Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка тест-систем для диагностики герпесвирусной инфекции кошек на основе иммунологических методов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-систем для диагностики герпесвирусной инфекции кошек на основе иммунологических методов"

На правах рукописи

Перепечаев Константин Андреевич

Разработка тест-систем для диагностики герпесвирусной инфекции кошек на основе иммунологических методов

03.00.23 - биотехнология 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗОЬЙЬ д.^

Щелково - 2007

003065615

На правах рукописи

Перепечаев Константин Андреевич

Разработка тест-систем для диагностики герпесвирусной инфекции кошек на основе иммунологических методов

03.00.23 - биотехнология 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2007

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор - Уласов Валентин Ильич Научный консультант:

доктор биологических наук - Кузнецова Светлана Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук - Клюкина Валентина Ивановна доктор биологических наук, профессор Тихонов Игорь Владимирович

Ведущее учреждение ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р Коваленко»

Защита состоится 5 октября 2007 года в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006 069 01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (141142, г Щелково, Московской области, пос. Биокомбинат, ВНИТИБП)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке ВНИТИБП

Автореферат разослан 4 сентября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ю Д Фролов

1. ВВЕДЕНИЕ 1.1. Актуальность темы Диагностика у кошек инфекционных заболеваний, проявляющихся респираторно-окулярным синдромом, чрезвычайно важна. Несмотря на то, что трудно оценить экономический ущерб, наносимый этой группой заболеваний питомникам породистых кошек и просто владельцам животных, не подлежит сомнению тот факт, что только наличие племенного ядра, свободного от респираторно-глазных инфекционных заболеваний позволяет получать здоровых котят, вести племенную работу, и, в конечном итоге, развивать зооиндустрию мелких домашних животных.

Респираторно-окулярный синдром у кошек вызывают различные патогенные микроорганизмы, такие как герпес и калицивирусы, хламидии, микоплазмы, но именно герпесвирусная инфекция кошек представляет наиболее серьезную проблему для фелинологов и ветеринарных врачей, по причине ее повсеместной распространенности, высокой вирулентности, тяжелых окулярных поражений, установления пожизненного носительства с эпизодами периодического выделения активного вируса после переболевания этой инфекцией и относительно слабой эффективности средств активной и пассивной иммунизации.

Для диагностики герпесвирусной инфекции кошек, российская ветеринарная практика имеет в своем распоряжении метод выделения вируса (ВВ) на культуре клеток и полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Метод ВВ, являясь классическим, надежным, специфическим и достаточно чувствительным диагностическим методом, в силу своей длительности (до 10 дней), высокой трудоемкости, сложности и дороговизны используется, в основном, лишь в научно - экспериментальных работах. Метод ПЦР, хотя и обладает чрезвычайно высокой чувствительностью и специфичностью -сложен в постановке

Метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-

чувствительность является действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Данный метод позволяет быстро получать результаты, не требует дорогостоящего оборудования или особых условий для работы и стерильности ИФА позволяет определять уровень антител как в сыворотке крови, так и во внутриглазной, спинномозговой жидкостях и даже в молоке, что необходимо при проведении любых научных и научно-практических исследований. С помощью ИФА можно проводить контроль эффективности вакцин и иммунных сывороток, определять напряженность иммунитета, что позволяет оценить степень защиты животных от заражения и заболевания Метод также чрезвычайно удобен для выявления вирусного антигена в смывах и соскобах со слизистой оболочки глаз, ротовой и носовой полостей.

Реакция иммунофлуоресценции, была предложена Кунсом в 1942 году, и ее трудно отнести к новым методам исследования. Однако, появление новых технологий, позволяющих получать монокпональные антитела, позволило значительно увеличить ее чувствительность и специфичность Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале РИФ является чрезвычайно ценным методом диагностики, его можно по праву отнести к экспресс-методам, поскольку он позволяет получить результат в течение 1-1,5 часов с момента взятия образца на анализ, прост в исполнении, не требует стерильной работы.

Таким образом, существуют все предпосылки для расширения спектра методов диагностики герпесвирусной инфекции кошек, поскольку быстрый и точный диагноз является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием

1.2. Цели и задачи исследования В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось создание диагностикумов на основе очищенного и концентрированного вируса ГВК-1,

штамм «Гранд», для использования его в качестве компонента наборов при определении уровня антител и детекции антигенов вируса ГВК-1 в различных биологических субстанциях при иммуноферментной и люминисцентной диагностике герпесвирусной инфекции кошек Решались следующие задачи-

1.2.1. Разработать метод получения очищенного и концентрированного вируса ГВК-1, штамм «Гранд», репродуцированного в перевиваемой культуре клеток СгРК.

1.2 2 Получить иммуносорбенты на основе активированной ВгСИ Сефарозы 4В с иммобилизованным в качестве антигена очищенным и концентрированным вирусом ГВК-1

1.2.3 Выделить антитела к вирусу ГВК-1 из сыворотки естественно переболевших кошек методом аффинной хроматографии и получить пероксидазный и ФИТЦ-конъюгаты антител к антигенам ГВК-1

1.2.4. Выделить кошки, получить антисыворотку к кошки на кроликах и получить пероксидазный и ФИ'ГЦ-коньюгаты с анти-^С кошки.

1.2 5 Разработать тест систему для определения уровня антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек в непрямом твердофазном ИФА

1.2 6. Разработать тест систему для детекции антигена ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта в прямом и непрямом твердофазном ИФА.

1 2.7. Разработать тест систему для определения антигенов вируса ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта в непрямой и прямой РИФ.

1.2 8. Провести сравнительную оценку эффективности детекции вируса в прямой и непрямой РИФ, прямом и непрямом твердофазном ИФА и методом зирусовыделения на культуре клеток.

12 9. Провести сравнительную оценку определения уровня антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек методами реакции нейтрализации на культуре клеток и непрямого твердофазного ИФА

1.3. Научная новизна

В результате проведенных исследований:

испытаны различные методы очистки и концентрирования кулвтурального вируса ГВК-1 штамм «Гранд», репродуцированного в перевиваемой культуре клеток СгБК и на их основе разработана схема получения очищенного и концентрированного вируса ГВК-1,

- разработана методика выделения кошки и усовершенствована схема иммунизации лабораторных животных, обеспечивающая получение высокоактивных специфических гипериммунных сывороток к кошки,

- разработана методика использования непрямой и прямой РИФ для определения антигенов вируса ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта;

- разработаны методики получения компонентов и отработаны условия постановки непрямого твердофазного ИФА для определения уровня антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек и твердофазного ИФА для определения антигенов ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта;

- установлена достоверная корреляция результатов, полученных при выявлении антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек в непрямом твердофазном ИФА и реакции нейтрализации и детекции вируса в прямой и "непрямой РИФ, прямом и непрямом твердофазном ИФА и методом

вирусовыделения на культуре клеток.

