Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ларинготрахеита птиц: получение и использование

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ларинготрахеита птиц: получение и использование"

На правах рукописи

УДК 619:616-097:616.98:578.825.1

0030Б8583

V

ЧУРИН Александр Иванович

Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ларинготрахеита птиц: получение и использование

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Покров - 2007

003068583

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИ-ИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ).

Научные руководители: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Новиков Борис Валентинович

кандидат ветеринарных наук,

старший научный сотрудник |Мавликаев Рафкад Галеевич]

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Ведущая организация: ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Защита состоится 27 апреля 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, г. Покров Владимирской области, ВНИИВВиМ; Тел/факс: (49243) 62125; www.vniiwim.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ.

профессор кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник

Стрижаков Александр Анатольевич

Зуев Юрий Владиславович

Автореферат разослан « ЛЛ-» марта 2007 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук -

В.Я. Савукова.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность

Инфекционный ларинготрахеит (ИЛТ) - вирусная респираторная болезнь, поражающая кур всех возрастов, индеек, фазанов [OIE, 2005; Craw-shaw G.J., 1982], куропаток и павлинов [Cover M.S., 1996; Kaieta E.F., 1990]. Заболеваемость восприимчивой птицы может доходить до 80-100%, а летальность - 30-72% [Bagust T.J. и др , 1997; Linares J.A. и др., 1993]. При хроническом течении ИЛТ заболеваемость - около 1-2% Наиболее часто регистрируется хроническое течение ИЛТ [OIE, 2005].

Возбудитель ИЛТ - ДНК-содержащий вирус семейства Herpesviridae. Мажорными структурными белками вируса ИЛТ, к которым получены моно-клональные антитела (МКА), являются полипептиды с молекулярными массами 205, 160, 115, 90, 67, 60, 52, 39-40, 34-35, 30, 26 кДа [York J.J. и др., 1990; Veits J. и др., 2003]. Штаммы вируса антигенно идентичны [Kotiw M. и др., 1982, Russell R.G. и др., 1983]. Отечественные штаммы вируса антигенно родственны штамму ЦНИИПП [Сюрин В.Н. и др., 1979].

По требованиям МЭБ диагностику ИЛТ проводят выделением вируса на первичных культурах клеток (КК) печени и почек куриных эмбрионов (КЭ), на 10 - 12 дневных КЭ, и последующей идентификацией в реакции диффузионной преципитации (РДП), реакции иммунофлюоресценции (РИФ) и твердофазном иммуноферментном анализе (ТФ ИФА), гистологическим методом и полимеразно-цепной реакцией (ПЦР). РДП, РИФ, ТФ ИФА недостаточно чувствительны, так как используемые в них препараты на основе по-ликлональных антител, зачастую, имеют перекрестную реактивность [OIE, 2005]. А реакция нейтрализации (РН) - трудоемка, длительна в исполнении и требует значительных материальных затрат. Использование МКА как реагентов (средств) значительно повышает чувствительность и специфичность методов [Veits J. и др., 2003; Sellers H.S. и др., 2004]. Ретроспективная диагностика ИЛТ направлена, прежде всего, на обнаружение антител к вирусу: в РН на цыплятах, КЭ и культурах клеток (КК), в РДП, в непрямой РИФ, в ТФ

ИФА [Abbas F., 1996; Bauer В., 1999; OIE, 2005].

Поэтому получение МКА и разработка на их основе вариантов имму-ногистохимии и ТФ ИФА для обнаружения вируса в исследуемом материале и специфических антител в сыворотках вакцинированной, больной и переболевшей птицы является актуальным для диагностики ИЛТ и дифференциации возбудителя от вирусов гриппа птиц, инфекционной бурсальной болезни, болезни Ньюкасла, болезни Марека, чумы уток.

1.2. Цель и задачи исследований

Целью работы является разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики ИЛТ на основе моноклональных антител Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить антигенно-активные препараты очищенного вируса ИЛТ.

2. Получить гибридомы, стабильно продуцирующие моноклональные антитела к антигенам вируса ИЛТ; изучить иммунохимические свойства моноклональных антител.

3. Разработать и испытать модификации иммуноферментных методов (иммуногистохимии и твёрдофазного ИФА) на основе полученных моноклональных антител для обнаружения вирусных антигенов в тканях и органах больных и павших птиц и для выявления антител в сыворотках крови больных и вакцинированных птиц.

4. Разработать методические указания по диагностике ИЛТ птиц твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител.

1.3. Научная новизна работы

Научная новизна состоит в том, что в результате исследований:

- получены шестнадцать новых клонов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к полипептидам с молекулярной массой 30, 34, 35, 39, 60 кДа вируса ИЛТ;

- на основе моноклональных антител клонов гибридом 4А5В8, 2А10ЕЗ, 1С4Р12, 1Н8С11 и 1С1(Ю10 разработан прямой вариант иммунопероксидаз-ного гистохимического метода для выявления антигенов вируса ИЛТ в мазках-отпечатках гортани и трахеи больных кур;

- на основе моноклональных антител клонов гибридом 4А5В7, 4А5В8, 2А10ЕЗ, 4А5С6, 4А5С10, 1С4Е7, 1С4РЗ, 1С4Р12, 1С4В9, 1Н8С11 и 1С10Ш0 разработан "сэндвич"-вариант ТФ ИФА для обнаружения и идентификации антигенов вируса ИЛТ;

- на основе моноклональных антител клонов гибридом 4А5В7, 4А5В8, 2А10ЕЗ, 4А5С6, 4А5С10, 1С4Е7, 1С4РЗ, 1С4Р12, 1Н8С11 и 1С10010 разработан непрямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА для обнаружения антител в сыворотках птиц

1.4. Практическая значимость результатов

Депонированы и занесены в банк данных музея гибридом ГНУ ВНИ-ИВВиМ 16 клонов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к полипептидам с молекулярной массой 30, 34, 35, 39, 60 кДа вируса ИЛТ.

Рекомендованы для включения в схему лабораторной диагностики прямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА на основе МКА для выявления антигенов вируса ИЛТ и непрямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА на основе МКА для выявления антител в сыворотках птиц.

Предложены методические указания для лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител.

1.5. Апробация и публикации результатов

Материалы диссертации доложены на научной конференции ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (2004 г.), на международной конференции УГСХА (2006 г.) и на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (2004, 2005гг.).

1.6. Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе статья в журнале "Ветеринария".

1.7. Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 190 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка использованной литературы, и дополнена 2 приложениями. Материалы диссертации иллюстрированы 27 таблицами и 34 рисунками. Список литературы включает 333 источника, из них 49 отечественных.

1.8. Основные положения, выносимые на защиту

1. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к антигенам вируса ИЛТ.

2. Результаты разработки вариантов иммуноферментных методов на основе полученных моноклональных антител: прямой вариант иммуноперок-сидазного гистохимического метода и прямой "сэндвич"-вариант твердофазного иммуноферментного анализа для выявления антигенов вируса ИЛТ, непрямой "сэндвич"-вариант твердофазного иммуноферментного анализа для выявления антител в сыворотках крови птицы.

3. Диагностическая ценность прямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА для выявления антигенов вируса ИЛТ и непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА для выявления антител в сыворотках крови птицы.

1.9. Личный вклад автора в выполнении работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно

В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д.б.н., ведущий научный сотрудник Пономарев В.Н., к.в.н., старший научный сотрудник Капустина О.В. (получение препаратов очищенного вируса ИЛТ), к.б.н., старший научный сотрудник Середа C.B., к.б.н., старший научный сотрудник Анохина Е.Г. (определение полипептидной специфичности МКА).

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Вирусы В работе использовали препараты вирусов, полученные из лаборатории "Музейных штаммов" ГНУ ВНИИВВиМ. Штаммы вируса ИЛТ: вирулентный "Богатищевский" с активностью 4,0 lg ИД50/см3, 5,25 lg ЭИД50/см3; вакцинный "ВНИИБП" - 5,0 lg ЭИД50/см3; клон "НТ" штамма "ЦНИИПП" - 6,0 lg ЭИД50/см3. Для оценки специфичности методов в работе использовали препараты: вируса болезни Марека (штамм "FC-126"), вируса чумы уток (штамм "АКВ-ВНИИВВиМ"), вируса инфекционной бурсапьной болезни (штамм "БГ"); вируса гриппа птиц (штамм А/ цыплёнок/ Росток/29 (H7N7), А/ крачка/ Южная Африка/82 (H5N2), А/ курица/ Росток/34 (H7N1)); вируса болезни Ньюкасла (штамм "La Sota").

Животные В работе использовали: 9-11-дневных КЭ для получения вирусного сырья в качестве системы культивирования, для очистки вируса и выделения специфического антигена и постановки серологических реакций; мышей BALB/c 5-6-недельных; взрослых самок мышей линии BALB/c; мышей белых нелинейных; петухов 150 - 180 - дневных; цыплят 75 - 90 и 45 -60-дневных; кур-молодок 120 - 150 - дневных; морских свинок; кроликов.

Диагностические сыворотки В работе использовали антисыворотки, содержащие антитела к вирусам гриппа птиц, болезни Ньюкасла, чумы уток и инфекционной бурсальной болезни; гипериммунные антисыворотки петуха, кролика и морской свинки, содержащие антитела к вирусу ИЛТ; сыворотки петуха, кролика, морской свинки от интактных животных.

Культуры клеток Культура клеток куриных фибробластов; культура клеток миеломы мыши SP2/0-Agl4.1., полученная из НИИБТ МЗ России

Для получения высокоактивных препаратов вируса ИЛТ в качестве системы культивирования использовали 9-11-дневные КЭ, которые заражали аппликацией на ХАО и в аллантоисную полость в дозе 10000 ЭИД50/0,2 см3 (клон "НТ" вакцинного штамма "ЦНИИПП"). ХАО и ЭЭЖ (аллантоисную жидкость) отделяли от КЭ через 5 суток. 10%-ную суспензию гомогената

ХАО центрифугировали при 2500 об/мин в течение 20 минут (при 4°С), осаждая клеточный детрит. Надосадок использовали при очистке и концентрировании. Титрование вируса проводили в КЭ, титр вируса выражали в эмбриональных инфекционных дозах (ЭИД50/см3). При очистке вируса ИЛТ за основу были взяты методические приемы, разработанные ранее во ВНИИВ-ВиМ [Перзашкевич B.C. и др., 1994]. При приготовлении препаратов нормальных антигенов использовали ХАО 15-16-дневных незараженных КЭ.

По схемам, предложенным Сюриным В.Н. с соавторами [Сюрин В.Н. и др., 1979], с незначительными модификациями, получали гипериммунные антисыворотки от петухов, кроликов и морских свинок. В качестве антигена для иммунизации птицы и животных (кроликов и морских свинок) использовали осветленную надосадочную вируссодержащую суспензию 10%-ного гомогената ХАО КЭ (вакцинный штамм "ЦНИИПП", вирулентный штамм "Богатищевский"), препараты очищенного вируса ИЛТ. Сохранность антигенной активности и иммуногенности препаратов очищенного вируса ИЛТ оценивали в микроварианте РДП и во встречном иммуноэлектрофорезе с полученными сыворотками петуха, кролика и морских свинок.

Определение концентрации белка в препаратах очищенного вируса, в препаратах специфичных антител, выделенных из антисывороток, культу-ральных и асцитических жидкостей (МКА), проводили микровариантом по Lowry О.Н. [Lowry О.Н. и др., 1951].

Получение гибридом Иммунизацию мышей линии BALB/c, доноров иммунных спленоцитов, провели препаратами антигенов вируса ИЛТ (штамм "ЦНИИПП"), очищенных в градиенте перколла 6-ти кратными инъекциями с интервалами 14 дней. На 3 сутки после последней инъекции антигена вируса ИЛТ от иммунизированных мышей получали спленоциты и проводили гибридизацию по методу Kohler и Milstein [Kohler G. и С. Milstein, 1975] в модификации Fazekas с соавтор. [Fazekas De St. и др., 1980] с клетками миелом-ной линии SP 2/0-Agl4.1 в соотношении 10:1, в присутствии 45% ПЭГ-1450. Проведено 2 гибридизации. Гибридные клетки культивировали in vitro в

стандартных условиях в селекционной среде ДМЭМ с содержанием HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) и 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Культуральные жидкости гибридных клеток на вирусспеци-фичекую антителопродукцию тестировали 3-4 раза в непрямом ТФ ИФА (с препаратами очищенного вируса) с интервалами в 3-7 дней. Выбранные позитивные гибридомы клонировали в полужидком агаре и методом лимитирующих разведений (последовательно) in vitro, и in vivo в брюшной полости линейных мышей [Gooding J.V., 1980].

Субкласс МКА определяли с использованием специальных наборов и согласно инструкциям (Sigma ImmunoType, США) в ТФ ИФА.

Полипептидную специфичность МКА определяли методом вестерн-блоттинга. Электрофорез проводили в 7,5% ДСН-ПААГ (натрия додецил-сульфат-полиакриламидный гель), с последующим переносом на нитроцел-люлозную мембрану. Учет результатов проводили замером длины пробега антигенов, сравнивая с пробегом маркерных белков; используя компьютерную программу Molmas.bas рассчитывали молекулярные массы.

Конъюгирование иммуноглобулинов с пероксидазой хрена (тип VI, Sigma) осуществляли по методу Nakane P.K. [Nakane Р.К., 1974] и по модифицированному методу Tijssen P. [Tijssen Р., 1985].

При титровании вирусов учет результатов эксперимента проводили по общепринятому методу Рида и Менча.

Для определения функциональных свойств разработанного метода ТФ ИФА (диагностическая чувствительность и специфичность) использовали рекомендации, указанные в руководстве МЭБ (Manual of standards diagnostic tests and vaccines, 2000). В качестве сравнительного метода для расчётов диагностической чувствительности и специфичности использовали метод виру-совыделения на КЭ.

Математическую обработку результатов проводили согласно Лакину Г.Ф. с использованием персонального компьютера и пакета прикладных программ Statgraphics (Version 2.1) [Лакин Г.Ф., 1990].

2.2. Результаты исследований

2 2 1 Получение антигенов вируса ИЛТ В работе использовали вирулентный штамм вируса ИЛТ "Богатищевский", вакцинные штаммы "ВНИ-ИБП" и "ЦНИИПП". Вирус ИЛТ культивировали в 9-11-дневных КЭ, заражение аппликацией на ХАО КЭ в дозе 1000 ЭИД50/см3. Титр вируса составил: штамм "ЦНИИПП" клон "НТ" - 6,0 - 6,6 lg ЭИД50/см3, штамм "ВНИИБП" -5,0 - 5,5 lg ЭИД50/см3, штамм "Богатищевский" - 5,0 - 5,25 lg ЭИД50/см3).

Первым этапом работы являлось получение концентрированных препаратов вируса ИЛТ, необходимых для иммунизации мышей-доноров иммунных спленоцитов и скрининга гибридных клонов.

Наиболее активные препараты очищенного вируса ИЛТ получены по схеме, включающей концентрирование ультрацентрифугированием, очистку ультрацентрифугированием в ступенчатом градиенте (30-35-40-45%) сахарозы, с последующим концентрированием и очисткой в градиенте плотности перколла. Титр препаратов очищенного вируса в градиенте плотности пер-колла в микроварианте РДП- 1:8 — 1:32.

Титр антител в сыворотках крови петуха, кролика, морской свинки, иммунизированных препаратами очищенного вируса по схемам, предложенным Сюриным с соавтор. [Сюрин В.Н. и др., 1979], для оценки сохранности антигенности, составил - 1:8 - 1:16, 1:32 - 1:64, 1:16 - 1:32, соответственно.

Итак, можно сделать заключение о том, что полученные препараты вируса в процессе очистки в градиенте плотности перколла сохранили антигенную активность, и поэтому пригодны для иммунизации мышей линии BALB/c и скрининга клонов.

2 2.2 Получение гибридом, продуцирующих моноклоначьные антитела к антигенам вируса ИЛТ Иммунизацию мышей линии BALB/c провели очищенным в градиенте перколла антигеном вируса ИЛТ (штамм ЦНИИПП) бти кратными инъекциями по схеме: 1-ая инъекция - подкожно в дозе 50 мкг (по белку) на мышь с неполным адъювантом Фрейнда; интервал между инъекциями — 14 суток; 4 раза с интервалом 14 дней - внутрибрюшинно в той же

дозе; 6-я - внутриселезеночная (бустер-доза) в дозе 100 мкг. Титр антител сыворотки мышей BALB/C в непрямом ТФ ИФА составил 1:16000- 1:32000.

Проведено 2 гибридизации. Для слияния использовали клетки миеломы мыши линии Sp 2/0 и спленоциты в соотношении 110. Гибридизацию индуцировали в гибридомной среде с ПЭГ-1500. Клонообразование было отмечено на 3-7 сутки В результате получили 262 клона гибридных клеток.

Скрининг клонов на продукцию специфичных антител проводили 3 раза с 3-4-дневными интервалами в непрямом ТФ ИФА с сорбированными на твердой фазе препаратами очищенного концентрированного вируса и нормальным эмбриональным антигеном.

В результате 3-кратного скрининга выбрали 49 наиболее активных клонов. Клонирование гибридом проводили последовательно в полужидком агаре и методом лимитирующих разведений. Между каждым этапом клонирования гибридом проводили скрининг на специфическую антителопродук-цию в непрямом ТФ ИФА В результате 3-кратного клонирования выбрали 16 стабильных и активных клонов-антителопродуцентов.

Клоны культивировали в стандартных условиях ш vitro в полистироловых планшетах, и in vivo в брюшной полости линейных мышей. Титры МКА в непрямом ТФ ИФА составили в культуральной жидкости 1:160-1:20480, а в асцитической -1:64000-1:8192000.

Изучение стабильности клонов гибридом при пассировании in vitro и in vivo Культуральные свойства гибридных клеток оценивали по характеру и интенсивности их роста в планшетах in vitro. При коэффициенте пересева 1:3 - 1:4 гибридом клонов (4А5В7, 4А5В8; 4А5С2; 4А5С6, 4А5С10; 2А10ЕЗ; 1C10D10; 1H8G11; 1C4F3; 1С4Е7; 1C4F12) и посевной дозе т vitro 100-150 тыс. клеток в 1 см3 частота пассирования составляет 1 раз за 3 - 4 дня. Индекс пролиферации за 48 часов составляет 3,5 - 4,5. Сохранность клеток, полученных при культивировании in vitro, после криоконсервирования - не ниже 80%, с полной сохранностью антителопродукции. Сохранность клеток, полученных пассированием in vivo на линейных мышах BALB/c, после раз-

мораживания не ниже 85%, с полной сохранностью антителопродукции. Культивирование гибридом in vivo вызывает образование асцитической жидкости в объеме от 1,5 до 5,5 см3 на 7-14 сутки у 80 - 90 % мышей.

Таким образом, по всем показателям полученные линии гибридом подходят для использования в производственных условиях.

2 2 3. Изучение гшмунохшшческт свойств МКА Полипептидную специфичность МКА к антигенам вируса ИЛТ определяли электрофоретическим разделением с последующим переносом из ПААГ-ДСН на нитроцеллюлоз-ную бумагу. Результаты вестерн-блота показали, что 2 клона гибридом продуцируют МКА к полипептиду массой 30 кДа, один клон - 34 кДа, 5 клонов -35 кДа, и 4 - 39 кДа и один клон - 60 кДа. ТФ ИФА установили, что 10 клонов продуцировали иммуноглобулины класса Ig G1, а 6 клонов - Ig М Общая характеристика МКА в полипептидам вируса ИЛТ представлена в табл. 1.

Таблица 1

Общая характеристика моноклональных антител к вирусу ИЛТ п=3

Шифр клона Класс (субкласс) иммуноглобулина Полипептидная специфичность МКА, кДа Титр МКА в культураль-ной жидкости Титр МКА в асцитической жидкости

4А5В7 G1 35 1280 - 2560 512000- 1024000

4А5В8 G1 35 2560-5120 1024000 - 2048000

4А5С2 G1 н.о 2560-5120 2048000-4096000

4А5С6 G1 60 5120- 10240 1024000-2048000

4А5С10 G1 34 (35) 10240-20480 4096000-8192000

4D6D3 G1 35 2560-5120 2048000 - 4096000

4D6D4 G1 35 320 - 640 256000-512000

4D6D9 G1 39 640 - 1280 64000- 128000

4D6D10 G1 39 320 - 640 64000- 128000

2А10ЕЗ G1 39 160-320 256000- 512000

1C10D10 М и о 1280-2560 4096000-8192000

1H8G11 М 30 1280-2560 4096000-8192000

1C4F3 м 30 640- 1280 4096000-8192000

1С4В9 м 35 2560-5120 1024000-2048000

1С4Е7 м 39 2560-5120 1024000-2048000

1C4F12 м н о 1280 - 2560 1024000 - 2048000

Примечания * - представлены обратные величины титров в ТФ ЙФА, н о - не определена

Таким образом, можно сделать заключение о том, что иммунизацией мышей антигенно активными препаратами очищенного вируса получены стабильные клоны гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к полипептидам (30, 34, 35, 39,60 кДа) вируса ИЛТ.

2 2 4 Разработка варианта иммуногистохимии (иммунопероксидазно-го метода) (ИГХ, ИПМ) на основе МКА для обнаружения вируса ИЛТ в мазках-отпечатках пораженных органов птиц В качестве простого и экспрессного варианта иммуноферментного метода была апробирована ИГХ для выявления вируса ИЛТ в мазках-отпечатках на предметных стёклах для гистологической техники со слизистой гортани и трахеи от клинически больных цыплят, зараженных вирулентным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ.

При отработке прямой ИГХ определяли пригодность варианта и титр пероксидазных конъюгатов МКА, специфичных полипептидам вируса ИЛТ с молекулярной массой 30, 35, 39 кДа, клонов 4А5В8, 2А10ЕЗ, 1С4И2, 1Н8С11 и 1С10010 с целью выявления вируса ИЛТ в клетках на мазках-отпечатках со слизистой трахеи больных птиц. Активность конъюгатов МКА 4А5В8 и 2А10ЕЗ составила 1:1000, 1С4П2 - 1:2000, 1Н8С11 и 1С10Ш0 -1:4000, а рабочее разведение 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:2000, соответственно.

Результаты ИГХ учитывали световой микроскопией при увеличении в 250 - 400 раз. При специфическом связывании пероксидазных конъюгатов МКА с вирусом ИЛТ в мазках-отпечатках наблюдается характерное красно-коричневого окрашивание инфицированных десквамированных, дегенериро-ванных и мертвых клеток слизистой оболочки поражённых органов. Инфицированные клетки встречаются одиночно и группами, цельными участками слизистой, в виде отдельных больших фокусов, а также в виде сетчатой структуры В мазках-отпечатках органов от неинфицированных и от клинически больных болезнью Ньюкасла цыплят - окрашивания не обнаруживали

ИГХ исследовали материал экспериментально инфицированных птиц -25 положительных проб из 52. Наличие вируса в полевых пробах подтвер-

ждено вирусовыделением на КЭ (вирусовыделением - 33 положительных пробы из 52), позднее - "сэндвич"-вариантом ТФ ИФА (в 52 - из 52).

Таким образом, прямой вариант ИГХ при использовании пероксидаз-ных конъюгатов МКА для выявления вируса в пробах патологического материала экспериментально инфицированных птиц имеет высокую специфичность, но с диагностической чувствительностью 43,7 %, что ограничивает применение его для широко масштабных исследований полевых проб.

2 2 5 Разработка "сэндвич"-варианта ТФ ИФА на основе МКА для выявления антигена При разработке "сэндвич"-варианта ИФА для выявления антигенов "шахматным" титрованием определяли дозу сенсибилизации МКА и титр пероксидазных конъюгатов.

Первоначальными задачами были: определение режима инкубации планшетов при сенсибилизации МКА и при постановке реакции; определение рабочей дозы сенсибилизации МКА каждого клона; определение титра и рабочего разведения конъюгата МКА-ПХ каждого клона.

В ходе сенсибилизации выбирали режим инкубации: в течение 16-18 часов при температуре 4°С или в течение 1 часа при температуре 37°С.

В ходе реакции также выбирали режим инкубации конъюгата: в течение 45 мин. при 20-23°С и в течение 45 мин. при 37°С.

Рабочую дозу сенсибилизации МКА каждого клона определяли "шахматным" титрованием сенсибилизируемых МКА и специфического антигена, при постоянной дозе конъюгата. В результате оптическая плотность (ОП) субстратного раствора в лунках планшета, в которых сорбция МКА осуществлялась в течение ночи, в 1,7-1,8 раза превышала ОП в лунках, в которых сорбция проводилась 1 час при 37°С.

В итоге выбраны следующие режимы - сенсибилизация в течение 16 -18 часов при температуре 4°С, инкубация исследуемых и контрольных образцов антигена - 60 мин. при 20 - 23°С и конъюгата - 45 мин. при 20 - 23°С.

Рабочее разведение пероксидазного конъюгата МКА определяли "шахматным" титрованием в прямом "сэндвич"-варианте ТФ ИФА.

Дозой сенсибилизации и рабочим разведением конъюгата считали их наибольшие разведения при ОП продукта реакции > 1,0. Результаты на рис. 1 (на примере клона 1С4РЗ) и в табл. 2.

Таблица 2

Доза сенсибилизации МКА и титры конъюгатов МКА - ПХ __в "сэндвич"-варианте ТФ ИФА_п = 4

№ МКА клон Доза сенсибилизации Специфический титр конъюгата МКА - ПХ

по критерию 2,1х по ОП > 1,0

1 1Н8011 1-8000- 1-12000 1 256000 1 2000 - 1 8000

2 4А5В8 1.6000- 1.10000 1.64000 1.500- 1 1000

3 1С4Е7 1 8000- 1:16000 1.256000 1 2000 - 1 8000

4 1С4В9 1 8000- 1:16000 1 256000 1-2000- 1.8000

5. 1С4РЗ 1 8000-116000 1 256000 1.2000- 1 8000

6 1С4Р12 1.8000- 1:16000 1:256000 1-2000- 1 8000

7 2А10ЕЗ 1-2000- 1 4000 1:64000 1 500- 1.1000

8 1С10Ш0 1:8000- 1-16000 1:256000 1 2000 - 1 8000

9. 4А5В7 1:6000- 1:10000 1:64000 1.500- 1.1000

ОП 4 0 5 нм

0123456789 10 II 12 разведения препаратов, !о°2 "^^Сенсибилизация лунок МКА клона 1 ("413 в 2-кратных разведениях, начиная с 1.1000

—— Максимально допустимый уровень фона - 0,05 (неспецифическое окрашивание субстрата)

—О— Разведения конъюгата, начиная с 1:250 и далее 2-кратно

■"""Уровень отсекания (максимальное разведение препарата при оптической плотности _раствора субстрата равной 0,1 и более)_

Рис. 1. Определение рабочей дозы сенсибилизации МКА клона 1С4РЗ и титра конъюгата в "сэндвич'-варианте ТФ ИФА

В итоге наиболее активными и стабильными были конъюгаты клонов

1Н8011, 4А5В7, 4А5В8, 1С4Е7, 1С4В9, 1С4РЗ, 1С4Р12, 2А10ЕЗ, 1С1(Ю10.

Подобрано рабочее разведение конъюгатов МКА: 1Н8С11 - 1:2000 - 1:8000,

4А5В7 - 1:500 - 1:1000, 4А5В8 - 1:500 - 1:1000, 1С4Е7 - 1:2000 - 1:8000,

1С4В9 - 1:2000 - 1:8000, 1С4РЗ - 1:2000 - 1:8000, 1С4Р12 - 1:2000 - 1:8000,

2А10ЕЗ - 1:500- 1:1000, 1СЮОЮ- 1:2000- 1:8000.

Чувствительность и специфичность "сэндвич"-варианта ТФ ИФА Для определения чувствительности и специфичности метода в опыте использовали специфические, нормальные и гетерологичные антигены.

При определении специфичности установлено, что сорбированные МКА (захватывающие антитела) на планшете и конъюгаты на их основе (детектирующие антитела) реагировали только с антигеном вируса ИЛТ (вакцинные штаммы "ЦНИИПП" и "ВНИИБП", вирулентный штамм "Богати-щевский" в виде 10%-ных суспензий ХАО и ЭЭЖ КЭ, препараты очищенного вируса ИЛТ), и не реагировали с нормальными (10%-ной суспензии ХАО и ЭЭЖ незараженных безлейкозных КЭ) и гетерологичными антигенами вирусов (болезни Ньюкасла (НБ) (штамм "La Sota"), инфекционной бурсальной болезни (ИББ) (штамм "БГ"), гриппа птиц (ГП) (штаммы А/цыпленок/ Росток/29 (H7N7), А/крачка/Южная Африка/82 (H5N2), А/курица/Росток/34 (H7N1)), болезни Марека (БМ) (штамм "FC-126"), чумы уток (ЧУ) (штамм "АКВ - ВНИИВВиМ")). Результаты представлены в табл 3.

В пробах патматериапа от клинически больных инфицированных птиц антигены вируса ИЛТ были выявлены прямым "сэндвич"-вариантом ТФ ИФА в титре 1:64 - 1:8192, в препаратах очищенного вируса ИЛТ в титре 1:2048 - 1:8192, в вакцинных препаратах - 1:65536 - 1:131072 Предельная чувствительность "сэндвич"-варианта ТФ ИФА составила 1 - 2 lg ЭИД50/см3.

Результаты определения предельной чувствительности РДП и "сэн-двич"-варианта ТФ ИФА представлены в табл. 4. Апробированы пары МКА всех 16 клонов, в таблице указаны только 5 клонов (1H8G11, 4А5С10, 1С4Е7, 4А5С6, 4А5В8) различной полипептидной (30, 34, 35, 39 и 60 кДа) специфичности. Все остальные 11 клонов МКА не имеют отличий при определении специфичности и определении титра антигена вируса.

Таким образом, прямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА является специфичным и позволяет выявлять антигены вируса в ЭЭЖ и ХАО зараженных КЭ, в пробах гортани и трахеи и экссудате из просвета гортани и трахеи больных цыплят и кур.

Таблица 3

Определение специфичности "сэндвич"-варианта ТФ ИФА на основе МКА п = 5

Исследуемый антиген МКА, специфичные полипептиду с молекулярной массой

1Н8011 (30 кДа) 4А5С10 (34 кДа) 4А5В8 (35 к Да) 1С4Е7 (39 кДа) 4А5С6 (60 кД'а)

Клон "НТ" штамма "ЦНИИПП" вируса ИЛТ, 6,0 ^ ЭИД50/см3 + + + + + '

Штамм "ВНИИБП" вируса ИЛТ, 5,0^ ЭИД5о/см3 + + + + +

Штамм "Богатищевский" вируса ИЛТ, 5,0 ^ ЭИД50/СМ3 + + + + +

Нормальный эмбриональный антиген - - - - -

Вирус болезни Ньюкасла (штамм "Ьа Зйа") - - - - -

Вирус гриппа птиц (серотипы Н7Ы7, И7Nl) - - - - -

Вирус инфекционной бурсальной болезни (штамм "БГ") - - - - -

Вирус болезни Марека (штамм "РС-126") - - - - -

Вирус чумы уток (штамм "АКВ-ВНИИВВиМ") - - - - -

Примечания "+" в ячейках таблицы означает - антиген вируса ИЛТ в материале выявлен, "-" в ячейках таблицы означает - антиген вируса ИЛТ в материале не выявлен

Таблица 4

Определение чувствительности прямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА на основе МКА п=5

МКА, специфичные полипептидам 30,34,35,39, 60 кДа Пробы патматериала от клинически больной птицы, 2-3 ЭИД50/ см3 Вирулентный штамм Богатищевский

инфекц. активность для КЭ 5,0 1ё ЭИД50/ см3 инфекц. активность для цыплят 4,0 ^ ИД50/ см3

РДП сэндвич ТФ ИФА РДП сэндвич ТФ ИФА РДП сэндвич ТФ ИФА

<1-2 2-3 1§ ЭИД50/см3 1:8192 1 -21ё ЭИД50/см3 1:8- 1:16 1:10000 1:8 1:1000

4 ЭИД50/СМ3 1 - 2 1ё ЭИД50/см3 3 1ёИД50/см3 \-2\g ИД50/см3

Вакцинные штаммы

ЦНИИПП, инфекц. активность 6,0-6,6 ^ЭИД50/см3 ВНИИБП, инфекц. активность 5,0-5,5 ^ЭИДзо/см3

Мб- 1-32 1:65536 - 1:131072 1:2-1:4 1:32768 - 1:65536

4 \ё ЭИД50/см3 1 - 2 ЭИД50/см3 5 ЭИД50/см3 1 - 2 ^ ЭИД50/см3

Примечание в числителе - титр вируса ИЛТ в пробе, в знаменателе - предельная чувствительность, 1§ ЭИД50/ см"1 (ИД50/ см3)

Из представленных данных в табл. 3 и 4 следует, что "сэндвич"-вариант ТФ ИФА является чувствительным (диагностическая чувствительность -96,15%) и специфичным (диагностическая специфичность - 100%), так как позволяет обнаружить антигены вируса ИЛТ во всех опытных материалах. "Сэндвич"-вариант ТФ ИФА может быть предложен для включения в схему лабораторной диагностики ИЛТ.

Для выявления антигена в "сэндвич"-варианте ТФ ИФА предлагаются использовать пары (антитела захватывающие - антитела детектирующие) МКА клонов 4А5В7 - конъюгат 4А5В7 (35 кДа, Ig Gl); 4А5В8 - конъюгат 4А5В8 (35 кДа, Ig Gl); 1C10D10 - конъюгат 1C10D10; 2А10ЕЗ - конъюгат 2А10ЕЗ (39 кДа, Ig Gl), 4А5С6 - конъюгат 4А5С6 (60 кДа, Ig Gl); 4А5С10 -конъюгат 4А5С10 (34 кДа, Ig Gl); 1C4F3 - конъюгат 1C4F3 (30 кДа, Ig М); 1C4F12 - конъюгат 1C4F12; 1С4Е7 - конъюгат 1С4Е7 (39 кДа, Ig М); 1С4В9

- конъюгат 1С4В9 (35 кДа, Ig M);1H8G11 - конъюгат 1H8G11 (30 кДа, Ig М).

Идентификация антигенов вируса ИЛТ "сэндвич"-вариантом ТФ ИФА в пробах патологического материала, обработанных детергентами С целью повышения чувствительности "сэндвич'-варианта ТФ ИФА при выявлении в вируссодержащем материале антигенов вируса ИЛТ для обработки проб использовали детергенты: дезоксихолат натрия, Nonidet Р40, Triton X-100 и додецилсульфат натрия (концентрации детергентов в суспензии пробы

- 0,5% и 1%). Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5

Активность антигена вируса ИЛТ в "сэндвич"-варианте ТФ ИФА после обработки детергентами _п=10

Детергент Конечная концентрация детергента в суспензии пробы

0,5% 1%

Титр антигена в пробе после обработки

Дезоксихолат натрия 1:2048- 1-4096 1:2048- 1:4096

Додецилсульфат натрия 1:2048- 1:4096 1:2048- 1:4096

Nonidet Р40 1:2048- 1:4096 1:2048- 1:4096

Triton Х-100 1:2048- 1:4096 1:2048- 1:4096

Положительный контроль (без обработки детерентами) 1:2048- 1:4096

Отрицательный контроль 0

После обработки проб патматериала детергентами возможно наиболее полное высвобождение вируса из клеточного детрита, что тем самым повысит концентрацию вируса.

