of antigenic identity between purified equine infectious anemia virus and an antigen extracted from horse spleen // J. Infect, and Immun. 1972, v.6, № 8, p.416-417.

151. Nacajima H. Physicochemical and biological characteristics of equine infectious anemia virus // Proc. 3rd int Conf. Equine Infectious Diseases. 1972, p. 162-174.

152. Nakajima H., Ushimi C. / Detection of precipitating antibody in equine infectious anemia by concentrated antigen. // Nat. Anim. Hlth. Quirt. 1972, -v. 12, - №2. - P.47-53.

153. Nakajima H., Mizuno Y., Yasuda K., Ushimi C. / Physicochemical studies of equine infectious anemia virus. Y. Effect of Ultraviolet irradiation on virus in-fectivity. // Arch. ges. Virusforsch. 1973,- v.41, - №1-2. - P.135-137.

154. Nakajima H., Ushimi C., Fukunada Y. and Hirasawa K. / Preparation of equine infectious anemia virus antigen for immunodiffusion test // Arch. ges. Virus forsch. 1973, - v.41, - №1-26. - P.339-345.

155. Nakajima H. / Diagnosis of equine infectious anemia by immunodiffusion test // Jap. Agr. Res. Quarty. 1974, - №8. - P.47-53.

156. Nakajima H., Fukunaga Y. and Ushimi C. / Titration of precipitating antibody in equine infectious anemia. // Nat. Inst. Anim. Hlth. Quart. 1974, - №14. -P.1-8.

157. Nakajima H. / Equine infectious anemia virus similar characteristics to RNA tumor virus // Chemistry and Biology. - 1976, - №14. - P. 48-50.

158. Nakajima H. / Agar gel immunodiffusion test. A new diagnostic method. -1977.- P.93-156 (ibid).

159. Nakajima H., Sugiura T. and Ushimi C. / Immunodiffusion test for the diagnoxLsis of equine infectious anemia // Proc. 4 Int. Cont. Equine Infectious Diseases. 1978. - P.339-349.

160. Nakajima H. / Equine infectious anemia virus // New Veterinary Microbiology (Yokendo). 1989. - P.852-859.

161. Nakajima H., Suguira T. / Equine Infectious Anemia Research in Japan on the Virology Immunology, Pathogenesis and Control // J. Equine Sci, 1994, -v.5, - №1. - p.1-19.

162. Nakane P.K., Kawaoi A. / Peroxidase Labelled antibody: a new method of conjugation // Y. Histochem. - 1974, - v.22. - P. 1084-1091.

163. Nishimura M., Nakajima H. / Structural proteins of equine infectious anemia virus and their antigenic activity //Ame. J. Vet. Res. 1984, - №45. - P.5-10.

164. Newmann S., Gunzer G., Hennrich N., Lang H. / RMN-elastase assay: Enzyme immunoassay for human polymorphonuclear elastase complexed with Lrproteinase inhibitor. J. Clin. Chem. and Clin. Biochem., 1984, - 22, №10. - P.693-697.

165. Pan C., Shem R. / Structural proteins and their immunological properties of EIA clonkey leukocyte attenuated vims // J. Equine veter. Sc. 1993, - vol.13. -P.163-166.

166. Parekh B., Issel C.J. and Montelaro R.C. / Equine infectious anemia virus, a putotive Lentivirus, contains polypeptides analogous to prototype-C oncornaviruses // Virology. 1980, -v. 107. - P.520-525.

167. Paquette B. / A retrospective study of equine infectious anemia Based on the Canadian control program // Canad. Veter. I. 1985, - v.26, - №12. - P.373-377.

168. Patricon M.C. / Technique ELISA // Pharm. Biol. 1981, - v. 15, - №131, -suppl. - P. 15-19.

169. Payne S.L., Salinovich O., Nauman S.M. / Course and extent of variation of equine infectious anemia virus during parallel persistent infectious // J.Virol. -1987, v.61, - №4. - P.1266-1270.

170. Pearson J.E., Knowles R.C. / Standartization of the equine infectious anemia immunodiffusion test in the United States // J. Am. Veter. Med. Assn. 1984,- v.184, №3. - P.298-301.

171. Pesce A.Y., Ford D.Y., Makler M.T. / Quantitative Aspects of Competitive Immunoassays. // In. Ishikawa E., Kawai T., Miyai K. (Ed.): Enzyme immunoassay, 1987.

172. Postmann T. Postmann B., Schmechta H., Nugel E., Seifert R., Grunow R. / Effect of IgG-Hoveseradish peroxidase conjugates puriffied on Con A-Sepharose upon sensitivity of enzyme immunoassay // Acta. Biol Med. Germ.- 1981, №40. - P.849-859.

173. Potgieter L.N.D., Rouse B.T. and Webbmartin T.A. / Enzyme-linked immunosorbent assay using staphylococcal protein A for detecting virus antibodies. // Amer. J. Vet. Res. 1980, - 41. - p.987-980.

