Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение антигенных и физико-химических свойств полипептидов вируса инфекционного ларинготрахеита кур

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение антигенных и физико-химических свойств полипептидов вируса инфекционного ларинготрахеита кур"

всероссийская академия сельскохозяйстшшых наук внии сельскохозяйственной биотехнолопи ..

¡Га правах .рукописи

Юров Глэб Констаптиповач

изучение антигенных и оизико - химических сво'лств полшеггшдов

вируса шфекционного ларинготрахепта кур споцаальиость 03.00.03. - иохокулярпая бпологал

автореферат диссертации на соискашга учапоЭ сгопши капдпдата биояогачесетз; пзуп

Москва 1993

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генной инженерии микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН. ■

Научный руководитель: доктор биологических наук

Народицкий Б.С.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Завриев С.К. " кандидат биологических наук Надточий Г.А.

Ведущая организация - Beроссийский Государственный НИИ стандартизации, сертификации и контроля ветпрепаратов.

Защита диссертации состоится " "_1993г.

в _час. на заседании Специализированного Совета Д.020.40.01 при

ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 12520S, г.Москва, ул.Тимирязевская д.42.

С диссертацией мокно. ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " " _1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Меликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акт^альность_раОоты.

Вирус инфекционного ларинготрахеита кур (ИЛТВ), вызыващий заболевания верхних дыхательных путей, широко распространен й России и наносит большой экономический ущерб. По сравнению с большинством других герпесвирусоэ антигенный состав ИЛТВ к :учен слабо, а вирусные полипептщщ, распространенных в России штаммов ЬЪобЦе йе изучались. Так ке,. отсутствуют достаточно технологичные й недорюгие тест- системы позволяющие оценивать напряженность йоствакцинального иммунитета, .

Для эффективной борьбы с, вирусными инфекциями необходимо изучение биологичеких особенностей репродукции вируса и, в том ^йсле, причин, вызывайтох. снижение . эффективности • иммунного ответа. Как ранее была показано, на мембранах инфицированных рядом вирусов клеток экспонированы вирусные полипептиды связывающиеся с Го-.фрагментами иммуноглобулинов (Рс- рецепторы), что защищает клетки от антителозависимой цитотоксичности. Такие рецепторы были обнаружены и у ряда герпесвирусов. У ИЛТВ полипептиды, обладающие Рс- рецепторной активностью на- данный момент не обнаружены.

Настоящая работа посвящена изучению антигенного состава вириона, структурных , и биологических особенностей вирусных полшептидов распространенного в России вирулентного и широко используемого вакцизного (ВНИИБП) штаммов вируса инфекционного ларинготрахеита кур.

Цель и задачи работы.

Объектом данной работы служили вакцинный и вирулентный штаммы вируса инфекционного ларинготрахеита кур. Предметом исследования являлись структурные вирусные полипептиды, в особенности поверхностные вирусные гликопротеины являющиеся мажорными вирусными антигенами.

Целью данной работы являлось изучение главных антигенов вируса, их cтpv^'тypнaя организация и роль в имунном ответе, изучение физико- химических и биологических свойств вирусных полипептидов, а так же разработка технологичной иммуноферментной тест- системы для определения титра специфичных к ИЛТВ антител в сыворотке вакцинированных кур.

В работе были поставлены задачи:

1. Выделить, изучить и сравнить полипептидный и. антигенный составы вакцинного и вирулентного штаммов ИЛТВ и их сгуктурную организацию.

2. Разработать технологичную схему очистки вирусных антигенов и на ее основе создать ИФ тест- о», 'ему для определения титра специфичных к ИЛТВ антител в сыворотке вакцинированных кур.

3. Идентифицировать' и охарактризовать вирусные полипептиды обладающие Рс- рецепторной активностью, если таковые будут обнаружены..

На2<шая_новизна_и_практотеская_цетос .

В настоящей работе впервые охрактеризован антигенный состав распространенных в России штаммов ИЛТВ. Показано, что вакцинный и вирулентный штаммы не отличаются по антигенному составу, а из четырех мажорных вирусных антигенов, узнаваемых кроличьими

гиперимунными антисыворотками, в случае использования сывороток полученных от реконвалесцентов, основным является гликопротеин 60 кДа. Впервые показано, что этот полипептид является единствённым из вирусных гликопротеинов, имеющим межмолекулярные дисуяьфидные■ связи и в составе вириона находится в форме гомодимера.

Впервые был идентифицирован и выделен вирусный полипептид, связывающийся с Рс- фрагментом иммуноглобулина класса в кур, было показано, что для проявления Рс- рецепции необходимо сохранение нативной конформации данного полипептида. Были определены оптимальные для проявления Рс- рецзпторной активности значения рН, изучены его физико- химические характеристики.

Была разработана схема двухстадийной хроматографической очистки антигенов ИЛТВ,. позволящая с небольшими трудозатр'тами получать очищенный препарат вирусных антигенов, на оск-ве которого была разработана ИФ- тест система. Лабораторные испытания показали, что тест- система. имеет чувствительность и специфичность, достаточную для определения титра специфичных к ИЛТВ антител в сыворотке вакцинированных кур.

Апробация__работы.

>1

Материалы диссертации доложены и обсуждены на расширеном заседании отдела генной инженерии ВНИИ СБ. Материалы диссертации были представлены на вероссийской конференции "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных"(Москва, май 1993).

