Усовершенствование технологии изготовления вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита и изучение ее антигенных и иммуногенных свойств

Нургалиева, Алиня Равилевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Усовершенствование технологии изготовления вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита и изучение ее антигенных и иммуногенных свойств
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование технологии изготовления вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита и изучение ее антигенных и иммуногенных свойств"

На правах рукописи

НУРГАЛИЕВА АЛИНЯ РАВИЛЕВНА

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО КЕРАТОКОНЪЮНКТИВИТА И ИЗУЧЕНИЕ ЕЕ АНТИГЕННЫХ И ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биолог

ческих наук

г 1 ноя ж

005539345

Казань-2013

005539345

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань)

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Макаев Харис Нуртдинович - доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РТ, заслуженный работник сельского хозяйства РФ; Иванов Александр Аркадьевич

доктор биологических наук.

Васильев Дмитрий Аркадьевич - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы пищевых продуктов Ульяновской государственной

сельскохозяйственной академии;

Фомин Алексей Максимович - доктор ветеринарных наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории по изучению бруцеллеза Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности.

Ведущее учреждение: ГНУ «Всероссийский научно исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН.

Защита состоится «/¿?» 2013 г. в 10.00 часов на заседании

диссертационного совета Д - 220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок - 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» (г. Казань). Электронный вариант автореферата и текст объявления о защите размещен на сайте ВАК РФ (vak.ed.gov.ru) и организации (www.vnivi.ru)

Автореферат разослан «_

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

В.И. Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Инфекционный кератоконъюнктивит (ИКК) крупного рогатого скота, вызываемый бактериями Moraxella bovis, регистрируется среди поголовья крупного рогатого скота в разных регионах земного шара, в том числе и России (Карайченцев В.Н., 2003; Иванов A.B. с соавт., 2005; Гаффаров Х.З. с соавт. 2008, Спиридонов Г.Н., 2008; Conceifäo F.R. et al., 2003; Burns М.J„ ÖConnor A.M., 2008). Заболевание наносит значительный экономический ущерб животноводству.

Для специфической профилактики этой болезни в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» разработана «Ассоциированная вакцина против ИКК крупного рогатого скота на основе антигенов бактерии Moraxella bovis и герпесвируса типа 1» (Патент РФ на изобретение №2264227).

Технология промышленного производства этой вакцины требует наработки больших объемов бактериальной массы. Получение поверхностным способом на плотной питательной среде больших объемов бактериальной массы трудоемко и не является' технологичным при серийном промышленном производстве вакцины. В этом аспекте перспективным и наиболее продуктивным методом культивирования бактерий считается глубинное выращивание в ферментерах с жидкими питательными средами различного состава. Применение глубинного культивирования при производстве бактериальных вакцин по сравнению с поверхностным способом позволяет значительно повысить продуктивность процесса выращивания микроорганизмов, уменьшить количество и продолжительность подготовительных операций и затраты ручного труда (Озеренко O.A. с соавт., 2004; Самуйленко А.Я. с соавт., 2009; Меньшенин В.В., Школьников Е.Э., 2009; Макаев Х.Н., Сабирова В.В., 2010; Еремец В.И. с соавт., 2012).

Наиболее употребляемые при выращивании различных бактерий жидкие среды готовят на основе гидролизата мышечной ткани. Однако, мясо является ценным пищевым продуктом. Ряд авторов предлагают использовать среды на основе гидролизатов из различных органов и тканей промысловых видов ластоногих, казеиново-дрожжевых и кровяно-дрожжевых лизатов, белков молока, куриных эмбрионов, отходов рыбной промышленности, соево-эритроцитарного гидролизата (Шептун Н.Г., 1989; Абрамов Д.В., 1990; Рязанова Л.А. с соавт, 1991; Заерко В.И, 1996; Телишевская Л.Я, 2000).

Исходя из того, что рекомендуемые питательные среды для выращивания бактерий Moraxella bovis в стационарных условиях дорогостоящие и не предусмотрены для крупномасштабного культивирования бактерий в биореакторах, изыскание оптимальной по компонентному составу питательной среды из непищевого сырья для глубинного культивирования бактерий Moraxella bovis является актуальной задачей.

1.2 Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлось усовершенствование технологии изготовления вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота путем применения дешевой

жидкой питательной среды и разработки оптимальных условий глубинного культивирования бактерий Moraxella bovis для получения биомассы при промышленном производстве вакцины.

Для выполнения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изыскать жидкую питательную среду на основе гидролизата непищевых отходов мясокомбината для выращивания бактерий Moraxella bovis-,

2. Разработать технологию глубинного культивирования бактерий Moraxella bovis с использованием предложенной среды в условиях биореактора;

3. Изучить культурально-морфологические, биохимические свойства бактерий Moraxella bovis, выращенных в предложенной питательной среде;

4. Усовершенствовать технологию изготовления вакцины против ИКК крупного рогатого скота путем применения жидкой питательной среды и разработки глубинного способа получения биомассы бактерий Moraxella bovis;

5. Провести в лабораторных и производственных условиях сравнительную оценку эффективности серий вакцины против ИКК крупного рогатого скота, изготовленных из биомасс, полученных на плотной и в жидкой питательных средах.

1.3 Научная новизна. Усовершенствована технология изготовления вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота применением биомассы бактерий Moraxella bovis, полученной глубинно-суспензионным методом культивирования в биореакторе с использованием жидкой питательной среды.

Впервые разработана рецептура жидкой питательной среды на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы коров с концентрацией 120 мг% аминного азота и содержащая по 5 % сыворотки крови крупного рогатого скота и дрожжевого экстракта к общему объему среды для культивирования моракселл глубинно-суспензионным способом.

Впервые установлено, что при выращивании бактерий Moraxella bovis в реакторных условиях в разработанной среде на основе ФГМПЭМ не изменяются их основные культурально-морфологические и биохимические свойства, а также антигенная и иммуногенная активности.

1.4 Практическая значимость. На основе проведенных исследований предложена жидкая питательная среда на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы коров с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота и дрожжевого экстракта для выращивания бактерий Moraxella bovis методом глубинного культивирования.

Усовершенствована технология глубинного культивирования бактерий Moraxella bovis с применением жидкой питательной среды на основе ФГМПЭМ для увеличения производства вакцины против ИКК крупного рогатого скота.

Разработана «Методическая рекомендация по изготовлению питательной среды из ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота для культивирования бактерий Moraxella bovis», утвержденная 25 января 2013 г. директором ФГБУ «ФЦТРБ-

вниви».