1.4. Практическая значимость работы

Разработаны методики получения компонентов для иммуноферментных и люминесцентных тест-систем, предназначенных для диагностики герпесвирусной инфекции кошек. На основе проведенных исследований разработаны методические рекомендации по определению уровня антител к ГВК-1 и антигенов ГВК-1 в иммуноферментном и РИФ-анализах «Методические рекомендации по лабораторной диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммуноферментного анализа (ИФА)»,

«Методические рекомендации по серологической диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммуноферментного анализа (ИФА)» и «Методические рекомендации по применению для диагностики герпесвируса кошек тип 1 (FHV-1) анти- FHV-1 флюоресцирующих антител» Разработанные методики определения уровня антител в РИФ и ИФА рекомендуется использовать для оценки напряженности иммунитета, определения материнских антител у котят с целью корректировки сроков первой вакцинации, а также в качестве методов контроля антигенной активности соответствующих моно- и поливалентных вакцин.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования постинфекционного и поствакцинального противовирусного иммунитета у кошек, а также дают возможность расширить научные знания относительно роли вирусов в возникновении массовых респираторных заболеваний кошек и могут быть использованы при дальнейшем изучении иммунологии и патогенеза инфекций, вызванных герпесвирусами.

1.6. Апробация результатов работы Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на

заседаниях Ученых Советов и Методических комиссий ФГУ «ВГНКИ» (2003

- 2005 гт.) и ВНИТИБП (2003-2006 гг), на научных конференциях:

«Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких

домашних животных» - Всероссийская научная конференция аспирантов и

студентов - Троицк, 2003; Всероссийском ветеринарном конгрессе - 13-м

Московском международном ветеринарном конгрессе по болезням мелких

домашних животных - Москва, 2005; Научной конференции молодых

ученых и аспирантов ФГУ «ВГНКИ» - Москва, 2005; Международной

научно-практической конференции, посвященной 35-летию института

ВНИТИБП - Щелково, 2005

1.7. Публикации работ

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ

1.8, Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 149 страницах, включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, список используемой литературы, практические предложения и приложения Список литературы включает 190 источников, из них 148 источников иностранных авторов. Работа иллюстрирована 18 таблицами, 38 рисунками. В приложении к диссертации представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их практическую значимость.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы Работа выполнена в 2003 - 2006 гг., в лаборатории молекулярной биологии Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук

2.1.1. Репродукция герпесвируса кошек тип 1 (ГВК-1), В качестве исходного материала использовали штамм «Гранд» вируса ГВК-1 с титром инфекционности 5,0-6,0 1§ ТЦЦ 50 /мл, полученный из ФГУ ВГНКИ, репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки кошки (СгИС)

2.1 2. Дезинтеграция клеточной суспензии СгЕК-ГВК-1 Инфицированную клеточную и контрольную культуры дезинтегрировали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз

2.1.3 Концентрирование и очистка вируса ГВК-1 Было использовано несколько принципов выделения вируса из вируссодержащих суспензий осаждение ПЭГ, высаливание сульфатом аммония, высокоскоростное центрифугирование и центрифугирование в ступенчатом градиенте плотности сахарозы, а также, осаждение на градиентную интерфазу сахарозы.

2.1.4. Определение титра инфекционности вируса ГВК-1 проводили в 24-луночных панелях по ТЦЩо/мл на культуре клеток СгБК.

1 1.5. Общий белок определяли по методу Лоури и др и на спектрофотометре СФ-26 (Россия). '

2.1.6. Вируснейтрализуюшая_(ВН)_активность Титр

вируснейтрализующей (ВН) активности сывороток, и антй-ГВК-1 антител определяли в реакции вируснейтрализации (РН) титрованием на 96-ти луночных микропланшетах по методу Florent G. и др.

2.1 7. Выделение антител к ГВК-1. Антитела к вирусу ГВК-1 выделяли из цельной сыворотки кошек Очистку антител проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным на ВгСп-Сефарозе (Fluka), по стандартной методике, очищенным вирусом ГВК-1.

2 18. Получение и очистка IpG кошки Иммуноглобулины класса G (IgG) выделяли из цельной сыворотки кошки высаливанием сернокислым аммонием с последующим обессоливанием препарата гельфильтрацией на сефадексе G-25 и очисткой ионообменной хроматографией на DEAE-Toyopearl 650М.

2.1.9. Контроль чистоты препаратов leG кошки проводили с помощью диск-электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле (ПААГ), специфичность проверяли в иммуноэлектрофорезе

2 1 10. Гипериммунные антисыворотки к IgG кошки получали по методу, разработанному в лаборатории иммунологии и утвержденному на методическом совете ВНИТИБП. Активность антисывороток определяли в РДП по методу Оухтерлони. Специфичность полученной антисыворотки определяли в иммуноэлектрофорезе.

2.1.11. Очистка анти-IpG кошки Очистку анти-lgG проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными на ВгСп-Сефарозе (Fluka), по стандартной методике, очищенными иммуноглобулинами класса G.

2 1 12 Получение коньюгатов анти-lgG кошки и антител к ГВК-1 с пероксидазой из хрена (RZ>3,0, Sigma) использовали периодатный метод Nakane Р.

2,1.13 Получение ФИТЦ- коньюгата анти-1еС кошки и антител к ГВК-1 Конъюгирование проводили в течение 18 ч при 4°С в темноте После окончания процесса избыток красителя удаляли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом 0-25.

2.1.14. Иммуноферментный анализ (ИФА) В работе использовали стандартный метод непрямого твердофазного ИФА на 96 луночных микролланшетах по Еп^аИ.

21.15. Реакция тшунофлюоресиениии (РИФ) Для исследования брали эпителиальные клетки конъюнктивы и роговицы. Результат микроскопии считали положительным при обнаружении свечения, оцениваемого не ниже чем на два креста, при отсутствии свечения в отрицательных контрольных препаратах.

3. Результаты исследований

3.1. Репродукция ГВК-1 в перевиваемой культуре клеток почки котки -

СгРК

В качестве исходного материала использовали культуральный штамм «Гранд» вируса ГВК-1 с титром инфекционности 5,0-6,0 ТЦД 50 /мл, полученный из ФГУ ВГНКИ, репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки кошки.

Перевиваемую культуру клеток почки кошки выращивали в 1,5 -литровых стеклянных матрасах. Посевная Концентрация клеток составляла 120-150 тыс/мл. Вирус инкубировали в термостате при температуре 37°С. Формирование 100% монослоя наблюдали на 3-4 день. Пересевы клеток осуществляли после образования сплошного монослоя через каждые 3-4 дня

После образования монослоя клеток, его трижды отмывали раствором Хенкса и инокулировали ГВК-1 штамм «Гранд» из расчета 1-2 ТЦЦ50 на клетку После проявления 80% ЦПД клетки разрушали однократным замораживанием-оттаиванием и осаждали клеточный детрит центрифугированием при 5000 об/мин в течение часа.

