Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аденовирусная инфекция животных

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Аденовирусная инфекция животных"

РГб од

На правах рукописи

ФОМИНА НАТАЛЬЯ ВАСИЛЬЕВНА

АДЕНОВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ЖИВОТНЫХ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации, опубликованной в виде монографии, на соискание ученой степени доктора биологических наук

Покров - 1996 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко (ВИЭВ).

ОйЩАЛЬШЕ ОПШНЕНШ:

ЛАГУШН H.A. - доктор ветеринарных наук, профессор, ВШИВВиМ. 0РЛЯНКИН Б.Г. - доктор ветеринарных наук, профессор, (ВИЭВ. ПЕРЕВ03ЧИК0ВА H.A. - доктор биологических наук, ВШИЗЖ.

ВЩ1цЕ£ УЧРЕЖДЕНИЕ - Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт (г.Казань).

Защита состоится 4 октября 1996 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д-120.61.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии (60II20, г.Покров, Владимирской области).,

\

С диссертацией (монографией) можно ознакомиться^ библиотеке института.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Г.П.Фёдоров

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы

Издание первой в Российской Федерации монографии "Аденовирусные инфекции животных" весьма актуально по ряду причин.

Во-первых, аденовирусная инфекция крупного рогатого скота Разносторонне описала в сообщениях ученых Российской Федерации (Р.В.Велоусова, Г.А.Хасанов, В.В.Гуненков, П.П.Крюков, В.Н.Сюрин а др.). В отношении ее разработаны и внедрены методы лабораторной диагностики и специфической профилактики.

Во-вторых, сотрудниками ВИЗВа (Ю.Д.Караваев, М.Н.Соколов и цр.) изучены эпизоотические особенности аденовирусной инфекции эвец. Показана роль этого вируса в респираторно-кишечной патологии указанного вида животных. Однако в информативном плане в распоряжении научных сотрудников и педагогов вуза не было достаточной информации о самом вирусе (антигенной активности, вариабельности и родстве аденовирусов с подобными вирусами других видов, диагностике и профилактике этой инфекции).

В-третьих, аденовирусная инфекция свиней ж лошадей вообще не получила освещения ни в научной, ни в учебной литературе.

И, наконец, осведомленность специалистов^ по аденовирусной инфекции'птиц многие годы оставляла желать лучшего. Только с появлением в ряде стран синдрома снижения яйценоскости (ССЯ) и проникновения этой инфекции в птицехозяйства Российской Федерации многие ученые и практики стали живо интересоваться аденовирусной инфекцией птиц. • |

Учитывая все возрастающий интерес к аденовирусной инфекции у многих видов животных и в том числе птиц, мы сочли своевременным и актуальным более широко (на основании в основном иностранных источников) осветить эту проблему в отдельной монографии, надеясь, что она заинтересует ученых и практиков, сталкивающихся с инфекционной патологией вирусной природы у ряда_животных.

1.2. Цель работы

Основной целью настоящей работы является: ,

1) анализ данных о роли аденовирусной инфекции в возникновении пневмоэнтерита у телят, поросят, жеребят,, ягнят и синдрома

снижения яйценоскости (ССЯ-76) и других инфекций, вызываемых ад новирусами у птицы;

2) разработка иммунсферментного метода диагностики аденов русной инфекции птиц, вызываемой вирусами СЕЮ, ССЯ-76.

1.3. Основные задачи исследования

В соответствии с поставленной целью решались следующие зад

ЧИ:

- показать широту распространения аденовирусной инфекц среди многих видов сельскохозяйственных животных, домашних и д ких птиц на базе анализов специальной литературы и собственн исследований;

- показать антигенную вариабельность аденовирусов млекопит ющих и птиц по данным мировой литературы на период до 1990 года

- показать многообразие клинического проявления аденовиру ной инфекции у ряда сельскохозяйственных, лабораторных животных птиц, зпизоотологические особенности данной инфекции и ее ассоц ацию с другими болезнями вирусной и бактериальной природы;

- усовершенст&вать методы культивирования вируса ССЯ-76;

- разработать иммуноферментный метод лабораторной диагност ки аденовирусной инфекции птиц.

1.4. Научная новизна

Впервые в Российской Федерации и странах СНГ написана и и

СО

дана моногрййя, включающая современные таксономические положени структуру, химический состав аденовирусов, их роль в инфекционн патологии животных, экономический ущерб, наносимый аденовирусн инфекцией хозяйствам промышленного типа. Показана возможное применения иммуноферментного метода в диагностике аденовирусн инфекции птиц. Научная новизна подтверждена двумя авторскими св детельствами на изобретение.

1.5. Практическая ценность работы

На основании проведенных исследований разработан метод су пензионного культивирования вируса ССЯ-76. Разработан иммунофе ментный метод лабораторной диагностики аденовирусной инфекци вызываемой вирусом ССЯ-76 и вирусом СЕЮ. Данные методы внедре в практику научных исследований и широко применяются при диагно тике аденовирусной инфекции в ветеринарии.

1.6. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Сбор и критический анализ отечественных и зарубежных научных сообщений о роли аденовирусов в инфекционной патологии животных и птиц, опубликованных в виде монографии.

2. Усовершенстование метода культивирования вируса ССЯ-76.

3. Разработка иммуноферментного метода диагностики аденовирусной инфекции птиц, вызываемой вирусами ССЯ-76, CELO, У AL, а также AdH5 и Ad bos3.

1.7. Апробация работы

Материалы, вошедшие в монографию, доложены и обсуждены на:

- ХХШ Всемирном ветеринарном конгрессе, Монреаль, 1987 г.

- конференции молодых ученых ВИЭВ, 1932-1984 гг.

- заседаниях ученых советов ВИЭВ, 1982-1994 гг.

- семинарах и совещаниях ветеринарных специалистов в павильонах "Ветеринария" и "Птицеводство" ВДНХ СССР, 1982-1994 гг.

- семинарах врачей-вирусологов республиканских ветлаборато-рий, Москва, 1982-1990 гг.

1.8. Публикации результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ (включая монографию), в том числе два авторских свидетельства.

1.9. Объем и структура диссертации

Диссертация в виде монографии изложена на 397 страницах ти- ^ пографского текста (2 тома), включает предисловие (2 стр.), обзор " v литературы 13 глав (362 стр.), материалы и методы, результаты исследований (31 стр.), список использованной литературы (в 13-ти главах) 926 источников, в том числе 127 отечественных и 799 работ зарубежных авторов. Монография иллюстрирована 25 таблицамии и 7 рисунками.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Монография "Аденовирусная инфекция животных" включает 13 глав, в которых дана общая характеристика и современная классификация аденовирусов, особенности репродукции, генетика и молекулярные основы трансформирующего и онкогенного действия их. Указанные вопросы освещены в первых четырех главах монографии и изложены на 84 стр. В отдельных главах ее освещены аденовирусная

инфекция человека (глава V), крупного рогатого скота (глава VI) овец и коз (глава VII), свиней (глава VU1), лошадей (глава IX), собак (глава X), обезьян, лабораторных животных (глава XI) и птш (глава ХП и ХШ). Уделено особое внимание аденовирусной инфекцш птиц, вызываемой вирусами CELO, УАЬ и ССЯ-76.

Глава первая посвящена общей характеристике и современное классификации аденовирусов, в которой показана в хронологическо\ порядке история выделения аденовирусов за прошедшие 40 лет, начиная с первого выделения их от человека (Rowe, 1953) до настоящего времени, когда врачи эпидемиологи, эпизоотологи и вирусологи столкнулись с поразительно большим разнообразием представителей семейства Adenovirídae. Однако, несмотря на большое антигенное разнообразие, все представители семейства Adenovíridae оказались ^близки по структуре, физическим и химическим свойствам.

В морфологическом отношении аденовирусы представляют собой изометрические частивд диаметром 70-90 нм с икосаэдрической симметрией, состоящие из 252 капсомеров, 12 из которых находятся на вершине икосаэдров и несут один (род М) или два (род А) фибера. Сердцевина вириона имеет ДНК и два белка V/V и VII/ с терминальным 55 кД белком, ковалентно связанным с 5-концами каждой спирали i Аденовирусу содержат линейную двуспиральную ДНК с молкуляр-ной массой от 20 до 30 мД и в составе капсида 12 структурных бел-от 5 до 120 кД. Между аденовирусными ДНК у членов различных подродов обнаружено всего лишь 10-25% гомологии. ' \ Видоспецифичность различных антигенов варьирует в зависимости -от рода и подрода.

i i Помимо указанных критериев аденовирусы имеют дополнительные ■характеристики, имеющие значение при диагностике инфекции, а именно: 1) стабильность в широком диапазоне рН (от 3 до 9) и чувствительность к температуре 5б°С; 2) относительную специфичность к животным определенных видов и типам культур клеток, способностью индуцировать в этих системах инаппарантную или латентную jинфекцию, обусловленную персистенцией вируса; 3) и, наконец, агглютинирующей активностью в отношении эритроцитов гомо- или ге-терологичных видов.

Большой поток информации относительно репродукции аденовирусов (человека и животных, в том числе птиц) свидетельствует не только об интересных молекулярно-биологических (функциональ-

но-структурных) особенностях представителей семейства Абепоугп-с1ае, но и о совершенно новых методологических подходах в изучении молекулярной биологии других вирусов, главным образом, ДНК-содер-жаддах. Поэтому, придерживаясь принятой классификации аденовирусов М и А родов, можно отметить, что у всех членов рода м и у некоторых рода А обнаружены гемагглютинины и избирательность их в отношении эритроцитов различных видов животных.

Во второй главе монографии приведена подробная информация по репликации аденовирусов, особенности транскрипции их, показано, что аденовирусная иРНК транскрибируется с учетом хозяйской РНК-полимеразы 11, что у аденовирусов существует 3 периода транскрипции, которые строго регулируются на протяжении инфекционного цикла. Транскрипция (сверхранняя, ранняя и поздняя) регулируется клеточными и вирусспецифическими механизмами, т.е. проявляется каскадным типом.

В настоящее время общепринятыми критериями, по которым новые изоляты включают в семейство аденовирусов, являются следующие: икосаэдральная форма вириона с 252 капсомерами, покрывающая 20 равносторонних треугольных плоскостей; освещен вопрос о генах, экспрессируемых на промежуточном этапе репродукции аденовирусов.

