Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Специфическая профилактика инфекционных болезней новорожденных телят, поросят и инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов
Автореферат диссертации по теме "Специфическая профилактика инфекционных болезней новорожденных телят, поросят и инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота"
На правах рукописи
СПИРИДОНОВ ГЕННАДИЙ НИКОЛАЕВИЧ
СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛЯТ, ПОРОСЯТ И ИНФЕКЦИОННОГО КЕРАТОКОНЪЮНКТИВИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
9 ОК'Т 2014
Казань-2014
005553152
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань)
Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Гаффаров Харис Зарипович
Официальные оппоненты:
- доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы Башкирского государственного аграрного университета Андреева Альфия Васильевна;
- доктор ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник отдела «Всероссийская коллекция штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов Уласов Валентин Ильич;
- доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой биологической и неорганической химии Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана Алимов Азат Миргасимович
Ведущее учреждение: Государственное научное учреждение «Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ» (г. Нижний Новгород)
Защита состоится «18» ноября 2014 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок-2, ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань). Текст объявления о защите размещен на официальном сайте ВАК РФ www.vak.ed.gov.ru: полный текст диссертации, автореферата, отзыв научного консультанта - на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru.
Автореферат разослан фУГ» г.
Ученый секретарь диссертационного Л
совета, кандидат ветеринарных ншос^^^ТТ^СГтепанов В.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Практика работы животноводческих комплексов как в Российской Федерации, так и за её пределами показывает, что большой экономический ущерб сельскохозяйственным предприятиям наносят болезни желудочно-кишечного тракта новорожденных телят и поросят, которые обусловлены нарушениями" параметров микроклимата в помещениях, нерациональным кормлением и содержанием глубокостельных коров и супоросных свиноматок, а также возбудителями различных инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной природы [2, 6, 7, 12, 13,16,17].
Установлено, что важную этиологическую роль в возникновении желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят и поросят играют рота-, коронавирусы, эшерихии коли, клостридии и др. Данные литературных источников и результаты многолетних исследований сотрудников ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» свидетельствуют о том, что эти инфекции часто протекают в смешанной форме [11,13,15]. При этом заболеваемость телят и поросят в первые дни жизни составляет более 70%, а отход — 80-90% от числа заболевших. В настоящее время главным направлением борьбы с указанными болезнями является активная иммунизация стельных коров и супоросных свиноматок, с молозивом и молоком от которых специфические антитела поступают в организм новорожденных и обеспечивают их защиту. Однако, по различным причинам некоторые животные после рождения не получают в необходимом количестве эту естественную защиту, что связано с недостаточным поступлением иммуноглобулинов с молозивом матери, несвоевременным и недостаточным получением молозива или нарушением механизма абсорбции иммуноглобулинов молозива кишечником новорожденных. Неполноценное кормление беременных животных также обуславливает образование иммунодефицитного молозива, которое не обеспечивает у новорожденных животных иммунитета достаточной напряженности, возникает гипоиммуноглобулинемия, что ведет к возникновению заболеваний, протекающих с признаками диареи. В этих случаях для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний необходимо применять гипериммунные сыворотки. В этой связи разработка ассоциированных вакцин и полиспецифических лечебно-профилактических гипериммунных сывороток против основных возбудителей желудочно-кишечных болезней телят и поросят остается весьма актуальной задачей.
В последние годы в РФ широкое распостранение получил инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота, вызываемый бактериями Moraxella bovis [8]. Болезнь наносит скотоводческим хозяйствам значительный экономический ущерб за счет выбраковки животных, потери племенной ценности, снижения удоев и прироста массы тела, затрат на проведение лечебных и оздоровительных мероприятий.
В связи с вышеизложенным возникла необходимость разработки биологических препаратов для специфической профилактики и лечения смешанных вирусно-бактериальных форм диареи новорожденных телят, поросят, jz также инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.
Степень разработанности проблемы. В Российской Федерации разработаны различные моновалентные и ассоциированные вакцины против желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных, которые применяются в различных регионах [1, 3, 4, 9, 10,14,15]. Несмотря на это, во многих хозяйствах заболеваемость новорожденных телят и поросят желудочно-кишечными заболеваниями остается довольно высокой. В отдельных хозяйствах она достигает до 100%. В этих случаях для лечения и повышения общей резистентности организма новорожденных животных применяются различные иммуностимулирующие препараты и гипериммунные лечебно-профилактические сыворотки. Основным недостатком существующих гипериммунных сывороток является то, что в их составе отсутствуют специфические антитела против рота-, коронавирусов, что значительно снижает их лечебно-профилактическую эффективность при смешанных формах инфекционных диарей новорожденных телят и поросят.
В мировой практике для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота используется ряд вакцин, отличающихся по принципам получения и по методу проведения вакцинации. В РФ вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита не разработана.
Цель и задачи. Целью исследований явилось изучение этиологической структуры желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят и поросят, инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, разработка способов их лечения и специфической профилактики. Для выполнения вышеуказанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить этиологическую структуру желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят и поросят, инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в регионах Среднего Поволжья и Предуралья;
2. Разработать технологии изготовления ассоциированных вакцин и полиспецифических гипериммунных сывороток против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят и поросят;
3. Разработать технологию изготовления ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1;
4. Изучить эффективность ассоциированных вакцин и полиспецифических гипериммунных сывороток в лабораторных и производственных условиях;
5. Разработать нормативные документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение ассоциированных вакцин и гипериммунных
лечебно-профилактических сывороток для внедрения их в ветеринарную практику.
Научная новизна. На основании результатов клинико-эпизоотологичского монторинга инфекционных заболеваний новорожденных телят и поросят сельскохозяйственных предприятий регионов Среднего Поволжья и Предуралья показано, что диарея новорожденных телят и поросят протекает преимущественно в виде смешанной инфекции. Основными этиологическими агентами при этом являются рота-, корона-, герпесвирусы, энтеротоксигенные штаммы Е. coli, синтезирующие адгезивные антигены К88, К99, А20 и 987Р, С/, perfringens и др.
Установлено, что до 73,1% патогенных штаммов Е. coli, вызывающие эшерихиозы новорожденных животных, продуцируют различные адгезивные антигены. Наиболее часто у больных колибактериозом новорожденных телят до 10-дневного возраста встречаются возбудители с адгезивными антигенами А20 и К99, у поросят - с адгезивными антигенами К88,987Р и К99.
Отработан режим культивирования на перевиваемых линиях культур клеток производственных штаммов рота-, корона-, герпесвирусов в круговом монослое роллерной установки, позволяющий получить вирусную суспензию с высокой биологической активностью.
Обоснована необходимость разработки ассоциированных вакцин и полиспецифических гипериммунных сывороток для специфической профилактики и лечения рота-, корона-, герпесвирусных, эшерихиозных диарей новорожденых телят и поросят, а также вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.
Впервые в РФ разработаны и освоены технологии изготовления ассоциированных вакцин и полиспецифических сывороток для специфической профилактики и лечения смешанных форм инфекционной диареи новорожденных телят и поросят на основе наиболее часто выявляемых в регионах Среднего Поволжья и Предуралья этиологических агентов, а также вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1.
Проведена оценка эффективности ассоциированных вакцин и полиспецифических сывороток против инфекционных диарей новорожденных телят и поросят, а также вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в экспериментальных и производственных условиях. Подтверждена их эффективность в лабораторных и производственных условиях.
Новизна и приоритет научных исследований диссертационной работы подтверждены 7 Патентами РФ на изобретения.
Теоретическая и практическая значимость. На основании результатов исследований разработаны и предложены для внедрения в ветеринарную практику новые эффективные биологические препараты для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний новорожденных
телят, поросят и инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота:
- Вакцина против рота-, коронавирусного гастроэнтерита (ТГС) и эшерихиозной диареи новорожденных поросят (Патент РФ № 2137499 от 20.09.1999 г);
- Вакцина против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят (Патент РФ №2145236 от 10.02.2000 г);
- Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, корона-, герпесвирусов и Е. coli (А20, К99) новорожденных телят (Патент РФ № 2145504 от 20.02.2000 г);
- Вакцина ассоциированная против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов Moraxella bovis и герпесвируса типа 1 (Патенты РФ №2145353 от 10.02.2000 г и №2264227 от 20.11.2005 г);
- Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят (Патент РФ №2456998 от 27.07.2012 г).
Разработан набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа.
Материалы исследований вошли в 18 нормативных документов, регламентирующих изготовление, контроль и применение вышеперечисленных биологических препаратов.
Методология и методы исследований. Работа выполнена в период с 1993 по 2013 гг. в лаборатории по изучению болезней молодняка ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань), результаты исследований апробированы в сельскохозяйственных предприятиях Среднего Поволжья и Предуралья, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям новорожденных телят и поросят, а также инфекционному кератоконъюнктивиту крупного рогатого скота. Отдельные этапы работы были выполнены с участием кандидатов наук Ефимовой М.А., Валебной JI.B., Дуплевой Л.Ш., Романова Е.А., Махмутова А.Ф. и Сатгаровой Н.В., которым выражаю искреннюю признательность.
В поцессе выполнения работы по разработке ассоциированных вакцин и полиспецифических лечебно-профилактических сывороток были использованы штаммы возбудителей:
- бактерии Е. coli: «ПЗ-З» — синтезирующий адгезивный антиген А20; «КВ-1» - синтезирующий адгезивный антиген К99; «ПЛ-6» - синтезирующий адгезивный антиген К88; «УК- 2» - синтезирующий адгезивный антиген 987Р;
- бактерии Moraxella bovis: штаммы «Г97-ВНИВИ» и «ШЗ-01»;
- ротавирус крупного рогатого скота - штамм «Ш-1»;
- коронавирус крупного рогатого скота - штамм «СМ-1»;
- герпесвирус типа 1 - штаммы «ТКА-ВИЭВ-В2» и «Оксфорд»;
- ротавирус свиней - штамм «Пугачевский 92».
— вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней - штамм «ВГНКИ-5».
Эксперименты проведены на 1256 белых мышах массой 14-16 г, 160 кроликах массой 2,5-3,0 кг, 3292 свиньях, 986 коровах и телятах разного возраста и физиологического состояния.
