Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование средств и методов лабораторной диагностики бешенства

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование средств и методов лабораторной диагностики бешенства"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

ВАЛИШИНА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

УДК 619:616 98:578.824.11:616 -076.

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Аспирант

03.00.06 — вирусология

Покров — 1992

РОССИЙСКАЯ

с о О У /*:: А Р С1 3 КI! ?-; л г* ---:-—

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии

Шучнкй руководитель - Доктор ветеринарных наук, про<1«?с;сор Вишдаков Иван Фёдорович

Официальные оппоненты - Доктор ветеринарных наук, профессор Лагуткин Николай Алексеевич (ВНЮТВнМ!

- Кандидат биологических наук, Калинина Тамара Андреевна (ПЗБ)

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт, г. Казань

Зашита состоится 17 декабря 1932 года в 10 часов на

заседании специализированного совета Д 120.61.01. во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120. г. Покров, Владимирской области. ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан ноября 1992 года.

Учёный сггсротарь специализированного совета, ____;тп? щ- гдат_петер:шар: тх наук Фёдоров Г. П.

- г -

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Несмотря на больше .успехи в изучении бешенства, во многих странах число случаев заболевания увеличивается, и болезнь по-прежнему наносит немалый урон. Одной из причин является несовершенство методов лабораторной диагностики (Бюллетень ВОЗ, Женева, «1987; Warrell et. al., 1988; IL T. Тарпис, H. A. Ковалёв, П. П. Кузнецов, 1990).

Для диагностики бешенства практическими лабораториями используются следующие методы: микроскопия мазков-отпечатков для обнаружения телец Бабеша-Негри, РДП, РСК, ММ, РН на мышах и Сиопроба на лабораторных животных (М. Каплан, Ш. Копровекий, 1975; IL А. Селимов, 1978; Hofbauer, 1979; Sureau, 1985; Warrell et. al., 1988; E Я Сюрин, Р. Е Бело-усова, H.R Фомина, 1991).

Каждый из применяемых методов имеет недостатки в плане чувствительности, воспроизводимости, экспрессности и технической простоты постановки.

1&тод выявления телец Бабеша-Негри имеет диагностическое Бначенле только при обнаружен™ типичных специфических включений.

РДП позволяет выявлять антигены и антитела к вирусу бешенства в долго хранившемся материале, однако материал, консервированный глицерином, формалином или другими средствами, для исследований непригоден (А. А. Росляков, 1970; Atañas i u et. al., 1971; Г. A. - Коломакин, НС. Тимонина, 1972). Метод малочувствителен и результаты учитывают только через 24-72 часа

Биопроба и РН на мышах для быстрой диагностики мало пригодны, так как учёт результатов проводят через 21 и 14 дней, соответственно (М. Каплан, IIL Копровекий, 1975).

ША - быстро выполнимый метод лабораторной диагностики бешенства. Однако противопоказано применение ЫФА для диагностики в течение 3-х месяцев после вакцинации, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса С К. Н. Бу-

чнев, 1971; Л. IL Горшунова, R И. Кошелёва, М.Н. Парасонис, 1971). В МФА не подлежат исследованию консервированные пробы и материал, имеющий признаки даже незначительного загнивания ( А. В. Мокроусова, 3. И. Тит лова, 1971). Для исследования большого числа проб метод требует подготовки специалистов в течение 1,5-2 лет и опыта исследований.

Разработанный в последние годы метод ТФ ИФА нашёл широкое применение в• медицинской ' и ветеринарной практике (Nicholson, Prestare, 1982; Kavaklova, Eskenary et. al., 1934; ILA. Хисматуллина, К.Ф. Бусыгин и др. , 1985; А.Д.. Ботвинкин, С. U. Чернов, Л. Я Грибанова, 1988; Э. Я. Сазано-ва, С. В. Кузнецова и др. , 1991). Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. В целом ряде сообщений указано, что этот метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, экс-прессностью, простотой и доступностью постановки (Б. Б. Дза-нтиев, А. М. Егоров, 1982; Zehetbauer, 1982; И. Ф. Вишняков, Л. Я Цыбанова, Т. В. Молчанова, JL Е Вергун, 1983; М. Б. Новикова, Е. М. Карасёва и др., 1987; Bass, Sharpee, Norden, 1987).

Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет, в своём распоряжении большой набор диагностических сывороток и ди-агностикумов, увеличение номенклатуры, улучшение качества и стандартизации диагностических препаратов для практических лабораторий остаётся важной задачей.

Для постановки серологических реакций в настоящее время используют антигены, приготовленные из мозговой ткани лабораторных животных, павших после интрацеребрального заражения фиксированным вирусом. Этот метод получения антигена нетехнологичен и небезопасен.

Указанные выше обстоятельства послужили основной предпосылкой для дальнейшего совершенствования средств и методов лабораторной диагностики бешенства. Актуальность работы обусловлена так?» необходимость» обеспечения ветеринарных

диагностических лабораторий безопасными диагностическими препаратами и высокопроизводительными методами.

Данная работа является результатом завершённых исследований по разработке усовершенствованию диагностики бешенства, выполненных во ВНИИБВиМ в соответствии с плановыми заданиями по научно-исследовательской работе.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований явилось совершенствование средств и методов лабораторной диагностики бешенства.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать метод изготовления универсального культу-рального инактивировэчного антигена, пригодного для постановки серологических реакций;

- изучить и определить оптимальные условия постановки ТФ ИФА для обнаружения специфических антигенов и антител;

- отработать методику постановки ВЙЭСФ для экспресс--диагностики бешенства;

- отработать реакцию иммунофлуоресценции с использованием микрокультуры клеток почки сайги (ПС) для обнаружения антигенов вируса'бешенства; ■

' - изучить диагностическую ценность отработанных методов и предложить схему лабораторной диагностики бешенства.