1.5 Апробация работы. Материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на: ежегодных заседаниях Ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» при обсуждении отчетов о НИР за 2006-2012 гг.; Международных, Всероссийских и Республиканских съездах, симпозиумах и научно-практических конференциях (Казань, 2006, 2010, 2011, 2013; Краснообск, 2010; Курск, 2010; Владимир, 2010; Москва, 2011).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 9 работав том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Эффективность питательной среды, приготовленной на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы коров с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота и дрожжевого экстракта для вьфащивания бактерий Moraxella bovis-,

2. Оптимизация условий глубинного культивирования бактерий Moraxella bovis в жидкой питательной среде на основе ФГМПЭМ;

3. Культурально-морфологические и биохимические свойства моракселл, полученных при глубинном культивировании в питательной среде на

основе ФГМПЭМ; '

4. Сравнительная оценка антигенной и иммуногенной активности экспериментальной серии вакцины против ИКК крупного рогатого скота, изготовленной на основе биомассы Moraxella bovis, полученной в жидкой питательной среде методом глубинного культивирования при введении лабораторным и сельскохозяйственным животным.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах компьютерного набора и включает следующие разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы, состоящий из 250 источников, в том числе 91 иностранных авторов, и приложения. Диссертация содержит 13 таблиц и иллюстрирована 6 рисунками.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2005-2013 г.г. в лаборатории по изучению болезней молодняка и лаборатории биотехнологии ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г.

Казань) в соответствии с гос. заданием по НИР №0120202602. Производственные опыты проведены В' сельскохозяйственных предприятиях республик Татарстан и Марий Эл.

При проведении научных исследований использованы: два штамма бактерий Moraxella bovis - «Г97-ВНИВИ» и «ШЗ-01», производственный штамм «ТКА-ВИЭВ-В2» герпесвируса типа 1.

Для культивирования Moraxella bovis в сравнительном аспекте использовали следующие жидкие питательные среды:

1. Бульон Хоттингера (БХ);

2. Гидролизат лактоальбумина (ГЛА);

3. Бульон мясопептонный (МПБ);

4. Среда на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота (среда на основе ФГМПЭМ).

Ростовые качества питательных сред определяли по количеству конечной концентрации бактерий в условиях культивирования при 37 С. Концентрацию микробных клеток определяли по изменению оптической плотности среды с использованием КФК-2 при 590 нм по ранее составленной калибровочной кривой и посевом серийных разведений среды на кровяной МПА.

Глубинное культивирование бактерий Moraxella bovis проводили в биореакторе «Marubishi», оснащенном системами регуляции числа оборотов перемешивающего устройства, поддержания определенной температуры, подачи стерильного воздуха.

Сравнительное изучение возможного влияния глубинно-суспензионного культивирования бактерий Moraxella bovis в среде на основе ФГМПЭМ на культурально-морфологические и биологические свойства бактерий проводили общепринятым методом исследований этих показателей у использованных в опытах штаммов после культивирования их на плотной питательной среде -кровяном МПА и в жидкой среде на основе ФГМПЭМ. При изучении биохимических свойств определяли ферментативную активность, реакцию на оксидазу и каталазу, образование сероводорода и индола, на наличие желатиназной, фенилаланиндезаминазной активности, способность пептонизировать лакмусовое молоко. Определение сахаролитических свойств культур бактерий Moraxella bovis осуществляли путем их пересева в среды Гисса с 1 % содержанием глюкозы, сахарозы, лактозы и маннита. Учет результатов проводили по истечении 5 суток при 37 °С.

О протеолитической активности штаммов бактерий судили по их способности разжижать желатину после посева культуры в столбик желатина.

Для установления оксидазной активности на поверхность 18 ч агаровой культуры бактерий Moraxella bovis наносили каплю 1 % раствора парааминодиметиланилина гидрохлорида.

Каталазную активность проверяли на предметных стеклах, используя 24 ч культуру бактерий. На каждую культуру штамма бактерий наносили по 1 капле 3 % раствора перекиси водорода. Показания снимали сразу и через 5 минут. О реакции судили по образованию пузырьков.

Реакцию на индол ставили по способу Мореля.

Для выявления фенилаланиндезаминазы испытуемую культуру бактерий засевали в пробирки на скошенный агар с фенилаланином и инкубировали при 37 °С. В качестве тест-реактива использовали раствор хлористого железа.

Тест in vitro для выявления гемолизина бактерий Moraxella bovis проводили по методу D.Clarke, J.Fox (1948) в модификации A.K. Агога (1982).

Для постановки лабораторных опытов и производственного испытания изготовили 2 серии ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота по утвержденной Россельхознадзором технологии, используя биомассу бактерий, выращенных на плотной (серия 1) и жидкой (серия 2) питательных средах. В качестве плотной питательной среды использовали традиционно принятую - кровяной МПА. Жидкую питательную среду для культивирования бактерий Moraxella bovis глубинно-суспензионным способом готовили согласно разработанной рецептуре на основе ФГМПЭМ. ' !

Контроль готовой продукции проводили по физическим показателям, стерильности, безвредности по ОСТ 10-07-001-93, ГОСТу 28085-89 и ГОСТу 9380067-00008064.

Антигенную активность вакцин изучали первоначально на 15 кроликах массой 2-2,5 кг, затем на естественно восприимчивых животных - 15 телятах 4 месячного возраста. Титр специфических антител в сыворотке крови иммунизированных животных определяли методом ИФА.

Для изучения иммуногенной активности вакцин в качестве лабораторных животных использовали белых мышей - 50 голов, естественно-восприимчивых-телят в количестве 180 голов.

При определении параметров роста бактерий Moraxella bovis учитывали удельную скорость роста, время удвоения биомассы живых микробных клеток, максимальное накопление бактерий в питательной среде.

Удельную скорость роста бактерий (ц) рассчитывали по формуле: ц = In (N/N0)/t,

где N0 - число клеток в нулевой точке отсчета времени; N — число клеток во время t; t — время экспоненциального роста.

Время, необходимое для удвоения численности микробной популяции (td), рассчитывали с учетом удельной скорости роста микробов по формуле: td = 0,693/ц,

где 0,693 - значение натурального логарифма числа 2; ц - удельная скорость роста микробной популяции.

Статистическую обработку экспериментально полученного материала проводили общепринятыми методами вариационной статистики с помощью критерия Стъюдента с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel 2007.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Подбор рецептуры оптимального состава питательной среды на основе ФГМПЭМ

Результаты опытов по изучению влияния концентрации аминного азота среды на рост бактерий Moraxella bovis обобщены и приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Рост бактерий Moraxella bovis в среде на основе ФГМПЭМ с различным содержанием аминного азота_

Содержание в среде аминного азота, мг% pH среды Концентрация бактерий, млрд. м.к./см3

80 7,31±0,02 0,18±0,07

100 7,31±0,01 0,25±0,04

120 7.36±0,02 0,50±0,04

140 7,36±0,03 0,56±0,05

160 7,40±0,02 0,60±0,04

180 7,43±0,02 0,62±0,04

200 7,43±0,03 0,60±0,07

Анализ полученных данных позволяет констатировать, что выход бактериальной массы был наиболее высоким при культивировании Moraxella bovis в питательной среде с концентрацией аминного азота 180 мг% - 0,62±0,04 млрд. м.к./см3. При культивировании в питательной среде с содержанием аминного азота 120 мг% выход микробной массы составил 0,50±0,04 млрд. м.к./см3, что незначительно ниже, чем при использовании среды с концентрацией аминного азота 180 мг%. Учитывая то, что расход питательной среды при этом уменьшается в 1,3 раза, то с экономической точки зрения в практических целях при культивировании бактерий Moraxella bovis целесообразнее использование питательной среды на основе ФГМПЭМ с концентрацией аминного азота 120 мг%.