Определение титра инфекционности ГВК-1 проводили в 24-луночных панелях по Т1Щз0/Мл на культуре клеток СгРК. Результаты оценивали по цитопатическому действию через двое - трое суток после заражения клеток и рассчитывали титр вируса по методу Ашмарина И.П. Титр инфекционности был равен 7,5 % ТЦЦзо/мл Первые признаки цитопатического действия вируса наблюдали через 24 часа инокуляции. Через 48 часов наблюдали поражение 45-50% монослоя клеток. К 72 часам после заражения цитопатический эффект наблюдали на 85-90% монослоя. Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать о пригодности перевиваемой культуры клеток почки кошки-СгРК для репродукции вируса ГВК-1

3.2. Очистка и концентрирование герпесвируса кошек тип 1 (ГВК-1) Для получения очищенных и концентрированных препаратов ГВК-1 было использовано несколько принципов выделения вируса из вируссодержащих суспензий: осаждение ПЭГ, высаливание сульфатом аммония, высокоскоростное центрифугирование, центрифугирование в ступенчатом градиенте плотности сахарозы, а также, осаждение на градиентную интерфазу сахарозы. При концентрировании вируса ГВК-1 были изучены различные условия осаждения его полиэтиленгликолем (ПЭГ). Был испытан ПЭГ с различным молекулярными массами: 3000, 6000 и 20000 дальтон в концентрации 5.0, 7,5 и 10,0%. Лучшие результаты получены в случае применения ПЭГ М-6000 в концентрации 7,5%. Очистка вируса в этих условиях равна 66,3%, а потеря составляет 10,9%.

Для концентрирования вируса ГВК-1 также был использован принцип осаждения вируса высаливанием. Для этой цели использовали 40% сульфат аммония - (N114)2804. 71% ГВК-1 осаждается 40% сульфатом аммония при концентрировании в 10 раз. Очистка от балластных белков составляет в этом случае 29,7%.

Испытывался также метод осаждения вируса высокоскоростным ультрацентрифугированием. Вирус из предварительно осветленной низкоскоростным центрифугированием культуральной жидкости осаждали

при 100000§ в течение 1- 5 часов. Высокоскоростное центрифугирование позволяет практически полностью без потерь осадить вирус ГВК-1 из вируссодержащей суспензии. Очистка при этом достигает 88,7 - 92,1%.

Концентрированный и частично очищенный вирус ГВК-1 центрифугировали при 100000§ в ступенчатом градиенте сахарозы от 15 до 55% с диапазоном изменения концентрации в 10% По окончании центрифугирования собирали фракции по 1 мл. В каждой фракции измеряли рефрактометрический индекс и титр инфекционности. Пик инфекционной активности приходится на фракции с плотностью 1,20г/см3, соответствующий уровню 45% сахарозы, с выходом вируса до 99,99%. Одновременно происходит очистка ГВК-1 на 98,8%.

Определение плавучей плотности вируса ГВК-1, штамм «Гранд», позволило при очистке вируса использовать центрифугирование на «подушке» сахарозы или, иначе на градиентную интерфазу. На преформированный ступенчатый градиент наслаивали вирусный препарат. Центрифугирование проводили при 1610000 в течение 90 минут. Вирус локализовался в интерфазе между 25% и 55% сахарозы. Посторонние компоненты, с меньшей плавучей плотностью (белки и нуклеиновые кислоты), через зону 45% сахарозы не проходят и остаются в верхней части центрифужной пробирки. При этом достигается не только очистка на 98,4% (0,5мг/мл белка в исходном препарате и 0,08мг/мл — в конечном), но и концентрирование его в 10 раз Выход вируса составил 99,99%.

Определив условия концентрирования вируса ГВК-1, штамм «Гранд», репродуцированного в перевиваемой культуре клеток С№К, вышеописанными методами, была составлена схема получения концентрированного и очищенного вируса, включающая осаждение вируса из культуральной среды ПЭГ с молекулярной массой 6000 Д в концентрации 7,5%, переосаждение осадка ультрацентрифугированием при 9Q000g в течение 5 часов и осаждение полученного материала на градиентную интерфазу сахарозы

3.3. Получение кошки

Иммуноглобулин О из сыворотки крови кошки выделяли осаждением 33% сернокислым аммонием Полученную глобулиновую фракцию сыворотки обессоливали гель фильтрацией на сефадексе в-25 (РЬалпасш) в колонке К 26 х 70, уравновешенным 25мМ трис-НС1 буфером, рН 8,3

Выход очищенного иммуноглобулина составил 160мг. Чистоту препарата 1§0 - проверяли диск-электрофорезом в полиакриламидном геле - 7,5%. О чистоте препарата свидетельствовало наличие одной полосы, располагающейся ближе к катодной части столбика, на специфичность препарата - наличие одной дуги преципитации, характерной для

Таким образом, методом ионообменной хроматографии, получен высокоочшценный препарат кошки, необходимый для последующей гипериммунизации кроликов.

3.4. Получение антивидовых иммуноглобулинов (анти-1щО) кошки Гипериммунную антисыворотку к кошки получали на кроликах массой 2,5 - 3,0 кг В качестве антигена использовали - из сыворотки крови кошки, полученный методом ионообменной хроматографии. В результате реиммунизации были получены антисыворотки кролика к кошки с титром от 1:32 до 1:256

Анти-^О кошки выделяли из антисыворотки методом аффинной хроматографии на колонке с иммобилизированным на активированной ВгОЧ-Сефарозе 4В в качестве антигена кошки. Синтезированный иммуносорбент хранили в колонке при +4°С, В результате проведенной работы было получено 163 мг кроличьих анти-иммуногдобулинов к кошки.

3.5. Тест-система иммуноферментного анализа для определения уровня антител к вирусу ГВК-1

Раствор кроличьих анти-^О кошки, полученный из антисыворотки с помощью аффинной хроматографии, с концентрацией 1 мг/мл центрифугировали при 5000§ в течение 30 минут и концентрировали на

ультрафильтрационной ячейке ФМ02 на мембране, с пределом исключения 10 кД при давлении 1,5 мПа до концентрации IgG 10 мг/мл

В качестве фермента для маркирования антител использовали пероксидазу из хрена (ПХ), RZ - 2,9 - 3,3 (Sigma). Рабочее разведение полученного конъюгата определяли титрованием с гомологичным (IgG кошки) и гетерологичным (IgG кролика) иммуноглобулинами, Рабочая концентрация полученного иммунопероксидазного конъюгата составила 200 нг/мл (в расчете на ПХ). При данном разведении величина ОП450 в реакции с положительным антигеном составила 1,48, с отрицательным — 0,03. OIL^. Конъюгаты сохраняли свою активность после лиофильного высушивания в течение 1,5 лет (срок хранения коньюгатов).

Таким образом, для выявления специфических антител к вирусу ГВК-1 в сыворотках кошек были получены очищенный и концентрированный антиген, специфическая (из пунктов передержки бездомных животных) анти-ГВК-1 сыворотка, отрицательная (контрольная) сыворотка и коньюгат анти-IgG кошки с пероксидазой из хрена

Для определения оптимальной концентрации антигена при постановке ИФА его титровали с положительной и отрицательной сыворотками в разведении 1-200. Оптимальное разведение антигена составило 1мкг/мл, что обеспечивало высокий уровень оптической плотности (ОП490 равен 1,8 - 1,6) и достоверное различие результатов со специфической и контрольной сыворотками.

