Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии иммуноферментной тест-системы для выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Третьякова, Ирина Владимировна

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика аденовирусов.

1.2. Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота.

1.3. Структурная характеристика аденовириона.

1.3.1. Строение нуклеокапсида.

1.3.2.Физико-химические свойства структурных белков аденовириона.

1.3.3. Основной структурный белок аденовириона - гексон.

1.3.4. Структурные белки аденовириона.

1.4. Иммунохимические свойства аденовирусных белков.

1.4.1. Антигенная структура белков аденовирусов.

1.4.2. Антигенные свойства гексона.

1.5.Основные методы диагностики вирусных болезней животных.

1.5.1. Лабораторная диагностика аденовирусной инфекции крупного рогатого скота.

1.6. Иммуноферментный анализ.

1.7. Иммуноферментный анализ, как метод диагностики аденовирусной инфекции.

1.7.1. Иммуноферментный анализ, как метод выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота.

1.7.2. Иммуноферментный анализ, как метод обнаружения аденовирусных антигенов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Биологические препараты.

2.1.2. Реактивы.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Получение монослойной культуры клеток перевиваемой линии MDBK.

2.2.2. Получение монослойной культуры клеток перевиваемой линии Т-1.

2.2.3. Получение монослойной культуры клеток ТБ.

2.2.4.Кулътивирование аденовируса крупного рогатого скота первого серотипа.

2.2.5.Культивирование аденовируса крупного рогатого скота седьмого серотипа.

2.2.6.Экстракция гексонов аденовирусов.

2.2.7 .Гидрофобная хроматография.

2.2.8.Анионообменная хроматография.

2.2.9. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.2.10. Непрямой иммуноферментный анализ.

2.2.12. Реакция нейтрализации.

2.2.13. Реакция непрямой гемагглютинации.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Культивирование аденовирусов первой и второй подгрупп.

3.1.1. Культуры клеток.

3.1.2. Методы культивирования аденовирусов.

3.2. Получение реагентов набора ИФА.

3.2.1. Получение аденовирусных антигенов.

3.2.2. Получение гипериммунных сывороток к гексонам аденовирусов.

3.2.3. Определение оптимальных условий проведения ИФА.

3.3. Апробация набора реагентов ИФА.

3.4. Сравнительная характеристика метода ИФА.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии иммуноферментной тест-системы для выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота"

Актуальным направлением в области ветеринарной биотехнологии является создание современных, высокотехнологичных, простых в исполнении и надежных иммунохимических методов для экспресс-диагностики инфекционных болезней животных. Такой подход особенно важен, когда речь идет об эффективной диагностике массовых болезней у молодняка крупного рогатого-скота, вызываемых ^ирусами, и о контроле напряженности иммунитета вакцинированных животных. В этиологической структуре вирусных инфекций животных важное место занимают аденовирусы (6а, 20, 21). Болезни, вызываемые аденовирусами, зарегистрированы в Венгрии, Австралии, США, Польше, Болгарии и ряде других стран, имеют распространение и в России (1,2,3,8а,39а,57,60,98,106,144,137,117). Аденовирусные инфекции регистрируются преимущественно у молодняка крупного рогатого скота, характеризуются острым течением и поражением органов дыхания, пищеварения и конъюнктивитом. Установлено, что аденовирусы являются иммунодепрессантами и способствуют развитию вторичной инфекции (2). Значительное распространение и экономический ущерб от заболеваний, вызываемых аденовирусами, делают актуальной задачу создания более совершенных методов лабораторной диагностики инфекции. При этом требуются качественно новые, высокочувствительные и специфичные экспресс-методы. Этим требованиям отвечают методы, где используются иммуноферментные тест-системы (4,9,16,22,34,38). Они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и получении иммунного комплекса, который можно выявить с помощью меченного ферментом реагента. Результат реакции оценивают по интенсивности окрашивания визуально или используют автоматизированные методы учета.

Результативность метода ИФА зависит от активности, специфичности и стабильности всех компонентов реакции. Это обстоятельство и определило основную задачу наших исследований - получение набора реагентов и разработку иммуноферментной тест-системы для диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, основанной на выявлении специфических антител в сыворотке крови. Основным этапом исследования стало получение высокопродуктивных клонов аденовирусов, культивирующихся в достаточных количествах, для последующего выделение структурных вирусных белков в нативной форме (10,24). Опыт показал, что используемый, как антиген нативный, кулыуральный вирус, равно как и очищенный только от кулыуральных белков путем центрифугирования, не обеспечивает специфичности результатов анализа. Поэтому следующей задачей стало получение концентрированных и высокоочшценных аденовирусных антигенов и наработка высокоактивных специфических сывороток к ним. Известно, что основные структурные белки аденовириона - гексон, пентон и отросток - организованы однотипно у всех представителей семейства и содержат набор антигенных детерминант разной специфичности. Наиболее изучен - гексон, который составляет более половины от массы вириона, синтезируется в количествах в 10-1000 раз превышающих необходимые для сборки вириона и содержит основные антигенные детерминанты, индуцирующие синтез вируснейтрализующих антител (111). Это послужило основанием для использования гексона в качестве специфического реагента (антигена) в ИФА. Изученные ранее физико-химические и иммунохимические свойства гексона (7,3,15,30.37,41,48) позволили определять оптимальные условия адсорбции его на твердом носителе (полистироловом планшете) и получить высокоактивные гипериммунные сыворотаи к гексонам (4,27,29,38,44). Традиционные иммунологические тесты по выявлению специфических антител к аденовирусам крупного рогатого скота отличаются тем, что в них используются слабо очищенные, недостаточно специфичные и активные, а также нестабильные реагенты. Современный уровень развития биотехнологии позволяет разработать значительно более эффективный экспресс-тест для серологических исследований при аденовирусной инфекции и иммунологического мониторинга при вакцинопрофилактике на основе непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с принципиально новыми подходами к качеству реагентов.