Известно, что обеспечение полноценного роста и размножения бактерий Moraxella bovis зависит не только от качественного состава используемой среды, но и от обогащения ее нативным белком. В связи с этим, мы изучили рост моракселл в питательной среде на основе ФГМПЭМ с концентрацией аминного азота 120 мг% и включением в ее состав сыворотки крови крупного рогатого скота. Обобщенные результаты экспериментов представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Рост бактерий Moraxella bovis в среде на основе ФГМПЭМ с

различным содержанием сыворотки крови крупного рогатого скота

Концентрация в среде сыворотки крови крупного рогатого скота, % pH среды Концентрация бактерий, млрд. м.к./см3

0 7,36±0,08 0,50±0,04

5 7,42±0,05 1,02±0,05

10 7,43±0,06 1,25±0,04

20 7,44±0,04 1,34±0,05

Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют, что добавление в питательную среду сыворотки крови крупного рогатого скота из расчета 5 % к общему объему среды приводит к- ' двукратному увеличению выхода бактериальной массы по сравнению со средой без сыворотки. Наиболее высокая концентрация микробных клеток наблюдается при добавлении в питательную среду 20 % сыворотки крови крупного рогатого скота. Однако, с экономической точки зрения целесообразнее использование среды с добавлением 5 % сыворотки крови крупного рогатого скота. В этом случае выход бактериальной массы лишь на 0,32 млрд. м.к./см3 меньше, чем при добавлении 20 % сыворотки крови, в то же время расход дорогостоящей сыворотки снижается в 4 раза.

На следующем этапе работы провели испытания по изучению ростостимулирующих свойств дрожжевого экстракта. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.

Таблица - 3 - Рост бактерий Moraxella bovis в питательной среде на основе ФГМПЭМ с различным содержанием дрожжевого экстракта _

Концентрация дрожжевого экстракта, % pH среды Концентрация бактерий, млрд. м.к./см3

0 7,36±0,02 1,0±0,04

'2. 7,34±0,04 1,22±0,07

5 7,33±0,02 1,5±0,04

ю. 7,31±0,03 1,6±0,09

Анализ результатов проведенных исследований свидетельствует, что при внесении в питательную среду дрожжевого экстракта в количестве 2 % к объему среды выход бактериальной массы увеличивается на 22 %. При добавлении в питательную среду данной добавки в количестве 5 % к общему объему среды концентрация микробных клеток увеличивается на 50 % и составляет 1,5±0,04 млрд. м.к./см3 по сравнению со средой без добавки. Наибольший выход микробной массы при культивировании моракселл обеспечивает среда, содержащая 10 % дрожжевого экстракта. Однако, показатели оказались статистически не достоверными (р>0,05), что указывает на нецелесообразность увеличения количества добавляемого фактора роста до 10 %, так как это не приводит к резкому увеличению показателей роста.

Таким образом, экспериментально установлено, что жидкая питательная среда на основе ФГМПЭМ с аминным азотом 120 мг% с содержанием в качестве ростовых добавок сыворотки крови крупного рогатого скота и дрожжевого экстракта в количестве по 5 % к общему объему среды обеспечивает выход биомассы моракселл в количестве 1,5±0,04 млрд. м.к./см3 через 24 ч стационарного культивирования.

3.2 Сравнительная оценка эффективности различных питательных сред для культивирования бактерий Moraxella bovis.

На данном этапе работы были проведены сравнительные исследования по изучению роста бактерий Moraxella bovis в различных жидких питательных средах в стационарных условиях. Результаты исследований обобщены в таблице 4.

Таблица 4 - Эффективность жидких питательных сред при культивировании бактерий Moraxella bovis в стационарных условиях_

Наименование питательной среды pH среды Концентрация, млрд. м.к./см3

ГЛА 7,73±0,11 0,20±0,03

МПБ 7,52±0,06 0.36±0,04

среда на основе ФГМПЭМ 7,38±0,09 1,50±0,06

БХ 7,44±0,11 0,52±0,02

Анализ проведенных исследований показал, что после 24 ч инкубации наиболее высокую концентрацию микробных клеток регистрировали в питательной среде на основе ФГМПЭМ. Ростовые свойства питательной среды на основе ФГМПЭМ в 8 раз превышали ростовые свойства ГЛА, в 5 раз МПБ и в 2,5 раза БХ. Таким образом, дешевизна, доступность, обеспечение роста дали основание для последующих исследований с использованием питательной среды на основе ФГМПЭМ.

3.3 Динамика роста культуры бактерий Moraxella bovis при глубинном культивировании в питательной среде на основе ФГМПЭМ в

биореакторе

Выращивание бактерий Moraxella bovis проводили в условиях биореактора в жидкой питательной среде на основе ФГМПЭМ с концентрацией аминного азота 120 мг% с внесением в качестве добавок по 5 % сыворотки крови крупного рогатого скота и дрожжевого экстракта в течение 24 ч при 37 °С. Начальное значение pH питательной среды составило 7,2±0,03. Исходная концентрация бактерий в среде в биореакторе составила 0,15 млрд. м.к./см3. Пробы для определения концентрации микробных клеток отбирали сразу после внесения расплодочного материала и через каждый час в течение 9 ч, далее каждые 3 часа. Аэрацию стерильным воздухом и перемешивание начали проводить через 0,5 ч после засева.

Известно, что гемолизин является одним из главных факторов патогенности бактерий Moraxella bovis. С целью изучения динамики накопления данного экзотоксина в процессе глубинного культивирования провели тест in vitro.

По результатам трехкратно проведенных опытов были рассчитаны основные параметры роста и построены графики динамики роста моракселл и

.....—•••• -rt' -ftj-« < ,".•!'

гемолитической активности культуры. Обобщенные данные представлены графиках (рис.1 и 2).

■х i

2,5

1,5

0,5

-тг

Г я

1 I I I-1-1-1-1-—Т-1-1-1-1-1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 15 18 21 24

еремя культивирований (ч)

Рис. 1 Динамика роста бактерий Moraxella bovis

Рис. 2 Динамика накопления гемолизина в процессе культивирования бактерий

Moraxella bovis. 11

Анализ результатов исследований свидетельствует о том, что при культивировании бактерий Moraxella bovis в жидкой питательной среде на основе ФГМПЭМ с внесением добавок рост моракселл характеризуется 1 ч лаг-фазой, 4 ч экспоненциальной фазой, 10 ч стационарной фазой. Максимальное накопление бактерий Moraxella bovis было отмечено на 6 ч культивирования (начало стационарной фазы), в этот период содержание бактерий составило 2,25±0,13 млрд.м.к./см3, что в 1,5 раза превышает аналогичный показатель при культивировании в стационарных условиях. Среднее значение максимальной удельной скорости в экспоненциальной фазе составило 0,67 ч"1, а время удвоения биомассы - 1,03 ч.