Для установления пороговой чувствительности ИФА определяли зависимость величины ОП490 продукта реакции от разведения сыворотки Опыт проводили при оптимальной концентрации сорбированного антигена вируса. Достоверно регистрируемое различие в показаниях ОП490 (более чем В 2 раза) наблюдалось при разведении специфической и контрольной сывороток с 1:400. Таким образом, была определена концентрация антигена вируса ГВК-1 и положительной сыворотки, которые могут быть

использованы для определения уровня антител к данному . вирусу иммуноферментным методом.

При разработке иммунологического контроля для подтверждения эффективности тест-системы использовали следующие критерии -воспроизводимость и чувствительность. В тесте на воспроизводимость коэффициент вариации и показатель степени адсорбции образца к среднему значению степени абсорбции положительной и нормальной контрольных сывороток были определены для оценки внутри - и межпланшетной воспроизводимости. Среди лунок коэффициент вариации варьировал от 3 до 6%, при определении специфических антител на планшетах вариация составила около 4% Коэффициент вариации между отдельными планшетами, был менее 4% для любой сыворотки и незначительно отличался между отдельными лунками

При определении чувствительное™ тест-системы планшеты были сенсибилизированы антигеном ГВК-1 в рабочей концентрации Методом ИФА было исследовано 63 сыворотки кошек, полученных из пунктов передержки бездомных животных и из ветеринарных клиник г. Москвы. Все сыворотки параллельно исследовали в реакции вируснейтрализации, Сравнительные исследования 63 сывороток кошек в ИФА и в РН показали, что 7 образцов сывороток были отрицательны в обеих реакциях, 12- имели в ИФА титр 1:200 и были отрицательными в РН, 44 исследуемые сыворотки были позитивны в РН и ИФА. Таким образом, в результате проведенных исследований были получены компоненты для проведения ИФА при определении уровня антител к вирусу ГВК-1, определены условия постановки реакции, доказана воспроизводимость и чувствительность разработанного теста.

3.6. Выделение антител к вирусу ГВК-1 из сыворотки естественно переболевших кошек методом аффинной хроматографии

1 Очищенный и концентрированный вирус ГВК-1 штамм «Гранд» был

Л

иммобилизован на ВгСЫ Сефарозу 4В. Синтезированный иммуносорбент хранили в колонке при +4°С. Полученный иммуносорбент был использован для аффинного выделения анти-ГВК-1 антител из сывороток естественно переболевших кошек. Для выделения специфических антител к ГВК-1 использовали сыворотки с титрами не ниже 1:3200. Все операции по выделению антител проводили при +4°С. Ход хроматограммы контролировали проточным УФ-детектором "иугсоМ. Элюированные с колонки антитела сразу переводили с помощью гель-хроматографии на Сефадексе 0-25 в 0,01 М фосфатный буфер. В результате проведенной работы было получено 250 мг антител к вирусу ГВК-1

3.7. "Реакция иммунофлюоресценции Для маркировки ФИТЦ использовали раствор аффинно очищенных антикв кошки и анти ГВК-1 антител (концентрация 5мг/мл). Конъюгирование проводили в течение 18 ч при 4°С в темноте. После окончания конъюгирования избыток красителя, не связавшегося с иммуноглобулином, удаляли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом 0-25 Выход меченного иммуноглобулина контролировали визуально и спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Окончательную очистку конъюгата проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке К 9X15 с ОВАЕ-Тоуореаг1650М

Таким образом, были получены конъюгаты с молярным соотношением 2-3.1 и рабочим разведением 164. Конъюгаты были лиофильно высушены и хранились при температуре 4°С до момента дальнейшего использования

Для исследования брали эпителиальные клетки конъюнктивы от кошек, с типичными клиническими признаками ГВК-1 инфекции — чихание, кашель, хемоз конъюнктивы, обильные слизисто-гнойные выделения из глаз.

В качестве положительного контроля использовали культуру клеток СгИС, выращенную на предметных стеклах и инфицированную ГВК-1 В

качестве отрицательного контроля « интактную культуру СгБК, ,и мазки эпителиальных клеток конъюнктивы от клинически здоровых кошек, нв: имеющих антител к вирусу ГВК-1 (сероотрицательные в ИФА). Оценку свечения проводили по четырехбальной системе.

Для определения вируса ГВК-1 в РИФ, образцы коиъюнктивальных соскобов, после соответствующей пробоподготовки, исследовали в прямой и непрямой РИФ. Результат микроскопии считали положительным при обнаружении свечения, оцениваемого не ниже чем на два креста, при отсутствии свечения в отрицательных контрольных препаратах.

Проведенные исследования показали, что, прямая и непрямая РИФ пригодны для выявления герпесвируса кошек в острый период болезни, когда вирус выделяется в наибольшем количестве.

3.8. Детекция вируса ГВК-1 в исследуемых образцах методом

ингибщювания антигена в иммуноферментном анализе Для определения чувствительности метода ингибирования антигена в непрямом твердофазном ИФА при детекции вируса ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях использовали референс-панель вируса герпеса кошек типа 1 штамма «Гранд», представляющую собой последовательные десятикратные разведения в ФБР-Т вируса, взятого в титре 7 1§ ТЦДзо/щ, На плашку сорбировали антиген ГВК-1 в сорбирующем буфере, инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре, затем пятикратно отмывали ФБР-Т. Предварительно инкубировали последовательные десятикратные разведения в ФБР-Т вируса ГВК-1 в восьми повторах (короткий ряд 96-луночного планшета) с положительной анти-ГВК-1 сывороткой взятой в разведении 1:800 в течение 1 часа при 37°С. Затем переносили содержимое каждой лунки в соответствующую лунку микропланшета с сорбированным антигеном ГВК-1. После часовой инкубации при комнатной температуре, плашки отмывали ФБР-Т и инкубировали еще час с рабочим разведением антивидового конъюгата (анти-1§0 кошки-ПХ) После добавления хромогена, результаты реакции

учитывали спектрофотометрически. В качестве контроля использовали культуральную жидкость интактной культуры клеток СгНК, Которую обрабатывали и исследовали аналогичным образом.

По результатам исследования, чувствительность тест системы с использованием референс панели ГВК-1 штамма «Гранд» составила 5 % ТЦЦ 50/мл, поскольку при данном разведении еще наблюдается достоверная разница между оптической плотностью вирусного материала и отрицательного контроля в соответствующем разведении.

3.9 .Детекция вируса ГВК-1 в конъюнктивальных соскобах методом ингибировапия антигена в непрямом твердофазном ИФА Было исследовано 20 образцов коныоктивальных соскобов от кошек из ветеринарных клиник г. Москвы, пунктов передержки животных и фелинологических питомников. Для детекции вируса ГВК-1 в конъюнктивальных соскобах методом ингибирования антигена в непрямом твердофазном ИФА использовали предварительно подготовленные, как описано в предыдущем разделе планшеты. При спектрофотометрическом учете результатов за положительный принимали результат, при котором значение ОП490 пробы было в 2 раза ниже ОП490 отрицательного контроля.