174. Reis J.K.P., Leite R.C. / Otimizacao da producao e estabilizacao do antigeno do virus da anemia infectiosa equina, para uso diagnostico // Arg. Brasil. Mad. Vet. Zootecn. Belo Horizonte. - 1994, - v.48, - №2. - P.380-385.

175. Richardson M.D., Turner A., Warnock D.W., Zlewellyn P.A. / Computerassisted rapid enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in the serological diagnosis of aspergillosis // J. Immunol. Meth. 1983, - v.56. - P.201-207.

176. Romer W., Rauterberg E. / Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with covalently bound protein on glass tules: I. Stable antigenicity and binding of IgG as a model antigen after repeated use // Immunobiology. 1984, -v. 166, - №1. - P.24-34.

177. Rosin-Arbesfeld R., Rivlin M., Noiman S., Mashiah P., Yaniv A., Miki T., Tronick S.R., Gazit A. / Structural and functional characterization of rev-like transcripts of equine infectious anemia virus // J. Virol. 1993, - v.67, - №9. -P.5640-5646.

178. Rozeik C., Schulz H.B. / The competitive antigen spot test (CAST). A. rapid and simple means of quantitatively screening antisera // J. Immunol. Meth. -1986,-v.94,-№l.-P.91-97.

179. Rubenstein K.E., Schneider R.S., Ullman E. / "Homogeneous" enzyme-immunoassay: a new immunochemical technique // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972, - v.47. - P.846-851.

180. Rwambo P.M., Issel C.J., Adams W.V.jr. / Equine infectious anemia virus (EIAV): Humoral responses of recipient ponies and antigenic variation during persistent infection // Arch. Virol. 1990. - P. 199-212.

181. Sakamoto T. / Cytological studies on siderocytes in equine infectious anemia. I. Morphological studies on siderocytes // Jap. J. Vet. Rec. 1960, - v.8, - №1. -P. 12-28.

182. Salinovich O., Payne S.L., Montelaro R.C. / Rapid emergence of novel antigenic and genetic variants of equine infectious anemia virus during persistent infection // J.Virol. 1986, - v.57, - №1. - P.71-80.

183. Sarkar M., Mandal C. / Immobilization of antibodies on a new solid phase for use in ELISA // J. Immunol. Meth. 1985, - v.83, - №1. - P.55-60.

184. Schuurs A.H.W.M., Van Weemen B.H. / Enzimeimmunoassay // Clin. Chim. Asta. 1977, - v.81. - P. 1-40.

185. Sekino Т., Samejima Т., Tajima M. / Development of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to equine infectious anemia virus // J. Japan Veter. Med. Assn. 1993, - v.46, - №2. - P. 112-116.

186. Sentsui H., Kono Y. / Hemagglutination by equine infectious anemia virus // Infec. Immunity. 1976, - v. 14. - P.325-331.

187. Sentsui H., Kono Y. / Preparation of hemagglutinating antigen of equine infection virus from infected equine leukocyte culture // Nat. Inst. Anim. Hlth Qurt. 1978, - №67. - P.75-84.

188. Sentsui H., Kono Y. / Phagocytosis of horse erythrocytes treated with equine infectious anemia virus by cultivated horse leukocytes // Arch. Virol. 1987, -v.95, - №1-2. - P.67-77.

189. Shane B.S., Issel C.Y. and Montelaro R.C. / Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of equine infectious anemia virus p26 антиген and antibody // Y. Clin. Microbiol. 1984, - №19. - P.351-355.

190. Shen D.T., Crawford T.B. and Gorham Y.R. / Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of equine anemia viral antigen // J. Equine Med. Sur. 1982, - v.3. - P.303-307.

191. Shen D.T., Gorham Y.R. and McGuire T.C. / Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of equine anemia antibody to purified p26 virul protein // Am. Y. Vet. Res. 1984, - v.45, - №8. - P.1542-1543.

192. Sobiech E., Bakonska-Pacon E. / Nie swoiste reakcje serologiczne w diag-nostyce niedokrwistosci zakaznej koni // Med. Veter. 1991, - т.11. - S.509-511.

193. Solsona M., Perrin В., Perrin M. And Moussa A. / Detection of antibodies to bovine infectious rhinotracheits virus by the ELISA technique // Bill. Acad. Vet. France. 1980, - 53. - P.215-225.

194. Suquira T. and Nakajima H. / Purification of equine infectious anemia virus antigen by affinity chromatography // Y. Clin Microbiol. 1977, - №5. -p.635-639.

195. Sugiura T., Matsumara T. and Fukunaga Y. / Diagnosis equine infectious anemia by enzyme-linked immunosorbent assay with viral antigen purified by affinity chromatography. // Bull. Equine Res. Inst. 1986, - v.23. - P.42-48.

196. Sugiura T., Kondo T., Matsumara T., Imagawa H., Kamada M., Thara T. / Field application of enzyme-linked immunosorbent assay for screening of equine infectious anemia // J. Equine Sc. 1995, - v.6, - №15. - P.15-20.