Третья глава монографии посвящена генетике аденовирусов и, в частности, структурной организации генома аденовирусов, ранней транскрипционной области их ДНК. Генетика аденовирусов внесла значительный вклад в понимание механизмов репликации вирусов, картирование мутаций аденовирусов.- Описаны методы изучения антигенных связей- и наличие^ общего эпитопа у аденовирусов. Данная глава написана на основании 70 сообщений зарубежных исследователей. •

В главе, четвертой описаны молекулярные основы трансформирующего и онкогенного действия аденовирусов, различая четыре степени злокачественной трансформации клеток. Это сложный феномен, состоящий из нескольких независимых этапов, каждый из которых определяется разными вирусными генами и проявляется по-разному, в зависимости от взаимоотношений вируса с клеткой или организмом хозяина. Независимо от степени онкогенности все без исключения аденовирусы обладают способностью трансформировать клетки в непермис-сивных и полупермиссивных условиях, в которых не происходит экспрессии поздних генов и сборки вирусных частиц.

В общей схеме (двух фаз, включающих 8 стадий) репродукции вирусов приведено более углубленное описание каждой из этих стадий (по типам взаимодействия аденовирусов с клеткой, проникновению, раздеванию-депротеинизации, декапсидации) относительно общих закономерностей организации генома аденовирусов. Достаточно указать на роль аденовирусов в открытии сплейсинга, выявлении роли энхансеров и изучении процессов иммортализации и трансформации клеток. Рассмотрены некоторые механизмы, с помощью которых вирус ингибирует или изменяет экспрессию клеточных генов и, в частности, при продуктивной аденовирусной инфекции, селективная трансляция аденовирусных иРНК в зараженных клетках, ингибирование продукции клеточных иРНК, сборка вирионов аденовирусов и роль дефектных частиц.

Глава пятая посвящена аденовирусной инфекции человека. В ней кратко описаны клинические проявления и эпидемиология указанной инфекции, вызываемой 41 сероваром этого семейства, выделенных от больных с респираторными явлениями, конъюнктивитом, геморрагическим циститом и гастроэнтеритом. Интересно, что из 41 серовара аденовирусов человека заболевание людей вызывают лишь 1-3 серова-I ра. Во многих случаях аденовирусные инфекции протекают субклини-1 чески, и в инфицированном организме образуются антитела, которые, ; вероятно, защищают его от экзогенной реинфекцш теми же серовара-^ ми. Описана клиническая картина эпидемического керато-конъюнкти-\ вита, острого геморрагического цистита, вызываемые аденовирусами \ 4-го серовара.

\ В этой же главе кратко описаны методы диагностики аденоин-фекции (выделение вируса, цитопатология, обнаружение телец-вклю-. чений), эпидемиология и специфическая профилактика. В написании этой пятой главы использовано 54 источника отечественных и зарубежных работ.

Глава шестая посвящена описанию аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, а именно симптомов болезни, патологических изменений, биологических свойств аденовируса крупного рогатого

;___скота (устойчивости, антигенной структуре) и патогенеза болезни.

В монографии приведена сводная таблица эталонных штаммов (серова; ров) аденовирусов крупного рогатого скота. В составе гексона ВАУЗ имеются уникальные видоспецифические и межродовая (общая для аде, новирусов млекопитающих и птиц) антигенные детерминанты.

Надежным методом типирования аденовирусов, идентификации новых изолятов и определения внутриштаммовых различий является анализ продуктов на основе рестрикционного гидролиза ДНК: электрофо-ретичесих профилей продуктов гидролиза ДНК специфическими эндо-нуклеазами различных сероваров, специфичных для каждого типа, что позволяет рекомендовать рестрикционный анализ для генного типирования.

На основании различий в биологических свойствах бычьих аденовирусов и характера вызываемых ими изменений в культурах клеток их делят на две подгруппы, которые в монографии подробно охарактеризованы. Нами уделено внимание перевиваемой линии клеток почки теленка.

Всесторонне охарактеризованы противоречивые данные о гемг.-айютинирующих свойствах аденовирусов крупного рогатого скота. Эти свойства оказались неодинаковыми; они обусловлены видом и концентрацией эритроцитов, температурой и рН среды. Спектр гем-агглютинирующей активности многих штаммов аденовирусов крупного рогатого скота, выделенных в различных странах мира, недостаточно еще изучен. Относительно онкогенных свойств аденовирусов крупного рогатого скота в монографии приведена небольшая информация. Пока что бычий аденовирус типа 3 является единственным ДНК-овым вирусом крупного рогатого скота, способным индуцировать злокачкест-венные неоплазмозы у лабораторных животных.

Интерфероногенные свойства у аденовирусов крупного рогатого скота не изучены. '

При аденовирусной инфекции у этого вида животных наблюдается латентное вирусоносительство, о чем свидетельствуют факты выделения вируса из ткани почек, тестикул и крови клинически здоровых животных. В монографии приводятся источники и пути передачи инфекции, методы лабораторной диагностики этой болезни у крупного рогатого скота. Помимо данной монографии они описаны нами в справочной книге "Диагностика вирусных болезней животных" (Москва, Агропромиздат, 1991).

Шестая глава завершается описанием ретроспективной диагностики, дифференциальной диагностики и специфической профилактики крупного рогатого скота, опираясь на работы отечественных исследователей (Белоусова Р.В., Гуненков В.В., Каленкова Л.М., Нурга-зиев Р., Сюрин В.Н. и др.) и серологической оценкой поствакци-

нального иммунитета, изученной в кафедре вирусологии Московской ветеринаркой академии в 1980-1S90 гг.

Глава седьмая посвящена аденовирусной инфекции овец и коз, проявляющейся остро—протекающим заболеванием молодых животных указанных видов. Она широко, но не повсеместно распространена и появляется часто в ассоциации с парагриппом-3 (ПГ-3), что широко подтверждено в монографии работами отечественных исследователей о заболевании ягнят смешанной этиологии (Н.И.Писаренко, М.Н.Соколов, 1978; Тищенко В.П., 1980).

Впервые вирус аденоинфекции был изолирован.из фекалий овец в 1969 году в Шотландии (Шарп, Макферран и Pao), позднее он был выявлен в Австралии, Венгрии, Сенегале и др.странах. В книге приведены данные о морфологии и химическом составе аденовирусов овец и генетических различиях аденовирусов'крупного рогатого скота и овец.

В монографии также приводятся данные по устойчивости аденовирусов овец к физико-химическим воздействиям, сведения о закономерности формирования гуморального иммунитета на основании выявления специфических антител у различных возрастных групп овец (по данным реакций РН и РСК).

; Род Mastadenovirus включает шесть сероваров аденовируса овец и один серовар аденовируса коз, причем вирусы типов 1, 2 и 3 -имеют общий комплементсвязываюпщй антиген, который отличается от антигена типов 4,5,6, на основании чего аденовирусы овец делятся на 2 подгруппы: 1 и П.

, В реакции диффузионной преципитации и РСК было четко показано, что все овечьи штаммы аденовируса содержат общий для аденовирусов млекопитающих антиген, а тест иммунофлуоресценции подтвердил это положение.

Таким образом, аденовирусы овец были выделены во многих странах мира, но в антигенном отношении они оказались неидентичны.

■ Следует отметить, что молекулярная масса геномов аденовирусов овец и крупного рогатого скота меньше генома аденовируса человека. -

, Гемагглютинирующие (ГА) свойства овечьих аденовирусов. Исследование гемагглютинирующих свойств дало возможность дифферен-" цировать серологически близко родственные овечьи и бычьи штаммы,

что может быть использовано, как наиболее простой внутритиповой дифференцирующий маркер овечьих и бычьих штаммов.

Экспериментальная инфекция воспроизводилась на молодых ягнятах. Опубликованные по данному вопросу сообщения однозначно свидетельствуют о том, что аденовирусы являются одним из вероятных возбудителей"синдрома слабости молодняка", что подтверждалось па-тологоанатомическими изменениями внутренних органов. Так, штамм РА/8 у зараженных ягнят вызывал яркую клиническую картину болезни с поражением дыхательных путей. Венгерский штамм Het/3, помимо гиперемии и поражения респираторного тракта, вызывал дисфункцию кишечника и проявлял выраженную контагиозность.

Аденовирусы овен размножаются в перевиваемых культурах различных тканей человека и животных. Установлены цитоплазматические изменения; характеристика цитопатического эффекта не связана с сероваром аденовируса, а скорее всего со штаммом, который в опытах вызывал агрегаций клеток в виде гроздей, в то время как другие штаммы индуцировали диффузное округление и набухание клеток. Используя метод непрямой иммунофлюресценщга Belak S., (1980) показал, что в инфицированной культуре вирусный антиген в ядрах клеток появлялся через 8 часов после, заражения и к 16-му часу ухе более 90X клеток обладали внутриклеточной флуоресценцией. Данный те>йт оказался пригодным для постановки быстрого диагноза на пневмознтериты аденовирусной этиологии у ягнят.

Диагностика аденовирусной инфекции у овец мало чем отличается от методов, применяемых при установлении диагноза на аденовирусную инфекцию у крупного рогатого скота. Обычно групповую идентификацию изолята проводят с помощью РСК и РДП, а типирование - в PH.

У овец в результате перенесенной инфекции после вакцинации создается активный иммунитет к аденовирусной инфекции. Высокой противовирусной активностью обладают секреторные антитела слизистой оболочки респираторного тракта переболевших и вакцинированных овец. Переболевшие овцематки сообщают потомству колостральный иммунитет, предохраняющий его в течение 2-2,5 месяцев.

В Венгрии в 1967 году впервые были разработаны и применены живые и инактивированные вакцины из штамма ТНТ-62 серовара 4 аденовируса крупного рогатого скота. В монографии приведены результаты применения формолвакцины.

Данная глава написана на основании 98 источников отечественной и 35 иностранной литературы.

Глава восьмая. Аденовирусная инфекция свиней - это хроническая у взрослых животных и острая у поросят болезнь, проявляющаяся, главным образом, поражением респираторного тракта. Аденовирус свиней впервые был изолирован из смывов прямой кишки у свиней, больных диареей (Haid D.A., et al., 1964, Hirohara Т., 1990). С 1964 года по настоящее время определено 4 серовара аденовирусов свиней: 1 - 25Р, 11 - А47, 111 - 6618, IV - 618, причем штаммы серовара 4 имеют наиболее широкое распространение как в европейских странах, так и в Северной Америке. Обнаружение антигенного родства между аденовирусами свиней и аденовирусами других видов животных обычно осуществляют в реакции нейтрализации. Аденовирусная инфекция свиней написана на основании ■ анализа 35 сообщений.