На рис. 2 показаны результаты нарастания гемолитической активности культуры бактерий Moraxella bovis. При сопоставлении графиков динамики роста штамма и динамики накопления гемолизина в суспензии в процессе культивирования видно, что максимальная продукция экзотоксина соответствует концу экспоненциальной - началу стационарной фаз роста бактерий. Следовательно, максимальный титр гемолизина 8 log2 в культуре наблюдается также через 5-6 ч культивирования.

Полученные данные позволяют заключить, что 5-6 ч культура (конец экспоненциальной - начало стационарной фаз роста) как по выходу бактериальной массы, так и по накоплению гемолизина является наиболее приемлемой для съема биомассы при изготовлении вакцины.

3.4 Изучение влияния посевной дозы, аэрации и перемешивания на рост моракселл при глубинном способе культивирования в среде на основе

ФГМПЭМ

3.4.1 Изучение влияния концентрации и физиологического состояния посевной дозы на рост моракселл при глубинном способе культивирования в среде на основе ФГМПЭМ

При изучении влияния качества и количества посевного материала на выход бактериальной массы Moraxella bovis при глубинном культивировании в жидкой питательной среде на основе ФГМПЭМ, в качестве посевного материала использовали бульонные культуры моракселл, находящиеся в экспоненциальной и в стационарной фазах роста. Посевной материал перед внесением в биореактор культивировали в колбах в той же среде, на которой предполагалось культивирование. Инокулят вносили из расчета, чтобы концентрация бактерий в 1 см3 питательной среды в биореакторе составляла 0,10; 0,15; 0,20 млрд.м.к. Помимо количества микробных клеток определяли длительность лаг-фазы, удельную скорость роста и время удвоения биомассы.

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что внесение посевного материала из расчета 0,10 млрд. м.к./см3 среды в биореакторе, находящегося в стационарной фазе роста, было менее эффективным. Длительность лаг-фазы при этом составила 130 минут. Максимальная концентрация бактерий Moraxella bovis к 6 ч культивирования была 1,7±0,13

млрд. м.к./см3. Удельная скорость роста составила 0,42 ч"1, время удвоения биомассы 1,65 ч. Использование той же посевной дозы в экспоненциальной фазе роста способствовало сокращению продолжительности лаг-фазы на 20 минут и увеличению концентрации бактерий на 0,25 млрд.м.к./см3 (на 9 %), а также увеличению скорости размножения до 0,57 ч"1 (на 35 %).

Увеличение концентрации микробных клеток до 0,15 млрд. м.к./см3 среды в биореакторе существенно повлияло на динамику размножения вакцинного штамма моракселл. В этом случае скорость размножения повышалась в 1,6-1,9 раза, выход бактерий увеличивался на 0,55-1,4 млрд.м.к./см , а лаг-фаза роста сокращалась на 50-80 минут. При этом также посев культурой, находящейся в экспоненциальной фазе роста, оказался более эффективным по сравнению со стационарной (р<0,05). Выход бактерий через 6 ч культивирования был больше на 850 млн.м.к./см3, лаг-фаза короче на 30 минут, а скорость размножения выше на 22 %.

Дальнейшее увеличение концентраций бактерий до 0,20 млрд. м.к. на 1 см питательной среды в биореакторе, находящихся как в стационарной, так и в экспоненциальной фазе роста, не привело к резкому увеличению накопления микробных клеток (р>0,05).

Таким образом, анализ процессов культивирования показывает, что при глубинном выращивании моракселл в биореакторе наиболее оптимальным является засев питательной среды инокулятом из расчета 0,15 млрд. м.к./см3 питательной среды в биореакторе, взятым в экспоненциальной стадии роста. В данном случае наблюдаются следующие параметры роста моракселл: удельная скорость роста - 0,82 ч"1; время удвоения биомассы - 0,84 ч, длительность лаг-фазы - 50 минут, накопление биомассы к 6 ч культивирования - 3,1±0,18 млрд. м.к./см3.

3.4.2 Изучение влияния аэрации и перемешивания на рост моракселл при глубинном способе культивирования в питательной среде на

основе ФГМПЭМ

Изучение накопления бактериальной массы проводили при следующих режимах аэрации: 1; 1,5; 2 л/мин стерильного воздуха на 1 л питательной среды. Каждому режиму аэрации соответствовало вращение мешалки со скоростью 50, 100, 150 об/мин. Расплодочным материалом служила бульонная культура бактерий Moraxella bovis, находящаяся в экспоненциальной фазе роста. Начальная концентрация бактерий в биореакторе составила 0,15 млрд. м.к./см3.

Обобщенный анализ полученных данных позволяет констатировать, что при вращении мешалки со скоростью 100 об/мин и аэрации культуры из расчета 1,5 л/мин на 1 л питательной среды концентрация бактерий составляет 3,6±0,14 млрд.м.к./см3.

Дальнейшее повышение скорости перемешивания до 150 об/мин и аэрация до 2 л/мин воздуха на 1 л культуры не приводило к существенному увеличению накопления бактериальной массы. Следовательно, при глубинном

культивировании бактерий Moraxella bovis в биореакторе наиболее оптимальным является режим перемешивания со скоростью 100 об/мин и аэрация 1,5 л/мин воздуха на 1 л культуры.

Таким образом, глубинное культивирование моракселл в жидкой питательной среде на основе ФГМПЭМ с аминным азотом 120 мг% и добавлением по 5 % сыворотки крови крупного рогатого скота и дрожжевого экстракта при засеве инокулятом из расчета 0,15 млрд. м.к./см3 питательной среды в биореакторе, взятым в экспоненциальной стадии роста, оптимальном режиме перемешивания со скоростью 100 об/мин и аэрации стерильным воздухом 1,5 л/мин на 1 л культуры позволяет получить максимальное накопление биомассы - 3,6±0,14 млрд. м.к./см3 через 6 ч культивирования, что в 2,4 раза превышает выход при культивировании в стационарных условиях.