П^&тшкации.

Основные результаты диссертации отражены в трех печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.

Диссертационая работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Результаты", "Обсуждение", выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, включая 4 таблицы и 14 рисунков.

Маериалы и методы.

Для исследований использовли вакцинный (ВНИИ БП) и вирулентный пг .мы вируса инфекционного, ларинготрахеита кур, любезно предоставленные Ганиевым А- (ВНИИ экспериментальной ветеринарии, РАСХН).

В работе были использованы кроличьи ' гиперимунные антисыворотки, сыворотки от экспериментально зараженных и вакцинированных кур и антивидовые антисыворотки.

Выделение вирионов проводили из зараженных хориоалантоисных мембран куриных эмбрионов по методу York et al.(1987) зональным центрифугированием в градиенте сахарозы. Вирусные гликопротеины выделяли из разрушенных вирионов аффинной хроматографией на конканавалин А сефарозе.

ДСН электрофорез в ПААГ проводили в буферной системе Laemll (1970), двухмерный (диагональный)электрофорез проводили по методу Zweig (1979) с небольшими модификациями. После электрофореза гель окрашивали серебром, проверили электроперенос на нитроцеллюлозу по методу Burnete (1987) или, в случае радиошлмунопрецшштацЕИ, радиоавтографировали.

Иммуноферментный анализ проводили проводили непрямым методом с использованием антивидовых иммунопероксидазных койьюгатов.

1 25

Для радимоимунопреципитации использовали меченые I

вирусные гликопротеины. Введение метки проводили по стандартной методике фирмы (Pierce).

Для выделения вирусных антигенов использовались гидрофобная и анионобменная жидкостная хроматография.

Для очистки иммуноглобулинов и их Fab .фрагментов использовалась тиофильная хроматография (Pôrath et al.,t985). В качестве источника иммуноглобулинов использовали нормальную (отрицательную) куриную сыворотку. Для получения Fab- фрагментов использовали пепсин. Степень чистоты йшуноглобулинов и РаЪ фрагментов контролировали ДСН - ПААГ элёкторофорезом.

Для определения значений рН, (Оптимальных для проявления рецепторной активности полипептйдег 68 ИДа. имуноглобулины или их фрагменты ковалентно привязыэыввлй- полистироловым планшетам

1 ос

Covallnk (Millipore) и инкубировали с меченым I пол1шептидом 63 кДа при различных значенйях- рН и удельную активность связвшегося меченого полдавйтйХа ' измеряли с помощью прибора Compugarana (Pharmacia). '

Изоэлёктрофокусировавдв проводилось для определения изоэлектрической точки виру-одах полипептидов на заранее за.питых пластинах Servalyt Prscoteâ' (Serra) в градиенте рН 3,0 - 10,0. Использовали прябор для гЪрйзонтального электрофореза Multlphor (Pharmacia),

Результаты и обсуждение.

Представители. обширного (более 80 членов) семейства герпесвирусов очень широко распространены в природе. Среди высших эунариот редко встречаются такие, которые не подвергались заражению хотя бы одним из представителей этого семейства вирусов. В связи о этим проявляется большой интерес к изучению биологичеких характеристик, особенностей репликации и антигеннных свойств представителей данного семейства.

По сравнению г большинством герпесвирусов вирус инфекционного ларинготрахеита кур изучен довольно-таки слабо. На данный момент не опубликовано работ по определению нуклеотидной последовательности вирусного генома и особенностям организации вириона. Структурные полипептиды ИЛТВ так же слабо изучены.

Основными антигенами герпесвирусов, ответственными за возникновение в инфицированном организме гуморального и клеточного иммунитета, . являются поверхностные полипептиды, находящиеся в суперкапсидной оболочке вириона. Большинство поверхностных полипептидов гликозилит^пно. Группой зарубежных авторов в ряде работ исследовались гликопротеины распространенных ъ Австралии двух вирулентных (СБУМ .ЗПзЬагу) и одного вакцинного <БА-2) штаммов ИЛТВ. Полипептида, входящие в состав вирионов ИЛТ, выделенных на. территории России штаммов вируса, ранее не изучались. Объектами данной работы являлись распространенный в России вирулентный и наиболее часто используемый для вакцинации в неблагополучных по инфекционному ларинготрахеиту хозяйствах вакцинный (ВНИИЕП) штаммы ИЛТВ.

Вирионы ИЛТ очищали из гомогенатов хориоалантоисных мембран

куриных эмбрионов, зараженных как вакцинным, так и вирулентным штаммами ИЛТВ зональным ценгрифугирванием в градиенте сахарозы. Препараты очищенных вирионов использовали для получения кроличьих гиперимунных антисывороток и для изучения главных антигенов ИЛТВ.'

На рис.1а представлены спектры вирусных полииептидов вакцинного и вирулентного штаммов ИЛТВ после электрофоретического разделения в денатурирующих условиях. Был идентифицирован ряд полипептидов с молекулярными массами с 20 до 205 кДа. Очищенные вирионы вакциного и вирулентного штаммов по данным ДСН-алектрофореза не отличались по полипептидному составу.

С использованием аффиннной хроматографии на конканавалин А . (СопА) сефарозе из препаратов вирусных антигенов,полученных после • разрушения очищенных вирионов детергентами, были получены препараты вирусных гликопротеинов.