Аденовирусы свиней лучше всего размножаются в первично-трип-синизкрованной культуре клеток почек свиней и культуре клеток меломы собак, но очень плохо в культуре клеток крупного рогатого скота и человека (Kasza L., 1966).

Все известные штаммы свиных аденовирусов серовара 4 агглютинируют эритроциты различных видов животных, PAV-1 агглютинирует эритроциты морской свинки, человека О группы и крыс при температуре 37° и 4°С, однако PAV-2 и PAV-3 вообще не вызывают-гемагглю-тинацию (Clarke М.С., Schärpe H.B.А., 1967). В монографии приводятся сведения о вирусемии, вирусоносительстве и вирусовыделении, а также патогенности свиных аденовирусов.

В монографии приведены данные об экспериментальной инфекции.

Интраназальная инокуляция вируса оказалась наиболее эффективным методом воспроизведения инфекции. .

При аденовирусной инфекции у свиней клинические признаки и явные поражения минимальны или совсем отсутствуют. Для выделения вируса лучше использовать перевиваемую культуру РК-15. В окрашенных препаратах инфицированных клеток выявляют внутриядерные тельца-включения. Серологическая идентификация изолированного вируса проводится в РН с референтной сывороткой. Серологический анализ на аденовирусную инфекцию у свиней можно установить по увеличению титра антител в РН или иммунофлуоресценции.

Специфическая профилактика не практикуется.

Глава IX. Аденовирусная инфекция лошадей. Это острая контагиозная болезнь жеребят, прояляюшдяся гипертермией, конъюнктивитом, пневмонией и часто гибелью иммунодефицитных жеребят арабской породы. У взрослых лошадей болезнь протекает легко. Описана клиническая картина и иатологоанатомические изменения, морфология и химический состав вируса. Антигенная структура аденовируса лошадей не изучена. Антигенной вариабельности штаммов этого вируса не установлено. Вирус обладает гемагглютинирущими свойствами (эритроцитами крысы или человека 0 группы).

Культивирование. Вирус лучше всего репродуцируется в культуре клеток почки лошадей, бычьей почки и перевиваемой линии клеток BSC-1.

Патогенные свойства проявляются ярко на жеребятах арабской породы.

Экспериментальная инфекция - почти все жеребята различных пород (кроме арабской) легко переносят экспериментальную инфекцию с развитием слабых респираторных симптомов. Повышенная чувствительность .к ней у жеребят арабской породы объясняется врожденным дефектом Т- и В-лимфоцитарной системы, генетически контролируемой геном, ответственным за аутосомный рецессивный иммунный ответ (Мс Jnire т.е., Pogpne М., 1973; Thompson D.B., Studdert M., 1975).

Диагностика проводится как при аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, овец и свиней. Специфическая профилактика не разработана.

Глава X. Аденовирусная инфекция собак. Аденовирусная инфекция собак проявляется в виде инфекционного гепатита, вызываемого сероваром 1 (CAV-1) и аденовироза. вызываемого сероваром 2 (CAV-2) аденовируса плотоядных. Инфекционный гепатит собак (ИГС) имеет синонимы: заразное воспаление печени собак, болезнь Рубар-та, вирусный гепатит. Это остроконтагиозная болезнь, сопровождающаяся лихорадкой, воспалительными процессами конъюнктивы, слизистой оболочки носовой полости и желудочно-кишечного тракта, печени и желчного пузыря, иногда - нарушением деятельности центральной нервной системы (В.И.Уласов, 1990; S.Rusarth, 1947,]показали, что возбудители ИГС и энтерита лисиц - один и тот же вирус,.

Приведены современные данные о ИГС. Глава написана на основании анализа 88 литературных источников, из которых 20 отечественных и 68 иностранных. В частности, описывается клиническая

картина и патологоакатомические изменения, патогенез болезни, клиническое проявление аденовироза и энцефалита лисиц.

По признаку острого воспаления миндалин и отсутствию воспаления легких можно клинически дифференцировать чуму плотоядных от "инфекционного гепатита. Для последнего наиболее .'типичным являют. ся фибринозно-геморрагические наложения на поверхности печени и .кишечника, студенистый отек стенки желчного пузыря, в 90Х случаев увеличение и полнокровие селезенки.

В монографии приведены данные об устойчивости вируса к физико-химическим средствам, об антигенной структуре и активности вируса ИГС и культивировании. Из перевиваемых культур к этому вирусу оказались чувствительными клетки МДСК.

Экспериментально гепатит можно воспроизвести у собак, лисиц, песцов 4-6-месячного возраста. Интересно отметить, что аденовирус собак серовар 1 был выделен от американских черных медведей (иг-sus americanus). Описана экспериментальная инфекция у лисиц. Возбудители ИГС и аденовироза обладают выраженным гепатотропизмом.

0 В разделе антигенная вариабельность и родство указаны различия в патогенности сероваров 1 и 2, Показан спектр патогенности вируса ИГС и чувствительность к этому возбудителю песцов, лисиц, мышей, обезьян, кроликов, утят и крупного рогатого сйэта.

Для ИГС характерно длительное вирусоносительство в течение ряда лет. Основным источником инфекции являются больные собаки, выделяющие вирус с мочой, носовой слизью, конъюнктивальным секретом и калом.

Инфекционный гепатит диагностируют на основании .зпизоотоло-гических, клинических, патологоанатомических и вирусологических исследований. Описаны методы выделения вируса, идентификации его • в РСК, РДП, РИФ, ИФА и гистохимическом исследовании и серологическая в РН, РЗГА, РСК, РДП,серодиагностика и ретроспективная диагностика. Глава завершается описанием иммунитета и специфической профилактики (применением живых и кнактивированных вакцин). Симптоматическое лечение включает применение гипериммунных сывороток.

Глаза XI. Аденовирусная инфекия обезьян и лабораторных животных.

Аденовирусная инфекция обезьян. После первого сообщения, о изоляции штаммов аденовирусов обезьян в 1956 году (Hull, Minner, Snuth, 1956) большое число их было выделено от этого вида кивот-

ных в Азии, Африке, Новом Свете. Двадцать обезьяних сероваров аденовируса рекомендовано обозначать как аденовирусы от SAV-1 до SAV-20. Вирус SAV-20, выделенный от африканских зеленых мартышек, и аденовирус SAV- .19 (АА153) от африканских бабуинов в РН отличаются от 35 сероваров человека. В монографии приведены данные по культивированию аденовирусов обезьян и классификации их (20 сероваров) в РГА в 4 подгруппы.

Помимо аденовирусов обезьян уделено внимание этиологической и патогенетической роли обезьяноподобных вирусов, экспериментальной инфекции африканских верветок, орангутангов, гиббонов и шимпанзе. Широко охарактеризованы гемагглютинирующие свойства ряда штаммов аденовирусов шимпанзе с эритроцитами макаки-резус и мартышки верветки.

Дается характеристика вирусов, выделенных от мышей (MAV-1 и MAV-2), их гемаггдютинируодая активность. Показано, что природные мышйные аденовирусы широко циркулируют среди лабораторных мышей. Приведены сведения о патогенезе аденовирусной инфекции у мышей' и течении экспериментальной инфекции у этих животных. Интересно, что вируспродуцирующие клетки у них рассеяны в эпителиальном слое слизистой оболочки тонкого кишечника, причем, устойчивость кишечника к вирусу контролируется, главным образом, локально продуцируемым Ig А.

Описана аденовирусная инфекция хомяков, кроликов с клинической картиной диареи. Вирус агглютинировал эритроциты кроликов. По мнению Boton U.,Ital., (1979), выделенный агент представлял иной серотип Mastadenovirus, для которого кролик являлся естественным хозяином.

Описаны случаи выявления аденовирусной инфекции у морских львов, опоссума и тупайа.

Глава XI написана на основании анализа 35 зарубежных сообщений.

Глава ХП. Аденовирусная инфекция птиц, вызываемая вирусом CELO mIJAL. Это хроническая, в основном у птиц, и летальная у куриных эмбрионов инфекция, вызываемая вирусом CELO и 9AL.

Первые сообщения в 1952 году о выделении аденовирусов птиц поступили из Южной Африки и США. С тех пор были выделены многочисленные изоляты аденовирусов, в том числе от домашних кур, индеек, уток, фазанов, перепелов, цесарок, голубей, а также диких

птиц. Однако,пока не были выявлены связи между изолятами и болезнями птиц, выделенные изоляты получили саше разные названия, например, "знтеровирус",' "латентный вирус", или "знтероцитопато-генный птичий вирус орфан (ЕСАО)". Так, выделенный из куриных эмбрионов вирус CELO соответственно его патогенному действию назван Chicken Embryo Lethal Orphan. Вирус, выделенный как контами-нант из штамма RPL-12 лимфоидного лейкоза, из-за сходства с аденовирусом получил название ííalles Adeno-Like (yAL). Ветеринарным вирусологам были известны три серовара птичьих аденовирусов. Это возбудитель бронхита перепелов (Qnail Bronchitis virus), выделенный в 1949 году доктором Olson N. в Западной Вирджинии (США), CELO - кишечный сиротский летальный вирус куриных эмбрионов, изолированный в 1952 году доктором Jates V.J., и вирус, изолированный в 1958 году доктором Sharpless J.R. и идентифицированный позднее Burwester В. I960, как адекоподобный вирус 3AL. В 1963 году вирусы CELO и -9AL были отнесены к аденовирусам.

В настоящее время насчитывается 12 различных сероваров аденовирусов, относящихся к группе CELO, 9AL и один тип возбудителоя синдрома снижения яйценоскости или литья яиц (Egg Drop Syndro-me-76, EDS-76), выделенный доктором J.H.H. van Eck в 1976 году.

Аденовирусная инфекция в птицеводстве по ряду причин приобрела особое значение. Во-первых, у кур она вызывается возбудителями таких болезней, как гепатит с тельцами-включениями, у индеек - как геморрагический энтерит, у фазанов - как вирусный гепатит

вирусы также частоБстрёчаются в роли вторичногоУбронхител кур, микоплазмозаадругих заболеваниях дыхательных путей птиц.