Научная новизна. Разработан способ изготовления универсального кульууралыюго антигена, включающий-культивирование вакцинного иди фиксированного вируса бешенства в культуре клеток ПО, обработку клеточного детрита ультразвуком в течение Б ± 0,5 мин, инактивацию препаратом А-24 (1,8,3,6 -диэндометилен - 1,3,6,8 - тетразациклодеканом) в течение 45 -50 часов при температуре 4°С с последующей лиофшшзацией. На метод изготовления антигена получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства Перевиваемую культуру клеток ПС впервые использовали для выращивания вируса бешенства.

В результате проведённых исследований разработан метод ТФ ИФА для выявление специфических антигенов и антител к

вирусу бешенства

Отработана реакция иммунофлуоресценции с использованием микрокультуры клеток ПС для выявления специфических антигенов вируса бешенства

Усовершенствован ВИЭОФ для обнаружения специфических антигенов и антител к вирусу бешенства

Практическая значимость и реализация результатов исследования. На основании экспериментальных исследований разработан и рекомендован для диагностических целей чувствительный, специфичный, высокопроизводительный и экспрессный метод ТФ ИФА, предназначенный для выявления специфических антигенов вируса бешенства в мозговых и вируссодержащих культуральных материалах, а также для обнаружения антираби-ческих антител в сыворотках крови вакцинированных животных.

Предложен способ изготовления универсального культу-рального специфического инактивированного антигена, пригодного для постановки диагностических реакций.

Рекомендована микрокультура клеток ПС для выявления специфических антигенов вируса бешенства методом иммунофлуоресценции.

Разработана НТД: Временная инструкция по изготовлению и контролю " Набора препаратов для диагностики бешенства животных методом твердофазного иммуноферментного анализа" и Наставление по его применению, а также " Методические указания по лабораторной диагностике бешенства животных методом твердофазного иммуноферментного анализа", утвержденные директором ВНИИВВкМ 29. 09.1992 г.

Апробация работы и публикация результатов. Результаты основных научных исследований апробированы и подтвержены комиссионными испытаниями (акт от 16.04.92г.), а также результатами экспертизных исследований 160 проб мозга и 725 проб сывороток крови диких и домашних животных из хозяйств различны/ регионов страны.

Штериалы диссертации доложены на научной конференции ВНЖВВиМ (1991г.) и на заседаниях ученого совета ВНИИВЕиМ (1990-1991гг.). По теме диссертации опубликовано 7 научных

работ, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства на изобретение.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту. Результаты разработки способа изготовления универсального культурального специфического инактивированного антигена вируса бешенства в культуре клеток' ПС и применения его для постановки серологических реакций.

Результаты разработки метода ингибирования и "Сзндвич"-варианта ТФ ИФА, предназначенных для диагностики бешенства.

Результаты экспериментальных исследований по совершенствованию реакции иммунофлуоресценции для выявления специфических антигенов и ВИЭОФ для выявления антигенов и антител к вирусу бешенства.

Объём работы. Диссертация изложена на 138 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы ( 218 источников , в том числе 59 отечественных). Работа иллюстрирована 22 таблицами и 16 рисунками и дополнена приложениями.

2. СОБСТВЕННЬЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

В работе использовали штаммы ТС-80 ВНИИВВиМ и CVS вируса бешенства.

Для получения вируссодержащего материала в опытах использовали: коз, нелинейных белых мышей массой 20 г, мышат-прыгунков массой 12 г, мышат-сосунков 2-3 дневного возраста

Для выделения, культивирования, титрования и изучения накопления антигена вируса бешенства использовали перевиваемые культуры клеток: почки сайги (ПС); почки эмбриона африканской козы ( ПЭАК) ; почки эмбриона свиньи (ППК-666); почки собаки ( ЫДСК) ; почки зелёной мартышки f.CV-1); почки сирийского хомяка - суспензионный вариант (BHK-21SS).

Культуры клеток получали в лаборатории "Биологии и культивирования вирусов" и в лаборатории "Культур клеток с музеем клеточных штаммов" ВНИКВВиМ.

При определении инфекционной активности вирус бешенства титровали в реакции иммунофлуоресценции или на 2-3 дневных мышатах-сосунах, титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча, выражая в бляшкообразующих единицах (Б0Е50) и мышиных интрацеребральных летальных дозах (МДД50) (И. П. Ашма-рин, А. А. Воробьёв, 1962).

Для проверки активности и специфичности препаратов антигенов, глобулинов, специфических сывороток использоЕали РДП, ВИЭОФ, МФА, РН и биопробу на мышах, ТФ ИФА.

Постановку реакций РДП, МФА, РН и "биопробу на мышах осуществляли по общепринятым методикам (М. Каплан, Щ. Коп-ровский, 1975).

ВИЭОФ осуществляли по усовершенствованной методике, используя бура-фосфатный буфер рН 6,6-6,3 и агарозу со средним значением эндоосмоса ( -Мг=0,18).