Использованы диагностические наборы для: выявления антигенов вируса трансмиссивного гастроэнтерита (ТГС) и ротавируса свиней методом иммуноферментного анализа; выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней иммуноферментным методом «ТГС-СЕРОТЕСТ»; диагностики коронавирусного энтерита крупного рогатого скота методом гемагглютинации; диагностики ротавирусного энтерита крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа; серологической иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота «Диарин-С»; определения специфических антител к бактериям Moraxella bovis «ИКК-СЕРОТЕСТ», набор «О» - коли агглютинирующих сывороток; антиадгезивные коли-сыворотки К88, К99, 987Р, А20, F41 «Колиадгезин-тест».
Клинико-эпизоотологическому обследованию подвергнуто поголовье крупного рогатого скота и свиней в 152 сельскохозяйственных предриятиях, расположенных в регионах Среднего Поволжья и Предуралья. Анализ эпизоотической ситуации в неблагополучных хозяйствах проводили согласно рекомендациям, разработанным Бакуловым И.А. и соавт. (1975).
Для культивирования вирусов использовали перевиваемые культуры клеток: МДВК — для коронавируса крупного рогатого скота, СПЭВ - для ротавируса крупного рогатого скота и свиней, ППК — для вируса ТГС, TR -для вируса инфекционного ринотрахеита (герпесвируса типа 1). При этом в качестве поддерживающих сред использовали гидролизат лактоапьбумина (ГЛА), среду 199 с добавлением глутамина, трипсина и антибиотиков.
Уровень клеточного иммунитета вакцинированных животных определяли по процентному соотношению Т- и В-лимфоцитов. Идентификацию их проводили в одном препарате по образованию реакции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами (Е-РОК) и розеткообразования лимфоцитов с зимозаном (ЗСз-РОК) (Блинов Н.И., 1985).
Антигенную активность ассоциированных вакцин контролировали путем введения вакцины кроликам и восприимчивым животным и последующего определения титров специфических антител в их сыворотках крови.
Производственное испытание экспериментальных серий ассоциированных вакцин и полиспецифических гипериммунных сывороток проводили в хозяйствах, неблагополучных по инфекционным диареям новорожденных телят и поросят, а также по инфекционному кратоконъюнктивиту крупного рогатого скота. Эффективность вакцин и гипериммунных сывороток оценивали по количеству заболевших и павших телят, поросят от желудочно-кишечных заболеваний, по титрам специфических антител и функционально-метаболической активности
лейкоцитов, сравнивая эти показатели до и после начала применения биопрепаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Этиологическая структура желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят и поросят в регионах Среднего Поволжья и Предуралья;
2. Технологии изготовления ассоциированных вакцин и полиспецифических гипериммунных сывороток против рота-, корона-, герпесвирусных и эшерихиозных диареи новорожденных телят и поросят;
3. Иммунобиологические показатели ассоциированных вакцин: стерильность, безвредность, антигенная и иммуногенная активность, профилактическая эффективность;
4. Иммунобиологические показатели полиспецифических гипериммунных сывороток: бактерицидные и превентивные свойства, содержание специфических антител, лечебно-профилакическая активность;
5. Этиологическая структура инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в регионах Среднего Поволжья и Предуралья;
6. Технология изготовления ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1;
7. Иммунобиологические показатели ассоциированной вакцины: безвредность, антигенная и иммуногенная активность, профилактическая эффективность.
Степень достоверности и апробация результатов.
Экспериментально полученный цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel.
Материалы диссертации доложены, обсуждены и получили положительную оценку на ежегодных заседаниях Ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» при обсуждении отчетов о НИР за 1993-2013 гг.; Международных и Всероссийских научно-практических конференциях (Владимир, 2003; Воронеж, 1997, 2002; Казань, 1992, 1998, 2000, 2011, 2012; Киров, 2003; Краснодар. 2011; Краснообск, 2010; Курск, 2010; Львов, 2009, 2013; Москва, 1996, 1997, 2001, 2010, 2011; Новосибирск, 1991; Покров, 2008; С.-Петербург, 2004; Ульяновск, 2010; Уфа, 2000, 2014; Харьков, 2011; Щелково, 2000, 2003, 2004, 2005).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 76 научных работ, из них 25 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, в том числе 7 патентов РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 328 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, заключение, рекомендации производству, список использованной литературы, состоящий из 374 источников, в том числе — 86
иностранных авторов и приложения. Диссертация содержит 48 таблиц и иллюстрирована 5 рисунками.
2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
2.1 Этнологическая структура инфекционных диарей новорожденных телят и поросят в регионах Среднего Поволжья и Предуралья
Клинико-эпизоотологическими, бактериологическими, вирусологическими исследованиями 97 скотоводческих и 55 свиноводческих хозяйств Среднего Поволжья и Предуралья показано широкое распространение у молодняка крупного рогатого скота и свиней болезней желудочно-кишечного тракта, вызванных возбудителями вирусной и бактериальной этиологии.
Установлено, что у телят из бактериальных агентов в 89,7% случаев выделяются энтеропатогенные штаммы E.coli, в 30,9% случаев - бактерии рода Streptococcus, в 26,8% случаев - бактерии С/, perfringens, в 17,5% случаев - Proteus vulgaris, в 7,2% случаев - Klebsiella, в 5,2% случаев -Pseudomonas aeruginosa. Кроме бактерий, в 45,4% случаев обнаружены ротавирусы, в 35,1% случаев - коронавирусы, в 28,8% случаев -герпесвирусы крупного рогатого скота.
Из патологического материала от больных и павших поросят выделены в 96,3% случаев энтеропатогенные штаммы Esherichia coli, в 18,21% случаев - бактерии Clostridium perfringens, в 27,3% случаев - Proteus vulgaris, в 16,4% случаев Salmonella choleraesuis, в 9,1% случаев - бактерии Streptococcus, в 5,5% случаев - Haemophilus parasuis. Кроме бактерий, в 50,9% случаев обнаружен ротавирус и в 34,5% случаев - вирус трансмиссивного гастроэнтерита. Во всех обследованных хозяйствах наблюдалась смешанная инфекция, вызванная в одних случаях несколькими видами бактерий, в других случаях - вирусами и бактериями. Смешанная бактериальная инфекция наблюдалась в 20 (20,6%) хозяйствах, а в остальных - смешанная вирусно-бактериальная инфекция.
Установлено, что желудочно-кишечные заболевания новорожденных телят и поросят чаще возникают в хозяйствах, в которых нарушаются параметры микроклимата в помещениях, правила содержания и кормления стельных коров и супоросных свиноматок, а также низкий естественный уровень специфической защиты новорожденных от воздействия не только патогенной, но и условно-патогенной микрофлоры. Нередко заболевание возникает эндогенно без заноса извне. Заболевание наблюдается в любое время года, но чаще осенью, зимой и весной, протекают в виде энзоотических вспышек. В некоторых хозяйствах заболевание приобретает стационарный характер, наблюдается в течение нескольких месяцев и лет, периодически проявляясь в виде энзоотии. Иногда вспышка заболевания следует после ввода в неблагополучное хозяйство новой партии животных.
2.2 Разработка технологии изготовления, методов контроля и применения ассоциированной вакцины и полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят
2.2.1 Биологические свойства штаммов микроорганизмов, используемых при изготовлении ассоциированной вакцины и полиспецифической сыворотки
При изготовлении ассоциированной вакцины и полиспецифической сыворотки использовали производственные штаммы вирусов: «Ш-1» ротавируса крупного рогатого скота, «СМ-1» коронавируса крупного рогатого скота, «ТКА-ВИЭВ-В2» — герпесвируса крупного рогатого скота, а также 2 энтеротоксигенных штамма Е.соН: «КВ-1» и «ПЗ-З», продуцирующие соответственно адгезивные антигены К99 и А20.
Штаммы рота-, коронавирусов телят и Е. соН получены авторами и депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия, 123002, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ).
Ротавирус крупного рогатого скота культивировали в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи (линия СПЭВ), выращенной в роллерных трехлитровых бутылях или 1,5-литровых матровых колбах на комбинированной ростовой среде, состоящей из гидролизата лактальбумина (ГЛА) — 45%, среды 199 — 45%, сыворотки крупного рогатого скота - 10% и антибиотиков. Коронавирус крупного рогатого скота культивировали в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона коровы (линия МДВК), выращенной в роллерных трехлитровых бутылях или 1,5-литровых матровых колбах на комбинированной среде, состоящей из среды 199 — 60%, ГЛА — 30% и эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота - 10%, герпесвирус крупного рогатого скота — в перевиваемой культуре клеток трахеи эмбриона коровы (линия ТЯ), выращенной в трёхлитровых бутылях или в 1,5-литровых матровых колбах на комбинированной среде, состоящей из среды 199 - 10%, ГЛА - 40%, среды Игла МЭМ - 40% и сыворотки крупного рогатого скота - 10%.
Установлено, что инфекционный титр рота-, корона-, герпесвирусов при культивировании их в условиях кругового монослоя на роллерной установке промышленного типа достоверно выше (р<0,05), чем при стационарном способе их культивирования.
Для получения биомассы культур Е.соН использовали МПА (для штамма «ПЗ-З», синтезирующего адгезивные антигены А20) и среду Минка (для штамма «КВ-1», синтезирующего адгезивные антигены К99). Инактивацию микробной взвеси, имеющую концентрацию 100-120 млрд. микробных клеток в 1 см3, проводили формалином. Анатоксины энтеротоксигенных штаммов - Е.соН «ПЗ-З» и «КВ-1» получали в среде Хотгингера.
2.2.2 Лабораторным регламент изготовления ассоциированной вакцины против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят, контроль ее стерильности, безвредности, антигенной активности
Вакцину готовили из инактивированных формалином рота-, корона-, герпесвирусных антигенов, взятых в равных соотношениях по 26 см3 на 100 см3, к ним добавляли 100 -120 млрд.-ную суспензию E.coli по 3 см3 на 100 см3 и осажденную взвесь ТС-, ТЛ-анатоксинов — 6 см3 на 100 см3, а также 6%-ный гель гидроокиси алюминия - 10 см3 на 100 см3 вакцинного препарата. Все тщательно перемешивали и сливали в ёмкость для расфасовки.
Каждую серию вакцины проверяли на стерильность, безвредность и антигенную активность. Установлено, что все экспериментальные серии вакцины были стерильны, безвредны, не обладали остаточной вирулентностью.