Во-вторых, аденовирусы отрицательно влияют на яйценоскость и качество яиц. И, наконец, вследствие вертикальной передачи этих вирусов они, контаминируя куриные эмбрионы, часто являются помехой в использовании их с целью репродукции других вирусов, что затрудняет проведение лабораторной диагностики других вирусных инфекций птиц.

Показано распространение и эпизоотические особенности аденовирусной инфекции птиц, естественное течение CELO-инфекции, патология куриных эмбрионов, экономический ущерб. Приведена характеристика вирусов CELO и 5AL, электронно-микроскопическая картина двух указанных вирусов, их геном и белки, структурный "V" и не-

структурный "Т"-антигены. Приведены литературные данные по классификации аденовирусов птиц, их устойчивости к физико-химическим воздействиям, антигенной структуре, иммунологическим и морфологическим свойствам. Последние идентифицируют по струтурным субъединицам вируса, которые обозначают: 1/гексон-антиген; 2/пентон-ан-тиген; 3/фибер-антиген. У аденовирусов птиц данные о длине фибера различаются.

Антигенная активность. Аденовирусы птиц индуцируют антитела, определяемые в РСК, РИФ, РДП, ELISA, PH и РЗГА. Антитела одного и того же типа обнаруживают также и в желтке яиц инфицированных кур-несушек. У цыплят материнские антитела сохраняются до 5-б-дневного возраста. Для обнаружения специфических антител к аденовирусу птиц в основном используют два теста: РДП и микронейтрализацию. РН используют для обнаружения специфических антител в белке и желтке кур. Тест микронейтрализации используют для одновременного выявления уровня нейтрализующих антител к определенному серовару.

Вирус CELO в организме кур, кроликов и морских свинок также индуцирует вируснейтрализующие антитела.

Местный иммунитет при аденовирусной инфекции играет более важную роль, чем гуморальный, так как препятствует размножению вируса в слизистых оболочках.

Относительно антигенной вариабельности и родства аденовирусов птиц известно, что все они имеют общий групповой антиген, выявляемый методом двойной имунодиффузии и РИФ. Нет антигенного родства между аденовирусами птиц и вирусом других семейств инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, птичьего энцефаломиелита, болезни Ньюкасла, птичьего лимфоматоза или лейкоза, оспы птиц, саркомы Рауса и др.

В современных птицеводческих хозяйствах аденовирусы постоянные убиквитарные агенты. Их часто изилируют от внешне здоровых птиц. Антигенные связи между вирусами группы -3AL приведены в таблице 1.

Таблица 1

Сравнительные антигенные связи между двумя группами

Вирус : 9А1Л : УАЬ2 : 95 : 65 : ЗАЬЗ : 9АЬ4 : 93

УАЫ ++++--9АЬ2 -+++--95 + ++ +-65 - +■ ■ -9АЬЗ ---_ + + + Ш4 --_- + + + 93 ---- + + + ЕУ-89 ---- + + +

Достаточно четко охарактеризованы аденовирусы птиц по их па-тогенности, что видно из таблицы 2.

Таблица 2

Сравнительная патогенность аденовирусов птиц, выделенных в США (Calnek B.W., Cowen B.S., 1975)

Серотип : Число : : изолятов :

Болезнь

2

3

4

5

6

7

8 9

10

12

Гибель эмбрионов, респираторные болезни, снижение яичной продуктивности, гепатиты (Индиана С)

Инфекционная анемия (DPL-2) Инклюзивный гепатит (Tipton, DPL-1) Не вызывает

Инклюзионный гепатит в Англии и др.странах

Не вызывает

Не вызывает

Не вызывает

Не вызывает

Не вызывает

1

Антигенная вариабельность и родство. Аденовирусы птиц, вызывающие гемагглютинацию и образование гемагглютинатов, могут быть с успехов использованы для установления родства между аденовирусами человека в РЗГА, что соответствует классификации сероваров, определяемых с помощью РН.

Описаны методы титрования аденовирусов птиц, которые хорошо репродуцируются в развивающихся куриных эмбрионах. Детально описаны результаты репродукции аденовирусов в культуре клеток. Для каждого серовара выявлено несколько вариантов размера бляшек.

Культивирование. Помимо моноолойной культуры клеток аденовирусы репродуцируются в клеточкой суспензии (печени и почке куриных эмбрионов). Описаны особенности репродукции аденовируса птиц, который не освобождается из инфицированных клеток даже при полной дегенерации их, а также цитопатология культуры клеток печени куриных эмбрионов, зараженных вирусом CELO.

Гемагглютинирукщие свойства. В отличие от аденовирусов человека аденовирусы птиц не агглютинируют эритроциты за исключением некоторых штаммов серовара 1, которые агглютинируют эритроциты крыс. Также приведена информация по интерфероногенному и тератогенному действию аденовирусов птиц (CELO).

Заслуживают внимания сообщения об онкогенных свойствах вируса CELO у новорожденных хомяков. С помощью РСК и МФА в опухолях этих животных был выделен специфический опухолевый Т-антиген.

В следующем разделе монографии приведена информация о адено-ассоциированном вирусе (ААВ), который, как правило, сопутствует аденовирусу CELO. Оказалось, что как вирус CELO, так и ААВ передаются потомству через яйцо, однако оба ойи не передаются транс-овариально при наличии у несушек специфических антител. В монографии приведено несколько объяснений трачсовариальной передачи указанных-вирусов. Интересно, что ААВ изменяет патогенез аденовирусной инфекции у птиц.

В главе ХП описан спектр патогенносги аденовирусов птиц в естественных условиях (табл.2), а также экспериментальная инфекция цыплят и куриных эмбрионов. Разноречивость результатов воспроизведения экспериментальной аденовирусной инфекции у цыплят и кур, видимо, можно объяснить индивй^альными особенностями полевых штаммов. Приводится описание гистопатологических изменений у кур при аденоинфекции. Что касается патологии эмбрионов, эксперимен-тално зараженных вирусом CELO и 5AL, то картина выглядит более однозначно. При заражении их вирусом CELO в 6-13-дневном возрасте происходит гибель эмбрионов, карликовость или курчавость их оперения. После адаптации вируса 9AL к эмбрионам он становился для них летальным при любом методе заражения.

В главе ХП приводится раздел локализации вируса, вирусемия, вирусоносительство и вирусовыделение. Передача аденовирусов птиц происходит в результате 1-2-недельного контакта птицы в период яйцекладки. Цыплята, инокулированные интратрахеально или в синус

вирусом CELO, выделяют его с фекалиями, передают здоровым контактирующим цыплятам.

Аденовирусы широко распространены при всех системах содержания птицы. Их выделяли почти в каждом клиническом случае и, одна-

ппп ^„.Л л^гт^ппп л ««.-.I*.". Л--.. ----.-----------------

iw, ли wDijtи ийлоопи чепце iDwci и идпо»и wo фирм i t?ucuw±d V ttttrwiÄJ-

зионный гепатит), респираторной болезнью, синдромом снижения яйценоскости, диареей, теяосиновитом, а также плохим ростом.

В монографии отрачсен вопрос о бессимптомном течении (персис-тенции вируса) аденовирусной инфекции, длительности вирусоноси-тельства внешне клинически здоровыми птицами. Распространение аденовирусной инфекции на племенных фермах ускоряется одновременным заражением птицы аденовирусом, вирусом инфекционного бронхита или микоплазмами.

Таким образом, эпизоотологические особенности аденовирусной инфекции птиц коротко сводятся к следующему: во-первых, вирусы группы CELO и 9AL устойчивы к теплу, кислотам, растворителям жи-I ров, ультрафиолетовым лучам; во-вторых, передача этих вирусов от птицы к птице происходит вертикальным и горизонтальным путями; в-третьих, скорость распространения данной инфекции внутри стада различна (ускоряют этот процесс помимо адено-, инфекционный бронхит, микоплазмоз галлисептикум, болезнь Гамборо); в-четвертых, при данной инфекции аденовирусы широко поражают многие ткани цыплят, вызывая стадию виремии; в-пятых, адеЬвирусная инфекция птиц сопровождается персистенцией вируса.

Что касается иммунитета и специфической профилактики, в монографии этому вопросу посвящен раздел литературного анализа. Однако приведенные в ней результаты практически не поддаются обобщению. Так, у суточных цыплят, зараженных per os аденовирусом CELO, авторы наблюдали замедленное образование антител, при этом число птиц, реагировавших в РДП, было ниже, чем при интратрахе-альном заражении, или, например, число серопозитивных птиц старшего возраста всегда превышало число серопозитивных молодых цыплят (Monreal J., et al., 1966). Кроме того, при естественном инфицировании еще недостаточно изучена последовательность выявления антител у зараженной птицы. Учитывая это обстоятельство, специфическая профилактика птиц против аденоинфекции пока еще находится на стадии научных поисков (кроме ССЯ-76).

В монографии приведены обнадеживающие результаты по вакцинации индеек против геморрагического энтерита и фазанов против болезни мраморной селезенки. Изучено формирование иммунитета у перепелов и кур в отношении вируса CELO-1.

Значительный раздел монографии посвящен описанию клинических форм проявления аденовирусной инфекции у цыплят, гусей, индеек, перепелов и фазанов (инклюзионный гапатит, инфекционная анемия и аденовирусный синовит бройлеров, гепатит кур-несушек, аденоинфек-ция у перепелов и индеек, бронхит перепелов, геморрагический энтерит индеек, болезнь мраморной селезенки фазанов, аденовирусная инфекция гусей, анемия кур).

Взаимосвязь между аденовирусами и другими инфекциями птиц.

Аденовирусы широко распространены у птиц. Их выделяют не только от птиц с самыми различными клиническими симптомами, но и от абсолютно здоровых. Это затрудняет ответ на вопрос: является ли вирус этиологическим агентом отмеченного клинического синдрома или речь идет о реактивации персистирующего вируса, вызванной другими возбудителями, или это просто случайное выделение?

Как бройлеры, так и несушки подвержены аденовирусной инфекции в Австралии, Англии и Германии. Сам по себе синдром этой болезни проявляется слабо, но он становится тял&ым в случаях осложнения MycoplasMa gallisepticum или вирусом инфекционного бронхита, поэтому снижение яичной"продуктивности может явиться следствием смешанной инфекции.

№ еще мало знаем вирулентные серовары птичьих аденовирусов. В противоположность этому все штаммы вируса ньюкаслской болезни, кроме штаммов Bi и La Sota, Бор-74 (ВГНКИ) и др. - вирулентны в разной степени.