При детекции вируса ГВК-1 в коныоктивальных соскобах у 20 кошек были получены следующие результаты 10 образцов — положительны и 10 — отрицательны

3.10. Детекция антигенов вируса ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях с помощью тест-системы на основе афинпо-очищенных анти-ГВК-1 антител («сэндвич» ИФА) Для определения чувствительности метода «сэндвич» ИФА при детекции вируса ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях использовали референс-панель вируса герпеса кошек типа 1 штамма «Гранд» (аналогично п. 3 8 ) На плашку сорбировали анти-ГВК-1 антитела в концентрации 30 нг/мл. После 4 ч инкубации и промывки ФБР-Т в каждую лунку короткого ряда добавляли по 100 "мкл 10-кратных разведений каждой концентрации

вируса в восьми повторах. После часовой инкубации и промывки инкубировали еще час с рабочим разведением пероксидазного конъюгата анти-ГВК-1 антител После добавления хромогена, результаты реакции учитывали спектрофотометрически. В качестве контроля использовали культуральную жидкость интактной культуры клеток СгРК, которую обрабатывали и исследовали аналогичным образом.

По результатам исследования, чувствительность тест системы с использованием референс панели ГВК-1 штамма «Гранд» составила 2 ^ ТЦД 50/мя, что соответствует определению 10000-15000 вирусных частиц в 1 мл 3.11. Детекция вируса ГВК-1 в конъюнктивалъных соскобах методом «сэндвич» ИФА Для детекции антигенов вируса ГВК-1 в «сэндвич» ИФА, пробы конъюнктивалъных соскобов (те же, которые были использованы дня детекции ГВК-1 методом ингибирования антигена в ИФА) в объеме Юмкл смешивали с 90мкл ФБР, содержащем 0,1% Тритона Х-100, и вносили в лунки микропланшет, поверхность которых была заранее сенсибилизирована анти-ГВК-1 ^О в рабочей концентрации. После часовой инкубации при комнатной температуре и пятикратной промывки ФБР-Т в лунки добавляли коньюгат анти-ГВК-1 ^в-ПХ в рабочем разведении. После часовой инкубации с коньюгатом и отмывки реакцию проявляли субстратным буфером с ОФД. В качестве отрицательных контролей использовали пробы конъюнктивалъных соскобов от здоровых кошек, культуру клеток СгЕК и смывы с данной культуры В качестве положительных были использованы: культуральный вирус ГВК-1 штамм «Гранд» пассажи ВГНКИ и ВНИТИБП; инфицированная ГВК-1 культура клеток СгБК и смывы с инфицированной культуры. При спектрофотометр ическом учете результатов за положительный принимали результат, при котором значение ОПод пробы в два раза превышало ОП490 отрицательного контроля

При детекции вируса ГВК-1 в конъюгастивальных соскобах у 20 кошек были получены следующие результаты. 11 образцов - положительны (вирус ГВК-1 - выявлен), 9 образцов - отрицательны.

3.11. Детекция вируса ГВК-1 методами вирусовыделения, ингибирования антигена в ИФА и «сэндвич» ИФА и иммунофлюоресценции

Из ветеринарных клиник г. Москвы, пунктов передержки животных и питомников породистых кошек были получены 15 образцов конъюнктивальных соскобов, взятых у кошек с типичными признаками респираторно-глазной инфекции, взятые в острый период болезни (в течение 3-7 дней с момента начала заболевания). В качестве контролей были использованы конъюнктивальные соскобы от 5 клинически здоровых кошек (у 2 из них, в сыворотке крови отсутствовали анти ГВК-1 антитела в ИФА). Взятые образцы конъюнктивальных соскобов были использЬваны для детекции антигена ГВК-1 следующими методами: вирусовыделения на культуре клеток (ВВ), «сэндвич» тест в твердофазном ИФА; ингибирование антигена в непрямом твердофазном ИФА; прямой и непрямой реакции иммунофлюоресценции (пРИФ и нРИФ)

При ВВ вирусного материала в пробах определяли по цитопатической активности на культуре клеток СгРК. К недостаткам метода ВВ следует отнести невозможность оценки результатов ВВ при контаминации культуры клеток вторичной микрофлорой, возможность инактивации вируса при несоблюдении температурного режима в период транспортировки, связывание вируса антителами на поверхности слизистых оболочек и деградация ферментами слюны и слезы кошек, что, в некоторых случаях, является возможным объяснением низкой чувствительности метода выделения вируса на культурах клеток Нельзя не отметить и длительность (до 10 дней), высокую трудоемкость, сложность и дороговизну данного метода. Кроме того, при наличии других вирусов, дающих аналогичные клинические признаки и вызывающих сходную картину ЦПД (например,

калицивирус кошек), возникает необходимость в дополнительной верификации выделенного вируса другими методами.

Конкурентный ИФА, обладая аналогичной чувствительностью с сэндвич-методом, требует проведения дополнительного этапа - раститровки исследуемого образца и его взаимодействие с анти-ГВК-1 контрольной положительной сывороткой. Это увеличивает период времени, необходимый для получения результата, усложняет метод и требует дополнительных реактивов. По сравнению с конкурентным ИФА, «сэндвич» ИФА проще и быстрее

Метод непрямой РИФ также отличается от прямого РИФ наличием дополнительного этапа, связанного с нанесением на мазок первых анти-ГВК-1 антител, их инкубацией и промывкой, хотя, чувствительность прямой и непрямой РИФ - одинакова.

Таким образом, несмотря на пригодность всех вышеперечисленных методов для выявления ГВК-1 в острый период заболевания, с точки зрения простоты, удобства постановки реакции и быстроты получения результата метод тройного сэндвич ИФА и прямой РИФ имеют несомненные преимущества перед другими методами

ВЫВОДЫ

6.1. Предложена схема комбинированной очистки и концентрирования герпесвируса кошек, штамм «Гранд», репродуцированного в культуре клеток СгБК, позволяющая получать препараты вируса, очищенные на 91% в расчете на инфекционную дозу, с титром инфекционности на 1,6-2,0 1§ТЦД5о/мл выше, чем в исходной суспензии.

6.2. Показана возможность одноэтапного препаративного выделения антигена ГВК-1 из вирусосодержащей суспензии с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-ГВК-1 Сефарозе 4В

6.3. Усовершенствован метод выделения из сыворотки крови кошек и схема получения сывороток анга- кошки на кроликах с активностью в РДП 132 - 1:256.

6.4. Методом аффинной хроматографии с использованием иммуносорбента на основе активированной ВгСИ Сефарозы 4В с иммобилизованным в качестве антигена очищенным и концентрированным вирусом ГВК-1 выделены антитела к вирусу ГВК-1 из сыворотки естественно переболевших кошек и получены пероксидазный и ФИТЦ-конъюгаты с антителами анти-ГВК-1.

6 5. Разработаны тест-системы прямой и непрямой РИФ с использованием ФИТЦ-конъюгатов анти-ГВК-1 антител и анти-1{>0 кошки Методы позволяют определять вирус ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях и патологическом материале.