3.5 Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств штаммов Moraxella bovis, при культивировании их разными способами и на различных питательных средах

При культивировании моракселл в питательной среде на основе ФГМПЭМ с соответствующими добавками рост бактерий наблюдали в виде равномерного помутнения среды с образованием осадка на дне, который легко разбивался при встряхивании. При пересеве на кровяной МПА культуры бактерий после 24 ч инкубации при 37 °С представляли собой серовато-белые, круглые, гладкие колонии диаметром от 1 до- 3 мм с зоной бета-гемолиза 0,5-2,0 мм. При микроскопии мазков, приготовленных из культур, выращенных в жидкой и на плотной питательных средах и окрашенных по Граму возбудитель представлял собой грамотрицательные короткие толстые палочки (1,5-2,0x0,5-1,0 мкм) с округленными концами, чаще расположенные парами или короткими цепочками. Бактерии Moraxella bovis не обладали подвижностью, спор не образовывали. Результаты изучения биохимических свойств моракселл приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Биохимические свойства бактерий Moraxella bovis

Основные свойства Испытуемые штаммы, выращенные на кровяном МПА Испытуемые штаммы, выращенные в питательной среде на основе ФГМПЭМ

Г97-ВНИВИ ШЗ-01 Г97-ВНИВИ ШЗ-01

1 2 3 4 5

Ферментация углеводов: Глюкоза - - - -

Сахароза - - - -

Лактоза - - - -

Продолжение таблицы 5

1 2 3 4 5

Манит - - - -

Сорбит - - - -

Оксидазная активность + + + +

Катал азная активность - - - -

Гидролиз желатина + + + +

Образование индола - - - -

Образование сероводорода (бумага с ацетатом свинца) + + + +

Образование сероводорода (столбик Т81) - - - -

Ферментация в лакмусовом молоке + + + +

Образование фенилаланинд езаминазы - - - -

Анализ полученных результатов сравнительного изучения культурально-морфологических и биохимических характеристик штаммов моракселл выращенных на кровяном МПА и в среде на основе ФГМПЭМ глубинно-суспензионным способом культивирования показал, что эти показатели у штаммов не отличаются. Следовательно, культура моракселл в процессе культивирования в жидкой питательной среде на основе ФГМПЭМ глубинным методом в биореакторе полностью сохраняет свои основные биологические свойства.

3.6 Оценка антигенной активности серий вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, изготовленных с использованием биомасс, полученных на различных питательных сред в опытах на кроликах и телятах

При изучении антигенной активности серий биопрепарата на кроликах животных I группы иммунизировали вакциной, изготовленной из биомассы

бактерий, полученной на плотной питательной среде, II группы - вакциной, изготовленной из бакмассы, полученной в жидкой питательной среде на основе ФГМПЭМ. Третья группа животных служила контролем (не вакцинированные). Вакцину вводили подкожно, двукратно с интервалом 14 дней, в область спины в дозе 2 см . Результаты исследований сывороток крови вакцинированных кроликов представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Уровень специфических антител к антигенам бактерий Moraxella bovis в сыворотке крови вакцинированных кроликов (М±т, п=5)_

Сроки исследования Титры антител в ИФА, log2

I группа II группа III группа

До вакцинации отр отр отр

Через 7 дней после первой вакцинации 6,92±0,45 7,12±0,65 отр

Через 14 дней после первой вакцинации 8,52±0,42 9,52±0,42 отр

Через 7 дней после второй вакцинации 10,92±0,27 11,72±0,27 отр

Через 14 дней после второй вакцинации 11,92±0,27 13,32±0,0 отр

Наивысший уровень специфических антител к бактериям Moraxella bovis как в первой, так и во второй группе животных, наблюдался на 14 день после второй иммунизации и составлял 11,92±0,27 log2 и 13,32±0,0 log2 соответственно. Титры антител в сыворотке крови кроликов иммунизированных вакциной, изготовленной из биомассы, полученной на жидкой питательной среде, уже на 7 сутки опыта были выше, чем у животных иммунизированных вакциной, изготовленной из биомассы, полученной на плотной питательной среде. В последующие сроки эта тенденция сохранялась, и на 14 день после второй вакцинации титр антител был выше, чем у животных I группы на 1 4 log2 (Р<0,05). '

В опытах на телятах животных I группы (5 голов) иммунизировали вакциной, изготовленной из биомассы бактерий, полученной на плотной питательной среде, II группы (5 голов) - вакциной, изготовленной из бакмассы, полученной в жидкой среде на основе ФГМПЭМ. Третья группа животных (5 голов) служила контролем (не вакцинированные). Вакцину вводили подкожно, двукратно с интервалом 14 дней в область средней трети шеи в дозе 5 см3. Результаты исследований сывороток крови вакцинированных телят представлены в таблице 7.

Анализ полученных данных показал, что уровень специфических антител к бактериям Moraxella bovis на 14 сутки после первой вакцинации составляет в I группе - 11,64±0,35 log2, во II группе - 12,04±0,27 log2, а на 14

сутки после второй иммунизациии величины титра специфических антител в сыворотке крови телят I и II группы существенно не отличались и составили 13,64±0,35 1о§2 и 13,44±0,42 1о§2 соответственно.

Таблица 7 - Уровень специфических антител к антигенам бактерий Moraxella bovis в сыворотке крови вакцинированных телят (М±т, п=5)_

Сроки исследования Тип ры антител в ИФА, log2

I группа II группа III группа

До вакцинации отр отр отр

Через 7 дней после первой вакцинации 7,44±0,22 8,44±0,42 отр

Через 14 дней после первой вакцинации 11,64±0,35 12,04±0,27 отр

Через 7 дней после второй вакцинации 13,44±0,42 13,24±0,27 отр

Через 14 дней после второй вакцинации 13,64±0,35 13,44±0,42 отр

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что экспериментальная серия вакцины, изготовленная с использованием бакмассы, полученной в жидкой питательной среде на основе ФГМПЭМ в условиях биореактора по антигенной активности не уступает вакцине, приготовленной по существующей технологии согласно ТУ на плотной питательной среде.

Таким образом, экспериментально установлено, что культура моракселл, полученная в начале стационарной фазы роста, в процессе глубинного культивирования в биореакторе в среде на основе ФГМПЭМ обладает высокими антигенными свойствами.

3.7 Испытание иммунологической эффективности серий вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, изготовленных с использованием биомасс, полученных на различных питательных средах

Для изучения иммунологической эффективности изготовили серии ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота согласно инструкции по изготовлению и контроля вакцины, утвержденной директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», используя биомассу бактерий, полученной на плотной и в жидкой питательных средах. Жидкую питательную среду на основе ФГМПЭМ для культивирования бактерий готовили согласно «Методической рекомендации по изготовлению питательной среды из ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота для культивирования бактерий Moraxella bovis», утвержденной директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Первоначально изучение иммуногенной активности вакцин проводили на белых мышах. Были сформированы 3 группы белых мышей: две опытные и одна контрольная. Животных I группы иммунизировали вакциной, изготовленной из биомассы бактерий, полученной на плотной питательной среде, II группы - вакциной, изготовленной из бакмассы, полученной в питательной среде на основе ФГМПЭМ. Третья группа животных служила контролем. Двукратную подкожную вакцинацию белых мышей проводили в дозе 0,5 см3 с интервалом 14 дней. Заражение лабораторных животных осуществляли внутрибрюшинно живыми культурами бактерий Moraxella bovis (через 14 дней после каждой вакцинации) в дозе 500 млн. м.к. на одно животное. Результаты исследований приведены в таблице 8.