ХП глава - аденовирусная инфекция птиц, вызываемая вирусами CELO и 9AL, написана на основании 269 литератруных источников. В ней приведен раздел собственных исследований по диагностике аде-ноинфекции (CELO и 9AL) в ряде птицехозяйств.

Глава ХШ - Аденовирусная инфекция кур, вызываемая . вирусом ССЯ-76. Болезнь проявляется синдромом снижения яйценоскости, размягчением или депигментацией скорлупы яиц, впервые описана голландским ученым J.H.H. van Eck в 1976 году.

Вирус ССЯ-76 не принадлежит ни к одному из 12-ти серотипов птичьих аденовирусов, отличаясь" от них в серологических реакциях,

а также гемагглютинацией (куриных, утиных и гусиных эритроцитов). Изолированный в 1978 году МеТеггап J.D.et al вирус ССЯ-76 в настоящее врем известен как штамм 127. Идентичный штамм Baxendale W. изолировал в 1978 году из лейкоцитов кур. В последующие годы подтверждена ведущая роль этого вируса в возникновении синдрома снижения яйценоскости. Было также показано широкое естественное распространение его среди уток. По данным Baxendale W.J. у 80% кур с пониженной яйценоскостью постоянно обнаруживали антитела к вирусу ССЯ-76. Серологическое обследование диких птиц показало наличие антигемагглютининов к ССЯ в крови сов, аистов, лебедей, диких гусей и уток.

В монографии подробно описаны клинические признаки и патоло-гоанатомические изменения при ССЯ-76. Основным характерным клиническим признатом инфекции в стаде является снижение яйценоскости до 15% и более. Кроме того, для кур яичных пород характерно изменение внутреннего качества яиц: белок их становится водянистым и мутным с беловатыми хлопьями. 'Снижение продуктивности может колебаться в пределах 3-551. Вирус в латентной форме, находящийся в организме ранее, и резкое действие его проявляется на фоне физиологического стресса - возрастания яйценоскости и увеличения гормонов (Meferran, 1981). Что касается механизма, который обуславливает повреждения яичной скорлупы, то он до сих пор не ясен.

Приведены данные об экономическом ущербе, наносимом вирусом сся-76. Так, еще в 1975 году во Франции отмечали, что средние потери от этой болезни составляли 15 яиц на несушку. Больная птица давала до 15% деформированных, совершенно без скорлупы или с очень слабой скорлупой яиц.

В книге приведено описание морфологии и химического состава вируса ССЯ-76. Оказалось, что ДНК этого вируса не гомологична ДНК птичьих аденовирусов других сероваров. Гемагглютинин его более стабилен и выдерживает нагревание при 70°С 1в течение 30 минут.

Все цыплята, экспериментально зараженные вирусом ССЯ-76, содержат три типа антител (прещтитируюпдае, вируснейтрализуюшие и антигемаглютинины), связанные с иммуноглобулинами класса J. Наличие нейтрализующих антител показано с 6-го дня после заражения, титр их возрастал до 28 дня. Преципитируюшие антитела обнаруживались на 6-й день и с 17-го дня титр их начинал снижаться. Анти-гемагглютинины появлялись в течение первых шести дней, максималь-

ные титры их наблюдались через 15 дней после заражения. Уже через б дней после заражения птиц штаммом 127 антитела выявлялись во всех указанных серологических реакциях (Darbyslure J.H., Peters R.W. , 1980).

Цыплята, выведенные от серопозитивных родителей, до 4-не-дельного возраста содержат материнские антитела, период полураспада которых 3 дня.

Отмечено два варианта ситуации влияния материнских антител на возможность выделения вируса ccfi-76, передаваемого вертикально.

Материнские антитела (вируснейтрализующие и антигемагглюти-нины) через желток сообщают цыплятам пассивный иммунитет в течение первых 4 недель жизни. Однако антитела пассивно передаются потомству, не полностью нейтрализуют вирус, передаваемый вертикально, и вирус в скрытой форме в организме пассивно иммунных цыплят проявляет себя как патогенный лишь в стрессовый период, у птицы это период яйцекладки (Zanella A.efal, 1980).

Однако возможна и другая ситуация. У однодневных цыплят без материнских антител вирус размножается, индуцируя активные антитела, тогда как у цыплят, имеющих материнские антитела, он не размножается, не реизолируется и не индуцирует образование анти-гемагглютининов.

В монографии широко освещены сравнительные антигенные' и патогенные свойства штаммов 127, ВС-14, Д-61, Е-77, 3877, М-13, причем штаммы, выделенные в различных странах мира, в антигенном отношении оказались родственными.

Гемагглютинирующие свойства. Штаммы вируса ССЯ-76 отличаются от других 12 сероваров аденовирусов кур гемагглютинирующей активностью. По этому признаку вирус ССЯ-76 в классификации аденовирусов кур занимает особое место. Все штаммы этого вируса агглютинируют эритроциты кур, гусей, индеек, уток, а мексиканский вирус ССЯ-76 (НО-1) и эритоциты человека, павлинов и голубей. Штамм 127 агглютинирует эритроциты птиц, но не млекопитающих. Гемагглюти-нин этого вируса устойчив при температуре 56°С Солее 8 дней.

В монографии широко описан спектр патогенности штаммов Е-77 и ВС-14, которые в ряде стран были выделены от уток. Показано, что вирус ССЯ-76 в организме инфицированной птицы может находиться в латентном состоянии до ее половой зрелости и начала яйцекладки.

Приведены данные об экспериментальной инфекции, а также способности к вылуплению цыплят из двух партий яиц: обесцвеченных (от инфицированных птиц) и нормальных. Показано, что патология при ССЯ-76 проявляется однотипно у кур-несушек, разных линий и пород.

В разделе монографии - культивирование вируса: утиные эмбрионы, однослойная и суспензионная клеточные культуры утиного происхождения - это оптимальная система для культивирования вируса ССЯ-76. Ряд авторов выделяли и культивировали на утиных эмбрионах несколько изолятов, заратая их в аллантоисную полость (Николаева И.П., Рождественский И.К., 1982).

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Раздел "Собственные исследования", выполненный во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) в период с 1982 по 1992 гг., касается серологической диагностики аденовирусной инфекции, вызванной вирусом FAV-l (CELO); получение гипериммунных сывороток на кроликах, петухах и козах; культивирование вируса ССЯ-76 в различных культурах клеток и утиных эмбрионах. Этот раздел был выполнен совместно с Осидзе С.Д.

Нами проведено масштабное серологическое обследование птице-хозяйств на наличие антител к аденовирусу FAV-l (CELO) с помощью РДП с целью выявления эпизоотической ситуации по аденовирусной инфекции птиц в некоторых хозяйствах, неблагополучных по респираторному микоплазмозу. Было обследовано 3 птицехозяйства, исследовано 554 пробы сывороток крови от кур равных возрастных групп.

Аденовирусный антиген был получен при заражении 9-дневных куриных эмбрионов в аллантоисную полость (0,2 мл аденовируса). Гипериммунная сыворотка на аденовирусный антиген получена на кроликах при иммунизации их штаммами Phelps и Tipton -5 аденовируса птиц по схеме, указанной в монографии (стр.72, т.2). Титр преци-питирующих антител в гипериммунной сыворотке составил 1:32.

Сыворотку крови кур разных возрастных групп (2-2,5; 10-11; 12-15 мес.) исследовали в РДП с аденовирусным антигеном.

Результаты исследований. Суммированные данные приведены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты исследований в РДП сывороток крови кур разных возрастов

Птицефабрика : Возраст : Число: Число положит.: Процент поло: птицы/мес.: проб : реагирующих : жит.реагирующих •

Томилинская

Кунцевская Владимирская

Совхоз "Путь" к коммунизму"

2-2,5 12-16 16-17 1-1,5 10-11 разных возрастов

14

43 40 120 9

140 132

60 10

84

96 34

6 3

70,0

73,0 26,0

10,0 30,0

Всего:.

554

223

40,0

Как видно из таблицы, антитела к аденовирусу птиц выявлялись у кур более старшего возраста, т.е. в период яйцекладки, начиная с 10-месячного возраста и до выбраковки птиц. В этот период в РДП положительно реагировало до 707. птиц. В отличие от взрослых несушек молодняк (1-2,5 ыес.) не имел специфических антител к аденовирусу (CELO) птиц. Титр антител в РДП у обследованной птицы составлял 1:4 - 1:8.

2-й раздел исследований, касающийся получения гипериммунных сывороток на петухах и козах, описан ниже (см."Разработка диагностического набора для диагностики ССЯ-76").

3-й раздел, исследований "Культивирование вируса ССЯ-76 в различных видах эмбрионов и культурах клеток" проводили по общепринятым методикам. 1

В результате исследований установлено, что накопление вируса ССЯ-76 в зкстраэмбриональной жидкости уток не зависело от количества пассажей возбудителя в этой системе. Активное накопление гемагглютининов отмечалось уже на вторые сутки и достигало максимального титра 8,33+0,17 logo- Б последующие сроки инкубации змб-рионов происходило дальнейшее повышение титра и к третьим суткам он достигал .9,33+0,17 loga» проявляя тенденцию к дальнейшему увеличению. К 5-6 суткам титр гемагглютининов достигал 11,77+0,14 log2. Инфицирование эмбрионов вирусом в дозе 10%lJZfeo/o. i мл и 102ЭИД5о/о. i мл сопровождалось меньшим накоплением гемагглютининов, что являлось показателем и уровня репродукции вируса. Причем последовательное пассирование вируса на утиных эмбрионах, заражаемых в дозе Ю4 ЭВД50/0.i мл, не влияло существенно на повышение инфекционного титра. Вирулентность его для эмбрионов сохранялась на одном уровне и составляла 104- 00-ю4'63 ЭИД50/0.1 мл.