6 6. Разработана тест-система непрямого ИФА для выявления антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке кошек с использованием в качестве антигена очищенного и концентрированного вируса ГВК-1.

6.7 Разработанная тест-система для выявления анти-ГВК-1 антител позволяет определять вирус ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях и патологическом материале методом ингибирования антигена в конкурентном твердофазном ИФА

6.8. Разработан «сэндвич»-вариант ИФА с использованием коньюгата анти-ГВК-1 антител. Метод позволяет определять вирус ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях и патологическом материале, чувствительность тест-системы составила 2 ^ ТЦЦ50/Ш

6.9.Установлено, что методы вирусовыделения (ВВ), прямого и непрямого РИФ, непрямой конкурентный ингибирующий и сэндвич ИФА пригодны для выявления ГВК-1 в острый период заболевания, но с точки зрения простоты, удобства постановки реакции, быстроты получения

результата сэндвич-метод и прямой РИФ имеют преимущество перед другими методами

6.10. ИФА является наиболее быстрым, удобным, экономичным и надежным методом для определения анти- ГВК-1 антител, превосходит по чувствительности на 1-2 порядок реакцию нейтрализации (РН) и может быть рекомендован для выявления анти- ГВК-1 антител в низких титрах. >, ¡ *

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В практику предложены иммуноферментная и люминисцентная тест-системы, предназначенные для диагностики герпесвирусной инфекции кошек На основе проведенных исследований разработаны методические, рекомендации по определению уровня антител к ГВК-1 и антигенов ГВК-1 в иммуноферментном и РИФ-анализах: «Методические рекомендации по лабораторной диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммуноферментного анализа (ИФА)», «Методические рекомендации по определению уровня антител к вирусу герпеса кошек тип 1 (FHV-1) в крови кошек в иммуноферментном анализе (ИФА)» и «Методические рекомендации по применению для диагностики герпесвируса кошек тип 1 (FHV-1) анти-FHY-l флюоресцирующих антител»

Разработанные методики определения уровня антител в РИФ и ИФА рекомендуется использовать для оценки напряженности иммунитета, определения материнских антител у котят с целью корректировки сроков первой вакцинации, а также в качестве методов контроля антигенной активности соответствующих моно- и поливалентных вакцин

Список работ, опубликованных по теме диссертации;

1. Перепечаев К. А. - Герпесвирусная инфекция кошек, клиника, патогенез и лабораторная диагностика //Ж. «Ветеринария и кормление»-2007, №5, С 34-35.

2 Перепечаев К.А., Уласов В.И., Элизбарашвили Э.И -Глазные поражения при хроническом течении герпесвирусной инфекции кошек. // Материалы Всероссийской научной конференции аспирантов и студентов.

Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных, Троицк, 2003,4-8

3. Перепечаев К.А., Уласов В И, Элизбарашвили Э.И -Глазные поражения при остром течении герпесвирусной инфекции кошек. // Материалы Всероссийской научной конференции аспирантов и студентов: Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных, Троицк, 2003,8 -12.

4. Перепечаев К А., Уласов В И - Значение герпесвируса кошек (FHV-1) в формировании корнеального секвестра // Материалы 13-го Московского Всероссийского ветеринарного конгресса, 2005,124-125

5. Перепечаев К А., Кузнецов Д П, Уласов В.И. - Герпесвирусная инфекция кошек: клинические формы и патогенез заболевания, пути передачи инфекции, лабораторная диагностика // Журнал «БИО -Ветеринарная клиника», 2005,7,15 - 18.

6. Перепечаев К.А., Кузнецов Д.П., Уласов В,И. - Герпесвирусная инфекция кошек: клинические формы и патогенез заболевания, пути передачи инфекции, лабораторная диагностика Н Журнал «БИО -Ветеринарная клиника», 2005, 8,6 - 10

7. Перепечаев К.А., Кузнецов Д.П., Уласов В.И - Репродукция вируса инфекционного ринотрахеита кошек в перевиваемой культуре клеток CRFK // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию ВНИТИБП, 2005,113-117.

8. Перепечаев К.А., Кузнецов Д.П, Уласов В.И. - Концентрирование и очистка вируса инфекционного ринотрахеита кошек, штамм «Гранд», различными методами // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию ВНИТИБП, 2005,117-123

9. Перепечаев К А, Кузнецов Д.П., Уласов В.И. - Выделение антител к вирусу инфекционного ринотрахеита кошек из сыворотки естественно переболевших животных методом аффинной хроматографии. II Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию ВТЙТЙБП, 2005,123-127

. . 10^. Перепечаев К А., Кузнецов Д.П, Уласов В.И - Получение коньюгата анти-IgG кошки-ФИТЦ // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию ВНИТИБП, 2005,127132

11. Перепечаев К.А., Кузнецов Д.П., Уласов В.И // Разработка тест-системы для определения уровня антител к вирусу инфекционного ринотрахеита кошек в иммуноферментном анализе П Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию ВНИТИБП, 2005, 133-140.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Перепечаев, Константин Андреевич

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Вирус инфекционного ринотрахеита кошек герпесвирус кошек тип 1)

2.1.1. Историческая справка

2.2. Морфология вируса герпеса кошек

2.3. Химический состав вируса герпеса кошек

2.4. Очистка и концентрирование вирсуа герпеса кошек

2.5. Иммунитет при герпесвирусной инфекции кошек

2.6. Диагностика герпесвирусной инфекции кошек

2.6.1. Выделение вируса на культуре клеток

2.6.2. Реакция иммунофлюоресценции

2.6.3. Гистохимический вариант ИФА или иммунопероксидазная реакция

2.6.4. Диагностика герпесвирусной инфекции кошек в полимеразной цепной реакции

2 6.5. Реакция нейтрализации

2.6.6. Реакция гемагглютинации

2.6.7. Иммуноферментный анализ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка тест-систем для диагностики герпесвирусной инфекции кошек на основе иммунологических методов"

1.1. Актуальность темы

На сегодняшний день диагностика у кошек инфекционных заболеваний, проявляющихся респираторно-окулярным синдромом, чрезвычайно важна. Трудно оценить экономический ущерб, наносимый этой группой заболеваний питомникам породистых кошек и владельцам животных, но не подлежит сомнению тот факт, что только наличие племенного ядра, свободного от респираторно-глазных инфекционных заболеваний позволяет получать здоровых котят, вести племенную работу, и, в конечном итоге, развивать зооиндустрию мелких домашних животных. Кроме того, домашняя кошка, средой обитания которой является жилище человека, непосредственно и постоянно контактирует с ним, что заставляет нас заботиться о ее здоровье не только из соображений гуманности и любви к животным, но и ради гигиены и сохранения здоровья человека.

Респираторно-окулярный синдром у кошек вызывают различные патогенные микроорганизмы, такие как герпес и калицивирусы, хламидии, микоплазмы. Но именно герпесвирусная инфекция кошек представляет наиболее серьезную проблему для фелинологов и ветеринарных врачей по причине ее повсеместной распространенности, высокой вирулентности, тяжелых окулярных поражений, установления пожизненного носительства с эпизодами периодического выделения активного вируса после переболевания этой инфекцией и относительно слабой эффективности средств активной и пассивной иммунизации.

