Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Эпизоотологические особенности и повышение эффективности терапии калицивирусной инфекции кошек

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Эпизоотологические особенности и повышение эффективности терапии калицивирусной инфекции кошек"

На правах рукописи

ЯДРЕНКИНА ТАТЬЯНА ГЕННАДЬЕВНА

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ КАЛИЦИВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

КОШЕК

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

О 4 СЕН 2014

Новосибирск — 2014

005552218

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Глотова Татьяна Ивановна

Официальные оппоненты: Строганова Ирина Яковлевна,

доктор биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» профессор кафедры;

Петрова Ольга Григорьевна,

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Уральский государственный аграрный университет», профессор кафедры

Ведущая организация: ГНУ «Прикаспийский Зональный науч-

но-исследовательский ветеринарный институт» Россельхозакадемии

Защита состоится «14» октября 2014 г. в «14 00» часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01., созданного на базе ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62, E-mail: dis.ievsidv@list.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии и на сайте ИЭВСиДВ: www.ievsidv.ru: автореферат размещен на сайте ВАК РФ: wwvv.vak2.ed.gov.ru

Автореферат разослан « ^ » ав^С^Т? 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, канд. ветеринар, наук

Г.М. Стеблева

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вирус калицивироза кошек Feline calicivirus (FCV) является важным и весьма распространенным возбудителем. Он принадлежит к семейству Caliciviridae, включающему другие патогены, имеющие значение для человека и животных (М.М. Рахманина, 1994; В.Н. Сюрин, 1998; А.Н. Крылов, 2000; J.E. Sykes, 1998; A.D. Radford, 2007). Впервые вирус выделен из желудочно-кишечного тракта кошки в 1957 г. L. Fastier.

В настоящее время заболевание, вызываемое FCV, встречается у кошек во всем мире (S. Dawson, 1994, C.R. Helps, 2005). Вирус обладает высокой пластичностью генома, что позволяет ему быстро реагировать на различные экологические изменения. Мутационная изменчивость, характерная для FCV, объясняет клиническое разнообразие форм болезни: от субклинической с бессимптомным течением, поражений слизистой ротовой полости и глаз, верхних отделов респираторных органов с разной степенью тяжести, до системной инфекции, заканчивающейся часто гибелью животного (A.D. Radford, 2007).

Калицивирусная инфекция может охватывать от 5 до 91% восприимчивых животных, вызывать развитие ринитов, язв в полости рта и редко - пневмонии. Чаще встречаются слабовирулентные штаммы FCV, вызывающие умеренные признаки заболевания и низкую смертность. В последние годы встречаются сообщения о высоко вирулентных штаммах вируса, вызывающих дополнительно к описанным клиническим проявлениям подкожные отеки, хромоту и гибель животного (B.S. Schulz, 2011).

В настоящее время актуальным является изучение распространения и частоты проявления данной патологии у животных, получение изолятов вируса, поиск противовирусных препаратов, эффективных в отношении возбудителя кали-цивирусной инфекции кошек с целью оптимизации лечебных мероприятий.

Степень разработанности проблемы. На момент начала работы исследований по изучению частоты выявления FCV, тропности его к органам, противовирусной активности этиотропных препаратов в отношении возбудителя болезни в условиях in vitro и in vivo в нашей стране было недостаточно.

Изучению изменений эпизоотической ситуации по инфекционным болезням мелких домашних животных, обусловленных возросшим в последние годы в нашей стране интересом к разведению высоко породных, племенных животных посвятили свои работы М.М. Рахманина (1994-2005), Э.И. Элизбарашвили (2006), Л.С. Савойская (2006), C.B. Филатов (2008).

Распространению возбудителя инфекции среди популяции домашних кошек способствуют концентрация животных в питомниках по их разведению, перегруппировки, выставки, вязки и другие мероприятия, сопровождающиеся стрессами, при которых происходит реактивация вируса из латентного состояния, сопровождающаяся его репликацией и экскрецией во внешнюю среду с носовыми, глазными выделениями, а также слюной животных.

При данной патологии большую роль играет специфическая профилактика, поскольку иммунизированные животные легче переносят инфекцию, однако она не предотвращает персистентного состояния вируса.

Количество экспериментальных работ, посвященных изучению клинико-эпизоотологических аспектов калицивирусной инфекции кошек в различных климатогеографических регионах России, ограничено. Недостаточное внимание уделяется изучению частоты выявления вируса в органах и противовирусной активности препаратов, а также — разработке эффективных схем лечения.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изучение клини-ко-эпизоотологических аспектов калицивироза кошек в зависимости от способа содержания животных, определение частоты выявления вируса в органах, а также изучение противовирусной активности нового препарата в условиях in vitro и in vivo.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить особенности распространения, частоту выявления вируса в пробах биоматериала и органах животных, а также клинического проявления калицивирусной инфекции у кошек при индивидуальном и групповом их содержании.

2. Провести исследования по выделению вируса в первично трипсинизи-рованной и субкультуре почки эмбриона котенка, перевиваемой культуре клеток FK-81.