197. Suzuki T., Ueda S. and Samijima T. / Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of equine infectious anemia // Vet. Microbiol. 1982, - v.7. -P.307-316.

198. Tanaka K., Sakaki K. / Neutralization test on serum from horses infected with the vims of equine infectious anemia // Nat. Inst. Anim. Hlth. Quart. 1962, -v.2, - №1. - p.128-139.

199. Taylor G.R. / Immunoperoxidase techiniques // Arch. Pathol. And Labor. Med. 1978, - v. 102, - №3. - P. 113-121.

200. Tashijan R.J., Crusberg T.C. / Equine infectious anemia as an AIDS animal model // J. Equine Veter. Sci. 1989, - v.9, - №2. - P.105-110.

201. Threadgill D.S., Steagll M.K., Flaherty M.T. / Characterization of equine infectious anemia virus dutpase: growth properties of a dutpase-deficient mutant // J. virol. 1993, - v.67, - №5. - P.2592-2600.

202. Todd D., Adair B.M. and Wibberley G. / An enzyme linked immunosorbent assay for enzootic bovine leukosis virus antibodies // Vet. Rec. 1980, - 107. -P. 124-126.

203. Tokui T., Hirato K. and Miura S. / Studies of the equine infectious anemia virus in tissue cultures. IV. The in vitro neutralization test // Rep. Res. Equine Infect Anemia (In Yapanese). 1968, - v.3. - P. 12-20.

204. Trivers G.E., Harris C.C., Rougevit C., Dray F. / Development and use of ultrasensitive enzyme immunoassay. // Meth. Enzymol. 1988, - v. 103. -P .409-434.

205. Udea S. / Studes on complement-fixation reaction in equine infectious anemia. II. Identification of complement-fixing inhibitors. // Jap. J. Microbiol. 1975, -v.19. - p.173-180.

206. Usimi C., Nakajima H. and Tanaka S. / Demonstration of equine infectious anemia viral antigen by immunofluorescence // Nat. Inst. Anim. Hlth. Quart. -1970, v.10, - №12. - P.90-91.

207. Vallee H. and Carre H. / sur la natura infectiruse de l'amenie du cheval // Hebd. Seans. Acad. Sci., Paris. 1904, №139. - P.331-333.

208. Voller A., Bidwell D., Huldt G., Engvall E. / A microplate method of enzyme linked immunosorbent assay application to malaria // Bull. Wld. Org. 1974. -v.51. - P.209-211.

209. Van Weemen D.K., Schuurs A.H.W.M. / Immunoassays using antigen-enzyme conjugates // FEBS Lett. -1971, v.15. - P.232-236.

210. Van Weemen D.K. / ELISA: highligths of the present stata of the art // J. Virol. Meth. 1985, - v. 10, - №4. - P.371-378.

211. Voller A., Bidwell D.S. and Bartlett A. / Enzyme immunoassay in diagnostic medicine. Theory and practice // Bull. World. Health. Organ. 1976, - v.53, -P.55-65.

212. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A. / The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) A guide with abstracts of microplate applications. London, 1979.- 128 p.

213. Winston S., Fiscus S., Hesterberg L., Matsushita T., Milbrand M., Porter Y. and Teramoto Y. / Rapid detection of viral-specific antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) // Vet. Immunol. Immunopathol 1987, №17.- P.153-164.

214. Yeggo M.H. / Diagnosis of viral diseases using ELISA technigues // Nucl. and Related Rech. Anim Prd. and. Health Proc. Int. Symp., Vienna, 17-21 March 1986. P.289-301.

215. Yolken R.H. / Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): a practical tool for rapid diagnosis of viruses and other infections agents // Yale J. Biol. Med. 1980,-v.53.- P.85-92.

216. Yolken R.H., Leister F.J. / Staphylococcal protein A-enzyme immunoglobulin conjugates: Versatile Tools for enzyme immunoassay // J. Immunol. Meth. -1981, v.43, - №2. - P.209-218.

217. Young-Hae Chong; Payne S., Issel C.J., Montelaro R.C., Rushlow K.E. / Characterization of the antigenic domains of the major core protein (p 26) of equine infectious anemia virus // J.Virol. 1991, - v.65, - №2. - P.1007-1012.

218. Zaitsu K., Ohkura Y. / New fluorogenic Substrates for horseradish peroxidase: rapid and sensitive assay for hydrogen peroxidase and the peroxidase // Anal. Biochem. 1980, - v. 109. - P. 109-113.

219. Zheng V.H., Sentsui H., Nakaya T. / In vivo dynamics of equine infectious anemia viruses emerging during febrile episodes: Insertions duplication at the principal neutralizing domain // J. Virol. 1997, - v.71, - №7. -P.5031-5039.

220. Zientara S., Labie I., Gicquel B. / Anemie infectiouse des eqeudes: situation actuelle // Prat. Veter. Equine. 1994, - v.26, - № 1. - P.5-7.