Однако указанный штамм 127 не размножался в 9-суточных куриных и 8-суточных перепелиных эмбрионах при заражении их в аллан-тоисную полость, но хорошо разножался в культурах фибробластов эмбрионов уток (ФЭУ), кур (ФЭК) и гусей (ФЭР), почках эмбрионов уток (ПЗУ), кур (ПЭК), перепелов (ПЗП) и печени утиных эмбрионов (ПЗУ). В течение пяти последовательных пассажей инфекционный титр вируса в культуре клеток почек эмбрионов кур не превышал 2,38+0,01 lgTIUfeo/M*. а гемагглютинирующий - 4,33+0,17 I022: в культуре клеток фибробластов эмбрионов кур - ,2,0+0,05 lgWlso/un и 4,11+0,11 log2; в клетках почек эмбрионов перепелов - 2,20+0,09 lgim¡50/MJ¡ и 3,22+0,15 log-2; в клетках почек эмбрионов уток инфекционный титр достигал 4,20+0,01 1£ТЦД50/мл» а гемагглютинирующий - 6,26+0,6 log2- Таким образом, культура клеток почек эмбрионов уток обеспечивала наиболее благоприятные условия для размножения вируса ССЯ-76.

Что касается пригодности суспензионных культур для репродукции вируса ССЯ-76, то было показано, что наибольшая гемагглютини-руюшая активность вируса отмечалась при культивировании его в эксплантатах утиных эмбрионов.

Не установлено зависимости между возрастом утиных эмбрионов и чувствительностью их к вирусу ССЯ-76, однако общий урожай вируса в суспензии эксплантатов утиных эмбрионов 15-16-суточного возраста оказался большим по сравнению с суспензией эксплантатов

более молодых утиных эмбрионов (12-суточного возраста) примерно в 3 раза. Установлена прямая зависимость накопления вируса от концентрации ткани и величины эксплантатов утиных эмбрионов. Доза заражения. существенно влияла на накопление вируса в экспланта тах утиных эмбрионов. При дозе заражения 3,0 IgTIUfeoAu] максимальное накопление вируса было отмечено на 7-е сутки культивирования (9,80+0,11 log2).

Таким образом, экспланта/ты утиных эмбрионов могут быть успешно использованы для выращивания вируса ССЯ-76 (штамма 127). Оптимальными условиями для накопления вируса в высоком инфекционном (4,5-5,5 igiOfeo/W ^ гемагглютишфующем (10,0-11,01 loga) титрах являются: концентрация суспензии экспланта .тов - 2,0%, размер эксплантатов - 1,0-2,5 мм, доза заражения - 3,0 1еТЦД5о/мл суспензии, питательные среды - Игла, 199, ГЛА, ФГМ-с, pH 7,4-7,7 без сыворотки крови крупного рогатого скота, заполнение флаконов суспензией - на 0,2=0,5 объема, адсорбция вируса на эксплантатах - 30 мин. при 18-20°С, скорость вращения флаконов - 18 об/мин., период культивирования - 86-120 час.

Метод суспензионного культивирования ССЯ-76 имеет важные преимущества перед Еыращиванием в однослойной культуре как по биологической активности вируса, так и по ряду экономических и технологических показателей. Инфекционный и гемагглютинируюший титры при культивировании вируса в эксплантаитах более высокие, чем в -первичных культурах клеток. След артель но, данный метод является перспективным для получения значителных объемов вируссо-держащего материала.

Четвертым разделом собственных исследований являлось совершенствование метода лабораторной диагностики ССЯ-76. Работа проводилась совместно с учеными Хилько С.Н. (Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, г.Москва) и Сергеевым В.Д. (Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства, г.Санкт-Петербург). В первом учреждении мы разрабатывали метод дете&ога антител к вирусу ССЯ-76 в ИФА у кур и систему ИФА для анализа антител у кур против AdH5 и Ad Ьо^З, во втором - диагностический набор для диагностики ССЯ-76.

Разработка метода детекции антител у кур к вирусу ССЯ-76 в ИФА. Как известно, основные способы диагностики аденовирусной ин-

фекции (как традиционные, так и иммуноферментные) направлены на идентификацию гексона соответствующих сероваров аденовирусов или антител против него (MecFerran J.В., 1978). Как указано было выше, вирус ССЯ-76 отличается от остальных аденовирусов птиц, а также млекопитающих (Е.К.Киселева, 1986) отсутствием общих детерминант в гексоне. Поэтому для серологической диагностики аденовирусных инфекций кур и других птиц необходимо создание двух систем, направленных на выявление антител против вируса ССЯ-76 и против "типичных" аденовирусов птиц других типов, содержащих общую антигенную детерминанту в гексоне вируса ССЯ-76 (штамма 127), стандартным представителем которых является вирус CELO или Adgall.

Нами разработан иммуноферментный анализ для выявления антител к гексонам аденовирусов птиц: вирусу ССЯ-76 и Adgall. Ниже приводятся данные по аналогичной системе, выявляющей куриные антитела против гексонов аденовирусов млекопитающих AdH5 (Ad5) и Ad bos:3/BAV3/ от гипериммунизированных кур. Три указанных системы были специфичны в отношении выявляемых антител и не обнаруживали антигенного перекреста между гексонами аденовирусов ССЯ-76, Adgall и аденовирусов млекопитающих.

Материалы и методы. Гексоны аденовирусов человека AdH5 и крупного рогатого скота Ad bos3 (BAV3) очищали, как описано ранее (Хилько С.Н., 1988). Аденовирус кур Ad gall(CELO) выращивали на куриных, а вирус ССЯ-76 (штамм 127) на утиных эмбрионах. Вирионы Ad gall и ССЯ-76 из аллантоисной жидкости очищали с помощью центрифугирования в CsCfL, а гексоны этих вирусов - с помощью хроматографии. Иммунизацию петухов проводили аллантоисной жидкостью, содержащей вирусы Ad gall или ССЯ-76 в смеси с адъювантом Фрейн-да, подкожно с интервалом 3 и 2 недели и брали кровь из подкрыль-цовой вены. Кур иммунизировали по той же схеме очищенными гексонами AdH5 и Ad bos3 и из желтка яиц выделяли IgJ.

IgJ кур выделяли из сыворотки и использовали для иммунизации кроликов, а также для приготовления иммуносорбента на основе се-рофазы CU-4B (Остерман А.А., 1983). Антитела из кроличьей антисыворотки против IgJ кур выделяли с помощью иммуноаффинной хроматографии (Остерман А.А., 1983), после чего их конъюгировали пе-роксидазой хрена (НПО "Биолар", Олайна), активированной периодат-ным окислением.

Мммуноферментный анализ куриных антител против аденовирусов проводили по описанной ранее схеме (Хилько С.Н. и др., 1883).

Результаты исследований. В создании систем иммуноферментного анализа детектирующих антител у кур против гексонов аденовирусов мы опирались на аналогичные системы ИФА для кроличьих антител (Хилько С.Н. и др., 1989). Для обнаружения антител против гексонов аденовирусов кур Adgall(CELO) микропанели сенсибилизировали гексоном Adgall в оптимальной концентрации 0,45 мкг/мл.

При титровании куриных антител против Adgall в сыворотке, полученной после двукратной иммунизации петухов, тифы антител составляли 1:800, а в объединенном препарате иммуноглобулинов сыворотки от нескольких петухов, гипериымунизированных вирионачи Ad gall по полной схеме (IgJcC3) титры антител достигали 1:12800. Реакция с гексоком Ad gall не обнаруживается в куриных сыворотках и в иммуноглобулинах J желтка кур, иммунизированных гетероло-гичными антигенами: аденовирусом ССЯ-76. гексонами Ad bos3 и Adh5, а также вирусом миелобластоза птиц или иммуноглобулинами кролика.

Специфичность реакции куриных антител в препаратах IgJcC3 с гексоном аденовируса Ad gall подтверждается конкурентным подавлением такой реакции в присутствии избытка гексона Ad gall или кроличьей антисыворотки против очищенных вкрионов Ad gall. Неспецифические антигены и нормальные кроличьи сыворотки не подавляли реакции гексона Ad gall с куриными антителами в препарате сСЗ. Некоторые сыворотки петухов, иммунизированных вирусом ССЯ-76 (т.е. антигенно неродственным Ad gall), положительно реагировали с гексоном Ad gall в описанной системе ИФА. Такие сыворотки имели титр 1:800 - 1:1600. Мы предполагаем, что у таких птиц присутствовали антитела к Ad gall ( или антигенно родственным ему аденовирусам кур Ad gals - Ad gall2) в результате перенесенной инфекции.

Таким образом, описанная система ИФА позволяет быстро и надежно выявлять у кур антитела против гексона и проводить серологическую диагностику инфекции кур 'аденовирусом Ad gall (CEL0)>

Для диагностики антител к гексону ССЯ-76 мы применен систему ИФА, в которой сенсибилизирующим антигеном служил очищенный гек-сон ССЯ-76. Ранее нами оптимизирована доза гексонового антигена ССЯ-76 в сенсибилизирующем слое, которая соответствовала концент-

рации гексона 1 мкг/мл. Далее мы протитровали в этой системе положительную куриную сыворотку против ССЯ-76, нормальную куриную сыворотку и ряд сывороток и желтков яиц от неиммунных или иммунных к другим антигенам кур и петухов. В описанной системе ИФА гипериммунная сыворотка петуха к вирусу ССЯ-76 реагировала п гомологичным антигеном (гексоном ССЯ-76) и титр антигена в ней составлял 1:6400, а неиммунная с ыворотка не реагировала. Отсутствие реакции с гексоном ССЯ-76 показано также для сывороток и желтков яиц кур, содержащих гипериммунные антитела к неродственным антигенам: гексонам Ad gall, Adh5, Ad bos3, к вирионам вируса миело-бластоза птиц и иммуноглобулинам кролика. Специфичность иммунной реакции куриных антител с гексоном ССЯ-76 подтверждена конкуренцией избытка гексона ССЯ-76, а также избытка кроличьих или козьих антител к ССЯ-76.

Таким образом, метод выявления у кур антител к ССЯ-76 в ИФА специфичен, чувствителен и прост в исполнении. На его основе нами разработан диагностикум на антитела 'для массового исследования кур на ССЯ-76. При подобных исследоаниях полезным усовершенствованием метода была замена источника тестируемых антител из сыворотки крови, на желток яиц, поскольку уровень' IgJ в желтке соответствовал уровню в сыворотке.

С целью разработки ИФА для анализа антител у кур против Adh5 и Ad bos3 мы провели иммунизацию кур очищенными гексонами аденовирусов млекопитающих (Adh5 и Ad bos3). Эта часть работы преследовала также отдельную цель - препаративное получение антител у' кур против гексонов аденовирусов млекопитающих и характеристику специфичности таких антител в ИФА.