Постановку "Сэндвич"-варианта ТФ ИФА и метода ингибиро-вания ТФ ИФА проводили по общепринятой схеме ( А. 11 Егоров, А. П. Осипов, Б. Б. Дзантиев, 1991).

Для изучения эффекта деструкции инфицированных вирусом бешенства клеток ПС под влиянием ДЭАЭ-декстрана' проводили электронно-микроскопические, цитологические, радиометрические исследования, используя - метод ультратонких срезов (препараты обрабатывали по общепринятой методике' 01аиег1, 1982), метод окрашивания культуры клеток по 1,'аю-ГрюнБальду-Гимза (М. Каплан, Ш Копровский, 1975), метод определения активности фермента лактатдегидрогенэзы по методике Кпз1еп£-.еп (1991), соответственно. Скорость биосинтеза ДНК клеток НС оценивали по интенсивности включения ^-тимиди'на в дозе 37-74 кБк/мл-в поддерешавшую среду за 24 часа до снятия клеток. Помощь е проведении исследований любезно сказана !£ С. Малаховой. ЕВ. Черных, Е. П. Прилопской.

В качестве специфических антигенов вируса бешенства не-

пользовали материалы, приготовленные из лизатов клеточных культур и 20 % суспензии мозга заралаённых мышат-сосунов с. инфекционной активностью не ниже 6,0 - 7,0 lg МЛД50/мл. Контрольный антиген готовили из неинфицирозанной культуры клеток.

Специфические сыворотки получали при заражении коз штаммом ТС-80 ВНИИЕВиМ вируса бешенства. В качестве антигена для иммунизации использовали 20 % суспензию мозга заражённых мышат на уровне 5-6 пассажей с инфекционной активностью 6,0 ШЩБО/мл. Иммунизацию коз проводили по схеме, рекомендованной Förster et. al. (1971).

Сыворотки вакцинированных против бешенства телят любезно предоставлены С. Ф. Чевелевым.

Гипериммунные антирабические сыворотки лошадей и диагностический глобулин получали через систему Эооветснаба.

В качестве контрольных сывороток использовали сыворотки неааражзнных коз, КРС и лошадей.

Для выделения IgG из сывороток лошадей и коз использовали метод ионообменной хроматографии (X. Фримель, 1979).

Приготовление пероксидазных конъюгатов с IgG проводили по методу Wilson и Hakane (1978).

ФИТЦ и ФАР-иммуноглобулины получали по методике, изложенной JL Форш (1984).

' Статистическую обработку результатов проводили с использованием персонального компьютера Wintech 1433 и пакета прикладных программ "Statgraf".

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Получение специфического антигена вируса бешенства

Благодарю IL В. Никишина за оказанную помощь в проведении исследований по разработке способа изготовления раби-ческого антигена.

С целью определения оптимальной культуральной системы для приготовления специфических культуральчых антигенов ис-

пользовали следующие культуры клеток: ППК-ббб, ПЭАК, МДСК, ПС, CV-1, BHK-21SS.

Наиболее стабильные результаты по накоплению и титрованию вируса получены с использованием культуры клеток ПС. Титр инфекционности для белых мышей достигал 7,0 lg МДЦБО/мл. В дальнейшем эта культура клеток была использована для получения вирусспецифического антигена Высокая чувствительность к вирусу бешенства, а такте высокий уровень накопления рабического антигена в культуре клеток ПС открывает определённые перспективы не только в получении диагностических, но возможно и профилактических препаратов.

Культуру клеток ПС заражали вирусом бешенства штаммы ÎC-80 ВНИИВВиМ, CVS с множественностью 0,1 инф. ед./кл. Накопление рабического антигена в клетках и клеточной среде определяли в динамике в "Сэндвич"- варианте ТФ ИФА в течение 15 суток. При исследовании лизата инфицированных клеток ПС, снятых на 6-7 сутки после заражения, максимальный титр антигена в реакции ТФ ИФА составил 1:625. В культуральной жидкости рабический антиген содержался в титре 1:125. Внесение в культуральную вируссодержашую жидкость ПЭГ-6000 приводило к преципитации и концентрированию специфического антигена вируса в 50-70 раз, что служит дополшггельным источником получения антигена Активность антигена при этом составляла 1: 625.

Полученный культуральный антиген обрабатывали ультразвуком на холоде в течение 1, 3 и 5 минут при частоте 23 кГц. Эффзктивность обработки лизата клеток ультразвуком оценивали методом титрования проб полученных антигенов в РДП, ВНЭОФ, ТФ ИФА. Максимально высокие титры антигена в различных реакциях наблюдались после обработки ультразвуком в течение 5 ± 0,5 минут. Активность специфического-антигена после обработки ультразвуком повышалась на 1- 2 разведения.

Для инактивации вируса был испьпан препарат А-24 (1,8,3,6-диэндометилен - 1,3,6,8-тетразоциклодекан) в следующих концентрациях: 1:1 ООО ООО, 1 : 100 ООО, 1:10 ООО, 1:1000. Инактивацию проводили при 4* С в течение 24, 48, 72

часов. Уровень инактивации проверяли на новорождённых мышах, заражая их интрацеребрально. Результаты исследования показали, что препарат А-24 в концентрации 1:1000 (0,01 X) полностью инактивировал вирус в течение 45-50 часов при 4е С. В результате инактивации препаратом А-24 и лисфилизацик ра-бический антиген не снижал своей активности в.течение 2 лет (срок наблюдения).