3. Определить противовирусную активность нового препарата рибави-рин-Липинт в отношении вируса калицивироза кошек in vitro и in vivo и разработать способ его применения для лечения больных животных.

Научная новизна работы. В результате клинического, вирусологического методов исследований установлено широкое распространение калицивирусной инфекции среди кошек г. Новосибирска при индивидуальном и групповом содержании. Подтверждено наличие как острой, субклинической, так и системной формы инфекции. Заболеваемость зависит от концентрации животных. Болезнь протекает чаще с изъязвлениями в ротовой полости, поражениями глаз и верхних дыхательных путей. Геном вируса можно обнаружить в слизистой оболочке носа, глаз и рта, а также легких, плевральной полости, брыжеечных лимфатических узлах, селезенке, печени, сердце и почках.

Получено четыре цитопатогенных изолята Feline calicivirus, обладающих характерными для представителей рода Vesivirus антигенными свойствами.

Изучена противовирусная активность нового препарата рибавирин-Липинт в отношении вируса калицивироза кошек in vitro и in vivo, разработана схема его применения для лечения калицивироза кошек.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как дают возможность расширить научные знания относительно роли вируса калицивироза кошек в возникновении массовых заболеваний у животных, сопровождающихся поражениями органов ротовой полости и респираторного тракта, глаз. Они могут быть использованы при дальнейшем изучении эпизоотологии вирусных инфекций у кошек с целью совершенствования лечебно-профилактических мероприятий.

Результаты исследований открывают возможность повышения уровня эффективности лечебных мероприятий при калицивирусной инфекции кошек

за счет использования препарата рибавирин-Липинт, обладающего выраженной противовирусной активностью в отношении FCV.

Методология и методы исследования. Методологическая основа исследований - анализ и синтез информации по изучению распространения заболевания, вызванного вирусом сем. Caliciviridae, представленной в отечественных и зарубежных источниках литературы. Для достижения поставленной цели были изучены основные характеристики FCV, клинические формы проявления заболевания, методы лабораторной диагностики, терапии и профилактики данного заболевания.

В работе использованы следующие методы исследований: эпизоотологи-ческие, клинические, биохимические, вирусологические, молекулярно-генетические.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов подтверждается большим объемом исследований, проведенных в динамике с 2008 по 2013 гг., анализом и статистической обработкой полученных данных и регистрационных материалов клиники «ДокторВет», результатов исследований, проведенных в лаборатории вирусологии ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии. Материалы диссертационной работы доложены на международных научно-практических конференциях: «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011), «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2012), «Фармакологическая научная конференция, посвященная 90-летию Рабиновича М.И.» (Троицк, 2012), «Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Монголии, Сибирского региона, Казахстана и Болгарии» (Улаанбаатар, 2013), «Молодежь в Аграрной науке и образовании - инновационный потенциал будущего» (Новосибирск, 2013), в сборнике трудов 8-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика» (Москва, 2014).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты изучения распространения и частоты выявления вируса в пробах биоматериала от больных животных, особенностей клинического проявления калицивирусной инфекции, частоты выявления вируса в органах инфицированных животных и получения изолятов вируса в культуре клеток.

2. Результаты изучения противовирусной активности нового препарата рибавирин-Липинт в отношении возбудителя калицивирусной инфекции кошек в условиях in vitro и in vivo на естественно инфицированных вирусом животных, а также разработки способа лечения калицивироза кошек.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки Российской Федерации («Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние животные», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»).

Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации использованы при разработке способа лечения калицивироза кошек, позволили подать заявку на изобретение РФ и получить патент (приложение 1).

Предложенный авторами способ лечения калицивироза кошек внедрен в практическую деятельность ветеринарных клиник городов: Новосибирск -

ООО «ДокторВет» (приложение 2); Челябинск- ООО «Ветлечебница Добрый доктор» (приложение 3); Красноярск - ООО «Провет» (приложение 4); Бердск — Бердская ветеринарная лечебница (приложение 5).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка сокращений, приложений. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 16 таблицами. Список литературы включает 205 источников, в том числе 153 зарубежных.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы

Работа выполнена в 2008-2013 гг. в лаборатории вирусологии Государственного научного учреждения Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии.

Распространение, особенности клинического проявления калицивироза кошек изучали путем осмотра животных, поступающих в ветеринарные клиники: «ДокторВет», ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии и др., а также - находящихся в условиях частных питомников по разведению кошек и приютах по содержанию бездомных животных в городах: Новосибирск, Бердск и Томск.

Лабораторные диагностические исследования проводили в лаборатории вирусологии ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии и частично в диагностическом отделе ветеринарной клиники «ДокторВет» (г. Новосибирск).

Вирусы и культуры клеток. Выделение вируса калицивироза кошек проводили в первично трипсинизированной и субкультуре почки эмбриона котенка, а последующее культивирование - в перевиваемой культуре клеток почки котенка - FK-81.