Из представленных в табл. 5 данных следует, что ни один из апробированных детергентов при обработке вируссодержащего материала в испытанных концентрациях не влияет на титр антигена вируса, и не повышает чувствительности метода.

2 2 6 Разработка варианта ингибирования ТФ ИФА на основе моно-клональных антител для выявления специфических антител в политональных сыворотках птицы Этот вариант ИФА отрабатывали с целью использования для выявления специфических антител к антигенам вируса ИЛТ в сыворотках птиц. При разработке варианта за основу были взяты МКА клонов 4А5В7, 4А5В8, 1С1(Ю10, 2А10ЕЗ, 4А5С6, 4А5С10, 1С4РЗ, 1С4Е7, 1Н8С11.

Первоначально определяли рабочую дозу сенсибилизации полистироловых планшетов МКА к полипептидам (30, 34, 35, 39, 60 кДа) вируса ИЛТ и рабочее разведение антигена вируса ИЛТ "шахматным" титрованием в прямом "сэндвич"-варианте ТФ ИФА. За рабочее разведение антигена вируса принимали, то, при котором ОП субстрата >1,0 единицы. В итоге рабочее разведение антигена вируса ИЛТ - 1:400 - 1:800.

Рабочее разведение пероксидазного конъюгата на основе МКА определяли "шахматным" титрованием гипериммунной сыворотки петуха, сывороток здоровых интактных цыплят и пероксидазного конъюгата МКА того же клона, МКА которого были сорбированы в рабочем разведении в планшетах, при рабочем разведении антигена вируса ИЛТ.

В результате специфические антитела сыворотки петуха не ингибиро-вали связывания ни одного из полученных конъюгатов МКА (специфичных тому же полипептиду вируса) с антигеном, захваченным сорбированными МКА. Возможную причину такого результата можно объяснить тем, что МКА к определенному полипептиду (30, 34, 35, 39, 60 кДа) строго специфичны одному эпитопу белка, в то время как антитела исследуемых сыворо-

ток птиц специфичны другому эпитопу того же протеина По-видимому, это является видовой особенностью иммунного ответа кур и мышей

В связи с тем, что полученные МКА к полипептидам вируса ИЛТ не конкурировали с антителами сывороток птиц, было принято решение по отработке непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА для выявления антител.

2.2.7 Разработка непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА на основе МКА для выявления специфических антител в поликлональных сыворотках птиц При разработке варианта за основу были взяты МКА, специфичные полипептидам вируса ИЛТ (30, 34, 35, 39 и 60 кДа) клонов 4А5В7, 4А5В8, 1С10010, 2А10ЕЗ, 4А5С6, 4А5С10, 1С4РЗ, 1С4Р12, 1С4Е7, 1Н8011.

Доза сенсибилизации планшета МКА: клона 1Н8011 1:8ООО -4А5В7 1:6000 - 1:10000; 4А5В8 1*6000 - 1:10000, 1С4Е7 1*8000 -1С4В9 1:8000 - 1:16000; 1С4РЗ 1:8000 - 1:16000; 1С4Р12 1:8000 -2А10ЕЗ 1-2000 - 1:4000; 1С10010 1:8000 - 1:16000; 4Э6ЭЗ 1:8000 -4Б604 1:8000 - 1:16000; 40609 1:8000 - 1:16000; 406010 1:8000 -4А5С2 1:4000- 1:8000; 4А5С6 1:4000- 1:8000; 4А5С10 1:4000- 1 8000.

Рабочее разведение специфического антигена вируса ИЛТ определяли "шахматным" титрованием с антителами гипериммунной сыворотки петуха в планшетах с сорбированными в рабочем разведениии МКА. Пероксидазные конъюгаты кроличьих антител к иммуноглобулинам кур (далее - кроличьи антикуриные) и пероксидазные конъюгаты МКА к иммуноглобулинам в кур (далее - анти-^О кур) вносили в разведении 1:500. За рабочее разведение специфического антигена принимали его наибольшее разведение, при котором ОП была> 1,0.

В итоге рабочее разведение антигена вируса ИЛТ было 1:256 — 1:512.

Определение активности и рабочих разведений антикуриных перокси-дазных конъюгатов "Шахматным" титрованием в непрямом "сэндвич"-варианте ТФ ИФА специфических антител гипериммунной сыворотки петуха, пероксидазных конъюгатов кроличьих антикуриных иммуноглобулинов и пероксидазных конъюгатов МКА анти-1§0 кур определяли их титры.

1:12000; 1:16000, 1:16000; 1:16000; 1:16000,

Проба считалась положительной, если ОП субстратного раствора в лунке, где ее инкубировали, в 2,1 и более раза выше ОП раствора в лунке с отрицательным контролем. Рабочее разведение - наибольшее разведение, при котором ОП >1,0. Результаты представлены на рис. 2.

ОП4 05 им

0 1 23456789 10 11 12 разведения препаратов, ^2

-О— 2-кратные разведения антикуриного конъюгата, начиная с 1:125

- -* - Максимально допустимый )ровеиь фона - 0,05 (неспецифическое окрашивание субстрата)

—О—2-кратные разведения гипериммунной сыворотки, начиная с 1:100

Уровень отсекания (максимальное разведение препарата при оптической плотности раствора субстрата равной ОД и более)

Рис 2 Определение титра антикуриного конъюгата кроличьих антител В результате титр антикуриного пероксидазного конъюгата кроличьих

антител составил 1:8000 - 1:32000, титр пероксидазного конъюгата МКА антикв кур составил 1:64000 - 1:128000, рабочее разведение, соответственно - 1:1000 - 1.4000, 1.4000 - 1:8000. В итоге были выбраны условия постановки непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА: отмывка трёхкратно ЗФР-Т и инкубирование при 20-23°С в течение 1 часа - специфический антиген, 1-1,5 часов - исследуемые сыворотки, 1 часа - антикуриный конъюгат.

Таким образом, разработан непрямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА на основе МКА к полипептидам (30, 34, 35, 39, 60 кДа) вируса ИЛТ для выявления антител в сыворотках птиц с использованием пероксидазных конъюгатов кроличьих поликлональных антител к иммуноглобулинам кур и МКА анти-

1еС кур, и подобраны условия постановки реакции

2 2 71 Определение специфичности непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА В непрямом "сэндвич"-варианте ТФ ИФА в планшетах с захваченным антигеном вируса ИЛТ сорбированными МКА к полипептидам (30, 34, 35, 39, 60 кДа) вируса ИЛТ готовили ряды двукратных разведений (с Г100) исследуемых сывороток: вакцинированных и больных цыплят, а также положительный (гипериммунная сыворотка петуха) и отрицательные контроли - антисыворотки крови кур (уток) содержащие антитела к гетерологическим вирусам (ГП, НБ, ИББ, ЧУ) и сыворотка здоровых цыплят.

При определении специфичности установлено, что антитела сывороток связывались с антигеном вируса ИЛТ, захваченным сорбированными МКА к полипептидам (30, 34, 35, 39, 60 кДа). Антитела гетерологических сывороток и нормальной сыворотки кур не связывались с антигеном вируса Комплекс "антиген-антитело сыворотки" выявляли пероксидазными конъюгатами антикуриных кроличьих антител и МКА к ^ в кур в рабочих разведениях.

Непрямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА на основе сорбированных МКА к полипептидам (30, 34, 35, 39, 60 кДа) вируса ИЛТ является специфичным и позволяет выявлять антитела к антигенам вируса ИЛТ в сыворотках птицы и дифференцировать от антител к гетерологичным вирусам (ГП, НБ, ИББ, ЧУ)

2 2 72 Определение чувствительности непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА В непрямом "сэндвич"-варианте ТФ ИФА в планшетах с захваченным антигеном вируса ИЛТ сорбированными МКА титровали исследуемые сыворотки вакцинированных и больных цыплят в виде двукратных разведений (с 1:100), а также гипериммунную сыворотку петуха (с 1:100)) и отрицательный контроль (сыворотку здоровых цыплят (с 1:100)).

При титре антител в сыворотках больных птиц в РДП <1:2 титр в ТФ ИФА был 1:200 - 1:400. При титре антител в сыворотках вакцинированных против ИЛТ птиц в РДП - 1:2 титр в ТФ ИФА был 1:800 - 1:1600. Титр антител в сыворотках экспериментально зараженных птиц после вакцинации в РДП - 1:2 - 1:4 при титре в ТФ ИФА - 1:1600 - 1:6400. Титр антител гипериммунной сыворотки петуха в РДП - 1:8 - 1:16, а в ТФ ИФА - 1:51200 -1:102400. Результаты определения чувствительности и специфичности непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА представлены в табл. 6.

Таблица 6

Чувствительность и специфичность непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА для выявления специфических антител в сыворотках птиц

п=4

Наименование испытуемых проб Определение специфичности Определение титра антител

РДП непрямым "сэндвич" ТФ ИФА

Гипериммунная сыворотка петуха специфичная к вирусу ИЛТ + 1.8- 1 16 1 51200 - 1 102400

Сыворотка крови вакцинированных 45-60-дн цыплят и зараженных вирулентным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ + 12-14 1 1600 -1 3200

Сыворотка крови 45-60-дн цыплят больных ИЛТ + <1 2 1 200 - 1 400

Сыворотка крови вакцинированных кур и зараженных вирулентным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ + 12-14 1 3200- 1 6400

Сыворотка 45-60-дн цыплят, вакцинированных против ИЛТ вирусвакциной (штамм "ЦНИИПП") + 12-14 1 800 - 1 1600

Нормальная сыворотка птицы (сыворотка здоровых интактных цыпляг) - 0 0

Сыворотка кур, специфичная вирусу гриппа птиц — 0 0

Сыворотка кур, специфичная вирусу болезни Ньюкасла - 0 0

Сыворотка кур, специфичная вирусу инфекционной бурсапьной болезни - 0 0

Сыворотка уток, специфичная вирусу чумы уток — 0 0

Диагностическая специфичность/чувствительность 100% 100%

Таким образом, непрямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА на основе сорбированных МКА клонов 4А5В7, 4А5В8, 1С1(Ю10, 2А10ЕЗ, 4А5С6, 4А5С10, 1С4РЗ, 1С4Р12, 1С4Е7, 1Н8С11, с использованием пероксидазных конъюга-тов кроличьих антител к иммуноглобулинам кур и пероксидазных конъюга-тов МКА анти-^в кур может быть рекомендован для серологического мониторинга ИЛТ среди домашней, синантропной и дикой птицы.

3. Выводы

1. Модифицирована схема получения препаратов частично очищенного специфического эмбрионального антигена вируса ИЛТ (клон "НТ" штамма "ЦНИИПП"), заключающаяся в последовательном концентрировании и очистке вируссодержащей суспензии ультрацентрифугированием в ступенчатом градиенте (30, 35, 40, 45%) сахарозы и в градиенте перколла. Препараты очищенного вируса обладают активностью в РДП в титрах 1:4 — 1:32 и в "сэндвич"-варианте ТФ ИФА - 1:1024- 1:8192.

2. Получены 16 новых клонов гибридом, продуцирующих специфические МКА к пяти полипептидам вируса ИЛТ с молекулярными массами 30, 34, 35, 39 и 60 кДа

3. Разработан прямой вариант гистохимического иммуноферментного метода на основе МКА к полипептидам (30, 35, 39 кДа) вируса ИЛТ. Метод является специфичным, позволяет выявлять антигены вируса ИЛТ в мазках-отпечатках слизистой гортани и трахеи больных цыплят и кур, но его диагностическая чувствительность 43,7%.

4. Разработан "сэндвич"-вариант ТФ ИФА на основе МКА к полипептидам (30, 34, 35, 39, 60 кДа) вируса ИЛТ. Метод является специфичным и чувствительным, и позволяет выявлять антигены вируса ИЛТ в экстраэмбриональной жидкости и суспензии гомогената хорио-аллантоисной оболочки куриных эмбрионов, в пробах гортани и трахеи больных цыплят и кур.

5. Разработан непрямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА на основе МКА к полипептидам (30, 34, 35, 39, 60 кДа) вируса ИЛТ. Метод является специ-

фичным и чувствительным, и позволяет выявлять антитела в сыворотках крови больных и вакцинированных против ИЛТ цыплят.

6. Разработанные на основе МКА прямой и непрямой "сэндвич"-варианты ТФ ИФА апробированы на полевых материалах и могут быть предложены для применения в схеме лабораторной диагностики ИЛТ.

4. Практические предложения

Подготовлены "Методические указания по диагностике инфекционного ларинготрахеита птиц твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител" и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ 18 июля 2006 года.

5. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Получение антигенов вируса инфекционного ларинготрахеита птиц / А.И. Чурин, Р.Г. Мавликаев, C.B. Середа, В.Н. Пономарёв, Б.В. Новиков // Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве: материалы Междунар. юбил. науч.-практ. конф., СПбГАВМ. - Санкт-Петербург, 2004. - С. 76 - 77.

2. Получение гипериммунной преципитирующей сыворотки к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц / Р.Г. Мавликаев, H.A. Изотова, В.В. Кадетов, А.И. Чурин, Б.В. Новиков, C.B. Середа // Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве: материалы Междунар. юбил. науч.-практ. конф., СПбГАВМ. - Санкт-Петербург, 2004. - С. 77 - 79.

3. Получение антигенов вируса инфекционного ларинготрахеита птиц / А.И. Чурин, Р.Г. Мавликаев, C.B. Середа, В.Н. Пономарёв, Б В. Новиков // Болезни диких животных: труды Междунар науч.-практ. конф., ВНИИВВиМ. - Покров, 2004. - С. 148 - 152.

4. Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ларинготрахеита птиц / А.И. Чурин, C.B. Середа, Е.Г. Анохина, В.Н. Понома-

рев, Р.Г. Мавликаев, Б В. Новиков // Сибирская язва и другие опасные инфекционные болезни животных, материалы по теме работы круглого стола, приуроченного к 80-летию академика РАСХН Бакулова И.А , ГНУ ВНИ-ИВВиМ. - Покров, 2005. - С. 227 - 231.

5. Чурин, А.И. Выявление антигенов вируса инфекционного ларингот-рахеита птиц "сэндвич"-вариантом ТФ ИФА на основе моноклональных ан-

тител / А.И. Чурин, Б.В Новиков, [Р.Г. Мавликаев// Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных- материалы Междунар. науч. конф., УГСХА. - Ульяновск, 2006. - С. 167 - 171.

6. Чурин, А.И. Непрямой "сэндвич'-вариант ТФ ИФА на основе моноклональных антител для определения антител к вирусу ИЛТ в сыворотках

кур / А.И. Чурин, Б.В. Новиков, [Р.Г. Мавликаев^/ Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: материалы Междунар. науч. конф., УГСХА. - Ульяновск, 2006. - С. 171 - 175.

7. Чурин, А.И. Иммунопероксидазный гистохимический метод идентификации антигенов вируса инфекционного ларинготрахеита птиц с использованием моноклональных антител / А.И. Чурин, [Р.Г. Мавликаев|, Б.В. Новиков // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: материалы Междунар. науч. конф., УГСХА. - Ульяновск, 2006. - С. 176- 179.

8. Получение моноклональных антител к антигенам вируса инфекционного ларинготрахеита птиц и их характеристика / А.И. Чурин, Е.Г. Анохина, Р.Г. Мавликаев], Б.В Новиков // Профилактика, диагностика и лечение

инфекционных болезней, общих для людей и животных: материалы Междунар. науч. конф., УГСХА. - Ульяновск, 2006. - С. 180 - 183.

9. Обнаружение антител к антигенам вируса инфекционного ларинготрахеита в сыворотках крови домашних, диких и синантропных птиц / А.И. Чурин, O.A. Панова, [Р.Г. Мавликаев|, Б.В. Новиков, А.Ю. Бондарев, П.И. Барышников // Ветеринария. - 2006. - № 12. - С. 48 - 49.

г

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, г. Покров Владимирской области. Тираж 70 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чурин, Александр Иванович

1. Оглавление

2. Список сокращений

3. Введение

3.1. Актуальность темы

3.2. Цель и задачи исследований

3.3. Научная новизна работы

3.4. Практическая значимость результатов

3.5. Апробация и публикации результатов

3.6. Основные положения, выносимые на защиту

3.7. Личный вклад автора в выполнении работы

4. Обзор литературы

4.1. Характеристика инфекционного ларинготрахеита птиц

4.2. Краткая характеристика семейства Herpesviridae

4.3. Характеристика вируса инфекционного ларинготрахеита птиц

4.4.1. Выделение вируса

4.4.2. Гистологический метод

4.4.3. Реакция нейтрализации (РН)

4.4.4. Реакция иммунодиффузии (РИД, РДП)

4.4.5. Метод флуоресцирующих антител (МФА)

4.4.6. Встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ)

4.4.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и другие методы молекулярной диагностики, применяемые при идентификации вируса ИЛТ

4.4.8. Иммуноферментный анализ (ИФА)

4.4.9. Получение и изучение свойств гибридом и сайтспецифических иммуноглобулинов

4.4.10. Применение моноклональных антител в диагностике вирусных болезней 34 4.5. Заключение по обзору литературы

5. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 36 5.1. Материалы и методы

5.1.1. Материалы

5.1.1.1. Животные

5.1.1.2. Вирусы

5.1.1.3. Специфические сыворотки

5.1.1.4. Культуры клеток

5.1.1.5. Питательные среды и растворы

5.1.1.6. Приготовление питательных сред и их компонентов

5.1.1.7. Реактивы

5.1.1.8. Исходные водные растворы

5.1.1.9. Растворы для конъюгации иммуноглобулинов и пероксидазы хрена

5.1.1.10. Растворы для постановки ИФА

5.1.1.11. Оборудование

5.1.2. Методы

5.1.2.1. Получение вируссодержащего материала, определение его инфекционной активности

5.1.2.2. Концентрирование и очистка вируса ИЛТ птиц

5.1.2.3. Получение препаратов нормальных антигенов

5.1.2.4. Приготовление гипериммунных антисывороток петухов, кроликов и морских свинок

5.1.2.5. Реакция диффузионной преципитации (РДП)

5.1.2.6. Иммуноэлектрофорез

5.1.2.7. Определение концентрации белка

5.1.2.8. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела

5.1.2.9. Приготовление культуры клеток перитонеальных макрофагов мыши

5.1.2.10. Гибридизация

5.1.2.11. Скрининг гибридных антитело продуцентов

5.1.2.12. Клонирование стабильно пролиферирующих гибридных антителопродуцентов

5.1.2.13. Определение классов и подклассов моноклональных иммуноглобулинов

5.1.2.14. Получение асцитических жидкостей, содержащих моноклональные антитела

5.1.2.15. Криоконсервирование гибридомных клеток и восстановление их после хранения в замороженном состоянии

5.1.2.16. Выделение антител из поликлональных сывороток и асцитических жидкостей

5.1.2.17. Приготовление конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой

5.1.2.18. Определение полипептидной специфичности МКА методом вестерн-блоттинга

5.1.2.19. "Сэндвич" - вариант ТФ ИФА для исключения присутствия гетерологическнх антигенов в препаратах частично очищенного вируса

5.1.2.20. Непрямой вариант ТФ ИФА для скрининга МКА

5.1.2.21. Иммуногистохимия (иммунопероксидазный метод)

5.1.2.22. "Сэндвич"-вариант ТФ ИФА для выявления антигена

5.1.2.23 Вариант ннгибирования ТФ ИФА для выявления специфических антител в сыворотках крови

5.1.2.24. Непрямой "сэндвнч"-вариант ТФ ИФА для выявления специфических антител

5.1.2.25. Методы математического анализа 57 5.2. Результаты собственных исследований

5.2.1. Культивирование вируса ИЛТ кур

5.2.2. Очистка и концентрирование вируса ИЛТ кур

5.2.3. Экспериментальная инфекция

5.2.4. Клиническое и патологоанатомическое исследование

5.2.5. Приготовление гипериммунных антисывороток петухов, кроликов и морских свинок

5.2.6. Оценка препаратов вируса ИЛТ и специфических сывороток в реакции диффузионной преципитации и во встречном иммуноэлектрофорезе

5.2.7. Определение условий постановки непрямого варианта ТФ ИФА

5.2.8. Влияние условий хранения на активность гипериммунных поликлональных антисывороток к вирусу ИЛТ

5.2.9. Определение концентрации белка в препаратах частично очищенного вируса ИЛТ

5.2.10. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ларинготрахеита птиц

5.2.10.1. Иммунизация мышей линии BALB/c

5.2.10.2. Гибридизация

5.2.10.3. Скрининг и селекция стабильных антителопродуцирующих и активнопролиферирующих клонов гибридом

5.2.10.4. Клонирование и культивирование in vitro клонов гибридом

5.2.10.5. Культивирование клонов гибридом in vivo и получение асцитических жидкостей от мышей линии BALB/c

5.2.10.6. Определение титра МКА в супернатаитах культуральных и иммуноасцитических жидкостей мышей в непрямом ТФ ИФА

5.2.10.7. Криоконсервирование гибридомных клеток

5.2.10.8. Изучение стабильности клонов гибридом при пассировании in vitro и in vivo

5.2.10.9. Определение классов и подклассов моноклональных иммуноглобулинов

5.2.10.10. Определение концентрации белка в глобулиновой фракции асцитов

5.2.10.11. Определение полипептидной специфичности МКА методом вестерн-блоттинга

5.2.10.12. Изучение преципитирующих свойств моноклональных антител в реакции диффузионной преципитации (РДП)

5.2.11. Приготовление конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой хрена

5.2.12. Разработка модифицированных вариантов ИФА на основе моноклональных антител для лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц

5.2.12.1. Разработка непрямого варианта иммуноферментного анализа (ТФ нИФА) для обнаружения специфических антител к вирусу ИЛТ в сыворотках крови птицы, и МКА в суперпатантах культуральных и иммуноасцитических жидкостей

5.2.12.2. Разработка иммуногистохимии (иммунопероксидазного метода) (ИГХ, ИПМ) на основе МКА для обнаружения вируса ИЛТ в мазках-отпечатках пораженных органов птиц

5.2.12.2.1. Разработка непрямого варианта иммуногистохимии

5.2.12.2.2. Разработка прямого варианта иммуногистохимии

5.2.12.3. Разработка "сэндвич"-варианта ТФ ИФА для выявления антигена

5.2.12.4. Определение чувствительности и специфичности "сэндвич"-варианта ТФ ИФА на основе моноклональных антител

5.2.12.5. Идентификация антигенов вируса ИЛТ "сэндвич'-вариантом ТФ ИФА в пробах патологического материала, обработанных детергентами

5.2.12.6. Влияние условий хранения на активность пероксидазных конъюгатов на основе моноклональных антител

5.2.12.7. Изменение антигенной активности вируссодержащих препаратов при хранении материала в различных температурных условиях

5.2.12.8. Разработка варианта ингнбировання ТФ ИФА для выявления специфических антител в полнклональных сыворотках птицы

5.2.12.9. Разработка непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА для выявления специфических антител в полнклональных сыворотках птиц

5.2.12.10. Определение специфичности и чувствительности непрямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА

5.2.12.11. Определение специфичности антивидовых (антикуриных) полнклональных и моноклональных антител к иммуноглобулинам сывороток крови птиц

5.2.12.12. Выявление антител в сыворотках крови домашних, диких и синантропных птиц непрямым "сэндвич"-вариантом ТФ ИФА

6. Обсуждение

7. Выводы

8. Практические предложения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ларинготрахеита птиц: получение и использование"

3.1. Актуальность темыИнфекционный ларинготрахеит (ИЛТ) - вирусная контагиозная респираторная болезнь, поражающая кур всех возрастов, индеек, фазанов [27, 84, 110, 171, 204, 275], куропаток и павлинов [110, 204, 240]; протекающая сверхостро, остро, подостро [2, 14, 294] и хронически; часто болезнь протекает атипично, а клинические признаки при атипичном течении слабо выражены или их нет [38, 240]. ИЛТ распространён повсеместно и зарегистрирован на всех континентах, но наиболее широко - среди поголовья крупных птицеводческих комплексов в странах Европы, Австралии, США, Новой Зеландии, Великобритании, Китае, странах Юго-восточной Азии. К настоящему времени ареал болезни значительно расширился [77, 1 14, 240, 249, 276].

Штаммы вируса антиген но идентичны и гомологичны на основе реакции нейтрализации, реакции иммунофлюоресценции [73, 109, 268, 281]. Известные отечественные штаммы вируса в антигенном отношении родственны эталонному штамму ЦНИИПП [43].

Заболеваемость птицы в хозяйствах, где ИЛТ регистрируется впервые, составляет 80-100%, а летальность - 30-72% [2, 66, 188]. При подостром течении отмечается высокая заболеваемость птицы, но уровень летальности может быть ниже, чем при остром и сверхостром течении, и колебаться от 10% до 30% [113, 200, 240, 267]. Умеренный ИЛТ (хроническое течение) наиболее распространён среди поголовья крупных птицеводческих комплексов, проявляется в разной степени как серозно-катаральный трахеит, синусит, конъюнктивит, при этом заболеваемость может быть около 1-2% и низкой летальностью, и может длиться в течение месяцев [240].

Решающее значение в борьбе с заболеванием имеет эпизоотический контроль и проведение своевременных и эффективных противоэпизоотиче-ских мероприятий. Для этого необходимо иметь надежные и экспрессные методы лабораторной диагностики.

Диагностика ИЛТ в настоящее время представляет собой комплекс методов, включающий анализ эпизоотологических данных, клинического и па-тологоанатомического обследований, а также лабораторных методов. Лабораторные исследования направлены на: выделение вируса на куриных эмбрионах (КЭ) или культурах клеток (КК) [3, 11, 15, 51, 84, 92, 98, 196, 272, 291] и обнаружение внутриядерных включений гистологическим методом с электронной микроскопией мазков-отпечатков слизистой трахеи и/или экссудата из её просвета от больных птиц [52, 101, 105, 133, 169, 232, 261, 267, 278, 321]. Индикацию и идентификацию вируса в пробах патматериала проводят в реакции диффузионной преципитации (РДП) [5, 38, 201, 323], реакции иммунофлюоресценции (РИФ) [20, 42, 54, 86, 101, 102, 175, 180], в твердофазном иммуноферментном анализе (ТФ ИФА) с использованием поли-клональных антител [52, 63, 73, 102, 161, 227, 270, 327], на основе молекулярных методов [53, 56, 60, 124, 127, 148, 260, 273]. РДП, РИФ, ТФ ИФА с использованием препаратов поликлональных антител низко чувствительны, так как последние, зачастую, имеют перекрестную реактивность [OIE, 2005].

Ретроспективная диагностика ИЛТ направлена, прежде всего, на обнаружение антител к вирусу: в РДП [5, 23, 38, 45, 90, 102], в непрямой РИФ [52, 102], в ТФ ИФА [19, 73, 216, 226, 270, 326], в реакции нейтрализации (РН) на цыплятах, КЭ и КК [11,23,38, 47,91, 174,263,268].

Однако перечисленные методы исследований имеют ряд недостатков:1. Для получения результата требуется несколько дней;2. Высокая стоимость, трудоёмкость;3. Диагностические исследования с использованием данных методов можно проводить лишь в ограниченном количестве специализированных центров, проводящих вирусологические исследование и обеспеченных специальным оборудованием и кадрами;4. Недостаточная универсальность, экспрессность и чувствительность.

Твердофазный ИФА и МФА при использовании поликлональных сывороток обладают сравнительно одинаковой чувствительностью и специфичностью, и превосходят по этим показателям РДП и PH. РН - трудоемка, длительна в исполнении и требует значительных материальных затрат. Кроме того, и ИФА и МФА наиболее приемлемы для массовых исследований проб патматериала [52, 73, 102, 161, 226, 327].

По данным Bauer В. с соавтор. ТФ ИФА при обнаружении антител в сыворотках крови больных и вакцинированных против ИЛТ цыплят был специфичным и в 8 раз более чувствительным по сравнению с РН [73]. А по данным York J.J. с соавтор. (1983) чувствительность ТФ ИФА при определении уровня антител в сыворотках крови больных и вакцинированных противИЛТ цыплят превышала в 16 - 32 раза РН [323].

Для ретроспективной серодиагностики ИЛТ в настоящее время в России используется непрямой ТФ ИФА с использованием контрольных поликлональных антител [19, 46, 48]. Однако поликлональные антитела часто имеют высокую перекрестную реактивность, что делает затруднительным интерпретацию результатов диагностических исследований. Получение биохимически гомогенных, стабильных высокоспецифичных и авидных реагентов в необходимых препаративных количествах на основе поликлональных антител из сывороток крови птицы и животных или из иммунноасцитических жидкостей очень сложно или практически невозможно. Поликлональные антитела гетерогенны, их наработка отличается по иммунологической активности в зависимости от вида животного - донора, метода иммунизации, степени очистки антигенсодержащего препарата и других неспецифических неопределенных причин. Получение гомогенных иммунных реагентов из поликлональных антител в больших препаративных количествах - технологически сложная, трудоемкая и дорогая работа.

Эти недостатки преодолеваются при постановке ИФА с использованием моноклональных антител (МКА). Кроме того, применение моноклональ-пых антител значительно повышает чувствительность и специфичность серологических методов диагностики и позволяет применять также РН и РИФ. При этом значительно сокращаются сроки исследований, по сравнению с рутинными серологическими методами, что немаловажно при одновременном массовом анализе проб.

Поэтому разработка в настоящее время модифицированных вариантов ТФ ИФА на основе МКА для обнаружения вируса ИЛТ в исследуемом материале и специфических антител в сыворотках вакцинированной, больной и переболевшей птицьг; использование для диагностики заболевания и дифференциации от гриппа птиц, инфекционной бурсальной болезни, болезни Ньюкасла, болезни Марека, чумы уток, является актуальным. Кроме того, ИФА с использованием МКА к вирусу ИЛТ перспективен для дальнейшего исследования антигенных и иммуногенных свойств возбудителя.

3.2. Цель п задачи исследованийЦелью работы является разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики ИЛТ на основе моноклональных антител. Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:1. Получить антигенно-активные препараты очищенного вируса ИЛТ.

2. Получить гибридомы, стабильно продуцирующие моноклональные антитела к антигенам вируса ИЛТ; изучить иммунохимические свойства моноклональных антител.

3. Разработать и испытать модификации иммуноферментных методов (иммуногистохимии и твердофазного ИФА) на основе полученных моноклональных антител для обнаружения вирусных антигенов в тканях и органах больных и павших птиц и для выявления антител в сыворотках крови больных и вакцинированных птиц.

4. Разработать методические указания по диагностике ИЛТ птиц твердофазным иммуноферментным анализом па основе моноклональных антител.

3.3. Научная новизна работыНаучная новизна состоит в том, что в результате исследований:- получены шестнадцать новых клонов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к полипептидам с молекулярной массой 30, 34, 35, 39, 60 кДа вируса ИЛТ;- на основе моноклональных антител клонов гибридом 4А5В8, 2А10ЕЗ, 1C4F12, 1H8G11 и 1C10D10 разработан прямой вариант иммунопероксидаз-ного гистохимического метода для выявления антигенов вируса ИЛТ в мазках-отпечатках гортани и трахеи больных кур;- на основе моноклональных антител клонов гибридом 4А5В7, 4А5В8, 2А10ЕЗ, 4А5С6, 4А5С10, 1С4Е7, 1C4F3, 1C4F12, 1С4В9, 1H8G11 и 1C10D10 разработан "сэндвич"-вариант ТФ ИФА для обнаружения и идентификации антигенов вируса ИЛТ;- на основе моноклональных антител клонов гибридом 4А5В7, 4А5В8, 2AI0E3, 4А5С6, 4А5С10, 1С4Е7, 1C4F3, 1C4F12, 1H8G11 и 1C10D10 разработан непрямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА для обнаружения антител в сыворотках птиц.

3.4. Практическая значимость результатовДепонированы и занесены в банк данных музея гибридом ГНУ ВНИ-ИВВиМ 16 клонов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к полипептидам с молекулярной массой 30, 34, 35, 39, 60 кДа вируса ИЛТ.

Рекомендованы для включения в схему лабораторной диагностики прямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА на основе МКА для выявления антигенов вируса ИЛТ и непрямой "сэндвич'-вариант ТФ ИФА на основе МКА для выявления антител в сыворотках птиц.

Предложены методические указания для лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител.

3.5. Апробация и публикации результатовМатериалы диссертации доложены па научной конференции ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (2004 г.), на международной конференции УГСХА (2006 г.) и на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (2004, 2005г.г.). По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе статья в журнале "Ветеринария".

3.6. Основные положения, выносимые на защиту1. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к антигенам вируса ИЛТ.

2. Результаты разработки вариантов иммуноферментных методов на основе полученных моноклональных антител: прямой вариант иммупоперок-сидазного гистохимического метода и прямой "сэндвич"-вариант твердофазного иммупоферментного анализа для выявления антигенов вируса ИЛТ, непрямой "сэндвич"-вариант твердофазного иммуноферментного анализа для выявления антител в сыворотках крови птицы.

3. Диагностическая ценность прямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА для выявления антигенов вируса ИЛТ и непрямого "сэндвич"-вариапта ТФ ИФА для выявления антител в сыворотках крови птицы.

3.7. Личным вклад автора в выполнении работыОсновной объем исследований проведен автором самостоятельно.

В выполнении отдельных этапов работы принимали участие следующие сотрудники института: д.б.н., ведущий научный сотрудник Пономарев В.Н. и к.в.н., старший научный сотрудник Капустина О.В. (получение препаратов очищенного вируса ИЛТ), к.б.н., старший научный сотрудник Середа С.В., к.б.н., старший научный сотрудник Анохина Е.Г. (определение полипептидной специфичности МКА).

4. Обзор литературы4.1. Характеристика инфекционного ларинготрахеита птицИнфекционный ларинготрахеит птиц (ИЛТ) - вирусная респираторнаяболезнь кур и цыплят, наносящая значительный экономический ущерб птицеводству вследствие высокой заболеваемости и смертности, а также из-за снижения производства товарного яйца. ИЛТ регистрируют у индеек и фазанов [27, 82, 84, 110, 163, 171, 204, 275, 323], а также у куропаток и павлинов [110, 204, 240, 330]. Искусственно удавалось заражать скворцов, воробьев, ворон, декоративных, домашних и диких голубей, японских перепелов, уток и гусей [2, 3, 83, 275, 276]. У уток - субклиническое течение болезни [298]. Кролики, морские свинки и белые крысы резистентны к заражению вирусом ИЛТ [74, 275].