Проводили определение прививной дозы ассоциированной вакцины для глубокостельных коров и нетелей. Опыты проводили на 20 глубокостельных коровах, разделенных на 4 группы по 5 голов в каждой. Коров 1-ой группы вакцинировали подкожно в области средней трети шеи двукратно с интервалом 14 дней в дозах 5 и 5 см3, 2-ой группы — в дозах 7 и 7 см3, 3-ей группы - в дозах 10 и 10 см3, 4-ой группы — в дозах 10 и 15 см3.
На 14-й день после вакцинации проводили определение титров специфических антител в сыворотке крови к рота-, корона-, герпесвирусным антигенам и Е. coli. За коровами вели наблюдение до отелов, а за телятами в течение 30 сут после рождения. Результаты исследований сывороток крови, полученных от вакцинированных коров, представлены в таблице 1.
Таблица 1 — Титры специфических антител сывороток крови коров, вакцинированных разными дозами вакцины (log2, M±m, n=5, р<0,05(*))
Группа животных Доза вакцины, см3 Титр антител к антигенам
ротавирус ИФА коронавирус РТГА герпесвирус ИФА Е. coli А20 РА E.coli К99 РА
I 5+5 8,84±0,22 5,52±0,22 9,04±0,27 7,12±0,22 6,72±0,27
II 7+7 9,04±0,27 6,12±0,22 9,44±0,22 8,12±0,22 7,52±0,22
III 10+10 10,44±0,22* 7,72±0,27* 10,84±0,22* 9,92±0,27* 8,72±0,27*
IV 10+15 10,44±0,41* 7,92±0,27* 10,84±0,41* 9,72±0,44* 8,52±0,22*
Из данных таблицы 1 видно, что наиболее оптимальной дозой ассоциированной вакцины для иммунизации стельных коров и нетелей является 10 см3 при двукратном ее применении с интервалом 14 дней.
Проводили изучение иммуногенной активности ассоциированной вакцины в экспериментальных условиях на восьми глубокостельных коровах. С этой целью животных разделили на 2 группы по 4 головы в каяадой.
Животных 1-ой группы иммунизировали ассоциированной вакциной против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи телят в дозе 10 см подкожно в область средней трети шеи двукратно за 30-35 и 15-20 дней до отела. Животные 2-ой группы были контрольными, т.е. иммунизации не подвергались. Показатели уровня специфических антител в сыворотке крови и молозиве вакцинированных коров и в крови новорожденных телят, получащих молозиво, представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2 - Содержание специфических антител в сыворотке крови коров, вакцинированных двукратно ассоциированой вакциной (log2, М±ш, п=8, р<0,05(*))
Срок исследования Титр антител к антигенам
ротавирус вИФА коронавирус вРТГА герпесвирус вИФА Е. coli в РА
К99 А20
до вакцинации 5,25±0,18 3,25±0,18 4,75+0,27 2,50+0,20 2,63+0,28
после первой вакцинации 8,83+0,20* 5,38±0,20* 8,38±0,20* 7,82±0,20* 8,20±0,13*
после второй вакцинации 9,50+0,29* 7,68±0,79* 9,50±0,20* 8,95±0,20* 9,82±0,2 9*
Таблица 3 - Содержание специфических антител в молозиве коров и сыворотке крови телят М±т, п=5, р<0,05(*))
Группа животных Титр антител к антигену
ротавирус вИФА коронавирус вРТГА герпесвирус вИФА Е. coli в РА
К99 I А20
сыворотка молозива
невакцинированные коровы 5,40±0,27 2,60±0,27 4,20+0,22 2,20±0,22 2,60±0,27
вакцинированные коровы 10,40±0,27* 8,00± 0,00* 10,6010,22* 7,92±0,27* 8,52±0,22*
сыворотка крови
телята от невакциниро-ванных коров 5,20±0,22 2,60±0,27 4,20±0,22 2,20±0,22 2,40±0,27
телята от вакцинированных коров 9,60±0,27* 7,40±0,27* 10,40+0,27* 7,72±0,27* 8,72+0,27*
Как видно из таблиц 2 и 3, ассоциированная вакцина обладает высокой антигенной активностью. Содержащие в ассоциированной вакцине антигены не проявляют конкурентного действия по отношению друг к другу, что указывает на совместимость ее антигенного состава.
Оценку напряженности колострального иммунитета у новорожденных телят, полученных от вакцинированных вакциной против рота-, корона-,
герпесвирусной и эшерихиозной диареи коров, проводили в остром комиссионном опыте.
С этой целью 4-х телят, полученных от вакцинированных коров, и 4-х -от невакцинированных коров, на второй день после рождения заражали смесью культуральных вирусных суспензий: ротавируса (штамм «Ш-1», инфекционный титр 107'0 - 107'5 ТЦД5о/см3), коронавируса (штамм «СМ-1», инфекционный титр 10s,°- 1075 ТЦЦ50/см3), герпесвируса (штамм «Оксфорд», инфекционный титр Ю7'0 - 107,5 ТЦЦ50/см5) в равных соотношениях в дозе 15 см и суточными агарововыми культурами энтеротоксигенных штаммов E.coli (К99, А20) в количестве 20 млрд. микробных клеток каждого штамма.
В ходе эксперимента установлено, что 3 теленка из 4 опытной группы, полученные от двукратно вакцинированных коров, после заражения их рота-, корона-, герпесвирусами и E.coli (К99 и А20), оставались клинически здоровыми в течение всего эксперимента. Лишь у одного теленка наблюдалась легкая форма диареи, закончившаяся на 4-е сут, в то время как у всех телят, полученных от невакцинированных коров, развилась тяжелая экспериментальная диарея, приведшая к гибели двух телят (одного теленка на 3, другого — на 7 сут после заражения). Таким образом, заболеваемость телят опытной группы составила 25%, сохранность 100%, тогда как эти показатели в контрольной группе телят составили 100 и 50% соответственно.
Таким образом, у новорожденных телят, полученных от вакцинированных коров, после приема молозива создается колостральный иммунитет, защищающий их от заражения рота-, корона-, герпесвирусами и E.coli.
Оценку эффективности применения ассоциированной вакцины проводили в 9 хозяйствах Республики Татарстан, неблагополучных по рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят в различных сочетаниях.
Всего было вакцинировано 6420 глубокостельных коров и нетелей. Параллельно в хозяйствах проводились мероприятия по улучшению кормления и условий содержания животных перед отелом. Отмечено, что введение вакцины не оказывало существенного влияния на общее состояние привитых животных. Установлено, что в неблагополучных хозяйствах после начала применения ассоциированной вакцины заболеваемость новорожденных телят желудочно-кишечными заболеваниями снизилась в 2-4 раза, что способствовало повышению их сохранности на 10,0-26,8%.
На основании результатов проведенных исследований для внедрения в ветеринарную практику предложена «Ассоциированная вакцина против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят» (Патент РФ на изобретение № 2145236, приоритет от 30.04.1999 г.). Разработаны нормативные документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение вакцины, которые утверждены директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласованы с ГУВ КМ РТ.
2.3 Разработка гипериммунной сыворотки против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят
На первом этапе нами проведены исследования по установлению оптимального интервала между введениями антигенов. С этой целью были испытаны две схемы. При первой схеме интервал между последовательными введениями рота-, корона-, герпесвирусных и эшерихиозных антигенов составил 7 сут, при второй схеме - 14 суток. Животным обеих групп антигены вводились 4-кратно в одинаковых дозах. Через 20 сут после последней инъекции антигенов брали кровь и исследовали в ее сыворотке уровень специфических антител. Установлено, что наиболее высокие титры специфических антител в сыворотке крови у животных образуются при введении антигенов с интервалом в 14 дней.
На втором этапе отрабатывали оптимальную дозу введения рота-, корона-, герпесвирусных и эшерихиозных антигенов. С этой целью были сформированы 3 группы быков-продуцентов живой массой 350-400 кг по 5 голов в каждой. Животным каждой группы вводили специфические антигены 4-кратно с интервалом 14 дней в дозах, указанных в таблице 4. Для гипериммунизации использовали инактивированные рота-, корона-, герпесвирусные антигены, антигены E.coli, содержащие соматические и адгезивные антигены (К99, А20), ТЛ-, ТС-анатоксины E.coli при следующем соотношении их компонентов в двух различных иммуногенах (в 1 л антигена):
1. Вирусный антиген:
- антиген ротавируса крупного рогатого скота с содержанием специфического белка 10-12 мг/см3, см3 - 330,0 - 335,0;
- антиген коронавируса крупного рогатого скота с содержанием специфического белка 10-12 мг/см , см3 - 330,0 - 335,0;
- антиген герпесвируса типа 1 крупного рогатого скота с содержанием специфического белка 10-12 мг/см3, см3 - 330,0 - 335,0;
- формалин, см3 - 4,0 - 5,0.
2. Эшерихизный антиген:
- соматический и адгезивный антиген К99 с концентрацией 10-15 млрд. м.к. в 1 см3, см3 - 330,0 - 335,0;
- соматический и адгезивный антиген А20 с концентрацией 10-15 млрд. м.к. в 1 см3, см3 - 330,0 - 335,0;
- формалин, см3 — 4,0 - 5,0;
- ТС- и ТЛ-анатоксины штаммов E.coli К99 и А20 в соотношении 1:1 соответственно в культуральной среде с титрами в РДП 1:8 - 1:16, л -до 1.
При гипериммунизации смесь рота-, корона-, герпесвирусных антигенов вводили внутривенно, эшерихиозный антиген - подкожно в область шеи. Через 20 сут после последнего введения антигенов от животных брали кровь и исследовали в ее сыворотке содержание специфических антител. Результаты этих исследований представлены в таблице 5.