Основными достоинствами разработанного способа получения культурального антигена вируса бешенства являются: отсутствие в течение культивирования вируса дополнительных манипуляций (смена среды, подведение рН, присутствие сыворотки) ; рабический антиген накапливается в высоких титрах уже через 6 дней после заражения культуры клеток ПС (в ранее предложенных способах получения рабического антигена для накопления вируса в достаточном количестве необходимо около 1 месяца); полученный антиген используют в серологических реакциях, исключая этап концентрирования; применение ультразвука для обработки клеточного детрита повышает титр антигена в 2 раза; неинфекционность полученного антигена. Рабический антиген был специфичен и активен в ТФ ИФА, в ВИ-ЭОФ, в РДП - в разведениях 1:625, 1:16-1:32, 1:4-1:8, соответственно; что указывает на его универсальность и позволяет использовать для постановки нескольких серологических реакций.

2.2.2. Изучение влияния ДЭАЭ-декстрана на репродукцию вируса бешенства

В сообщениях ,Kaplan(1967), Р. Ш. ИльясовойС1975), Bussereau(1982), А. П. Башмаковой(1985) нет единого мнения относительно оптимальной дозы ДЭАЭ-декстрана, способствующей увеличению инфекционности вируса В соответствии с данными, полученными ранее, изучено влияние различных доз ДЭАЭ-декстрана на накопление вируса, подобрана его оптимальная доза при выращивании штаммов ТС-80 ВНИИВВиМ и CVS в культуре клеток ПС. Присутствие ДЭАЭ-декстрана в концентрации

40 мкг/мл способствовало повышению титра инфекционной активности вируса бешенства в 10 раз по сравнению с материалом, выращенным без ДЭАЭ-декстрана, и составило 7,50±0,1б ]£ МДД50/МЛ. Дальнейшее увеличение концентрации ДЭАЭ-декстрана от 50 мкг/мл и выше оказывало токсическое действие, что приводило к снижению инфекционной активности вируса бешенства до 3,40+0,15 МЛД50/мл.

Блеете с тем, при выращивании вируса з культуре клеток ПС в присутствии ДЭАЭ-декстрана в концентрации 25-50 мкг/мл происходила деструкция клеток, начиная с 3-их суток и полное разрушение монослоя к 7-ым суткам культивирования. В контрольной интактной культуре меток, обработанной ДЭАЭ-декстраном аналогично заражённой, а также инфицированной культуре клеток без ДЭАЭ-декстрана, подобных изменений не наблюдали. Для доказательства того, что деструкция обусловлена вирусолитическим действием были проведены электронно-микроскопические, цитологические, радиометрические исследования.

На основании проведённых исследований оптимальной нужно считать дозу ДЭАЭ-декстрана - 40 ± 0,5 мкг/мл, присутствие которой способствовало проявлению ЦПД в инфицированной культуре клеток, повышению на 1,0 титра вируса бешенства В перспективе возможно применение этого эффекта для выявления и титрования вируса бешенства в культуре клеток ПС по ЦПД. что существенно сократит время.а постановки диагноза и уменьшит непосредственный контакт с вирусом по сравнению с другими методами (титрование на мышах и МФА).

2. 2. 3. Отработка условий постановки ВИЭОФ

Применение ВИЭОФ расширяет возможности лабораторной диагностики бешенства. По эффективности он приближается к РДП, но преимущество его в том, что результаты становятся известными через 1-2 часа. Нами разработаны условия постановки ЕКЭОФ для определения уровня антирабичреких антител и выявления антигенов вируса бешенства.

Для постановки ВИЭОФ использовали мединал-ацетатный буфер рН 8,6, бура-фосфатный буфер со значениями рН ог 6,4 до 7,8 и агарозу с высоким(-Мг=0,23), средним (-Ыг«0,18) и низким(-Мг=0,02) значениями эндоосмоса. Мединал-ацетатный буфер, который первоначально применяли в реакции, обладает токсическими свойствами и небезопасен для исследований.

Оптимальным для постановки ВИЭОФ являлось использование агарозы со средним значением эндоосмоса (- Мг-0,18) в сочетании с бура-фосфатным буфером рН 6,6-6,8. Время проведении электрофореза 45 минут при постоянном напряжении 150 В и силе тока 18 тА на одну пластину размером 80*90 мм. Антиген в этом случае выявлялся в максимальном титре, который составил 1:16 - 1:32.

Полученные данные подтвердил!! перспективность ЗИЗОФ для диагностики бешенства. Усовершенствованный нами вариант анализа в 2-4 раза превосходил по чувствительности РДП, обеспечивал выявление только специфического антигена вируса бепенстЕа в разведениях до 1:64 при исследовании суспензий мозга животных; до 1:32 при исследовании концентрированных культуральных антигенов; до 1:4 при исследовании неконцент-рированкых вируссодержашдх жидкостей. Специфические антитела в сыворотках крови телят, лошадей, коз, морских свинок, кроликов выявляли в титрах 1:2- 1:128.

2. 2.4. Разработка "Сэндвич"-варианта ТФ №А

Иммуноглобулины б, ■ необходимые в качестве препаратов антител для сенсибилизации твёрдой фазы и приготовления конъюгатов, выделяли из специфических сывороток крови лошадей и коз. Была оценена пригодность для получения ДО коммерческих сывороток и глобулинов, реализуемых системой Зоо-5 ветснаба и медицинской биологической промышленности. В результате проведённых исследований установлено, что только гипериммунная сыворотка лошадей отвечает необходимым требованиям, т. е. активность в РДП не ниже 1:16 - 1:32.