Нет свидетельств того, что к вирусу ИЛТ чувствительны люди и другие млекопитающие [163].

ИЛТ впервые описан в 1925г. Мей и Титслер под названием инфекционный бронхит [222]. С 1931г. болезнь стали именовать инфекционным ла-ринготрахеитом [74, 157]. Некоторые переболевшие птицы длительное время (свыше 2 лет) остаются вирусоносителями и при спонтанных рецидивах выделяют вирус. Источник инфекции - больная птица, реконвалесценты-вирусоносители, птицы-синантропы. Основные факторы передачи вируса от больной птицы здоровой - аэрогенный (воздушно-капельный путь) [1, 134, 313], контактный и через инфицированную скорлупу. Инкубационный период длится от 3-4 до 30 дней [119]. Продолжительность его и тяжесть течения болезни зависят от вирулентности штамма [76, 109, 168], дозы вируса, метода введения в организм [76, 109], возраста и физиологического состояния птицы [6, 76, 109]. Протекает болезнь сверхостро, остро, подостро и хронически; но чаще - атипично и характерные клинические признаки при атипичном течении слабо выражены или их нет [2, 14, 294].

По локализации поражений различают ларипготрахеальную и конъ-юпктивальную формы [202]. Ларинготрахеальная форма обычно протекает остро и сопровождается истечениями из носа, кашлем, затруднённым дыханием, хрипом, отхаркиванием кровянистой слизи (катаралыю-геморрагиче-ский или фибринозпо-казеозный экссудат), закупоривавшей просвет гортани и трахеи [1, 58, 75, 113, 117, 134, 163, 168, 172, 173, 199, 201, 202, 206, 216,i-i243, 250, 267, 276, 294, 308], редко встречается поражение воздухоносных мешков (аэросаккулит) [169]. Катаральное или фибринозное воспаление слизистых оболочек можно наблюдать в носовой полости и инфраорбитальных синусах. В ряде случаев отмечают катаральный фарингит [58, 169]. При закупорке просвета гортани и трахеи фибринозным экссудатом наступает гибель птиц в результате асфиксии.

Конъюнктивальная форма чаще наблюдается у цыплят 3-8 недельного возраста и характеризуется катаральным или фибринозным конъюнктивитом с отложением в конъюнктивальный мешок фибринозно-казеозных масс, склеиванием и отеком век, помутнением роговицы, иногда с развитием пан-офтальмита. Отмечают также смешанную (ларинготрахеально-конъюнкти-вальную) форму болезни [58, 117, 134]. Наиболее характерные признаки ИЛТ отмечаются у цыплят-бройлеров в возрасте 4-7 недель и у кур-несушек в возрасте 18-76 недель [2, 113, 138,188, 200, 267, 284].

Важное место в патогенезе ИЛТ играет поражение органов иммунной системы. При вскрытии у павших и вынужденно убитых цыплят находят атрофию и делимфатизацию тимуса, фабрициевой бурсы и селезенки, а при гистологическом исследовании - микронекрозы лимфоидной ткани в указанных органах. Некроз клеток иммунной системы (лимфоцитов и макрофагов) у цыплят способствует развитию приобретенного иммунодефицита. В результате возможной активизации условно-патогенной микрофлоры, снижается эффективность проводимых вакцинаций против некоторых инфекционных болезней [1, 2, 5, 6, 9, 87, 228]. Доказана способность вируса ИЛТ к репродукции в лимфоцитах и гистиоцитах - макрофагах соединительной ткани [93, 95, 149]. Вирус не обнаруживается в лейкоцитах и в лимфоидных органах (селезёнке, бурсе, тимусе). При экспериментальном заражении 3-дневных цыплят вирус выделяют из печени к 5 - 7 дню в 20% случаев [68].

При экспериментальном заражении в клоаку на 3-8-ой дни после заражения, но чаще через 3-5 дней развивается отёк слизистой оболочки фабрициевой бурсы и катаральное, фибринозное воспаление [52, 53, 178].

Индуцируемый вирусом ИЛТ вторичный иммунодефицит предопределяет активизацию других инфекций, в т.ч. бактериальных [1, 2, 81, 87, 110].

ИЛТ на фоне инфекционного бронхита и респираторного микоплазмо-за протекает тяжелее и сопровождается более высоким уровнем смертностисреди птиц [110, 230, 269].

Заболеваемость птицы в хозяйствах, где ИЛТ регистрируется впервые, составляет 80 - 100%, а летальность - 30 - 72% [2, 66, 188]. После острой фазы ИЛТ может наступить латентный период с сохранением генетического материала вируса в ДНК нейроцитов ганглия тройничного нерва [68, 113, 121, 122, 130, 217, 233]. При различных воздействиях может произойти реактивация инфекции с выделением вируса во внешнюю среду [67, 68, 70, 114, 119, 130, 154]. При подостром течении - высокая заболеваемость, но уровень смертности может быть ниже, чем при остром и сверхостром течении, и колебаться от 10% до 30% [113, 199, 240, 267].

Хронический или умеренный ИЛТ, наиболее распространённый среди поголовья крупных птицеводческих комплексов в странах Европы, в Австралии, США, Новой Зеландии, Великобритании, может быть отмечен среди оставшейся в живых птицы после переболевания любой из вышеупомянутых форм болезни [58, 77, 109, 111, 114, 235, 249, 253, 275, 315]. При этом заболеваемость может быть около 1-2%. Умеренный ИЛТ проявляется в разной степени как серозно-катаральный трахеит, синусит, конъюнктивит, и может длиться в течение нескольких месяцев с редкими смертными случаями [240].

Иммунный ответ. Иммуноглобулины класса А появлялись у цыплят на 6-й день после интратрахеального заражения [330].

Вируснейтрализующие антитела появляются у цыплят через 7 дней после экспериментального заражения, достигают максимума к 49 дню (индекс нейтрализации 2,30 - 3,15 lg), и обнаруживаются до 120 дней с положительным индексом нейтрализации [69, 102, 174, 330]. Преципитирующие антитела появляются на 7 день после заражения, максимальных титров достигают на 49 день (3,25 lg) и сохраняются до 120 дней [2].

4.2. Краткая характеристика семейства HcrpcsviridaeHerpesviridae является одним из самых крупных семейств вирусов животных, человека, птиц, рыб, и в настоящее время включает три подсемейства (Alpha-, Beta-, Gammaherpesvirinae), десять родов (Simplexviriis, Varicellovirus", Marek's disease-like viruses", "Infectious laryngotracheitis-like viruses"; Cytomegalovirus, Muromegalovims, Roseolovirus; Lymphocryptovirus, Rhadinovims, "Ictalurid herpes-like viruses"), и 49 неклассифицированных вирусов, предположительно отнесенных к семейству [24]. Подсемейство Alpha-herpesvirinae включает следующие рода Simplexvirus, Varicellovirus, "Marek's disease-like viruses", "Infectious laryngotracheitis-like viruses" [24]. Экспериментально показано, что некоторые представители подсемейства Alpha-herpesvirinae могут инфицировать широкий спектр видов животных, тогда как представители подсемейств Beta- и Gammaherpesvirinae проявляют очень ограниченную хозяинную специфичность. Такая же закономерность отмечена и при изучении спектра восприимчивых культур клеток. В естественных условиях передача вирусов происходит аэрозольно, например, герпесвирус человека типа 3 (HHV-3), герпесвирус человека типа 4 (HHV-4) (контактно, алиментарно), половым путем (герпесвирус человека типа 2 (HHV-2)) [24].

Вирусы продуктивно инфицируют фибробластоподобные клетки в культуре и эпителиальные клетки in vivo. Многие представители вызывают у естественных хозяев везикулярные поражения эпителия [24].

Род: "Infectious laryngotracheitis-like viruses". Типовой вид: Gallid herpesvirus 1 (GaHV-1) (герпесвирус куриных) Вид (1): Gallid herpesvirus 1 (Infectious laryngotracheitis virus) - герпесвирус куриных 1 (вирус инфекционного ларинготрахеита) (GaHV-1) [24].

Антигенные свойства. Оболочечиые гликопротеины альфагерпесвиру-сов, которые расположены и на внешней оболочке вируса и на поверхности зараженных вирусом клеток, являются важными иммуногенами способными к стимулированию гуморальных, и вероятно клеточных, иммунных реакций. [50, 108, 237]. Возможная роль других вирусных компонентов в иммунном ответе еще не была исследована. По крайней мере, шесть антигенно отличимых гликопротеинов вируса простого герпеса 1-го типа (HSV-1) gB, gC, gD, gE, gG, and gH являются главными иммуногенами [72, 89, 184, 282, 293]. Очищенные препараты белков gB, gC, gD, и gE, индуцируют синтез вирус-нейтрализующих антител. Однако ненейтрализующие антитела обладают той же способностью [219]. Мало свидетельств причастности гликопротеинов HSV-1 в защитных клеточно-опосредованных иммунных ответах, несмотря на то, что gC и gB являются антигенами для вирусспецифических цитостати-ческих Т-лимфоцитов [80, 182]. У мышей, иммунизированных синтетическим пептидом gD, отмечен Т-клеточный ответ, но при этом не образовывались вируснейтрализующие антитела [50].

Получение препаратов очищенного вируса большинства представителей семейства Herpesviridae (вирус простого герпеса [116, 197, 292], вирус ветряной оспы [198], цитомегаловирус человека [115, 192, 289], вирус инфекционного ринотрахеита [170, 229], вирус болезни Ауэски [132]) представляется несколько затруднительным. Сложность выделения вируса из клеточного материала (суспензии) системы культивирования, возможно, зависит от общей закономерности для представителей семейства механизма репродукции - прохождение почкованием через ядерную мембрану, через мембраны комплекса Гольджи и эпдоплазматической сети, а также с синтезом, образованием и формированием структур вириона - каскадный процесс синтеза структурных и неструктурных белков, формированием кора, капсида (через образование прокапсида) и тегумента. Кроме того, особенностью репродукции вируса ИЛТ является - образование вирусных частиц различного размера от 195 до 250 нм в диаметре, и соответственно, плотность таких вирионов различается [65, 112, 314].

4.3. Характеристика вируса инфекционного ларинготрахеита птицМорфология и физико-химический состав. Электронные микрофотографии инфицированных вирусом ИЛТ культур клеток демонстрируют ико-саэдральные вирусные частицы сходные по морфологии с вирусом простого герпеса. Watrach A.M. с соавтор. (1963) описали гексагональную форму нук-леокапсида вируса диаметром 80-100 нм [314]. Нуклеокапсиды имели икоса-эдральпую симметрию и состояли из 162 капсомеров [112, 314]. Капсид содержит 162 частично полых капсомера (150 гексамеров и 12 пентамеров) [112, 150]. Сердцевина зрелого вириона содержит вирусную ДНК. Полные вирусные частицы имеют диаметр 195-250 нм и состоят из нуклеокапсида, покрытого суперкапсидной оболочкой. Наружная оболочка вирионов имеет типичное строение и содержит многочисленные выступы (шипы) длиной около 8 нм. В состав наружной оболочки входят липиды и углеводы [244].

Вирион вируса ИЛТ состоит из четырех структурных элементов: сердцевины (ядра), икосаэдрического капсида, тегумента и оболочки, окружающей капсид. Суперкапсидная оболочка имеет в своем составе липиды [10]. В составе вириона определено до 32 белков с индивидуальными молекулярными массами от 13 до 290 кД. Молекулярная масса вирионов составляет 1000 мД, плавучая плотность в CsCI - 1,29 г/см3 [312].

Геном. Геном вируса ИЛТ содержит линейную двухцепочечную ДНК и имеет длину 155 тыс. п.н., состоит из длинной уникальной последовательности U1 (120 тыс. п.н.) и короткой уникальной последовательности Us (17 тыс. п.н.) [147, 150,214, 218,319].

На основе методов молекулярной диагностики установлено, что большинство идентифицированных открытых рамок считывания (ORFs) генома вируса ИЛТ имеют значительные сходства с геномами других герпесвирусов птиц и млекопитающих подсемейства alpherpesvirnses, включая вирус болезни Марека 1-го типа (MDV-1) [301], герпесвирус человека 3-го типа (вирус ветряной оспы) (VZV) [118], герпесвирус лошадей 1-го типа (вирус инфекционного аборта лошадей) (EHV-1) [300], и герпесвирус человека 1-го типа (вирус простого герпеса 1) (HSV-1) [299].

Полипептидный состав вируса ИЛТ. Гликопротеипы вируса ИЛТ различной молекулярной массы (205, 160, 135, 125, 115, 100, 90, 85, 74, 67, 60, 56, 54, 52, 50, 46, 41, 40, 38, 36, 34, 31, 29, 26 кДа) определены в иммуноэлек-трофорезе препаратов лизата инфицированной культуры клеток печени КЭ [63, 328, 329]. Полипептиды вируса ИЛТ (205, 160, 115, 90, 85, 69, 60, 55, 46, 35-40, 30, 18, 13 кДа) были выделены из экстрактов вирусинфицированныхклеток и очищены с помощью лектин-аффинной хроматографии и выявлены в ВИЭФ и вестерн-блоте. Гликопротеины вируса ИЛТ с молекулярными массами 205, 160, 115, 90, 67, 60, 52, 34, 26 кД стимулируют формирование гуморального и клеточно-опосредованного иммунного ответа, предохраняющего 83 % птиц от заражения их патогенным вирусом. Эти гликопротеины вируса ИЛТ являются главными иммуногенами [63, 329, 330, 331]. Участки генома вируса ИЛТ UL0 и UL[-1] кодируют два белка 64 кД и 73 кД [332]. В непрямом варианте МФА, техника которого ранее отработана Fuchs W. и Mettenleiter Th. С. (1999) [145], а также в радиоиммунологическом анализе и в вестерн-блоте с моноспецифической сывороткой кролика определили белковый продукт (38 и 30 кДа), кодируемый участком гена ORF-C [311].Veits J. с соавтор. (2003) установили в непрямой реакции иммуноф-люоресцеиции, что полипептид с молекулярной массой 60 кДа вируса ИЛТ является оболочечным и локализуется в цитоплазме клетки. Полипептид с молекулярной массой 39-40 кДа, по данным тех же авторов, является структурным белком тегумента вируса и локализуется в цитоплазме клетки, белки с молекулярными массами 30, 34, 35 кДа также являются обязательными структурными протеинами вируса и локализуются во время процесса синтеза, формирования и сборки вирусной частицы в ядре и цитоплазме [193].

Гликопротеины 85-, 115-, 160-, и 200-кДа являются продуктами ORF-5. [193]. ORF-5 генома вируса ИЛТ гомологична участку генома вируса простого герпеса (HSV-1), кодирующего белок gJ [264], и располагается между двумя участками генома, кодирующих гликопротеины G и D [319].

МКА, реагирующие в вестерн-блоте с гликопротеином 60 кДа были специфичны продукту гена gC вируса ИЛТ (46,4 кДа) [209]. Выяснено, что этот белок (60 кДа) гликозилирован на N-конце [193].

Моноспецифические антитела к различным гликопротеипам вируса ИЛТ, выделенные из поликлональных сывороток, были также специфичны различным гликопротеинам вируса простого герпеса (HSV-1), например, антитела к гликоиротеину gB (молекулярная масса 110 кДа) вируса ИЛТ [246], к гликопротеину gС (gp60) (молекулярная масса 60 кДа) [209, 304], к глико-протеину gG (молекулярная масса 32 кДа) [181], и к гликопротеину gM (молекулярная масса 73 кДа) [145]. Гликопротеин gp60 является, возможно, продуктом ORF-5 (открытая рамка считывания нуклеотидной последовательности генома) короткой уникальной последовательности (Us) [304, 319].

Гликопротеин В (gB) является первым структурным белком вируса ИЛТ птиц [205, 246], ген которого был клонирован, картирован и секвениро-ван [182, 236], и 4 участка которого позиционно консервативно связаны с протеином gB HSV-1 [183]. Гликопротеиновый комплекс gB в большой степени идентичен таковому у других герпесвирусов [209].Poulsen D.J. и Keeler C.L. Jr. (1997) описали этапы синтеза и процесса нарезания гликопротеина В (gB). В иммуноэлектрофорезе лизата культуры клеток печени КЭ, инфицированной вирусом ИЛТ, с поликлональными иммуноглобулинами сыворотки кролика, полученной к синтетическому пептиду Cro-gB-beta-galactosidase, определено, что первоначально синтезируется как белок-предшественник молекулярной массой 110 кДа. Он представляет собой димер молекулярной массой 100 кДа. В последующем, этот димер быстро нарезается в комплексе Гольджи на два протеина, по 58 кДа каждый, связанных друг с другом дисульфидной связью. Очевидное сокращение массы (со 110 до 100 кДа) зрелой формы gB в течение обработки в комплексе Гольджи, предположительно, является общей закономерной особенностью этого гликопротеина у герпесвирусов птиц [247].

Другой гликопротеин-предшественник gC (молекулярная масса 60 кДа) гомологичен таковым вируса простого герпеса (HSV-1), вируса псевдобешенства (PRV), и бычьего герпесвируса (BHV-1), и является белком слияния, взаимодействуя с клеточными детерминантами [78, 190, 324].Kongsuvvan К. с соавт. (1993) рядом с геном, кодирующим гликопротеин 60 (gp60), картировали и секвенировали нуклеотидную последовательность гена, кодирующего полипептид с молекулярной массой 32 кДа (гликопротеин gG). Данный белок содержит 4 потенциальных сайта гликозилиро-вапия и сигнальную последовательность на N-копцевой области. Установлено, что аминокислотная последовательность N-копцевой области белка имеет сходство с аналогичным участком гликопротеинов X (gX) вируса болезни Ауески, вируса ринопневмонии лошадей 4-го типа, и гликопротеином G (gG) вируса простого герпеса. Антитела, полученные на этот рекомбинантный белок, экспрессированного в составе клеток E.coli, выявляли данный антиген в культуральной жидкости инфицированных вирусом ИЛТ клеток [181].

Гликопротеин вируса ИЛТ (205 кДа) имеет в своём составе высокий процент углеводного остатка (глюкозамин и манноза) и представляет собой крупный гликопротеин-предшественник вируса [63, 330], антигенные детерминанты которого те же, что и у гликопротеинов, образованных после его нарезки [52]. Подобный процесс нарезания крупного гликопротеипа-предшественника был описано и у других герпесвирусов: например, у вируса болезни Ауески [96], у вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота [191, 306].

Антигенная вариабельность и родство. Известные отечественные штаммы вируса ИЛТ в антигенном отношении родственны эталонному штамму ЦНИИПП [27, 43]. Штаммы вируса ИЛТ антигенно идентичны и гомологичны на основе реакции нейтрализации, реакции иммунофлюоресцен-ции [27, 43, 73, 109, 214, 268, 281]. Незначительное антигенное отличие среди штаммов было определено по неполной нейтрализации гетерологическими антисыворотками, но иммунологических различий среди штаммов вируса ларинготрахеита не обнаружено [5, 14, 27, 36, 44, 87, 107, 154, 249, 268, 281]. Штаммы вируса ИЛТ различаются по вирулентности для птиц и КЭ [14, 44, 66, 162, 196, 215, 249, 268], устойчивости при хранении [27, 36, 44, 47], по молекулярно-структурным особенностям [60, 100, 127, 128, 150, 214, 254, 205, 258, 259]. Эти данные были подтверждены позднее в рестрикционном эндонуклеазном анализе [103, 214, 283].

При экспериментальном заражении цыплят, кур и куриных эмбрионов штаммами "К", "Л" и "Г" вируса развивалось заболевание, характеризующееся ларинготрахеитами и конъюнктивитами - у птицы и проявлением специфических поражений хорио-аллантоисной оболочки (ХАО) КЭ. Исследованиями антигенных свойств штаммов "К", "Л", "Т", "Б", "Н" и "Г" в перекрестных реакциях нейтрализации, преципитации и гемагглютинации определены общие свойства одного серологического типа. Однако степень нейтрализации их гомологичными и гетерологичными сыворотками была неодинаковой. Все штаммы вируса ИЛТ были идентичны штаммам "116м и "ЦНИИПП" вируса ИЛТ [5,14, 154].

4.4. Диагностика ИЛТДиагностика ИЛТ осуществляется с учетом эпизоотологических данных, клинических симптомов, патоморфологических изменений, а также комплекса лабораторных исследований [6].

Схема диагностики ИЛТ в настоящее время включает комплекс мегодов, направленных на выделение вируса на развивающихся куриных эмбрионах [2, 3, 11, 15, 23, 27, 44, 47, 83, 84, 85, 91, 98, 179, 196, 268], в первичных культурах клеток: куриных фибробластов [2, 3, 11, 23, 44, 47, 83, 84, 85, 91, 98, 179, 196], почек и печени эмбрионов и цыплят [15, 23, 98, 142, 266], или перевиваемых культурах клеток [51, 136, 271]. Кроме того, в лабораторную диагностику ИЛТ входит идентификация вируса в РДП, в непрямом методе флюоресцирующих антител (нМФА), в ИФА с использованием поликлональных и моноклональных антител, ПЦР и другие молекулярные методы.

4.4.1. Выделение вирусаДля вирусологического исследования от больных, павших или вынужденно убитых цыплят в начальной фазе (первые 2-10 сутки) болезни, берут поражённые органы (пробы трахеи, гортани, легких, конъюнктивы) и экссудат в виде смывов с тех же органов [68, 161, 327]. Из патологического материала готовят 10% суспензию, осветляют и надосадок используют для заражения 9 - 12 дневных куриных эмбрионов, культуры клеток, неиммунных к вирусу ИЛТ цыплят [2, 3, 11, 15, 44, 51, 52, 83, 84, 85, 92, 98, 144, 145, 179, 194, 196, 224, 226, 272, 291, 279, 302, 313].

4.4.2. Гистологический методГистологический является стандартным методом экспресс-диагностики ИЛТ [58, 169, 200,251,278].

Вирус ИЛТ размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки гортани, трахеи, клоаки [178], вызывая острое воспаление этих оболочек с образованием внутриядерных включений [68, 178, 179, 307]. Для этого на предметных стеклах готовят мазки из соскобов эпителия слизистой оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы [2, 231]. При исследовании методом негативного контрастирования вирусные частицы с характерной структурой обнаруживаются в ядрах эпителиоцитов гортани и трахеи цыплят, больных ИЛТ, реже - лимфоцитов и гистиоцитов [6, 149, 321].

Гистопатологические изменения у КЭ, заражённых в аллантоисную полость вирулентным штаммом, характеризовались образованием синцития с внутриядерными тельцами-включениями, наблюдаемыми, главным образом, в ХАО, клетках печени КЭ, эпителии ротовой полости, пищевода и редко эпителиоцитах мочевыводящих канальцев, бронхов, трахеи, перьевых фолликулов [189].

Электронная микроскопия позволяет иногда в течение 3-4 ч диагностировать ИЛТ даже при атипичном проявлении; вероятность обнаружения телец-включений в патологическом материале существует только в начальной фазе болезни - между 2-7 днями. Внутриядерные включения обнаруживаются через 12ч, и к 30 - 36 ч после заражения достигают наивысшей концентрации [52, 66, 101, 105, 133, 161, 167, 169, 250, 261, 267, 310]. Указанный метод позволяет диагностировать ИЛТ иногда в течение 3-4 ч даже при атипичном проявлении [58, 179]. Чувствительность метода, по разным данным, варьирует от 7 до 100% [52, 58, 64, 66, 68, 101, 109, 161, 245, 258, 280, 307]. Вероятность обнаружения телец-включений в патологическом материале существует только в начальной фазе болезни - между 2-7 днями [6, 58, 66, 161, 189].

При умеренном течении болезни внутриядерные специфические тельца-включения гистологическим методом выявляются не всегда [58, 161, 267].

4.4.3. Реакция нейтрализации (РН)Реакцию нейтрализации используют редко - для идентификации вируса ИЛТ [14, 23, 47, 97, 107, 154, 202, 257, 267, 302, 321], и чаще - для обнаружения специфических вируснейтрализующих антител [11, 36, 47, 102].

В РН используют 3 - 8-дневных цыплят [1 1, 23, 47, 257], 10-12 дневных КЭ [14, 23, 38, 47, 91, 176], культуру клеток куриных фибробластов, почек КЭ и культуру клеток печеии КЭ [15, 23, 38, 97, 257, 263, 295, 296].

При определении титра антигена в вируссодержащем материале (вирус, выделенный на ХАО КЭ) в реакции применяют нормальную и специфическую гипериммунную сыворотки. Гипериммунные сыворотки к вирусу ИЛТ получают путем заражения птицы, кроликов или морских свинок вируссо-держащей жидкостью в виде 10-20% гомогената ХАО КЭ (титр должен быть не менее 10^ ЭИДбо/мл), зараженных вирусом ИЛТ [6, 11, 23, 38].

Отработана методика постановки РН в перевиваемой культуре клеток гепатомы печеии цыплят LMH [51, 136, 144, 271].Jones R.C., Williams R.A., Savage С.Е. (1993) диагностировали ИЛТ в 7 из 19 проб поражённых суставов от хромых бройлеров методами: РН, флуоресцирующих антител (МФА) и ПЦР [195].

Реакция нейтрализации, с использованием в качестве тест-объекта: КЭ [6, 23, 38, 47, 52, 73, 91, 102, 268, 295] и культуры клеток [6, 23, 47, 98, 263, 266] для ретроспективной диагностики ИЛТ, применяется с целью определения титра антител в сыворотках. С этой целью исследуют парные сыворотки переболевшей птицы, отобранные в интервале через 14-28 дней.

Реакция нейтрализации при определении титра антител наиболее чувствительна по сравнению с РДП. Она выявляет специфические антитела у 9698% инфицированных птиц независимо от формы течения заболевания. На КЭ и КК реакцию ставят но общепринятой методике. Однако эта реакция трудоёмка, и требует значительного количества КЭ [16].

4.4.4. Реакция иммунодиффузии (РИД, РДП)Реакцию диффузионной преципитации (РДП) в агаре впервые применяли для диагностики ИЛТ птиц Woernle Н. и Brunner А. (1961) [323]. Для дифференциальной диагностики ИЛТ от оспы кур РДП применили Jordan F.T.W. и Cluibb R.C. (1962) [203].

РДП и по сей день применяется с целью индикации и идентификации антигенов вируса ИЛТ, а так же для определения специфических антител в сыворотках вакцинированных и больных птиц [6, 9, 14, 23, 38, 52, 53, 73, 102]. При определении титра антигена в вируссодержащем материале (гомо-генат ХАО заражённых КЭ, суспензии воспалительного экссудата, соскобысо слизистой оболочки трахеи и гортани или гомогената трахеи и гортани от больной (павшей) птицы) в РДП применяют специфические антитела из гипериммунных сывороток петуха, кролика и морской свинки [6, 23, 38]. В качестве контрольных - сыворотки к вирусам других болезней птиц (инфекционная бурсальная болезнь, болезнь Ньюкасла, грипп птиц) и нормальные сыворотки.

Перзашкевич B.C. с соавт. (1995) отработали условия получения специфического антигена, пригодного для РДП и ИФА. Активность специфического антигена ИЛТ, полученного различными способами, в среднем составила в РДП 1:4 -1:32, а в твердофазном ИФА - 1:265 - 1:4000 [32, 45].

Реакция проста по технике выполнения, экономически более выгодна, чем РН, высокоспецифична, и позволяет в сравнительно короткие сроки выявить примерно 75% положительных случаев, установленных при помощи заражения эмбрионов. РДП специфична, но недостаточно чувствительна, её используют при ретроспективной диагностики взрослых птиц [5,6].

По некоторым сообщениям, РДП ограничена в использовании при массовых исследованиях патологического материала при индикации и идентификации вируса ИЛТ, и при выявлении антител в сыворотках птиц [90, 143].

4.4.5. Метод флуоресцирующих антител (МФА)Метод флуоресцирующих антител (МФА, реакция иммунофлюоресценции (РИФ)) является высокочувствительным методом диагностики. С помощью МФА вирус ИЛТ можно обнаружить в мазках-отпечатках из слизистой оболочки трахеи, гортани и конъюнктивы экспериментально зараженной и естественно больной птицы, из пораженной ХАО КЭ, культуры клеток фибробластов КЭ. Реакцию ставят по общепринятой методике. Чаще используют прямой метод. Положительную иммупофлюоресценцию в мазках от больной птицы наблюдают в период острого течения болезни, когда обнаруживаются внутриядерные включения и можно выделить вирус на КЭ.

Первые сообщения отечественных учёных, Чистовой З.Я. с соавтор., о применении РИФ для выявления вируса ИЛТ в зараженной ХАО КЭ и в культуре клеток куриных фибробластов были в 1964 [47]. Они же разработали схему гипериммунизации кроликов вирусом ИЛТ с целью получения высокоактивной антисыворотки.

Метод флуоресцирующих антител (прямой и непрямой варианты) довольно успешно применяется для выявления антигенов вируса ИЛТ в пробах патматериала (гортань и трахея) от больных или павших в течение первых 9 суток после начала заболевания птиц. При выделении вируса на КЭ применяется метод флуоресцирующих антител для идентификации вируса ИЛТ в мазка-отпечатках трахеи больной птицы [20, 38, 52, 54, 73, 86, 101, 139, 161, 175, 180, 295, 296, 321], или в заражённой культуре клеток [38, 47, 52, 54, 73, 97, 102, 175]. Чувствительность метода высокая - 93 - 100% [52, 101], а специфичность - 93 - 96% [52, 101].

Специфические сыворотки для РИФ получают гипериммупизацией кроликов и кур вирусом ИЛТ [6, 20, 47].

Результат иммунофлюоресценции оценивают в зависимости от интенсивности свечения и количества флуоресцирующих клеток [6, 20, 38]. Комплекс антиген-антитело хорошо виден на общем темном поле в виде яркихлюминесцирующих конгломератов в мазках ХАО зараженного КЭ.

Положительная иммунофлуоресценция в мазках от больной птицы наблюдается в остром периоде заболевания, когда обнаруживаются внутриядерные включения и можно выделить вирус па куриных эмбрионах.

В непрямом варианте МФА на основе МКА к гликопротеинам определили полные вирусные частицы ИЛТ в цитоплазматических везикулах и вакуолях мигрирующих из комплекса Гольджи [65, 132].Jones R.C. с соавтор. (1993) в 7 из 19 проб поражённых суставов от хромых бройлеров методами: РН, МФА и ПЦР установили ИЛТ [195].

Непрямой МФА применяется и для ретроспективной диагностики с целью выявления антител в сыворотках больных птиц [20, 38, 52, 102].

4.4.6. Встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ)ВИЭФ широко распространён, так как имеет ряд преимуществ. Этотметод специфичен, высокочувствителен, прост и удобен для массовых исследований [318].

ВИЭФ используют для идентификации вируса ИЛТ и для определения специфических антител. Старовойтов Н.С. (1971) и Герасимова Н. И. (1982) разработали оптимальные условия постановки, изучила влияние концентрации и чистоты компонентов на чувствительность метода [7, 38].

В ВИЭФ и вестерн-блоте на основе поликлональных антител кролика и МКА в треках геля после электрофореза препаратов лизата инфицированной клеток культуры печени КЭ определены молекулярные массы гликопротеинов вируса ИЛТ: 205, 185, 160, 135, 125, 115, 100,90,85,74,67,60, 56, 54, 52, 50, 46, 41, 40, 38, 36, 34, 31, 29, 26 кДа [63, 97, 328, 329].

4.4.7. Полнмеразная цепная реакция (ПЦР) и другие методы молекулярной диагностики, применяемые при идентификации вируса ИЛТДля идентификации вируса ИЛТ в настоящее время ПЦР является одним из наиболее чувствительных методов [53, 56, 57, 100, 122, 123, 124, 126, 218, 254, 273, 278, 302, 321]. Keam L. с соавтор. [124] и Key D. W. с соавтор. [126] описали методы детекции ДНК вируса ИЛТ на основе dot-blot гибридизации и клонирования фраментов ДНК вируса, меченых дигоксигенином. Эти методы выявления вируса ИЛТ являются высокочувствительными и специфичными в острой фазе и в латентной фазе заболевания цыплят [128, 129].Abbas F. J. с соавтор, описали метод dot-blot гибридизации на основе ПЦР с биотинилированной ДНК [53]. In situ гибридизация для выявления ДНК вируса ИЛТ в пораженных тканях разработана Nielsen О. L. с соавтор. [235]. Рестрикционный эндонуклеазный анализ и секвенирование фрагментов вирусной ДНК позволяет проводить идентификацию и дифференциацию полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса ИЛТ [53, 56, 57, 60, 122, 125, 126,127, 128, 147, 150, 159, 217, 235, 254, 258, 259, 260, 302, 321].

ПЦР используют для обнаружения вируса в тканях гистопрепаратов фиксированных в формалине и в парафине [125], для дифференциальной диагностики полевых изолятов от вакцинных штаммов [56, 60, 100, 104, 127,128, 147, 148, 254, 258, 259]. На основе ПЦР дифференцируют штаммы вируса ИЛТ [60, 123, 128, 150, 166]. Jones R.C., Williams R.A., Savage С.Е. (1993) в 7 из 19 проб поражённых суставов от бройлеров ПЦР установили ИЛТ [195]. По сообщениям Abbas F. и Andreasen J.R. Jr. (1996) диагностика ИЛТ на основе ПЦР и dot-blot гибридизации мало применима, так как оба этих метода имеют низкую чувствительность 27% и 0%, соответственно, а специфичность - 100% и 100%), соответственно [52].

4.4.8. Иммупофермептпый анализ (ИФА)В ветеринарной практике для диагностики ИЛТ в различных серологических тестах, в том числе твёрдофазном ИФА и иммуногистохимическом методе, используют как поликлональные антисыворотки, так и моноклональные антитела. Диагностику ИЛТ для выявления антигенов вируса тоже проводят ТФ ИФА в пробах от больных птиц, а иммуногистохимическим методом проводят в гистосрезах и в мазках-отпечатках поражённых органов птицы [52, 63, 97, 161, 226, 329]. Для выявления специфических антител к вирусу ИЛТ в сыворотках больных и/или вакцинированных птиц применяют твердофазный ИФА [18, 19, 46, 48, 63, 71, 102, 135, 146, 160, 185, 216, 227, 270, 287, 288, 297, 326, 327, 328, 331].

Твердофазный иммупофермептпый анализ для выявления антигенов вируса ИЛТ. В мировой практике в течение последних 15-20 лет широко используется ТФ ИФА в качестве эффективного экспресс-метода для индикации и идентификации антигенов вируса ИЛТ [52, 226, 227, 270, 327].