Таблица 4 - Схема гипериммунизации быков-продуцентов для получения полиспецифической сыворотки к рота-, корона-, герпесвирусам и Е.соП
Этап иммунизации Срок иммунизации, сут Полиантиген Схема иммунизации I I II | III Доза антигена, см3 Способ введения
1-ый 1-ый Вирусный антиген Эшерихиозный антиген 60 6 90 10 120 14 Внутривенно Подкожно
Н-ой 14-ый Вирусный антиген Эшерихиозный антиген 90 10 120 20 135 24 Внутривенно Подкожно
Ш-ий 28-ой Вирусный антиген Эшерихиозный антиген 120 20 135 24 165 30 Внутривенно Подкожно
IV-ый 42-ой Вирусный антиген Эшерихиозный антиген 135 24 165 30 210 40 Внутривенно Подкожно
Таблица 5 — Специфическая активность гипериммунных сывороток, полученных разными схемами иммунизации быков-продуцентов р<0,05(*))
Антиген Метод исследования Титр специфических антител
Схема №1 Схема №2 Схема №3
Ротавирус ИФА 10,84±0,22 12,24±0,27* 12,44±0,22*
Коронавирус РТГА 7,6±0,27 9,0±0,00* 9,52±0,89*
Герпесвирус ИФА 10,84±0,22 11,84+0,22* 12,04±0,27*
E.coli К99 РА 8,64±0,235 10,04±0,27* 9,84±0,22*
E.coli А20 РА 9,6±0,35 10,44+0,22* 10,04±0,27*
TJI-токсин РДП 2,4±0,27 4,4+0,27* 4,2±0,22*
ТС-токсин РДП 2,0+0,00 3,4±0,27* 3,2±0,22*
Из данных таблицы 5 видно, что наиболее оптимальной схемой гипериммунизации быков-продуцентов является вторая, которая позволяет получать полиспецифическую гипериммунную сыворотку с высоким содержанием специфических антител к рота-, корона-, герпесвирусам и эшерихиям коли с наименьшим расходом антигенов и без осложнений у животных после введения иммуногенов. С использованием второй схемы гипериммунизации нами изготовлены 26 серий полиспецифической сыворотки против рота-, корона-, герпесвирусов и эшерихий коли (К99, А20). Лабораторные исследования показали, что все серии стерильны, безвредны для животных, обладают высокими превентивными свойствами — защищают 8090% белых мышей после контрольного заражения их летальной дозой Е. coli.
Определение оптимальной лечебной и профилактической дозы гипериммунной сыворотки для телят проводили в условиях молочнотоварной фермы, стационарно неблагополучной по рота-, корона-,
герпесвирусной и эшерихиозной диареи. С лечебной целью испытывали на больных телятах 3-6-дневного возраста 4 дозы сыворотки — 1,0; 1,5; 2,0 и 2,5 см3 на 1 кг массы тела теленка. При этом гипериммунную сыворотку вводили однократно внутримышечно в область ягодицы. Одновременно животным опытной и контрольной групп вводили антибиотик (стрептомицин) согласно инструкции по его применению. При этом установили, что полиспецифическая гипериммунная сыворотка оказывает выраженное лечебное действие при смешанных вирусно-бактериальных инфекциях. Применение ее в дозах 1,0 и 1,5 см3 на 1 кг массы теленка позволило вылечить 70%, а в дозах 2,0 и 2,5 см3 - 100% больных телят, тогда как в контрольной группе, где в качестве лечебного средства применялся только антибиотик, сохранность новорожденных телят составила лишь 60%, что на 40% ниже, чем у животных 3-ей и 4-ой опытных групп. Отмечено также, что при применении сыворотки в дозе 2,5 см3 на 1 кг массы тела у 70% телят через 3-5 мин после введения препарата наблюдались дрожь, возбуждение, переходящие в угнетенное состояние. Следовательно, оптимальной лечебной дозой сыворотки для новорожденных телят является 2 см3 на 1 кг массы тела.
По такой же схеме была отработана оптимальная профилактическая доза сыворотки на 4 группах телят по 10 гол в каждой. Испытывали 4 дозы сыворотки - 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 см3 на 1 кг массы тела теленка. С профилактической целью сыворотку вводили телятам внутримышечно в первый день после рождения. За животными вели клиническое наблюдение в течение 30 дней. При этом установили, что полиспецифическая гипериммунная сыворотка обладает выраженными профилактическими свойствами по отношению к рота-, корона-, герпесвирусам и эшерихиям коли. Так, в группе телят, обработанной гипериммунной сывороткой в дозе 1,5 см3 на 1 кг массы тела, заболело 30%, в группе, обработанной сывороткой в дозе 2 см3 на 1 кг массы тела, заболело 20% телят, тогда как в контрольной (интактной) группе все телята (100%) заболели диареей, из которых 5 (50%) пали. Сохранность новорожденных телят в опытных группах достигала 100% против 50% в контрольной группе, т.е. применение сыворотки с профилактической целью позволило повысить сохранность новорожденных телят в 2 раза. Установлено, что наиболее оптимальной дозой сыворотки для профилактики рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят является 1,5 см3 на 1 кг массы тела.
Производственное испытание профилактических и лечебных свойств гипериммунной сыворотки против рота-, корона-, герпесвирусов и эшерихий коли проводили в условиях хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям новорожденных телят.
Лечебные свойства гипериммунной сыворотки изучены на 186 больных новорожденых телятах. С лечебной целью сыворотку вводили внутримышечно в дозе 2,0 см3 однократно, при тяжелых формах болезни сыворотку назначали повторно через 48 часов. Кроме сыворотки для лечения
телят как опытной, так и контрольной групп применяли антибиотики в лечебных дозах. Результаты испытания сыворотки показали, что из 186 животных, подвергнутых лечению гипериммунной сывороткой, клиническое выздоровление наступило у 175 (94,0%) телят, 11 (6,0%) телят погибли. В то время как из 108 животных контрольной подгруппы, лечение которых проводилось антибиотиками, наблюдали выздоровление лишь у 70 (64,8%) телят, пало 38 (35,2%) телят.
Профилактические свойства гипериммунной сыворотки изучали на 325 новорожденых телятах, при этом 248 телят служили контролем. Для профилактики желудочно-кишечных заболеваний телятам в первые сутки после рождения вводили внутримышечно полиспецифическую гипериммунную сыворотку в дозе 1,5 см3 или задавали во внутрь в дозе 2,0 см3 на 1 кг массы тела. За животными ввели клиническое наблюдение в течение 30 дней. В результате исследований установили, что из 325 пассивно иммунизированных животных переболели диареей 52 (16,0%), пало 18 (5,3%) телят. В контрольной подгруппе, не подвергавшихся профилактической обработке полиспецифической сывороткой, заболели диареей 190 (76,6%) телят, пало 70, сохранность телят составила 71,7%.
Таким образом, гипериммунная полиспецифическая сыворотка против рота-, корона-, герпесвирусов и эшерихий коли обладает выраженными лечебно-профилактическими свойствами. Так, при применении ее в стационарно неблагополучных хозяйствах по желудочно-кишечным заболеваниям с профилактической целью повышается сохранность новорожденных телят на 23,0%, с лечебной целью — на 29,2%.
На основании результатов проведенных исследований для внедрения в ветеринарную практику предложена «Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, корона-, герпесвирусов и Э. коли (К99, А20) новорожденных телят» (Патент РФ № 2145504, приоритет от 19.05.1999 г.). Разработаны нормативные документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение гипериммунной сыворотки.
2.4 Разработка технологии изготовления, методов контроля и применения ассоциированной вакцины и полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят
2.4.1 Биологическая характеристика производственных штаммов микроорганизмов, используемых для изготовления ассоциированной вакцины и полиспецифической гипернммунной сыворотки
Для изготовления ассоциированной вакцины и полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят использовали ротавирус свиней - штамм "Пугачевский - 92", вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней - штамм "ВГНКИ-5" и 3 штамма E.coli : "ПЛ-2" - синтезирующий адгезивный антиген К88, "КВ-1" - синтезирующий адгезивный антиген К99 и "УК-2" - синтезирующий адгезивный антиген 987Р.
Штаммы ротавируса и E.coli получены и депонированы нами во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия, 123002, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ).
2.4.2 Лабораторный регламент изготовления ассоциированной вакцины против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят, контроль ее стерильности, безвредности, антигенной и иммуногенной активности
Ротавирус свиней культивировали в роллерных трёхлитровых бутылях или 1,5-литровых матровых колбах с выросшей однослойной перевиваемой культурой клеток почки эмбриона свиньи (линия СПЭВ) на комбинированной ростовой среде, состоящей из гидролизата лактальбумина (ГЛА) - 45%, среды 199 - 45%, сыворотки крупного рогатого скота - 10% и антибиотиков.
Вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней культивировали в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи (линия ППК), выращенной в роллерных трехлитровых бутылях на комбинированной среде, состоящей из среды 199 - 45%, ГЛА - 45% и эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота - 10%.
Осветленные суспензии рота-, коронавирусов объединяли в равных соотношениях. Затем добавляли 40%-ный формалин (с содержанием активного формальдегида 37-38%) из расчета 0,5 см3 на 100 см3 суспензии, перемешивали и оставляли на сутки при комнатной температуре. После этого проводили проверку на бактериальную и грибковую контаминацию.
Для получения бактериальной массы E.coli использовали мясо-пептонный агар (для штаммов «ПЛ-6» и «УК-2») и среду Минка (для штамма «КВ-1»), для получения анатоксинов - бульон Хоттингера. Инактивацию бактериальной взвеси и токсинов осуществляли формалином при температуре 37-38°С.
Вакцину готовили из рота-, коронавирусных антигенов (с содержанием белка не менее 10-12 мг/см3), взятых в равных соотношениях по 390 см3 на 1000 см3 вакцинного препарата, к ним добавляли 100-120 млрд. суспензию E.coli по 20 см3 и осажденную взвесь ТС-, ТЛ-анатоксинов — 60 см3, а также 6%-ный гель гидроокиси алюминия — 10 см3 на 1000 см3 вакцинного препарата. Все тщательно перемешивали и сливали в ёмкость для расфасовки.
Контроль готовой продукции проводили по физическим показателям, стерильности, безвредности, остаточной вирулентности, антигенной и иммуногенной активности. При этом установили, что все экспериментальные серии вакцины были стерильны, безвредны, не обладали реактогеностью и остаточной вирулентностью.
Антигенную активность каждой серии ассоциированной вакцины контролировали на трех кроликах массой 2,5-3,0 кг, которым подкожно, двукратно с интервалом 14 дней, вводили препарат в дозе 2 см3. При этом
установили, что ассоциированная вакцина обладает высокой антигенной активностью по каждому составляющему компоненту, что указывает на совместимость ее антигенного состава: через 14 дней после 2-ой вакцинации титры специфических антител в сыворотке крови вакцинированных кроликов составили к ротавирусу 7,4±0,27 log2 в РН, коронавирусу - 7,6±0,27 log2 в РИГА, Е. coli - 8,2±0,22 - 8,8+0,22 в РА.