В опытах использовали вирус калицивироза кошек (штамм Ларс-ЗОДЕП). Культивирование и заражение клеток вирусом калицивироза кошек проводили в чувствительной перевиваемой линии культуры клеток FK-81 (почка котенка) во флаконах для клеточных культур (Nunc, Дания) до появления 100% цитопа-тогенного действия. Культуру клеток выращивали в среде Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов (производство ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН») с добавлением 5-10% эмбриональной сыворотки крови теленка (HyClone, lot №ASA28574), 0,06% L-глутамина и 100 мкг/мл канамицина. Культуру клеток культивировали при 37°С и 5% С02. В качестве поддерживающей использовали ту же среду без сыворотки.

Пробы биологического материала для исследования. От животных отбирали пробы выделений из носа, конъюнктивы и слизистой ротовой полости, которые замораживали и доставляли в диагностическую лабораторию в термосе со льдом для исследований посредством ПЦР.

Для изучения тропности вируса калицивироза к органам провели патолого-анатомическое вскрытие трупов 10 животных, павших после развития острой

формы инфекции. От них отбирали пробы биоматериала: кусочки легкого, печени, селезенки, заглоточных и брыжеечных лимфатических узлов и др., которые исследовали посредством ПЦР для установления распространения FCV в органах животных.

Препараты. Рибавирин-Липинт (серии 027, 010213, ЗАО «Вектор-Медика»).

Определение токсичности и противовирусной активности препаратов проводили в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005).

За опытными и контрольными животными вели клинические наблюдения, проводили биохимические исследования крови, ежедневный отбор проб биоматериала для вирусологического и серологического анализа.

Наличие специфических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови кошек определяли в реакции нейтрализации.

Постановку реакции нейтрализации проводили с постоянной дозой вируса (100 ТЦЦ 50/мл) и двукратными разведениями сыворотки крови, микрометодом в культуральных 96-луночных планшетах по методу M. Mochizuki, S. Konishi, 1977. Результаты реакции учитывали на 3 сутки после заражения монослоя культур клеток.

Учитывали наличие болезней, протекающих у кошек со сходной симптоматикой, - инфекционный ринотрахеит, коронавирусная инфекция и хламидиоз. Для проведения дифференциальной диагностики использовали коммерческие тест-системы: «Калицивир», «Риновир», «Коронавир» и «ХЛА-КОМ», разработанные ФГУ «ВГНКИ» совместно с Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии. ПЦР проводили на амплифи-каторе марки «Терцик».

В сыворотке крови определяли активность ферментов печеночного происхождения - трансаминаз и щелочной фосфатазы, а так же à-амилазы, мочевины, креатинина, общего и прямого билирубина, общего белка. Для этого использовали реактивы фирмы Biocon (производитель Германия).

Статистическую обработку результатов определения инфекционной активности вируса проводили по методу Reed и Mench (1938), выражая титр вируса в lg ТЦЦ 5 0/смЗ.

Математические расчеты. Достоверность результатов подтверждали путем статистической обработки и определения различий средних значений с помощью критерия Стьюдента. Для обработки полученных данных использовали программу «Microsoft Excel».

Личное участие. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. Автор выражает благодарность за помощь в выполнении некоторых разделов диссертации зав. отделом биотехнологии ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии А.Г. Глотову, старшему научному сотруднику лаборатории вирусологии О.В. Семеновой, гл. ветеринарному врачу клиники «ДокторВет», кандидату ветеринарных наук Т.Е. Тугуновой, а так же ЗАО «Вектор-Медика», предоставившему препарат рибавирин-Липинт.

2.2 Результаты исследовании

2.2.1 Эпизоотологические и клинические особенности проявления калицивирусной инфекции у кошек

Для изучения распространения калицивирусной инфекции кошек провели анализ и статистическую обработку регистрационных материалов клиники «ДокторВет», результатов исследований, проведенных в лаборатории вирусологии ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии за период с 2008 по 2013 гг.

Всего было обследовано 1125 животных, принадлежащих частным питомникам, заводчикам и приютам, в возрасте от нескольких недель (менее 1 месяца) до 18 лет. В результате проведенных исследований у 161 животного (14,3%) были выявлены клинические признаки, характерные для калицивирусной инфекции кошек. От этих животных были отобраны пробы биоматериала для исследования методом ПЦР.

Частота выявления вируса методом ПЦР в пробах биоматериала от животных с различными клиническими проявлениями инфекции в период 2008-2013 гг. составила 22,9%. В 0,7% случаев заболевания животных были вызваны ассоциацией трех возбудителей: БСУ (вирус калицивирусной инфекции кошек), РСоУ (вирус коронавирусной инфекции кошек) и РНУ-1 (герпес вирус кошек 1 типа); в 3,1 % — двух вирусов: БСУ, РСоУ; а в 2,9 % случаев — РСУ и РНУ-1 (табл. 1).