ИФА как метод идентификации антигенов вируса ИЛТ в пробах смывов экссудата из просвета трахеи и гортани больных цыплят, оказался болеечувствительным, чем метод выделения вируса с использованием КЭ и культур клеток, чем РН и РДП, а по чувствительности и специфичности приближается к МФА [52, 54, 97, 201, 216, 226, 227, 327].York J.J. и Fahey K.J. (1988) впервые разработали непрямой "сэндвич"-вариапт ТФ ИФА с использованием поликлональных антител и моноклональных антител (МКА) для выявления антигенов вируса ИЛТ в препаратах трахеи больных цыплят [327].

В настоящее время в зарубежной литературе имеются данные о получении МКА к главным антигенам (с молекулярными массами 205, 160, 115, 90, 67, 60, 52, 34, 26 кД) вируса инфекционного ларинготрахеита птиц, об их характеристике при изучении структурных, антигенных и иммуногенпых свойств вируса ИЛТ [52, 54, 63, 97,161, 304, 329].

Иммуногистохимический метод (гшмуногистохимия, иммуноперокси-дазпый метод) для выявления антигенов вируса ИЛТ. Из всех методов диагностики ИЛТ, наряду с ТФ ИФА - сравнительно простым, быстрым, чувствительным и высокоспецифичным методом широкое применение нашёл иммуногистохимический метод (ИГХ, ИПМ).

Антигены вируса ИЛТ иммупогистохимически выявляют в мазках-отпечатках и соскобах слизистой оболочки гортани и трахеи больных птиц, в заражённой культуре клеток, т situ в гистосрезах поражённых органов (гортани и трахеи) больных птиц [63, 66, 97, 161]. В качестве реагента, специфического к вирусу ИЛТ или к отдельным его антигенным детерминантам, используют поликлональные антитела и МКА [54, 63, 66, 97, 161, 164].

Уже более 15 лет МКА к гликопротеинам вируса ИЛТ в ТФ ИФА применяют при изучении антигенных и иммуногенных свойств, при диагностике в птицеводстве. А иммуногистохимия в таких масштабах не используется [52, 97, 161]. Abbas F., Andreasen J.R. Jr. (1996) выявили антигены вируса ИЛТ в смывах из трахеи экспериментально инфицированных цыплят, используя нМФА, ИГХ, гистологический метод, ПЦР, ДНК-гибридизацию. Каждый из этих методов авторы сравнивали с методом выделения вируса. Чувствительность ИГХ, пМФА, гистологического метода выявления специфических телец-включений, ПЦР и гибридизация составила 100%, 93%, 7%, 27% и 0%, соответственно, а специфичность - 93%, 93%, 100%, 100% и 100%. Гистологический метод, ПЦР и гибридизация более специфичны, но менее чувствительны, чем такие методы как ИПМ и реакция непрямой иммунофлюоресценции. ИПМ и нРИФ были в равной степени одинаково специфичны, но иммуногистохимия - более чувствительна [52].

Твердофазный иммупофермептпый анализ для выявления специфических антител к антигенам вируса ИЛТ в сыворотках крови больных и вакцинированных птиц. ТФ ИФА применяется для выявления антител в сыворотках крови больных и (или) вакцинированных животных и птиц, в том числе и для выявления антител к вирусу ИЛТ в сыворотках кур и цыплят [19, 46, 48, 63, 102, 71, 135, 146, 160, 185, 216, 220, 227, 270, 287, 288, 297, 326, 327, 328, 331]. По данным Bauer В. с соавтор. (1999) ТФ ИФА при обнаружении антител в сыворотках крови больных и вакцинированных против ИЛТ цыплят был специфичным, и в 8 раз более чувствительным по сравнению с реакцией нейтрализаци (РН) [73]. А по данным York J.J. с соавтор. (1983) чувствительность ТФ ИФА при ретроспективной диагностике при определении уровня антител в сыворотках крови больных и вакцинированных против ИЛТ цыплят превышала в 16-32 раза РН [326].

Рядом отечественных исследователей предложен непрямой вариант ТФ ИФА для выявления специфических антител в сыворотках крови птиц [18, 19, 46,48].

Цыбанова Т.С., Власов Н.А. (1995) тоже применили непрямой вариант твердофазного ИФА для определения специфических к ИЛТ антител в сыворотке крови вакцинированных птиц. В качестве специфического и нормального антигенов использовали лизат ХАО инфицированных и нормальных КЭ, очищенных гель-фильтрацией. Сыворотки, специфичные к вирусу ИЛТ, получали гипериммунизацией птиц, морских свинок и кроликов вирусом, очищенном в перколле. В качестве антивидового пероксидазного коныогата использовали меченные пероксидазой кроличьи иммуноглобулины. Показано, что с помощью ИФА можно выявлять специфические антитела в титрах 1:100-1:2000 в сыворотках крови вакцинированных птиц. При этом в РН и РИД титры антител составляли, соответственно, 1:8-1:32 и 1:2-1:16 [46].

Шадрова Н.Б. и др. (2000) разработали диагностический набор на основе непрямого варианта ИФА с сорбированным на твёрдой фазе планшета антигеном вируса ИЛТ, который был строго специфичен в отношении гомологичной поликлональной сыворотки и неспецифичен к поликлональным сывороткам, полученным на гетерологичные антигены. Набор рассчитан на большое количество проб, при использовании сывороток крови кур в одном разведении при инструментальном учете оптической плотности. В качестве положительного контроля в набор прилагается гипериммунная сыворотка крови кур (титр не ниже 1:1600). При определении титра каждой в отдельности исследуемой сыворотки используются математические программы [48].

При диагностике ИЛТ следует дифференцировать от гриппа, инфекционного бронхита, болезни Ньюкасла, инфекционной бурсальной болезни, чумы уток, болезни Марека, респираторного микоплазмоза, оспы, аденовирусной инфекции.

4.4.9. Получение и изучение свойств гибридом и сайтснецифических иммуноглобулиновПонятие моноклоналыюсти существовало в иммунологии давно. Клоналыю-селекционной теория об особенностях дифференциации и организации иммунной системы в эмбриональном и постнаталыюм периодах была сформулирована еще Ф.Бернетом в 1959г. Эта теория является дальнейшим развитием идеи Йерне о естественной селекции (1955). Основным положением идеи Ф.Бернета было то, что одна клетка иммунной системы продуцирует антитела только против одного антигена, т.е. иммунная система клонирована по антигену. Блестящим экспериментальным подтверждением клонально-селекционной теории иммунитета и явился метод получения моноклональных антител. Моноклональность гибридомиых антител (т.е. физическая мо-ноклональность) в подавляющем большинстве случаев совпадает с монокло-нальностью в понимании Бернета (антитела, продуцируемые одним клоном гибридных клеток, все одинаковы).

Первые сообщения о гибридных клетках, продуцирующих антитела к известным антигенам, были сделаны в 1970 году Синковицем [285, 286].

В своих исследованиях автор наблюдал спонтанное образование гибридных клеток между лимфоцитами и плазматическими клетками лейкозных мышей. Эти гибридные клетки неограниченно делились и продуцировали антитела к антигенам вируса лейкоза мышей. В 1971 году Б.Мохид опубликовал в журналах «P.N.A.S.» и «Science» работы по продукции иммуноглобулинов в клетках-гибридах между клетками миеломы и лимфомы мышей [231]. Но никто из них не пришел к выводу о возможности целенаправленного получения линий гибридных клеток, продуцирующих антитела предопределённой специфичности.

Основные принципы получения гомогенных антител предопределенной специфичности были разработаны Кёлером и Мильштейном, первая публикация о которых вышла в 1975 году [210, 211]. Используя методы соматической гибридизации клеток, они получили гибриды иммунных к эритроцитам барана лимфоцитов с сингенными клетками миеломы. Полученные гибридные клетки, названные гибридомами, унаследовали от миеломных клеток способность к неограниченному росту, а от иммунных лимфоцитов - способность к секреции антител.

Такие антитела авторами были названы моноклональными, так как синтезировались клонами гибридом, полученными от одной родительской клетки. В соответствии с клонально-селекционной теорией Бернета специфичность каждого моноклонального антитела соответствует структуре одной определенной антигенной детерминанты. Серологические свойства моноклональных иммуноглобулинов идентичны для всех молекул данного клона.

Разработка G. Kohler и С. Milstein метода целенаправленного получения линий гибридных клеток, продуцирующих антитела предопределённой специфичности (моноклональные антитела (МКА) или сайтспецифические иммуноглобулины) стала прогрессивным этапом в развитии теории и практики иммунологических исследований. МКА применяются во многих областях биологии, в том числе и в изучении антигенной структуры, картированииантигенных детерминант и других физико-химических свойств возбудителей инфекционной патологии человека, животных и растений [8, 22, 61, 88, 94, 120, 141, 151, 152, 153,208,211,212, 236, 256].

4.4.10. Применение моноклональных антител в диагностике вирусных болезнейРазвитие гибридомной технологии и использование её разработок в изучении свойств, дифференциации и диагностике антигенно-родственных возбудителей болезней послужило мощным толчком в создании тест-систем нового поколения на основе МКА. Поликлональные антисыворотки нестандартны по уровню активности и очень часто имеют высокую перекрестную реактивность, что делает затруднительным и даже невозможным их использование в высокочувствительных тест-системах.

В научной литературе существует много сообщений об использовании МКА в качестве диагностических реагентов при вирусных инфекциях, среди которых герпесвирусные инфекции, гепатиты А и В, бешенство, оспа, клещевой энцефалит, корь, чума крупного рогатого скота, лейкоз птиц, лейкоз крупного рогатого скота, грипп птиц, лихорадка долины Рифт, геморрагическая болезнь кроликов, вирусная диарея, коронавирусные и ротавирусные инфекции крупного рогатого скота, а также бактериальных и паразитарных инфекциях [4, 31, 34, 120, 203, 213, 230, 239, 255, 265, 274, 309, 325].

На основе моноклональных антител разработаны высокочувствительные варианты ИФА для идентификации вируса лейкоза крупного рогатого скота [305], дифференциации различных штаммов вируса бешенства [30, 35, 290], обнаружения общих и специфических детерминант на частицах 146S и 12S вируса ящура [223].

Моноклональные антитела применяют при диагностике инфекционных болезней в качестве антиглобулиновых реагентов, копъюгированных с флюорохромом, ферментом или изотопом для выявления специфических антител в сыворотках крови больных и (или) вакцинированных животных. На основе моноклональных антител использован ИФА для выявления IgM к респираторному синцитиальному вирусу крупного рогатого скота. Этот метод позволяет выявлять инфицированных животных на ранних стадиях, определять кинетику антителообразования в поствакцинальный и постинфекционный периоды [317].

Некогда актуальная для практической ветеринарии проблема дифференциации антигенно-родственных между собой вирусов катаральной лихорадки овец [38, 39], эпизоотической геморрагической болезни оленей [25] и болезни Ибараки [187] была решена с применением МКА. Необходимо было тщательно идентифицировать выделенный вирус для постановки точного диагноза, так как даже антитела, вырабатываемые животными в ответ на инфицирование одним вирусом, могут перекрестно реагировать с другим вирусом. Ранее широко применяемые для этих целей серологические методы на основе поликлональных антител не позволяли четко дифференцировать эти вирусы.

4.5. Заключение по обзору литературыОсновные направления научных исследований при разработке новых средств и методов диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц в течение 2-ой половины 20-го века и начала 21-го преследуют своей целью выявлять возбудителя болезни, изучать патогенные свойства различных штаммов и изолятов его, устанавливать их эволюционную взаимосвязь. Новые современные методы диагностики ИЛТ основаны на изучении антигенных и им-муногенных свойств структурных компонентов вириона, анализа генома. В основе их лежат новейшие разработки в области биотехнологии - гибридом-ные биотехнологии, методы рестрикционного анализа ДНК, молекулярной гибридизации и амплификации ДНК.

5. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ5.1. Материалы и методы 5.1.1. Материалы 5.1.1.1. ЖивотныеВ работе использовали: куринь^эмбрион 9-11-дневного возбезлейкозныукурины^эмбриои($) 9-11-дневного возраста; мышей линии BALB/c 5-б-недельного возраста, массой 10-15 г; мышей линии BALB/c, взрослых рожавших самок массой 20-30 г; мышей белых нелинейных (БЛНМ), массой 20-30 г; петухов 150 - 180 дневного возраста; цыплят 45 - 60 дневного и 75 - 90 дневного возраста; кур-молодок 120 - 150 дневного возраста; морских свинок, массой 300 - 400 г; кроликов, массой 3,5 - 4 кг.

Мышей линии BALB/c 5-6-недельного возраста использовали для иммунизации и при получении моноклональных антител в виде асцитических жидкостей. Взрослых мышей линии BALB/c, мышей гибридов первого поколения (BALB/c х БЛНМ) использовали в качестве реципиентов гибридом для получения асцитных препаратов МКА. Белые лабораторные нелинейные мыши служили донорами спленоцитарных макрофагов. Кормление осуществляли в соответствии с рекомендуемыми рационами. В исследованиях использовали только клинически здоровых животных.

Мышей получали из питомников "Светлые горы", "Столбовая" и НИИ Канцерогенеза РАМН, г. Москва. Животных выдерживали до начала экспериментов под наблюдением в течение 7-14 дней. Кормление осуществляли в соответствии с рационами, рекомендованными для этих животных. В исследованиях использовали только клинически здоровых животных.

5.1.1.2. ВирусыВсе штаммы вирусов, использованные в работе, получены из лаб. Музейных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ:вирулентный штамм вируса ИЛТ "Богатищевский" с инфекционнойтивностью 5,25 lg ЭИДзо/см3;вакцинный штамм "ВНИИБП" вируса ИЛТ с инфекционной активностью 5,0 lg ЭИДзо/см3;вакцинный штамм "ЦНИИПП" (клон "НТ") вируса ИЛТ с инфекционтивностью 4,0 lg ИДзо/см3;вирулентный штамм вируса ИЛТ "Богатищевский" с инфекционной акной активностью 6,0 lg ЭИД50/СМ3;вирус болезни Марека, вакцинный штамм "FC-126", в виде 10%-ной экстраэмбриональной жидкости зараженных КЭ;вирус чумы уток, вакцинный штамм ""АКВ-ВНИИВВиМ", с инфекционной активностью 6,5 lg ТЦДзо/см3, в виде 10%-ной экстраэмбриональной жидкости зараженных КЭ;вирус инфекционной бурсалыюй болезни (ИББ), вакцинный штамм "БГ", с инфекционной активностью 6,5 lg ЭИД50/см3, в виде 10%-ной суспензии гомогената КЭ;вирус гриппа птиц, штамм А/цыплёнок/Росток/29 (H7N7), штамм А/крачка/Южная Африка/82 (H5N2), штамм А/курица/Росток/34 (H7N1), в виде 10%-ной экстраэмбриональной жидкости зараженных КЭ;вирус болезни Ньюкасла птиц, штамм "La Sota" с биологической активностью 9,25 lg ЭИД50/СМ3, в виде 10%-ной вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости КЭ, любезно предоставлена сотрудниками лаб. "Индикации микроорганизмов" ГНУ ВНИИВВиМ.

5.1.1.3. Специфические сывороткиВ качестве специфических и гетерологических сывороток использовали:антисыворотки к вирусам гриппа птиц, болезни Ньюкасла, инфекционной бурсальной болезни, чумы уток;гипериммунные антисыворотки из крови петуха, кролика и морской свинки, специфичные вирусу ИЛТ;сыворотки крови петуха, кролика, морской свинки от интактных, здоровых животных;сыворотку крови морской свинки, специфичную к вирусу ИЛТ, любезно предоставленную сотрудником лаборатории Индикации микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Изотовой Н.А.

5.1.1.4. Культуры клетокКультура клеток куриных фибробластов;культура клеток мышиной миеломы линии SP2/0-Agl4J. (SP2/0), дефектная по гену гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ), использовали в качестве партнера для слияния при получении гибридом; полученная из НИИБТ МЗ России.

5 115 Питатепъиые среды и растворыПри проведении гибридизации и культивировании гибридом использовали следующие среды и растворысреду Dnlbecco's minimal essential medium (DMEM) Hybn-Max", сухую, с L-глютамином, 4500 мг/дмя глюкозы, без бикарбоната натрия (Sigma, США),antibiotic antimycotic solution (100\) Hybn-Max" (Sigma, США) с составом 10000 ЕД пенициллина, 10 мг стрептомицина, 25 мкг амфотерицина,фетальную сыворотку крупного рогатого скота, тестированную на способность поддерживать пролиферацию и клонообразование гибридом (Sigma, США, Flow, Великобритания),8-азагуанин (2-амино-6-гидрокси-8-азапурин) (50х) Hybn-Max" (Sigma, США),200 мМ раствор L-глутамина Hybn-Max" (Sigma, США), HAT media supplement (50x) Hybri-Max" (Sigma, США), в составе которого 5 мМ гипоксантина, 0,02 мМ аминоптерина и 0,8 мМ тимидина,НГ media supplement (50х) Hybn-Max" (Sigma, США), в составе которого 5 мМ гипоксантина и 0,8 мМ тимидина,PEG/DMSO раствор Hybn-Max" (Sigma, США), ЮОмМ раствор гшрувата натрия (Sigma, США), 7,5%-ный водный раствор бикарбоната натрия (Россия), 40%-ный водный раствор глюкозы (Россия), 0,83%-ный водный раствор хлорида аммония (Sigma, США), 4%-ный раствор гентамицина5 116 Приготов leuue цитате ibiihix сред и их компонентовСреду DMEM ютовили путем растворения сухого компонента в бидистиллированной воде (сопр <7 МОм) и добавления бикарбоната натрия (Sigma, США) до конечной концентрации 3,2 г/дм"5Среду для культивирования гибридом (ГС) готовили путем добавления к 80 см1 среды DMEM 20 см1 фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 1 см' 200 мМ раствора глутамина, 1,5 см ЮОмМ раствора пирувата натрия, 1 смя раствора 'Antibiotic antiirncotic solution (100Х) Hybn-Max"Среду для культивирования клеток миеломы готовили путем добавления 2 см исходного пятидесятикратного раствора 8-азагуанина к 100 см'гибридомной среды.

Селективную среду HAT для культивирования смеси гибридомных и родительских клеток готовили путем добавления к 100 см3 гибридомной среды 2 см3 исходного пятидесятикратного раствора HAT (Sigma, США)Селективную среду НТ для культивирования гибридомных клеток готовили путем добавления к 100 см3 гибридомной среды 2 см3 исходного пятидесятикратного раствора НТ (Sigma, США).

5.1.1.7. РеактивыВ работе использовали следующие импортные реактивы: агар-агар (Difco, США); агароза со средним электроЭндоосмосом (Sigma, США); азид натрия (Sigma, США); 2,2-азино-бис-(3-этил)-бензотиазолин-6-сульфоновой кислоты диаммониевая соль (АБТС) (Sigma, США); акриламид (Serva, Германия); альбумин бычий сывороточный кристаллический (Sigma, США); амидочерный 10-В (Reanal, Венгрия); аминоптерин (4-амипоптероглутами-новая кислота, (Sigma, США); З-амино-9-этилкарбазол (Sigma, США); аммония хлорид (Sigma, США); бисакриламид (Serva, ФРГ); бикарбонат натрия (Sigma, США); боргидрид натрия (Sigma, США); 5-бром-2-дезоксиуридин (Serva, Германия); гипоксантин (6-гидроксипурин, Sigma, США); глицерин (Difco, США); L-глютамин (Sigma, США); глютаровый альдегид (Sigma, США; Serva, Германия); 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорид (Serva, Германия); диметилсульфоксид (Sigma, США); додецилсульфат натрия (Sigma, США); казеин для биохимических исследований (Реанал, Венгрия; ДиАМ, Россия; Merck, Германия); карбонат натрия (Sigma, США); краситель Романовского-Гимза (Merck, Германия); кумасси R-250, G-250 (Fluka, Швейцария); лимоннокислый натрий (Fluka, Швейцария); маркеры молекулярных масс для электрофореза в ПААГ-ДСН (Pharmacia, Швеция); 2-меркапто-этанол (Serva, Германия); 1Ч,К-диметилформамид (Merck, Германия); N\N'-метилен-бис-акриламид (Serva, Германия); натрия азид (Sigma, США); натрия боргидрид (Sigma, США); натрия метапериодат (Sigma, США); неполный адъювант Фрейнда (Difco, США); полный адъювант Фрейнда (Difco,США); пероксидаза хрена (ГНУ ВНИИВВиМ; Serva Германия; Sigma США); полиэтиленгликоль-1500,-4000,-6000 (Merck, Германия); пристан (2,6,10,14-тетраметилпентадекан, Sigma, США); протеин-А Sepliarose 4В (Pharmacia, Швеция); сефадекс G-25 Coarse (Pharmacia, Швеция); твин-20 (Serva, Германия); твин-80 (Serva, Германия); N,N,N\N'- тетраметилэтилен-диамин (Serva, Германия); тимидин (Serva, Германия); трис-(гидроксиметил)аминометан (Sigma, США); трипсин (Serva, Merck, Германия); тритон Х-100 (Serva, Германия); фенольный реактив Фолина-Чиокалтеу (Sigma, США); этилендиа-минтетраацетата натриевая соль (ЭДТА); этиленгликоль (Sigma, США).

Отечественные реактивы квалификации ч.д.а., х.ч., о.с.ч.: кислота три-хлоруксусная кристаллическая; кислота уксусная ледяная, кислота соляная концентрированная; кислота серная концентрированная; натрия гидроокись; натрия ацетат, натрия цитрат трехзамещепный, хлорид аммония, кальция хлорид; кальция хлорид; калия фосфат однозамещенный; калия фосфат двух-замещенный; натрия фосфат однозамещенный; натрия хлорид, фосфат натрия однозамещенный, натрия фосфат двухзамещенный, аммония сульфат, бария хлорид, сульфат магния одноводный, сульфат марганца одноводный; ацетон, этанол, метанол, диэтиловый эфир, хлороформ, эфир этиловый; ами-ноуксусная кислота (глицин), лимонная кислота (Реахим, СССР); деионизи-рованная вода; перекись водорода.

Использовали ряд других реактивов, наименования и характеристики, которых приведены при изложении результатов собственных исследований.

5.1.1.8. Исходные водные растворыИспользовали водные стерилизованные фильтрованием через мембранные фильтры растворы:200 мМ раствор L-глутамина; 100 мМ раствор пирувата натрия; 4%-ный раствор гентамицина; 7,5%-ный раствор бикарбоната натрия; 40%-ный раствор (объём/объём) глюкозы; 0^83%-ный раствор хлорида аммония;раствор 8-азагуанина, плотностью 1,54 мг/см3. К 77 мг 8-азагуанина добавляли по каплям 1Н раствор NaOH до полного растворения, затем объем раствора доводили дистиллированной водой до 50 см3; полученный раствор после стерилизации хранили на холоду до использования;забуференный физиологический раствор (ЗФР) (0,01 М), рН 7,2-7,4. Для его приготовления 17 г натрия хлорида, 0,436 г калия фосфорнокислогоРОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННА БИБЛИОТЕКАоднозамещенного, 1,802 г натрия фосфорнокислого двузамещенного растворяли в 2 литрах дистиллированной воды;0,01М забуференный физиологический раствор (ЗФР), рН 7,2-7,4 с твин-20 (ЗФР-Т) готовили, добавляя к 2 дм3 ЗФР 1 см3 Твин-20;0,01М забуференный физиологический раствор (ЗФР-Т), рН 7,2-7,4, содержащий 1% БСА (ЗФР-БСА-Т), готовили, растворяя 10 г БСА в 1000 см3 ЗФР-Т;0,01М забуференный физиологический раствор (ЗФР-Т), рН 7,2-7,4, содержащий 0,5% молочного казеина (ЗФР-Т-казеин), готовили растворением 5 г молочного казеина в 1000 см3 ЗФР-Т и варкой до закипания при постоянном перемешивании;лизисный буфер состава: 10 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 1 мМ фенил-метилсульфонилфлуорид, 0,15 М NaCI, 0,1% додецилсульфат натрия, 1,0 % Triton Х-100, 1,0% дезоксихолата натрия, 0,01% азида натрия;раствор перколла и набор маркеров Density marker beads for calibration of gradients of Percoll R (Farmacia Fine chemicals, Швеция).

Окрашивающие растворы амидового черного и кумасси ярко-синий G-250, отмывающий раствор приготовили по методике предложенной Грассма-ном и Ханнигом [158]. Готовили насыщенный на холоду раствор амидового черного в растворителе, содержащем смесь ледяная уксусная кислота - метанол (1:9). Для этого 13,0 г амидового черного растворяли в 100 см3 уксусной кислоты и прибавляли 900 см3 метанола. Смесь перемешивали встряхиванием и оставляли отстаиваться на ночь; затем фильтровали. Отмывающий раствор: уксусная кислота - метанол (1:9).

Окрашивающий раствор кумасси ярко-синий G-250 и отмывающий раствор состава: кумасси 0,50 г, этанол 96%-ный 45 см3, ледяная уксусная3 3кислота 10 см", дистиллированная вода 45 см. Краситель растворяли в спиртовом растворе кислоты и оставляли на ночь при комнатной температуре. Отфильтрованный через фильтровальную бумагу раствор готов к употреблению. Отмывающий (обесцвечивающий) раствор: этанол 96%-ный 450 см3, ледяная уксусная кислота 100 см3, дистиллированная воду 450 см3.

Для бесфонового экспресс-окрашивания: 0,05%-ный раствор кумасси G-250 в 12,5%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ), использовали для проявления полос, затем для уменьшения фонового окрашивания, последовательно - 12,5%-ный раствор ТХУ, дистиллированную воду.

5.1.1.9. Растворы для конъюгации иммуноглобулинов и пероксидазыхрена0,1 М раствор периодата натрия NaIO.4: 21,6 г NaI04 растворяли в 1 дм3 дистиллированной воды;0,1 М раствор гидрокарбоната натрия NallCC^: 8,4 г NaHCCb растворяли в 1 дм3 дистиллированной воды;раствор боргидрида натрия (NaBH:t): 40 мг натрия боргидрида растворяли в 10 см3 дистиллированной воды;0,2 М карбонатно-бикарбопатный буфер, рН 9,5: 16,8 г NaHCC^ и 21,2 г ИагСОз растворяли в 1000 см3 дистиллированной воды;0,5 М ацетатный буфер, рН 4,4. Для приготовления 4,1 г ацетата натрия растворяли в 50,0 см3 дистиллированной воды, рН доводили 20%-ным раствором уксусной кислотой; и общий объем доводили до 100 см3;10 см3 0,5 М ацетатного буфера рН 4,4 доводят разведением бидистил-лированной водой до 100 см3.

5.1.1.10. Растворы для постановки ИФАИспользовали следующие растворы, приготовленные на бидистиллировапной воде:0,05 М карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,5 (КББ). 4,2 г NaHC03 и 5,3 г Na2C03 растворяли в 1000 см3 дистиллированной воды.

0,05 М цитратный буфер, рН 4,0: 1,0 см3 0,5 М цитратного буфера рН 4,0 разводили бидистиллированной водой до 10 см3.

0,05 М ацетатный буфер, рН 4,4: 0,41 г ацетата натрия растворяли в' 50,0 см3 дистиллированной воды, и доводили до 100 см3; рН доводили 20%-ным раствором уксусной кислотой.

50 мМ раствор Tris-HCl, рН 7,6: 3,03 г Tris растворяли в 500 см3 дистиллированной воды.

Рабочий раствор хромогенного субстрата для ТФ ИФА готовили непосредственно перед использованием: в 10 см3 0,05 М цитратного буфера рН 4,0 вносили 0,04 см3 1%-ного раствора перекиси водорода и 0,1 см3 0,04М раствора АБТС. Раствор готовили ex tempore.

Рабочий раствор хромогенного субстрата для выявления иммунного комплекса на нитроцеллюлозной мембране, содержащий 0,05М Трис-HCl, рН 7,4, 0,05% 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорида, 0,15% перекиси водорода (Н2О2). Раствор готовили ex tempore.

Рабочий раствор хромогенного субстрата для ИГХ готовили непосредственно перед использованием:- в 19 см3 0,05 М ацетатного буфера, рН 5,0, вносили 4 мг З-амино-9-этилкарбазол, предварительно растворенного в 1 см3 NjN-диметилформами-да, и добавляли 0,04 см3 33%-ного раствора перекиси водорода.- 50 мг тетрагидрохлорида 3,3'- диаминобензидина растворяли в 100 см3 50 мМ раствор Tris-HCl, рН 7,6 и добавляли перекись водорода до конечной концентрации 0,003%-0,01%.

5.1.1.11. ОборудованиеВ работе использовали следующее оборудование: шкаф с ламинарным вертикальным потоком стерильного воздуха (ВЛВСОСК - BSH, Германия);С02 - инкубатор (ASSAB, Medicin АВ, Швеция); водяной термостат (ТЖ-0-03); рН-метр (Phannacia-LKB, Швеция); микроскоп, инвертированный СК-2 (Olympus, Япония); холодильники низкотемпературные с регулируемым диапазоном температур, марок Sanyo Ultra Low, Revco, США); холодильник (ЗИЛ, СССР);комплект 4- и 8-автоматических пипеток с диапазоном объемов 0,020 -0,250 см3 (Flow, Великобритания); комплект одпоканальных автоматических пипеток с диапазоном объемов 0,002-0,250 см3 (Gilson, Франция);8-канальпый сканирующий спектрофотометр Multiskan Р340 (Labsis-tems, Финляндия);весы торсионные WT 5070 (Польша), весы технические на 2 кг, лабораторные па 1 кг, аналитические (ВЛА-200) (СССР);диализные и нитроцеллюлозные мембраны (Sigma, США), фильтровальную бумагу ЗММ (Whatman, США); вакуумный насос; установку для ультрафильтрации; магнитную мешалку;ультразвуковой дезинтегратор Soniprep-150 (MSE, Великобритания); центрифуга Т-23 (ГДР), ультрацентрифуга Beckman и бакет-роторы к ней АН-627 и АН-650 (Sorvall, США).

5.1.2. Методы5.1.2.1. Получение вируссодерлсащего материала, определение его инфекционной активностиДля получения вирусного сырья в качестве системы культивирования,обеспечивающей получение высокоактивного вируса ИЛТ кур, использовали 9-11-дневные куриные эмбрионы (КЭ), с последующей очисткой вируса, выделением специфического антигена и постановкой серологических реакций.

5.1.2.3. Получение препаратов нормальных антигенов В качестве сырья для получения препаратов нормальных антигенов использовали ХАО 15-16-дневных незараженных безлейкозпых КЭ, которые гомогенизировали. Готовили 10%-ный гомогенат ХАО на ЗФР рН 7,2-7,4, из которого получали ацетоновый порошок [99].

Также в качестве сырья для получения препаратов нормальных антигенов использовали монослойные культуры клеток куриных фибробластов 911-дневных КЭ, выращенные в клинских матрасах. Первичную культуру получали в лаборатории "Культур клеток с музеем клеточных штаммов". Ростовую среду удаляли и вносили 150 см3 бессывороточной среды Игла MEM,содержащей 100 ЕД/см3 пенициллина, 100 мкг/см3 стрептомицина. Культуру клеток однократно замораживали и оттаивали, осветляли центрифугированием при 2500 об./мин. в течение 30 мин. Надосадок отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 10 см3 бессывороточной среды Игла MEM. >5.1.2.4. Приготовление гипериммунных антисывороток петухов, кроликов и морских свинокГипериммунные антисыворотки получали от петухов, кроликов и морских свинок по схемам, предложенным Сюриным В.Н. с соавторами [43] с незначительными модификациями. В качестве антигена для иммунизации птицы и животных использовали вируссодержащую суспензию, полученную после центрифугирования 10%-ного гомогената ХАО инфицированных КЭ (клон "НТ" вакцинного штамма "ЦНИИПП" вируса ИЛТ) при 2500 об./мин. в течение 30 мин., препараты частично очищенного (клон "НТ" вакцинного штамма "ЦНИИПП" вируса ИЛТ) в градиенте плотности перколла, эмбриональные препараты вирулентного штамма "Богатищевский" вируса.

5.1.2.5. Реакция диффузионной преципитации (РДП)Постановку реакции диффузионной преципитации (РДП) проводилидля определения титра антигена в препаратах частично очищенного вируса и определения титра антител в гипериммунных антисыворотках птицы, кроликов и морских свинок.

Приготовление геля для РДП. Для РДП готовили 1,5%-ный агаровый гель на фосфатном буфере по Сервису. Рабочий раствор геля готовили по методике, предложенной Сюриным В.Н. с соавторами [43]. Горячий агар разливали по 3 см3 на обезжиренные предметные стёкла или по 25 см3 в чашки Петри, расположенные строго горизонтально [14]. Затем в геле делали лунки по трафарету с использованием перфоратора и вакуумного насоса.

Постановка реакции. На первом этапе проводили качественную реакцию с пробами со всех фракций, полученных после осветления, осаждения ПЭГ-6000, отобранных после ультрацентрифугирования через слой 30%-ной сахарозы или в ступенчатом градиенте сахарозы, и перколла. В качестве контролей в реакции применяли следующие реактивы: антиген вируса ИЛТ (штамм "ВНИИБП"), нормальная сыворотка птицы, преципитирующая аити-сыворотка к антигенам вируса болезни Ньюкасла и вируса инфекционнойбурсальной болезни. Титр вируса определяли в полученных препаратах методом "шахматного" титрования в микроварианте РДП по Ухтерлони [242].

Реакцию считали положительной при формировании полос преципитации между лунками с разведениями антигенных препаратов и лунками с разведениями гипериммунных специфических сывороток. Титром препарата антигена или сыворотки считали максимальное разведение, которое обеспечивало формирование визуально видимой линии преципитата.

Прокрашивание геля. Перед прокрашиванием пластины с гелем лунки промыли физиологическим раствором. Затем на гель наслоили фильтровальную бумагу для полного высушивания. На сухую пластинку геля наносили окрашивающий раствор и выдерживали при комнатной температуре на 30-40 мин. При прокрашивании геля использовали раствор амидового черного или кумасси ярко-синий G-250.

5.1.2.6. ИммуиоэлектрофорезГотовили 0,8 % раствор агарозы (Pharmacia, США) на 0,1 М мединал-ацетатном буфере рН 8,6. Стеклянные пластины размером 9x12 см устанавливали на строго горизонтальную поверхность и заливали расплавленной гелем, так чтобы агаровый слой был толщиной 1,5 мм. После застывания агарозы вырезали лунки диаметром 2 мм и каналы между ними размером 60x2 мм. Расстояние между каналами и лунками составляло 4 мм. Лунки заполняли вровень с поверхностью агарозы исследуемыми пробами. Проводили электрофорез в течение 45 минут при силе тока 45 мА на два стекла. По окончании электрофореза каналы заполняли куриными аптисыворотками. Пластины инкубировали 48 часов. Учет результатов проводили визуально при просмотре пластин в проходящем свете через 24 и 48 часов. Для документирования результатов пластины промывали ЗФР в течение 24 часов при 2-х сменах раствора в день, высушивали под фильтровальной бумагой и окрашивали раствором кумасси G-250.