Целью исследований являлась разработка технологии изготовления специфических реагентов и создание на их основе иммуноферментной тест-системы для выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота первой и второй подгрупп в сыворотке крови.

Для выполнения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести скрининг культур клеток, чувствительных к аденовирусам двух подгрупп, и определить эффективный способ культивирования.

2. Выделить и очистить из кулыуральной вируссодержащей суспензии основной структурный белок аденовируса - гексон.

3. Получить гипериммунные сыворотки к гексону аденовируса на основе оптимизированной схемы иммунизации телят.

4. Разработать условия проведения реакции по методу непрямого ИФА с полученными реагентами.

5. Определить диагностическую ценность и апробировать набор реагентов ИФА для выявления антител к аденовирусам в пробах сывороток крови крупного рогатого скота, полученных от экспериментально, спонтанно инфицированных животных и вакцинированных животных.

Научная новизна результатов исследования. Предложена единая перевиваемая культура клеток почки теленка (Т-1) для получения высокопродуктивных клонов аденовирусов крупного рогатого скота первой и второй подгрупп. Показано, что использование техники культивирования перевиваемых клеток в суспензии и на микроносителях существенно повышает инфекционную активность аденовирусов и сокращает сроки репродукции (Авт. свидетельство «Способ выращивания вирусов -возбудителей респираторных и кишечных инфекций крупного рогатого скота», - № 4431499/30-13/080715 от 24.11.88г.).

Впервые в качестве антигенов в методе ИФА для выявления специфических антител в сыворотке крови крупного рогатого скота использованы структурные белки аденовирусов первого (BAV-1) и седьмого (BAV-7) серотипов - гексоны, позволяющие дифференцировать антитела к аденовирусам первой и второй подгрупп.

Оптимизирована схема получения гипериммунных сывороток к гексонам аденовирусов крупного рогатого скота на телятах-донорах для использования в качестве специфических референс-сывороток.

Оптимизированы условия адсорбции гексонов на полистирольных планшетах и условия их хранения в виде соединения гексон-твердый носитель.

Установлены значения диагностического и поствакцинального титра антител, характеризующего напряженность иммунитета животных к аденовирусной инфекции.

Практическое значение результатов исследования. Разработана тест-система на основе ИФА для выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота. Материалы исследований вошли ^нормативно-техническую документацию на изготовление набора для серодиагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА) и утвержденную ГУВ Госагропрома СССР в установленном порядке (18.05.89г.).

Разработаны и утверждены ГУВ Госагропрома СССР «Методические указания по серодиагностике аденовирусной инфекции крупного рогатого скота методом ИФА» (26.05.89г.).

Разработано «Временное наставление по применению набора реагентов для серодиагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА)».

Проведены межведомственные комиссионные испытания наборов реагентов ИФА (акт от 23.03.89г.), которые показали их высокую чувствительность и специфичность в соответствии с техническими условиями (10.07.106-89г.).

Опытно-промышленная серия наборов ИФА апробирована в 17 региональных ветеринарных лабораториях, показана их высокая диагностическая ценность.

Материалы исследований внедрены в учебный процесс и на их основе разработаны лабораторно-практические занятия при изучении возбудителей респираторных вирусных инфекций на кафедре ветеринарной вирусологии МГАВМиБ им. К.И.Скрябина.

Апробация работы. Результаты работы доложены на научно-производственных конференциях и конференциях молодых ученых МГАВМиБ им. К.И.Скрябина (1987,1988); на Всесоюзной конференции по молекулярной биологии ДНК-содержащих вирусов, имеющих практическое значение для сельского хозяйства и медицины (Киев, 1987г.), на межкафедральном совещании профессорско-преподавательского состава МГАВМиБ им. К.И.Скрябина (2001г.).

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе Авторское свидетельство № 4431499/30-13/080715 от 24.11.88 на способ выращивания вирусов-возбудителей респираторных и кишечных заболеваний крупного рогатого скота.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Третьякова, Ирина Владимировна

5. ВЫВОДЫ

1. Разработан экспресс-метод выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота в сыворотке крови больных, реконвалесцентов и вакцинированных животных на основе непрямого твердофазного иммуноферментного анализа на полистироловых планшетах. Набор реагентов для экспресс-метода ИФА включает специфические антигены-гексоны первого (BAV-1) и седьмого (BAV-7) серотипов, что позволяет выявлять антитела к аденовирусам крупного рогатого скота первой и второй подгрупп.

2. Предложена универсальная линия клеток и эффективные способы культивирования аденовирусов крупного рогатого скота. Показано, что перевиваемая линия клеток почки теленка Т-1 является единой чувствительной культурой клеток для аденовирусов 1 и 11 серологических подгрупп. Установлено, что при размножении аденовирусов методом суспензионного культивирования и в клетках, выращенных на микроносителях, их инфекционная активность достигает 7,0-8,5 lg ТЦД50/Ш , сроки культивирования сокращаются до 3-4 суток.