Проводили определение прививной дозы ассоциированной вакцины для супоросных свиноматок. Опыты проводили на 20 супоросных свиноматках, разделенных на 4 группы по 5 голов в каждой. Свиноматок 1-ой группы вакцинировали подкожно в области средней трети шеи двукратно с интервалом 14 дней в дозах 5 и 5 см3, 2-ой группы - в дозах 7 и 7 см , 3-ей группы — в дозах 10 и 10 см3,4-ой группы - в дозах 10 и 15 см3. На 14-й день после второй вакцинации от животных брали кровь и проводили определение в ее сыворотке титров специфических антител к рота-, коронавирусам и Е. coli. При этом установили, что наиболее высокие их титры наблюдаются у животных 4-ой групп на 14-й день после второй вакцинации: к ротавирусу 10,64±0,35 log2 коронавирусу 6,92±0,27 log2 эшерихиям коли 7,32±0,0 - 8,92±0,27 log2. У животных 3-ей группы титры антител были чуть ниже, чем у животных 4-ой группы, но эта разница была не достоверна. У животных 1-ой и 2-ой групп титры антител к рота-, коронавирусам и Е. coli были достоверно ниже, чем у животных 3-ей и 4-ой групп.
Таким образом, установили, что оптимальной прививной дозой для двукратной вакцинации супоросных свиноматок является 5 и 10 см с интервалом 14 суток.
Изучение антигенной и иммуногенной активности ассоциированной вакцины проводили в экспериментальных условиях в виварии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» на 10 супоросных свиноматках, разделенных по принципу аналогов на две группы - опытную и контрольную по 5 голов в каждой. Животным опытной группы препарат вводили двукратно за 30 и 15 дней до опороса в дозах для первой прививки 5 см3, для второй — 10 см3; животным контрольной группы вакцина не вводилась. Контрольное заражение поросят, полученных от вакцинированных и интактных свиноматок, проводили через 24 ч после рождения. С этой целью поросятам перорально вводили смесь культуральных вирусных суспензий: ротавируса штамма «Пугачевский-92» с титром 107'0 ТЦД50/см3, вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней штамма «ВГНКИ № 5» с титром Ю7,0 ТЦЦ50/см3 в количестве 5 см3, и одновременно энтеропатогенные штаммы E.coli, продуцирующие адгезивные антигены К88, К99 и 987Р по 5 млрд, микробных клеток каждой.
Результаты исследования сывороток крови и молозива свиноматок на содержание специфических антител представлены в таблице 6. Из нее видно, что ассоциированная вакцина обладает высокой антигенной активностью. Содержащие в ассоциированной вакцине антигены не проявляют
конкурентного действия по отношению друг к другу, что указывает на совместимость ее антигенного состава.
Таблица 6 - Содержание специфических антител в сыворотке крови и молозиве свиноматок (М±ш, n=5, log2)
Группа Титр специфических антител
ротавирус (ИФА) вирус ТГС (РН) эшерихии (РА)
К 88 К 99 987Р
сыворотка крови
опытная контрольная 10,24±0,27 6,84±0,22 6,92±0,27 8,72±0,27 3,12±0,41 7,12±0,22 7,52±0,22 2,92±0,27
молозиво
опытная контрольная 11,04±0,27 8,04±0,27 7,12±0,22 8,92±0,27 5,72±0,27 7,52±0,41 7,92±0,27 5,32±0,35
Иммуногенные свойства вакцины оценивали по результатам сохранности поросят опытной и контрольной групп после контрольного заражения. Заражению подвергались 11 поросят, полученных от вакцинированных свиноматок, и 14 - от интактных. При этом установили, что ассоциированная вакцина обладает высокой иммуногенной активностью. Так, в группе поросят, полученных от вакцинированных свиноматок, сохранность составила 90,9%, тогда как в контрольной группе - лишь 42,9%.
Производственное испытание экспериментальных серий вакцины проводили в совхозе «Звениговский» Звениговского района Республики Марий Эл, СХПК «Татарстан» Балтасинского и совхозе «Кощаковский» Пестречинского районов Республики Татарстан и ООО «Турсагалка» Аургазинского района Республики Башкортостан, стационарно неблагополучных по рота-, коронавирусному гастроэнтериту и эшерихиозной диареи новорожденных поросят. Вакцинацию супоросных свиноматок проводили двукратно за 30-35 и 15-20 сут до опороса внутримышечно в области средней трети шеи в дозах 5 см для первой прививки и 10 см3 — для второй.
Всего вакцинировали 1145 супоросных свиноматок. Установили, что введение вакцины не оказывает существенного влияния на общее состояние привитых животных. На месте введения препарата иногда наблюдалась местная реакция в виде припухлости размером с лесной орех, которая исчезала в течение 2-4 недель. Результаты исследований представлены в таблице 7. Из данных этой таблицы видно, что в группах новорожденных поросят, полученных от вакцинированных свиноматок, заболеваемость составила 30,6%, сохранность - 92,6%, тогда как в группах поросят, полученных от невакцинированных свиноматок, эти показатели составили 80,6 и 70,9% соответственно.
Таблица 7 — Эффективность применения вакцины в хозяйствах, неблагополучных по рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят
Группа Количество Получено Заболеваемость Сохранность
животных, гол. поросят, гол. кол-во % кол-во %
С-з "Звениговский " Звениговского района РМЭ
опытная 400 3412 1464 42,9 3106 91,1
контрольная 150 1185 967 81,6 819 69,1
С-з "Кощаковский" Пестречинского района РТ
опытная 200 1860 493 26,5 1798 96,6
контрольная 100 957 735 76,8 698 72,9
СХПК "Татарстан" Балтасинского района РТ
опытная 345 2750 649 23,6 2572 93,5
контрольная 290 2385 2078 87,1 1765 74,0
ООО «Турсагалка» Аургазинского района РБ
опытная 200 1729 380 21,9 1552 89,7
контрольная 200 1755 1284 73,2 1175 66,9
Итого:
опытная 1145 9751 2986 30,6 9028 92,6
контрольная 740 6282 5064 80,6 4457 70,9
Таким образом, вакцинация супоросных свиноматок ассоциированной вакциной против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи обеспечивает в стационарно неблагополучных хозяйствах высокую сохранность новорожденных поросят за счет выработки у них пассивного колостральногх» иммунитета через молозиво матерей. Применение ее с профилактической целью позволило снизить заболеваемость новорожденных поросят в стационарно неблагополучных хозяйствах в 2,6 раза и тем самым повысить их сохранность на 21,7%.
На основании результатов исследований для внедрения в ветеринарную практику предложена «Вакцина против рота-, коронавирусного гастроэнтерита (ТГС) и эшерихиозной диареи новорожденных поросят» (Патент РФ на изобретение № 2137499, приоритет от 25.11.1998 г.). Разработаны нормативные документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение данной вакцины.
2.5 Разработка полиспецифической лечебно-профилактической сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят
Отработку схемы гипериммунизации проводили на 3 группах свиней по 10 голов в каждой. Гипериммунизацию проводили согласно схемам, приведенным в таблице 8. При этом антигены вводили внутримышечно в область шеи: с одной стороны эшерихиозный антиген, с другой - вирусный.
Таблица 8 — Схемы гипериммунизации свиней-продуцентов рота-, коронавирусными и эшерихиозными антигенами
Срок иммунизации, сут Схема иммунизации
1 2 3
доза антигена, см3 доза антигена, см"1 доза антигена, cmj
вирусного эшери-хиоз-ного вирусного эшери-хиоз-ного вирусного эшери-хиоз-ного
1 3 4,5 4 6 6 9
14 4 6 6 9 8 12
28 6 9 8 12 10 15
42 8 12 10 15 12 18
Для гипериммунизации использовали инактивированные рота-, коронавирусные антигены в культуральной среде, антигены E.coli, содержащие соматические и адгезивные антигены (К88, К99, 987Р) в физиологическом растворе, ТЛ-, ТС-анатоксины E.coli в среде культивирования (бульон Хоттингера) при следующем соотношении их компонентов в двух различных иммуногенах (в 1 л антигена):
1. Вирусный антиген:
- антиген ротавируса свиней с содержанием специфического белка 10-12 мг/см3, см3 - 490,0 - 500,0;
- антиген коронавируса (ТГС) свиней с содержанием специфического белка 10-12 мг/см3, см3 -490,0 - 500,0;
- формалин, см3 - 4,0 - 5,0.
2. Эшерихиозный антиген:
- соматический и адгезивный антиген К88 с концентрацией 10-15 млрд. м.к. в 1 см3, см3 - 230,0 -250,0;
- соматический и адгезивный антиген К99 с концентрацией 10-15 млрд. м.к. в 1 см3, см3 - 230,0 - 250,0;
- соматический и адгезивный антиген 987Р с концентрацией 10-15 млрд. м.к. в 1 см3, см3 - 230,0 - 250,0;
- формалин, см3 - 4,0 - 5,0;
- ТС- и ТЛ-анатоксины штаммов E.coli К88, К99 и 987Р в соотношении 1:1:1 с титрами в РДП 1:8- 1:16, л-до 1.
Титры специфических антител в сыворотках крови, полученных при иммунизации разными схемами, представлены в таблице 9.
Таблица 9 - Титры специфических антител в сыворотках крови, полученных разными схемами гипериммунизации (log2, M±m, n=10, P<0,05(*))__
Антиген Метод исследования Титр специфических антител
схема №1 схема №2 схема №3
Ротавирус ИФА 13,13±0,35 13,64±0,40* 13,64±0,22*
Вирус ТГС ИФА 13,13±0,49 13,64±0,28* 13,64±0,28*
E.coli К88 РА 12,13±0,20 12,64±0,28* 12,49±0,40
E.coli К99 РА 11,13±0,22 11,64±0,40* 11,49±0,16
E.coli 987Р РА 11,13±0,29 11,64±0,40* 11,49±0,35
ТЛ-токсин РДП 2,58±0,10 3,00±0,28* 2,58±0,22
ТС-токсин РДП 2,58±0,16 3,00±0,49* 2,58±0,35
Из данных таблицы 9 следует, что наиболее оптимальной является 2-ая схема гипериммунизации свиней-продуцентов, которая позволяет получать гипериммунную сыворотку с наиболее высокими титрами специфических антител: к ротавирусу - 13,64 1о§2, коронавирусу — 13,64 1о§2, Е.соИ К88 -12,64 1оя2, Е.соИ К99 - 11,64 1оц2, Е.соИ 987Р - 11,64 1о& и к ТЛ-, ТС-токсинам Е.соИ - 3,0
С применением 2-й схемы гипериммунизации изготовлены 5 серий полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят. Каждую серию сыворотки проверяли на стерильность, безвредность и содержание специфических антител. Установлено, что все экспериментальные серии сыворотки были стерильны, безвредны, содержали специфические антитела в высоких титрах.