5.1.2.7. Определение концентрации белкаКонцентрацию белка в препаратах частично очищенного вируса ИЛТ, очищенных препаратах иммуноглобулинов МКА определяли микрометодом по методике, предложенной Lovvry О.Н. [248]. В качестве калибровочного стандарта использовали альбумин бычий сывороточный, фирмы «Sigma».

5.1.2.8, Получение гибридом, продуцирующих мопоклональпые антителаГибридомы получали по методу Kohler и Milstein [210] в модификацииFazekas и Scheidegger [140], используя в качестве партнера для слияния мие-ломную линию клеток SP 2/0-Agl4.1 и В-лимфоцитов селезенки мыши, иммунной к вирусу ИЛТ.

5.1.2.9. Приготовление культуры клеток перитонеальных макрофаговмышиКультуру клеток перитонеальных макрофагов аутбредных мышей готовили по общепринятой методике [277]. Перед использованием культуру макрофагов проверяли на отсутствие контаминации микрофлорой методом световой микроскопии.

Культуру макрофагов в 96-луночных полистироловых пластинах готовили за 1-2 дня до внесения культур гибридом при клонировании или культивировании клеток.

5.1.2.10. ГибридизацияВ качестве партнера для слияния при получении гибридом использовали культуру клеток мышиной миеломы линии SP2/0-Agl4.1. (SP2/0). Через 3 суток после последней инъекции проводили процедуру слияния иммунных спленоцитов и клеток миеломы проводили химическим методом при помощи полиэтиленгликоля с молекулярной массы (мол. м.) 1450 по методике, предложенной Koliler G., Milstein С. [210] в модификации Fazekas и Scheidegger [140]. Гибридизацию спленоцитов гипериммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии SP2/0-Agl4.1. осуществляли в соотношении 10:1 в присутствии 45% ПЭГ-1450. Гибридные клетки культивировали in vitro в стандартных условиях в течение 20 суток в селективной среде HAT, затем переводили па ростовую среду DMEM с добавлением 15-20% фетальной сыворотки коровы, 2 мМ глютамипа, 1 мМ пирувата натрия, 1 г/дм3 глюкозы, 1 мг/дм3 амфотерицина В, 50 мг/дм3 гентамицина.

Гибридные клетки, продуцирующие МКА, специфичные к антигенам вируса ИЛТ, тестировали в непрямом варианте ТФ ИФА с интервалами в 3-7 дней по мере интенсивности роста клеток.

На следующем этапе провели селекцию гибридных клеток в среде DMEM с содержанием НАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) и 20% фетальной сыворотки телят. Супернатапты клонов отдельно тестировали на специфическую антителопродукцию (скрининг) в непрямом варианте ТФ ИФА, с использованием, для выявления комплекса "антиген-антитело", пе-роксидазного конъюгата антител кролика к иммуноглобулинам мыши (далее - антимышиных).

Выбранные позитивные гибридомы последовательно клонировали в полужидком агаре и методом лимитирующих разведений. На каждом этапе клонирования определяли гибридомы на специфичность полученных МКА. По результатам отбирали клоны гибридом - продуцентов антител требуемой специфичности. Отобранные клоны наращивали, криоконсервировали, а также использовали для получения асцитических жидкостей.

5.1.2.11. Скрининг гибридных антителопродуцентовСелекцию клонов на специфическую антителопродукцию проводили вИФА па полистироловых планшетах (Cliniplate, Dynatech microelisa), основываясь на стандартных методиках ТФ ИФА [12].

5.1.2.12. Клонирование стабильно пролифернрующпх гибридных анти-телопродуцентовКлонирование гибридных клеток проводили в полужидком агаре и методом лимитирующих разведений, последовательно [29, 155, 225, 241].

5.1.2.13. Определение iciaccoe и подклассов моноклональных иммуноглобулиновОпределение класса и субкласса МКА проводили с использованием специальных наборов "Mouse monoclonal antibody isotyping reagents" и "Mouse monoclonal antibody isotyping kit" и согласно инструкциям по применению (Sigma ImmunoType, США), в твердофазном ИФА.

5.1.2.14. Получение асцитических жидкостей, содержащих монокло-иальные антителаАсцитические жидкости, содержащие моноклональные антитела, получали по методам, описанным Новохатским А.С. с коллегами [30], а также рядом других исследователей [28, 177].

Взрослым рожавшим самкам мышей линии BALB/c внутрибрюшинно вводили суспензию клонированных гибридных клеток в 1 см3 ДМЕМ с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) в соотношении 1:1. После образования асцитной опухоли (на 15-20 сутки) асцитическую жидкость извлекали. Клетки из полученного препарата осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут и закладывали на хранение, а надосадочную жидкость, предварительно после заморозки и разморозки осветлили при 4000 об./мин в течение 30 минут, использовали в дальнейшей работе.

Выделение поликлональных антител из сыворотки проводили аналогичным образом, проводя 2-3-х кратное высаливание сульфатом аммония.

5.1.2.17. Приготовление коиыогатов иммуноглобулинов с пероксидазойСинтез конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой хрена (тип VI,Sigma) осуществляли по методу перйодатного окисления фермента до альдегидной формы с последующим восстановлением боргидридом натрия по методу Nakane Р. К. и Kavvaoi А. [234] и по модифицированному методу, предложенному Tijssen Р. [303].

5.1.2.18. Определение полипептиднои специфичности МКА методом вестерн-блоттингаПрепараты очищенного вируса и препараты неинфицированных хориоаллантоисных оболочек КЭ с концентрацией белка около 1 мг/см3 предварительно обрабатывали лизисным буфером. Электрофоретическое разделение инфицированных и неинфицированных препаратов проводили в 7,5%> ДСН-ПААГ (натрия додецилсульфат-полиакриламидный гель), с последующим электропереносом на нитроцеллюлозную мембрану. Затем полоски нитро-целлюлозной мембраны инкубировали с супернатантами культуральных жидкостей клонов гибридом, содержащими МКА, взятыми в разведении 1:10, в течение 1 часа при комнатной температуре. Комплекс антиген-антитело выявляли меченными пероксидазой хрена антимышиными иммуноглобулинами кролика и добавлением субстратной смеси.

Иммуноферментные методы5.1.2.19. "Сэндвич" - вариант ТФ ИФА для исключения присутствия гетерологических антигенов в препаратах частично очищенного вирусаВ данном случае использовали "Набор препаратов на основе моноклональных антител для дифференциальной диагностики гриппа птиц и болезни Ныокасла твердофазным иммуноферментным методом" (СТО 00495549001 1-2006), разработанный в ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ. Полистироловые планшеты с сорбированными в лунках моноклональными антителами освобождали от упаковки и однократно отмывали, заливая в лунки по 0,2 см3 ЗФР-Т. Затем жидкость из лунок удаляли.

5.1.2.20. Непрямой вариант ТФ ИФА для скрининга МКАДля определения оптимальных условий скрининга МКА в непрямомварианте ТФ ИФА были необходимы следующие реагенты:специфический и нормальный антигены для сенсибилизации твёрдойфазы;специфическая гипериммунная сыворотка и нормальная сыворотка мышей в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно;иммуноглобулины кролика к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (антимышиный пероксидазный конъюгат) для выявления комплекса "антиген-антитело".

Для сенсибилизации планшетов использовали препарат частично очищенного концентрированного эмбрионального антигена вируса ИЛТ с активностью 1:8 - 1:16 в РДП, нормальный культуральный (суспензия культуры клеток куриных фибробластов) антиген и эмбриональный антиген в виде 10%-ной суспензии ХАО безлейкозных КЭ.

В качестве специфических сывороток использовали гипериммунные сыворотки петуха и линейных мышей, полученные из крови мышей - доноров лимфоцитов после введения бустер-дозы антигена.

Нормальные сыворотки получали из крови незаражённых, клинически здоровых кур и мышей.

Для постановки непрямого варианта ТФ ИФА был приготовлен пероксидазный конъюгат кроличьих антител к иммуноглобулинам мыши (антимышиный). Также был приготовлен пероксидазный конъюгат антикуриных кроличьих антител к иммуноглобулинам кур (далее - антикуриных кроличьих антител) и пероксидазный конъюгат протеина А."Шахматным" титрованием в непрямом варианте ТФ ИФА определяли дозу сенсибилизации планшетов препаратами частично очищенного вируса и титр специфичных антител в поликлональных сыворотках.

При отработке непрямого варианта ТФ ИФА как метода скрининга преследовали решение следующих задач: - определение рабочего разведения антигена для сенсибилизации; определение титра антител в поликлональных сыворотках птицы, линейных мышей, кроликов и морских свинок; подбор условий сенсибилизации планшетов препаратами очищенного вируса.

Данный метод использовали для определения рабочей дозы сенсибилизации планшетов препаратами частично очищенного вируса ИЛТ, а также для выявления и титрования антител, специфичных к антигенам вируса в поликлональных сыворотках, в супернатантах культуральпых и иммуноасцити-ческих жидкостей.

Через 40 минут определяли ОП субстратного раствора при длине волны 405 нм. Пробу считали положительной, если ОП субстратного раствора в лунке в >2,1 раза ОП раствора в лунке с отрицательным контролем.

Дозой сенсибилизации считали наибольшее разведение, ОП продукта реакции в лунке с которым была > 1,0.

После двухкратной отмывки ЗФР на мазки-отпечатки наносили субстратную смесь З-амино-9-этилкарбазола. После остановки ферментативной5-1реакции промывкой дистиллированной водой провели микроскопирование при увеличении в 250-400 раз.

Проба считается положительной, если ОП субстратного раствора в этой лунке > 2,1 раза выше ОП субстратного раствора в лунке с отрицательным контролем.

Через 40 минут инкубации при комнатной температуре учитывали результаты. Для этого проводили определение ОП субстратного раствора при длине волны 405 нм. Исследуемая проба считается положительной, если имеет ОП в 2 и более раза ниже ОП отрицательного контроля.

5.1.2.24. Непрямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА для выявления специфических антителЭтот вариант ИФА использовали для выявления в сыворотках птицыспецифических антител к антигенам вируса ИЛТ птиц.

Проба считается положительной, если ОП субстратного раствора в лунке, где ее инкубировали, в > 2,1 раза выше ОП в лунке с контролем.

5.1.2.25. Методы математического анализаМатематическую обработку результатов проводили согласно Лакину Г.Ф. с использованием персонального компьютера и пакета прикладных программ Statgraphics (Version 2.1) [21].

При титровании вирусов учет результатов эксперимента проводили путем расчета 50% инфекционным дозы по общепринятому методу Рида и Менча [33].

Для определения функциональных свойств разработанного метода ТФ ИФА (диагностическая чувствительность и специфичность) использовали рекомендации, указанные в руководстве МЭБ (Manual. Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases, 2005) [240]. В качестве сравнительного метода, с которым проводили расчёты диагностической чувствительности и специфичности, использовали метод вирусовыделения на КЭ.

5.2. Результаты собственных исследований5.2.1. Культивирование вируса ИЛТ курДля получения высокоактивного вирусного сырья, пригодного для очистки вируса и получения необходимого количества вируссодержащего материала использовали 9-11 дневные КЭ.

КЭ заражали методом аппликации на хориоп-аллантоисную оболочку (ХАО) и в аллантоисную полость в дозе 10000 ЭИД5о/0,2см3 10%-ной суспензией гомогената ХАО (клон "НТ" штамма "ЦНИИПП" вируса ИЛТ). Погибших в течение первых 24 ч после инокуляции КЭ не учитывали. У выживших КЭ на 5-6-й день собирали экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ) и ХАО.

Таким образом, в результате проведенных исследований в качестве наиболее высокоактивного был выбран вакцинный штамм "ЦНИИПП" вируса ИЛТ кур, препараты которого имели инфекционную активность для 9-10 дневных КЭ - 6,0 - 6,5 lg ЭИД50/см3.

5.2.2. Очистка и концентрирование вируса ИЛТ курЗадачей следующего этапа работы явилась получение препаративныхколичеств очищенного вируса ИЛТ кур. В качестве исходной вируссодержа-щей суспензии использовали гомогенаты хориоп-аллантоисных оболочек КЭ, инфицированных вакцинным штаммом "ЦНИИПП" (клон "НТ") вируса ИЛТ кур. Инфекционный титр вируса составлял 6,0 - 6,5 lg ЭИДзо/см3.

Для удаления балластных белков из гомогената применяли методы ультрацентрифугирования через слой 30%-ной сахарозы, в ступенчатом градиенте плотности сахарозы и в градиенте плотности перколла.

Параллельно ультрацентрифугированию в ступенчатом градиенте провели центрифугирование через слой 30%-ной сахарозы при тех же режимах (ротор АН-627 центрифуги Beckman L-65). При этом в верхней четверти сформировалась взвесь рыхлых хлопьев, остальная часть осела на дно пробирки. Взвесь отобрали отдельно, а осадок ресуспендировали в 0,05 М буфере Tris-HCl, рН 7,2-7,4.

Суспензия частично очищенного вируса в градиенте плотности перколла разделилась на 2-3 фракции соответственно плотности взвешенных в ней частиц, маркёры разделились также соответственно своей плотности. Фракцию вируса, расположенную в зоне маркёра DMB-6 (плотность 1,087 г/см3), образовавшейся в виде четко видимой линии, осторожно отбирали пипеткой. Фракцию ресуспендировали в ЗФР и осаждали ультрацентрифугированием. Данную фракцию осадка обозначили как частично очищенный сконцентрированный препарат вируса.

Фракцию вируса в градиенте плотности перколла обрабатывали в ультразвуковом дезинтеграторе Soniprep MSE-150 шестикратно по 30 секунд. Затем ультразвуковой дезинтеграт центрифугировали при 15000 об./мин. в течение 45 мин. [329]. Осадок ресуспендировали в ЗФР.

В итоге при концентрировании и очистке вируса показатель кратности очистки осаждением через слой 30%-ной сахарозы составил 50 - 70 раз, центрифугированием в ступенчатом градиенте сахарозы - 100 - 150 раз, а кратность очистки в перколле - 400 - 500 раз.

5.2.3. Экспериментальная инфекцияИз 30 голов 4-недельных цыплят сформировали 3 группы: 2 группы по 12 голов и одна - 6. Цыплят первых двух групп вакцинировали против ИЛТ эмбрион-вирусвакциной из штамма "ЦНИИПП" клон "НТ" (с инфекционной активностью 6,0 - 6,5 lg ЭИДз0/см3) в дозе 5000 ЭИДбо/цыпл., вводили ин-тратрахеальпо в объёме по 0,5 см3, изготовленную в ГНУ ВНИИИВВиМ. Через 15-16 дней после вакцинации у всех цыплят взяли кровь из подкрыльцо-вой веиы, приготовили сыворотки и исследовали их непрямым вариантом ТФ ИФА на наличие (отсутствие) специфических антител. Через 15-16 дней после вакцинации 2-ую группу цыплят заразили интратрахеально в объёме по 0,2 см3 в дозе 1000 ИДзо вирулентным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ. Группу (3-я группа - контрольная) цыплят из 6 голов также заразили интратрахеально в объёме по 0,2 см3 в дозе 1000 ИДзо вирулентным штаммом"Богатищевский" вируса ИЛТ. 1-ой группе цыплят интратрахеально ввели по 0,2 см3 ЗФР, рН 7,4-7,6. Ежедневно цыплят обследовали на проявление специфических для ИЛТ клинических признаков. На 5-7 день после заражения у цыплят всех трёх групп взяли кровь, приготовили сыворотки и исследовали их в непрямом варианте ИФА. В третьей группе, в период развития и максимального проявления специфических клинических признаков болезни в ла-ринготрахеальной форме, птицу убили и провели сбор поражённых органов (гортань и трахея).

Для последующих исследований приготовили мазки-отпечатки на предметных стёклах с участков пораженных органов (гортань и трахея).

5.2.4. Клиническое и патологоаиатомическое исследованиеКлиническое исследованиеИнкубационный период - период до проявления первых специфических клинических признаков составил 48 - 60 часов. Болезнь протекала в острой ларинготрахеальной форме.

Клиническая картина. Общее состояние - угнетённое, вялое, аппетит -хороший, отмечали отек нижних век, нижней части шеи и в области носовых синусов; специфические системные признаки - характеризовались в течение первых 2-3 дней влажными клокочущими и булькающими хрипами.

Общее состояние на 4-5 день характеризовалось сильным угнетением, вялостью, сонливостью, отсутствием аппетита, слёзотечением; цыплята большую часть времени неподвижно сидели, и не реагировали на слабые воздействия внешних раздражителей, перьевой покров у цыплят был взъерошен, испачкан испражнениями в области киля и живота, тусклый, матовый, плохо держался в перьевых фолликулах.

Специфические системные признаки характеризовались влажными клокочущими хрипами при дыхании в спокойном состоянии, переходящими, при сильном беспокойстве птицы, в клокочущие со свистом, и инсперацион-ную одышку (диспноэ). В последующем (через 1-2 дня) инсперационная одышка переходила в смешанную, при этом цыплята сильно вытягивали шею, низко наклоняя голову к полу клетки, пытаясь сделать вдох. Затем трясли головой и при вытягивании шеи делали свистящие вдох и выдох. После нескольких таких попыток им удавалось отхаркиванием освободить просвет трахеи и гортани от экссудата. В течение последующих 20-30 минут наблюдали спокойное ровное дыхание с незначительными слабыми влажными клокочущими хрипами. Находясь в спокойном состоянии у большей части птицы было ровное дыхание. Со временем сила и частота хрипов усиливались, и что в последствии вновь приводило к одышке.

Патологоаиатомическое исследование. Патологоанатомические изменения характеризовались резко выраженным катаральным или катарально-геморрагическим воспалением слизистых оболочек носовой полости, гортани и трахеи. Слизистая оболочка гиперемирована, отёчна, пронизана мелкими точечными и полосчатыми кровоизлияниями. В ротовой полости на слизистой оболочке - налет серовато-белого цвета, в области корня языка, неба, в углах клюва, и у входа в гортань и глотку. В просвете трахеи обнаружена ка-зеозная пробка (у некоторых кур - закупоривающая просвет), крошковатая, липкая, вязкая, густая, серо-кремового цвета с точечными красноватыми вкраплениями. После ее удаления слизистая оболочка трахеи и гортани отечная, утолщенная, неровная, небольшими участками красноватая (острый се-розно-катаральный и серозно-геморрагиче-ский или серозно-фибринозный ларинготрахеит, серозно-геморрагический параларинготрахеит). Резко выражен острый серозно-катаральный фарингит. В области бифуркации и в самых крупных бронхах: слизистые бесцветные мутноватые сгустки, собственно стенка бронхов серо-белого цвета (резко выражено серозно-катаральное воспаление). Стенка воздухоносных мешков тусклая, серо-белого цвета, в полости воздухоносных мешков - пенистый крошковатый липкий вязкий экссудат (серозно-катаральный и серозно-геморрагический аэросаккулит).

Патогистологическая картина в слизистой оболочке гортани и трахеи. Микроскопическое исследование (увеличение 400х световой микроскопии) проводили после просушки на воздухе и фиксации мазков-отпечатков поражённых гортани и трахеи, с последующей окраской по Романовскому-Гимза. Микроскопирование проводили при увеличении в 400 - 800 раз. Гистологические изменения соответствовали картине при макроскопическом исследовании. В гортани и трахее - серозно-катаральное и серозно-геморра-гическое или фибрипозно-геморрагическое воспаление слизистой оболочки в зависимости от длительности течения болезни и общего состояния отдельных цыплят. В начале болезни отмечалась гиперемия кровеносных сосудов с периваскуляриыми кровоизлияниями, отек слизистой оболочки, дистрофия идегенерация эпителия впервые 2-3 дня, с последующей десквамацией клеток эпителия, инфильтрированием слизистой оболочки лимфоидно-гистиоцитар-ными (фибробластоидными) клетками (на 5-8 день).

Таким образом, можно сделать вывод о том, что клинические признаки и патологоапатомические изменения в органах дыхательной системы были характерны для ИЛТ.

Получение гипериммунных сывороток от морских свинок. Антисыворотку к вирусу ИЛТ получали гипериммунизацией морских свинок по схеме, описанной Сюриным В.Н. [43]. Для гипериммупизации использовали 10%-ную суспензию гомогената ХАО КЭ (штамм "ЦНИИПП", с инфекционной активностью 6,0 - 6,5 lg ЭИД50/см3) в разведении 1:9 на ЗФР (рН 7,3), иммунизировали морских свинок по схеме: первая иммунизация в объеме 0,1 см3, внутрикожно, в плантарную поверхность обеих лапок; вторая иммунизация -через 7-9 дней в объеме 0,1 см3, подкожно, в область верхней губы; последующие 2 инъекции препарата очищенного вируса - через 14 - 16 и 21 - 23 дней после второй, внутримышечно. Через 8-10 дней после последнего введения - морских свинок обескровливали. Сыворотки крови, полученные общепринятым методом, исследовали на активность и специфичность.

Получение гипериммунных сывороток от кроликов. Кроликов иммунизировали той же суспензией по следующей схеме: внутривенно в течение 3 недель по 3 раза в неделю с интервалом в один день в первую неделю - по 2 см3, во вторую и третью - по 3 см3; через 10 дней вводили препарат очищенного вируса, внутривенно. Сыворотки крови, полученные через 8-15 дней общепринятым методом, исследовали на активность и специфичность [43].

5.2.6. Оценка препаратов вируса ИЛТ и специфических сывороток в реакции диффузионной преципитации и во встречном иммуноэлектрофорезеПри определении титра в РДП в препаратах частично очищенного вируса ИЛТ и специфических антител в гипериммунных антисыворотках петухов, кроликов и морских свинок применили метод "шахматного" титрования. Предварительные результаты реакции учитывали через 12, 24, 36 и 48 часов, и спустя 72 часа проводили окончательный учет реакции.

Суспензия вируса, полученная осаждением ПЭГ-6000, не реагировала в РДП ни со специфической сывороткой и ни с одной контрольной сывороткой (нормальные сыворотки птицы и животных, антисыворотки цыплят к вирусам болезни Ньюкасла, ИББ, гриппа птиц, чумы уток.). Фракция вируса над слоем 30%-ного раствора сахарозы так же не реагировала с сыворотками. Фракции вируса, осаждённые через слой 30%-ной сахарозы, а также, полученные в градиенте 35-45%-ной сахарозы и в градиенте перколла, показали чёткие линии преципитации со специфическими сыворотками через 24-72 часа с момента постановки; и не реагировали с контрольными. Данные представлены на рис. 1 и 2.

При этом титры антигенов вируса ИЛТ (клон "НТ" шт. "ЦНИИПП"), полученных ультрацентрифугированием через слой 30%-ного раствора сахарозы и в ступенчатом градиенте сахарозы, были в пределах 1:2 - 1:4, в отдельных случаях - 1:8. Титры препаратов частично очищенного в градиенте перколла вируса в РДП был в пределах 1:8 - 1:16, в отдельных случаях титр был - 1:32. Кроме того, в РДП определяли титр антигена в вакцинных препаратах и пробах полевого материала от больных цыплят.

Результаты оценки препаратов вируса ИЛТ представлены в табл. 1 и 2.

Результаты определения титра антител в сыворотках цыплят в реакции диффузионной преципитации представлены на рис. 3.IS ' * окРис. I. Определение специфичности в РДП препаратов вируса ИЛТ с поликлональными антителами гипериммунной сыворотки крови кролика. Окраска кумасси-0250. Обозначения:! 2- гипериммунная специфическая сыворотка кролика в разведении 1:32;3,8- препарат частично очищенного вируса ИЛТ в перколле;4- антиген вируса гриппа птиц;5- суспензия гомогената ХАО КЭ, инфицированных вирусом ИЛТ (шт. "ЦНИИПП" клон "НТ");6- антиген вируса инфекционной бурсальной болезни;7- антиген вируса болезни Ньюкасла;9,10- препарат вируса ИЛТ, осажденного ПЭГ;11-14 - препараты частично очищенного вируса ИЛТ в ступенчатом градиенте сахарозы (30-35-40-45%): II- препарат в слое 30%-ной сахарозы; 12- препарат частично очищенного вируса ИЛТ в слое 35%-ной сахарозы; 13 - препарат частично очищенного вируса ИЛТ в слое 45%-ной сахарозы; 14- препарат частично очищенного вируса ИЛТ в слое 40%-ной сахарозы.

Рис. 2. Оценка препаратов частично очищенного вируса ИЛТ в микроварианте РДП "шахматным" титрованием с поликлональными антителами сыворотки крови петуха. Окраска амидо черным В.

Обозначения:1,2,3,4,5,6 - двукратные разведения гипериммунной сыворотки крови петуха к вирусу ИЛТ (с 1:2 до 1:64);7 - гипериммунная специфическая сыворотка крови цыплят к вирусу болезни Ньюкасла;8,9,10,11,12,13 - двукратные разведения препаратов частично очищенного вируса ИЛТ (с 1:2 до 1:64).

Рис. 3. Определение титра антител в сыворотках крови цыплят в реакции диффузионной преципитации. Окраска кумасси-С250.

Обозначения:А, В - сыворотка крови вакцинированных против ИЛТ цыплят; С - сыворотка крови больных цыплят;I - вакцинный препарат вируса ИЛТ (штамм "ЦНИИПП") в разведении 1:8; 2,3,4, 5,6, 7 - двукратные разведения сывороток крови цыплят; 8 - антиген вируса болезни Ньюкасла.

А затем определяли титр вируса в пробах экспертизного материала и в пробах органов от экспериментально заражённой птицы (гортань и трахея больных цыплят и взрослой птицы) методом "шахматного" титрования с 2-кратными разведениями сывороток и антигенов в микроварианте РДП по Ух-терлони [242]. Результаты оценки препаратов вируса ИЛТ в пробах экспертизного материала представлены в табл. 3.

Таблица 3Индикация вируса ИЛТ в пробах экспертизного материала и в пробахорганов от экспериментально заражённой птицып = 4№ Вируссодержащий материал Вирусовыделение на КЭ Титр в РДП с поликлональной сывороткой петуха Титр, lg ЭИД50/см3 выявленных/ всего, шт.

1. 10%-ная суспензия гомогената трахеи (ПФ "Белгородская") 1-2 0/5 02. 10%-ная суспензия ХАО КЭ (ПФ "Костромская") 1-2 2/5 0 - 1:2ч J. 10%-ная суспензия трахеи цыплят и/тр. зараж. вирул. шт. "Богатищевский" в дозе 1000 ИД50/СМ3 2-3 5/30 0- 1:24. Всего 7/40 0-1:2В пробах экспертизного материала и в пробах органов от экспериментально заражённой птицы методом вирусовыделения вирус удалось выявить только в 7 из 40 случаев, при титре антигена вируса в микроварианте РДП в положительных (вирусовыделением на КЭ) пробах - 1:2.

В итоге можно отметить, что наиболее антигенно-активными препаратами вируса являются препараты, полученные последовательными этапами концентрирования ультрацентрифугированием, очистки и концентрирования ультрацентрифугированием через ступенчатый градиент сахарозы и перколла. С использованием этих препаратов получены гипериммунные сывороткикрови петуха, кролика и морской свинки.

ВИЭФ. Готовили 0,8 % раствор агарозы (Pharmacia, США) на 0,1 М ме-динал-ацетатном буфере рН 8,6. Проводили электрофорез в течение 45 минут при силе тока 45 мА на два стекла [313]. По окончании электрофореза каналы заполняли препаратами куриных аптисывороток. Пластины инкубировали 48 часов. Учет проводили через 24 и 48 часов визуально при просмотре пластин в проходящем свете. Пластины промывали ЗФР 24 часа при 2-х сменах раствора, высушивали фильтровальной бумагой и окрашивали кумасси G-250.

Результаты оценки препаратов вируса ИЛТ во встречном иммуноэлек-трофорезе с поликлональными антителами представлены на рис. 4 и 5. По результатам ВИЭФ можно заключить, что препараты частично очищенного вируса ИЛТ активно преципитируют с поликлональными антителами гипериммунной сыворотки морской свинки, кролика и петуха.

5.2.7. Определение условий постановки непрямого варианта ТФ ИФАИсследования проводили с целью выявления специфичных антител в поликлональных сыворотках птиц, кроликов и морских свинок, а также МКА в супернатантах культуральных и иммуноасцитических жидкостей.

Обозначения:SAg - специфический эмбриональный антиген, препарат частично очищенного вируса ИЛТ в перколле, в разведении 1:8;NAg - нормальный эмбриональный антиген;SS - специфические антитела сыворотки крови в разведении 1:20:1 - морской свинки;2 - кролика;3 - петуха.частично очищенного вируса и титр специфичных антител в поликлональных антисыворотках петуха и в гипериммунной антисыворотке линейных мышей.

Подбирали условия отмывки планшетов после каждого этапа инкубации компонентов реакции: планшеты отмывали трёхкратно ЗФР-Т. Процедуру отмывания проводили после каждого этапа ИФА.

Между всеми стадиями проводили трехкратную отмывку планшетов ЗФР-Т, а после конъюгата - пятикратную.

Дозой сенсибилизации считали наибольшее разведение, в котором ОП продукта реакции составляла > 1,0 ОП. Результаты титрования представлены на рис. 6.

ОП 4 0 5 нм0123456789 10 11 12 разведения препаратов, log22-кратные разведения препарата частично очищенного вируса, начиная с 1:125- Максимально допустимый уровень фона - 0,05 (неспецифическое окрашивание субстрата) —О—2-кратные разведения антисыворотки петуха, начиная с 1:125Уровень отсекания (максимальное разведение препарата при оптической плотности раствора субстрата, равной 1,000 и более)Рис. 6. "Шахматное" титрование в непрямом ТФ ИФА с целью определения дозы сенсибилизации планшетов препаратами частично очищенного вируса и определения титра антител в антисыворотке петуха.

Определение титра антител в гипериммунных сыворотках петуха, вакцинированных и заралсенных цыплят, в гипериммунных сыворотках кролика и морской свинки. Лунки полистирольных планшетов сенсибилизировали препаратами частично очищенного вируса ИЛТ в рабочем разведении (оптимальной дозе сенсибилизации). После отмывания и блокировки, вносили исследуемые (петуха, цыплят, кролика и морской свинки) сыворотки в разведениях от 1:100. Комплекс "антиген-антитело" выявляли антивидовым пе-роксидазным конъюгатом (иммуноглобулины кролика к иммуноглобулинам кур, протеин А) в рабочем разведении. Данные представлены в табл. 4 и 5.

Необходимо отметить, что антиген, используемый для иммунизации кроликов и морских свинок, не реагировал с сыворотками к гетерологичным вирусам (БН, ГП, ИББ, ЧУ).

Итак, можно сделать заключение о том, что отработана и модифицирована схема получения очищенных антигенно-активных препаратов вируса ИЛТ. Отработаны схемы получения гипериммунных сывороток от кур, кроликов, морских свинок и мышей с использованием очищенных препаратов вируса; отработаны РДП, ВИЭФ и непрямой вариант ТФ ИФА для оценки антигенной активности препаратов вируса и сывороток.

5.2.9. Определение концентрации белка в препаратах частично очищенного вируса ИЛТКонцентрацию белка в препаратах частично очищенного вируса ИЛТ,определяли микрометодом по методике, предложенной Lovvry О.Н. [248]. В качестве калибровочного стандарта использовали альбумин бычий сывороточный, кристаллический, фирмы «Sigma». Концентрация белка в препаратах частично очищенного вируса ИЛТ была в интервале от 0,30 до 1,35 мг/см3 в зависимости от степени очистки. Данные представлены в табл. 7. В дальнейшей работе, при гипериммупизации линейных мышей и скрининга МКА в непрямом ТФ ИФА, использовали наиболее активные препараты очищенного вируса в градиенте плотности перколла, в фазе маркёра DMB-6, с концентрацией общего белка 0,3 - 0,5 мг/см3 и титром в РДП -1:16-1:32.

5.2.10. Получение гибридом, продуцирующих моиоклопальпые антитела к антигенам вируса инфекционного ларинготрахеита птиц5.2. К). 1. Иммунизация мышеи линии BALB 'сМышей линии BALB/c иммунизировали препаратами частично очищенного вируса ИЛТ (клон "НТ" штамма "ЦНИИПП"), полученными из 10%-ной суспензии гомогената ХАО КЭ (см. Концентрирование и очистка вируса ИЛТ птиц). Схема иммунизации включала 6 инъекций материала с интервалом 14 суток. Первая инъекция - подкожно в дозе 50 мкг (по белку) на мышь в сопровождении неполного адъюванта Фрейнда. Вторая, третья, четвертая и пятая инъекции - подкожно, с интервалом между инъекциями в 14 суток провели в той же дозе. Последняя, шестая, инъекция - внутриселе-зеночная (бустер-доза) в дозе 100 мкг (по белку).

Для контроля качества иммунизации мышей сыворотки, полученные общепринятым методом, исследовали на активность и специфичность в непрямом ТФ ИФА в планшетах с сорбированными препаратами частично очищенного вируса ИЛТ в разведении 1:2000, и с использованием перокси-дазного конъюгата антимышиных иммуноглобулинов кролика. Титр антител сывороток крови иммунизированных мышей BALB/c - 1:16000 - 1:32000.

5.2.10.2. ГибридизацияБыло проведено две гибридизации. Гибридизацию проводили на 4-е сутки после последнего введения антигена. Для слияния миеломы мыши SP2/0-Agl4.1 и лимфоциты селезенки брали в соотношении 1:10.

Слияние проводили в присутствии 45% ПЭГ-1450, содержащего 10% диме-тилсульфоксида. Процедуру гибридизации спленоцитов линейных мышей и клеток мышиной миеломы SP-2/0 проводили по методике предложенной Kohler G. с соавтор. [210] в модификации Fazekas de St.G.S. с соавтор. [140].

В результате гибридизации всего получено 262 гибридных клона: после первой гибридизации - 150 клонов, после второй - 112 клонов.

5.2.10.3. Скрининг и селекция стабильных аитителопродуцирующих и активнопролиферирующих тонов гибридомКлонообразование было отмечено на 3-7 сутки у всех гибридных клонов. Через 12-14 дней образовавшиеся клоны тестировали в непрямом варианте ТФ ИФА на предмет продукции ими МКА к вирусу ИЛТ. Скрининг гибридом проводили 3-4-кратно с интервалом в 2-3 суток.

Скрининг проводили непрямым ТФ ИФА в планшетах с сорбированным частично очищенным вирусом ИЛТ в рабочем разведении.