Таблица 8 - Иммунологическая активность вакцин на белых мышах

Группа мышей Результаты заражения на 14 день после первой вакцинации Результаты заражения на 14 день после второй вакцинации

Заражено, гол. Пало, гол. Смертность, % Заражено, гол. Пало, гол. Смертность, %

I группа 20 4 20 10 2 20

II группа 20 4 20 10 2 20

контрольная 10 8 80 10 8 80

Результаты исследования свидетельствуют о том, что обе вакцинированные группы мышей оказались устойчивыми к контрольному заражению. Защитный эффект вакцин, изготовленных различными способами не различался и составил 80 %.

Положительные результаты изучения иммунологической активности опытных серий вакцины против ИКК на лабораторных животных явились основанием для испытания вакцин на крупном рогатом скоте.

Изучение иммуногенной активности серий ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота проводили в стационарно неблагополучном по данному заболеванию хозяйстве. Анализ эпизоотической ситуации по ИКК КРС показал, что в данном хозяйстве заболеваемость телят варьировала в пределах 25-30 % от общего поголовья.

Для экспериментального исследования были сформированы 3 группы телят по 60 голов в каждой. Животных I группы иммунизировали вакциной, изготовленной из биомассы бактерий, полученной на плотной питательной среде, II группы - вакциной, изготовленной из бакмассы, полученной в питательной среде на основе ФГМПЭМ. Третья группа животных служила контролем. Эффективность применения препарата определяли на основании показателей заболеваемости до и после применения вакцин, а также по уровню

специфических антител в сыворотке крови вакцинированных животных через 7 и 14 суток после первой и второй вакцинаций.

Анализ полученных результатов исследований позволяет констатировать, что изготовленные серии вакцины обладают достаточно высокой антигенной активностью: титры специфических антител через 2 недели после второй вакцинации в сыворотке крови животных составляли в ИФА к бактериям Moraxella bovis в I группе животных - 13,02±0,23 log2, во II группе -13,12 ±0,14 log2; в PH к герпесвирусу типа I в I группе животных - 7,80±0,31 log2, во II группе - 7,70±0,32 log2.

Клинико-эпизоотологическим обследованием вакцинированного поголовья животных установлено, что обе вакцинированные группы телят оказались устойчивыми к естественному заражению возбудителем ИКК крупного рогатого скота. В то же время в контрольной (не вакцинированной) группе заболело 8 телят.

Следовательно, обе серии вакцины (полученные как на твердой питательной среде, так и в жидкой) надежно защищают телят от заражения возбудителем ИКК в условиях стационарного неблагополучия по данной инфекции хозяйства. В обеих вакцинированных группах телят больных инфекционным кератоконъюнктивитом в ходе эксперимента не выявлено, тогда как в контрольной не вакцинированной группе заболели 13,3 % телят.

Обобщенный анализ клинических, эпизоотологических и серологических исследований показал, что вакцина, изготовленная с использованием биомассы бактерий Moraxella bovis, полученной при глубинном культивировании в питательной среде на основе ФГМПЭМ не уступает по эффективности вакцине, полученной из биомассы моракселл, выращенной на плотной питательной среде.

4 ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована технология изготовления инактивированной вакцины против ИКК крупного рогатого скота посредством применения глубинного культивирования Moraxella bovis в дешевой жидкой питательной среде в биореакторе, обеспечивающая сокращение длительности выращивания, повышение выхода бактериальной массы, снижение риска контаминации ее посторонней микрофлорой, повышение эффективности производства за счет уменьшения доли ручного труда в сравнении с существующим способом изготовления на плотной питательной среде.

2. Подобрана жидкая питательная среда на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы коров (ФГМПЭМ) с концентрацией аминного азота 120 мг%, содержащая в качестве добавок по 5 % сыворотки крови крупного рогатого скота и дрожжевого экстракта к общему объему среды для выращивания моракселл. Показана ее пригодность для первичного выделения и наработки биомассы бактерий Moraxella bovis методом глубинного культивирования.

3. Глубинное культивирование бактерий Moraxella bovis в жидкой питательной среде на основе ФГМПЭМ при засеве инокулятом из расчета 0,15 млрд. м.к./см3 питательной среды в биореакторе, взятым в экспоненциальной фазе роста при режиме перемешивания со скоростью 100 об/мин и аэрации стерильным воздухом 1,5 л/мин на 1 л культуры позволяет получить максимальный рост микробных клеток (3,6±0,14 млрд. м.к./см3) через 6 ч культивирования, что в 2,4 раза превышает выход биомассы при культивировании в стационарных условиях.

4. При выращивании в жидкой питательной среде на основе ФГМПЭМ в реакторных условиях бактерии Moraxella bovis сохраняют свои культурально-морфологические и биологические свойства, соответствующие паспортным данным. Подкожное введение белым мышам полученной биомассы вызывает устойчивость их к экспериментальному заражению высоковирулентным возбудителем данной инфекции.

5. Сравнительная оценка антигенной и иммуногенной эффективности в лабораторных и производственных условиях серии вакцины против ИКК крупного рогатого скота, изготовленной с использованием биомассы моракселл, полученной глубинно—суспензионным методом в жидкой питательной среде на основе ФГМПЭМ, показала, что подкожное введение данной вакцины кроликам и молодняку крупного рогатого скота обеспечивает максимальное накопление специфических антител в сыворотке крови после второй иммунизации (13,32±0,0 log2 и 13,12±0,14 log2) и устойчивость к заражению возбудителем данной инфекции. По этим показателям она сходна с вакциной, полученной из биомассы, выращенной на плотной питательной среде.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработана «Методическая рекомендация по изготовлению питательной среды из ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота для культивирования бактерий Moraxella bovis», утвержденная 25 января 2013 г. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

2. Разработанные условия глубинного культивирования бактерий Moraxella bovis рекомендуется внедрить в биологическую промышленность при производстве вакцины против ИКК крупного рогатого скота.

6 СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гатиятуллина А.Р. Изыскание питательной среды из непищевого сырья для глубинно-суспензионного культивирования бактерий Moraxella bovis / А.Р. Гатиятуллина, В.В. Сабирова, Х.Н. Макаев, Х.З. Гаффаров // Токсикозы животных и актуальные проблемы болезней молодняка: Матер. Междунар. науч. конф. - Казань, 2006. -С.241-243.

2. Нургалиева А.Р. Получение биомассы бактерий Moraxella bovis в жидкой питательной среде / А.Р. Нургалиева, Г.Н. Спиридонов, Х.Н. Макаев, J1.B. Валебная // Ветеринария и кормление. - 2010. - №6. - С.54.

3. Нургалиева А.Р. Влияние сыворотки крови крупного рогатого скота на рост бактерий Moraxella bovis / А.Р. Нургалиева, Г.Н. Спиридонов, Х.Н. Макаев, Л.В. Валебная // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: Матер. Междунар. научно-практич. конф, посвящ. 70-летию со дня основания Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока. -Краснообск, 2010. - С. 132-134.

4. Нургалиева А.Р. Разработка оптимальных условий глубинно-суспензионного культивирования бактерий Moraxella bovis / А.Р. Нургалиева, Г.Н. Спиридонов, Х.Н. Макаев // Обеспечение продовольственной безопасности России. Если не мы, то кто?!: Матер. Междунар. научно-практич. конф, посвящ. 140-летию со дня рождения проф. Ильи Ивановича Иванова. - Курск, 2010. -С.221-222.