Определение " оптимальной лечебной и профилактической дозы гипериммунной сыворотки для поросят проводили в свиноводческом хозяйстве, стационарно неблагополучном по рота-, коронавирусному гастроэнтериту и эшерихиозной диареи поросят. Результаты исследований приведены в таблицах 10 и 11.
Таблица 10 - Результаты применения различных доз гипериммунной сыворотки с лечебной целью __
Группа Кол-во жив-х, гол Доза сыворотки, см3 Выздоровело Пало Сохранность, %
кол-во % кол-во %
опытная 12 10 9 75 4 33,3 66,7
12 15 И 91,7 2 8,3 91,7
12 20 11 91,7 2 8,3 91,7
контрольная 12 - 8 66,7 5 41,7 58,3
Из таблицы 10 видно, что применение сыворотки в дозах 15 и 20 см3 позволило вылечить 91,7% больных поросят. В то время как применение противоэшерихиозной сыворотки в сочетании с антибиотиками позволило
вылечить и сохранить лишь 58,3% поросят, что в 1,6 раза ниже, чем в опытной группе. При применении гипериммунной сыворотки в дозе 20 см3 у некоторых поросят через 30-40 мин после введения наблюдалось возбуждение, дрожь, рвота. Таким образом, оптимальной лечебной дозой сыворотки для новорожденных поросят признано 15 см3.
С целью определения оптимальной профилактической дозы полиспецифической сыворотки опыты проводили на новорожденных поросятах, разделенных на 2 группы. Животных опытной группы (48 гол.) разделили на 4 подгруппы по 12 голов в каждой, которым в первый день после рождения вводили гипериммунную сыворотку с профилактической целью в различных дозах (таблица 11). Поросятам контрольной группы сыворотку не вводили. За животными велось клиническое наблюдение в течение 45 дней.
Таблица 11 - Результаты применения различных доз гипериммунной сыворотки с профилактической целью
Группа Кол-во жив-х, гол Доза сыворотки, см3 Заболело Пало Сохранность, %
кол-во % кол-во %
опытная 12 3 6 50 3 25 75
12 5 4 33,3 2 16,7 83,3
12 7 2 16,7 1 8,3 91,7
12 10 3 25 1 8,3 91,7
контрольная 12 - 10 83,3 4 33,3 66,7
Данные таблицы 11 свидетельствуют о том, что гипериммунная сыворотка обладает выраженными профилактическими свойствами по отношению к рота-, коронавирусам и эшерихиям коли. Так, в группе поросят, обработанной гипериммунной сывороткой в дозе 5 см3, заболело 33,3%, пало 16,7% поросят; в группе поросят, обработанной сывороткой в дозе 7 см3, заболело 16,7%, пало 8,3% поросят, тогда как в контрольной группе заболело 83,3%, пало 33,3% поросят. Сохранность новорожденных поросят в группах, где применялась гипериммунная сыворотка в дозах 7 и 10 см , составила 91,7%, против 66,7% в контрольной группе, т.е. применение сыворотки с профилактической целью позволяло повысить сохранность новорожденных поросят на 25%. При увеличении дозы сыворотки до 10 см3 достоверного повышения ее эффективности не наблюдается, а при дозе 3 см3 — желаемый эффект не достигается.
Таким образом, оптимальной дозой сыворотки для профилактики рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных поросят является 7 см .
2.5.4 Испытание лечебно-профилактической эффективности полиспецифической гипериммунной сыворотки в производственных условиях
Производственное испытание опытных серий полиспецифической гипериммунной сыворотки проводили в 4-х свиноводческих хозяйствах (ООО «Агрофирма «Вамин-Аксу», ООО «Сосна», СХПК «Кама» Республики Татарстан " и ГСХП «Рощинский» Республики Башкортостан), неблагополучных по рота-, коронавирусному гастроэнтериту и эшерихиозной диареи поросят. Гипериммунную полиспецифическую сыворотку новорожденным поросятам вводили внутримышечно в область бедра с профилактической целью в дозе 7 см3, с лечебной целью в зависимости от тяжести болезни в дозе 10-15 см3. При этом суточную лечебную дозу сыворотки вводили дробно 2 раза с интервалом 5-6 часов. Всего за период проведения испытаний было обработано 2921 новорожденных поросят. При этом установили, что полиспецифическая гипериммунная сыворотка обладает выраженными лечебно-профилактическими свойствами. Так, например, в группе поросят, обработанной полиспецифической сывороткой, заболело 22,5%, пало 5,7% поросят, тогда как в контрольной (интактной) группе эти показатели составляли 82,6% и 31,2%, соответственно. При этом сохранность поросят в опытной группе составляла 94,3% против 68,8% в контрольной группе. Применение сыворотки в лечебных дозах позволяло вылечить 87,6% больных поросят, тогда как в контрольной группе, где применяли для лечения только антибиотики, сохранность поросят составляла лишь 67,6%, что в 1,3 раза ниже, чем в опытной группе.
Таким образом, использование полиспецифической гипериммунной сыворотки в производственных условиях позволяет добиваться высокой экономической эффективности при лечении и профилактике смешанной рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят.
На основании результатов исследований для внедрения в ветеринарную практику предложена «Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят» (Патент РФ № 2456998 от 15.12.2010 г.). Разработаны нормативные документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение полиспецифической гипериммунной сыворотки.
2.6 Разработка технологии изготовления, методов контроля и применения ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1
2.6.1 Этиологическая структура инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого в отдельных регионах РФ
Проведено изучение этиологической структуры и клинико-эпизоотологических аспектов инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в 128 хозяйствах Республики Татарстан,
12 - Республик Башкортостан и Удмуртия, 3 - Челябинской и 1 - в Тверской областях, что позволило выявить особенности возникновения, развития и проявления болезни, а также установить степень ее распространения.
Энзоотии инфекционного кератоконъюнктивита мы наблюдали в животноводческих комплексах как с большой, так и с маленькой плотностью поголовья крупного рогатого скота. Обычно заболевание начиналось весной, достигало максимума в июле-августе месяцах и к концу октября постепенно уменьшалось. В летние месяцы заболеваемость среди телят 2-4-мес возраста достигала 50-85%, откормочного поголовья - 20-25% и среди дойного стада-в пределах 12-15%.
Клинически в начале у телят наблюдалось опухания век, покраснение конъюнктивы, слезотечение. Через 4-5 дней на роговице появлялись небольшие сероватые очаги помутнения, а на 6-10 день в ее центре развивалась эрозия диаметром около 1 мм, которая вскоре превращалась в язву. Стадия изъязвления сопровождалась сильным беспокойством животных, повышением температуры тела до 41°С и отказом от корма. Помутнение роговицы быстро распространялось во всех направлениях от язвы. В течение последующих 10-15 дней по краю очага поражения появлялось развитие сосудистой сети, а в отдельных, особо тяжелых случаях, она окружала всю роговицу по периферии, формируя красный ободок. Эти изменения приводили к утолщению роговицы и утере ее прозрачности.
Среди дойного стада и молодняка 6-10-мес возраста, находящегося на откормочных площадках, наблюдалась деформация глазного яблока в виде кератоконуса или кератоглобуса. У 10-15% телят все слои роговицы в результате ее изъязвления перфорировались и стекловидное тело с хрусталиком вытекало через это отверстие, • что приводило к одно- или двухсторонней слепоте.
В неблагополучных по ИКК хозяйствах проводилась работа по выделению возбудителя болезни. С этой целью от больных животных с помощью стерильных тампонов собирали серозно-гнойные истечения с поверхности глазного яблока, конъюнктивальных мешков и из пространства под третьим веком, а также брали пробы крови для серологических исследований. Лабораторные исследования включали в себя микроскопические исследования образцов патологического материала, посев их на специальные плотные и жидкие среды для изолирования возбудителя болезни, а также исследования для исключения кератоконъюнктивита инвазионного (телязиоз) характера. В результате были выделены гемолитические штаммы бактерий Moraxella bovis - возбудителя ИКК крупного рогатого скота. Кроме того, во многих хозяйствах у животных при серологическом исследовании выявляли антитела к вирусу инфекционного ринотрахеита - герпесвирусу типа 1. В отдельных хозяйствах инфекционный процесс часто осложнялся сопутствующей условно-патогенной микрофлорой: стафилококками, стрептококками, E.coli, протеем, сенной палочкой и др.
Нами получены 244 изолята микроорганизмов, по морфологическим и культуральным свойствам сходные с возбудителем ИКК - бактериями Moraxella bovis. Сравнительное изучение их основных биохимических свойств, антигенного их родства с референтными штаммами бактерий Moraxella bovis (ATСС 10900, АТСС 17947 и АТСС 17948), полученными из Американской национальной коллекции микроорганизмов, позволили идентифицировать их как бактерии Moraxella bovis, относящиеся к семейству Neisseriaceae. На штамм "Г97-ВНИВИ" бактерий Moraxella bovis, выделенного от теленка с признаками острого кератоконъюнктивита, получен Патент РФ на изобретение № 2145353 (приоритет от 15.09.1998).
В последние годы установлено, что инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота может быть вызван другими представителями рода Moraxella, в частности бактериями Moraxella bovoculi. Инфекционный кератоконъюнктивит, вызванный бактериями Moraxella bovoculi, мы наблюдали в совхозе-техникуме Чистопольского района Республики Татарстан. Клинические признаки болезни были сходны с таковыми при поражении бактериями Moraxella bovis. При бактериологическом исследовании смыва из конъюнктивального мешка глаза теленка 7-месячного возраста с признаками острого кератоконъюнктивита выделены гемолитические штаммы бактерий, идентифицированные в дальнейшем как бактерии Moraxella bovoculi. Результаты изучения морфологических, культурально-биохимических, серологических и биологических свойств выделеного штамма позволили депонировать его во Всероссийской государственной коллекции штаммов микрооранизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГБУ «ВГНКИ») под регистрационным номером: «Штамм Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № -ДЕП» инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота». На штамм получен Патент РФ на изобретение №2521651 от 12.05.2014 г., он признан производственным и предназначен для изготовления вакцины против ИКК КРС и диагностикумов.