Таблица 1 - Выявление генома возбудителей инфекционных болезней кошек в пробах биоматериала методом ПЦР

п=517

Наименование возбудителя болезни Количество положительных проб/ %

В моноварианте

ШУ-1 71/15,8

РСоУ 76/16,9

РСУ 103/22,9

Бактерии сем. СЫатуйасеае 145/32,2

Ассоциации возбудителей

РСУ + РСоУ 14/3,1

РНУ-1 + РСУ 13/2,9

РНУ-1 + РСУ + Бактерии сем. СЫатусКасеае 3/0,7

РСУ + Сем. СЫатуШасеае 15/3,3

РСоУ+ РНУ-1+РСУ 3/0,7

РСоУ + РНУ-1 + РСУ + бактерии сем. СЫату&асеае 1/0,2

РСоУ + РНУ-1 2/0,4

РСоУ+ бактерии сем. СЫатусНасеае 3/0,7

РНУ-1+РСоУ+бактерии сем. СЫашуЛ'асеае 1/0,2

Всего 450/100,00

Не выявлено 67

Источником инфекции по данным анамнеза являлись персистентно инфицированные вирусом животные без выраженных клинических признаков заболевания, животные с субклинической формой инфекции, бродячие и бездомные, а также — котята из питомников.

Случаи заболевания регистрировали у животных различных пород (персидская, британская, сфинкс, шотландская вислоухая и ряда других, а также беспородных), содержащихся индивидуально или групповым методом. Максимальное количество инфицированных вирусом животных выявили среди беспородных кошек (30,4%), затем у персидских - 9,9%; сфинксов - 20,5; британских - 16,2 и прочих пород - 23%.

Также нами был проведен анализ возникновения заболевания у животных различных возрастных групп (табл. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее восприимчивыми к вирусу были котята 1-6-месячного возраста. У них часто выявляли острую форму инфекции, заканчивающуюся гибелью. У животных в возрасте от 6 до 10 лет заболевание чаще протекало в субклинической форме и сопровождалось периодами обострения с незначительным повышением температуры тела (до 39,2°С), поражениями десен, гиперсаливацией, а в некоторых случаях - желтухой.

Таблица 2 - Распространение калицивироза у кошек разных возрастных групп

Возраст животных Количество животных с калицивирозом / % (от общего числа выявленных больных животных)

До 1 мес 1/0.6

1...6 мес 64/39,8

7...12 мес 33/20,5

1...5 лет 48/29,8

6... 10 лет 9/5,6

Старше 10 лет 6/3,7

Всего 161/100,00

Наши исследования выявили ряд факторов, способствующих распространению инфекции среди кошек: контакт с персистентно инфицированными вирусом животными; наличие патологий верхних дыхательных путей; возраст (котята); нарушение правил зоогигиены; большая концентрация, отсутствие вакцинации или выборочная вакцинация животных.

Особей, инфицированных FCV, выявляли равномерно в течение года, независимо от сезона, что соответствует результатам, полученным другими исследователями (М.М. Рахманина, 2005; A.J. Coutts et al„ 1994; A.D. Radford et al., 2007).

2.2.1.1 Особенности клинического проявления системного калицивироза у кошек

«Системная вирусная инфекция» - этот термин используется для описания эпизоотологических, клинических и патологических данных проявления

особой формы заболевания калицивирусной инфекцией у кошек. Основные клинические признаки ее включают: лихорадку, устойчивую к действию антибиотиков, изъязвления в полости рта (как правило, на языке, коже и слизистых оболочках ротовой полости и носа); отек в области головы, распространяющийся на одну или несколько лап; язвы на коже (например, в области подушечек пальцев, нижних конечностей); желтуху. Смертность при данной форме инфекции может достигать до 50% (В. Капд е1 а!., 2008).

Случаи системного заболевания у кошек, вызванного высоко вирулентными штаммами БСУ, зарегистрированы и описаны в США, Англии, Франции и Германии.

В Российской Федерации ранее не было зарегистрировано и описано случаев системной калицивирусной инфекции у кошек.

В результате проведенных нами исследований в 2012 г. в одном из частных питомников г. Новосибирска была зарегистрирована вспышка системного калицивироза у кошек.

Она началась в ноябре и длилась в течение одного месяца. Клинические признаки были выявлены у трех из 7 животных питомника в возрасте 4-6 мес. В первые дни заболевания отмечали повышение температуры тела до 40,5 градусов, формирование отеков в области головы и передних конечностей, наличие эрозий на языке и слизистой рта, хромоту, риниты, конъюнктивиты, а в более поздние сроки - желтуху. Из трех заболевших одно животное было подвергнуто эвтаназии, одно погибло, а одно выздоровело благодаря проведенному лечению. Для подтверждения установленного клинического диагноза провели исследование проб биоматериала, отобранных от больных животных, методом ПЦР с применением обратной транскрипции (ОТ-ПЦР).

В результате проведенных исследований установленный нами клинический диагноз был подтвержден методом ОТ-ПЦР и выделения вируса в культуре клеток.