Гексоны аденовирусов млекопитающих антигенно родственны между собой, но не родственны.гексонам аденовирусов птиц, в том числе ССЯ-76. Поэтому для анализа куриных антител против гексонов Adh5 и Ad bos3 потребовалась отдельная система ИФА. Сенсибилизацию проводили гексоновыми антигенами аденовирусов млекопитающих: Adh5 - 0,8 мкг/мл, Ad bos3 - 0,9 мкг/мл, Ad bosl - 0,5 мкг/мл, Ad slml6 - 1 мкг/мл.

При титровании куриных антител в ИФА с гексоном Adh5 нормальная куриная сыворотка, а также сыворотки кур , гипериммунизи-рованных Ad gall и ССЯ-76 давали отрицательный результат, а в сыворотке кур, иммунизированных гомологичным гексоном Adh5, обна-

ружены антитела к нему в титре 1:12800. Желток яйца, снесенного в день взятия крови, содержал антитела против гёксона Adh5 в том же титре. Антитела, реагирующие с гексоном А<1 bos3, присутствовали также в желтке яиц от кур, иммунизированных гексоном Ad bos3, что отражает выявление в ИФА родоспецифической антигенной детерминанты.

При. перекрестном титровании в ИФА куриных антител против гексонов аденовирусов млекопитающих (Adh5, Ad.bos3, Ad gall, Ad siml6) отмечено, что антитела реагируют преимущественно с гомологичным гексоном и титр их составляет 1:12800 - 1:25500, а титры куриных антител против всех гетерологичных гексонов были близки и составляли 1:800 - 1:1600.

Следует отметить, что иммуноглобулины желтка яиц являлись не только более удобными объектами серодиагностики, но и весьма эффективным источником для препараткЕного выделения антител класса IgJ заданной специфичности. При гкпериммунизации концентрация антител против гексонов аденовирусов в желтке яиц кур и сыворотке кроликов была сходна, однако выход антител по массе в случае желтка яиц был выше (объем желтка составлял 10-12 мл, что соответствовало эквиваленту 200 мл сыворотки в месяц от одной курицы).

Разработка диагностического набора для диагностики ССЯ-76.

Эту часть собственных исследований мы проводили с Сергеевым В.Д. и др. (ВНИВИП) и Осидзе С.Д. (ВИЗЗ). Цель их: 1) отработать наиболее оптимальную схему гипэришунизащш животных; 2) получить вируссодержащий материал, более активный в антигенном отношении; 3) подобрать продуцентов для получения высокоактивных специфических' сывороток; 4) отработать технологический регламент изготовления набора.

В итоге этих исследований нами был разработан и предложен набор для диагностики ССЯ-76 иммуноферментным методом. Указанный набор предназначен для диагностики болезней птиц путем обнаружения специфических антител в сыворотках крови подозрительных по болезни, больных или переболевших кур ССЯ-76.

" В монографии описаны материалы и методы по разработке набора для диагностики ССЯ-76.

Результаты, исследований. При отработке наиболее оптимальных схем гипериммунизации животных нами было установлено, что титры антигемагглютининов в сыворотке крови.петухов составляли 1:512 -

1:2048, а кроликов - 1:64 - 1:123. При гипериммунизации козы титр антигемагглютининов после 3-х инъекций вирусов ССЯ-76 составлял 1:4096, а после 4-й инъекции - 1:8192.

Кроме того, титры антигемагглютининов в сыворотке крови иммунизированных петухов как при введении культурального, так и выращенного в суспензии вируса были аналогичны. Однако метод культивирования суспензионного вируса как простой и экономичный оказался более приемлемым для гипериммунизации животных.

Таким образом, для получения активной сьшоротки к вирусу ССЯ-76 наиболее эффективной .оказалась схема иммунизации коз, основанная на использовании "суспензионного вируса" в качестве антигена. Позитивная сыворотка оказалась высокоспецифичной и не давала перекрестов с гетерологичными вирусами (болезни Ньюкасла, инфекционного бронхита, болезни Марека и возбудителем респираторного микоплазмоза).

Подробная схема технологического процесса получения очищенных вирусных препаратов описана в "Методических рекомендациях по очистке и концентрированию аденовирусов птиц".

Далее, в монографии описан метод приготовления и характеристика антивидовых иммунопероксидазных конъюгатов и отработка оптимальных условий • иммуноферментного анализа. Важнейшим условием проведения ИФА для выявления антител являлось наличие высокоочи-щенных прпаратов вируса. Игнорирование этого требования приводит к неспецифическим результатам и снижает чувствительность метода. Нами были испытаны различные схемы концентрирования и очистки вируса ССЯ-76 и разработана методика его получения. Очищенный вирусный препарат имел следующие характеристики: очистка от примесей белков на 95-97%; К=97-99%, где К - процентное соотношение удельной гемагглютинирурщей активности очищенного и исходного вируса; титр 1024-2048 ГАЕ/0,025 мл; содержание белка 150-200 мкг/мл.

После инактивации ССЯ-76 призводным димерэтиленимина вирусный антиген проверяли на степень инактивации в трех последовательных пассажах на утиных эмбрионах.

Для изучения зависимости адсорбции вирусного антигена от его концентрации в лунки полистиролового планшета вносили различные разведения вируса. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 18 часов. О степени насыщения поверхности вирусным антигеном судили по

оптической плотности продукта пероксидазной реакции после взаимодействия антигена с иммунной сывороткой и конъюгатом. Результаты исследований показали, что оптимальная концентрация сорбируемого антигена составила 4-8 мкг белка вируса-ССЯ-76 с активностью 4-8 ГАЕ/0,25 СМ3.

Для определения рабочего разведения конъюгата иммобилизованный на плашке вирусный антиген инкубировали с иммунной сывороткой, а затем с различными разведениями конъюгата. Антивидовой конъюгат проверяли на активность и специфичность, стандартизировали, стабилизировали, подвергали лиофильному высушиванию и при постановке ИФА использовали в разведении 1:20. Результаты считали положительными при выявлении в сыворотках крови кур, разведенных 1:100, окрашивания содержимого лунок в коричневый цвет разной интенсивности.

В результате исследований было установлено, что комплектующим буфером являлся 0,01 М натрий-карбонатный буфер с рН 9,6. При определении диагностического титра сывороток крови кур в ИФА было показано, что разведение испытуемых сывороток 1:50 - 1:100 давало возможность не пропустить слабоположительных сывороток.

Для определения активности и специфичности отработанной диагностической тест-системы ИФА с. очищенным инактивированным антигеном вируса ССЯ-76 использовали положительные сыворотки к'данному .вирусу, отрицательные сыворотки крови и специфические сыворотки крови кур к вирусам гриппа птиц, ныокаслской болезни, инфекционного бронхита кур, болезни Гамборо и аденовируса птиц. Учет результатов проводили визуально по интенсивности окрашивания содержимого лунок. За титр принимали наивысшее разведение сыворотки, при которой четко видна разница цветного (коричневого) окрашивания по сравнению с отрицательным контролем. Титр положительной сыворотки составил 1:5000 - 1:12000. Содержимое лунок, раститрованных отрицательной сывороткой крови кур и гетерологич-кых сывороток, было бесцветным.

Набор включал 8 реагентов: 1 ампула положительной сыворотки крови кур к вирусу ССЯ-76; 1 ампула отрицательной сыворотки крови кур; 1 ампула антивидового конъюгата в стандартном разведении; 2 планшета для ИФА с адсорбированным, очищенным и инактивированным антигеном вируса ССЯ-76; 1 флакон концентрированного разбавителя - 1,5 М калий фосфатный буфер, рН 7,2-7,4; 1 флакон разбавленного

детергента твин-20; 1 флакон с 5-аминосалициловой кислотой и 1 таблетка гидроперита. Набор расчитан на анализ 180 проб сыворотки крови или проведение 90 анализов в двух повторностях.

Подготовка к испытанию, проведение испытания и оценка результатов ИФА подробно описаны в монографии.

Далее мы изучали сравнительную чувствительность ИФА и РЗГА при выявлении специфических антител к вирусу ССЯ-76. Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4

Сравнительные показатели РЗГА и ИФА при исследовании сыворотки крови кур

:. Титры антител

Сыворотка РЗГА : ИФА

1 2 : 3

1 1:8 1 800

2 • 1 8 1 800: ч

3 1 16 1 1600'

4 1 8 1 800

5 1 4 1 400

6 1 32 1 1600

7 1 128 1 6400

8 0 0

9 1 8 1 400

10 0 1 100

11 1 8 1 400

12 1 32 1 3200

. 13 1 128 1 2400

14 1 64 1 1600

15 1:256 1 6400

16 1 64 1 3200

17 0 1 100

18- сыворотка положительная

(положительный контроль) 1 256 1 25600

продолжение таблицы 4

1

2

3

19

20 21

1:64

1:128

О

1:1600 1:2400 1:100

22-сыворотка крови кур нормальная (отрицательный контроль)

О

О

Как видно из таблицы 4, титры антител в сыворотках крови ку; в ИФА были выше, чем в РЗГА. Некоторые пробы (8, 10, 17, 21) ] РЗГА были отрицательные, а в ИФА - положительные. Это объясняется тем, что пороговая чувствительность ИФА в 50-100 раз выше, че» в РЗГА. Наличие корреляции между результатами ИФА и РЗГА свидетельствует о том, что при применяемых нами условиях очистки вируса ССЯ-76, сорбции вирионов на поверхности полистироловых планшет не происходило существенного разрушения вирусных частиц.

При использовании наборов для диагностики ССЯ-76 методом Ш1 нами было подтверждено его главное преимущество - . высокая чувствительность и специфичность., что дало основание на проведение широких испытаний и выпуск опытно-промышленных, а в дальнейшем \ промышленных серий набора.

Указанный диагностикум нами рекомендован для массового эпизоотического обследования птицепоголовья и контроля напряженност* поствакцинального иммунитета.

В период с 5 по 24 июня 1988 года наш была проведена апробация набора для диагностики ССЯ-76 ИФА с целью серологического обследования птицепоголовья на наличие антител к вирусу ССЯ-76. Испытание проводили в производственных условиях на птицефабрике "Жигулевская" Куйбышевской области. Исследовано 180 проб сывороток крови кур и 40 желтков яиц на наличие специфических антител к вирусу ССЯ-76 двумя методами ИФА и РЗГА. ИФА проводили согласнс "Методическим указаниям по постановке ИФА для проведения лабораторных исследований на ССЯ-76 у кур", а РЗГА ставили согласнс "Методическим рекомендациям по применению реакции задержки гем-агглютинации для ретроспективной диагностики заболевания ССЯ-76".