2.6.2 Разработка технологии изготовления ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1
При изготовлении ассоциированной вакцины использовали два штамма бактерий Moraxella bovis: запатентованный штамм «Г97-ВНИВИ» (Патент РФ на изобретение № 2145353) и штамм «ШЗ-01», выделенные от больных инфекционным кератоконъюнктивитом телят, а также штамм «ТКА-ВИЭВ-В2» герпесвируса типа 1.
Для получения биомассы бактерий Moraxella bovis в качестве питательной среды использовали МПА, содержащий 10% дефибринированной крови барана. Инактивацию бактериальной взвеси осуществляли формалином. Герпесвирус крупного рогатого скота
культивировали в перевиваемой культуре клеток трахеи эмбриона коровы (линия TR).
2.6.3 Лабораторный регламент изготовления ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота
Вакцину готовили из антигена штамма «ТКА-ВИЭВ-В2» герпесвируса типа 1 с инфекционным тиром 107'°"7'5TUZWcm3, а также 2-х производственных штаммов бактерий Moraxella bovis: «Г97-ВНИВИ» и «ШЗ-01». Ассоциированная вакцина содержала следующие компоненты в 1 л:
- антиген герпесвируса типа 1, шт. «ТКА-ВИЭВ-В2» в культурапьной среде с инфекционным титром Ю7,0"7'5 ТЦД5о/смз — 780-830 см ;
- суспензия клеток штамма бактерий Moraxella bovis «Г97-ВНИВИ»^на физиологическом растворе с концентрацией 100-120 млрд. м.к. в 1 см -40-50 см3;
- суспензия клеток штамма бактерий Moraxella bovis «ШЗ-01» на физиологическом растворе с концентрацией 100-120 млрд. м.к. в 1 см — 40-50 см3;
- гидроокись алюминия, 6%-ная, см — 90,0-100,0;
- формалин, см3 — 4,0-5,0.
Каждую серию вакцины проверяли на стерильность, безвредность и антигенную активность. Установлено, что все экспериментальные серии вакцины были стерильны, безвредны, не обладали остаточной вирулентностью.
Антигенную активность вакцины контролировали путем двукратного введения вакцины кроликам живой массой 2,5-3,0 кг в дозе 2 см . Установлено,- что наивысший уровень специфических антител в ИФА у кроликов наблюдается в сыворотке крови на 14 день после второй вакцинации и достигают они к бактериям Moraxella bovis до 11,04 ± 0,57 -13,64 ± 0,00 Iog2, к герпесвирусу типа 1 - до 9,72 ± 0,27 log2.
Определение прививной дозы ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита проводили на молодняке крупного рогатого скота 3-х возрастных групп: 1-6; 6-12 и 14-18-месяцев. Для каждой возрастной группы испытывали три дозы вакцины. Вакцинацию проводили подкожно в среднюю треть шеи двукратно с интервалом в 14^ дней. Животным 1-ой группы вводилась вакцина в дозах 1,5; 3,0 и 4,5 см , 2-ой группы - 2,5; 5,0 и 7,5 см3, 3-ей группы - 5,0; 10,0 и 15,0 см . После применения вакцины у животных не наблюдалось ухудшения общего состояния и повышения температуры тела. На месте введения препарата наблюдалось незначительное повышение местной температуры и образование небольшой припухлости, которая исчезала в течение двух недель. При исследовании сывороток крови, полученных на 14-й день после второй вакцинации, наиболее высокие титры специфических антител наблюдались у животных 3-ей группы. У животных 2-ой группы титры антител были чуть ниже, чем у животных 3-ей группы, однако, эта разница
была статистически не достоверна. У животных 1-ой группы титры антител были достоверно ниже, чем у животных 2-ой и 3-ей групп.
Таким образом, оптимальными прививными дозами вакцины признаны для телят 1-6 мес возраста — Зсм3, молодняка 6-12 мес возраста — 5 см3 и молодняка старше 12 мес и взрослого поголовья — 10 см3.
Исследования по изучению антигенной активности вакцины проводили на телятах в условиях учебно-опытного хозяйства КГАВМ на телятах 6-8-мес возраста. Вакцину вводили подкожно в среднюю треть шеи двукратно с интервалом 14 дней в дозе 5см3 . Взятие крови осуществляли перед вакцинацией и далее каждые 7 дней из ярёмной вены. Результаты исследования сыворотки крови телят на содержание специфических антител представлены в таблице 12.
Таблица 12 - Уровень специфических антител к антигенам бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1 в сыворотке крови вакцинированных телят (log2, М ± ш, п = 5)
Срок исследования, сут Титр антител в ИФА к антигену
Moraxella bovis, шт. «Г97-ВНИВИ» Moraxella bovis, шт. «ШЗ-01» герпесвируса типа 1
До вакцинации - - 4,79±2,19
Через 7 дней после первой вакцинации 8,64±0,35 8,84±0,41 7,72±0,44
Через 14 дней после первой вакцинации 12,04±0,67 12,64±0,00 9,72±0,27
Через 7 дней после второй вакцинации 13,44±0,22 13,04±0,27 10,32±0,00
Через 14 дней после второй вакцинации 13,24±0,27 12,84±0,41 9,72±0,44
Из данных таблицы 12 видно, что максимальный уровень специфических антител в сыворотке крови вакцинированного молодняка крупного рогатого скота достигается на 7 день после второй вакцинации и составляет в ИФА к бактериям Moraxella bovis шт. «Г97-ВНИВИ» -13,44±0,22 log2, к шт. «ШЗ-01» - 13,04±0,27 log2, герпесвирусу типа 1 -10,32±0,00 log2.
Определяли также количество Т- и B-лимфоцитов в периферической крови вакцинированных животных. Результаты исследований представлены в таблице 13. Из этой таблицы видно, что после каждого введения вакцины у животных наблюдается достоверное увеличение процентного соотношения Т- и В-лимфоцитов.
Следовательно, после вакцинации у животных происходит активизация как гуморальных, так и клеточных факторов иммунитета.
Таблица 13 - Уровень Т- и В- лимфоцитов в крови животных, вакцинированных ассоциированной вакциной, % (М ± т, п = 5, р<0,05(*))
Показатель Кролики Крупный рогатый скот
Т- В- Т- В-
До вакцинации 53,90±0,92 16,82±0,42 54,50±0,39 17,00±0,39
После 1-ой вакцинации 57,10±0,54* 21,40±0,48* 56,20±0,51 20,00±0,51*
После 2-ой вакцинации 59,20±0,67* 24,90±0,48* 59,40±0,59* 25,22±0,72*
2.6.4 Оценка эффективности применения ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в производственных условиях
Производственное испытание ассоциированной вакцины проводили в скотоводческих хозяйствах республик Башкортостан, Марий Эл, Татарстан, Удмуртия, Чувашия, а также Самарской, Челябинской, Тверской областей. Вакцину применяли с профилактической целью в угрожаемых и стационарно неблагополучных хозяйствах по инфекционному кератоконъюнктивиту крупного рогатого скота. При этом вакцинировали весь нарождающийся молодняк в возрасте 30-35 дней независимо от времени года, а также все поголовье крупного рогатого скота перед выгоном на пастбище. Вакцину вводили подкожно в среднюю треть шеи, двукратно с интервалом 21-30 дней в дозах: телятам в возрасте от 1 до 6 мес - 3 см3; молодняку в возрасте от 6 мес до года — 5 см3; молодняку старше года и коровам - 10 см . Результаты производственного испытания вакцины в хозяйствах республик Татарстана и Башкортостана приведены в таблицах 14 и 15. Из данных таблиц 14 и 15 видно, что в неблагополучных хозяйствах до применения вакцины заболеваемость телят до 6-мес возраста составляла 24-56%, молодняка до 12-мес возраста - 19-65% и молодняка старше года и взрослого поголовья -4-22%. Применение ассоциированой вакцины с профилактической целью позволило в 8 хозяйствах из 14 полностью искоренить болезнь, а в остальных - снизить заболеваемость до минимума.
Таблица 14 - Эффективность применения ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Татарстан___
Хозяйство Количество крупного рогатого скота, гол. Заболеваемость, %
до применения вакцины после применения вакцины
телята до 6 мес позраста молодняк до 12 мес возраста молодняк старше 12 мес возраста и коровы телята до 6 мес возраста молодняк до 12 мес возраста молодняк старше 12 мес возраста и коровы
СПХК "Девятовское" 1319 35-45 28 16 3-4 - -
КХ "Каипское" 173 38 35 8 - - -
ТНВ "Вафин и К" 1148 32 27 13 - - -
ОАО "Нарманка" 2560 56 34 22 - - -
КХ "Спектр" 213 24 • 19 14 - - -
ООО "Идель" 884 38 32 19 - - -
СХПК им. Вахитова 2970 35-50 25-27 10-15 2-3 2 -
"Учхоз КГАВМ" 1198 40-45 20-25 10-12 2-3 - -
ООО им. Ленина 4506 32 65 14 3 5 -
А/ф «Камско-Устьинская» 1476 18 47 12 4 7 -
СХПК «Енали» 3795 36 58 8 - - -
Таблица 15 - Эффективность применения ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в хозяйствах Дюртюлинского района Республики Башкортостан
Хозяйство Поголовье, гол Заболеваемость животных, % Вынужденная выбраковка и гибель животных, голов
до применения вакцины после применения вакцины до применения вакцины после применения вакцины
телята до 6 мес молодняк от б до 12 мес животные старше года телята до 6 мес молодняк от 6 до 12 мес животные старше года телята до 6 мес молодняк от 6 до 12 мес животные старше года телята до 6 мес молодняк от 6 до 12 мес животные старше года
СПК-колхоз им. Н.Наждми 1393 26 42 8 3 6 14 19 — 3
СПК-колхоз им. Кирова 1600 30 36 10 2 12 15
СПК-колхоз им. Калинина 659 18 39 12 — 14 — ■ —
СХПК «Уныш» 1307 25 47 13 вакцина не применялась 7 21 - вакцина не применялась
СПК-племхоз «Россия» 1560 9 20 4 - 18 2
За период с 2000 по 2013 гг. в условиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» изготовлено 136 серий ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в количестве более 20 тыс. литров, которые использованы в широком производственном опыте с положительными результатами в хозяйствах республик Башкортостан, Марий Эл, Татарстан, Удмуртия, Чувашия, а также Воронежской, Курганской, Ленинградской, Московской, Самарской, Саратовской, Тверской, Челябинской областей. Вакцинация обеспечила снижение заболеваемости животных инфекционным кератоконъюнктивитом в среднем в 16 раз, что привело к значительному сокращению экономического ущерба.