Из сывороток лошади было получено 9 серий 1^6; из скво-

роток козы - 3 серии ДО. Активность выделенных из сывороток ДО составляла в РДП 1:16- 1:32 и в ВИЭОФ 1:32-1:64, однако удельная активность ДО, выделенных из сыворотки лошади, была в РДП в среднем в 2 раза выше, чем ДО, выделенных из сыворотки козы. Кроме этого, сыворотка лошади является коммерческим препаратом, что существенно упрошдет и ускоряет наработку диагностикумов.

Используя специфические ДО из сыворотки лошади, приготовлено 6 серий пероксидазных конъюгатов. Титры конъюгатов составляли от 1: 400 до 1:1600.

Отработку "Сэндвич"-варианта ТФ ИФА проводили по принципу шахматного титрования. Для постановки "Сэндвич"-вари-анта ТФ ИФА отрабатьшали сенсибилизирующую дозу ДО. оптимальные разведения специфических пероксидазных конъюгатов, оптимальный буферный раствор для разведения реагентов, температурный и временной режимы анализа.

В результате испытаний 12 серий препарата ДО из анти-рабической сыворотки лошади с активностью в РДП 1 : 16 -1 : 32, значения оптической плотности выходили на плато, начиная с концентрации иммуноглобулинов для сенсибилизации - 20 мкг/мл. Оптимальная сенсибилизирующая доза для ДО из сыворотки козы соответствовала дозе ДО из сыворотки лошади.

Сравнение эффективности использования для сенсибилизации пластин 0,01 М ФБР рН 7,2 с 0,5 М НаС1 и 0,05 М карбо-натно-бикарбонатного буфера (КББ) рН 9,6 показало, что оптимум рН для сенсибилизации пластин ДО лежит в области рН 9, 6.

Таким образом, для сенсибилизации пластин в ТФ ИФА необходимо использовать ДО в концентрации 20 мкг/мл на 0,С5 М КББ рН 9,6.

Для сокращения времени постановки реакции необходимо иметь готовые сенсибилизированные иммуноглобулинами пластины. При выяснении срока годности пластин, сенсибилизированных 3 часа при 37°С и 18 часов при 4°С, целесообразно закладывать на хранение пластины, сенсибилизированные в

течение 18 часов при 4°С. Пластины годны в течение 6 месяцев при хранении при 4'С.

Для определения титра полученных специфических перокси-дазных конъюгатов проводили их шахматное титрование со специфическим и нормальным антигенами. Полученные конъюгаты имели достаточно высокую активность (1:800)' при применении их в "СэндЕИЧ"-варианте ТФ ИФА. Для постановки "Сэнд-вич"-варианта ТФ ИФА их использовали в рабочем разведении, равном удвоенному титру. Конъюгат сохранял свою активность в течение двух лет (срок наблюдения) при хранении при минус 12° С и минус 60" С.

В семи сериях опытов была определена зависимость результатов ТФ ИФА от времени сенсибилизации пластин времени инкубации пластин с антигеном и конъюгатом. Результаты ТФ ИФА оценивали по выявлению в "Сэндвич"-варианте ТФ ИФА специфического антигена в разведении 1:625. Наилучших результатов удавалось достичь при сенсибилизации пластин 1е 6 в течение 3 часов при 37'С или 18 часов при 4"С и времени контакта с антигеном и конъюгатом в течение 1,5 и 1 часов, соответственно.

Для уменьшения связывания нормальных клеточных компонентов с препаратами антител, используемых для сенсибилизации лунок и приготовления конъюгатов, был применён буферный раствор, предложенный Кеппа (1985) и состоящий из 0,01 М трис НС1 рН 7,6-7,8, содержащего 0,8% Иа01, 0,5% казеина и 0,02% мертиолята ( КМБ ). На КМБ готовили разведения и антигенов, и конъюгатов.

Ш рекомендациям ^апББОп а1. (1983) для оболочечных вирусов необходимо включение в буфер, предназначенный для разведения, дезоксихолата натрия в концентрации 1 мг/л. Важным качеством такого антигена является способность легко адсорбироваться на поверхности лунок полистироловых панелей. При добавлении дезоксихолата натрия в указанной выше концентрации мы отмечали повышение оптической плотности на 0.15210. 013 ед ОП.

В опытах по обнаружению антигенов вируса бешенства и

для сравнения чувствительности ТФ ИФА с ранее разработанными серологическими реакциями исследовали концентрированные культуральные антигены вируса бешенства, неконцентрирован-ние ьнруееодержащие культуральные. жидкости культур клеток ПС и ВНК-21, 20 X суспензии проб мозга мышей, зараженных вирусом бешенства, штаммы CVS и ТС-80 ВНИИВВиМ и 20 % суспензии проб мозга собак, кроликов, морских свинок, зараженных вирусом бешенства, штамм CV3. В качестве отрицательных контролей использовали нормальные культуральные антигены и культуральные жидкости, изготовленные из незараженных культур клеток ПС и ВНК-21 и 20 % суспензии проб мозга незараженных корсаков, собак, овец, телят, свиней, мышей, морских свинок, кроликов.

В качестве гетерологичннх контролей использовали 20 X суспензии проб мозга кроликов, зараженных вирусом болезни Ауески; кроликов и лошадей, зараженных вирусом, вызывающим энцефэлитоподобную болезнь; коров, зараженных вирусом чумы крупного рогатого скота ; собак, зараженных вирусом чумы плотоядных; лисиц, зараженных вирусом чумы плотоядных.

В оптимальных условиях постановки "Сэндвич"-вариант ТФ. ИФА обеспечивал выявление только специфического антигена вируса бешенства в разведениях до 1:3125 при исследовании суспензий мозга животных; до 1:625 при исследовании концентрированных антигенов; до 1:125 при исследовании неконцентрированных вируссодержаших жидкостей, -йго соответствует выявляемой инфекционности вируса бешенства на уровне 3,5 - 4,0 lg ИЛДБО/мл. Чувствительность "Сэндвич"-варианта ТФ ИФА превышала более чем в 100 раз чувствительность РДП и более чем в 40 раз чувствительность ВИЭОФ.

Специфический антиген вируса бешенства в пробах мозга мышей, заражённых интрацеребрально в дозе 2,0 lg ШЩ50/МЛ штаммами ТС-80 ВШИЕВиМ и CVS, а также полевым! штаммами, выделенными из проб мозга животных, поступавших на экспертизу, выявляли в динамике накопления в "Сэндвич"-варианте ТФ ИФА. Клинические признаки болезни и гибель наступали на

5 сутки у мышей, зараженных штаммами ТС -80 ВШИВВиМ и CVS и на 7 сутки у мышей, зараженных полевыми штаммами. Раби-ческий антиген выявляли уже на 3 сутки с титре 1:25 при заражении мышей штаммами ТС-80 ВНИИВЕиМ и CVS и на . 4 сутки при варакешш полевыми штаммами. К моменту гибели мыш«й Титр антигена в "Сэндвич"-варианте ТФ ИФА достигал 1:3125.

Таким образом, с помощью "Сэндвич"- варианта ТО ИФА можно выявить рабический антиген при постановке биопробы на мышах ещё до появления клинических признаков. Это существенно сокращает время постановки диагноза.

При хорошо отлаженной и подготовленной работе "Сэнд-вич"-вариант ТФ ИФА позволяет:

- получать результат за 3 - 4 часа;

- провести за рабочую смену около 40 анализов проб антигенов при их титровании и около 140 анализов при исследовании материала в диагностическом титре в трех повторное-тях.

2. 2.5. Разработка и изучение диагностической ценности

метода ингибирования ТФ ИФА' *

Для постановки метода ингибирования ТФ ИФА использовали специфический антиген, активность которого в "Сэндвич"- варианте ТФ ИФА составляла 1:625. Определение рабочего разведения специфического антигена для постановки метода ингибирования ТФ ИФА проводили шахматным титрованием со специфической и нормальной сыворотками. Из полученных результатов следует, что при всех разведениях специфической сыворотки оптическая плотность максимальна в лунках, содержащих специфический антиген в разведении 1:25.

Для определения специфичности и чувствительности метода исследовали специфические к вирусу бешенства и нормальные сыворотки телят, морской свинки, лошадей, коз; гетерологич-ныз сыворотки: сыворотки свиней, специфичные к вирусу болезни Ауески; сыворотки лошадей, поливалентные к вирусам чумы плотоядных, парвовирусного энтерита, гепатита; сыво-

ротки лошадей, специфичные к вирусу, вызывающему энцефали-топодобную болезнь; сыворотки собак, специфичные к вирусу чумы плотоядных; сыворотки хорьков, специфичные к вирусу чумы плотоядных; сыворотки свиней, специфичные к вирусу болезни Тешена, стандартную противолистериозную сыворотку. Антитела, специфичные к вирусу бешенства, обнаружены только в сыворотках вакцинированных против бешенства животных и не обнаружены в сыворотках здоровых животных и животных, заражённых гетерологичными вирусами и бактериями, что свидетельствует о высокой специфичности предложенного метода.

Результаты сравнительного изучения чувствительности метода ингибирования ТФ ИФА с РДП, ВИЭОФ и РН показали, что чувствительность ТФ ИФА превышает чувствительность РДП более чем в 2000 раз, ВИЭОФ более чем в 1000 раз и РН в 50 раз.

Метод ингибирования ТФ ИФА позволял выявлять специфические антитела в сыворотках вакцинированных КРС, начиная с 21 суток после вакцинации. Показана возможность выявления антител у вакцинированных животных в тех случаях, когда антитела с помощью других реакций выявить не удаётся, либо они обнаруживаются в низких титрах с недостаточной степенью достоверности. Методом ингибирования ТФ ИФА было исследовано 420 обезличенных проб сывороток телят из Новосибирской и Ростовской областей, привитых культуральной вакциной ТС-80 ВНШВВиМ. Для выявления роли логавакцицальных антител у телят исследовали сыворотки, взятые до вакцинации; через 21 день; 6; 12 и 15 месяцев после вакцинации.

Коррелятивной зависимости между результатам, полученными в РДП, ВИЭОФ, РН и ТФ ИФА, не отмечено. В РН титры антител варьировали на 21 день - 1:5-1:17; через б месяцев -1:16-1:33; 12 месяцев - 1:37-1:70 при дозе вируса 50 МЛД50. Динамика поствакцинальных антител в РДП, ВИЭОФ показала, что в РДП они выявляются редко и только в цельной пробе, а в ВИЭОФ в разведении 1:2. В ТФ ИФа наибольшие титры выявляли на 21 день - 1:625-1:15625. К 12 месяцам титр антител снижался до 1:25-1:125. Результаты проведенных исследований

позволяют рассматривать метод ингибирования ТФ ИФА, как наиболее чувствительный и быстрый метод определения в сыворотках крови антирабических антител.