2.2.1.2 Распространение калицивироза у кошек в приютах по результатам ПЦР и серологических исследований

БСУ является широко распространенным среди кошек во всем мире, в частности у непривитых, бездомных животных и свободно гуляющих домашних, а также, проживающих в приютах и питомниках.

Для определения распространенности БСУ у кошек в приютах провели исследования проб биоматериала, отобранных от животных, методом ПЦР, а также - проб сыворотки крови от этих же животных на наличие вируснейтрали-зующих антител.

Обнаружение антител в сыворотке крови использовали в качестве доказательства предыдущего воздействия инфекционных агентов.

Обнаружение РНК вируса методом ПЦР в пробах биоматериала являлось доказательством выявления животных, инфицированных вирусом и вирусоно-сителей. Всего было обследовано 139 животных из пяти приютов с численностью животных от 23 до 35.

Частота выявления животных, серопозитивных к БСУ, в момент поступления в приюты, составляла 35%. Длительность пребывания животных в приюте сопровождалась ростом числа инфицированных вирусом животных. Количество положительных проб при повторном серологическом исследовании через 2 месяца увеличивалось до 42% (табл. 3). Уровень вируснейтрализующих антител у котят до 6 мес., как правило, составлял: 1:8-1:32, а у взрослых животных -1:4-1:1028.

Таблица 3 — Количество животных в приюте, имеющих антитела к FCV

п= 139

№ п/п Возрастная группа животных Количество серопозитивных к FCV животных/ % от общего количества обследованных животных

на момент поступления в приют после 2-х мес. пребывания в приюте

1 До 1 мес. 2/1,4% 3/2,2%

2 Старше 1 до 3 мес. 2/1,4% 4/2,8%

3 Старше 3 до 6 мес. 8/6% 9/6,5%

4 Старше 6 до 12 мес. 5/3,6% 8/5,7%

5 Старше 1 года до 6 лет 17/12,2% 18/13%

6 Старше 6 лет 15/10,8% 16/11,5%

7 Всего: 49/35% 58/42%

Результаты исследований свидетельствуют о том, что животные до 6-месячного возраста более восприимчивы к инфекции FCV, чем взрослые.

Длительность пребывания животных в приюте способствует увеличению числа инфицированных вирусом животных, что подтверждается ростом количества проб сыворотки крови с вируснейтрализующими антителами с 35% до 42%, а также ростом числа животных, выделяющих вирус с различными секретами с 36,5% до 42,8% после двух месяцев (срок наблюдения).

2.2.2 Выявление вируса калицивироза кошек в органах животных

Большинство исследователей чаще всего ассоциируют FCV с везикулярной болезнью. Однако описаны случаи его выделения от кошек с целым рядом различных синдромов. Вирус удавалось изолировать из содержимого кишечника (L. Fastier, 1957; M.J. Studdert, 1978; N. Nathanson et al., 2007; P.A. Pesavento et al., 2008), выявить в эпителии клеток респираторного тракта (Р.А. Pesavento et al., 2004, 2008).

Провели патологоанатомическое вскрытие 10 трупов, павших после развития острой формы инфекции животных. От них взяли пробы биоматериала: образцы легкого, печени, селезенки, заглоточных и брыжеечных лимфатических узлов и др. Их исследовали посредством ПЦР для установления распространения FCV в органах животных. Всего было исследовано 150 проб биоматериала. Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4 - Выявление БСУ методом ПЦР в пробах биоматериала различного происхождения

____п=150

Вид биоматериала Число положительных проб Процент положительных проб от числа исследованных

Легкие: верхняя доля нижняя доля 6 2 4 4,0 1,3 2,7

Лимфатические узлы: заглоточные брыжеечные 1 0 1 0,7 0 0,7

Выделения: изо рта из глаз из носа 22 5 8 9 14,7 3,3 5,3 6,0

Селезенка 1 0,7

Печень + желчный пузырь 2 1,3

Сердце 1 0,7

Почки 6 4,0

Выпот из плевральной полости 1 0,7

Мочевой пузырь+ моча 0 0

Содержимое желудка + слизистая оболочка 0 0

Кал 1 0,7

Всего 41 27,3

Из данных табл. 4 видно, что вирус чаще выявляли в пробах выделений (14,7%), легких и почках (4,0%), редко в лимфатических узлах, сердце, выпоте из плевральной полости, селезенке и кале (0,7%). Геном БСУ не обнаружен в пробах стенки мочевого пузыря и моче, слизистой желудка и его содержимом.

Вирус чаще удавалось обнаружить в нижней, чем верхней доле легкого, что, вероятно, обусловлено стадией развития и течением заболевания. Кроме того, удалось выявить одновременно геном двух вирусов: РСУ и РСоУ в почках (два животных) и в легких (одно), что свидетельствует об ассоциативном течении заболевания у кошек, вызванном этими вирусами.