Сегодня для диагностики герпесвирусной инфекции кошек, российская ветеринарная практика имеет в своем распоряжении метод выделения вируса (ВВ) на культуре клеток и полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Метод ВВ, являясь классическим, надежным, специфическим и достаточно чувствительным диагностическим методом, в силу своей длительности (до 10 дней), высокой трудоемкости, сложности и дороговизны используется, в основном, лишь в научно - экспериментальных работах. Метод ПЦР, хотя и обладает высокой чувствительностью и специфичностью, не может являться экспресс-методом, так как сложен в постановке, требует дорогостоящего оборудования и его результаты трудно интерпретировать с точки зрения клинической значимости.

Метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) позволяет быстро получать результаты, не требует дорогостоящего оборудования или особых условий для работы и стерильности. ИФА позволяет определять уровень антител как в сыворотке крови, так и во внутриглазной, спинномозговой жидкостях и в молоке, что необходимо при проведении любых научных и научно-практических исследований. С помощью ИФА можно проводить контроль эффективности вакцин и иммунных сывороток, определять напряженность иммунитета, что позволяет оценить степень защиты животных от заражения и заболевания. Метод также чрезвычайно удобен для выявления вирусного антигена в смывах и соскобах со слизистой оболочки глаз, ротовой и носовой полостей.

Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа.

Для получения антивидовых иммуноглобулинов животных, меченых пероксидазой из хрена (ПХ), необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов в, М и А классов.

Методы выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека разработаны детально, но применительно к иммуноглобулинам животных они не всегда эффективны. Использование многих иммунологических методов для решения прикладных задач в области ветеринарии сдерживается отсутствием коммерческих моноспецифических антисывороток. Идеальным условием получения моноспецифических антисывороток представляется иммунизация продуцентов чистыми антигенами.

Ключевым моментом в отработке твердофазного непрямого ИФА является получение коньюгата, то есть иммуноглобулина меченого пероксидазой. Качество получаемого коньюгата находится в прямой зависимости от серологической активности иммуноглобулина, активности фермента и условий связывания этих компонентов.

Реакция иммунофлуоресценции, была предложена Кунсом в 1942 году, и ее трудно отнести к новым методам исследования. Однако, эта реакция получила в настоящее время "вторую жизнь" благодаря появлению гибридомных технологий, позволяющих получать моноклональные антитела. Их применение позволило значительно увеличить ее чувствительность и специфичность.

Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. РИФ является чрезвычайно ценным методом диагностики, его можно по праву отнести к экспресс-методам, поскольку он позволяет получить результат в течение 1-1,5 часов с момента взятия образца на анализ, прост в исполнении, не требует стерильной работы.

Таким образом, существуют все предпосылки для расширения спектра методов диагностики герпесвирусной инфекции кошек, поскольку быстрый и точный диагноз является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.

1.2. Цели и задачи исследования

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось создание диагностикумов на основе очищенного и концентрированного вируса ГВК-1, штамм «Гранд», для использования его в качестве компонента наборов при определении уровня антител и детекции антигенов вируса ГВК-1 в различных биологических субстанциях при иммуноферментной и люминисцентной диагностике герпесвирусной инфекции кошек.

Решались следующие задачи:

1.2.1. Разработать метод получения очищенного и концентрированного вируса ГВК-1, штамм «Гранд», репродуцированного в перевиваемой культуре клеток CrFK.

1.2.2. Получить иммуносорбенты на основе активированной BrCN Сефарозы 4В с иммобилизованным в качестве анигена очищенным и концентрированным вирусом ГВК-1.

1.2.3. Выделить антитела к вирусу ГВК-1 из сыворотки естественно переболевших кошек методом аффинной хроматографии и получить пероксидазный и ФИТЦ-конъюгаты антител к антигенам ГВК-1.

1.2.4. Выделить IgG кошки, получить антисыворотку к IgG кошки на кроликах и получить пероксидазный и ФИТЦ-коньюгаты с анти-IgG кошки.

1.2.5. Разработать тест систему для определения уровня антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек в непрямм твердофазнм ИФА.

1.2.6. Разработать тест систему для детекции антигена ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта в прямом и непрямом твердофазном ИФА.

1.2.7. Разработать тест систему для определения антигенов вируса ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта в непрямой и прямой РИФ.

1.2.8. Провести сравнительную оценку эффективности детекции вируса в прямой и непрямой РИФ, прямом и непрямом твердофазном ИФА и методом вирусовыделения на культуре клеток.

1.2.9. Провести сравнительную оценку определения уровня антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек методами реакции нейтрализации на культуре клеток и непрямого твердофазного ИФА

1.3. Научная новизна

В результате проведенных исследований:

- испытаны различные методы очистки и концентрирования культурального вируса ГВК-1 штамм «Гранд», репродуцированного в перевиваемой культуре клеток СгИС и на их основе разработана схема получения очищенного и концентрированного вируса ГВК-1;

- разработана методика выделения кошки и усовершенствована схема иммунизации лабораторных животных, обеспечивающая получение высокоактивных специфических гипериммунных сывороток к кошки;

- разработана методика использования непрямой и прямой РИФ для определения антигенов вируса ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта;

- разработаны методики получения компонентов и отработаны условия постановки непрямого твердофазного ИФА для определения уровня антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек и твердофазного ИФА для определения антигенов ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта;

- установлена достоверная корреляция результатов, полученных при выявлении антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек в непрямом твердофазном ИФА и реакции нейтрализации и детекции вируса в прямой и непрямой РИФ, прямом и непрямом твердофазном ИФА и методом вирусовыделения на культуре клеток.

1.4. Практическая значимость работы

Разработаны методики получения компонентов для иммуноферментных и люминесцентных тест-систем, предназначенных для диагностики герпесвирусной инфекции кошек. На основе проведенных исследований разработаны методические рекомендации по определению уровня антител к ГВК-1 и антигенов ГВК-1 в иммуноферментном и РИФ-анализах: «Методические рекомендации по лабораторной диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммуноферментного анализа (ИФА)», «Методические рекомендации по серологической диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммунофрментного анализа (ИФА)» и «Методические рекомендации по применению для диагностики герпесвируса кошек тип 1 (FHV-1) анти- FHV-1 флюоресцирующих антител»

Разработанные методики определения уровня антител в РИФ и ИФА рекомендуется использовать для оценки напряженности иммунитета, определения материнских антител у котят с целью корректировки сроков первой вакцинации, а также в качестве методов контроля антигенной активности соответствующих моно- и поливалентных вакцин.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования постинфекционного и поствакцинального противовирусного иммунитета у кошек, а также дают возможность расширить научные знания относительно роли вирусов в возникновении массовых респираторных заболеваний кошек и могут быть использованы при дальнейшем изучении иммунологии и патогенеза инфекций, вызванных герпесвирусами.

1.5. На защиту выносятся следующие положения:

1.5.1. Схема очистки и концентрирования ГВК-1, штамм «Гранд», репродуцированного в культуре клеток СгРК.