Результаты исследований приведены в таблице 5.

Как видно из таблицы, у цыплят суточного возраста среднеарифметический титр антител, определяемых методом РЗГА,был 1:9,3, а ИФА - 1:405; в 2-3-недельном возрасте титр составлял в РЗГА 1:6, в ИФА - 1:155, но начиная с 2-месячного возраста титр антител постепенно снижался и к 5 месяцам они исчезали совсем. Затем у молодняка с 5 мес. и взрослого поголовья кур уровень антител резко возрастал и к 12-13 мес. составил уже в РЗГА 1:128, а в ИФА - 1:6400. Таким образом, испытание в производственных условиях диагностического набора для ИФА подтвердило его высокую чувствительность и специфичность, что позволило нам рекомендовать его для ветеринарно-диагностической работы в нашей стране.

Дифференциальная диагностика. Поскольку по эпизоотическим, клиническим и патологоанатомическим данным ССЯ-76 имеет сходство с другими болезнями, ее необходимо дифференцировать от инфекционного бронхита, отравлений пестицидами, фунгицидами, микотоксинами и различными факторами незаразной этиологии, вызывающей снижение яйценоскости.

В качестве экспресс-метода дифференциации в Англии, Бельгии и Австралии применяют рестрикционный анализ ДНК полевых изолятов вируса ССЯ-76 от изолятов других аденовирусов. ^

В пвседневной лабораторной практике дифференциация синдрома снижения яйценоскости от аденовирусной инфекции,' вызываемой ад£-к новирусами птиц (CELO и 1AL), может быть успешно осуществлена с\ помощью вышеуказанных тестов серодиагностики (РЗГА, РН, РДП, ИФА) \ при непременном условии наличия в лаборатории сывороток и антиге- \

Ретроспективную диагностику болезни у кур рекомендуется про- -водить с помощью тех же реакций, начиная со 160-дневного возрата.

Иммунитет и специфическая профилактика. В монографии приво- I дятся литературные данные по иммунитету и специфической профилак-* тике ССЯ-76.

Для специфической профилактики ССЯ-76 у кур разработаны и .,•)' успешно применяются, главным образом, ияактивированные -вакцины,-— " что подробно освещено в монографии. ~

нов, соответствующих указанным возбудителям.

Таблица 5

Выявление гемагглютинирующих антител в сыворотках крови кур и желтках яиц методами ИФА и РЗГА .

Обследуемые помещения и возраст птицы

Объект исследования

К-во:Из них по-■ проб:ложительных :(число/£) I

Титры в ИФА

Титры в РЗГА

с. к.

ж.я.

с.к.

ж. я.

Маточный цех 2, кор.З Сыворотки крови 20 (11-12 мес.) (с.к.)

15/75 1:100-1:3200

1:4-1:64

Маточный цех 2, кор.13 (10-11 мес.)

Маточный цех 2, коо.б (8-9 мес.)

Маточный цех 2, кор.17 (9-10 мес.)

Маточный цех 2, кор.8 12-13 мес.)

Клеточный цех 1, кор.60 (2-3 мес.)

Цыплята суточн.возраста

Площадка 3, кор.16 (2-3 нед.)

Площадка з, кор.8 (4-i> 1й&е .v

Желтки яиц(ж.я.)

с:к.

к. я. с.к.

ж.я.

с,к.

ж.я. с.к.

с.к.

с.к. с.к.

с.к.

10

20

10 20

10 20

10 20.

20

20 20

20

7/70 - 1:400-1:800

15/75 1:200-1:1600 - 1:2-1:64

7/70 - 1:400-1:6400

3/15 1:100-1:400 - 1:8-1:16

1/10

—"1/15 j'—1-; 200_^_,

>/10 - 1:200

19/95 1:400-1:6400

3/15 1:50-1:100

8/40 1:100-1:3200

10/50 1:100-1:800

О

О

1:32

1:4-1:128 О

1:2-1:64 1:2-1:16

О

Для того, чтобы избежать заболевания птицы ССЯ-76, необходимо осуществлять следующие рекомендации: 1) предотвратить поступление в хозяйство контаминированного материала или лиц из неблагополучного хозяйства; 2) комплектовать родительские стада птицей, свободной от ССЯ-76; 3) перевозить вновь поступившую птицу в чистом транспорте и, наконец, проводить специфическую профилактику.

Учитывая, что основным источником возбудителя ССЯ-76 являются утки, необходим постоянный вирусологический контроль утковод-ческих хозяйств.

В случае необходимости должна осуществляться плановая вакци-нопрофилактика с использованием вакцин в зависимости от эпизоотического состояния птицеводческих хозяйств и необходим иммунологический контроль привитой птицы.

выводы

1. Монография "Аденовирусная, инфекция животных" представляет первый в Российской Федерации и странах СНГ аналитический и кри- / тический обзор специальной литературы по данной инфекции.у чело- - j века, крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей,.соб^к, обезьян, лабораторных животных и птиц, в котором отражены основ-,, ные особенности аденовирусов, выделенных от человека и вьппеука- Т\ занных животных. ■ > \

2. В ряде птицехозяйств изучено распространение аденовирусной инфекции, вызываемой вирусами CELO и ÍAL. Антитела к аденовирусу птиц выявлялись у кур в период яйцекладки, начиная с 10-месячного возраста и до выбраковки птицы. В этот период в РДП положительно реагировало до 70Z птиц, тигры антител у обследованной птицы составляли 1:4-1:8. В отличии от взрослых кур-несушек молодняк (1-2,5 мес.) не имеет антител к вирусу CELO.

3. Показана возможность репродукции вируса синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ) в суспензии эксплантантов утиных эмбрионов. Метод суспензионного культивирования указанного вируса имеет преимущества перед выращиванием его в однослойной культуре как по биологической активности вируса, так и по ряду экономических и технологических показателей. Инфекционный (4,5-5,5 1дТЦД5р/мл) и

гемагглютинирующий (10,0-11,0 logo) титры при культивировании вируса в эксплантатах более высокие, чем при выращивании в монослое первичных культур клеток. Следовательно, данный метод является перспективным для получения значительных объемов вируссодер-кащего материала.

4. Разработан метод иммуноферментного анализа для определения антител у кур к вирусам ССЯ-76, Ad gall (CELO), AdH5 и Ad bos3. Данный метод позволяет быстро и эффективно выявлять у кур антитела против гексона аденовирусов и проводить серодиагностику аденоинфекции. Усовершенствованием метода была замена источника тестируемых антител из сыворотки крови на желток яиц.

5. Разработан, испытан в лабораторных и полевых условиях и внедрен в производство "Набор для диагностики ССЯ-76 иммунофер-ментным мётодом". При использовании 'наборов нами было показано его главное преимущество - высокая чувствительность и специфичность. Пороговая чувствительность ИФА в 50-100 раз выше чем РЗГА. Указанный диагностикум рекомендован для массового эпизоотологи-ческого обследования птицепоголовья и контроля напряженности поствакцинального иммунитета.

/

\ 1

■ ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

- Нормативно-техническая документация (ТУ, Инструкция, Наставление) ка "Набор для диагностики синдрома снижения яйценоскос-ти-76 иммуноферментным методом". Утверждены ГУВ при Госкомиссии Совмина СрСР 'ро продовольствию и закупкам, 14.11.1991 г.

- "Методические указания по лабораторной диагностике синдрома снижения Цценоскости-76 у кур методом иммуноферментного анализа". Утверждены ГУВ СССР 12.02.1990 г.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фомина П.В. Серологическое обследование птицехозяйств на наличие аденовирусной инфекции птиц (Труды ВИЭВ, 58, 59-60, 1983)

2. Грабко В.И., Лунин В.Г., Фомина Н.В. и др. Клонирование фрагментов вирионной ДНК аденовируса CELO, содержащих ген гексона и онкоген (Доклады ВАСХНИЛ, 12, 31, 1983)

3. Грабко В.И., Лунин В.Г., Народицкий B.C., Фомина Н.В. и др. Исследование инфекционной активности ДНК аденовируса птиц на куриных эмбрионах (Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 6, 37-41, 1984)

4. Осидзе С.Д., Фомина Н.В. Национальный метод получения специфической позитивной сыворотки к вирусу синдрома снижения яйценоскости- 76 (Труды ВИЭВ, 63, 115-118, 1985)

5. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных (Справочная книга) (Агропромиздат, Москва, 22 п.л., 1986)

6. Фомина Н.В., Осидзе С.Д. Культивирование вируса синдрома снижения яйценоскости-76 в эмбрионах1и культурах клеток различных видов птиц (Материалы ХХШ ВВК,' ■^Монреаль, Канада, август 16-21, 470,' 1987)

7. Фомина Н.В., Осидзе С.Д., Хйлько С.Н., Кирасова М.А. Им-муноферментный метод определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 (Труды ВИЭВ, 66j 37-41, 1988)

8. Фомина Н.В., Осидзе С.Д., Грошева Г.А. Способ получения антигена вируса синдрома снижения яйценоскости-76 кур (Авторское свидетельство N 1412067, зарегистрировано 22 марта 1988 г.

9. Хилько С.Н., Кирасова М.И., Фомина Н.В. и др. Иммунофер-ментный анализ гексона аденовирусов. Определение антител от ги-периммунизированных кур (Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 9, 43-48, 1989) j

10. Осидзе С. Д., Фомина Н.В., ГрошеваГ.А., Сергеев В. Д. Способ выявления антител для диагностики синдрома снижения яйценоскости-76 кур (Авторское свидетельство N 1671311, зарегистрировано 22 апреля 1991 г.)

И. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н-.В. Ветеринарная вирусология (Учебник 2-е издание) (Изд."Колос", 32 п.л., 1991)

12. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных (книга) (Изд."Колос", 40 п.л., 1991)

13. Фомина Н.В., Белоусова Р.В., Соболев В.В., Сюрин В.Н. Вирусы животных (учебное пособие) (Изд.МВД, 24 п.л., 1991)

14. Фомина Н.В. Аденовирусная инфекция животных (Изд."Колос", 24 п.л., 1995.

I

Типография ОВДШ ВШИВВиМ, г.Покров, 1996г., тираж - 70 экз.