2.2.3 Выделение вируса калицивироза в культуре клеток

Выделение вируса БСУ проводили в первично трипсинизированной культуре клеток почки эмбриона котенка, затем полученные изоляты вируса адаптировали к перевиваемой культуре клеток почки котенка РК-81, которую использовали для дальнейшего культивирования вируса и изучения его биологических свойств.

Для изоляции вируса в культуре клеток отобрали 8 проб биоматериала (смывы с носовой и ротовой полости), положительных на наличие РСУ при исследовании методом ПЦР (рис. 1).

Рисунок 1 - Электрофореграмма продуктов ПЦР для выявления FCV (1-4 -отрицательные пробы биоматериала; 5 - изолят Лорд; 6 - Тайсон; 7 - Персик; 8 - изолят Эшли)

Для получения первично трипсинизированной культуры клеток использовали почки эмбриона котенка, полученные при проведении стерилизации беременной кошки, тестированной на наличие вирусной инфекции, обусловленной FCV.

Цитопатогенное действие FCV проявлялось в округлении клеток, истончении и разрыве монослоя клеток. Сначала появлялись единичные участки повреждения в монослое, затем их количество и величина увеличивались, и через 24 часа регистрировали полное разрушение его целостности. Конечная картина ЦПД выражалась в гибели клеток и отслоении их в питательную среду.

Из восьми проб биоматериала удалось получить четыре изолята FCV: Лорд, Тайсон, Персик и Эшли, адаптированных к перевиваемой культуре клеток почки котенка FK-81, в которой накапливались до 7,5±0,14 ^ТЦЦ50/смз. Они обладали характерными для представителей рода Vesivirus антигенными свойствами.

Все изоляты оказались чувствительными к хлороформу, эфиру, трипсину и нагреванию до 50°С, не обладали гемагглютинирующими и гемадсорбирую-щими свойствами в отношении эритроцитов морской свинки, т.е. проявили свойства, характерные для FCV.

2.2.4 Противовирусная активность препарата рибавирин-Липинт в отношении вируса калицивироза кошек в опытах in vitro

Ранее было установлено, что рибавирин эффективен в отношении многих ДНК и РНК вирусов, в том числе и в отношении вируса калицивироза кошек (А.Г. Глотов, 2004; R.C. Povey, 1978). Несмотря на это он не нашел применения в ветеринарной практике из-за высокой токсичности.

В медицине в последние годы прошел клинические испытания новый препарат липосомального рибавирина — рибавирин-Липинт, обладающий меньшей токсичностью и более высокой терапевтической эффективностью, чем существующие препараты рибавирина. Уникальная нанотехнология позволила заключить рибавирин в мельчайшие, искусственно созданные биоконтейнеры -

липосомы, из которых препарат высвобождается постепенно, в нужных дозах, и самое главное - в определенных органах-мишенях (A.A. Gabizon, 2006).

Данных о противовирусной активности этого препарата в отношении возбудителя калицивирусной инфекции кошек нет.

Для определения противовирусной активности препарата в отношении вируса калицивироза кошек в условиях in vitro использовали штамм Jlapc-30ДЕП вирус калицивироза кошек. Инфекционную активность его определяли в чувствительной перевиваемой линии культур клеток почки котенка (FK-81).

В работе использовали коммерческий препарат рибавирин-Липинт (ЗАО «ВЕКТОР-МЕДИКА», серия 02э).

Оценку цитотоксичности препарата проводили по четырех крестовой системе, анализируя морфологию клеток и целостность монослоя культуры клеток почки котенка.

Исследование противовирусной активности препарата проводили, используя три нетоксичные для культуры клеток дозы рибавирина липосомаль-ного (0,05; 0,5 и 5,0 мг/см3). Культуру клеток FK-81 инфицировали 6,5 lg ТСЩо/одсмз вируса калицивироза кошек штамм Ларс-ЗОДЕП.

Наиболее эффективной в противовирусном отношении (рис. 2) в условиях in vitro оказалась концентрация испытуемого препарата - 5,0 мг/см3, которая приводила к снижению инфекционной активности вируса на 4,33 ^ТЦД50/см3.

Титр вируса, IgTLW 50/0,1 смЗ

Рисунок 2 - Противовирусная активность препарата рибавирин-Липинт в отношении вируса калицивироза кошек

2.2.5 Противовирусная активность препаратов рибавирин-Липинт в опытах in vivo и разработка способа лечения калицивироза

Для определения эффективной дозы препарата рибавирин-Липинт в очаге калицивироза сформировали 3 опытные группы кошек по принципу аналогов по 6 животных в каждой. У них отмечали: повышение температуры тела от 39,5 до 41,5°С, чихание, кашель, серозно-катаральные истечения из глаз и носа, отказ от еды, наличие эрозий на слизистой носа, ротовой полости и языка. У всех

лоза препарата 0,05 мг/смЗ доза препарата 0,5 мг/смЗ лоза препарата 5 мг/смЗ контроль внруса

животных клинически и по результатам вирусологических исследований установлена острая респираторная форма калицивироза, обусловленная наличием вируса.

Препарат рибавирин-Липинт выпаивали животным перед кормлением в соответствующих дозах: 1 группа — 20-25 мг/кг, 2-я - 30-35 и 3-я — 40-45 мг/кг массы тела животного, один раза в день в течение 10 дней.

За животными вели клинические наблюдения, биохимические исследования крови, ежедневный отбор проб биоматериала для проведения вирусологических исследований.

Критерием эффективности терапии являлась длительность проявления клинических признаков и сроки выявления вируса в носовых, конъюнктиваль-ных секретах и выделениях со слизистой ротовой полости. Одним из основных показателей клинического выздоровления являлось снижение температуры тела, восстановление аппетита, отсутствие истечений из носа и глаз, кашля и чихания, эрозий в ротовой полости.

Оптимальные результаты лечения калицивироза кошек получали при использовании рибавирина - Липинт в дозе 20-25 мг/кг (1-ая опытная группа). Увеличение дозы препарата до 30-35 мг/кг и 40-45 мг/кг не привело к значительным сокращениям длительности проявления клинических признаков у животных и сроков выявления вируса в пробах биоматериала у животных опытных групп 2 и 3 в сравнении с животными 1-ой опытной группы.

Важную информацию о функциональном состоянии печени дает определение в сыворотке крови активности ферментов печеночного происхождения -трансаминаз и щелочной фосфатазы. Анализ полученных нами данных свидетельствует о том, что увеличение дозы препарата до 30-35 мг/кг и 40-45 мг/кг сопровождалось ростом показателей Алт, АсТ и ЩФ в сыворотке крови животных опытных групп.

Для подтверждения оптимальных сроков лечения калицивироза кошек препаратом рибавирин-Липинт и лечебной эффективности выбранной нами дозы препарата провели производственный опыт на 32 кошках.

Результаты исследований показали, что уже на 5 день у 87,5% животных отсутствовали клинические признаки заболевания, а у 84,4% вирус не выявляли в истечениях из носа и слизистой ротовой полости. Эффективность лечения к 7 дню составила 90,6%, что является подтверждением высокой терапевтической эффективности разработанного нами способа применения препарата рибавирин-Липинт для лечения калицивирусной инфекции кошек.

3 ВЫВОДЫ

1. В результате диагностических исследований установлено широкое распространение калицивирусной инфекции среди кошек в Сибири. Частота выявления вируса в пробах биологического материала от животных разных пород и пола в возрасте от 1 мес. до 10 лет при индивидуальном содержании составила 22,9%. Кошки до 6-мес. возраста являются более восприимчивыми к инфекции FCV, чем взрослые, а само заболевание у них чаще протекает в острой форме.

У животных в возрасте от 6 до 10 лет чаще регистрируется субклиническая форма инфекции.

2. Зарегистрирован случай системной калицивирусной инфекции у кошек, сопровождающейся целым комплексом характерных для нее клинических признаков: повышением температуры тела до 40,5 градусов, формированием отеков в области головы и передних конечностей, наличием эрозий на языке и слизистой ротовой полости, хромоты, ринита, конъюнктивита, а в более поздние сроки - желтухи; гибелью животных, подтвержденный результатами ПТТР и выделения вируса в культуре клеток.

3. Частота выявления вируса в пробах биоматериала от животных при групповом содержании в приютах может достигать 36,5%. Уровень серопози-тивности животных к вирусу в момент их поступления в приют составлял 35%, в том числе у котят 6%, а у взрослых особей 23%. Увеличение сроков пребывания животных в приюте до двух месяцев (срок наблюдения) способствует росту количества инфицированных вирусом животных до 42%.

4. Анализ распределения FCV в организме инфицированного животного свидетельствует о том, что геном вируса можно обнаружить в слизистой оболочке носа, глаз и рта, а также легких, плевральной полости, брыжеечных лимфатических узлах, селезенке, печени, сердце и почках.

5. В перевиваемой и субкультуре почки эмбриона котенка получено четыре цитопатогенных изолята Feline calicivirus: Лорд, Тайсон, Персик и Эшли, адаптированных к перевиваемой культуре клеток почки котенка FK-81, в которой после трех «слепых» пассажей они накапливались в значительных количествах от 6,75±0,14 Ig ТЦД50/см3 до 7,5±0,14 lg ТЦД50/(:мз, обладали характерными для представителей рода Vesivirus физико-химическими свойствами.

6. Препарат рибавирин-Липинт не оказывает цитотоксического действия на ^культуру клеток FK-81 в максимальной дозе 5,0 мг/см3, обладает выраженной противовирусной активностью в отношении возбудителя калицивирусной инфекции кошек, в дозах 0,5 и 5,0 мг/см3 угнетает репродукцию возбудителя на 2,25 и 4,33 ^ТЦЦ50/см3 соответственно.

7. Разработанный способ лечения калицивироза кошек, включающий применение противовирусного препарата рибавирин-Липинт в дозе 20-25 мг/кг массы тела 1 раз в день, перед приемом корма, в течение 10 дней, обладает высокой терапевтической эффективностью, не ухудшает общее состояние организма животного и может быть использован для терапии калицивирусной инфекции кошек.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. При диагностике калицивирусной инфекции кошек необходимо исключать заболевания, протекающие со сходной клинической картиной: ринот-рахеит кошек, коронавирусная инфекция и хламидиоз. Диагностика заболевания должна складываться на основании особенностей клинического проявления болезни и результатов исследования проб биоматериала от животных методом полимеразной цепной реакции.

2. При групповом содержании необходимо проводить серологические исследования проб сыворотки крови в момент поступления в приюты для выявления инфицированных вирусом животных и разработки эффективных схем профилактики калицивирусной инфекции.

3. Для повышения эффективности лечения калицивирусной инфекции кошек необходимо использовать предложенный нами способ лечения, включающий применение противовирусного препарата рибавирин-Липинт в дозе 20-25 мг/кг массы тела 1 раз в день, перед приемом корма, в течение 10 дней.

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Глотова, Т.И. Противовирусная активность рибавирина лнпосо-мального в отношении вируса калицивнроза кошек / Т.И. Глотова, О.В. Кунгурцева, Т.Б. Тугунова, Т.Г. Ядренкина, А.Г. Глотов, H.A. Дон-ченко // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. — № 4. — 2012. — С. 92-97.

2. Глотова, Т.И. Распространение калицивируса среди кошек и его тропность к органам / Т.И. Глотова, Т.Г. Ядренкина, А.Г. Глотов, Т.Б. Тугунова // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние жнвотные. — № 4. — 2013. — С. 29-31.

3. Пат. 2480215 Российская Федерация, МПК А61К31/4196 А61Р31/12. Способ лечения калицивнроза кошек / Глотова Т.И., Глотов А.Г., Кунгурцева О.В., Тугунова Т.Б., Ядренкина Т.Г.; заявитель и патентообладатель Государств, науч. учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии. - № 2012103422/15 ; заявл. 01.02.2012 ; опубл. 27.04.2013, Бюл. № 12. - 6 с. : 4 ил.

4. Глотова, Т.И. Эпизоотологические и клинические особенности проявления калицивнроза у домашних кошек / Т.И Глотова, Т.Г. Ядренкина, Т.Б. Тугунова, А.Г. Глотов // Актуальные проблемы современной ветеринарии: матер, международ, науч.-практ. конф. — Краснодар, 2011. - С. 60-63.

5. Глотова, Т.И. Выделение вируса калицивнроза от кошек / Т.И. Глотова, О.В. Кунгурцева, Т.Б. Тугунова, Т.Г. Ядренкина, А.Г. Глотов // Актуальные вопросы ветеринар, медицины: матер. XI Сибирской ветеринар, конф. -Новосибирск, 2012. - С. 19-20.

6. Тугунова, Т.Б. Лечебная эффективность липосомального рибавирина при калицивирозе кошек / Т.Б. Тугунова, Т.Г. Ядренкина, Т.И. Глотова, А.Г. Глотов // Матер, фармаколог, науч. конф., посвящ. 90-летию М.И. Рабиновича: сб. науч. тр. ФГБОУ ВПО «УГАВМ». - Троицк, 2012. -С. 96-101.

7. Ядренкина, Т.Г. Вспышка системного калицивнроза у кошек / Т.Г. Ядренкина, Т.Б. Тугунова, А.Г. Глотов, Т.И. Глотова // Аграрная наука -сельскохозяйственному производству Монголии, Сибирского региона, Казахстана и Болгарии: сб. науч. докл. XVI междунар. науч.-практ. конф. — Улаан-баатар, 2013.-С.161-162.

8. Ядренкина, Т.Г. Новый способ лечения острой формы калицивироза кошек / Т.Г. Ядренкина, Т.И. Глотова, А.Г. Глотов, Т.Б. Тугунова // Молодежь в аграрной науке и образовании - инновационный потенциал будущего: матер. Всероссийской науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2013. — С. 144-146.

9. Глотова, Т.И. Распространение калицивироза у кошек в приютах по результатам ПЦР и серологических исследований / Т.И Глотова, Т.Г. Ядренкина, А.Г. Глотов, О.В. Семенова, Т.Б. Тугунова // Молекулярная диагностика 2014: сб. тр. VIII Всероссийской науч.-практ. конф. с междунар. участием. -Москва, 2014.-С. 440.

10. Глотова, Т.И. Выявление FCV в органах животных методом ПЦР / Т.И. Глотова, Т.Г. Ядренкина, А.Г. Глотов, Т.Б. Тугунова // Молекулярная диагностика 2014: сб. тр. VIII Всероссийской науч.-практ. конф. с междунар. участием. — Москва, 2014. - С. 458.

Подписано в печать 23.07.2014 г. Формат 60 * 84 '/,6. _Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 60.

Отпечатано в ГНУ СибНСХБ Россельхозакадемии 630501, Новосибирская обл., пос. Краснообск