В плане апробации "Набора .. " и диагностической оценки метода ТФ ИФА в период с 1989 по 1992 гг. исследовано 160 проб мозга и 725 прбб сывороток крови диких и домашних животных: КРС, овец, маралов, коз, лошадей, кошек, собак, степных хорей, корсаков, лисиц, волков, енотов из Владимирской, Московской, Новосибирской, Ростовской, Воронежской, Кемеровской областей, Ставропольского края, Крыма, Горного Алтая, Казахстана и Тувинской республики. При этом в 8 случаях получены положительные результаты в "Сэнд-вич"-варианте ТФ ИФА по выявлению вирусспецифического антигена. В 326 пробах сывороток от вакцинированных животных методом ингибирования ТФ ИФА обнаружены вирусспецифические антитела в разведениях 1:25-1:15625. Полученные данные были подтверждены биопробой и в РН на мышах.

2.2. 6. Совершенствование метода иммунофлуоресценции для обнаружения антигена вируса, бешенства

Метод МФА в культуре клеток наиболее часто применяется в лабораторной диагностике бешенства (М.А. Селимов, 1978; Hofbauer, J979; Sureau, 1986; P. X. Юсупов, К Ф. Бусыгин, 1986; Warrell, 1988; А. А. Мовсесянц, Л. В. Григорьева, Е. Е. Кривицкая, 1991). Однако он обладает рядом недостатков: необходимостью приготовления пробирок с покровными стёклами; значительным расходом культуры клеток и питательной среды; нестандартностью выращиваемой в пробирках культуры клеток; трудоёмкостью процесса фиксации и окрашивания культуры клеток на покровных стёклах; большому расходу ФИТЦ -конъюгата.

Поэтому для устранения этих недостатков нами был усовершенствован метод титрования вируса бешенства с помощью иммунофлуоресценции с использованием микрокультуры клеток-ПС. Метод выгодно сочетает преимущества микротитрационной техники с чувствительностью и специфичностью традиционного

МФА. При этом повышается производительность и упрощается процедура обработки клеток ФИТЦ-конъюгатом.

При отработке условий фиксации культуры клеток ПС в лунках пластиковых панелей лучшие результаты получены при использовании 20 % раствора ацетона на ЗФР или 96 % этанола. При этом зремя фиксации не оказывает существенного влияния на качество клеточного монослоя и результаты иммуноф-_ луоресцентной обработки препаратов.

Определены условия постановки и показана возможность титрования вируса-бешенства в микрокультуре ПС с использованием реакции флуоресцирующих антител. Результаты реакции учитывают через 48-72 часов-в отличие от титрования на мышах, когда ответ получают только на 5-7 сутки.

В лунки пластиковых панелей вносили по 200 мкл суспензии клеток ПС, содержащей 200 тысяч клеток в 1 мл. Панели помещали в С0г-инкубатор и инкубировали при 37°С до образования сплошного клеточного монослоя. Затем готовили 10-кратные разведения вируссодержащего материала на среде Игла (МЕМ) и вносили в лунки панелей. Через 48 часов инкубирования клетки в лунках фиксировали 20 % раствором ацетона,окрашивали ФИТЦ-иммукоглобулинами, специфичными к вирусу бешенства, и определяли титр вируса по характерному свечению.

Уровень накопления вируса бешенства в микрокультуре клеток ПС составил 6,2±0,37 le БОЕБО/мл для штамма CV5 и 6,0±0,32 lg Б0Е50/мл для штамма ТС-30 ВНИИВВиМ, что соответствует чувствительности культуры клеток ПС, выращенной з пробирках на покровных стёклах. При титровании этого материала на новорождённых мышах титры вируса были 6,5t0,14 и 6,2+0,12 lg МЛД50/мл, соответственно.

При сравнительном изучении ФИТЦ и ФАР- иммуноглобулино-вых конъюгатов установлено, что антирабический конъюгат с ФАР не уступает по своим рабочим характеристикам ФИТЦ-им^у-ноглобулинам, специфичным к вирусу бешенства. Антирабичес-кие глобулины, меченые ФАР, позволяют обнаруживать антиген вируса бешенства в тех же разведениях, ""'что и конгюгат с ФИТЦ. Снижения неспецифических флуоресцирующих частиц при применении ФАР-конъюгата не отмечено.

- ¡¿и -

Проведённые исследования позволили рекомендовать методы ТФ ИФА в схему лабораторных исследований при бешенстве, а в комплексе с другими методами предложить схему лабораторной диагностики этой болезни (рисунок 1).

ВЫВОДЫ

1. Подобрана новая культуральная система для выращивания вируса бешенства - перевиваемая культура клеток ПС. Инфекционная активность вакцинного штамма для этой культуры составила 7,0±0,21 1с МЛД50/мл.

2. Изучены и определены оптимальные условия получения универсального инактивированного антигена вируса бешенства в культуре клеток 11С, заключающиеся в обрабатке лизата ви-руссодержащих клеток ультразвуком, инактивации препаратом А-24 (1,8,3,6 - диэндометилен - 1,3,6,8 - тетразациклоде-каном), лиофилизации. Антиген специфичен и активен в ТФ ИФА - 1:625, в БИЭОФ - 1:16-1:32, в РДП - 1:4 -1:8.