Двумерным (диагональным) электрофорезом гликопрогеиновой фракции вирусных белков было выявлено пять гликопротеинов с молекулярными масс1ни 205, 155, 115, 90 и 60 кДа. Полипептид о молекулярной массой 60 кДа находился как в мономерной форме, так я в виде связанного мекмолекулярными дисульфидными связями димера с электрофоретической подвижностью , соответствующей 112 кДа (Рлс.1б).

На первом этапе исследований нас. интересовали " главные антигены ИЛТВ. По данным York и др.(1987) мажорные антигены ИЛТВ экспонированы на поверхностной оболочке вириона и. гликозилированы, так как моноклональные антитела полученные '

Рис.1. Электрофореграммы полипептидов и гликопротеинов ШГГВ.

1 2

155116* ео-

60-'

ТГ?**"'7'У|'|¡'мГ'^'ГТ^г" |Г"г

A. Полипептидный состав очищенных вирионов вирулентного (1) и вакцинного (2) штаммов ИЛТ.

B. Двумерный (диагональный) электрофорез гликопротеинов выделенных из вирулентного штамма ИЛТВ.

против ШГГВ, взаимодействовали только с гликопротеинами, поэтому, для дальнейших исследований нами использовались препараты вирусных гликопротеинов.

Антигенные свойства цельных вирионов и гликопротеиновых-фракций вирулентного и вакцинного штаммов ШГГВ исследовали в иммуноблотинге с использованием кроличьих гиперимтаных антисывороток и сывороток, полученных от экспериментально зараженных кур. С кроличьей гйпер1&лунной антисывороткой полученой против вирулентного штампа очиценного вириона ИЛТВ, взаимодействовали полипеГГГида с молекулярными массами 205, 155, 115, 90, 80, 65 и 60 кДа и ряд :нйзкомолекулярных полипептидов; с гликопротеинами взаимодействовали полипептида 60, 90, 115 и 205кДа. Кроличьей • антисывороткой не обнаруживались низкомолекулярные полипептида при использовании в качес ве антигена гликопротеиновой фракции ИЛТВ. Это позволяет сделать вывод, что низкомолекулярные полипептиды негликозилированы и, скорее всего, не входят в Сойтав поверхностной оболочки вириона.

При использований антисыворотки, полученной от экспериментально Фф'айенных кур, главным антигеном, как при использований 'О'чёфенных - вирионов" вакцинного и вирулентного штаммов, так й при использовании гликопротеиновой фракции выделенной iiö 'вирулентного штамма являлся полиггептид с молекулярной 'массой 60кДа.

Как отмечалось выше, полипепТидные составы вакцинного и вирулентного 'штаммов 1ШЗ не различались. После исследования в • тглуноблотинге отличий в антигеном составе вакцинного и вирулентного штаммов так г:е не было' обнаружено, поэтому, для

радиоиммунопреципитации использовался только вирулентный штамм ИЛТВ.

В радиоиммунопреципитации при взаимодействии как с кроличьими, так и с куриными антисыворотками были выявлены полипептиды с теми же молекулярными массами, что и в иммуноблотинге с гликопротеиновыми фракциями ИЛТВ (Рис.2а) Кроличья антисыворотка дополнительно выявляла полипептид 155кДа. Это можно обър лть двумя причинами: во- первых, полипептид 155 кДа является более слабым иммуногеном и, поэтому, обнаруживается только более чувствительным метом (радиоиммунопреципитация); во-вторых, данный полипептид мокет быть гликозилирован в меньшей степени, чем другие гликопротеины и, при очистке гликопротеинов на конканавалин А -сефарозе этот белок связывался с сорбентом не полностью.

Спектр выявленных вирусных антигенов в основном совпадает с полученными ранее York и др. .данными, по, обращает на себя внимание, что у York и др. жштептида с молекулярными массами 205, 115, 90 и 60 кДа облапали и*¿мерно одинаковой антигенной активностью. Полученные на;д! результаты свидетельствуют, что только для кроличьих лшеримунных антисывороток, но. не для куриных, эти полипептида обладали пригэрно равной антигешостьга. Поэтому, вполне вероятно то, что полипептид 60 кДа представляет собой главный для кур антиген ИЛТВ . является особенностью выделенного в России штамма. Следует отметить ,что полипептиды 90 и 115 кДа слабо реагировали в иммуноблотинге и, в большей степени, в радиоиммунопреципитации. Это позволяет говорить о том, что антигенные детерминанты полипептидов 90 и 115 кДа имеют, в

Рис.2. Радиовтограмма Шмунопреципитатов ИЛТВ после их рйделения в электрофорезе.

3 4Г

«Да

205- Ъ,

1551159060-

\

кМ I 2 кДй ■■ ©Р8 **«»■

205-' 15560-1

205- |

50- , 3

у

во. И %

125

Ак В рддиоиммунопреципитации- использовались меченные I глшсопротеиш вирулентного.штамма ИЛТВ. Трек'1 - гликоп*../теины сыявляееде кроличьей' гиперимуншой антисывороткой, трек 2 -неимунной кроличьей сывороткой; трек 3 - положительной куриной сывороткой, трек 4 - отрицательной куриной сывороткой. С левой стороны показаны значения, соответствующие молекулярным массам гланорнцх вирусных гликопротеинов.