5. Нургалиева А.Р. Оптимизация состава питательной среды для культивирования бактерий Moraxella bovis / А.Р. Нургалиева // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2010. -Т.200. - С.123-125.

6. Нургалиева А.Р. Подбор питательной среды для культивирования бактерий Moraxella bovis / А.Р. Нургалиева // Лекарственные препараты для животных: Матер, конференции. - Москва, 2011. - С.76.

7. Нургалиева А.Р. Оценка антигенной активности вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, изготовленной с использованием различных питательных сред / А.Р. Нургалиева, Н.В. Саттарова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2011. - Т.206. - С. 165-169.

8. Нургалиева А.Р. Глубинное культивирование бактерий Moraxella bovis / А.Р. Нургалиева, Н.В. Саттарова // Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов: Матер. Междунар. научно-практич. конф. молодых ученых и специалистов. - Казань, 2013. - С.143-145.

9. Саттарова Н.В. Оптимизация условий постановки непрямого варианта ИФА для выявления антител к бактериям Moraxella bovis / Н.В. Саттарова, А.Р. Нургалиева // Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов: Матер. Междунар. научно-практич. конф. молодых ученых и специалистов. - Казань, 2013. - С.68-71.

Подписано в печать 31.10.13 г. Печать офсетная Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л. 1,2. Тираж 100. Заказ 1437 Отпечатано с готовых диапозитивов в типографии ООО «Инфотек» 420029, г. Казань, ул. Сибирский тракт, д.34, к.З. Тел.: 510-97-52

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Нургалиева, Алиня Равилевна, Казань

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФГБУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ

И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология

04201450740

На правах рукописи

НУРГАЛИЕВА АЛИНЯ РАВИЛЕВНА

с микотоксикологиеи и иммунология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор

Макаев Харис Нуртдинович

доктор биологических наук Иванов Александр Аркадьевич

Казань-2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БХ - бульон Хоттингера

ГЛА - гидролизат лактоальбумина

ИКК - инфекционный кератоконъюнктивит

ИФА - иммуноферментный анализ

м.к. - микробные клетки

МПА - мясопептонный агар

МПБ - мясопептонный бульон

МПЖ - мясопептонный желатин

МППБ - мясопептонный печеночный бульон

РН - реакция нейтрализации

ППА - протеазопептонный агар

ФБР - фосфатно-буферный раствор

ФГМПЭМ - ферментативный гидролизат маточно-плацентарно-эмбриональной массы коров шт. - штамм

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................ 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.......................................... 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................. 10

1.1 Этиологическая структура и эпизоотологические особенности инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота............ 10

1.2 Систематика, культурально-морфологические, биохимические и иммунобиологические свойства бактерий Moraxella bovis................... 13

1.3 Питательные потребности бактерий Moraxella bovis и питательные среды для их культивирования....................................................... 20

1.4 Современные способы культивирования микроорганизмов............. 28

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................... 41

2.1 Материалы и методы исследований............................................... 41

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ....................... 49

3.1 Подбор рецептуры оптимального состава питательной среды на

основе ФГМПЭМ...................................................................... 49

3.2 Сравнительная оценка эффективности различных питательных сред

для культивирования бактерий Moraxella bovis................................. 52

3.3 Динамика роста культуры бактерий Moraxella bovis при глубинном культивировании в питательной среде на основе ФГМПЭМ................ 53

3.4 Изучение влияния посевной дозы, аэрации и перемешивания на рост моракселл при глубинном способе культивирования в среде на основе ФГМПЭМ................................................................................. 57

3.4.1 Изучение влияния концентрации и физиологического состояния посевной дозы на рост моракселл при глубинном способе культивирования в среде на основе ФГМПЭМ.................................. 57

3.4.2 Изучение влияния аэрации и перемешивания на рост моракселл при глубинном способе культивирования в питательной среде на основе ФГМПЭМ................................................................................. 60

3.5 Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств штаммов Moraxella bovis, при культивировании их разными способами и на различных питательных средах.................................................. 63

3.5.1 Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств штаммов бактерий Moraxella bovis, выращенных на кровяном

МПА...................................................................................... 63

3.5.2 Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств штаммов бактерий Moraxella bovis, выращенных в питательной

среде на основе ФГМПЭМ при глубинном культивировании................ 65

З.бОценка антигенной активности серий вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, изготовленных с использованием биомасс, полученных на различных питательных средах 67

3.6.1 Оценка антигенной активности серий вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, изготовленных с использованием биомасс, полученных на различных питательных средах, на кроликах................................................... 68

3.6.2 Оценка антигенной активности серий вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, изготовленных с использованием биомасс, полученных на различных

питательных средах, на телятах................................................... 70

3.7 Испытание иммунологической эффективности серий вакцины

против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, изготовленных с использованием биомасс, полученных на различных

питательных средах.................................................................... 73

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.......................... 78

ВЫВОДЫ................................................................................. 89

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ............................................... 91

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................... 92

ПРИЛОЖЕНИЯ............................................................................. 120

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекционный кератоконъюнктивит (ИКК) крупного рогатого скота, вызываемый бактериями Moraxella bovis, регистрируется среди поголовья крупного рогатого скота в разных регионах земного шара, в том числе и России (Карайченцев В.Н., 2003; Иванов A.B. с соавт., 2005; Гаффаров Х.З. с соавт. 2008, Спиридонов Г.Н., 2008; Conceifäo F.R. et al., 2003; Burns M.J., ÖConnor A.M., 2008). Заболевание наносит значительный экономический ущерб животноводству.

Технология промышленного производства этой вакцины требует наработки больших объемов бактериальной массы. Получение поверхностным способом на плотной питательной среде больших объемов бактериальной массы трудоемко и не является технологичным при серийном промышленном производстве вакцины. В этом аспекте перспективным и наиболее продуктивным методом культивирования бактерий считается глубинное выращивание в ферментерах с жидкими питательными средами различного состава. Применение глубинного культивирования при производстве бактериальных вакцин по сравнению с поверхностным способом позволяет значительно повысить продуктивность процесса выращивания микроорганизмов, уменьшить количество и продолжительность подготовительных операций и затраты ручного труда (Озеренко O.A. с соавт., 2004; Самуйленко А.Я. с соавт., 2009; Меньшенин В.В., Школьников Е.Э., 2009; Макаев Х.Н., Сабирова В.В., 2010; Еремец В.И. с соавт., 2012).

основе гидролизатов из различных органов и тканей промысловых видов ластоногих, казеиново-дрожжевых и кровяно-дрожжевых лизатов, белков молока, куриных эмбрионов, отходов рыбной промышленности, соево-эритроцитарного гидролизата (Шептун Н.Г., 1989; Абрамов Д.В., 1990; Рязанова Л.А. с соавт., 1991; Заерко В.И., 1996; Телишевская Л.Я., 2000).

Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось усовершенствование технологии изготовления вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота путем применения дешевой жидкой питательной среды и разработки оптимальных условий глубинного культивирования бактерий Moraxella bovis для получения биомассы при промышленном производстве вакцины.

Для выполнения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изыскать жидкую питательную среду на основе гидролизата непищевых отходов мясокомбината для выращивания бактерий Moraxella bovis',

5. Провести в лабораторных и производственных условиях сравнительную оценку эффективности серий вакцины против ИКК крупного рогатого скота,

изготовленных из биомасс, полученных на плотной и в жидкой питательных средах.

Научная новизна. Усовершенствована технология изготовления вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота применением биомассы бактерий Moraxella bovis, полученной глубинно-суспензионным методом культивирования в биореакторе с использованием жидкой питательной среды.

Впервые разработана рецептура жидкой питательной среды на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы коров с концентрацией 120 мг% аминного азота и содержащая по 5% сыворотки крови крупного рогатого скота и дрожжевого экстракта к общему объему среды для культивирования моракселл глубинно-суспензионным способом.

Практическая значимость. На основе проведенных исследований предложена жидкая питательная среда на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы коров с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота и дрожжевого экстракта для выращивания бактерий Moraxella bovis методом глубинного культивирования.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на:

- ежегодных заседаниях Ученого совета ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») при обсуждении отчетов о НИР за 2006 - 2012 гг.;

Международной научно-практической конференции Российской федерации (Казань, 2010);

- Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня основания Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока «Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири» (Краснообск, 2010);

- Международной научно-практической конференции «Обеспечение продовольственной безопасности России. Если не мы, то кто?» (Курск, 2010);

- Международной научно-практической конференции молодых ученых ФГУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2010);

Международной научной конференции, посвященной 80-летию организации ВГНКИ «Лекарственные препараты для животных (разработка, производство, эффективность и качество)» (Москва, 2011);

- Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение инновационного развития ветеринарной медицины и животноводства» ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» (Казань, 2011);

- Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Эффективность питательной среды, приготовленной на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы коров

с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота и дрожжевого экстракта.

2. Оптимизация условий глубинного культивирования бактерий Moraxella bovis в жидкой питательной среде на основе ФГМПЭМ.

3. Культурально-морфологические и биохимические свойства моракселл, полученных при глубинном культивировании в питательной среде на основе ФГМПЭМ.

4. Сравнительная оценка эффективности вакцины против ИКК крупного рогатого скота, изготовленной на основе биомассы Moraxella bovis, полученной в жидкой питательной среде методом глубинного культивирования, и вакцины, полученной из бакмассы, выращенной на плотной питательной среде, на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Этиологическая структура и эпизоотологические особенности инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота

В последнее время широкое распространение среди молодняка крупного рогатого скота получил инфекционный кератоконъюнктивит, вызываемый бактериями Moraxella bovis (Гаффаров Х.З. с соавт., 2008; Slatter D.H., 1982; Eugster А.К., 1984; Davidson К., 1986; Das R.G., 1988; Stellmacher H., 1988; Nagy A., 1989; Aly S.M., 1995; Piscitelli H.G., 1996; Brown M.H., 1998; Batta M.K., 1999; Conceicao F.R., 2003; Burns M.J., 2008). Согласно последним исследованиям, причиной возникновения и развития заболевания является сочетанное действие биологического возбудителя - бактерии Moraxella bovis и физического фактора -солнечного ультрафиолетового облучения (Русинов А.Ф., 1995; Гаффаров Х.З. с соавт., 1998; Arora A.K. et al., 1982). Частота его проявления в РФ наиболее высока, особенно среди молодняка крупного рогатого скота текущего года рождения и на откормочных площадках с высокой плотностью поголовья (Иванов A.B. с соавт., 2005).

Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота высококонтагиозная болезнь глаз, характеризующаяся слезотечением, гиперемией сосудов конъюнктивы, светобоязнью, блефароспазмом, иридоспазмом, серозно-гнойным истечением, помутнением и изъязвлением роговицы, деформацией глазного яблока в виде кератоконуса или кератоглобуса, частичной или полной потерей зрения пораженного глаза животного (Плахотин М.В. с соавт., 1966; Карайченцев В.Н. с соавт., 1992; Дуплева Л.Ш., 2009; Wilcox G.E., 1968).

Инфекция чаще всего встречается в летние и осенние месяцы у молодняка в период пастбищного содержания, но может наблюдаться у животных и при стойловом содержании. Она быстро распространяется в стаде при прямом контакте животных. Доказана возможность переноса возбудителя мухами -Musca domestica, Musca autumnalis (Караджов Я.Н., 1979; Pugh G.W. et al., 1968; Brown J.E., Adkins T.R., 1972). Прямое воздействие солнечных лучей, ветер, пыль,

недостаток витамина А благоприятствуют заражению (Эльце К. с соавт., 1977; Русинов А.Ф., 1994; Черванев В.А., Алтухов Б.Н., 1995; Валебная J1.B., 2007).

Заболевание наносит значительный экономический ущерб вследствие массового поражения крупного рогатого скота в пределах хозяйства. Потери складываются из снижения продуктивности и затрат на лечебно-оздоровительные мероприятия (Какоулин Т.Е., 1982; Иванов A.B. с соавт., 2005; Henson J.B., Grumbles L.C., 1960).

В крупных животноводческих комплексах с высокой концентрацией поголовья на небольшой территории заболеваемость составляет 60-90 % (Какоулин Т.Е., 1982; Barth Т. et al., 1986). Заражению особенно подвержены крупный рогатый скот и мелкий рогатый скот, но могут поражаться лошади, свиньи, олени (Фомин К.А., 1968; Андриасян В.Б. с соавт., 1988).

Ведущая роль в возникновении ИКК принадлежит бактериям Moraxella bovis (Русинов А.Ф., 1967, 1995; Дженсен Р. и соавт. 1977; Иванов A.B. с соавт., 2005; Гаффаров Х.З. с соавт., 2008; Hughes J.R. et al., 1965; Baptista P., 1980; Miller R.B., Fales W.H., 1984; Pugh G.W. et al., 1986; Tamzali et al., 1992). В качестве сопутствующей микрофлоры часто встречаются ß-гемолитические стрептококки, стафилококки.

Ранее в качестве возбудителя болезней глаз крупного рогатого скота большинство исследователей считали риккетсий (Орлов Ф.М., 1973; Аллахвердиев P.C., 1978), хламидий (Огняков Д.К., 1973; Pedersen К.В., 1973; Wehr J. et al., 1980) и микоплазм (Langfort E.V., Leach R.H., 1973; Rosenbusch P., 1985).

Основным возбудителем заболевания глаз вирусной природы считается герпесвирус (Борисевич В.Б. с соавт., 2006; McK

Информация о работе

Нургалиева, Алиня Равилевна
кандидата биологических наук
Казань, 2013
ВАК 06.02.02

Диссертация

Усовершенствование технологии изготовления вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита и изучение ее антигенных и иммуногенных свойств - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы