Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка тест-системы для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-системы для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа"

005537650

На правах рукописи//

Саттарова Наталья Валерьевна

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К БАКТЕРИЯМ MORAXELLA BOVIS МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА (ИКК-СЕРОТЕСТ)

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 НОЯ 2013

Казань-2013

005537650

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань)

Научный руководитель: -кандидат ветеринарных наук,

заслуженный ветеринарный врач РТ Спиридонов Г.Н.

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук, профессор

зав. лаб. иммунологии Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности Хисматуллина Наиля Анваровна

- кандидат ветеринарных наук, доцент каф. вирусологии и микробиологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины Нургалиев Фарит Муллагалиевич

Ведущее учреждение: - ФГБУ Федеральный центр охраны здоровья

животных (ФГБУ«ВНИИЗЖ»), г. Владимир

Защита состоится "10" декабря 2013 г. В Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок -2, «ФЦТРБ-ВНИВИ»),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань)

Автореферат разослан " " 2013 г. и размещен на

официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru и на официальном сайте ВАК РФ www.vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного ,,

совета, кандидат ветеринарных наук сВ.И.Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Инфекционный кератоконъюнктивит (ИКК) крупного рогатого скота бактериальной этиологии в последние годы приобрел широкое распространение во всем мире. В настоящее время сформировалось общее представление о том, что ведущая роль в возникновении ИКК крупного рогатого скота принадлежит бактериям Moraxella bovis (Иванов A.B., 2005; Гаффаров Х.З. с соавт., 1998, 2007; Angelos J. А., 2001; Postoma G. С, 2008).

Заболевание наносит значительный экономический ущерб сельскохозяйственному производству за счет снижения продуктивности, потерь живой массы, иногда падежа, а также расходов на дорогостоящее лечение.

Особое место в мероприятиях по борьбе с кератоконъюнктивитом занимает диагностика и специфическая профилактика (Bishop В., 1982; McConnel C.S., 2008). Мировая ветеринарная наука за последние годы достигла значительных успехов в вопросе диагностики, профилактики и лечения ИКК крупного рогатого скота. Для специфической профилактики ИКК крупного рогатого скота используются ряд вакцин, отличающихся по принципам получения и по методу проведения вакцинации (Hughes D. Е., 1976; Pugh G.W., 1977; Lepper A.W. et aL, 1995; Bums M. J., 2008; O'Connor A.M., 2011).

В ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" разработана и широко используется в различных регионах РФ ассоциированная вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота (ИКК КРС) на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1 (Иванов A.B., Гаффаров Х.З. и др., 2008; Спиридонов Г.Н., 2008).

С целью разработки более эффективных и адекватных методов диагностики требуются новые методические подходы, основанные на достижениях биологической науки и научно-технического прогресса в целом. В связи с этим одним из главных направлений ветеринарной диагностики является создание простых в использовании и надежных иммунохимических методов.

В лабораторной диагностике многих болезней широкое применение находит иммуноферментный анализ (ИФА) (Васильев Д. А., 1998; Хисматуллина H.A., 2002). Использование ИФА может иметь важное значение и для серологического мониторинга инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, а также изучения иммунного статуса в регионах, где проводилась вакцинация.

Метод иммуноферментного анализа универсален, обладает высокой специфичностью и чувствительностью, не требует сложного оборудования, и приемлем для проведения анализов в массовых количествах.

В настоящее время в Российской Федерации не разработаны методы серологической диагностики ИКК крупного рогатого скота. Исходя из этого, проведение исследований по разработке отечественных иммуноферментных тест-систем для выявления специфических антител к бактериям Moraxella

bovis является актуальной задачей, имеющей научное и практическое значение.

1.2 Цель и задачи исследований. Целью работы явилась разработка «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)», предназначенного для серологической диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и иммунологического мониторинга вакцинированного поголовья. Для выполнения вышеуказанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести эпизоотологический мониторинг и изучить иммунобиологические свойства выделенных бактерий Moraxella bovis -возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота;

2. Разработать технологию изготовления компонентов тест-системы ИФА, предназначенной для серологической диагностики ИКК крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител и стандартизировать условия ее проведения;

3. Провести оценку активности, специфичности и воспроизводимости иммуноферментной тест-системы путем тестирования сывороток крови, полученных от вакцинированных и больных инфекционным кератоконъюнктивитом крупного рогатого скота;

4. Определить диагностическую ценность иммуноферментной тест-системы в лабораторных и производственных условиях, а также провести серологический мониторинг в отношении ИКК крупного рогатого скота в хозяйствах регионах Среднего Поволжья и Предуралья.

1.3 Научная новизна работы. Впервые в РФ разработан «Набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)». Оптимизированы условия проведения иммуноферментного анализа. В ходе исследований установлена чувствительность, специфичность и воспроизводимость иммуноферментной тест-системы.

Положительные результаты лабораторных испытаний тест-системы подтверждены в производственных условиях.

1.4 Практическая значимость работы. Внедрение разработанной иммуноферментной тест-системы в практику ветеринарных лабораторий РФ позволит решить проблему как серологической диагностики ИКК крупного рогатого скота, так и оценки напряженности поствакцинального иммунитета.

Разработаны нормативные документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение данной тест-системы, в частности:

— технические условия на «Набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)», ТУ 9388 - 009-00492374-2013 (утверждены директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласованы ГУВ КМ РТ 7 июня 2013 г);

- инструкция по применению «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа

(ИКК-СЕРОТЕСТ)» (утверждены директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласованы ГУВ КМ РТ 7 июня 2013 г);

- инструкция по изготовлению и контролю «Набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)» (утверждена директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 7 июня 2013 г).

1.5 Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Эпизоотология ИКК в регионах Среднего Поволжья и Предуралья. Характеристика иммунобиологических свойств выделенных бактерий Moraxella bovis - возбудителя ИКК крупного рогатого скота;

2. Технология изготовления специфических компонентов тест-системы ИФА для серологической диагностики ИКК КРС и определения уровня поствакцинальных антител к бактериям Moraxella bovis;

3. Диагностическая ценность иммуноферментной тест-системы, анализ и интерпретация результатов испытания набора;

4. Результаты серологического мониторинга ИКК крупного рогатого скота в хозяйствах Среднего Поволжья и Предуралья.

1.6 Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на: ежегодных заседаниях Ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» при обсуждении отчетов о НИР за 2008-2012 гг.; Международных и Всероссийских научно-практических конференциях (Самара, 2009; Владимир, 2010; Краснообск, 2010; Москва, 2011; Казань, 2008, 2011, 2013).

1.7 Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в т.ч. 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.8 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах компьютерного текста и включает разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы и приложения, содержит 272 источника, в том числе 144 иностранных авторов и приложения. Диссертация содержит 13 таблиц и иллюстрирована 5 рисунками.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2008-2012 г.г. в лаборатории по изучению болезней молодняка ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», результаты апробированы в сельскохозяйственных предприятиях Среднего Поволжья и Предуралья, неблагополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту крупного рогатого скота, в соответствии с гос. заданием по НИР № 01200202602.

Анализ эпизоотической ситуации по ИКК крупного рогатого скота в неблагополучных хозяйствах проводили согласно рекомендациям И.А.Бакулова с соавт. (1982) и С.И.Джупина (1991).

В процессе выполнения работы по разработке иммуноферментной тест-системы были использованы:

- штаммы бактерий: Moraxella bovis «Г97-ВНИВИ», Moraxella bovis «ШЗ-01», Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 Ka -ДЕП»;

- лабораторные и естественно восприимчивые животные: 35 кроликов породы «Шиншилла», 125 белых мышей, 328 голов крупного рогатого скота;

- питательные среды: мясопептонный агар с добавлением 5% дефибринированной крови барана; мясопептонный бульон с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота; 12% мясопептонный желатин; лакмусовое молоко; среды Гисса с содержанием 1% сахарозы, глюкозы, лактозы, маннита.

Идентификацию выделенных культур проводили путем определения их физико-химических, морфологических, тинкториальных и других биологических свойств.

Для получения гипериммунной сыворотки использовали 10 кроликов массой 2,5-3,0 кг и 6 телят массой 130-150 кг, которые были разделены на две группы. Животных обеих групп иммунизировали антигенам бактерий Moraxella bovis в нарастающих дозах. Первую группу животных иммунизировали с интервалом 7 дней, вторую - 14 дней. Отбор крови проводили каждую неделю.

Отрицательную сыворотку крови кроликов и телят получали от здоровых животных, не имеющих антител к данным бактериям.

Липополисахаридный антиген Moraxella bovis выделяли методом водно-фенольной экстракции по O.Westphal (1965). Выделение белковых компонентов клетки бактерий Moraxella bovis проводили методом, описанным Bishop В. (1982), количественное определение белка - по методу O.Warburg и W.Christian (1941) сравнением поглощения белков при 280 и 235 нм на спектрофотометре СФ-46.

В работе использовали коммерческие препараты антивидовых иммунопероксидазных конъюгатов против иммуноглобулинов кролика и быка, изготовленные ГУ «НИИЭМ» им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для иммунологических реакций из полистирола производства «Linbro», (США) по общепринятой методике (Егоров A.M. с соавт., 1991). В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин (ОФД). Результаты реакции учитывали по показаниям оптической плотности при длине волны 490 нм (ОП490) на спектрофотометре «BIO-Rad Model 680» фирмы «BIO-Rad» (США).

Комиссионные испытания были проведены в условиях лаборатории по изучению болезней молодняка ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Интерпретацию полученных результатов проводили методами, описанными И. П. Ашмариным и А. А. Воробьевым (1962), Н. Бейли (1970) и

С. H. Лапач (2002). Статистическую обработку результатов исследований проводили методом вариационной статистики с применением критериев достоверности по Стьюденту с использованием программы «Microsoft Office Exell».

Отдельные этапы работы были выполнены с участием с.н.с., к.б.н. Валебной Л.В., м.н.с. Гатиятуллина А.Р., которым выражаю искреннюю признательность.

Выражаю глубокую благодарность профессору Макаеву Х.Н. за оказание научно-методической помощи при выполнении и оформлении данной работы.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ЗЛЭпизоотологнческий мониторинг ИКК крупного рогатого скота

Проведен эпизоотологический, бактериологический и серологический мониторинг в 14 скотоводческих хозяйствах Российской Федерации, неблагополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту крупного рогатого скота, в том числе в б хозяйствах Республики Татарстан, в 4 -Челябинской области, в 3 - Республики Башкортостан и в 1 - Тверской области. В процессе изучения этиологических аспектов ИКК в неблагополучных хозяйствах провели бактериологическое исследование 302 конъюнктивальных смывов, полученных от больных животных в острой стадии болезни. В ходе исследований установлено, что микробный пейзаж в исследуемых пробах был разнообразен. В ассоциации с бактериями Moraxella bovis - основным возбудителем инфекционного кератоконьюнктивита крупного рогатого скота (в 71% случаях), часто выделяли гемолитические грамотрицательные диплококки (22% случаях) и другую условно-патогенную микрофлору (стафилококки, стрептококки, кишечная палочка - 11 % случаях), осложняющую инфекционный процесс. В последние годы в хозяйствах Среднего Поволжья от больных с инфекционным конъюнктивитом телят часто стали выделять культуры грамотрицательных диплококков сходные по культурально-биохимическим свойствам с возбудителем ИКК - бактериями Moraxella bovis. Такие бактерии выделены нами в хозяйствах в совхозе-техникуме Чистопольского и СХПК «Енали» Апастовского районов РТ. Впоследствии выделенный нами штамм в совхозе-техникуме Чистопольского района был идентифицирован по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам как бактерии Moraxella bovoculi рода Moraxella семейства Moraxellaceae. Штамм Moraxella bovoculi выделен нами впервые в РФ, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Москва, ФГБУ «ВГНКИ») и предложен в качестве производственного штамма для изготовления диагностикумов и вакцины против ИКК крупного рогатого скота.

3.2 Изучение биологических свойств культур бактерий Moraxella bovis, выделенных от животных, больных инфекционным кератоконыонктивитом

Выделенные культуры бактерий Moraxella bovis через 20-24 ч роста на кровяном агаре в аэробных условиях при температуре 35-37°С образовывали рассеянные колонии небольших размеров (0,5-2 мм в диаметре) с зоной полного гемолиза (ß-гемолиз), некоторые колонии были окружены а-зоной гемолиза.

В фазе логарифмического роста клетки имели вид коротких палочек размером 0,9-1,7-1,6-2,7 мкм с характерным расположением парами или короткими цепочками. В висячей капле проявляли «дергающуюся» подвижность. Молодые клетки имели капсулу, но при дальнейших пассажах ее теряли.

В биохимическом отношении бактерии Moraxella bovis довольно инертны. Выделенные культуры бактерий на мясопептонном агаре без добавления сыворотки или дефибринированной крови не давали роста. Не удавалось их культивировать и на среде Симмонса. На мясопептонном желатине при 22°С изучаемые культуры бактерий вызывали слоистое разжижение его в верхней части пробирки. При 37°С реакция на желатиновом агаре была положительной уже через 24 часа. Большинство изученных штаммов бактерий оказались каталазоположительными. Проба на оксвдазу дала положительный результат. В реакции Эрлиха цвет эфирной вытяжки с реактивом не изменялся, т.е. оставался желтоватым. Следовательно, эпизоотические культуры бактерий индола не образовывали.