3. Впервые в качестве специфических антигенов в иммуноферментной тест-системе по выявлению антител к аденовирусам крупного рогатого скота использованы структурные белки аденовирионов - гексоны. Методами гидрофобной и анионообменной хроматографии из культуральной вируссодержащей жидкости получены электрофоретически чистые (95%) препараты гексонов серотипов BAV-1 и BAV-7, сохраняющие свою трехмерную структуру, высокую активность и специфичность в иммуноферментной тест-системе, а также проявляющие высокую антигенность при их использовании в качестве иммуногенов для получения гипериммунных сывороток.

4. Оптимизирована схема иммунизации телят-доноров и получены высокоактивные гипериммунные сыворотки к гексонам BAV-1 и BAV-7 для иммуноферментной тест-системы с титром антител 1: 6400 и выше. Методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа показано, что титры специфических антител в гипериммунных сыворотках к антигенам гомологичной подгруппы аденовирусов значительно выше, чем к антигенам гетерологичной подгруппы (на 4 log2).

5. Оптимизированы условия проведения экспресс-теста методом иммуноферментного анализа по выявлению антител к аденовирусам в сыворотке крови крупного рогатого скота. Установлено, что оптимальная адсорбция гексонов аденовирусов на полистироловых планшетах происходит при концентрации 1,0 мкг/мл в карбонатном буфере рН 9,6 и 12-16-ти часовой инкубации (4-6 °С). При температуре 4 °С адсорбированные на полистироловых планшетах гексоны аденовирусов сохраняют свою активность и специфичность не менее 4-х лет. Снижение фоновой активности достигается внесением в буферный раствор овальбумина до конечной концентрации 0,1%. Показано высокое качество цветной индикации специфического комплекса антиген-антитело при использовании субстрата орто-фенилендиамина в ацетатном буфере, рН 5,0.

6. Показана высокая чувствительность и специфичность реагентов иммуноферментной тест-системы при исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, полученной от экспериментально и спонтанно инфицированных животных, а также при иммунологическом мониторинге вакцинированных животных. Установлено, что тест-система на основе ИФА выявляет сероконверсию в парных сыворотках крови и позволяет судить об иммунологическом статусе животных: титр антител к аденовирусам в

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы исследований по разработке технологии иммуноферментной тест-системы для выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота вошли в следующие (нормативные) документы:

- Временная инструкция и технические условия № 10.07.106-89 по изготовлению и контролю набора для серодиагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА), утвержденные ГУВ Госагропрома СССР в установленном порядке 18.05.1989г.

- Методические указания по серодиагностике аденовирусной инфекции крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА), утвержденные ГУВ Госагропрома СССР в установленном порядке 21.05.1989г.

-Временное наставление по применению набора реагентов для серодиагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА). Данный набор прошел межведомственную комиссионную проверку в установленном порядке (акт от 23.03.1989г.) и широкое производственное испытание в 17 ветеринарных республиканских лабораториях.

Я благодарю сотрудников кафедры и лаборатории ветеринарной вирусологии МГАВМиБ им.К.С. Скрябина профессора Р.В. Белоусову, научных сотрудников Т.П. Лобову и А.Е. Копенкина, а также сотрудников лаборатории генной инженерии вирусов ВНИИСБ РАСХН ведущих научных сотрудников С.Н. Хилько и Л.В. Верховскую за помощь в проведенных исследованиях и за разрешение оформления результатов совместных работ в виде диссертации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Третьякова, Ирина Владимировна, Москва

1. Алиева Н.А., Ганиев М.К., Дрейзин Р.С. Выделение аденовирусов коров при пневмонии телят.// Известия Акад. наук Азерб. ССР, Баку. 1967. - т. 2. -N1. - С.108-112.

2. Белоусова Р.В., Лобова Т.П., Пономарева Т.И. Культивирование аденовируса первого типа в суспензионной культуре клеток. // Сбор. науч. трудов МВАим. К.И.Скрябина. 1989. - С. 169-171.

3. Белоусова Р.В., Третьякова И.В., Лобова Т.П. Иммуноферментный метод диагностики аденовирусной инфекции КРС. // Достижения науки и техники AnK.- 1990.-Nl.-C. 25-27.

4. Бейлли Н. Статистические методы в вирусологии.// М: Медицина. 1962. -С. 29-31.

5. Григорьев В.Г., Хилько С.Н., Тихоненко Т.И. Структурный и иммунологический анализ продуктов протеолиза гексонов аденовирусов приматов. // Молекулярная биология. 1985. - т.19. - вып.6. - С. 1526-1536.

6. Дзантиев.Б.Б., Егоров A.M. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа. // Журнал Всесоюзного химического общества. 1982. - т. 2. - N 4. - С. 442-449.

7. Дяченко Н.С., Носач JI.H., Беренчи Д. Аденовирус, клетка, организм. // Киев: Наук, думка. -1988. С.23.

8. Иммуноферментный анализ. П/р. Г. Нго, Г. Ленхоффа. // М: Мир. 1988. - С.173-189, 193-209.

9. Инфекционные болезни. Справочник п/р. Д.Ф. Осидзе. // М: Агропромиздат. 1987.

10. Исакова В.Р. Получение и характеристика иммунологической специфичности моноклональных антител против структурных белков аденовирусов. //Автореферат дис. канд. биол. наук. -1991. С. 10-14.

11. Кис В.И, Серопрофилактика вирусных пневмоэнтеритов телят в промышленных хозяйствах.//Автореферат дис.канд.вет.наук. 1980. - С. 16.

12. Ковалишин Г.Г., Хилько С.Н., Народицкий Б.С. Сравнительное изучение гексонов некоторых аденовирусов рода Mastadenovirus. // Микробиол. журнал. 1986. - т. 48. - N 2. - С. 50-55.

13. Кожухов В.М., Жилова В.Г., Кашкин А.П. Использовании ИФА для изучения иммунного ответа у привитых гриппозными вакцинами и у реконвалесцентов. // Вопр. вирусологии. 1985. - т. 30. - N 6. - С. 745-749.

14. Меныпин В.В., Яковлев Т.Е., Самуйленко А.Я. Получение антивидового коньюгата анти IgG утки. // Ветеринария. -1991. - N 3. - С.34.

15. Миронова JI.Л., Белоусова Р.В., Лобова Т.П. и др. Акт внедрения. От 12.06.1989.

16. Мирошниченко О.И., Народицкий Б.С., Тихоненко Т.Н., Шереметьева Е.В. Использование метода гибридизации с клонированным фрагментом BAV-3 для диагностики аденовирусной инфекции КРС. // Вестник с/х науки.- 1987. N. 9.-С. 91-96.

17. Мубарак И., Вертинская К.К., Гуненков В.В. Лабораторная диагностика заболеваний телят, вызываемых аденовирусами. // Ветеринария. 1972. - N. 5.-С. 106-108.

18. Ницмане А.К., Жильинский А.Д., Бригманес А.Ю. Проблемы энзоотических болезней в индустриальном животноводстве. Профилактика и лечение болезней сельскохозяйственных животных. // тр. ЛСХА, Тарту. -1979. вып. 177. - С. 68-72.

19. Новые подходы к совершенствованию диагностики аденовирусной инфекции. / Дяченко Н.С., Ванцак Н.П., Тарасишин Л.А. и др. Тез. Докл. XI Укр. респ. съезда микробиол., эпидимиол. и паразитол. - Киев, 1985. - С. 59-60.

20. Носач Л.Н. Иммунофлюоресцентное изучение специфичности детерминант гексона в инфицированных аденовирусами клетках. // Микробиол. журнал, 1982. - т. 44. - С. 65-70.

21. Носач Л.Н., Дяченко Н.С. Цитопатология аденовирусной инфекции. // Киев: Наук, думка. 1982. - С. 124.

22. Носач Л.Н., Белоусова Р.В., Дяченко Н.С. и др. Характеристика внутриядерных включений, образующихся при репродукции аденовирусов крупного рогатого скота. // Цитология и генетика. 1986. - т. 20. - N. 1. - С. 51-54.

23. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М: Наука.- 1985.

24. Получение гипериммунных сывороток к некоторым гексонам аденовирусов крупного рогатого скота. / Третьякова И.В., Лобова Т.П., Белоусова Р.В., Нургазиев Р.З. и др. Достижения науки и техники АПК. -1989. -N1.- С. 45-47.

25. Простяков А.П. Иммунологические методы исследования с сельском хозяйстве. // Журнал Всесоюзного химического общества. 1982. - т. 2. - N.4. -С. 103-107.

26. Пути использования гексона аденовирусов в диагностической практике. / Дяченко Н.С., Носач JI.H., Ванцак Н.П. и др. Вопр. вирусол. и гигиены в Лит. ССР, Вильнюс. - 1979. -С. 194-195.

27. Специфичность и выраженность отдельных антигенных детерминант в гексонах аденовирусов. / Хилько С.Н., Киселева Е.К., Кирасова М.А. -Вирусы и вирусные заболевания. Киев: Наукова думка, - 1988. - в. 16. - С. 49-60.

28. Сравнение специфичности и чувствительности реакции пассивной гемагглютинации и других методов индикации антител к аденовирусам. / Михайлов Э.Г., Дяченко Н.С., Тарасишин Л.А. Микробиол. ж. - 1986. - т. 48.-N6.-С. 80-82.

29. Стендифер П. Иммуноферментный анализ гаптенов и антигенов с разделением компонентов. В кн.: Иммуноферментный анализ. П/р. Т. Нго и Г. Ленхоффера. // М.: Мир. 1988. - С. 172-192.

30. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. // М.: Наука. 1986. - С. 212-220.

31. Сюрин В.Н., Карелин В.П., Непоклонова И.В. Достижения биотехнологии в диагностике и профилактике вирусных болезней животных. // Вестник с./х. науки. 1984. - N 3 (330) - С. 106-114.

32. Тарасишин Л.А. Метод радиоиммунологического анализа и его применение в вирусологии. // Вопр. вирусологии. 1980. - т. 25. - N 1. - С.5-10.

33. Тарасишин Л.А., Дяченко Н.С., Ванцак н.П. Радиоиммунологический анализ гексона аденовируса обезьян SA7. // Вопр. вирусологии. 1980. - т.2. -С. 192-197.

34. Тарасишин Л. А., Хилько С.Н., Дяченко Н.Г. Карпова О.В., Белоусова Р.В. Антигенные детерминанты гексона аденовируса крупного рогатого скота типа 3. // Вопр. вирусологии. 1986. - т. 31.-N5.-C. 620-623.

35. Третьякова И.В., Белоусова Р.В., Верховская Л.В. Иммуноферментный анализ, как метод серодиагностики аденовирусной инфекции КРС. // Сб. матер, межд. конфер.: Казань. 2000. - С. 135-137.

36. Третьякова И.В., Белоусова Р.В. Лобова Т.П. Использование ИФА для серодиагностики аденовирусной инфекции КРС. // Ветеринария. 1989. - N 28.-С.28-32.39а. Фомина Н.В. Аденовирусная инфекция животных. // Москва: Колос. -1995.

37. Фримель Г. Иммуноферментный анализ. // В кн.: Иммунологические методы П/р Г. Фримеля. 1987. - С. 162-170.

38. Хилько С.Н., Григорьев В.Г., Чайка О.В. и др. Гексон аденовирусов : Структура, изменчивость и антигенные детерминанты. // Мол.ген., микроб, и bhp.-1984.-N1.-C. 15-19.

39. Хилько С.Н., Кирасова М.А., Исакова В.Р., Бургасова М.П., Киселева Е.К. Иммуноферментный анализ гексона аденовирусов. Идентификация и характеристика кроличьих и мышиных антител против гексонов. // Мол. генетика, микроб, и вир. 1989. - N 7. - С. 41-47.

40. Хилько С.Н., Кирасова М.А., Пиккер Е.Г., Осидзе С. Д. Иммуноферментный анализ гексонов аденовирусов. Определение антител отгипериммунизированных кур. // Мол. генетика, микроб, и вир. 1989. - N 9. -С. 43-48.

41. Хилько С.Н., Пономарева Т.Н., Григорьев В.Г. Способ получения аденовирусных антигенов. //Авторское свидетельство N 1364342. 1986.

42. Юминова Н.В., Цианова С.С. Иммунологические реакции и их значение в оценке качества противовирусных вакцин. // Профил. вирусных инфекций в свете современных достиж. иммунол. М: 1986. - С. 45-46.

43. Adam Е., Erdei J., Lengyel A. et al. Delineation of antigenic determinants of adenovirus hexson by monoclonal antibodies. // Intervirology. 1985. - v. 28. - n 4. - p. 222-227.

44. Adam E., Nasz I. Az adenovirus hexon antigens zerkezetenek virsgalata monoclonalis antitestekel. // Kiserl. Orvosnud. 1985. - v. 37. - N1. - p. 27-35.

45. Adam E., Nasz I., Lengyel A. et al. Determination of different antigenic sites on the adenovirus hexon using monoclonal antibodies. // Arch. Virol. 1987. v. 93. -n. 3-4.-p. 261-272.

46. Adam E., Nasz I., Lengyel A. et al. Detection of adenovirus hexon using monoclonal antibodies for antigen capture in ELISA. // Acta microbiol. Hung. -1986.-v. 33.-p. 317-324.

47. Adrian Th., Widand R., Hierholzer j. Wigand R. DNA restriction analysis of adenovirus prototypes 1 to 41. // Arch. Virol. 1986. - v. 91. - n. 2. - p. 277-290

48. Adrian Th., Wigand R., Hierholzer j. Immunological and biochemical characterisation of human adenoviruses of subgenus B. DNA restriction analysis. // Ibit. 1985. - v. 84. - n. 1. - p. 79-89.

49. Ahmed Th., El-Sisi M., Saber M. Ein Beitragg sur episootilogie einer adeno -ahnlichen virus-(CELO)-infection beim geflugelin agypten// Tieraerztl. Umsch. -1969.-v. 24.-p. 111-115.

50. Aldasy P., Csonts L., Bartha A. Pneumoenteritic in calves caused by adenovirusus. // Acta. Vet. Hung. 1965. - v. 15. - p. 167-175.

51. Anderson L., Godfrey E., Meintosh K. Comparison of a monoclonal antibody with a policlonal serum in an enzyme-linked immynosorbent assay ELISA for detecting adenovirus. // J Clin. Microbiol. 1983. - v. 18. - n. 3. - p. 463-468.

52. Avrameas S. Copling of emymes to proteins with glutaraldehyde. // Immunochem. -1969. v. 66. - p. 43-52.

53. Aymard M., Fardy J. Les mesodes immunoenzymatiques en virologie. // Rev. Fr. Lab. 1984. - v. 13. - n. 133. - p. 72-79.

54. Baber D., Condy J. Isolation of bovine adenoviruses types 3, 4 and 8 from free-living african buffaloes (syncerus caffer). // Res. Vet. Sci. 1981. - v. 31. - p. 69-76.

55. Bank K., Van Velmen. Elisa high lights of the present state of the art. // J. Vird. Meth. 1966. - v. 16. - p. 371-378.

56. Bartha A. Proposal for subgrouping of bovine adenoviruses. // Acta. Vet. Acad. Sci. Hung. 1969. - v. 19(3) - p. 319-321.

57. Bartha A., Aldasy P. Isolation of adenovirus strains from calves with vims diarrhoea. // Act. Vet. Acad. Sci. Hung. -1964. v. 3. - p. 239-245.

58. Bartha A., Aldasy P. Further two serotypes of bovine adenoviruses (serotype 4 and 5). // Acta. Vet. Acad. -1966. v. 16. - p. 107-108.

59. Bartha A., Mathe S., Aldasy P. New serotype 8 of bovine adenoviruses. // Acta. Vet. Acad. Sei. Hung. 1970. - v. 20. - p. 399-400.

60. Bauer H., Moureal G. Purification method for the avain adenoassotiated virus (short communication). // J. Virol. Meth. 1985. - v. 11. - n.l. - p. 87-92.

61. Bode L., Beutin L., Kohler H. Nitrocellulose enzyme - linked immunosorbent assay NC - ELISA - a sensitive technique for the rapid visual detection of both viral antigens and antibodies. // J. Virol. Meth. -1984. - v. 8. - n. 1(2). - p. 111-121.

62. Boulander P. Adenovirus assembly: self assembly of partially digested hexon. // J. of virology. - 1975. - v. 16. -n. 6. - p. 1678-1682.

63. Boulander P., Delaux C., Lemay P. Izolation and characterization of a slow -migrating class of adenovirus type 2 hexon. // Virology 1978. - v. 87. - p. 456468.

64. Bosh A. M. G., Van Hell H., Brands J. Schuurs A Specificity sensitivity and reproductibility of enzyme immunoassay. In: Enzyme labeled immunoassay of hormons and drugs. // S. B. Pal., ed, water de Grayter, Berlin, 1978. - p. 175187.

65. Boudin M., Moncany M. D., Hallin J. Izolation and characterization of adenovirus type 2 vertex capsomer ( penton base). // Birology. 1979. - v. 92. - p. 125-138.

66. Calnek В., Sheck W., Meneder N. Serological cross- reactivity of avain adenovirus serotypes in an ensyme-linked immunosorbent assay. // Avian Dis. -1982. v. 26. - n. 4. - p. 894-906.

67. Canterero L., Butter J., Osborne J. The adsorptive characteristics of protein for polysterine and their significance in solid phase immynoassays. // Anal. Biochem. 1980. - v. 105. - p. 375- 382.

68. Clark M., Lister R. et. al. ELISA. Techniques. // J. Meth. Enzymol. -Orlando. 1986. - v. 118. - p. 742-766.

69. Corneck G., Sigler P., Ginsberg H. Caracterization of crystals of adenovirus type 5 hexon. // Mol. Biol. -1971 v. 57. - p. 397- 401.

70. Darville J. Simple restriction endonuclease method for typing and subtyping adenoviruses. // J. Clin. Pathol. 1985. - v. 38. - n. 3. - p. 331-335.

71. Docrfler W. Adenovirus DNA the niral genome and its expression. // 1986. -USA.-p. 485.

72. Dorsett P., Ginsberg H. Characterization of type 5 adenovirus fiber protein. // J. Virol. -1975. v. 15. - p. 208-210.

73. Earle J., Mc. Ferran N., Wisdom G. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of antibodies to eight common neurotrophic viruses. // Talanta. 1984. - v. lOB.-p. 889-893.

74. Elazhary M., Derbyshire J. The cultivation of bovine adenovirus type 3 in culture of suspended MDBK cells. // Vet. Microbiol. 1978. - v. 2. - n. 4. - p. 283288.

75. Engler J. The nucleotide sequence of the polypeptide IX gene of human adenovirus types 3. // Gene. 1981. - v. 13. - p. 387-392.

76. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Quantitative assay for immunoglobulin G. // Immunochem. 1971. -n. 8. - p. 871874.

77. Everitt E., Sundquist В., Pettersson U. Structural proteins of adenoviruses X. Izolation and topography of low molecular weight antigens from the virion of adenoviruses type 2. // Virology. 1973. - v. 52. - p. 130-147.

78. Mc Ferran J., Adair B. Avian adenoviruses a review. // Avian Pathol. - 1977. -v. 6.-p. 189-217.

79. Fliut S. Adenovirus cytopathology. // Comr. Virol. Vol. 19. New York, London- 1984.-p. 297-358.

80. FlorenT., De Marneffe C. Enzyme-linked immunosorbent assay to monitor serum antibodies to bovine respiratory disease viruses. // Vet. Microbiol. 1986. -v. 11.-n. 4.-p. 309-317.

81. Franclin R., Harrizon S., Pettersson.U. Structurae studies on the adenovirus hexon. // repr. from Gold Spring Harbor Sympos. on Quantit. Biol. 1971. - v. XXXVI.

82. Frause R., Bieker R. Scheider H. Identification and typing of herpes simplex virus (HSV) isolates with monoclonal antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay. // Arth. Lab. -1985. v. 31. - n. 1. - p. 7-10.

83. Gaasfra W. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). // J. Meth. Mol. Biol. 1987. -v. 1.-p. 346-355.

84. Gerny E., Edith M., Hambie A. Adenovirus ELISA for the evalution of cerebraspinal fluid in patients with suspected neurosyphilis. // A.J.C.P. October. -1985,-p. 505-508.

85. Ginsberg H. The adenoviruses. // Plenum press, N. Y. and London. 1984.

86. Green M., Mackey J., Wold W. Thirty-one human adenovirus serotypes (Ad-Ad 31) from five groups (A-E) based upon DNA genoma homologies. // Virology. 1979.-v. 93.-p. 481-485.

87. Grutter M., Franklin R. Studies on the molecular weigh of the adenovirus type 2 hexon and its subunit. // J. Mol. Biol 1994. - v. 89. - p. 163-178.

88. Hamblin C., Barneff I., Hedger R. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detected of antibodies against foot-AND-mouth disease virus.//J. Immunol. Meth. -1986.-v. 93.-n. l.-p. 115-121.

89. Hofmann H., Frisch-Higgemayer H„ Heinz F. Rapid diagnostic of tick born encephalitic by means of enzyme-linked immunosorbent assay. // J. Gen. Virol. -1979.-v. 42.-p. 505-511.

90. Hu S., Battless J., Porrs Diane E. Restriction analysis and homology studies of the bovine adenovirus 7 genome, // J. Virol. -1984. v. 51. - n. 3. - p. 880-883.

91. Hu S Hays W., Potts D. Sequence homology between bovine and human adenoviruses. // J.Virol. 1984. - v. 49. - n. 2. - p. 604- 608.

92. Ihaba., Tanaka Y., Sato K. Bovine adenovirus 11 A serotype Fucuroi recovered from Japanese cattle. // Japan. J. Microbiol. 1984. - v. 58. - p. 345361.

93. Ishibashi M., Maizel J. The polypeptides of adenovirus v. 1. The early and late glycopeptides of adenovirus. // Virology. -1974. v. 58. - p. 345-361.

94. Ishibashi M., Yasue H. Adenoviruses of animals. // Adenoviruses. New York, London. 1984. - p. 497-521, 550-562.

95. Jeggo M. Diagnosis of viral diseases using ELISA techniques current status and futura prospect. // Nucl. and Related Techn. Anim. Proo. and Health. Proc. Int. Symp. Viena. - 1986. - p. 285-301.

96. Johanson M., Uhnoo I., Svensson L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of enteric adenovirus 41. // J. Med. Virol. 1985. - v. 17. - n. 1,- p. 19-27.

97. Kjellen H., Pereira H. Role of adenovirus antigens in the induction of virus neutralizing antibodies. // J. Gen. Virol. 1968. - v. 2. - p. 177-185.

98. Kohler K. Reinigung und charakteriisterung zweier proteine des adenjvirus type 2. // Znaturforsch. 1985. - v. 20. - p. 747-749.

99. Laver W., Wrigley R., Pereira H. Removal of penton from particles of adenovirus type 2. // Virology. -1969. v. 38. - p. 579-586.

100. Lengyel A., Adam E., Nasz I. A sensitive method for detection of policlonal and monoclonal antibodies against the adenovirus hexon. // Acta. Virol. 1985. - n. 29.-p. 362-372.

101. Mathur В., Verma K., Agarwa I. Serological survey for the detection of certain common respiratory infections in migratory birds: A note. // J. Anim. Sci. -1972.-v. 12.-p. 144-145.

102. Matthews R. Classification and nomenclature of viruses. // Intervirology. -1979.-v. 12.-p. 177-179.

103. Mattson D., Smith P. Schihz J. Isolation of bovine adenovirus type 4 from cattle in Oregon. // Amer. J. Vet. Res. 1977. - v. 38. - n. 12. - p. 2029-2032.

104. Nakane P., Kawaio A. Peroxidase-labelled antibody: A new methods of conjugated. // J. Histochem. Cytochem. -1974. v. 22, - p. 1084-1094.

105. Nasz J. The composed antigenic structure of the adenovirus hexon protein. // Rev. Roum. Med. Virol. -1988. v. 39. - n. 4. - p. 267-280.

106. Nermut M. The architecture of adenoviruses: recent views and problem Brief Review. // Arch. Virol. -1980. v. 64. - p. 175-196.

107. Norrby E., Marusyk H., Hammarskjold M. The relationship between the soluble antigens and the virion of adenovirus tupe 3. Identification of antigen speci fities available at the surface of virions. // Virology. 1969. - v. 38. - p. 477-482.

108. Norrby E., Skaaret P. The relationship between the soluble antigens and the virion of adenovirus tupe 3. Immunological identification of fiber antigen and isolation vertex capsomer antigen. // Virology. -1968. v. 32. - p. 489-493.

109. Ocelerich M. Enzyme immunoassay: a review. // J. Clin. Chem. Biochem. -1984.-v. 22.-p. 895-904.

110. Obi O., Taylor W. Serological survey of adenovirus antibodies in domestic animals in Nigeria. // Сотр. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 1984. - v. 7. - p. 6368.

111. Orr J. Necritizing enteritis in a calf infected with adenovirus. // Vet. J. -1984.-v. 25.-p. 72-74.

112. Panki M., Virtanen M., Palva A. Nucleis acid sandwich hydridization in adenovirus diagnosis. // New Development Diagnosis in Virology. Berlin. - 1983. -p. 307-318.

113. Patent specification. Tride G., Kanarek A. Kerry J. et al. N. 1313851. complement specification published. 18. 04. 1973.

114. Pereiro H., Dc Casto L. A combine enzyme immunoassay for rotavirus and adenovirus. // J. Vitol. Meth. 1985. - v. 10. - n. 1. - p. 21-28.

115. Pereiro H., Valentine R., Russell W. Crystalization of adenovirus protein. // Nature. 1968. - 219. - p. 946-947.

116. Pettersson U., Philipson L., Hoglund S. Structural proteins of adenoviruses. 1. Purification and characterization adenovirus type 2 hexon antigen. // Virology. -1967.-v.33.-p. 575-580.

117. Pettersson U., Philipson L., Hodlund S. Structural proteins of adenoviruses. 11. Purification and characterization of the adenovirus type 2 fiber antigen. // Virology. -1986. v. 35.-p. 204-215.

118. Philip J., Sands J. The isolation of bovine adenovirus serotypes 4 and 7 in Britain. // Res. Vet. Sci. 1972. - v. 13. - p. 386-387.

119. Philipson L., Lonberg Holm K., Petterson U. Virus receptor interaction in the adenovirus system. // Virology. - 1969. - v. 39. - p. 1064-1075.

120. Gorges J., Wigand R. Laboratory procedures in adenoviruses. V. A comparison of three group specific serological reactions. // Zbc. Bact. Hyg. J. Abt. Orig. - 1978. - A 242. - p. 283-298.

121. Ginsberg H. Adenovirus structural proteins. // in Comprehensive Virology. -1979. Plenum Press, New York, - v. 13. - p. 409-475.

122. Ginsberg H. Pereira H., Valentine R. A proposed terminology for the adenovirus antigens and virion morphological. // Virology. 1966. - v. 28. - p. 782783.

123. Ramirez R., Trigo F. Infection por adenovirus en bovinos у ovinos. // Vet. Mexico. 1986. - v. 17. - p. 110-115.

124. Roggendorf M., Wigand R., Deinhardt F. Enzyme-linked immunosorbent assay for acute adenovirus infection. // Virol. Meth. 1982. - v. 4. - p. 27-35.

125. Rosen L. A hemagglutination-inhibition technique for typing adenoviruses. // Amer. J. Hyg. 1960. - v. 71. - p. 120-128.

126. Rosen L. Hemagglytination of adenoviruses. // Virology. 1985. - v. 5. - p. 574-577.

127. Russell W., Valentine R., Pereira H. The effect of heat on the anatomy of the adenovirus. //J. Gen. Virol 1967. -v. 1. - p. 509-522.

128. Sarkkinen H., Tuokko H., Halonen P. Comparison of enzyme immunoassay and radio - immunoassay for detection of human rotaviruses and adenoviruses from stool spicimens. // J. Virol. Meth. - 1980. - v. 1. - n. 3. - p. 331-341.

129. Schuurs A., Van Weemen B. Enzyme immunoassay. // Clin, Chem. Acta. -1997.-v. 8.-p. 1-40.

130. Sizov I, Adenovirus infection in cattle in Bulgaria. // Vet. Med. Nauk. -1982.-v. 19.-p. 22-27.

131. Sizov I, Role of bovine adenovirus in calf diseases. // Vet, Med. Nauk. -1981.-v. 18. -p. 3-7.

132. Tissjen P. Practic and theory of enzyme immunoassay. // 1987. v. 15 - p. 79-241.

133. Valentine P., Pereira H. Antigens and structure of the adenovirus. // J. Mol. Biol.-1965.-v. 13.-p. 13-20.

134. Van Weemen В., Sehuurs A. Immunoassay using antigen enzyme conjugates. //FEBS. Letters. -1971. n. 15. - p. 232-236.

135. Vort Roberts F., Phillips J., Donald L. Quantitative differences among various proteins as bloking agents for ELISA microtites plates. // J. Immunol. Meth. 1987. - v. 101.-n. 1 - p. 43-45.

136. Wadell G. Structural and biological properties of capsid components of human adenoviruses. \\ Ph.d.thesis.Karolinska Inst., Stockholm. 1979.

137. Wadell G. Molecular epidemiology of human adenoviruses. 11 Curr. Microbiol and Immunol -1984, -n, 110. p. 191-220,

138. Wadell G., Varsanyi T. Demonstration three different subtypes of adenoviruses type 7 by DNA restriction site mapping. // Infect, and Immunol. -1978.-n. 2. -p. 238-246.

139. Wadell G., Norrby E. Immunological and other biological characteristics of peptons of human adenoviruses. // J. Virol. 1969. - n. 4. - p 671-676.

140. Wigand R., Barta A,, Dreizin R. Adenoviridae: second report. // Intervirology. -1982. v. 18 - n. 1 - p. 169-176.

141. Weemen Banke K. ELISA: highligts of the present state of the art. //J. Virol. Meth. 1985. - v. 10. - n. 4. - p. 371-378.

142. Wigand R., Adrain T. Classification and epidimiology of adenoviruses Adenovirus DNA. // Fd. W. Deerfler. Boston. Im. Vijnoff. Publ. 1986. - p. 409441.

143. Whestone C. Should the criteria for species distinction in adenovirus be reconsidered? Evidence from canine adenoviruses 1 and 2. // Intervirology. 1985. -v. 23. - n. 2. - p. 116-119.

144. Wilcox W., Ginsberg H. Production of specific neutralizing antibody with soluble antigens of type 5 adenovirus. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1963. - v. 114.-p. 19-24.

145. Wilcox W., Ginsberg H. Purification and immunological characterization of types 4 and 5 adenoviruses soluble antigens. // PNAS. USA. 1961. - v. 7. - p. 512-526.

146. Wilcox W., Mautner V. Antigenic determinants of adenovirus capsid. 1. Measurement of antibody cross reactivity. // J. Immunol. - 1970. - v. 116. - p. 1924.1. Разработано впервые

147. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫНШЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРуда1. Груша P-3I УТВЕРЖДАЮм.начальника Главноговления ветеринарии njgon* СССР1. Рахманин19вЯ г.

148. НАБОР ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ^ЩЖБИРУСНОЙ ИШЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ШШ^НОФЕРМЕНТНОГО1. АНАЛИЗА (ИФА)1. Технические условия

149. ТУ 10.U7.Iu6-8S> (Вводятся впервые на опытную партию 500 наборов)198*.

150. Срок введения с " и1ч Срок действия до"и!?7. 19г.