В. Иммунопрещшитаты меченных 1гликопротеинов ИЛТВ разделяли, методом диагонального электрофореза и радиоавтографировали. Только полипептид с молекулярной массой 60 кДа содержал мешолекулярные дисульфидные связи. С левой стороны показаны значения соответствующие молекулярным массам мажорных вирусных гликопротеинов.

основном, конформационную природу.

Известно, что некоторые гликопротеины ряда герпесвирусов представляют собой олигомеры, соединенные между собой мекмолекулярными дасульфидными связями. Полипептида ИЛТВ е данном аспекте ранее не изучались. Для выявления полипептидов ИЛТВ. имеющих мехмолекулярные дисульфидные связи нами использовался метод диагонального электрофореза. В первом направлении вирусные полипептиды разделяли ДСН-ПААГ электрофорезом в невосстановленных условиях, затр- проводили восстановление дисульфидных связей и разделяли полипептиды в перпендикулярном направлении. После разделения во втором направлении белки не' содержащие мекмолекулярных дисульфидных связей нахаходились на одной диагонали, а субъединичные белки выпадали.из общей диагонали и делились в соответствш с молекулярной массой составляющих их субъединиц.

Диагональный электрофорез ИЛТВ с последующим окрашиванием

серебром показал, что из мажорных вирусных гликопротеинов только

полипептид 60 кДа имеет межмолр"" пярше дисульфидные связи

1

(рис.1б). Диагональный слектрофорез "I - меченных иммунопреципитатов (рис.2в) и диагональный электрофорез ИЛТВ с последующим иммуноблотингом дали аналогичные результаты и позволяют сделать вывод, что наиболее ■ :ммуногенный полипептид 60 кДа представляет собой соединенный дасульфидными связями дамер, с молекулярным весом 112 кДа.

Наличие на диагонали зоны, соответствующей полипептиду с молекулярной массой 60 кДа, аналогичной молекулярной массе восстановленного димера 112 кДа , позволяет предположить, что

данные полипептиды идентичны и в составе вйриона находятся как в мономерной (60 кДа), так и в димерной (112 кДа) формах.

Вирус инфекционного лЬрийгоТрахеита кур " .вызывает респираторные заболевания результатом которых являются сшркение среднесуточного привеса; яйценоскости и 'повышенный отход поголовья. Вирус передается аэрозольным путем и высококонтагиозен. В неблагойолучнных по ИЛТВ хозяйствах проводится массовая профилактическая вакцинация. В России для этих целей чаще всего используется атенуированная вакцина, приготовленная из ваяцйнного (ВНИИБП) штвмма вируса. Для контроля напряженности поствакцинального иммунитета- необходима технологичная и достаточно чувствительная тест-система. На данный момент в России т&ковая отсутствует. Нами была поставлена задача разработать такую тест- систему на основе иммуноферментного анализа.

В работе использовалась наиболее .распространеная схема Ш анализа Длй определения титра антител, обеспечивающая высокую чувствительность и достаточную' быстроту его проведения - метод непрййЪгд КФ анализа на многолуночных полистироловых плащетах (5X13^), ' '

Чувствительность и специфичность Ш анализа определятся, ТДавным образом, степенью чистоты, используемого антигена. При Чйфусологических исслэдованиях в качестве антигена используется очищенный вирион или отдельные вирусные антигены. Очистка. ЕПрлонов герпесвирусов достаточно трудоемка, • требует использования дорогостоящего оборудования и характеризуется невысоким выходом конечного продукта. Кроме того, как известно, в

состав вирионов включается небольшой процент синтезированных вирусных белков и невошедшие в его состав вирусные антигены так же теряются в процессе очистки. Поэтому, наши усилия были направлены на разработку максимально технологичного и недорого метода хроматографической очистки антигенов ШГГВ.

После серии экспериментов нами была разработана схема двухстадийной хроматографической очистки антигенов ШГГВ (Табл.1).

Применение. на первом этапе ионобменной хроматографии позволило использовать неионный детергент (Triton Х-100) в концентрации достаточной для солюбилизации поверхностных вирусных антигенов и разрушения суперкапсидной оболочки .вириона. После нанесения на колонку детергент удаляется вместе с несвязавшимся с сорбентом материалом и не мешает дальнейшей очистке с использованием гидрофобной хроматографии.

Высокая кратность очистки (54 раза) при использовании на следующем этапе гидрофобной хроматографии достигается за счет удачного подбора буфера, используем^ j при нанесении материала на колонку, и элюиругацего буфера. При этом более гидрофильные протеины не связываются с сорбентом, что позволяет использовать хроматографическув колонку меньших размеров. На обоих этапах хроматографической очистки используется ступенчатая элюция, что. хорошо воспроизводимо и не требует анализа большого количества фракций, как в случае использования градиентной элюции.

В качестве исходного препарата использовался гомогенат зараженных ИЛТВ хориоалантоисных мембран куриных эмбрионов. Культивирование ИЛТВ в куриных эмбрионах имеет ряд преимуществ:

U

ТАБЛИЦА 1-

название фракции концентрация белка (мг/мд) "объем (мл) ! суммарное' количество белка(мг) кратность очистки (раз )

■ исходная 3,6 250 900

элюат с ИЕАЕ-ТР 0,5М ИаС1 0,86 75 64,3 14

Элюат с ВиШ-ТР 0,5М НаС1 0,085 14 1,19 . 756,3 (54)

ТАБЛИЦА 2.

Ч № 1 Хфракщга хорио- Ч. ; алантоисакч! оптическая плотность (492 нм)

1 2. •3. 4 5

зараженные ИЛТВ 1,27 1,56 0,64 0,14 0,48

неззраженные ИЛТВ 1 ,29 1,47 0,42 0,11 0,07

Фракции: 1- несорбировавшийся на БЕЛЕ-ТР материал,' 2- элюат-0,2М 1ТаС1, 3- элюат О.БМ ИаС1; Ч- несорбировавшийся на ВигИ-ТР материал, б- элюат 0,5М N301.

нет необходимости в использовании культуральных сред и получении первичных клеточных культур (перевиваемых клеточных линий для культивирования ИЛТВ не существует), кроме того, в куриных эмбрионах вирус накапливается в больших количествах. Но, в гомогенатах хориоалантоисных мембран находится во много раз большее количество белков невирусной природы, взаимодействующих с сыворотками, полученными от вакцинированных кур. Поэтому, на всех этапах отработк" схемы очистки вирусных антигенов параллельно те же стадии очистки проходили гомогенаты хориоалантоисных мембран. не зараженных ИЛТВ.. и фракции, полученные после каждого этапа очистки в непрямом ИФ- анализе (Табл.2).

При разработке ИФ тест-системы с использованием в качестве адсорбоируемого материала хроматографически очищеных антигенов ИЛТВ было показано, что снижение корцентрации антигена с 20 до 3 мкг/мл практически не влияло на чувствительность анализа, поэтому, концентрация очищенного вирусного антигена 3 мкг/мл была признана оптимальной, так как обеспечивала, максимальную чувствительность анализа при м.. .шальном расходе • вирусного антигена. При этом, препараты полученные из незараженных хороалантоисов , взаимодействовали с исследуемыми сыворотками практически на уровне фоновых значений.

При исследовании сывороток, полученных от вакцинированных птиц, было показано, что после первой вакцинации наблюдалось повышение титра антител, а после второй вакцинации он достигал максимальных значений (Табл.3). Довольно большие различия в титрах антител кур каждой из трех групп можно объяснить как индивидуальными особенностями каждого организма, так и

применявшимся методом вакцинации (при аэрозольном методе возможно попадание различного количества вакцины в каждый организм).

Те же сыворотки исследовали в ИФА', где в качестве антигена использовался очищенный вирион (табл.4). Метод оказался примерно' в два раза более чувствительным. Зто можно объяснить двумя причинами: во-первых, в составе вириона присутствуют все вирусные антигены, а в хроматографически очищенных препаратах только часть из них; во-вторых, в качестве ' антигена использовался высокоочиценный вирион ИЛТВ, полученный после двухкратного ультрацентрифугирования, так как использование вирусного препарата' после однократного ультрацентрифугирования приводило к появлению значительного фонового окрашивания, что затрудняло учет результатов анализа и снижало ёго специфичность.

В результате препаративной хроматографической очистки из • ' гомогената 50 зараэкеннных ИЛТВ хориоалантоисных мембран было выделено 1,19 мг очищенного вирусного антигена. Из такого же количества исходного, материала было выделено менее 0,3 мг очищенного вириона. Этих количеств препарата достаточно для сенсибилизации соответственно 40 и 10 96- луночных планшетов, что позволяло исследовать соответственно 400 и- 100 .образцов сывороток.

Таким образом, была разработана иммуноферментная тест система для определения титра антител к вирусу инфекционного ляринготрахеита кур с использованием ' в качестве антигена хроматографически очищенного препарата вирусных полипептидов. Несмотря на то, что использование в качестве антигена очищенного вириона делало тест - систему более чувствительной,

ТАБЛИЦА 3.

11° сывороткач кур: ТИТР сыворотки

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

ДО вакцинации 1:10 >1:5 1:20 >1:5 >1:5 1:5 >1:5 1:10 1:10 1:10

после 1й вакцинации 1:10 1:5 1:40 1:20 1:20 1:20 1:40 1:40 1:10 1:20

после 2й вакцинации 1:40 1:20 1:80 1:40 1:80 1 :40 :160 :320 1:80 1:20

ТАБЛИЦА 4.

№ сывороткаЧ кур: ТИТР, сыворотки

1 2 3 4 5 6 • 7 8 9 10

ДО вакцинации 1:10 >1:5 1:40 1:5 >1:5 1:20 1:5 1:20 1:20 1:20

после 1й вакцинации 1:20 1:20 1:80 1:20 1:40 1:40 1:80 1:80 1:20 1:40

после 2й вакцинации. 1:40 1:40 :160 1:80 1:80 1:80 :320 :640 1:80 1:80

чувствительность тест-системы с использованием хроматографичсски очищенного вирусного антигена достаточна для достоверной оценки напряженности гуморального иммунитета- у вакцинированных против ШГГВ кур. Разработанная схема хроматографической очистки высоко технологична и позволяет в течение одного рабочего дня выделять достаточно большое количество препарата очищенных вирусных белков. При этом, из того 'же количества исходного материала при хроматографической 'очистке' было' выделено в четыре раза большее количество препарата, чем при выделении дельных вирионов.

Белки, связывающиеся с константной • частью молекулы иммоглобулина (Рс- рецепторы), сначала' были обнаружены у ряда прокариот, затем, было показано, что Ро - рецепторные взаимодействия являются одним" из компонентов, необходимых для активациии иммунной системы млекопитающих": Было,, так же, обнаружено, что белки ряда вирусов тоже обладают Рс- рецепторной активностью. Считается, что эта способность позволяет защищать вирусинфицированныё клетки от клеточного иммунного ответа.

Рс- рецепторы'. обнаружены и у ряда герпесвирусов. Они представляют собой субъединичные или мономерные полипептиды, входящие в состав суперкапсидно'й оболочки или тегумента вириона. У вируса инфекционного ларинготрахеита ранее не было обнаружено полипептидов, обладающих Рс- рецепторной активностью. В процессе изучении полипетидного и антигенного составов ИЛТВ и при разработке иммуноферментной тест системы в ряде случаев наблюдалось сильное неспецифическое взаимодействие куриных иммуноглобулинов с препаратами вирусных антигенов. Это позволило предположить, что в порцессе размножения ШГГВ синтезируются

полипептида.обладающие Fe- рецеторной активностью.

Для ИЛТВ не существует перевиваемых культур клеток. Наиболее распространенным является его культивирование на хориоалантоисных мембранах куриных эмбрионов. В ряде случаев, для культивирования используется первичная культура почки цыпленка, к сожалению, в данном направлении нам не удалось получить удовлетворительных . результатов.

В составе куриных эмбрионов находятся белки обладающие Fe активностью, поэтому, микроскопические исследования с использованием флюорецентной метки- наиболее распространенный метод. позволяющий идентифицировать 7с- рецепторы на мембране инфицированных клеток, в данном случае был неприемлем. По тем же причинам нельзя было ввести радиоактивную метку в состав вирусных полипептидов ln vivo. Выделение же, обладающих Fe- рецепторной активностью полипептидов из очищенных вирионов ИЛТВ, представлялось нецелесообразным по следующим причинам:. во-первых, было неизвестно находится Fe- рецептор в составе вириона или является вирус- индуцированным белком; во- вторых, разрушение вирионов могло вызывать изменение природной конформации полипептида, что могло привести к снижению или к исчезновению его Fe- рецепторной активности; в- третях, препараты очищенных вирионов могли контаминировать Fe- рецепторы невирусной природы, что потребовало бы продолжительных дополнительных исследований (например, электронно- микроскопических о использованием меченных коллоидным золотом препаратов иммуноглобулинов и их фрагментов). Поэтому, нами была предпринята попытка выделить. обладающие Fc-рецепторной активностью полипептида , из зараженных ШГГВ

хориоалантоисшх мембран с помощью жидкостной хроматографии.

При разработке метода хроматографической очистки получаемые фракции тестировались по следующим параметрам: взаимодействие с нормальными куриными иммуноглобулинми, взаимодействие с куриными сыоротками специфичными к ИЛТВ и электрофоретический анлиз чистоты получаемых препаратов. Все те же стадии очистки'проходили и гсмогенаты незараженных ИЛТВ хориоалантоисшх мембран.

В результате ряда экспериментов были подобраны условия, позволяющие после двух стадий гидрофобной хроматорафии (на первом этапе использовался ступенчатый, а на втором- линейный градиенты концентрации ЫаС1 получить фракции, взаимодействующие в № дот-анализе с нормальными куриными иммуноглобулинам: .при использовании в качестве 'исходного -материала ' зараженных хориоалантоисов и не взаимодействующие с аналогичными фракциями • полученными из хориоалантоисов назараженных ИЛТВ.

Электрофоретический анализ показал, что уже после первого этапа очистки можно было идентифицировать полипептид с молекулярной массой 63 кДа, присутствовавший только во фракциях, полученных из зараженных хориоалантоисов (рис.36), а после градиентной хроматографии он являлся одним из мажорных компонентов (Рис.За). Это заставило предположить, что именно полипептид 63 кДа взаимодействует с куриными иммуноглобулинами. Для дальнейших исследований полипептид 63 кДа был доочицен с помощью анинобменной хроматографии высокого разрешения на колонке ИОШ-О (РРЬС), после чего в ИФ- дот анализе изучалось взаимодействие сконцентрированного ультрафильтрацией очищенного препарата полипептида 63 кДа с нормальными иммуноглобулинами ряда

Рис.3. Электрофоретический анализ фракций полученных в процессе очистки полипептида бЗкДа. 5 6 78 1 2 12345

1___2 3. 4

63- *5? — —

Б В

I '

I

63- -Г

бз-З з|

А. Трек 1 - исходный "гомогенат хориоалантоисных мембран зараженных ИЛТВ; трек-4 - препарат полученный после ступенчатой гидрофобной хроматографии; трек 2,3 - фракции препарата полученные после градиентной гидрофобной, хроматографии; треки 5-8 - фракции полученные после анионобменной хроматографии на колонке МОШ-СЗ (РРЬС). В' первой и второй фракциях (треки 5,6) - очищенный препарат полипептида 63 кДа.

Б. фракции гомогенатов незаракенкых (трек 1) и зараженных ИЛТВ (трек 2) хориоалантоисных мембран полученные после ступенчатой гидрофобной хроматографии. Полипептид 63 кДа присутствует толлько в препарате •улученном из зараженных хориоалантоисов.

В. После разделения в электрофорезе в присутствии или в отсутствие восстановителя (ШТ) частично очищенный препарат полипептида £3 кДа переносили на нитроцеллюлозу к' инкубировали с положительной куриной сывороткой и, затем, с антивидовым иммунопероксидазкым коньюгатой'. Треки 2,5 - полипептид бЗкДа в восстановленных и невосстановленных условиях соответственно, треки 1,3- прошедший те ке стадии очистк^, препарат выделе1ший из нерарансеншх хориоалантоисов, так же-, в-,, восстановлепоЯ и невосстановленой формах.

млекопитающих, человека и курицы. Полипептид 63 кДа взаимодействовал только с иммуноглобулинами курицы.

Для подтверждения вирусной природы полипепгида 63 кДа использовался иммуноблотинг (Рис.Зв). Из его результатов' можно сделать два вывода. Во-первых, хотя и нельзя о полной уверенностью утверждать,' что полипептид 63 кДа входит в состав вириона, он, по крайней мере, является белком вирусной природы", так как в организме экспериментально зараженных кур присутствуют специфичные к нему антитела, а с нормальными (отрицательными) куриными сыворотками полипептид 63 кДа в иммунсблотинге не взаимодействовал. Во-вторых, рецепторная активность полпептида 63 кДа проявляется только в нативных (не денатурирующих) условиях (т.е. при сохранении природной конформации белка), т.к. он взаимдействовал с нормальными куриными сыворотками & дот- анализе и не взаимодействовал в иммуноблотинге после проведения электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. Влияние на рецепторную активность полипептида 63 кДа денатурирующих агентов было так ке подтверждено результатами дот- анализа, где после 10 гашутной инкубации в присутствии гуанидин хлорида при 20°С иммуноглобулинсвязыващая активность полипепгида '63 кДа снижалась, а после инкубации в-тех .не условиях при 95°С полностью исчезала.

Для выяснения природы иммуноглобулинсывязвающей активности полипетида 63 кДа из куриной сыворотки били выделены иммуноголобулины "класса G и после расщепления их пепсином были выделены и очищены их Fab фрагменты. По даннным Ш дот- анализа полипептид 63 кДа взаимодействовал с полными молекулами

иммуноглобулинов и не взаимодействовал с их РаЬ фрагментами.' Таким образом, полипептид 63 кДа обладал рецепторной активностью к Рс- фрагменту молекулы иммуноглобулина.

Взаимодействия обладающих. Ус рецепторной активностью белков с иммуноглобулинами зависят от условий протекания реакции, в том числе, и от рК. Предварительные эксперименты (дот- анализ) проводились при рН 8,5. так как не было известно его оптимальных значений. При разработке схемы эксперимента, позволившей бы определить оптимальные значения рН, необходимые для проявления Гс- рецепторной активности полипептида 63 кДа, возник ряд трудностей:^ использование многокомпонентной системы с использованием на одном из .этапов иммунологических (антиген-антитело)' реакций не представлялось возможным, так как при экстремальных значениях рН иммунные комплексы диссоциируют; адсорбция белка на полистироловые планшеты по сходным причинам (возможная десорбция) так же могла не позволить получить адекватные результаты.

Поэтому для проведения анализа тмуноглобулины или их

фрагменты,ковалентно "пришивали" карбоксильными группировками к

полистироловым планшетам на которых были . экспонированы

аминогруппировки с помощью гетеробифункционального реагента и

1

затем, инкубировали при различных значениях рН с меченным I очищенным препарата полипептида 63 кДа. Результаты представлены на рис.4а. Максимальной рецепцией полшептид обладал при значениях рН 5,0 и 9,0. Следует особо отметить, что при кислых значениях рЗ резко возрастало неспецифическое взаимодействие. Это, скорее всего, имеет следующие причины: известно, что у

Рис.4. Определение значений рН. оптимальных для проявления Рс-рецепторной активности и определение изоэлектрической точки

полипептида бЗкДа.

бЗкДа с ковалентно пришитыми к полистиролу куриными иммуноглобулинами (сплошная линия) и их -фрагментами (пунктирная линия) в диапозоне рН 3-10. По оси ординат -удельная активность связавшегося с иммуноглобулинами и их фрагментами полипептида 63 кДа.

В. Изоэлектрофокусированием была определена изоэлектрическая

точка полипептида бЗкДа. С левой стороны - маркеры (окраска

1

Кумаси), с правой - радиоавтогрвмма I- полипептида бЗкДа.

многих, особенно достаточно гидрофобных белков при значениях рН. близких к их изоэлектрической точке,резко снижается растворимость и белок выпадает в осадок. Изоэлектрофокусированием было установлено, что изоэлетрическая точка полипептида 63 кДа находится в пределах.рН 5,1- 5,3 (рис.46), т.е., как раз в области максимального неспецифического взаимодействия с иммобилизованными на полистирол . иммуноглобулинами и их фрагментами. .

Хотя .для исследований использовался препарат очищенного полипептида 63 кДа, применявшимися методами анализа не было однозначно показано, что Fc-рецепторнной активностью одладает именно данный белок, т.е. "существовала определенная вероятность того, что Fc- рецепторной активностью могут обладать какие- либо другие контаминируюцие препарат белки. Иммуноблотинг не позволил ответить на этот вопрос, потому что, как отмечалось выше, после денатурирующего электрофореза полипептид 63 кДа терял свою Рс-рецепторную активность. Поэтому, был использован метод радиоиммунопреципитации позволявший изучать рецепторные свойства исследуемого белка в максимально- возможно мягких условиях. Результаты и схема анализа представлены на рис. 5. Полипептпд 63 кДа взаимодействовал только с полными молекулами иммуноглобулинов и не" взаимодействовал с их РаЪ- фрагментами. И полные молекулы и. Fab- фрагменты так ..а взаимодействовали с рядом белков различной молекулярной массы контаминировавпшми препарат полипептида 63 кДа. Эти взаимодействия объяснялись, скорее всего, специфичностью использовавшихся куриных иммуноглобулинов и РаЪ-' фрагментов к данным контаминавтам, так как они не взаимодействовали ни с

Рис.5. Определение Fc-рецепторной активности полипептида бЗнДа.

I-Fc-H

2 сн1шя IjC

РКОГЕШЯ sepwrqsk

63"

У-

А Б

А. Схема анализа. Иммобилизованный на сефарозе белок А (4) инкубировался с аффшшо очищенными иммуноглобулинами козла против иммуноглобу-йинов курицы (3). 'Затем, связавшиеся с белком А иммуноглобулины инкубировались с куриными иммуноглобулинами или'их Fab фрагментами (2). Полученный комплекс инкубировался о

IOC

меченным I полипептидом бЗкДа (1).

Б. Радяоавтограг.ма преципитатов после их разделения в электрофорезе. Трек 1 - взаимодействие бЗкДа с Fab- фрагментами; 2-е полной молекулой Ig; 3- с' комплексом белок А-сефароза - Ig козла; 4- с белок А-сефарозой.

э

1

матрицей (белок А- сефароза), ни с комплексом белок А- сефароза -козьи иммуноглобулины, специфичные.к иммуноглобулинам курицы.

Изучение физико-химических характеристик полипептида 63 кДа показало, что этот белок не содержит межмолекулрных дисульфидных связей (Рис.Зв), не гликозилирован, так как не взаимодействует с конкавалином А, и имеет изоэлектрическую точку в области рЫ 5,1-6,3, и его Fc-рецетгорная активность исчезает после обработки денатурирующими агентами.

Молекулярные массы обнаруженных у различных вирусов Fc-рецеторов колеблются в широких пределах - от 30 кДа у цитомегаловируса человека до 180 кДа у вируса гепатита мышей . Но, Fc- рецепторы ряда герпесвирусов имеют близкую к изучавшемуся полипептиду 63 кДа молекулярную массу (65 и 70 кДа у ВПГ-1, 69 кДа у ШВ человека). Следует отметить, что часто в составе вириона присутствуют два различных полипептида, обладающих Fc-рецепторной активностью и, например, • в случае ВПГ-1, для проявления активности необходимо присутствие обоих белков (gE и gl) и сохранение их. природной конформации, а в случае ШВ полипептиды•69 и 33 кДа сохраняли свою активность даже после их разделения в как восстанавленной, так и в невосстановленной формах.

'Fc- рецепторная активность полилептида 63 кДа исчезала после обработки денатурирующими агентами,т.е. как и у ВПГ-1 зависела от

конформации белка'. Как и у полипептида 63 кДа изоэлектричекая

н

точка большинства вирусных белков аходится в кислой области. Интересной особенностью полилептида 63 кДа является отсутствие

гликозшшрования, так как большинство обладающих Тс- рецепторной активностью белков являются гликоггротеинами.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые охарактеризован антигенный состав распространенных в России вакцинного и вирулентного штаммов вируса инфекционного ларинготрахеита кур. Штаммы не отличались по полипептидному и антигенному составу. Главными антигенами являлись гликопротеины с молекулярными массами 205, 115, 90 и 60 кДа. В сыворотках, полученных от экспериментально зараженных кур, превалировали антитела против полипептида'60 кДа.

2. Впервые проанализированы вирусные полипептиды . имеющие межмолекулярные дисульфидные связи. Было показано,что среди мажорных вирусных гликопротеинйв только полипепти^ с молекулярной массой 60 кДа является субъединицей соединенного ' ковалентными связями гомодимера с молекулярной массой 112 кДа.

3. Разработана оригинальная высокотехнологичная схема двухстадийной хроматографической очистки антигенов вируса инфекционного ларинготрахеита , позволяющая получать• препарат очищенного антигена.

4. На основе хроматографически очищенных антигенов ИЛТВ била разработана и апробирована в лабораторных условиях ИФ тест-система, позволяющая определять титр специфичных к ИЛТВ антител в сыворотке вакцинированных кур.

5. Впервые выделен и очищен .вирусный полипептид, обладающий способностью связываться с Рс- фрагментом иммуноглобулинов класса С кур. Максимально Рс-репеторная активность проявляется при значениях рН 5,0 и 9,0. Обладающий Рс- рецепторной активностью

полипептид представляет собой мономерный негликозилированный белок с молекулярной массой 63 кДа.

СПИСОК

работ опубликованых по теме диссертации:

1.Юров Г.К..Народицкий Б.С.,Ганиев А.Поверхностные полипептиды вируса инфекционного ларинготрахеита кур: изучение межмолекулярных дисульфидных связей.//Вопросы вирусологии - 1993 - Ы°4 стр.174-176.

2. Юров Г.К., Баранникова A.C., Пикер Е.Г. Иммуноферментный диагностикум ларинготрахеита кур на основе мажорных антигенов вируса.// Тезисы Всероссийской научной конференции "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных". Москва. 21-22 апреля 1993.

/ ¿О/?* €