После 24-ч инкубации культур бактерий в лакмусовом молоке с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коровы в верхней части пробирки появлялась темно-синяя полоса, а при дальнейшей их инкубации среда становилась щелочной. Продолжение инкубации культур приводило к полной пептонизации лакмусового молока и его однородно-розовому окрашиванию.

В средах Гисса испытуемые культуры бактерий не оказывали ферментирующего действия на углеводы (цвет питательных сред в пробирках не изменялся), но pH среды увеличивалась с 7,2 до 8,2. При посеве культур бактерий в нитратную среду также никаких изменений не наблюдали, т.е. они не редуцируют нитраты в нитриты.

Столь же часто в мазках, приготовленных из экссудата пораженных глаз, обнаруживали грамотрицательные диплококки. При этом в первичных посевах после 18-24 ч инкубации в аэробных условиях при температуре 37°С на поверхности кровяного агара данные бактерии формировали рассеянные колонии диаметром < 1 мм. Колонии были круглые выпуклые с ровными краями белого или серовато-белого цвета. Все изоляты имели узкую зону ß-гемолиза вокруг или под каждой колонией. В мазках, окрашенных по Граму, представляли собой грамотрицательные диплококки, с редко встречающимися кокками; диаметр клеток составлял 0,7-1,3 мкм, смежные стороны клеток уплощены.

Для того чтобы охарактеризовать гемолитические кокки и определить связаны ли они с родом Moraxella нами были проведены обширные кулыурально-морфологические и биохимические тесты.

При исследовании 150 выделенных культур, схожих по культуральным свойствам с моракселлами, получили следующие результаты.

На мясопептонном желатине при 22°С изучаемые культуры бактерий не вызывали его разжижение. Все изучаемые штаммы бактерий оказались каталазоположительными. Проба на оксидазу давала положительный результат, что является характерным признаком для микроорганизмов семейства Moraxellaceae рода Moraxella. Эпизоотические культуры бактерий индола также не образовывали.

При 72-часовой инкубации данных бактерий в лакмусовом молоке реакция отрицательная. В средах Гисса испытуемые культуры бактерий не оказывали ферментирующего действия на углеводы (цвет питательных сред в пробирках не изменялся), но значение pH среды увеличивалось с 7,2 до 8,2. Также установлено, что эти штаммы способны к редукции нитратов и обладали фенилаланиндезаминазной активностью.

Сравнительное изучение их основных культурально-морфологических, биохимических свойств позволили нам отнести данные бактерии к семейству Moraxellacea, рода Moraxella, вид Moraxella bovoculi.

Выделенный эпизоотический штамм Moraxella bovoculi прошел депонирование в лаборатории качества и стандартизации бактериальных средств для ветеринарного применения ФГБУ «ВГНКИ» (г. Москва) под регистрационным названием «Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № -ДЕП».

В ходе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей исследуемого штамма с н.п. микроорганизмов, представленных в базах данных GenBank, установлена наибольшая гомология анализируемых H.n.löS рРНК с бактериями рода Moraxella, вида Moraxella bovoculi (99,9%).

3.3 Разработка тест-системы ИФА для серологической диагностики ИКК крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител

3.3.1 Сравнительная оценка методов получения антигенов бактерий Moraxella bovis

Первоочередной задачей в ходе разработки диагностических наборов является получение специфического и высокоочищенного антигена.

С этой целью нами получены и испытаны в непрямом варианте ИФА следующие антигены: липополисахаридный (ЛПС) и белковый, полученный путем обработки бактерий ультразвуком с последующим проведением экстракции разрушенных структур трихлоруксусной кислотой.

Для выделения антигенов клетки необходимо дезинтегрировать методом, позволяющим сохранить ее компоненты функционально и анатомически интактными (Захарова М.С. и соавт., 1972). Согласно полученным нами данным оптимальными параметрами для дезинтеграции клеток Moraxella bovis ультразвуком является экспозиция 10 минут.

Выделенные клеточные комплексы при этом режиме обладали выраженными антигенными свойствами. При данных параметрах экспозиции в мазках, окрашенных по Граму, не обнаруживали целые микробные клетки, а также отсутствовал рост колоний на 5% кровяном агаре. При меньшей частоте ультразвука происходило недостаточное разрушение микробной клетки и, как следствие, наблюдали меньшую активность антигена. Однако, при жестком ультразвуковом воздействии (более 10 мин) происходило сильное разрушение клетки, вплоть до частичной деградации компонентов, отвечающих за антигенную активность.

Оценку активности и специфичности антигенов, полученных разными методами, проводили в реакции с гипериммунными сыворотками крови кроликов, полученными к цельным антигенам бактерий Moraxella bovis, а также с гипериммунными сыворотками крови телят, полученными к аналогичному антигену.

В качестве отрицательного контроля использовали сыворотки крови кроликов и телят, не содержащие антитела к данному возбудителю.

В результаты сравнительной оценки активности двух антигенов бактерий Moraxella bovis — белкового и ЛПС-антигена установлено преимущество первого, так как при использовании его в ИФА с гипериммунными сыворотками крови наблюдали более высокие показатели коэффициента специфичности и титров специфических антител к бактериям М. bovis.

Все серии белкового антигена испытывали на специфичность и активность в реакции ИФА. При этом установили, что белковый антиген бактерий Moraxella bovis не реагирует с гетерогенными гипериммунными сыворотками (сальмонеллезной, эшерихиозной, туберкулезной), тогда как с гомологичными сыворотками (гипериммунной и полученной от вакцинированного против ИКК животного) дает положительную реакцию в высоких титрах (1:1280 — 1:5120), что свидетельствует о его специфичности.

3.3.2 Подбор оптимальной схемы иммунизации животных для получения гипериммунной сыворотки к бактериям Moraxella bovis

Достоверность результатов ИФА зависит от специфичности и активности не только антигена, но контрольной положительной сыворотки. С этой целью для получения гипериммунных сывороток подобрали рациональную схему иммунизации животных. Кровь для исследования брали каждые семь дней со дня иммунизации.

Активность гипериммунных сывороток крови кроликов и телят оценивали в непрямом твердофазном варианте ИФА.

Анализ результатов исследования свидетельствовал о том, что максимальная активность сывороток крови кроликов, которым антиген вводили 3-х кратно с интервалом 7 дней (первая группа) наблюдали на 21 день после первой инъекции (через 7 дней после третьей иммунизации) и сохранялась примерно на том же уровне до конца срока наблюдения. Титр антител составлял 13,32 Iog2. В то время как максимальная активность сывороток крови кроликов, которым вводили антиген 3-х кратно с

интервалом 14 дней (вторая группа) была отмечена на 35 день после первой иммунизации.

Таким образом, для получения сывороток крови кроликов с максимальным содержанием специфических антител более пригодна сокращенная схема. В сравнении со стандартной, она значительно сокращает время, необходимое для получения сывороток, а также затраты, связанные с содержанием животных.

В отличие от кроликов при гипериммунизации телят были получены противоположные результаты — сыворотки с максимальным количеством антител можно получить только при использовании схемы, в которой интервал между введениями антигена составляет 14 дней. Максимальный титр антител наблюдали на 35 день после первой иммунизации - 13,32 в то время как при сокращенной схеме титр антител за весь срок наблюдения не превысил 10,32

3.3.3 Оптимизация условий постановки твердофазного непрямого варианта иммуноферментного анализа

С целью увеличения точности, чувствительности и уменьшения расходов необходимо было, в первую очередь, подобрать оптимальные условия проведения реакции. Одним из основных требований в этом направлении является: определение температуры и времени инкубации специфических компонентов тест-системы в лунках полистироловых планшет; определение сенсибилизирующей дозы антигена; подбор оптимальных условий экспозиции иммунной сыворотки.

3.3.4 Определение оптимального разведения антигена и конъюгата

На данном этапе разработки набора провели подбор концентрации

антигена для адсорбции на полистироловый 96-луночный планшет.

При подборе оптимальной концентрации антигена для адсорбции, оценивали интенсивность иммуноферментной реакции при следующих концентрациях антигена в растворе: 2; 2,5; 5 и 8 мкг/см3. В качестве тестируемых образцов использовали положительные и отрицательные контрольные образцы сывороток крови животных. Был проведен подбор концентрации сорбции антигена. Параллельно подбирали рабочее разведение конъюгата (табл. 1).

Таблица 1 - Результаты подбора условий сорбции антигена и

Концентрация антигена, мкг/см3 Титр антител сывороток крови в ИФА,

Разведение конъюгата

1:600 1:1200 1:2400 1:4800

2 10,32 11,32 12.32 10,32

2,5 11,32 11,32 13,32 10,32

5 12,32 13,32 13,32 11,32

8 12,32 13,32 13,32 11,32

Из данных таблицы 1 видно, что средний и наиболее приемлемый показатель титра сывороток крови животных был выявлен при разведении конъюгата 1:2400 и концентрации сорбированного антигена 2,5 мкг/см3.Таким образом, данное разведение конъюгата, при исходной концентрации сорбированного антигена 2,5 мкг/см3, было сочтено оптимальным и использовано в дальнейшей работе.

На следующем этапе разработки ИФА, учитывая опыт получения аналогичных иммуноферментных тест-систем, произвели подбор оптимальной температуры и времени экспозиции адсорбции антигена. С этой целью в 3-х повторностях испытывали режимы иммобилизации антигена в течение 6,18,24 ч при температуре 4°С и 1, 2,3 ч - при 37°С.

Процесс адсорбции антигена оценивали по интенсивности реакции с контрольными гипериммунными положительными и отрицательными сыворотками в серийных разведениях. Критерием являлось достижение максимального значения титра антител (табл. 2).

Таблица 2 - Определение оптимальной температуры и времени адсорбции антигена бактерий Moraxella bovis (n=3; Р<0,01)

Температура Время адсорбции антигена/Титр антител log2

37°С 1ч 2ч Зч

11,68±0,41 13,32±0,00 12,65±0,41

4°С 6ч 18 ч 24 ч

11,99±0,41 13,32±0,00 12,99±0,41

В результате проведенных исследований установлено, что эффективно использовать режим иммобилизации антигена в течение 2 ч при температуре 37°С или 18 ч при температуре 4°С, при которых наблюдали максимальные значения титра антител. Учитывая полученные данные для дальнейшей работы нами была выбрана инкубация антигена при температуре 4°С в течение 18ч как наиболее оптимальная.

3.3.5 Определение оптимального времени экспозиции исследуемых сывороток

Процесс образования стабильных иммунных комплексов в тест-системе ИФА является сложным процессом и требует определенного времени, для установления которого в 3-х повторностях оценивали интенсивность реакции в зависимости от времени инкубирования специфических и отрицательных сывороток в серийных разведениях при температуре 37°С. При этом использовали конъюгат в рабочем разведении 1:2400. Результаты исследований представлены в таблице 3, которые свидетельствовали, что показатели оптической плотности исследуемых сывороток в диапазоне от 15 до 60 мин возрастают, а далее стабилизируются. Наблюдаемый эффект был зафиксирован для сывороток, обладающих различным уровнем специфической активности.

Таблица 3 - Подбор условий сорбции контрольных сывороток на сенсибилизированный антигеном бактерий Moraxella bovis планшет (п=3; Р<0,01)_____

Продолжительность взаимодействия антиген-антитело, мин. Показатели оптической плотности исследуемых сывороток (ОП490) Титр антител положительной сыворотки, log2

отрицательная положительная

15 0,100±(Ш 0,910±0,01 8,64

30 0,170±0,00 1,28±0,03 10,64

60 0,350±0,00 1,68±0,03 12,64

90 0,380±0,03 1,70±0,01 12,64

На основании полученных результатов 60-мин экспозицию сывороток приняли достаточной для достижения максимальной и стабильной реакции.

3.4 Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к бактериям Moraxella bovis при тестировании сывороток крови животных в одном разведении

Разработка тест-системы включала определение оптимального рабочего разведения сыворотки, коэффициентов уравнения линейной регрессии для количественной оценки титра и установление позитивно-негативного порога для качественной интерпретации данных.

3.4.1 Определение рабочего разведения сыворотки крови телят и расчет титра антител. При тестировании сывороток крови методом одного разведения, результаты представляют в виде S/P отношения величин оптической плотности исследуемой сыворотки и положительного контроля.

g^p _ ОП (исследуемой пробы) - ОП (отрицательного контроля)_

ОП (положительного контроля) - ОП (отрицательного контроля)

Для определения оптимального рабочего разведения сыворотки в ИФА методами последовательных разведений и одного разведения сыворотки исследовали 60 сывороток крови телят. Для каждой пробы определили титр и значение S/P в разведениях 1:80, 1:160 и 1:320. Для каждого из указанных разведений между значениями lg(T) и lg(S/P) с помощью компьютерной программы «Microsoft Office Exell» рассчитали коэффициенты (А и В) для уравнения модели связи lg(T) = А + В * lg(S/P) и коэффициенты корреляции. Для всех испытанных разведений связь между S/P-показателями и эмпирическими значениями титров была довольно высокой, коэффициенты корреляции составили 0,85; 0,87; 0,87, соответственно разведениям сывороток 1:80, 1:160, 1:320. Исходя из результатов, для практического применения рекомендовали регрессионную модель для разведения 1:160 для прогнозирования значения титра антител в одном разведении.

Уравнение линейной регрессии числового значения титров, исходя из

значений оптической плотности, имело вид:

IgT = 2,6642x1g (S/P)+3,8145

Коэффициенты уравнения, соответствующие разведению 1:160 использовали для расчета суммарного титра антитела к бактериям Moraxella bovis при тестировании сывороток в одном разведении. В качестве примера на рисунке 1 приведен график зависимости lg(T) от lg(S/P) и соответствующая регрессионная модель для разведения 1:160 в тест-системе для выявления антител к бактериям Moraxella bovis.

IgT = 2.6642 »le(S/P)+ 3,8145

-0,8

4g(S/F)

Рис. 1. График зависимости IgT антител к бактериям Moraxella bovis, определенного методом последовательного разведения от lg (S/P) в разведении сыворотки 1:160.

3.4.2 Определение позитивно-негативного порога. Позитивный и негативный порог (ПНП) реакции рассчитали по методу Snyder D.B. (1983). Сумма среднего значения и двух стандартных отклонений явилась верхней границей отрицательных значений, а сумма среднего значения и трёх стандартных отклонений — нижней границей положительных значений. Тестировали 50 заведомо отрицательных сывороток крови телят. Рассчитали среднее значение оптической плотности сывороток (0,31 o.e.), прибавляя удвоенное значение стандартного отклонения (0,18 o.e.). ПНП, полученный в виде прямой, отражал верхнюю границу отрицательных величин (0,67 o.e.), а оптическая плотность, соответствующая наименьшему положительному значению, равнялась 0,85 о.е.(ПНП). Для данных значений показателей вычисляли S/P-отношения, которые были критериями разграничения результатов реакции.

В дальнейшем значение S/P выражали в виде процента:

д^р _ ОЩисследуемой пробы) - ОЩотрицательного контроля) ^ ЮОУ ОЩположительного контроля) - ОЩотрицательного контроля)

Пробу считали отрицательной, если величина S/P менее 11%. Если величина S/P более 22%, пробу считали положительной. Выявленные результаты исследований сывороток в диапазоне от >11% до <22% следует считать сомнительными.

3.4.3 Характеристики качества иммуноферментной тест-системы. При исследовании методом ИФА на основе разработанной тест-системы 70 положительных стандартных образцов было получено 64 положительных и б отрицательных результатов, то есть 6 образцов не были распознаны. Чувствительность тест-системы при этом составила 91,4 %.

Для расчета специфичности использовали число ложноположительных результатов, при исследовании 100 отрицательных стандартных образцов было получено 85 отрицательных и 15 положительных результатов, то есть 15 образцов были оценены неправильно. Специфичность составила 85,0 %.

Установлено, что чем меньше число ложноогрицательных результатов, тем выше чувствительность, и чем меньше ложноположительных результатов, тем лучше специфичность.

3.4.4 Выбор условий хранения антигена на планшете. Сохранение исходной активности иммобилизованного антигена проверяли в реакциях с контрольными сыворотками непосредственно после нанесения на планшет, а также через 1, 3, 6 и 12 месяцев хранения при комнатной температуре, а также при температуре +4-8°С. При этом установлено, что адсорбированный на планшеты антиген сохраняет свою активность при хранении в течение 12 месяцев при температуре 4-8 °С.

3.5 Комиссионное испытание «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)»

Межлабораторное комиссионное испытание специфичности и чувствительности тест-системы ИФА для серологической диагностики ИКК крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител проводили в условиях лаборатории по изучению болезней молодняка ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» с участием сотрудников лаборатории вирусологии.

При испытании антигена и положительной сыворотки крови на специфичность использовали: контрольную положительную сыворотку к бактериям Moraxella bovis, контрольную отрицательную сыворотку по отношению к бактериям Moraxella bovis, сыворотку крови от вакцинированных против инфекционного кератоконъюнктивита и больных инфекционным кератоконъюнктивитом телят, а также гетерологичные гипериммунные сыворотки (сальмонеллезную, эшерихиозную и туберкулезную).

В результате комиссионного испытания «Набора препаратов...» установлено, что все компонента набора активны и специфичны в ИФА. Антиген, полученный путем ультразвуковой обработки, не реагирует с гетерологичными гипериммунными сыворотками (сальмонеллезной, эшерихиозной, туберкулезной), тогда как с гомологичными сыворотками (гипериммунной сывороткой и сыворотками крови, полученными от

вакцинированных против инфекционного кератоконъюнктивита и явно больных животных) дает положительную реакцию в высоких титрах -12,32±0,41 log2;l 1,32±0,44 log2 и 11,32±0,547 log2, соответственно.

На основании проведенных испытаний комиссия пришла к заключению, что испытуемый диагностический набор по своим характеристикам соответствует своему назначению и может быть рекомендован для проведения широких производственных испытаний.

3.6 Производственное испытание «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)»

При производственном испытании тест-системы проводили исследование сывороток крови крупного рогатого скота, доставленных из различных регионов РФ, неблагополучных по инфекционному кратоконъюнктивиту. При этом исследовали сыворотки крови, полученные от больных и вакцинированных животных из неблагополучных по ИКК хозяйств, а также от здоровых животных из благополучных хозяйств. Исследование животных проводили в период разгара болезни (июль-август месяцы). Результаты исследований отражены в таблице 4.

Таблица 4 - Данные исследования сывороток крови крупного рогатого скота на наличие антител к бактериям Moraxella bovis

Наименование хозяйства Кол-во проб Состояние животных Реагируют положительно в ИФА

Кол-во %

ООО «Среднее Девятово» 58 здоровые, вакцинированные 53 91,4

ООО «Хаерби» 65 здоровые, вакцинированные 62 95,4

ООО «Варшавское» 37 здоровые, вакцинированные 33 89,2

ООО «Агрофирма «Калининское» 41 здоровые, вакцинированные 38 92,7

ООО «Золотой колос Пестрецы» 60 больные, не вакцинированные 54 90,0

ООО «Башак» 54 больные, не вакцинированные 47 87,0

ООО «Оршанский сельхозпром» 45 здоровые, не вакцинированные - 0,0

ООО «Ак Барс-Агро» 57 здоровые, не вакцинированные - 0,0

Данные таблицы показывают, что специфические антитела к бактериям Moraxella bovis обнаруживаются у 89,2-95,4% вакцинированных против ИКК животных и 87,5-90,0% больных телят. При этом титры специфических антител у здоровых вакцинированных животных выявляются в титрах 1:640 —

1:2560, у больных, не вакцинированных животных в титрах 1:160 — 1:1280. Исследования сывороток крови от не вакцинированных животных из благополучных по ИКК КРС хозяйств дают отрицательные результаты.

Таким образом, разработан набор препаратов для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovis в сыворотке крови методом ИФА, позволяющий диагностировать ИКК КРС у не вакцинированных животных и осуществлять иммунологический мониторинг у вакцинированного поголовья.

4 ВЫВОДЫ

1. Разработана иммуноферментная тест-система на основе антигенов бактерий Moraxella bovis для серологической диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител.

2. Показано, что разработанная иммуноферментная тест-система позволяет определить титры специфических антител в сыворотке крови животных по единственному фиксированному разведению на основе уравнения связи с S/P — показателем, которое имеет вид lgT=2,6642*lg(S/P)+3,8145. Также установлены соответствующие пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, которые находятся в диапазоне <11 - > 22%.

3. Получен иммуноспецифический компонент тест-системы -антиген белковой природы, позволяющий выявлять антитела к бактериям Moraxella bovis в сыворотках крови животных.

4. Изысканы схемы гипериммунизации телят и кроликов для получения сывороток крови с высоким уровнем антител к бактериям Moraxella bovis. Показано, что для получения сывороток крови с максимальным количеством специфических антител более пригодна схема, включающая трехкратное введение антигена кроликам с интервалом 7 дней, и 14 дней - телятам.

5. Комиссионными испытаниями установлено, что диагностический «Набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа» по своим характеристикам соответствует своему назначению и рекомендован для внедрения в ветеринарную практику.

6. Серологическими исследованиями 417 проб сывороток крови из неблагополучных по ИКК хозяйств показана высокая специфичность и чувствительность тест-системы «ИКК-СЕРОТЕСТ». В хозяйствах Среднего Поволжья и Предуралья специфические антитела к бактериям Moraxella bovis выявлялись в сыворотках крови у 89,2-95,4% вакцинированных против ИКК животных и 87,5-90,0% у больных телят.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработан и предложен для внедрения в ветеринарную практику «Набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)», предназначенный для серологической диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и иммунологического мониторинга вакцинированного поголовья.

Материалы исследований по разработке и применению тест-системы ИФА вошли в научно-нормативные документы.

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Саттарова, Н.В. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител к бактериям Moraxella bovis / H.B. Саттарова II Матер, науч. конф. молодых ученых и специалистов, посвященной 100-летию со дня рождения профессора X. X. Абдуллина. — Казань, 2008. - С. 172-175.

2. Саттарова, Н.В. Диагностика инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота методом ИФА / Н.В. Саттаррова, JI.B. Валебная, Г.Н. Спиридонов // Науково-техшчний бюлетень 1нстшуту бюлоги тварин i державного науково-дослщного контрольного ¡нституту ветарепарапв та кормових добавок. - Львов, 2009. - Вып. 10. - С. 179-182.

3. Саттарова, Н.В. Набор препаратов для диагностики кератоконъюнктивита крупного рогатого скота методом ИФА / Н.В. Саттарова, Л.В. Валебная, Г.Н. Спиридонов II Матер. Междунар. конф., посвященной 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии. - 2009. - С. 391-3955.

4. Иванов, A.B. Иммуноферментная диагностика инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / A.B. Иванов, Н.В. Саттарова1 Г.Н. Спиридонов //Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: Матер. Междунар. науч.-практ. конф. - Краснообск, 2010. — 87-91.

5. * Саттарова, Н.В. Разработка набора реагентов для определения специфических антител к бактериям Moraxella bovis иммуноферментным методом / Н.В. Саттарова, Г.Н. Спиридонов, Л.В. Валебная // Ветеринария и кормление - 2010. - №6. - С. 55-56.

6. Саттарова, Н.В. Мониторинг инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, вызываемого бактериями Moraxella bovis! Н.В. Саттарова // Лекарственные препараты для животных (разработка, производство, эффективность и качество): Матер. Междунар. науч. конф. - М., 2011. - С. 74-75.

7. * Нургалиева А.Р. Оценка антигенной активности вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота,

изготовленной с использованием различных питательных сред / А.Р. Нургалиева, Н.В. Саттарова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Т. 206.-Казань, 2011. -С. 165-169.

8. Саттарова, Н.В. Оптимизация условий постановки непр мого варианта ИФА для выявления антител к бактериям Moraxella bovis / H.B. Саттарова, А.Р. Нургалиева // Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов: Матер. Между нар. науч.-практич. конф. молодых ученых и специалистов. - Казань, 2013. - С. 68-71.

9. Нургалиева А.Р. Глубинное культивирование бактерий Moraxella bovis / А.Р. Нургалиева, Н.В. Саттарова // Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов: Матер. Междунар. науч.-практич. конф. молодых ученых и специалистов. - Казань, 2013. — С. 143-145.

* - издания, рекомендованные ВАК РФ.

Подписано в печать 05.11.13. Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л. 1,25 Тираж 100. Заказ № 0511/1. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Саттарова, Наталья Валерьевна, Казань

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ

ФГБУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ

САТТАРОВА НАТАЛЬЯ ВАЛЕРЬЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К БАКТЕРИЯМ MORAXELLA BOVIS МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО

АНАЛИЗА (ИКК-СЕРОТЕСТ)

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ФЕДЕРАЦИИ

И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ»

(ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

04201450736

На прав;

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук

Спиридонов Геннадий Николаевич

Казань 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ............................................................................... 2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................... 4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ............................................. 5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................ 10

1.1 Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота.......... 10

1.2 Характеристика и биологические свойства основного возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита (ИКК) крупного рогатого скота -бактерий Moraxella bovis.................................................................. 15

1.3 Методы диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота............................................................................... 25

1.4 Методы иммуноанализа......................................................... 27

1.5 Иммуноферментный анализ.................................................... 31

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................ 39

2.1 Материалы и методы исследований........................................... 39

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ........................ 52

3.1 Эпизоотологический мониторинг ИКК крупного рогатого скота........ 52

3.2 Изучение биологических свойств культур бактерий, выделенных от животных, больных инфекционным кератоконъюнктивитом, на территории Республики Татарстан.............................................. 54

3.3 Разработка тест-системы ИФА для серологической диагностики ИКК крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител................................................................................. 60

3.3.1 Сравнительная оценка методов получения антигена бактерий Moraxella bovis.................................................................. 60

3.3.2 Подбор оптимальной схемы иммунизации животных для получения гипериммунной ^сыворотки к бактериям Moraxella bovis....................................................................................... 64

3.4 Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к бактериям Moraxella bovis при тестировании сывороток крови животных в одном разведении....................................... 69

3.5 Комиссионное испытание «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)»...................... 72

3.6 Производственные испытания «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа» (ИКК-СЕРОТЕСТ)...................... 76

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ... 78

ВЫВОДЫ................................................................................. 89

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ............................................... 90

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................................ 91

ПРИЛОЖЕНИЯ......................................................................... 121

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ-АТ - антиген-антитело

БСА/ЛСА - сывороточный альбумин быка/лошади ИКК - инфекционный кератоконъюнктивит ИФА - иммуноферментный анализ КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер КМПА - кровяной мясопептонный агар КРС - крупный рогатый скот

м.к. - микробные клетки »I». ч ........

МПА - мясопептонный агар

МПБ - мясопептонный бульон

МПЖ - мясопептонная желатина

ОП490 - оптическая плотность

ОФД - ортофенилдиамин

ПМПА - полужидкий мясопептонный агар

РА - реакция агглютинации

РДП - реакция диффузионной преципитации

РСК - реакция связывания комплимента

Т - титр

ТСА - триптон-соевый агар

ТСБ - триптон-соевый бульон

ТХУ - трихлоруксусная кислота

УФ - ультрафиолетовый

ФБР - фосфатно-буферный раствор

ФСБР/т. - фосфатно-буферный раствор с Твином 80

шт. - штамм

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекционный кератоконъюнктивит (ИКК) крупного рогатого скота бактериальной этиологии в последние годы приобрел широкое распространение во всем мире. В настоящее время сформировалось общее представление о том, что ведущая роль в возникновении ИКК крупного рогатого скота принадлежит бактериям Moraxella bovis (Иванов A.B., 2005; Гаффаров Х.З. с соавт., 1998, 2007; Angelos J. А., 2001; Postoma G. С, 2008).

Заболевание наносит значительный экономический ущерб сельскохозяйственному производству за счет снижения продуктивности, потерь живой массы, иногда падежа, а также расходов на дорогостоящее лечение.

Особое место в мероприятиях, по борьбе с кератоконъюнктивитом занимает диагностика и специфическая профилактика (Bishop В., 1982; McConnel C.S., 2008). Мировая ветеринарная наука за последние годы достигла значительных успехов в вопросе диагностики, профилактики и лечения ИКК крупного рогатого скота. Для специфической. I профилактики ИКК крупного рогатого скота используются ряд вакцин, отличающихся по принципам получения и по методу проведения вакцинации (Hughes D. Е., 1976; Pugh G.W., 1977; Lepper A.W. et ah, 1995; Burns M. J., 2008; O'Connor A.M., 2011).

В ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" разработана и широко используется в различных регионах РФ ассоциированная вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота (ИКК КРС) на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1 (Иванов A.B., Гаффаров Х.З. и др., 2008; Спиридонов Г.Н., 2008).

С целью разработки более.эффективных и адекватных методов диагностики требуются новые методические подходы, основанные на достижениях биологической науки и научно-технического прогресса в целом. В связи с этим одним из главных направлений ветеринарной диагностики является создание простых в использовании и надежных иммунохимических методов.

В лабораторной диагностике многих болезней широкое применение находит иммуноферментный анализ (ИФА) (Прунтова О.В., 1997; Васильев Д. А., 1998; Хисматуллина H.A., 2002; Мудрак Н.С., 2004).

Использование ИФА может иметь важное значение и для серологического мониторинга инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, а также изучения иммунного статуса в регионах, где проводилась вакцинация.

Метод иммуноферментного анализа универсален, обладает высокой специфичностью и чувствительностью, не требует сложного оборудования, и приемлем для проведения анализов в массовых количествах.

В настоящее время в Российской Федерации не разработаны методы серологической диагностики. ИКК крупного рогатого скота. Исходя из этого, проведение исследований по разработке отечественных иммуноферментных тест-систем на основе антигенов ¡для выявления антител к бактериям Moraxella bovis является актуальной задачей, имеющей научное и практическое значение.

Цель и задачи исследований. Целью работы явилась разработка «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)» для серологической диагностики инфекционного тсератоконъюнктивита крупного рогатого скота и иммунологического мониторинга вакцинированного поголовья.

В соответствии с поставленной целью решали следующие задачи:

1.Провести эпизоотологический мониторинг и изучить иммунобиологические. .свойства выделенных бактерий Moraxella bovis -возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота;

2. Разработать технологию изготовления компонентов тест-системы ИФА, предназначенной для серологической диагностики ИКК крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител и стандартизировать условия ее проведения; ..«¡¡i,..h) ¡^п..^ ... .

3. Провести оценку активности, специфичности и воспроизводимости иммуноферментной тест-системы .путем тестирования сывороток крови,

полученных от вакцинированных и больных инфекционным кератоконъюнктивитом крупного рогатого скота;

4. Определить диагностическую ценность иммуноферментной тест-системы в лабораторных и производственных условиях, а также провести серологический мониторинг в отношении ИКК крупного рогатого скота в хозяйствах регионах Среднего Поволжья и Предуралья.

Научная новизна работы. Впервые в РФ разработан «Набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)». Оптимизированы условия проведения иммуноферментного анализа,. В ходе исследований установлена чувствительность, специфичность и воспроизводимость ИФА на основе разработанной тест-системы.

Положительные результаты лабораторных испытаний тест-системы подтверждены в производственных условиях.

Практическая "-значимость работы. Внедрение разработанной иммуноферментной тест-системы в практику ветеринарных лабораторий РФ позволит решить проблему как серологической диагностики ИКК крупного рогатого скота, так и оценки напряженности поствакцинального иммунитета. <.

Разработаны нормативные документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение данной тест-системы, в частности:

- технические условия на «Набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)», ТУ 9388 - 009-00492374-2013, утверждены директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласованоФУВ КМРТ, 7 июня 2013 г;.

- инструкция по применению «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)» (утверждена директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») 7 июня 2013 г;

- инструкция по изготовлению и контролю «Набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного

анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)» (утверждена директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») 7 июня 2013 г.

Апробация работы. " Основные положения диссертации доложены, обсуждены и получили положительную оценку на:

- ежегодных заседаниях Ученого совета Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») при обсуждении отчетов о НИР за 2009-2012 гг.;

- международной конференции, посвященной 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии (Самара, 2009);

- международной научно-практической конференции молодых ученных ФГУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2010);

- междунаро'ДйЬй нау^нЬ-практической конферейЦии, посвященной 70-летию со дня основания Института экспериментальной ветеринарии Сибири, Дальнего Востока «Актуальные вопросы' ветеринарной медицины Сибири» (Краснообск, 2010);

- международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию организации ВГНКИ «Лекарственные препараты для животных (разработка, производство, эффективность и качество)» (Москва, 2011);

- всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение инновационного развития ветеринарной медицины и животноводства» ФГОУ " ВИО" «Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» (Казань, 2011);

- международной научно-практической конференции «Биотехнологии в решении экологических проблем природы. Общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученных и специалистов» (Казань, 2013).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в т.ч. 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

и'> 15 ПК; . ... „К

1. Эпизоотология ИКК в регионах Среднего Поволжья и Предуралья. Характеристика иммунобиологических свойств выделенных бактерий Moraxella bovis - возбудителя ИКК крупного рогатого скота;

2. Технология изготовления специфических компонентов тест-системы ИФА для серологической диагностики ИКК КРС и определения уровня поствакцинальных антител к бактериям Moraxella bovis;

3. Диагностическая ценность иммуноферментной тест-системы, анализ и интерпретация результатов испытания набора;

4. Результаты серологического мониторинга крупного рогатого скота в отношении ИКК в хозяйствах регионов Среднего Поволжья и Предуралья.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах компьютерного текста и включает разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы и приложения, содержит 277 источника, в том числе 144 иностранных авторов и приложение. Диссертация содержит 14 таблицы и иллюстрирована 5 рисунками.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота

Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота - острое контагиозное заболевание, характеризующееся слезотечением, гиперемией сосудов конъюнктивы, светобоязнью, серозно-гнойным истечением, помутнением и изъязвлением роговицы, деформацией глазного яблока в виде кератоглобуса или кератоконуса, частичной или полной потерей зрения пораженного глаза животного.

Впервые V. Могах (1896) и Т. Axenfeld (1897) независимо друг от друга выделили возбудитель инфекционного конъюнктивита человека. В 1899 году F.S. Billings сообщил о случаях инфекционного кератита у крупного рогатого скота в штате Небраска (США) и в окрашенных мазках, приготовленных из истечений пораженных глаз, выявил короткие палочки с закругленными концами. Позже F.S. Jones и R.B. Little (1923).описали 24 вспышки острого инфекционного офтальмита у крупного рогатого скота и во всех случаях были выявлены характерные диплобациллы.

R. Hauduroy et al. (1937) идентифицировали, выделенные F.S. Jones и R.B.t Little диплобактерии как Hemophilus bovis. Позднее A. Lwoff (1939) включил их в род, Moraxella. .ul(>M!...t.

В нашей стране первые сообщения об эпизоотических вспышках ИКК появились лишь в 70-80-е годы (Бобырь В.К., 1974; Какоулин Т.Е., 1982; Андриасян В.Б.,1988; Черванцев В.А., 1995). Однако были описаны только клинико-эпизоотические особенности болезни и отсутствовали данные по выделению основного возбудителя, идентификации и доказательств его этиологической роли в возникновении болезни.

В настоящее время во всем мире сформировалось общее представление, что ведущая роль в возникновении ИКК крупного рогатого скота принадлежит бактериям Moraxella bovis (Pugh G.W., 1970, 1975; Lepper A.W., 1986; Гаффаров X.3. с соавт., 1998, 2007).

UK * .< Л * l' АМН J ! U ' ' . . . -

1 ••'•"■ -•*>.* n

Наряду с этим известно, что герпесвирус типа I также может вызвать острый конъюнктивит у этого вида животных (Zbrun M.V., 2011). При этом воспалительный процесс не прогрессирует до помутнения роговицы и ее изъязвления. В ряде работ высказывается мнение, что герпесвирус типа I создает благоприятную среду для патогенного действия основного возбудителя ИКК -бактерий Moraxella bovis (Штрауб О.Х., Abinanti F.R. et al., 1961; Sykes J.A., 1962; Mohanty S.B., 1970; Rebnun W. et al., 1978; Straub O.X., 1981; Georg L.W., 1988).

Другие источники указывают на то, что при ИКК крупного рогатого скота могут играть менее выраженную роль хламидии (Фомин Ю.В., 1970; Гаффаров Х.З. 2004; Равилов А.З., 2004; Wehr J.- et; al., 1980), Mycoplasma bovoculi (Эйделынтейн И.A., 1999; Langford E.V., 1973; Schottxer-Wegner H.H., 1990), риккетсии (Сидорчук A.A., 2005) и условно патогенные бактерии, которые в ряде случаев участвуют в формировании смешанных инфекций (Travnicek М. et al., 1982 и др.).

Нет сомнений в том, что в качестве сопутствующей микрофлоры участвуют в этой патологии стрептококки, стафилококки, диплококки, E.coli и др., которые осложняют инфекционный процесс (Дорофеев К.А., 1973; Русинов А.Ф., 1995).

Большое значение в возникновении массовых кератоконъюнктивитов у крупного рогатого скота придается и гельминтам, в частности, нематодам из рода Thelazia Bosc, которые, находясь в глазу, оказывают на него механическое и токсическое раздражающее действие с последующим поражением большей части поверхности роговицы (Горцевский С.А., 1962; Эльце К. с соавт., 1977; Абуладзе К.И., 1980.Русинов А.Ф, 1983; Ивашкин В.М., 1984).

Инфекционный кератоконъюнктивит, вызываемый бактериями Moraxella bovis, широко распространен во всех странах мира и наносит значительный экономический ущерб. ¡Частртаеш проявления в Российской^Федерации наиболее высока, особенно среди молодняка крупного рогатого скота текущего года рождения и на откормочных площадках с высокой плотностью поголовья.

Наибольшего развития болезнь достигает в теплое время года, особенно на пастбищах. Поражается чаще один глаз, а затем переходит на другой; реже поражаются сразу два глаза, причем, как правило, один глаз сильнее, чем другой.

Заболевание в больших стадах причиняет значительный экономический ущерб развитию скотоводства вследствие снижения удоя до 50%, прироста массы тела на 31-37%, иногда падежа, а также затрат на проведение ветеринарно-санитарных и лечебно-'профилактических мероприятий (Фомин К.А., 1968).

Болезнь распространяется при непосредственном контакте больных животных со здоровыми, а также через переносчиков - мух и других насекомых (Gerhard R.R., 1982; Glass H.W., 1982).

Известно, что интенсивность развития эпизоотического процесса зависит от степени облучения животных в летние месяцы экстремальным потоком солнечных УФ-лучей: чем оно больше, тем интенсивнее протекает и тяжелее развивается инфекционный! процесс: (Валеб