3. Разработан "Сэндвич"-вариант ТФ ИФА, позволяющий выявлять специфический антиген вируса бешенства в суспензиях из мозга животных и вируссодержащих культуральных жидкостях в титрах 1:125 - 1:3125 и 1:25-1:125, соответственно, в течение 3-4 часов. Чувствительность метода составляет 3,5-4,0

ШЩ50/МЛ и превышает более чем в 100 раз чувствительность РДП и более чем в 40 раз чувствительность ВИЭОФ.

4. Разработан метод ингибирования ТФ ИФА, обеспечивающий обнаружение специфических антител, что позволяет использовать его -для оценки уровня специфических антител в сыворотках крови вакцинированных -тавотных. Чувствительность метода превышает чувствительность РДП более чем в 2000 раз, ВИЭОФ более чем в 1000 раз и РН в 50 раз.

Рис. 1. Схема лабораторной диагностики бешенства

+

- положительный результат.

5. Усовершенствован метод ВИЭОФ, который может быть использован как дополнительный тест для диагностики бешенства и для предварительного тестирования специфических антигенов и сывороток. Чувствительность ВИЭОФ превышает чувствительность РДП в 2- 4 раза.

6. Отработан микрометод реакции флуоресцирующих бляшек для обнаружения антигена вируса бешенства. Установлено, что чувствительность культуры клеток, выращенной в лунках пластиковых панелей, аналогична чувствительности культуры клеток, выращенной на покровных стёклах в пробирках и составляет 6,5+0,13 1д Б0Е50/МЛ.

7. Рекомендован в схему диагностики бешенства чувствительный, специфичный, высокопроизводительный и экспрессный метод ТФ ИФА, предназначенный для выявления специфических антигенов и антител при бешенстве.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложен метод изготовления инактивировзнного универсального культурального антигена, пригодного для постановки серологических реакций. На метод изготовления антигена .получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства на изобретение.

2. Разработаны и предложены: "Набор диагностических препаратов для лабораторной диагностики бешенства методом твердофазного иммуноферментного анализа" , на который составлена нормативно-техническая документация (Временная инструкция по изготовлению и контролю, Технические условия и Наставление по применению), утверждённая директором института 29. 09. 92 г.

3. Разработан метод ТФ ИФА, предназначенный для диагностики бешенства, на который подготовлены "Методические указания по лабораторной диагностике бешенства твердофазным иммуноЗерментным анализом", утвержденные директором института 29. 09. 92 г.

4. Усовершенствован метод ВИЭОФ, как дополнительный тест в диагностике бешенства, на который подготовлены "Методические указания по лабораторной диагностике бешенства методом встречного иммуноэлектроосмофореза", утверждённые директором института 29. 09.92 г. *

5. Предложена схема лабораторной диагностики бешенства.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сологуб (Вадишина) Т. В. , Балабанов Е А. , Никишин И. В. Со-верыенствовани« метода встречного иммуноэлектроссмофореза для лабораторной диагностики бешенства // Вопросы ветеринаркой вирусологии микробиологии и эпизоотологии. Тез. докл. науч. конф. / ВНИИВВиМ.- Покров, 1990,- с. 70-71.

2. Балабанов В. Л. , Сологуб (Валишин^) Т. В. , Никишин К. В. , Бэ-лун 0. В. , Зуев В. В. , Курносов А. Н. Еыраиивание вируса бешенства в культурах клеток различного происхождения // Вопросы ветеринарной вирусологии микробиологии и эпизоотологии. Тез. докл. науч. конй. /' ВНИИВВиМ. - Покров, 1990,- с. 120-122.

3. Никишин И. К , Сологуб (Еолипнна) Т. В. , Вишняков И. Ф. Получение универсального ку >;ьтурольного рабического антигена // Вопросы ветеринарной вирусологии микробиологии и эпизоотологии. М?.-тс-риалы науч. ко на. / ВНИИВВиМ, - Покров, 1992.- е. 260.

4. Прилепская Е. Е , Сологуб (Валишина) Т. В. , Вишняков И. Ф. , Шкивам И. Е , Горшкова Т. Ф. Оценка цитотоксичности ДЕАЕ-декстра-на по биохимическим тестам // Вопросы ветеринарной вирусологии микробиологии и эпизоотологии. Материалы науч. конф. / ВШШВВиМ. -Покров, 1992.- с. 312.

5. Сологуб (Валишина) Т. Е , Никишин И. В. , Вишняков И. Ф. Выявление антител к вирусу бешенства методом ингибирования ТФ ИФА // Вопросы ветеринарной вирусологии микробиологии и эпизоотологии. Материалы науч. конф. / ВНИИВВиМ.- Покров, 1992.- с. 261.

6. Черных ЕЕ, Сологуб (Валишина) Т. В. , Никишин И. В. , Вишняков И. Ф. , Чевелёв Л Ф. , Аверина Н.Н. Влияние ДЕАЕ-декстрана Не выращивание вируса бешенства в культуре клеток почки сайги // Вопросы ветеринарной вирусологии микробиологии и эпизоотологии. Мате риалы науч. конф. / ВНИИВВиМ. - Покров, 1992.- с. 147-148.

7. Сологуб (Валишина) Т. Е , Вишняков И. Ф. , Никишин И. Е Совершенствование Ш>А для обнаружения антигена вируса бешенства /, Вопросы ветеринарной вирусологии микробиологии и эпизоотологии.

. Материалы науч. конф. / ВНИИВВиМ. - Покров, 1992. - с. 260.