В качестве положительного контроля использовали: сыворотку крови мыши - донора спленоцитов для данного опыта в разведении 1:1000 - 1:2000, а также гипериммуннную сыворотку петуха (в разведении 1:100). В качестве отрицательных контролей использовали гибридомную среду, 10%-ную суспензию ХАО безлейкозных КЭ на ЗФР (рН 7,2-7,4) (в разведении 1:100), суспензию на ЗФР культуры клеток куриных фибробластов (в разведении 1:100).

Реакцию учитывали определением ОП при длине волны 405 нм после инкубации 40 мин. с субстратом при комнатной температуре.

Пробу считали положительной, если ОП субстратного раствора в лунке с исследуемыми пробами супернатантов культуральных жидкостей в 2,1 и более раза выше ОП раствора в лунке с отрицательным контролем. В качестве отрицательного контроля служили лупки контроля нормального антигена.

В результате 3-4-кратпого скрининга 262 гибридных клеток на специфическую антителопродукцию было выявлено 49 положительных, которые не реагировали с контролем нормального антигена. Пробы 49 гибридных клеток в планшете с антигеном вируса ИЛТ при учете реакции имели ОП субстратного раствора от 0,185 до 0,654, при оптической плотности в планшетах с нормальным антигеном (отрицательный контроль) - 0,038 - 0,078. Пробы культуральных жидкостей клеток этих 49 клонов по результатам скрининга можно считать положительными на специфическую антителопродукцию. Положительные клетки приняты были в дальнейшую работу для клонирования. Все остальные пробы от гибридных клеток при учете реакции имели ОП субстратного раствора от 0,128 до 0,230, при ОП в планшетах с нормальным антигеном (отрицательный контроль) - 0,086 - 0,159. Эти клетки продуцирующие антитела к нормальному эмбриональному антигену, и приняты как отрицательные.

5.2.10.4. Клонирование и культивирование in vitro клонов гибридом Клонирование проводили в полужидком агаре и методом лимитирующих разведений в условиях с содержанием в атмосфере камеры инкубатора 5% углекислого газа (СО2) и 95% относительной влажности.

Скрининг клонов на продукцию антител, специфичных к антигенам вируса ИЛТ проводили в непрямом ТФ ИФА после каждого этапа клонирования. После первой гибридизации из 150 клонов продукция антител выявлена у б клонов. После второй - из 112 клонов выявлено 10 положительных.

Из общего количества гибридных клонов было получено 16 положительных к вирусу ИЛТ: 4А5В7; 4А5В8; 4А5С2; 4А5С6; 4А5С10; 4D6D3; 4D6D4; 4D6D9; 4D6D10; 2А10ЕЗ; 1C10D10; 1H8G11; 1C4F3; 1С4В9; 1С4Е7; 1C4F12. Культуры этих клонов подвергали 2-3-кратному реклонированию в полужидком агаре и методом лимитирующих разведений при расчетной посевной концентрации 0,7-1,0 клетка на лунку. Для дальнейшей характеристики было отобрано 16 стабильных по культуральным свойствам и антитело-продукции клонов. Результаты представлены в табл. 8.

Таблица 8Стабильность полученных гибридом при клонированиип = 4Этапы клонирования Число клонов, сохранивших пролифериру-щую и антителопродуцирущую активность1-е, культивированием в полужидком агаре 492-е, лимитирующими разведениями 273-е, культивированием в полужидком агаре 165.2.10.5. Культивирование клонов гибридом in vivo и получение асцити-ческих жидкостей от мышей линии BALBcДля получения МКА в виде асцитических жидкостей клетки самых активных клопов вводили мышам интраперитонеально (в среде DMEM, в соотношении с неполным адыовантом Фрейнда - 1:1, в объёме 1 см3 одной мыши) и культивировали in vivo. Через 10-14 дней после инъекции клеток провели сбор асцитической жидкости у мышей. Клетки, ресуспендированные в криосреде, заморозили; а супернатанты асцитов клонов исследовали на активность в непрямом варианте ТФ ИФА.

5.2.10.6. Определение титра МКА в супернатаитах культуральных и иммуиоасцитическпх.жидкостей мышей в непрямом ТФ ИФАЛунки иолистирольных 96-луночных планшетов сенсибилизировалипрепаратами частично очищенного вируса ИЛТ в рабочем разведении, приготовленном на 0,05 М растворе КББ рН 9,4-9,6. Супернатанты культуральных и иммуноасцитических жидкостей клонов исследовали на активность в непрямом варианте ИФА в 2-кратных разведениях, начиная с 1:20 и с 1:500, соответственно. Комплекс "антиген-антитело" выявляли пероксидазным конъюгатом антимышиных иммуноглобулинов кролика, в рабочем разведении. Между каждым этапом инкубации планшеты отмывали трёхкратно ЗФР-Т, а после конъюгата - 5 раз. Обратные величины титров МКА в супернатаитах культуральных жидкостей гибридом были в интервале от 160 до 20480, а в иммуноасцитических - от 64000 до 8192000. Все клоны гибридом, продуцирующие МКА к вирусу ИЛТ, являются активными и стабильными антите-лопродуцентами предопределённой специфичности, так как титры антител соответствуют характеристике общих свойств гибридных клеток.

Таким образом, в результате клонирования и дальнейшего культивирования было отобрано 16 клонов гибридом, стабильно продуцирующих МКА к вирусу ИЛТ: 4А5В7, 4А5В8, 4А5С2, 4А5С6, 4А5С10, 4D6D3, 4D6D4, 4D6D9, 4D6D10, 2А10ЕЗ, 1C10D10, 1H8G11, 1C4F3, IC4B9, 1С4Е7, 1C4F12.

5.2.10.8. Изучение стабильности клонов гибридом при пассировании in vitro и in vivoКультуральные свойства гибридных клеток определяли при наблюдении световой микроскопией (при увеличении в 80 - 400 раз) за характером и интенсивностью роста клеток в полистироловых пластинах in vitro в процессе наработки препаративных количеств моноклональных антител. При коэффициенте пересева гибридом клонов (4А5В7; 4А5В8; 4А5С2; 4А5С6; 4А5С10; 2А10ЕЗ; 1C10D10; 1H8G11; 1C4F3; 1С4В9; 1С4Е7; 1C4F12) 1:3-1:4 и посевной дозе 100-150 тыс. клеток в 1 см3 частота пассирования составляет 1 раз в 3 - 4 дня. Индекс пролиферации за 48 часов составляет от 3,5 до 4,5.

При криоконсервировании гибридом определено, что выживаемость клеток, полученных при культивировании in vitro, после размораживания не ниже 80%, с полной сохранностью антителопродукции. Сохранность клеток, полученных пассированием на линейных мышах BALB/c, после размораживания не ниже 85%, с полной сохранностью антителопродукции. Культиви-роавние in vivo в брюшной полости мышей линии BALB/c 1-2 х 10б гибридом вызывает образование асцитных опухолей у 80 - 90 % мышей на 7-14 сутки. Объем асцитической жидкости, полученной от одной мыши, варьировал в пределах от 1,5 до 5,5 см3.

Таким образом, полученные клоны гибридом (4А5В7; 4А5В8; 4А5С2; 4А5С6; 4А5С10; 2А10ЕЗ; 1C10D10; 1H8G11; 1C4F3; 1С4В9; 1С4Е7; 1C4F12) подходят для использования в производственных условиях.

5.2.10.9. Определение классов и подклассов моноклональных иммуноглобулиновОпределение класса и подкласса МКА в виде супернатантов культуральных жидкостей проводили с использованием специальных наборов "Mouse monoclonal antibody isotyping reagents" и "Mouse monoclonal antibody isotyping kit" и по инструкции к его применению (Sigma, США), в ТФ ИФА.

В результате определено 10 клонов подкласса lg G1 (4А5В7; 4А5В8; 4А5С2; 4А5С6; 4А5С10; 4D6D3; 4D6D4; 4D6D9; 4D6D10; 2А10ЕЗ) и 6 клонов подкласса (1C10D10; 1H8GU; 1C4F3; 1С4В9; 1С4Е7; 1C4F12).

МКА подклассов lg G1 и lg М этих клонов использовали в работе.

5.2.10.10. Определение концентрации белка в глобулиновой фракции асцитовКонцентрацию белка в глобулиновой фракции асцитических жидкостей клонов гибридом определяли микрометодом по методике предложенной О.Н. Lovvry [248]. Определение концентрации белка необходимо для расчета количества нероксидазы хрена при приготовлении конъюгатов. Результаты определения концентрации общего белка (иммуноглобулина, lg) и необходимого количества пероксидазы хрена (ПХ) представлены в табл. 9.

Таблица 9Концентрация белка в глобулиновой фракции клонов гибридом п = 6iVLKA клона 1H8G11 4А5В7 4A5B8 1C4E7 1C4B9Концентрация, мг/см 7,2 7,12 7,12 10,34 9,575Класс lg IgM IgGl IgGl IgM IgMСоотношение lg : ПХ 2:1 3:1 3:1 2:1 2:1МКА клона 1C4F3 1C4F12 2A10E3 1C10D10 4D6D4Концентрация, мг/см3 9,3 8,81 5,75 7,045 7,1Класс lg IgM IgM IgGl IgM IgGlСоотношение lg : ПХ 2:1 2:1 3:1 2:1 3:1МКА клона 4D6D9 4D6D10 4A5C2 4A5C6 4A5C10Концентрация, мг/см3 7,16 5,11 8 8,555 7,435Класс lg IgGl IgGl IgGl IgGl IgGlСоотношение lg : ПХ 3:1 3:1 3:1 3:1 3:1В результате концентрации общего белка в препаратах глобулиновой фракции клонов гибридом варьировали в пределах от 5,11 мг/см3 до 10,34 мг/см3. Эти препараты иммуноглобулинов МКА использовали в дальнейшей работе при приготовлении пероксидазных конъюгатов.

Обозначения:N - нормальный эмбриональный антиген;S - специфический эмбриональный антиген вируса ИЛТ;NS - нормальная сыворотка крови петуха;SS - специфическая гипериммунная сыворотка крови петуха;М - маркеры;1 - МКА (культуральная жидкость) клона 1H8G11;2 - МКА (культуральная жидкость) клона 1C4F3;3 - МКА (культуральная жидкость) клона 1C10D10.

М N1 SI N2 S2 N3 S3 N4 S4i4— 60 кДа39 кДаРис. 9. Определение полипептидной специфичности в вестерн-блоттинге МКА клонов к полипептидам вируса ИЛТ.

5.2.10.12. Изучение преципитирующих свойств моноклональных антител в реакции диффузионной преципитации (РДП)При изучении преципитирующих свойств моноклональных антител кантигенам вируса ИЛТ в микровариапте РДП их исследовали с препаратами частично очищенного вируса ИЛТ, пробами экспертизпого материала, пробами органов от экспериментально заражённой птицы и в вакцинном материале. В качестве положительных коитролей использовали эмбриональные и органные (от клинически больных цыплят) препараты вируса ИЛТ вакцинных штаммов "ЦНИИПП" и "ВНИИБП", вирулентного штаммма "Богати-щевский", поликлональные антитела гипериммунной антисыворотки петуха. В качестве отрицательных - нормальный эмбриональный антиген (суспензии ХАО и ЭЭЖ незараженных КЭ, суспензия гомогената гортани и трахеи здоровых интактных цыплят), эмбриональные препараты вирусов болезни Ньюкасла, инфекционной бурсальной болезни, гриппа птиц, болезни Марека, чумы уток. Предварительные результаты реакции учитывали через 12, 24, 36 и 48 часов, и спустя 72 часа проводили окончательный учет реакции. Результаты представлены на рис. 10, 11 и в табл. 11, 12.

Только МКА клонов гибридом 1H8G11, 1C10D10, 1С4Е7, 1С4В9, 1C4F3, 1C4F12 образовывали чёткие линии преципитации, реагируя со всеми препаратами вакцинных штаммов и вирулентного штамма, и только с препаратами вируса ИЛТ очищенного в перколле, обработанных ультразвуком, и не реагировали с препаратами гетерологических вирусов (болезни Ныокасла, ИББ, гриппа птиц, болезни Марека, чумы уток). Все остальные МКА клонов не образовывали линий преципитации с препаратами вируса ИЛТ, так как МКА ни одного клона не обладали преципитирующими свойствами.

Пробы 10%-ной суспензии гомогената экспертизного материала, в пробах от экспериментально заражённой птицы не реагировали с МКА.Da Е X FG Н J^ Ъ < С.(04 О 'ОРис. 10. Оценка препаратов вируса ИЛТ в реакции диффузионной преципитации (РДП) с моноклональными антителами. Определение титра антигена вируса ИЛТ в РДП с МКА (асцитическая жидкость) клона 1C4F12. Окраска кумасси-0250.

Обозначения:i - МКА асцита к антигену (35 кДа) вируса ИЛТ, в разведении 1:100;2,3,4,5,6,7 - двукратные разведения (с 1:2 до 1:64) надосадка препарата частично очищенного вируса ИЛТ в перколле, обработанного ультразвуком;8 - специфическая сыворотка цыплят к вирусу инфекционной бурсальной болезни;9,10,11,12,13,14 - двукратные разведения (с 1:2 до 1:64) осадка препарата частично очищенного вируса ИЛТ в перколле, обработанного ультразвуком;15,16,17,18,19,20 - двукратные разведения препарата частично очищенного вируса ИЛТ в перколле;21 - специфическая сыворотка цыплят к вирусу болезни Ньюкасла.

М J 10 20 1 i У 19 1742 18 « * ♦Таблица 11"Шахматное" титрование в микроварианте РДП МКА и антигена вируса ИЛТ птиц в препаратах очищенного вируса и в экспертизном материалеп = 4№ J Характеристика антигена МКА (асцитическая жидкость) клонов* А. в. с. D. Е. F.

Таблица 12"Шахматное" титрование МКА клонов и антигена вируса ИЛТ вирулентного и вакцинных штаммов в микроварианте РДПп = 4Вируссодержащий материал Иммуноасцитические жидкости клонов № 1С4Е7 1:100 1H8G11 1:100 1C10D10 1:100 1С4В9 1:10 1C4F3 1:100 1C4F12 1:1001. Штамм "ЦНИИПП"1 1:161:32 1:161:32 1:161:32 1:161:32 1:161:32 1:161:322. Штамм "ЦНИИПП"2 1:81:16 1:81:16 1:81:16 1:81:16 1:81:16 1:81:16J. Штамм "ВНИИБП" 1:2- 1:4 1:2-1:4 1:2-1:4 1:2-1:4 1:2-1:4 1:2-1:4л Штамм 1:8- 1:8- 1:8- 1:8- 1:8- 1:8Ч. "Богатищевский"1 1:16 1:16 1:16 1:16 1:16 1:165. Штамм 1:8 1:8 1 я 1:8 1:8 1 я"Богатищевский"2 1.о Примечания: 1. Матровая расплодка 10%-ный гомогенат ХАО КЭ клон "НТ" штаммма "ЦНИИПП"; 2. 10%-ный гомогенат ХАО КЭ клон "НТ" штаммма "ЦНИИПП", 6,0 - 6,6 lg ЭИДзо/см"; 3. 10%-ный гомогенат ХАО КЭ штаммма "ВНИИБП", 5,0 lg ЭИД50/СМ3; 4. Штамм "Богатищевский", 10%-ный гомогенат ХАО КЭ, 5,0 lg ЭИД50/см3; 5. Штамм "Богатищевский", 10%-ный гомогенат трахеи цыплят, 4,0 lg ИД5о/см3.

В итоге при изучении преципитирующих свойств МКА было отмечено, что микровариант РДП не позволяет выявить антигены в эмбриональных и органных препаратах экспертизных полевых проб, и тем самым не может быть предложен в качестве метода диагностики ИЛТ.

5.2.11. Приготовление конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазойхренаСинтез конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой хрена (тип VI, Sigma) осуществляли по методу перйодатного окисления фермента до альдегидной формы и последующим восстановлением боргидридом натрия по методу Nakane Р.К. и Kavvaoi А. [234] и по модифицированному методу, предложенному Tijssen Р. [303].

Активность и рабочее разведение специфических конъюгатов МКА-ПХ определяли шахматным титрованием при разработке прямого "сэндвич"-варианта ТФ ИФА и прямого варианта иммуногистохимии.

5.2.12. Разработка модифицированных вариантов ИФА на основе моноклональных антител для лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц5.2.12.1. Разработка непрямого варианта иммуноферментного анализа (ТФ и ИФА) для обнаружения специфических антител к вирусу ИЛТ в сыворотках крови птицы, и МКА в супернатантах культуральных и иммуноасцитических жидкостейПри разработке непрямого варианта твердофазного иммуноферментного анализа как метода скрининга необходимо решить следующие задачи:- определить дозу сенсибилизации планшетов препаратами очищенного вируса ИЛТ;- определить рабочее разведение пероксидазных конъюгатов (антимышиного и антикуриного).

Данный метод использовали для выявления специфических антител МКА к антигенам вируса ИЛТ в супернатантах культуральных и иммуноасцитических жидкостей.

Дозу сенсибилизации планшетов препаратами очищенного вируса ИЛТ и рабочее разведение антимышиного пероксидазного конъюгата определяли "шахматным" титрованием в непрямом ТФ ИФА. (см. п. 5.2.7., Рис. 6.)В полистироловых планшетах для ИФА, с сорбированными препаратами очищенного вируса ИЛТ в разведении 1:2000, готовили ряды двукратных разведений на ЗФР-Т супернатантов культуральных (в разведении с 1:160) и иммуноасцитических (с 1:500) жидкостей, отрицательных и нормальных сывороток. В качестве положительных контролей использовали специфические сыворотки птиц, а также сыворотки линейных мышей - доноров лимфоцитов после введения бустер-дозы антигена (в разведении 1:2000). В качестве отрицательных контролей использовали нормальную сыворотку мыши, гибри-домную среду, МКА к вирусу гриппа птиц, МКА к вирусу болезни Ньюкасла. Нормальные сыворотки получали из крови незаражённых, клинически здоровых интактных мышей.

За титр антител в исследуемых супернатантах культуральных и иммуноасцитических жидкостей принимали наивысшее их разведение, при котором ОП субстратного раствора в лунке в 2,1 и более раза выше ОП в лунке с отрицательным контролем.

В итоге можно сделать заключение о том, что разработан непрямой вариант ТФ ИФА с использованием препаратов очищенного вируса ИЛТ, сорбированных на твердой фазе полистироловых планшетов, и пероксидазных коныогатов антивидовых иммуноглобулинов (протеина А) для выявления антител в сыворотках крови кур, кроликов и морских свинок, а также для выявления МКА в культуральных и иммуноасцитических жидкостях с целью скрининга антителопродуцентов клонов гибридом.

5.2.12.2. Разработка иммуиогистохимии (иммунопероксидазного метода) (ИГХ, ИПМ) на основе МКА для обнаружения вируса ИЛТ в мазках-отпечатках пораженных органов птиц5.2.12.2.1. Разработка непрямого варианта иммуиогистохимииПри отработке непрямого варианта иммуиогистохимии (ИГХ, иммунопероксидазного метода (ИПМ)) определяли применимость супернатантов культуральных и (или) иммуноасцитических жидкостей клонов гибридом 4А5В8, 2А10ЕЗ, 1C4F12, 1H8G11 и 1C10D10 с целью выявления вируса ИЛТ в клетках на мазках-отпечатках со слизистой оболочки гортани и трахеи от экспериментально инфицированных цыплят и кур и в пробах экспертизного материала от клинически больных птиц."Шахматным" титрованием MICA в виде двукратных разведений культуральных супернатантов (от 1:20 до 1:500) и иммуноасцитических (от 1:500 до 1:8000) жидкостей клонов, приготовленных на ЗФР рН 7,2 - 7,4, и разведений антимышиного пероксидазного конъюгата (от 1:200 до 1:800) определяли их рабочие разведения для обнаружения вируса ИЛТ в зараженных клетках. Мазки-отпечатки приготовлены на предметных стёклах, подготовленных по общепринятой технике, для гистологической техники.

Для определения рабочего разведения супернатантов культуральных и иммуноасцитических жидкостей клонов в непрямом методе ИГХ в опыте использовали мазки-отпечатки со слизистой оболочки гортани и трахеи от инфицированных и здоровых (в качестве контроля) птиц, в качестве отрицательного контроля служили мазки-отпечатки слизистой трахеи цыплят больных болезнью Ньюкасла.

Результаты гистохимического метода учитывали световой микроскопией при увеличении в 250 - 400 раз. В мазках-отпечатках как от инфицированных клинически больных, так и от неинфицированпых цыплят, во всём поле зрения наблюдалось неспецифическое диффузное разлитое окрашивание от желтого до светло-коричневого цвета различной интенсивности. Возможной причиной фонового окрашивания служило неспецифическое взаимодействие антимышиного пероксидазного конъюгата со структурными элементами тканей гортани или трахеи цыплят.

Поэтому четкой картины различимых границ инфицированных и неинфицированпых клеток не наблюдалось. Возможной причиной диффузногоокрашивания могла быть неспецифическая сорбция антимышиных иммуноглобулинов кролика на поверхность предметного стекла,В результате из 52 экспертизных проб гортани и трахеи больних инфекционным ларинготрахеитом ИГХ было выявлено 12 положительных.

В связи с неспецифической реакцией на мазках-отпечатках с использованием антимышиных иммуноглобулинов кролика непрямой вариант ИГХ имел низкую чувствительность.

5.2.12.2.2. Разработка прямого варианта иммуиогистохимииПри отработке прямого варианта ИГХ определяли применимость пероксидазных конъюгатов на основе МКА клонов гибридных клеток 4А5В8, 2А10ЕЗ, 1C4F12, 1H8G11 и 1C10D10 с целью выявления вируса ИЛТ в мазках-отпечатках со слизистой оболочки гортани и трахеи от инфицированных птиц. Определяли титр ПХ-конъюгатов на основе МКА для обнаружения вируса ИЛТ в зараженных клетках. Мазки-отпечатки приготовлены на предметных стёклах для гистологической техники."Шахматным" титрованием конъюгатов МКА определяли оптимальное разведение (от 1:500 до 1:8000). Для определения рабочего разведения конъюгатов в прямом варианте ИГХ в опыте использовали мазки-отпечатки со слизистой оболочки гортани и трахеи от инфицированных и здоровых (в качестве контроля) птиц, в качестве отрицательного контроля служили мазки-отпечатки слизистой трахеи цыплят больных болезнью Ньюкасла. При этом определяли специфичность и чувствительность прямого варианта ИГХ.

После двукратной отмывки в ЗФР-Т не связавшегося конъюгата на мазки-отпечатки наносили раствор субстрата З-амино-9-этилкарбозола.

Результаты ИГХ (представлены па рис. 12 - 17) учитывали световой микроскопией при увеличении в 250 - 400 раз.

Рис. 12. Иммуногистохимия на основе МКА клон 1H8G11. Мазок-отпечаток воспалительного экссудата просвета гортани и трахеи больного цыпленка. Образование сетчатой структуры клеток эпителия слизистой оболочки.

Рис. 13. Иммуногистохимия на основе МКА клон 2А10ЕЗ. Мазок-отпечаток слизистой оболочки трахеи больного цыпленка на границе здоровой (слева) ткани и участка ткани слизистого эпителия, вовлеченного в воспалительный процесс (справа). Стрелками указаны инфицированные клетки эпителия слизистой оболочки трахеи.*ViУ'.

ЕдУДЭД "IV TШ1t" tM' v; ^Tj wЖ%Я Л4#f■ ШШ * ♦ -М' «Рис. 14. Иммуногистохимия на основе МКА клон 1C10D10. Мазок-отпечаток слизистой оболочки трахеи больного цыпленка. Стрелками указаны инфицированные клетки эпителия слизистой.

Рис. 15. Иммуногистохимия на основе МКА клон 1H8G11. Мазок-отпечаток слизистой оболочки трахеи больного цыпленка. Стрелками указаны инфицированные клетки эпителия слизистой.пРис. 16. Иммуногистохимия на основе МКА клон 1C10D10. Мазок-отпечаток слизистой оболочки трахеи здорового цыпленка.

Рис. 17. Иммуногистохимия на основе МКА клон 1C10D10. Мазок-отпечаток воспалительного экссудата просвета гортани и трахеи больного цыпленка. Образование сетчатой структуры клеток эпителия слизистой оболочки.

1 ооПри специфическом связывании пероксидазных конъюгатов МКА с антигенами вируса ИЛТ в мазках-отпечатках наблюдается характерное красно-коричневое окрашивание инфицированных клеток и экссудата из полости поражённых органов. В мазках-отпечатках проб слизистой гортани и трахеи и проб (соскобов) экссудата из полости гортани и трахеи наблюдается интенсивное красно-коричневое окрашивание десквамированных, дегенерирован-ных и мертвых клеток эпителия. Инфицированные клетки встречаются одиночно и группами, цельными участками слизистой, в виде отдельных больших фокусов, а также в виде сетчатой структуры. В мазках-отпечатках органов от неинфицированных цыплят окрашивания не обнаруживали.

За титр конъюгата принимали его максимальное разведение, которое выявляет специфический антиген. Результаты определения рабочего разведения пероксидазных конъюгатов на основе МКА представлены в табл. 13. Прямым вариантом иммуногистохимии определили активность конъюгатов МКА клонов 4А5С6, 4А5В8 и 2А10ЕЗ - 1:1000, 1C4F12 - 1:2000, клонов 1H8G11 и 1C10D10 - 1:4000. Рабочее разведение составило, соответственно, 1:500, 1:500,1:1000, 1:2000 и 1:2000.

Таблица 13Рабочее разведение конъюгатов МКА-ПХ в прямом вариантеиммуногистохимии для выявления антигена п = 2Показатели 1H8G11 1C4F12 4А5В8 2А10ЕЗ 1C10D10Активность конъюгата МКА-ПХ 1:4000 1:2000 1:1000 1:1000 1:4000Рабочее разведение конъюгатов 1:2000 1:1000 1:500 1:500 1:2000Результаты определения чувствительности (в %) и специфичности прямой ИГХ представлены в табл. 14. В результате определения чувствительности и специфичности установлено, что при использовании пероксидазных конъюгатов МКА клонов 4А5В8, 2А10ЕЗ, 1C4F12, 1H8G11 и 1C10D10 прямой вариант ИГХ позволяет обнаружить в зараженных клетках вирус.

ИГХ исследовали материал экспериментально инфицированных птиц -25 положительных проб из 52. Наличие вируса в пробах экспериментально инфицированных птиц подтверждено вирусовыделением на КЭ (33 положительных из 52), позднее - "сэндвич"-вариаптом ТФ ИФА (в 52 - из 52).

Прямой вариант ИГХ для выявления вируса в исследованных пробах патологического материала имеет высокую специфичность, но при этом -низкую диагностическую чувствительность (около 43,7%). Этот недостаток ограничивает его применение для широкомасштабных исследований проб.

5.2.12.3. Разработка "сэндвич "-варианта ТФ ИФА для выявления антигенаПервоначальными задачами, стоящими при разработке метода, были:- определение режима инкубации планшетов при сенсибилизации МКА и при постановке реакции;- определение рабочей дозы сенсибилизации МКА каждого клона;- определение рабочего разведения антигена;- определение рабочего разведения конъюгата МКА-ПХ.

Определение рабочей дозы сенсибилизации МКА каждого клона и определение рабочего разведения антигена.

После этого в лунки добавляли по 0,1 см3 рабочего субстратного раствора АБТС. Через 40 мин. определяли ОП раствора при длине волны 405 нм.

Определение рабочего разведения конъюгата МКА с пероксидазой хрена "шахматным" титрованием.

Проба считается положительной, если ОП субстратного раствора в лунке в 2,1 и более раза выше ОП в лунке с отрицательным контролем.

Дозой сенсибилизации и титром конъюгата считали их наибольшие разведения, в которых ОП продукта реакции составляла > 1,0 единицу ОП(аналогично характеристикам конъюгатов фирмы Sigma). Рабочими разведениями конъюгатов МКА принимали их титры при ОП > 1,0.

Результаты определения рабочей дозы сенсибилизации МКА, титров конъюгатов представлены на рис. 18-32 и в табл. 15.

Из полученных данных исследований по определению титра и рабочего разведения пероксидазных конъюгатов МКА можно сделать заключение о том, что наиболее активными и стабильными были конъюгаты клонов 1H8G11, 4А5В7, 4А5В8,1С4Е7, 1С4В9, 1C4F3, 1C4F12, 2А10ЕЗ, 1C10D10.

В итоге по результатам "шахматного титрования" можно сделать заключение о том, что определены титры конъюгатов в "сэндвич"-варианте ТФ ИФА, подобраны рабочие разведения сорбированных (захватывающих) антител, рабочие разведения конъюгатов МКА (детектирующих антител), режимы и условия инкубации компонентов реакции.

5.2.12.4. Определение чувствительности и специфичности "сэндвич"-варианта ТФ ИФА на основе моноклональных антителДля определения чувствительности и специфичности "сэндвич"-варианта ТФ ИФА использовали специфические, нормальные и гетерологич-ные антигены. Определяли титр специфических антигенов вируса ИЛТ птиц.

Обнаружение антигенов вируса ИЛТ в пробах вакцинного материала, препаратах очищенного вируса и в полевых пробах патологического материала.

Для сенсибилизации планшетов использовали МКА всех 16 клонов гибридом в рабочих разведениях; для выявления связавшегося антигена использовали рабочие разведения конъюгатов МКА-ПХ гибридом.изПри постановке "сэндвич"-варианта ТФ ИФА использовали следующие антигены в качестве специфических и контрольных (гетерологичные - антигены возбудителей других вирусных болезней птиц):- специфические антигены - эмбриональный антиген, полученный от зараженных КЭ вирусом ИЛТ (штамм "ЦНИИПП" (клон "НТ") и штамм "ВНИИБП") в виде 10%-ных суспензий ХАО в ЗФР и суспензий ЭЭЖ в ЗФР, препараты очищенного вируса ИЛТ штамма "ЦНИИПП" в ЗФР;- нормальный антиген, в виде 10%-ной суспензии гомогената ХАО и аллантоисная жидкость незараженных безлейкозных КЭ, в разведении 1:2;- антиген вируса инфекционной бурсальной болезни, шт. БГ, в виде 10%-ной суспензии гомогената бурсы больных цыплят, в разведении 1:2;- антиген вируса гриппа птиц, штамм А/цыплёнок/Росток/29 (H7N7), штамм А/крачка/Южная Африка/82 (H5N2), штамм А/курица/Росток/34 (H7N1), в виде 10%-ной суспензии ЭЭЖ инфицированных безлейкозных КЭ, в разведении 1:2;- антиген вируса болезни Ныокасла (штамм "La Sota") в виде восстановленного препарата сухой вирусвакцины, в разведении 1:2;- антиген вируса болезни Марека (штамм "FC-126") в виде восстановленного препарата сухой вирусвакцины, в разведении 1:2;- антиген вируса чумы уток (штамм "АКВ-ВНИИВВиМ") в виде восстановленного препарата сухой вирусвакцины, в разведении 1:2.

Постановка реакции описана в разделе Материалы и методы.

Антиген вносили в виде ряда разведений в ЗФР-Т от цельного.

Для сопоставления результатов со стандартным вариантом ТФ ИФА проводили титрование вируса в патологическом материале.

Результаты выявления антигенов вируса ИЛТ в различных вакцинных препаратах, препаратах очищенного вируса, пробах экспертизного материала и экспериментально инфицированных животных "сэндвич"-вариантом ТФ ИФА представлены в табл. 16-20.

В "сэндвич"-вариаите ИФА на основе МКА апробированы пары МКА всех 16 клонов, в таблицах указаны только 6 клонов (1H8G11, 4А5С10, 2А10ЕЗ, 1С4Е7, 4А5С6, 4А5В8) различной полипептидной специфичности. Все остальные 10 клонов МКА не имеют отличий при определении специфичности и выявлении антигена вируса в различных пробах материала. Из представленных в табл. 16-20 данных следует, что "сэндвич"-вариант ТФИФА позволяет обнаружить антигены вируса ИЛТ во всех опытных материалах в сравнении с методом вирусовыделения на КЭ и цыплятах, и РДП с использованием специфических поликлональных и моноклональных антител. Результаты определения чувствительности представлены в табл. 19, специфичности - в табл. 20.

Вариант является чувствительным (диагностическая чувствительность - 88,9% - 96,1%)) и специфичным (диагностическая специфичность - 100%) в сравнении с вирусовыделением и прямым вариантом иммуиогистохимии. Поэтому "сэндвич"-вариант ТФ ИФА может быть предложен для диагностики ИЛТ в широких масштабах.

Чувствительность "сэндвич'-варианта ТФ ИФА при выявлении антигенов вируса ИЛТ в полевых пробах гортани и трахеи от больных цыплятп = 4№ Характеристика патматериала, полученного от цыплят возраста 45 - 60 дней Доза контрольного заражения и/тр. вирулентным штаммом "Богатищевским" Вирусо-выдсление на КЭ, выявле-ных/всего Выявление антигенов вируса в "сэндвич" - варианте ТФ ИФА Доля птицы, у которых выявлены антигены, выявленных/всего, гол. %1. Вакцинированных и/тр. против ИЛТ вакциной [штамм "ЦНИИПП") н.и. 1/10 8/10 88,92. вакцинированных п/тр. против ИЛТ вакциной (штамм "ЦНИИПП") 1000 ИДзо/см3 1/10 12/14 92,3л Не вакцинированных против ИЛТ 1000 ИДм/см3 9/10 25/25 96,14. 10%-ная суспензия гомогената трахеи цыплят (ПФ "Белгородская") Титр в ИФА 1:64 - 1:128 4/5 5/5 83,35. 10%-ная суспензия ХАО 'ПФ "Костромская") Титр в ИФА 1:128 - 1:256 8/10 10/10 83,3Примечание: н.и. - не инфицировали.

5.2.12.5. Идентификация антигенов вируса ИЛТ "сэнович "-вариантом ТФ ИФА в пробах патологического материала, обработанных детергентамиС целью повышения чувствительности "сэндвич'-варианта ИФА при выявлении в вируссодержащем материале антигенов вируса ИЛТ для обработки проб использовали детергенты; дезоксихолат натрия, Nonidet Р40, Triton Х-100 и додецилсульфат натрия. После обработки проб патологического материала детергентами возможно наиболее полное высвобождение вируса из клеточного детрита, что тем самым повысит концентрацию вируса.

Подготовка проб патологического материала. Суспензии проб исследуемых образцов смешивали в равных объёмах с готовыми растворами детергентов (конечные концентрации детергентов в суспензии пробы - 0,5% и 1%), тщательно перемешивали и выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем смеси проб с детергентами центрифугировали при 5000 об/мин. в течение 30 мин. Надосадок использовали как исследуемый образец.