1.5.2. Методика выделения кошки, получения анти-^в кошки на кроликах, и получения пероксидазного и ФИТЦ-коньюгатов с антикошки для использования последних в тест-системах индикации антигенов ГВК-1 и определения уровня анти-ГВК-1 антител.

1.5.3. Методика выделения анти-ГВК-1 анттел и получения пероксидазного и ФИТЦ-коньюгатов с анти-ГВК-1 анттелами.

1.5.4. Результаты выявления антгена вируса ГВК-1 в различных вариантах постановки РИФ и ИФА и антител к вирусу ГВК-1 в непрямом твердофазном ИФА

1.5.5. Результаты полученные при выявления антител к вирусу ГВК-1 в своротке крови кошек в непрямом твердофазном ИФА и реакции нейтрализации и детекции вируса в прямой и непрямой РИФ, прямом и непрямом твердофазном ИФА и методом вирусовыделения на культуре клеток.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Перепечаев, Константин Андреевич

6. ВЫВОДЫ.

6.1. Предложена схема комбинированной очистки и концентрирования герпесвируса кошек, штамм «Гранд», репродуцированного в культуре клеток СгБК, позволяющая получать препараты вируса, очищенные на 91% в расчете на инфекционную дозу, с титром инфекционности на 1,6-2,0 1§ТЦД50/мл выше, чем в исходной суспензии.

6.2. Показана возможность одноэтапного препаративного выделения антигена ГВК-1 из вирусосодержащей суспензии с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-ГВК-1Сефарозе 4В.

6.3. Усовершенствованы метод выделения из сыворотки крови кошек и схема получения сывороток анти- кошки на кроликах, позволяющая получать сыворотки с активностью в РДП 1:32 - 1:256.

6.4. Методом аффинной хроматографии с использованием иммуносорбента на основе активированной ВгСЫ Сефарозы 4В с иммобилизованным в качестве антигена очищенным и концентрированным вирусом ГВК-1 выделены антитела к вирусу ГВК-1 из сыворотки естественно переболевших кошек и получены пероксидазный и ФИТЦ-конъюгаты с антителами анти-ГВК-1.

6.5. Разработаны тест-системы прямой и непрямой РИФ с использованием ФИТЦ-конъюгатов анти-ГВК-1 антител и антикв кошки. Методы позволяют определять вирус ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях и патологическом материале.

6.6. Разработана тест-система непрямого ИФА для выявления антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке кошек с использованием в качестве антигена очищенного и концентрированного вируса ГВК-1.

6.7. Разработанная тест-система для выявления анти-ГВК-1 антител позволяет определять вирус ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях и патологическом материале методом ингибирования антигена в конкурентном твердофазном ИФА.

6.8. Разработан «сэндвич»-вариант ИФА с использованием коньюгата анти-ГВК-1 антител. Метод позволяет определять вирус ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях и патологическом материале, чувствительность тест-системы составила 2 ^ ТЦД 50/мл

6.9. Установлено, что методы вирусовыделения, прямой и непрямой РИФ, ингибирования антигена в ИФА и «сэндвич»-ИФА пригодны для выявления ГВК-1 в острый период заболевания, но с точки зрения простоты, удобства постановки реакции, быстроты получения результата метод «сэндвич»-ИФА и прямая РИФ имеют преимущество перед другими методами

6.10. ИФА является наиболее быстрым, удобным, и экономичным методом для определения анти-ГВК-1 антител, превосходит по чувствительности на 1-2 порядка реакцию нейтрализации (РН) и может быть рекомендован для выявления анти- ГВК-1 антител в низких титрах.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В практику предложены иммуноферментная и люминиецентная тест-системы, предназначенные для диагностики герпесвирусной инфекции кошек. На основе проведенных исследований разработаны методические рекомендации по определению уровня антител к ГВК-1 и антигенов ГВК-1 в иммуноферментном и РИФ-анализах: «Методические рекомендации по лабораторной диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммуноферментного анализа (ИФА)», «Методические рекомендации по серологической диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммуноферментного анализа (ИФА)» и «Методические рекомендации по применению для диагностики герпесвируса кошек тип 1 (FHV-1) анти- FHV-1 флюоресцирующих антител»

Разработанные методики определения уровня антител в РИФ и ИФА рекомендуется использовать для оценки напряженности иммунитета, определения материнских антител у котят с целью корректировки сроков первой вакцинации, а также в качестве методов контроля антигенной активности соответствующих моно- и поливалентных вакцин.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования постинфекционного и поствакцинального противовирусного иммунитета у кошек, а также дают возможность расширить научные знания относительно роли вирусов в возникновении массовых респираторных заболеваний кошек и могут быть использованы при дальнейшем изучении иммунологии и патогенеза инфекций, вызванных герпесвирусами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Перепечаев, Константин Андреевич, Щёлково

1. Авилов B.C., Мникова JT.A., Сологуб В.К., Коромыслов Г.Ф., Дзантиев Б.Б., Сорокина Н.В., Егоров A.M. // Иммуноферментный анализ // Ветеринария, 1981, 8, 33-35.

2. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. // Статистические методы в микробиологических исследованиях // JT, Медгиз, 1962.3. Биотехнология,— М., 1984.

3. Бобкова А.Ф., Чирков С.Н. // Применение иммуноферментного анализа для диагностики вирусных заболеваний растений (Обзор) // С/х биология, 1983, 5, 32-36.

4. Богаров А.Ф., // Вирусы группы герпеса, М., 1979.

5. Богаров А.Ф., Гофман Ю.П., Бикбулатов P.M. Морфология внутриклеточного паразитизма вируса герпеса человека // В кн., Труды стоматологов Лит. ССР, Каунас, 1967, 49.

6. Богаров А.Ф., Кицак В.Я. Некоторые аспекты персистенции вируса простого герпеса человека // В кн., Хроническая вирусная инфекция и ее роль в патологии человека. Новосибирск, 1978, 63 - 69.

7. Богаров А.Ф., Кицак В.Я., Богаров Е.Ф., Трухачев A.A. // Вирус простого герпеса, Новосибирск, Наука, 1982,4 27.

8. Брондз Б.Д. // Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологическом распознавании. // М., 1987.

9. Быкова H.H., Лукина В.А., Бойко A.A. // Сравнительная оценка иммуноглобулинов, меченых пероксидазой (иммуноферментных конъюгатов). // Передовой науч.-производст. Опыт в биологической промышленности, 1985, 9, 8-11.

10. Голшмид В.К., Шрешнев А.Г., Чензова О.И. // К методике выделения фракций IgG из кроличьих агглютинирующих сывороток. // Лаб.дело, 1976, 10, 601.

11. Жданов В.М., Гайдамович С.Я. // Частная вирусология, М., «Медицина», 2,375-412.

12. Игнатьев A.M., Мони Ю.В., Бабикова P.A., Петрова И.А. -Использование метода иммунофлуоресценции при диагностике Инфекции КРС // Сб. научн. Трудов МВА им. Скрябина, 1973, 70, 118119.15,1617,1821,22