Ход опыта. Готовили ряды двукратных разведений обработанных проб на ЗФР-Т-казеин и вносили их в вертикальные ряды планшета. Для определения влияния каждого из детергентов на сорбированные МКА на твердой фазе планшета в вертикальные ряды также вносили их двукратные разведения раствора в ЗФР-Т-казеин. Планшеты инкубировали в течение часа при комнатной температуре. После трёхкратной отмывки в ряды, в которых были разведения детергентов, вносили двукратные разведения специфического и нормального антигена (от 1:32 до 1:4096); планшеты инкубировали в течение 1 часа. На 45 мин в лунки планшета вносили конъюгат МКА-ПХ в рабочем разведении. После 4-5 кратной отмывки планшетов вносили субстратныйраствор АБТС, инкубировали при комнатной температуре.

За титр антигена принимали наибольшее его разведение, в лунке которого ОГ1 субстратного раствора в 2,1 и более раза выше ОП раствора в лунке с отрицательным контролем (нормального антигена). Результаты по определению активности антигена вируса в пробах, обработанных детергентами различной концентрации представлены в табл. 21.

Таблица 21Активность антигена вируса ИЛТ в "сэндвич"-варианте ТФ ИФА после обработки детергентами п=10Детергент Конечная концентрация детергента в суспензии пробы 0,5% 1%Титр антигена в пробе после обработки Дезоксихолат натрия 1:2048 - 1:4096 1:2048 - 1:4096Додецилсульфат натрия 1:2048 - 1:4096 1:2048 - 1:4096Nonidet Р40 1:2048 - 1:4096 1:2048- 1:4096Triton Х-100 1:2048 - 1:4096 1:2048- 1:4096Положительный контроль (без обработки дете-рентами) 1:2048 - 1:4096 Отрицательный контроль 0 Из представленных в табл. 21 данных следует, что ни один из апробированных детергентов при обработке вируссодержащего материала в этих концентрациях не влияет на титр антигена вируса, и не повышает чувствительности варианта.

Титром конъюгатов считали их наибольшие разведения, в которых ОП >1,0. Результаты "шахматного" титрования представлены в табл. 22.

5.2.12.8. Разработка варианта ингибирования ТФ ИФА для выявления специфических антител в поликлональных сыворотках птицыЭтот вариант ИФА отрабатывали с целью использования для выявления специфических антител к антигенам вируса ИЛТ в сыворотках больных и вакцинированных птиц.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Чурин, Александр Иванович

7. Выводы

1. Модифицирована схема получения препаратов частично очищенного специфического эмбрионального антигена вируса ИЛТ (клоп "НТ" штамма "ЦНИИПП"), заключающаяся в последовательном концентрировании и очистке вируссодержащей суспензии ультрацентрифугированием в ступенчатом градиенте (30, 35, 40, 45%) сахарозы и в градиенте перколла. Препараты очищенного вируса обладают активностью в РДП в титрах 1:4 - 1:32 и в "сэндвич"-варианте ТФ ИФА - 1:1024 - 1:8192.

2. Получены 16 новых клонов гибридом, продуцирующих специфические МКА к пяти полипептидам вируса ИЛТ с молекулярными массами 30, 34, 35, 39 и 60 кДа.

3. Разработан прямой вариант гистохимического иммуноферментного метода на основе МКА к полипептидам (30, 35, 39 кДа) вируса ИЛТ. Метод является специфичным, позволяет выявлять антигены вируса ИЛТ в мазках-отпечатках слизистой гортани и трахеи больных цыплят и кур, но его диагностическая чувствительность 43,7%.

4. Разработан "сэндвич"-вариант ТФ ИФА на основе МКА к полипептидам (30, 34, 35, 39, 60 кДа) вируса ИЛТ. Метод является специфичным и чувствительным, и позволяет выявлять антигены вируса ИЛТ в экстраэмбриональной жидкости и суспензии гомогената хорио-аллантоисной оболочки куриных эмбрионов, в пробах гортани и трахеи больных цыплят и кур.

5. Разработан непрямой "сэндвич"-вариант ТФ ИФА на основе МКА к полипептидам (30, 34, 35, 39, 60 кДа) вируса ИЛТ. Метод является специфичным и чувствительным, и позволяет выявлять антитела в сыворотках крови больных и вакцинированных против ИЛТ цыплят.

6. Разработанные на основе МКА прямой и непрямой "сэндвич"-варианты ТФ ИФА апробированы на полевых материалах и могут быть предложены для применения в схеме лабораторной диагностики ИЛТ.

8. Практические предложения

Подготовлены "Методические указания по диагностике инфекционного ларинготрахеита птиц твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител" и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ 18 июля 2006 года.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чурин, Александр Иванович, Покров

1. Айткен, И.Д. Болезни птицы / И.Д. Айткен, Д.Дж. Александер, У.Х. Аллан; под ред. и с предисл. В.П. Карпова М.: Агропромиздат, 1985. - С. 124 - 128.

2. Бабкин, В.Ф. Инфекционный ларинготрахеит / В.Ф. Бабкин // Респираторные болезни с.-х. животных. М: Колос, 1986. - С. 143 - 150.

3. Бабкин, В.Ф. К вопросу эпизоотологии и течения инфекционного ла-ринготрахеита кур в хозяйствах УССР / В.Ф. Бабкин // Ветеринария: Респ. межвед. темат. науч. сб. Вып. 14. - Киев, 1967,- С. 28 - 32.

4. Башкиров, О.Г. Моноклональные антитела в диагностике ротавирусной инфекции / О.Г. Башкиров, Т.В. Булгарина // Тез. докл. мол. ученых инта микробиол. АН Латв. ССР. Рига, 1987. - С. 9.

5. Бирман, Б.Я. Инфекционный ларинготрахеит птиц / Б.Я. Бирман, К.К. Дягилев, И.Н. Громов. Минск: НЧУП «Бизнесофсет», 2002. - 72 с.

6. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрип и др. М.: ВНИТИБП, 1998.-С. 672-683.

7. Герасимова, Н.И. Разработка серологического метода контроля напряженности иммунитета у птиц, аэрозольпо вакцинированных против инфекционного ларинготрахеита: Автореф. дис. канд. вет. наук / Н.И. Герасимова / ВНИИВВиМ. Покров, 1982. - 22 с.

8. Глобенко, Л.А. Биотехнология получения и применения противовирусных моноклональных иммуноглобулиновых препаратов: дис. д-ра биол. наук / Л.А. Глобенкою / ВНИИЗЖ. Владимир, 1998. - 315 с.

9. Гусева, Е.В. Вирусные болезни кур / Е.В. Гусева, Т.А. Сатина. Владимир, 1999. - 59 с.

10. Гусева, Е.В. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний животных: Обзор литературы. / Е.В. Гусева, Т.А. Сатина / ВНИИЗЖ. Владимир, 1995.-59 с.

11. Данченко, Л. К. Изучение некоторых биологических свойств штаммов вируса инфекционного ларинготрахеита кур: автореф. дис. канд. вет. наук / Л. К. Данченко. Персиановка, 1968. - 19 с.

12. Егоров, A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев М.: Высш. шк., 1991. - 288 с.

13. Ерохина, JT.M. Патологоанатомическая диагностика вирусных болезней животных / Л.М. Ерохина. М.: Колос, 1984. - 27с.

14. Зубов, Н.Д. Некоторые вопросы эпизоотологии и профилактики инфекционного ларинготрахеита птиц: автореф. дис. канд. вет. наук / Н.Д. Зубов.-М.,- 1969,- 17 с.

15. Иммунологическая эффективность вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита птиц /10.С. Дутко и др. // Ветеринария. 1991. -№3.-С. 32 - 34.

16. Использование ТФ ИФА для выявления антител к вирусу ИЛТ / Т.С. Конвисарева и др. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: сб. статей междунар. науч. конф. молодых ученых. ВНИТИБП. Щелково, 2001. - С. 46 - 50.

17. Конвисарева, Т.С. Разработка средств и методов лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита кур: автореф. дис. канд. биол. наук. / Т.С. Конвисарева. Щелково, 2001. - 23 с.

18. Котляр, П.10. Иммуноферментный метод диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц: автореф. дис. канд. вет. наук / П.Ю. Котляр. -С.-Петербург, 1995.- 18 с.

19. Кучкаров, Б.К. Люминесцентный метод выявления вирусного антигена инфекционного ларинготрахеита кур: автореф. дис. канд. вет. наук. / Кучкаров, Б. К. Тарту, 1971. - 11 с.

20. Лакин, Г.Ф. Биометрия/Г.Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.

21. Лашкевич, В.А. Использование моноклональных антител в вирусологии / В.А. Лашкевич // Вопросы вирусологии. 1983. - № 6. - С. 648-654.

22. Лежава, Г.А. Изучение биологических свойств вируса инфекционного ларинготрахеита птиц / Г.А. Лежава, А.Я. Урушадзе // Вопросы ветеринарной вирусологии. Т. I. - М.: Колос, 1964. - С. 401 - 412.

23. Луговцев, В.Ю. Классификация и номенклатура вирусов позвоночных./ пер. и ред. В.Ю. Луговцев, Д.А. Васильев // Ульяновская ГСХА, Ульяновск, 2002.-С. 31 -41.

24. Луницин, А.В. Разработка средств и методов лабораторной диагностики эпизоотической геморрагической болезни оленей: автореф. дис.канд. вет. наук/ Луницин Андрей Владимирович. Покров, 1993. - 22 с.

25. Малахова, И.В. Хранение и восстановление гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к вирусным антигенам / И.В. Малахова, Е.В. Зорин, А.С. Новохатский // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1985,-№3.-С. 41 -44.

26. Мамчур, Б.А. Изучение инфекционного ларинготрахеита индеек в экспериментальных и естественных условиях: автореф. дис. канд. вет. наук / Б.А. Мамчур. Одесса, 1969. - 19 с.

27. Новохатский, А.С. Клонирование гибридом методом предельных разведений / А.С. Новохатский, И.В. Малахова, Т.Т. Михеева // Вопр. вирусол. 1985. -№ 5. - С. 48-49.

28. Новохатский, А.С. Получение асцитических препаратов моноклональных антител. / А.С. Новохатский и др. // Вопросы вирусологии. 1985. - № 6. - С. 749 - 753.

29. Носик, Д.Н. Диагностические препараты моноклональных антител для реакции прямой иммунофлуоресценции / Д.Н. Носик, М.Н. Корнеева, Н.Е. Литвинович // Молекулярная биология вирусов гриппа и гепатита.-Ч.2.-М., 1985.-С. 44-48.

30. Очистка вируса инфекционного ларинготрахеита птиц / B.C. Перзашке-вич и др. // Актуальные вопросы вет. вирусологии: тезисы науч.-практ. конф. / ВНИИВВиМ. Покров.-1994. - 185 с.

31. Перадзе, Т.В. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / под ред. Т.В. Перадзе, П. Халонена. М.: Медицина, - 1985. - 302 с.

32. Повышение специфичности иммуноферментного анализа за счет использования конъюгата на основе моноклональных антител / С.С. Ма-ренникова и др. // Вопросы вирусологии. 1986. - № 6. - С. 48 - 51.

33. Получение и характеристика моноклональных антител к структурнымбелкам вируса бешенства штамм "ТС-80" / В.В. Недосеков и др. // Доклады РЛСХН. 1999. - №4. - С. 38 - 40.

34. Прокофьева, М.Т. Биологические свойства вируса инфекционного ларинготрахеита кур / М.Т. Прокофьева, В.Ф. Бабкин // Ветеринария. -1967. №5.-С. 43 -45.

35. Старовойтов, Н.С. Идентификация вирусов оспы кур и инфекционного ларинготрахеита при смешанном инфицировании: автореф. дисс. канд. вет. наук. /Н.С. Старовойтов/ВНИИВВиМ. Покров, 1971. - 5 с.

36. Сюрин, В.Н. Диагностика вирусных болезней животных: справочник / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина М.: Агропромиздат, 1991. -90 с.

37. Сюрин, В.Н. Обнаружение вируса инфекционного ларинготрахеита кур при помощи флуоресцирующих антител / В.Н. Сюрин, М.А. Шесточен-ко, З.Я. Чистова // Вопросы ветеринарной вирусологии. М.: Колос, 1964.-С. 426 -430.

38. Сюрин, В.Н. Частная ветеринарная вирусология. Справочная книга. / В.Н. Сюрин, Н.В. Фомина М.: Колос, 1979. - 85 с.

39. Трефилов, Б.Б. Сравнительное изучение генетических признаков вакцинных. штаммов вируса инфекционного ларинготрахеита птиц: автореф. дис. канд. вет. наук/Б.Б. Трефилов. Тарту, 1972. -21 с.

40. Цыбанова, Т.С. Отработка условий получения специфического антигена вируса ИЛТ / Т.С. Цыбанова, B.C. Перзашкевич, Н.А. Власов // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: тезисы науч-практ. конф. / ВНИИЗЖ. Владимир, 1995. - С. 264 - 265.

41. Цыбанова, Т.С. Применение непрямого варианта твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу ИЛТ / Т.С. Цыбанова, Н.А. Власов,

42. B.Ц. Цыдыпов // Вирусные болезни с.-х. животных: тез. докл. Всерос. науч. практ. конф. - Владимир, 1995. - 265 с.

43. Чистова, З.Я. О вариантах вируса инфекционного ларинготрахеита птиц / З.Я. Чистова, В.Н. Сюрии // Вопросы ветеринарной вирусологии. Т. I - 1964. - С. 413 - 425.

44. Ямпикова, С.С. Получение моноклональных антител к вирусам гриппа /

45. C.С. Ямпикова, С.Н. Курочкин, Н.В. Гнучев // Вопросы вирусологии -1983.-T.28,N1.-С. 21-24.

46. A synthetic peptide induces long-term protection from lethal infection with herpes simplex vims 2 / E. Watari et al. // J. Exp. Med. 1987. - Vol. 165. -P. 459-470.

47. A unique avian hepatoma cell line for the cultivation of infective laryngotra-cheitis virus and for the expression of foreign genes with a mammalian / E. Scholz et al. // J. Virological methods. 1993. - Vol. 43. - P. 273-286.

48. Abbas, F. Comparison of diagnostic tests for infectious laryngotracheitis / F. Abbas, J.R. Andreasen// Avian Dis. 1996 - Vol. 40. - P. 290-295.

49. Abbas, F. Development of a polymerase chain reaction and a nonradioactive DNA probe for infectious laryngotracheitis vims / F. Abbas, J.R. Andreasen, M.W. Jackwood //Avian Dis. -1996 Vol. 40. - P. 56-62.

50. Abbas, F. Production of monoclonal antibodies against infectious laryngotracheitis virus of chickens and their use in an indirect immunofluorescence diagnostic test / F. Abbas // Oregon State University, Corvallis. 1992.

51. Abenes, G. Antigenic mapping and functional analysis of the F protein of newcastle disease virus using monoclonal antibodies / G. Abenes, H. Kida, R. Yanagavva // Arch. Virol. 1986. - Vol.90, N. 1-2. - P. 97-110.

52. Alexander, H.S. Analysis of infectious laryngotracheitis virus isolates from Ontario and New Brunswick by polymerase chain reaction / H.S. Alexander, D.W. Key, E. Nagy // Can. J. Vet. Res. 1998. - Vol. 62. - P. 68-71.

53. Alexander, H.S. Polymerase chain reaction to detect infectious laryngotracheitis vims in conjunctival swabs from experimentally infected chickens / H.S. Alexander, E. Nagy//AvianDis. 1997. -Vol. 41, №3 -P. 646-653.

54. An outbreak of infectious laryngotracheitis in California broilers / J.A. Linares et al. //Avian Dis. 1994. - Vol. 38. - P. 188-192.

55. Antigenic drift in type A influenza vims: Sequence differences in the hemagglutinin of Hong Kong (H3N2) variants, selected with monoclonal hybri-doma antibodies / W.G. Lawer et al. // Virology. 1979. - Vol.29, N1. - P. 226 - 237.

56. Antigenic relationship among strains of Ibaraki vims and epizootic haemor-rhagic disease virus studied with monoclonal antibodies / M. Sugiyama et al. II Res.Vet.Sci. -1989. -V 46, N 2. -P. 283-285.

57. Antigens of infectious laryngotracheitis herpesvirus defined by monoclonal antibodies / J.J. York et al.//Arch. Virol. 1990 - Vol. 115-P. 147-162.

58. Armstrong, W.H. A slide smear technique for the diagnosis of laryngotracheitis / W.H. Armstrong// Avian Dis. 1959. - Vol. 3. - P. 80-84.

59. Assembly pathway of avian infectious laryngotracheitis vims / P. Guo et al. // Am. J. Vet. Res. 1993. - Vol. 54. - P. 2031 - 2039.

60. Bagust, T. J., and J. S. Guy. Laryngotracheitis / Diseases of poultry, Iowa State University Press. Ames, 1997. - P. 527 - 539.

61. Bagust, T.J. Avian infectious laryngotracheitis: Virus-host interactions in relation to prospects for eradication / T.J. Bagust, M.A. Johnson // Avian Pathol. -1995. Vol.24. - P. 373-391.

62. Bagust, T.J. Laryngotracheitis (Gallid-l) herpesvirus infection in the chicken. 4. Latency establishment by wild and vaccine strains of ILT virus / T.J. Bagust // Avian Pathol. 1986. - Vol. 15. - P. 581-595.

63. Barhoom, S. Development of an inactivated vaccine against infectious laryngotracheitis (ILT) serological and protection studies / S. Barhoom, A. For-gacs, F. Solyom//Avian Pathol. -1986. - Vol 15, №2. - P. 213-221.

64. Baucke, R.B. Membrane proteins specified by herpes simplex viruses V. Identification of an Fc-binding glycoprotein / R.B. Baucke, P.G. Spear // J. Virol. 1979. - Vol. 32. - P. 779-789.

65. Beach, J.R. A filterable vims, the cause of laryngotracheitis of chickens / J.R. Beach // J. Exp. Med. 1931. - Vol.54. - P. 809-810.

66. Beach, J.R. Infectious bronchitis of fowls / J.R. Beach // J. Med. Assoc. -1926. Vol. 68.-P. 570-580.

67. Benton, W.J. The clinical and serological response of chickens to certain laryngotracheitis viruses / W.J. Benton, M.S. Cover, L.M. Greene // Avian Dis.-1958.- Vol. 2.-P. 383-396.

68. Beveridge, W.I.B. Infectious laryngotracheitis / W.I.B. Beveridge // "Animal Health in Australia", Australian Government Publishing Service, Canberra. -1981.-Vol. l.-P. 158-161.

69. BHV-1 adsorption is mediated by the interaction of glycoprotein gill with heparinlike moiety on the cell surface / K. Okazaki et al. // Virology. -1991,-Vol. 181.-P. 666-670.

70. Biggs, P.M. The world of poultry disease / P.M. Biggs // Avian Dis. -1982. -Vol. 11. P. 281-300.

71. Blacklaws, B.A. Specificity of the immune response of mice to herpes simplex virus glycoproteins В and D constitutively expressed on L cell lines / B.A. Blacklaws, A.A. Nash, G. Darby// J. Gen. Virol. 1987. - Vol. 68. - P. 1103- N14.

72. Bobokhidze, T.I. Peculiarities of mixed infection of colibacillosis and infectious laryngotracheitis of chickens (Eschenchia coli) / T.I. Bobokhidze // Bui. Vses. Inst. Eksp. Vet. -1982. Vol. 48 - P. 32-33.

73. Borst, G.H. Infectious laryngotracheitis in peacocks in the Netherlands / G.H.Borst, G.M. Lambers // Tijdschr Diergeneeskd. 1983. - Vol 1108. - P. 199 -200.

74. Brandly, C.A. Some studies on infectious laryngotracheitis. The continued propagation of the virus on CAM of the hen's egg / C.A. Brandly // J. Infect. Dis. 1935.-Vol.57.-P. 201-206

75. Brandly, C.A. Studies on certain filterable virus factors concerned with the egg propagation of infectious laryngotracheitis / C.A. Brandly // J. Am. Vet. Micr.- 1937,-Vol. 90.-P. 479-487.

76. Brandly, C.A. Studies on the egg-propagation of infectious laryngotracheitis and fowl pox / C.A. Brandly // J. Am. Assoc. 1936. - Vol. 88. - P. 587-599.

77. Braune, M.O. Standardization of the fluorescent antibody technique for the detection of avian respiratory viruses / M.O. Braune, R.F. Gentry // Avian Dis. 1985. - Vol. 9. - P.535-545.

78. Brown, J., Tracheal cryptospondiosis and herpesvirus infections laryngotracheitis an exploratory study / J. Brown, M.A Goodwin // Proc of 45th West Poult. Dis. Conf. Davis, California, 1996 - P. 79.

79. Brown, K.E. An amplified ELISA for the detection of parvovirus B19 IgM using monoclonal antibody to FITC / K.E. Brown, M.M. Buckley, B.J. Cohen // J. Virol. Meth. 1989. - Vol. 26. - P. 189-198.

80. Buckmaster, E. A. Characterization and physical mapping of an IISV-1 glycoprotein of 115x103 molecular weight / E.A. Buckmaster, U. Compels, and

81. A. Minson// Virology. 1984. - Vol. 139. - P. 408-413.

82. Burnet, F. Immunological studies with the infectious laryngotracheitis of fowls using the de egg technique / F. Burnet // J. Exp. Med. -1936. Vol. 63. -P. 685 - 701.

83. Burnet, F. The propagation of the vims of ii laryngotracheitis on the CAM of the developing / F. Burnet//Exp. Pathol. 1934. - Vol. 15. - P. 52-55.

84. Calnek, B.W. In vitro infection studies with infectious laryngotracheitis vims / B.W. Calnek, K.J. Fahey, T.J. Bagust // Avian Dis. -1986. Vol. 30. - P. 327-339.

85. Campbell, A.M. Monoclonal antibody and immunosensor technology / A.M. Campbell // Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. -1991,-Vol. 23.-P. 427.

86. Chang, P.W. An in vivo and in vitro study of infectious laryngotracheitis virus in chicken leukocytes / P.W. Chang, F. Sculco, V.J. Yates // Avian Dis. -1977,-Vol. 21.-P. 492-500.

87. Characterization of the envelope proteins of pseudorabies virus / H.T. Hampl et al. // J. Virol. 1984. - Vol. 52. - P. 583 - 590.

88. Characterization of monoclonal antibodies against infectious laryngotracheitis virus / F. Abbas et al. // Avian Dis. 1996. - Vol. 40 - P. 49 - 55.

89. Churchill, A.E. The use of chicken kidney tissue culture in the study of the avian viruses of Newcastle disease, infectious laryngotracheitis and infectious bronchitis / A.E. Churchill // Res. Vet. Sci. 1965,- Vol. 6,- P. 162-169.

90. Clarke, D.H. Technique for hemagglutination and hemagglution inhibition with artropod-borne viruses / D.H. Clarke, J. Casal // Amer. J. of Trop. Med. And Hyg. 1958. - Vol. 7. - P. 561-573.

91. Clavijo, A. Differentiation of infectious laryngotracheitis vims strains by polymerase chain reaction / A. Clavijo, E. Nagy // Avian Dis. -1997. Vol. 41. -P. 241-246.

92. Comparison of histopathology to the direct immunofluorescent antibody test for the diagnosis of infectious laryngotracheitis in chickens / M.A. Goodwinet al. //Avian Dis. 1991. - Vol. 35. - P. 389-391.

93. Comparison of serological tests for the detection of antibodies to infectious laryngotracheitis virus / B.M. Adair et al. // Avian Pathol. 1985. - Vol.14. -P. 461-469.

94. Comparison of the genomes of 15 avian herpesvirus isolates by restriction endonuclease analysis / B. Gunther et al. // Avian Pathol. 1997. - Vol. 26. -P. 305-316.

95. Comparison of the genomic short regions of a vaccine strain (SA-2) and a virulent strain (CSW-1) of infectious laryngotracheitis virus (Gallid herpesvirus 1) / H.M. Trist et al. // Avian Dis. 1996. -Vol. 40. - P. 130-9.

96. Comparison of tracheal histopathology and scanning electron microscopy of infectious laryngotracheitis / R.C. Bayer et al. // Poult. Sci. 1977. - Vol. 56. - P. 964 - 968.

97. Complete nucleotide sequence of infectious laryngotracheitis virus (gallid herpevirus 1) ICP4 gene / M.A. Johnson et al. // Vims Res. 1995. - Vol. 35.-P. 193 - 204.

98. Construction of recombinant avian infectious laryngotracheitis virus expressing the p-galactosidase gene and DNA sequencing of the insertion region / P. Guo et al. // Virology. 1994. - Vol. 202. - P. 771-781

99. Courtney, R. J. Vims-specific components of herpes simplex virus involved in the immune response / R.J. Courtney // "Immunobiology of Herpes Simplex Vims Infection", CRC Press, Boca Raton. 1984. - P. 34 - 44.

100. Cover, M.S. The biological variation of infectious laryngotracheitis vims / M.S. Cover // Avian Dis. 1958. - Vol. 2. - P. 375-383.

101. Cover, M.S. The early history of infectious laryngotracheitis / M.S. Cover // Avian Dis. 1996. -Vol. 40, №3. - P. 494-500.

102. Crawshavv, G.J. Infectious laryngotracheitis in peafowl and pheasants / G.J. Crawshaw, B.R. Boycott // Avian Dis. -1982. Vol. 26. - P. 397-401.

103. Cmickshank, J. G. The fine structure of infectious laryngotracheitis vims / J.G. Cruickshank, D.M. Berry, B. Hay // Virology. 1963. - Vol. 20. - P. 376-378.

104. Curtis, P.E. Infectious laryngotracheitis / P.E. Curtis // Vet. Rec. 1983. -Vol. 112.-P. 486.

105. Curtis, P.E. Infectious laryngotracheitis / P.E. Curtis, A.S. Wallis // Vet. Rec.- 1983,- Vol. 112.-P. 486.

106. Cytomegalovirus proteins. Polypeptides of virions and dense bodies / M. Fiala et al. // J. Virology. 1976. -Vol. 19. - P. 243-254.

107. Darlington, R.W. Herpesvirus envelopment / R.W. Darlington, L.H. Moss // J. Virology. 1968. - Vol. 2. - P. 48-55.

108. Davidson, S. Recent laryngotracheitis outbreaks in Pennsylvania / S. Davidson, K. Miller // Proc. 37th West Poult. Conf.: Sacramento, 1988. P. 135136.

109. Davison, A.J. The complete DNA sequence of varicella-zoster vims / A.J. Davison. J.E. Scott//J. Gen. Virol. 1986. - Vol. 67. - P. 1759-1816.

110. Davison, S. Laryngotracheitis in chickens: the length of the preinfectious and infectious periods / S. Davison, G. Smith, R.J. Eckroade // Avian Dis. 1989.- Vol. 33, №1.-P. 18-23.

111. De Boer, G.F. Application of monoclonal antibodies in the avian leucosis virus gs-antigen EL1SA / G.F. De Boer, A.D.M.E. Osterhaus // Avian Pathol. -1985,-Vol. 14, № 1.-P. 39-55.

112. Demonstration in live chickens of the carrier state in infectious laryngotracheitis / C.S. Hughes et al. // Research in Veterinary Science. 1987. - Vol. 42. - P. 407-410.

113. Demonstration of sites of latency of infectious laryngotracheitis virus using the polymerase chain reaction / R.A. Williams et al. // J. Gen. Virol. 1992. -Vol. 73.-P. 2415-2430.

114. Detection of DNA from infectious laryngotracheitis virus by colourimetric analyses of polymerase chain reactions / M.W. Shirley et al. // J. Virol. Methods 1990. - Vol. 30. - P. 251-260.

115. Detection of infectious laryngotracheitis virus in chickens using a nonradioactive DNA probe / L. Keam et al. // Avian Dis. 1991. - Vol. 35. -P. 257-262.

116. Detection of infectious laryngotracheitis virus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by nested polymerase chain reaction / J. Humberd et al. // Avian Dis. 2002. - Vol. 46. - P. 64 - 74.

117. Development and evaluation of a non-isotopically labeled DNA probe for the diagnosis of infectious laryngotracheitis / D.W. Key et al. // Avian Dis. -1994,-Vol. 38.-P. 467-474.

118. Differences among restriction endonuclease DNA fingerprints of Pennsylvania field isolates, vaccine strains and challenge strains of infectious laryngotracheitis virus / L.H. Keller et al. // Avian Dis. 1992. - Vol. 36. - P. 575-581.

119. Differentiation between virulent and avirulent strains infectious laryngotracheitis vims by DNA: DNA hybridization using a cloned DNA marker / M. Kotiw et al. // Vet. Microbiol. 1986. - Vol. 11. - P. 319-330

120. Dual infection of chickens with pox and infectious laryngotracheitis (ILT) con finned with specific pox and ILT DNA dot-blot hybridization assays / O.O. Fatunmbi et al. // Avian Dis. 1995. - Vol. 39. - P. 925-30.

121. Effects of certain stress factors on the re-excretion of infectious laryngotracheitis virus from latently infected carrier birds / C.S. Hughes et al. // Res. Vet. Sci. 1989. - Vol. 46. - P. 247-276.

122. Effect of brefeldin A on alphaherpesvirus membrane protein glycosylation and vims egress / M.E. Whealy et al. // J. Virology. 1991. - Vol. 65. - P. 1066-1081.

123. Egress of alphaherpesviruses- comparative ultrastructural study / H. Granzow et al.//J. Virol. 2001,- Vol. 75.-P. 3675-3684.

124. Electron microscopic studies of the virus of infectious laryngotracheitis / A. M. Watrach et al. // Am. J. Vet. Res. 1959. - Vol. 20. - P. 537-544.

125. El-Mahdi, M. M. Experimental studies on infectious laryngotracheitis in chicken / M.M. El-Mahdi, A.A. Nafady, M.B. El-Begawey // Arch. Exp. Vet-erinarmed. 1988. - Vol. 42, №6. - P. 840-847.

126. Engvall, E. Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA. III. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labeled anti-immunoglobulin in antigen coated tubes / E. Engvall, P. Perlman // J. of Immunology 1972. - Vol. 109. -P. 129-135.

127. Establishment and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell line, LMH / Т.К. Kawaguchi et al. // Cancer Res. 1987. - Vol. 47. -P. 4460 - 4464.

128. Fahey, K.J. Laryngotracheitis herpesvirus infection in the chicken: The role of humoral antibody in immunity to a graded challenge infection / K. J. Fahey, T.J. Bagust, J.J. York //Avian Pathol. 1983. - Vol. 12. - P. 505-514.

129. Fahey, K.J. The role of mucosal antibody in immunity to infectious laryngotracheitis virus in chickens / K.J. Fahey, J.J. York // J. Gen. Virol. 1990. -Vol. 71.-P. 401 -405.

130. Fazekas, De St. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics / Fazekas De St., S. Groth, D. Scheidegger//J. Immunol.Meth. 1980. - Vol. 35.-P. 1-21.

131. Freshney, R.I. Disaggregation of the tissue and primary culture: a manual of basic technique "Culture of animal cells" / R.I. Freshney // New York. -1983.-P. 315 356.

132. Fuchs, W. DNA sequence and transcriptional analysis of the UL1 to UL5 gene cluster of infectious laryngotracheitis vims / Fuchs W., T.C. Mettenle-iter // J. Gen. Virol. 1996. - Vol. 77. - P. 2221 - 2229.

133. Fulton, R.M. Effect of route of vaccination on the prevention of infectious laryngotracheitis in commercial egg-laying chickens / R.M. Fulton, D.L. Schrader, M. Will // Avian Dis. 2000. - Vol. 44. - P. 8 - 16.

134. Gallid herpesvirus 1 (infectious laryngotracheitis virus): Cloning and physical maps of the SA-2 strain / M.A. Johnson et al. // Arch. Virol. 1991. -Vol. 119.-P. 181-198.

135. Garcia, M. Characterization of infectious laryngotracheitis virus isolates:demonstration of viral subpopulations within vaccine preparations / M. Garcia, S.M. Riblet // Avian Dis. 2001. - Vol. 45. - P. 558-66.

136. Genetic susceptibility of chicken macrophages to in vitro infection with infectious laryngotracheitis virus / T. Loudovans et al. // Avian Pathol. -1991,- Vol. 20, №2. -P. 291-302.

137. Genome isomerism in two alphaherpesviruses: Herpes saimiri-1 (herpesvirus tamaerinus) and avian infectio laryngotracheitis virus / D.A. Leib et al. // Arch. Virol. 1987. - Vol. 93. - P. 287-294.

138. Gerhard, W. Antigenic drift in influenza A viruses. I. Selection and characterization of antigenic variants of А/ PR/8/34 (H0N1) influenza viruses with monoclonal antibodies / W. Gerhard, R.G. Webster // J. Exp. Med. 1978. -Vol. 148, №2.-P. 383-392.

139. Gerhard, W. The analysis of the monoclonal immune responce to influenza virus. II. The antigenicity of the viral hemagglutinin / W. Gerhard // J. Exp. Med. 1976. - Vol. 144. - P. 985- 995.

140. Glissen, J.R. Persistence, epidemiology and control of infectious laryngotracheitis / J.R Glissen//Proceedings. 1988.-P.137 - 138.

141. Gooding, J.V. Antibody production by hybridomas / J.V. Gooding // J. Immunol. Meth. 1980. - Vol. 39, № 4. - P. 285-302.

142. Goudswaard, J. Three immunoglobulin classes in pigeon (Columbia livia) / J. Goudswaard, J.-P. Vaerman, J.F. Heremans // Int. Archs. Allergy Appi. Immunol. 1977. - № 53. - P. 409 - 419.

143. Graham, R.F. Subacute or chronic infectious avian laryngotracheitis / R.F. Graham, F. Throp, W.A. James Hi. Infect. Dis.-1930. -Vol. 47. P. 87-91.

144. Grassmann, W. Immunodiffusion. Methods and applications / W. Grass-mann, K. Hannig, Z. Hoppe-Seylers // Physiol. Chem.-1952.-Vol 290.-P. 1.

145. Guesdon, J.L. The use of avidin-biotin interaction in iminunoenzymatic techniques / J.L. Guesdon, T. Ternyck, S. Avrameas // J. Histochem. Cyto-chem. 1979,-Vol. 27.-P. 1131-1139.

146. Guy, J.S. Rapid diagnosis of infectious laryngotracheitis using a monoclonal antibody-based immunoperoxidase procedure / J.S. Guy, H.J. Barnes, L.G. Smith // Avian Pathol. 1992. - Vol.21. - P. 77-86.

147. Guy, J.S. Increased virulence of modified-live infectious laryngotracheitis vaccine virus following bird-to-bird passage / Guy J.S., Barnes H.J., Smith L. // Avian Dis. 1991. - Vol. 35. - P. 348-355.

148. Guy, J.S. Laryngotracheitis in diseases of poultry / J.S. Guy, T.J. Bagust // American Association of Avian Pathologists Iowa State Press, Ames, 2003. -P. 120- 133.

149. Madge, D. Radioimmunochemical studies on 7.8S and 5.7S duck immunoglobulins in comparison with Fab and Fc fragments of chicken IgY / D. Hadge, H. Ambrosius //Dev. Сотр. Immunol. 1984. -№8. -P. 131-139.

150. Haines, D.M. Enzyme immunohistochemical staining of formalin-fixed tissues for diagnosis in veterinary pathology / D.M. Haines, E.G. Dark // Can. Vet. J. 1991. - Vol. 32. - P. 295-302.

151. Han, M.G. Analysis of Korean strains of infectious laryngotracheitis vims by nucleotide sequences and restriction fragment length polymorphism / M.G.Han, S.J. Kim// Vet. Microbiol. -2001,- Vol.483. P. 321 - 331.

152. Hanson, L.E. Laryngotracheitis / L.E. Hanson // Diseases of poultry, Iowa State University Press, Ames. 1984. - P. 444 - 451.

153. Hanson, L.E. Laryngotracheitis / L.E. Hanson, T.J. Bagust // Diseases of poultry. Iowa State University Press, Ames. - 1991. - P. 485-495.

154. Hayashi, S. Pathological changes of tracheal mucosa in chickens infected with infectious laryngotracheitis virus / S. Hayashi, Y. Odagin, T. Kotani // Avian Dis. 1985. - Vol. 29, №4. - P. 943-950.

155. Herpesvirus induced 'early' glycoprotein: characterization and possible role in immune cytolysis / V. Misra et al. // J. Virol. 1982. - Vol. 43. - P. 1046 - 1054.

156. Hilbink, F.W. Susceptibility of birds other than chickens to infectious laryngotracheitis / F.W. Hilbink // Tijdschr Diergeneeskd. 1985. - Vol. 1110. — P. 437-439.

157. Hinshaw, W.R. A study of mortality and egg production in flocks affected with laryngotracheitis / W.R. Hinshaw, E.C. Jones, W. Graybill // Poult. Sci.- 1931.-Vol. 10.-P. 375-382.

158. Hinshaw, W.R. A survey of infectious laryngotracheitis of fowls / W.R. Hinshaw // Calif. Agric. Exp. Stn. Bull. -1931. Vol. 520. - P. 1-36.

159. Hitchner, S. B. Studies on serum neutralization test for diagnosis of laryngotracheitis in chickens / S.B. Hitchner, C.A. Shea, P.G. White // Avian Dis.- 1958. Vol. 2. - P. 258 -269.

160. Hitchner, S.B. A fluorescent-antibody study of the pathogenesis of infectious laryngotracheitis / S.B. Hitchner, J. Fabricant, T.J. Bagust // Avian Dis -1977,-Vol. 21.-P. 185-194.

161. Hitchner, S.B. Studies on serum neutralization test for the diagnosis of laryngotracheitis in chickens / S.B.Hitchner, C.A. Shea, P.O. White // Avian Dis.- 1958.-Vol. 2.-P. 258-269.

162. Hoogenraad, N. The effect of pre-injection of mice with pristane on ascites tumor formacion and monoclonal antibody production / N. Hoogenraad, T. Helman, J. Hoogenraad//J. Immunol. Meth. 1983. - Vol. 61. - P. 317.

163. Hudson, C.B. The susceptibility of pheasants and a pheasant bantam cross to the virus of infectious bronchitis / C.B. Hudson, F.R. Beaudette // Cornell. Vet. 1932.-Vol. 22.-P. 70 - 74.

164. Hughes, C.S. Comparison of cultural methods for primary isolation of infectious laryngotracheitis virus from field materials / C.S. Hughes, R.C. Jones // Avian Pathol. 1988. - Vol. 17. - P. 295-303.

165. Ide, P.R. Sensitivity and specificity of the fluorescent antibody technique for detection of infectious laryngotracheitis vims / P.R. Ide // Can. J. Сотр. Med. 1978.-Vol. 42.-P. 54.

166. Identification of an infectious laryngotracheitis virus gene encoding an immunogenic protein with a predicted Mr of 32 kilodaltons / K. Kongsuwan et al. // Virus Res. 1993. - Vol. 29. - P. 125 - 140.

167. Identification of herpes simplex vims type 1 (HSV-1) glycoprotein gC as the immunodominant antigen for HSV-1 specific memory cytotoxic T lymphocytes / J. Glorioso et al. // J. Immunol. 1985. - Vol. 135. - P. 575 - 582.

168. Identification of the infectious laryngotracheitis virus gB gene by the polymerase chain reaction / D.J. Poulsen et al. // Vims Genes. 1991. - Vol. 5.-P. 335 347.

169. Identification, properties, and gene location of novel glycoprotein specified by herpes simplex virus 1 / M. Ackennan et al. // Virology. 1986. - Vol. 150.-P. 207 - 220.

170. Immune response and in vivo distribution of the virus in chickens inoculated with the cell-associated vaccine of attenuated infectious laryngotracheitis (ILT) vims / Honda T. et al. // J. Vet.Med. Sci. 1994. -Vol. 56. - P.691 -5.

171. Immunological properties of the cell-associated live infectious laryngotracheitis vims / Taneno A. et al. // Jpn. J. Vet. Sci. 1990. - Vol. 53, - № 4. -P. 827.

172. Inaba Y. Ibaraki disease and its relationship to bluetongue / Y. Inaba // Austr. Vet. J. 1975.-Vol. 51, №4.-P. 178-185.

173. Infectious laryngotracheitis in broilers / J. A. Linares et al. // Proc. of 42nd West Poult. Dis. Conf: Davis, California, 1993. P. 7.

174. Infectivity for chicken embryos of tissue-culture-modified infectious laryngotracheitis virus / M. Yamanaka et al. // Avian Dis. 1982. - Vol. 26. - P. 295-304.

175. Interaction of glycoprotein gill with cellular heparinlike substances mediates adsorption of pseudorabies virus / Th. C. Mettenleiter et al. // J. Virol. -1990,-Vol. 64.-P. 278-287.

176. Interactions of monoclonal antibodies and bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) glycoproteins characterization of their biochemical and immunological properties / S. van Drunen Littel-van den Hurk et al. // Virology. 1984. -Vol. 135.-P. 466-479.

177. Inniere, A. Isolation and characterization of a noninfective virion-like particle released from cells infected with human strains of cytomegalovirus / A. Inniere, W. Gibson//Virology 1983.-Vol. 130.-P. 118-133.

178. Isolation and characterization of monoclonal antibodies against structural proteins of infectious laryngotracheitis vims / J. Veits et al. // Avian Dis. -2003,-Vol. 47.-P. 330 342.

179. Isolation of infectious laryngotracheitis virus from lacrimal fluid of chick / S. F. Satriona et al. // Poult. Sci. 1957. - Vol. 36. - P. 1155.

180. Isolation of infectious laryngotracheitis virus from proximal femora of lame broiler chickens / R.C. Jones et al. // Res. Vet. Sci. 1993. - Vol. 55, №3.1. P. 377-378.

181. Izuchi, Т. Pathogenicity of infectious laryngotracheitis vims as measured by chicken embryo inoculation / T. Izuchi, A. Hasagawa // Avian Dis. 1982. -Vol. 26.-P. 18-25.

182. Johnson, D.C. Monensin inhibits the processing of herpes simplex vims glycoproteins, their transport to the cell surface, and the egress of virions from infected cells / D.C. Johnson, P.G. Spear // J. Virology. 1982. - Vol. 43. -P. 1102-1112.

183. Jones, F. Role of cytoplasmic vacuoles in varicella-zoster virus glycoprotein trafficking and virion envelopment / F. Jones, C. Grose // J. Virology. -1988,-Vol. 2.-P. 2701 2711.

184. Jordan, F.T.W. A review of the literature on infectious laryngotracheitis / F.T.W. Jordan // Avian Dis. 1966. - Vol. 10. - P. 1 - 26.

185. Jordan, F.T.W. Infectious laryngotracheitis / F. T. W. Jordan // Poultry Dis. 1996.-P. 173 177.

186. Jordan, F.T.W. The agar gel diffusion technique in the diagnosis of infectious laryngotracheitis (I.L.T.) and its differentiation from fowl pox / F.T.W. Jordan, R.C. Chubb // Res. Vet. Sci. 1962. - Vol. 3. - P. 245 - 255.

187. Jordan, F.T.W. The control of infectious laryngotracheitis / F.T.W. Jordan // Zentralbl Veterinaermed. 1964. - Vol. 11. - P. 15 - 32.

188. Juntti, N. The use of monoclonal antibodies in enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodies to bovine viral diarrhoea virus / N. Juntti, B. Larsson, C. Possum //J. Vet. Med.- 1987. Vol. 34. - P. 356-363.

189. Kaleta, E.F. Herpesviruses of birds a review / E.F. Kaleta // Avian Pathol.1990.-Vol. 19.-P. 193-211.

190. Keeler, C.L. Identification of the thymidine kinase gene of infectious laryngotracheitis virus / C.L. Keeler, D.H. Kingsley, C.R.A. Button // Avian Dis.1991.-Vol. 35.-P. 920 929.

191. Kemohan, G. Infectious laryngotracheitis in fowls / G. Kemohan // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1931. - Vol. 78. - P. 196 - 202.

192. Kendall, C. Utilization of the biotin/avidin system to amplify the sensitivity of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / C. Kendall, I. lonescu-Matiu, G.R. Dreesman//J. Immunol. Methods. 1983.-'Vol. 56.-P. 329-339.

193. Kingsley, D. H. Identification and characterization of the infectious laryngotracheitis vims glycoprotein С gene / D.H. Kingsley, J.W. Hazel, C.L. Keeler // Virology. 1994. - Vol. 203. - P. 336-343.

194. Kohler, G. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity / G. Kohler, C. Milstein // Nature. 1975. - Vol. 256, № 5517. -P. 495-497.

195. Kohler, G. Immunoglobulin production by lymphocyte hybridomas / G. Kohler, H. Hengartner, M.J. Sliulman // Eur. J. Immunol. 1978. - Vol. 8, № 2. -P. 82-88.

196. Koprowski, H. Production of antibodies against influenza vims by somatic cell hybrids between mouse myeloma and primed spleen cells / H. Koprowski, W. Gerhard, C.M. Croce // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. -Vol. 74.-P. 2985-2988.

197. Korpowski, H., Biotechnology in diagnostics / H. Korpowski, S. Ferrone, A. Akbertini // Proc. Int. Symp. Imp. Biotech. Dign. Amsterdam, New York, Oxford: Elsevier, 1985. - P. 326.

198. Kotivv, M.C. Differentiation of infectious laryngotracheitis virus strains using restrictic endonucleases / M.C. Kotivv, R. Wilks, J.T. May // Avian Dis. -1982,-Vol. 26.-P. 718-731.

199. Kotivv, M.C. The effect of serial in vivo passage on the expression of virulence and DNA stability of an infectious laryngotracheitis vims strain of low virulence / M.C. Kotivv, R. Wilks, J.T. May // Veterinary Microbiology. -1995,-Vol. 45.-P. 71-80.

200. Labeled avidin-biotin enzyme-linked immunosorbent as for detecting antibody to infectious laryngotracheitis virus in chickens / Y. Ohkubo et al. // Avian Dis. 1988. - Vol. 32. - P. 24-31.

201. Latency and reactivation of infectious laryngotracheitis vaccine vims / C.S. Hughes et al. // Arch. Virol. -1991. Vol. 121. - P. 213-218.

202. Lee, L.F. Comparative studies of six avian herpesviruses / L.F. Lee, R.L Armstrong, K. Nazcrian// Avian Dis. 1972. - Vol. 16. - P. 799-805.

203. Leslie, G.A. Structural and antigenic relationships between avian immunoglobulins / G.A. Leslie, A.A. Benedict // J. Immunol. 1970. - № 105. - P. 1215 -1220.

204. Marsden, H.S. Herpes simplex virus glycoproteins and pathogenesis / H.S. Marsden // 40th symposium Society for General Microbiology "Molecular Basis of Virus Disease", Univ. Press, Cambridge, 1987. P. 259-288.

205. Martins da Silva, N.R. A method for the rapid purification of serum IgM for the diagnosis of recent viral infections of chickens / N.R. Martins da Silva, A.P.A. Mockett, J.K.A. Cook // J. of Virol. Methods 1990. - Vol. 29. - P. 117-126.

206. May, H.G. Tracheolaryngitis in poultry / H.G. May, R.P. Tittsler // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1925. - Vol. 67. - P. 229 - 231.

207. McCullough, K.C. Monoclonal antibodies against foot-and-mouth disease vims 146S and 12S particles / K.C. McCullough, R. Butcher // Arch. Virol. -1982.-Vol. 74. -№1.-P. 1-9.

208. McNulty, M.S. Infectious laryngotracheitis in Ireland / M.S. McNulty, G.M. Allan, R.M. McCracken // Irish Vet. J. 1985. - Vol. 39. - P. 124 - 125.

209. McKearn, T.J. Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A new dimension in biological analises / Kennett R.H., McKearn T.J., Bechtol K.B. Plenum Press, 1988. - P. 374.

210. Meulemans, G. A comparision of three methods of diagnosis of infectious laryngotracheitis / G. Meulemans, P. Halen // Avian Pathol. 1978. - Vol. 7. -P. 433-436.

211. Meulemans, G. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting infectious laryngotracheitis viral antibodies in chicken serum / G. Meulemans, P. Halen // Avian Pathol. 1982 - Vol. 11 - P. 361-368.

212. Mills, J.N. Replication of four antigenic types of avian reovirus in subpopu-lations of chicken leukocytes / J.N. Mills and G.E. Wilcox // Avian Pathol. -1993,-Vol. 22.-P. 353 361.

213. Misra, V. Proteins specified by bovine herpesvirus type-1 (infectious bovine rhinotracheitis vims) / V. Misra, R.M. Blumenthal, L.A. Babiuk // J. Virol. -1981.-Vol. 40.-P. 367 378.

214. Monoclonal antibodies to identify Zinga as Rift Valley Fever vims / J.M. Meegan et al. // Lancet. 1983. Vol. 1. - P. 641.

215. Moorhead, P.S. Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral blood / P.S. Moorhead, P.W. Nowell, W.J. Mellman // Exptl. Cell. Res. 1960. - Vol. 20. - P. 613-616.

216. Mueller, M.E. Respiratory herpesvirus infection with inclusion body conjunctivitis in Red-cheeked Cordon-blue (Uraeginthus bengalus) / M.E. Mueller//Avian Pathol. 1990. - Vol. 19, №3. - P. 595-599.

217. Nakamura, K. Comparison of the effects of infectious bronchitis and infectious laryngotracheitis on the chicken respiratory tract / K. Nakamura, K. Irnai, N. Tanimura // J. Сотр. Pathol. 1996.-Vol. 114,№1.-P. 11-21.

218. Nakane, P. K. Peroxidase-labeled antibody: a new method of conjugation / P.K. Nakane, A. Kavvaoi // J. Histochem. Cytochem. 1974. - № 22. - P. 1084-1091.

219. Nielsen, O.L. In situ hybridization for the detection of infectious laryngol cheitis virus in sections of trachea from experiments infected chickens / O.L. Nielsen, K.J. Handberg, and P.H. Jorgensen // Acta Vet. Scand. 1998. -Vol. 39.-P. 415-421.

220. Nielsen, K.H. Uses of monoclonal antibodies in veterinary medicine / K.H. Nielsen, M.D. Henning// Genet. Eng. and Biotechnol. 1990. - Vol. 10. - P. 14-18.

221. Norrild, B. Immunochemistry of herpes simplex virus glycoproteins / B. Nor-rild // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1980. - Vol. 90. - P. 67-106.

222. Nucleotide sequence of the gene encoding infectious laryngotracheitis vims glycoprotein В / К. Kongsuwan et al. // Virology. 1991. - Vol. 184. - P. 404-410.

223. Ohara, Y. Detection of antibodies to M protein of measles vims, patients with subacute sclerosing panencephalits / Y. Ohara, M. Tashiro, S. Takase // Microbiol. Immunol. -1985. Vol. 29, №. 8. - P. 709-723

224. OIE. Office International des Epizooties. Avian infectious laryngotracheitis. Review. 2005.

225. Oi, V.T. Immunoglobulin-producing hybrid cell lines /V.T. Oi, L.A. Herzen-berg// Selected Methods in Cellular Immunology. 1980. - P. 351-372.

226. Ouchterlony 0. Immunodiffusion and immunoelecktrophoresis. / 0. Ouchterlony // Handbook of experimental immunology, Blackwell Sci. Publ., Oxford, 1967. P. 655 -706.

227. Pattison, M. The effect of live infectious bronchitis vaccine on the course of infectious laryngotracheitis / M. Pattison, R.E. Gouqh, P.S. Dawson // Vet. flea. 1971,- Vol. 11.-P. 643-644.

228. Petit, J.R. Infectious laryngotracheitis (Herpes vims) / J.R. Petit // Factsheet Ont Minist. Agric. Food. Toronto, 1982. - P. 11.

229. Pirozok, R.P. Rapid histological technique for the diagnosis of infectious avian laryngotracheitis / R.P. Pirozok, C.F. Helmbolt, E.L. Jungherr // J. Am. Vet.Med.Assoc. 1957. - Vol. 130. - P. 406-407.

230. Poulsen, D.J. Characterization of the assembly and processing of infectious laryngotracheitis virus glycoprotein В / D.J. Poulsen, C.L. Keeler // J. Gen. Virol. 1997. - Vol. 78. - P. 2945-2951.

231. Poulsen, D.J. Identification of the infectious laryngotracheitis vims gB gene by the polymerase chain reaction / D.J. Poulsen et al. // Vims Genes. -1991,- Vol. 5. -P. 335-347.

232. Protein measurement with Folin phenol reagent /О.Н. Lowry, N.J. Rose-brough, A.L. Fair, and R.J. Randall//J. Biol. Chem. -1951. -№ 193 .-P. 265.

233. Pulsford, M. F. Infectious laryngotracheitis in South Australia / M.F. Puls-ford, J. Stokes // Aust. Vet, J. 1953. - Vol. 29. - P. 8-12.

234. Purcell, D. A. Histopathology of infectious laryngotracheitis in fowl infected by an aerosol / D.A. Purcell // J. Сотр. Path. 1971. -Vol. 81. -P. 421-431.

235. Purcell, D.A. Aerosol administration of the SA-2 vaccine strain of infectious laryngotracheitis vims / D.A. Purcell, P.G. Sunnan // Aust. Vet. J. 1974. -Vol. 50.-P. 419-420.

236. Purcell, D.A. The ultrastructural changes produced by infectious laryngotracheitis vims in tracheal epithelium of the fowl / D.A. Purcell // Res. Vet.Sci. -1971.-Vol. 12.-P. 455-458.

237. Raggi, L.G. Effect of infectious laryngotracheitis on egg production and quality / L.G. Raggi, J.R. Brownell, G.F. Stewart // Poult. Sci. 1961. - Vol. 40.-P. 134-140.

238. Rapid differentiation of vaccine strains and field isolates of infectious laryngotracheitis virus by restriction fragment length polymorphism of PCR products / P.C. Chang et al. // Journal of Virological Methods. 1997. - Vol. 66.-P. 179-186.

239. Raybould, T.J.G. Bovine-murine hybridoma that secretes bovine monoclonalantibody of defined specificity / T.J.G. Raybould, C.F. Crougli, L.J. McDou-gal // Am. J. Vet. Res. 1985. - Vol. 46, № 2. - P. 426 - 427.

240. Repertoire of antiviral antibodies expressed by somatic cell hybrids / W. Gerhard et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - Vol. 75, № 3. - P. 1510-1514.

241. Reproducibility of a vims-neutralization test for infectious laryngotracheitis vims / J.R. Andreasen et al. // Avian Dis. -1990. Vol. 34. -P. 185-192.

242. Restriction endonuclease analysis of Delmarva field isolates of infectious laryngotracheitis virus / C.L. Keeler et al. // Avian Dis. 1993. - Vol. 37. -P. 418 -426.

243. Restriction endonuclease analysis of infectious laryngotracheitis viruses: Comparison of modified-live vaccine viruses and North Carolina field isolates / J.S. Guy et al. // Avian Dis. 1989. - Vol. 33. - P. 316 - 323.

244. Restriction endonuclease patterns of some European and American isolates of avian infectious laryngotracheitis virus / D.A. Leib et al. // Avian Dis. -1986.-Vol. 30.-P. 835 837.

245. Reynolds, H.A. Development of the nuclear inclusion bodies of infectious laryngotracheitis / H.A. Reynolds, A.W. Watrach, L.E. Hanson // Avian Dis. 1968.-Vol. 12.-P. 332 - 347.

246. Richman, D.D. Identification of a new glycoprotein of herpes simplex virus type 1 and genetic mapping of the gene that codes for it / D.D. Richman et al.//J. Virol. 1986,- Vol. 57.-P. 647-655.

247. Robertson, G.M. Micro-assay systems for infectious laryngotracheitis vims / G.M. Robertson, J.R. Egerton // Avian Dis. -1977. -Vol. 21. -P. 133 135.

248. Roizman, B. Herpes simplex viruses and their replication / B. Roizman, D. M. Knipe // Fields virology, Philadelphia, 2001. P. 2399-2460.

249. Roseto, A. Isolement d'hybrides cellulatires secretant des anticorps speci-fiques du coronavirus enterique bovin / A. Roseto, J.F. Lantherot, P. Bobule-sko // C. r. Acad. Sci. 1982. - Vol. 294. - № 8. - P. 347 - 349.

250. Rossi, C.R. Studies of laryngotracheitis vims in avian tissue cultures. I. Plaque assay in chicken embryo kidney tissue cultures / C.R. Rossi, H.A. Reynolds, A.M. Watrach // Arch. Virol. 1969. - Vol. 28. - P. 219-228.

251. Russell, R.G. Respiratory tract lesions from infectious laryngotracheitis virus of low virulence / R.G. Russell // Vet. Pathol. -1983. -Vol. 20. P. 360-369.

252. Russell, R.G. Characterization of infectious laryngotracheitis viruses, antigenic comparison of neutralization and immunization studies / R.G. Russell, A.J. Turner. // Can. J. Сотр. Med. 1983. - Vol. 47. - P. 163-171.

253. Salem, M. Infectious laryngotracheitis vims, infectious bronchitis, Newcastle disease virus and adenovirus coinfection in broilers / M. Salem et al. // Proc. of 45 th West Poult. Dis. Conf. Davis, California. - 1996. - P. 77-78.

254. Sander, J.E. Evaluation of ELISA titers to infectious laryngotracheitis / J.E. Sander, S.G. Thayer // Avian Dis. 1997. - Vol. 41. - P. 429-32.

255. Schnitzlein, W.M. Generation of thymidine kinase-deflcient mutants of infectious laryngotracheitis vims / W.M. Schnitzlein // Virology. 1995. - Vol. 209.-P. 304-314.

256. Schnitzlein, W.M. Propagation of infectious laryngotracheitis virus in an avian liver cell line / W.M. Schnitzlein, J. Radzevicius, D.N. Tripathy // Avian Dis. 1994. - Vol. 38. - P. 211-217.

257. Scholl, E. Differential diagnosis of infectious laryngotracheitis from other avian respiratory diseases by a simplified PCR procedure / E. Scholl, R.E. Porter, P. Guo // J. Virol. Methods. 1994. - Vol. 50. - P. 313-321.

258. Schoemaker, H. The emergance of monoclonal antibody in diagnosis and therapy / H. Schoemaker, M. Wall, V. Zurawski // World Biotech. Proc.Conf.: London. 1984. - Vol.2. - P. 405-420.

259. Seddon, H.R. Infectivity experiments with the vims of laryngotracheitis of fowls / H. R. Seddon, L. Hart // Aust. Vet. J. 1936. - Vol. 12. - P. 13-16.

260. Seddon, H. R. The occurrence of infectious laryngotracheitis in fowls in New South Wales / H. R. Seddon, L. Hart // Aust. Vet. J. 1935. - Vol. 11. P. 212-222.

261. Selected methods in cellular immunology / B.B. Mishell et al. San Francisco, 1980.-P. 486.

262. Sellers, H.S. Mild Infectious Laryngotracheitis in Broilers in the Southeast / H.S. Sellers // Avian Dis. 2004. - Vol. 48. - P. 430-436.

263. Serum-free culture of adult chicken hepatocytes morphological and biochemical characterisation / N. Yamanaka et al. // Research in Veterinary Science. 1997. - Vol. 62. - P. 233-237.

264. Sevoian, M. A quick method for the diagnosis of avian pox and infectious laryngotracheitis / M. Sevoian // Avian Dis. 1960. - Vol. 4. - P. 474-477.

265. Shibley, G.P. A study of infectious laryngotracheitis virus. I. Comparison of serologic and immunogenic properties / G.P. Shibley, R.E. Luginbuhl, C.F. Helmboldt // Avian Dis. 1962. - Vol. 6. - P. 59-71.

266. Showalter, S.D. Monoclonal antibodies to herpes simplex vims type 1 proteins, including the immediate-early protein ICP 4 / S.D. Showalter, M. Zvveig, B. Hampar// Infect. Immun. 1981. - Vol. 34. - P. 684-692.

267. Sikezdi, P. Versuchewr Differemicrung von Slammen des Vims der Infektio-sen laryngotrachieitis des huhnes / Sikezdi, P. Veterinarmedizinisclic Dissertation, Giessen. - 1991. - P. 45 - 48.

268. Sinkovic, B.S. Vaccination of day-old chickens against infectious laryngotracheitis by conjuncti-val instillation / B. Sinkovic, S. Hunt // Aust. Vet. J. -1968,-Vol. 44.-P. 55 57.

269. Sinkovics, J.G. Leukeinia-Limphoma / J.G. Sinkovics, E. Shirato, P. Gyorky // Yearbook Medical Publishers, Chicago, 1970. P. - 53.

270. Sincovics J.G., Dreesman G.R. Monoclonal antibodies of hybridomas / J.G. Sincovics, G.R. Dreesman //Rev. Infect. Dis.- 1983. Vol.5, N.l. - P. 9-34.

271. Slaght, S.S. Adaptation of enzyme-linked immunosorbent assay to the avian system / S.S. Slaght, T.J. Yang, L. van der Heide // J. Clin. Microbiol. -1979. Vol. 10.-P. 698- 702.

272. Slaght, S.S. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting chicken anti-reovirus antibody at high sensivity / S.S. Slaght et al. // Avian Dis. 1978.-Vol. 22.-P. 802-805.

273. Smith, J.D. Herpes simplex virus and human cytomegalovirus replication in Wl-58 cells / J.D. Smith, E. de Harven // J. Virology. 1973. - Vol. 12. - P. 919-930.

274. Some observations of the propagation of infectious laryngotracheitis virus in tissue culture / P.W. Chang et al. //Avian Dis.- 1960. -Vol. 4. P. 484-490.

275. Spear, P.G. Antigenic structure of herpes simples viruses / P.G. Spear // The herpesviruses. Plenum Publishing Corp., New York, 1985. Vol. 5. - P. 425-443.

276. Spear, P. G. Membrane proteins specified by herpes simplex viruses I. Identification of four glycoprotein precursors and their products in type 1-infected cells/P.G. Spear//J. Virol. 1976. - Vol. 17.-P. 991-1008.

277. Stewart-Brown, B.N. A case report and discussion of laryngotracheitis in chickens / B.N. Stewart-Brown, W.G. Van-Alstme // Iowa State Univ. Vet. -1986 -Vol. 48, №1.-P. 36-39.

278. Studies of infectious laryngotracheitis vaccines: immunity in broilers / J.R. Andreasen et al. //Avian dis. -1989. Vol. 33. - P. 516-523.

279. Studies of infectious laryngotracheitis vaccines: immunity in layers / J.R. Andreasen et al. // Avian Dis. -1989. Vol. 33. - P. 524-530.

280. Subba Rao, P.V. An avidin-biotin micro ELISA for rapid measurement of total and allergen-specific human IgE / P.V. Subba Rao, N.L. McCartney-Francis, D.D. Metcalfe // J. Immunol. Methods 1983. - Vol. 57. - P. 71-85.

281. Susceptibility of ducks to the virus of infectious laryngotracheitis / S. Ya-mada et al. // Avian Dis. 1980. - Vol. 24. - P. 930-938.

282. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex vims type 1 / D.J. McGeoch et al. // J. Gen Virol 1988. -Vol. 69. -P. 1531-1574.

283. The DNA sequence of equine herpesvirus-1 / E.A.R. Telford et al. // Virology- 1992. Vol. 189.-P. 304-316.

284. The genome of a very virulent Marek's disease virus / E.R. Tulman et al. // J. Virol 2000. - Vol. 74. - P. 7980-7988.

285. The non-essential UL50 gene of avian infectious laryngotracheitis virus encodes a functional dUTPase which is not a virulence factor / W. Fuchs et al. // J. Gen. Virol. 2000. - Vol. 81. P. 627-638.

286. Tijssen, P. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology./ P. Tijssen // Elsevier, Amsterdam, N.-Y., Oxford, 1985,- Vol. 15. P.115

287. Use of lambda Xgtll and monoclonal antibodies to map the gene for the 60,000-dalton glycoprotein of infectious laryngotracheitis virus / K. Kong-suwan et al. // Virus Genes. 1993 - Vol. 7 - P. 297-303.

288. Use monoclonal antibody in an ELISA test for the detection of antibodies to bovine leukemia vims / D. Portetelle et al. // J. Virol. Meth. 1983. - № 6. -P. 19-29.

289. Van Drunen Littel-van den Hurk, S., and L. A. Babiuk. Synthesis and processing of bovine herpesvirus 1 glycoproteins / S. van Dmnen Littel-van den Hurk, L.A. Babiuk// J. Virol. 1986. - Vol. 59. - P. 401-410.

290. Van Kammen, A. Rapid diagnosis of some avian virus diseases / A. Van Kammen, P.B. Spradbrow // Avian Dis. 1976. - Vol. 20. - P. 748-751.

291. Van Kammen, A.V. Subclinical pneumonia associated with an experimental adenovirus infection in domestic fowl and the effect of concurrent infectious laryngotracheitis virus / A. Van Kammen V., J.D. Humphrey // Res. Vet. Sci. -1978.-Vol.24.-P. 32-38.

292. Van Zaan, D., Jzerman J. Monoclonal antibodies against bovine immunog-lodistinguish bovine T and В lymphosytes / D. Van Zaan, J. Jzerman // Vet. Immunol. Immunopathol. 1989. - P. 87-102.

293. Vander Кор, M.A. Infectious laryngotracheitis in commercial broiler chickens / M.A. VanderKop // Can. Vet. J. 1993. - Vol. 34. - P. 185.

294. Villegas, P. Viral diseases of the respiratory system / P. Villegas // Poultry Sci. 1998. - Vol. 77, № 8. - P. 1143-1145.

295. Villegas, P. Procedure for primary chicken embryo liver cells in tissue culture / P. Villegas // Laboratory manual avian vims diseases. Athens, 1989. -P. 7.

296. Watrach, A.M. The structure of infectious laryngotracheitis virus / A.M. Watrach, L.E. Hanson, M.A. Watrach // Virology. 1963. - Vol. 21. - P. 601 - 608.

297. Webster, R.G. Studies on infectious laryngotracheitis in New Zealand / R.G. Webster // New Zealand Vet.J. 1959. - Vol. 7. - P. 67-71.

298. Weeke, B. Identification serum proteins by cross-eleckrophoresis of Laurell / B. Weeke // Scand. J. clin. lab. invest., 1970. Vol. 25. - P. 269.

299. Westenbrink, F. Immunoglobulin M-specific enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis of bovine respiratory syncytial virus infections / F. Westenbrink, T.G. Kimman // Am. J. Vet. Res. 1987. - Vol. 48, № 7. - P. 1 132 - 1137.

300. Wiens, G.D. Western blot analysis of a fish pathogen / G.D. Wiens, S.D.T.

301. Prasad, S.L. Kaattari. // Techniques in fish immunology, SOS Publication, New Jersey 1990. - P. 87 - 94.

302. Wild, M.A. A genomic map of infectious laryngotracheitis virus and the sequence and organization of the genes present in the unique short and flanking regions / M.A. Wild, S. Cook // Virus Genes. 1996. - Vol. 12. - P. 107 -116.

303. Wilks, C.R. An immunofluorescence diagnostic test for avian infectious laryngotracheitis / C.R. Wilks, V.G. Kogan // Aust. Vet. J. 1979. - Vol. 55. -P. 385 - 388.

304. Winterfield, R.W. Susceptibility of turkeys to infectious laryngotracheitis / R.W. Winterfield, I.G. So//Avian Dis. 1968.-Vol. 12.-P. 191 - 202.

305. Woernle, H. Prazipitationstest zur Diagnose der infektiosen Laryngotracheitis des Huhnes / H. Woernle, A. Brunner // Tierarztliche Umschau. 1961. -Vol. 16.-P. 245-246.

306. Wudunn, D. Initial interaction of herpes simplex virus with cells is binding to heparan sulfate / D. Wudunn, P.G. Spear// J. Virol. 1989. - Vol. 63. - P. 52 - 58.

307. Yolken, R.H. Use of monoclonal antibodies for viral diagnosis / R.H. Yolken// New Develop, in Diagn. Virol. 1983. - P. 177 - 195.

308. York, J.J. Development and evaluation of an ELISA for the detection of antibody to infectious laryngotracheitis vims in chickens / J.J. York, K.J. Fahey, T.J. Bagust//Avian dis. 1983. - Vol. 27. - P. 409 - 421.

309. York, J.J. Diagnosis of infectious laryngotracheitis using a monoclonal antibody ELISA / J.J. York, K.J. Fahey // Avian Pathol. 1988. - Vol. 17. - P. 173 - 182.

310. York, J.J. Humoral and cell-mediated immune responses to the glycoproteins of infectious laryngotracheitis herpesvirus / J.J. York, K.J. Fahey // Arch. Virol. 1990. - Vol. 115.-P. 289-297.

311. York, J.J. Immunogenic glycoproteins of infectious laryngotracheitis herpesvirus / J.J. York, S. Sonza, K.J. Fahey // Virology 1987. - Vol. 161 - P. 340

312. York, J.J. The appearance of viral antigen and antibody in the trachea of infected and vaccinated chickens infected with infectious laryngotracheitis vims / J.J. York, J.G. Young, K.J. Fahey // Avian Pathol. 1989. - Vol. 18. -P. 643 - 658.

313. York, J.J. Vaccination with affinity purified glycoproteins protects chickens against infectious laryngotracheitis herpesvirus / J.J. York, K.J. Fahey // Avian Pathol. 1991. - Vol. 20. - P, 693-704.

314. Zum Nachweis der Latenz des attenuierten vims der infecktiosen laryngotracheitis des Hulines im trigeminus-ganglion / E.F. Kaleta et al. // Dtsch. Tieraerztl. Wochenschr. 1986. - Vol. 93. - P. 40-42.