На основании проведенных исследований разработана и внедрена в ветеринарную практику РФ «Вакцина ассоциированная против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа I» (регистрационный № ПВР-1-4.7/02047 от 04.05.2008 г., сертификат соответствия № РОСС Яи.ФВ01.Н23235, Патент РФ на изобретение № 2264227, приоритет от 24.02.2004 г.). Разработаны нормативные документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение данного биопрепарата, которые утверждены директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласованы зам. руководителя Россельхознадзора и директором ФГБУ «ВГНКИ».
2.7 Разработка «Набора препаратов для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)»
В связи с тем, что в Российской Федерации не существуют методы серологической диагностики инфекционного кератоконюнктивита крупного рогатого скота, перед нами была поставлена задача - разработать тест-систему для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа, предназначенную для серологической диагностики болезни и иммунологического мониторинга вакцинированного поголовья крупного рогатого скота.
При разработке ИФА нами изысканы способы получения специфических компонентов данной тест-системы: антигена и гипериммунной сыворотки к бактериям Moraxella bovis. При этом антиген получили путем ультразвуковой дезинтеграции бактерий Moraxella bovis на ультразвуковом дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 кНг±500Гц в течение 10 мин. Полученный при этом режиме клеточный экстракт обладал выраженными антигенными свойствами в реакции ИФА. Данный белковый антиген бактерий Moraxella bovis не реагировал с гетерогенными гипериммунными сыворотками (сальмонеллезной, эшерихи-озной, туберкулезной), тогда как с гомологичными сыворотками (гипериммунной, а также сыворотками, полученными от больных и вакцинированных против ИКК животных) давал положительную реакцию в высоких титрах (1:1280-1:5120), что свидетельствует о его специфичности.
Провели исследования по изысканию оптимальной схемы иммунизации кроликов и крупного рогатого скота для получения гипериммунной сыворотки к бактериям Moraxella bovis. Животных гипериммуцизировали трехкратно антигенами бактерий Moraxella bovis в нарастающих дозах с интервалом 7 и 14 дней. При этом установили, что оптимальной схемой получения положительной сыворотки крови к бактериям Moraxella bovis является трехкратное введение антигена с интервалом 7 дней для кроликов и 14 дней - для крупного рогатого скота.
Проводили исследования по подбору оптимальных условий проведения реакции: определение температуры и времени инкубации специфических компонентов тест-системы в лунках полистироловых планшет, определение сенсибилизирующей дозы антигена, подбор оптимальных разведений контрольных сывороток.
Установлено, что оптимальным режимом постановки ИФА при определении специфических антител к бактериям Moraxella bovis является использование специфического антигена для сенсибилизации полистироловых планшет в концентрации 2,5 мкг/см3 при температуре 4°С в течение 18 ч и экспозиции исследуемых сывороток в течение 60 мин при температуре 37°С.
На основе результатов исследований разработан «Набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis в сыворотке крови крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа». Межлабораторным комиссионным испытанием в условиях лаборатории по изучению болезней молодняка ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» установлено, что разработанная тест-система по своим характеристикам соответствует своему назначению, сопоставим с методом аналогичной направленности и может быть рекомендован для проведения широких производственных испытаний.
Проведено производственное испытание тест-системы с использованием сывороток крови крупного рогатого скота, доставленных из различных регионов РФ, неблагополучных по инфекционному кратоконъюнктивиту. Установлено, что специфические антитела к бактериям Moraxella bovis в ИФА обнаруживаются у 89,2-95,4% вакцинированных против ИКК животных и 87,5-90,0% больных телят. При этом титры специфических антител у здоровых вакцинированных животных выявляются в разведениях 1:640-1:2560, у больных, не вакцинированных животных, в разведениях 1:160-1:1280. Исследования сывороток крови от не вакцинированных животных из благополучных по ИКК КРС хозяйств дали отрицательные результаты.
На основании результатов проведенных исследований предложен для внедрения в ветеринарную практику «Набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)». Разработаны нормативные документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение данной тест-системы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Установлено в регионах Среднего Поволжья и Предуралья широкое распространение заболеваний желудочно-кишечного тракта у молодняка крупного рогатого скота и свиней, обусловленных возбудителями вирусной и бактериальной природы, протекающие преимущественно в виде смешанных инфекций. В патологических материалах от телят чаще всего выделяются энтеропатогенные штаммы E.coli (89,7%), бактерии рода Streptococcus (30,9%), С/, perfringens (26,8%), Proteus vulgaris (17,5%), Klebsiella (7,2%), Pseudomonas aeroginosa (5,2%), коронавирусы (35,1%), ротавирусы (45,4%), герпесвирусы (28,8%); от поросят - энтеропатогенные штаммы E.coli (96,3%), бактерии Clostridium perfringens (18,21%), Proteus vulgaris (27,3%), Salmonella choleraesuis (16,4%), Streptococcus (9,1%), Haemophilus parasuis (5,5%), вирус трансмиссивного гастроэнтерита (34,5%) и ротавирус (50,9%).
2. Производственные штаммы вирусов и бактерий, используемые для изготовления ассоциированных вакцин и полиспецифических гипериммунных сывороток, по своим физико-химическим, антигенным и другими биологическими свойствами признаны типичными, соответствующими критериям их характеристик. Все штаммы депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ВГНКИ) и лаборатории музей штаммов микроорганизмов особо опасных болезней ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань).
3. Разработаны технологии изготовления, контроля и применения асоциированной вакцины и полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят. Ассоциированная вакцина рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят обладает выраженной антигенной и иммуногенной активностью. Двукратное применение ее индуцирует выработку специфических антител у крупного рогатого скота к антигенам ротавируса 9,50±0,29 log2 в ИФА, коронавируса -7,68±0,79 log2 в РТГА, герпесвируса - 9,00+0,00 log2 в ИФА и эшерихий -8,95±0,20 - 9,82±0,29 log2 в РА. Применение ее в стационарно неблагополучных хозяйствах позволило снизить заболеваемость с 90,4 до 33,1,%, смертность - с 29,6 до 9,0%, т.е. в 3,1 и 3,7 раза, соответственно. Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи обладает выраженными лечебно-профилактическими свойствами. Применение ее в стационарно неблагополучных хозяйствах по желудочно-кишечным болезням с профилактической целью способствует повышению сохранности новорожденных телят на 23,0%, с лечебной целью — на 29,2%.
4. Разработаны технологии изготовления, контроля и применения асоциированной вакцины и полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят. Двукратное применение вакцины индуцирует
выработку специфических антител у свиноматок в сыворотке крови к антигенам ротавируса - 10,24±0,27 log2 в ИФА, коронавируса - 6,92+0,27 log2 в РН, эшерихий - 7,12±0,22 - 8,72±0,27 log2 в РА; в молозиве, соответственно, 11,04+0,27 log2, 7,12±0,22 log2, 7,52+0,41 - 8,92+0,27 log2. Применение ее с профилактической целью способствует снижению заболеваемости новорожденных поросят в стационарно неблагополучных хозяйствах, в 2,6 раза и тем самым повышает их сохранность на 21,7%.
Гипериммунная сыворотка против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят обладает выраженными лечебно-профилактическими свойствами. Применение ее в стационарно неблагополучных хозяйствах способствует сокращению гибели новорожденных поросят в 3,2 раза, повышает их сохранность на 13,8%.
5. Изучена этиологическая структура инфекционного керато-конъюнктивита крупного рогатого скота в регионах Среднего Поволжья и Предуралья. Установлено, что заболеваемость телят в неблагополучных пунктах до 6-мес возраста составляет 24-56%, молодняка до 12-мес возраста — 19-65% и молодняка старше года и взрослого поголовья - 4-22%.
6. Разработана технология изготовления, контроля и применения ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1. Установлено, что вакцина обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью. Двукратное введение ее с интервалом 14 дней индуцирует у крупного рогатого скота выработку специфических антител к бактериям Moraxella bovis в сыворотке крови в титрах 13,04±0,27 - 13,44±0,22 log2, герпесвирусу типа 1 — 10,32±0,00 log2 , а также способствует увеличению содержания в периферической крови Т-лимфоцитов от 54,50±0,39 до 59,40±0,59, B-лимфоцитов от 17,0±0,39 до 25,22±0,72%. Применение ее с профилактической целью позволило в 8 хозяйствах из 14 полностью искоренить болезнь, а в остальных — снизить заболеваемость до минимума (до 1-3%).
7. Разработан «Набор препаратов для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovis в ИФА», предназначенный для серологической диагностики ИКК крупного рогатого скота, а также определения уровня поствакцинальных антител.
РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ
1. На основе проведенных исследований запатентованы и предложены для внедрения в ветеринарную практику следующие биологические препараты:
- Вакцина против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят;
- Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, корона-, герпесвирусов и Е. coli (А20, К99) новорожденных телят;
- Вакцина против рота-, коронавирусного гастроэнтерита (ТГС) и эшерихиозной диареи новорожденных поросят;
- Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, корона-вирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят;
- Вакцина ассоциированная против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят;
- Вакцина ассоциированная против инфекционного кератоконъюн-ктивита крупного рогатого скота на основе антигенов Moraxella bovis и герпесвируса типа 1;
- Набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа.
2. Разработаны: - нормативные документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение данных биологических препаратов.
Методические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Алипер Т.И. Инактивированная вакцина при трансмиссивном гастроэнтерите свиней (ТГС) / Т.И. Алипер, Е.А. Непоклонов, В.А. Сергеев // Ветеринария. - 2002. - № 8. - С. 18-21.
2. Байбиков Т.З. Эпизоотологический и серологический мониторинг некоторых вирусных болезней свиней в России / Т.З. Байбиков, С.А. Кукушкин // Проблемы экотоксикологического, радиационного и эпизоотологического мониторинга. — Матер. Всеросс. научн.-практ. конф. - Казань, 2005. - С. 245-252.
3. Байбиков Т.З. Полиштаммовая эмульсионная инактивированная вакцина ВНИЗЖ для профилактики трансмиссивного гастроэнтерита поросят / Т.З. Байбиков, О.С. Пузанкова, С.А. Кукушкин, A.M. Рахманов, A.C. Толокнов //Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. — Матер, межд. научн.-практ. конф. Воронеж, 2002. - С. 122-124.
4. Верховский O.A. Эффективность применения комбинированных инактивированных вакцин серии комбовак / O.A. Верховский // Матер, семинара: Современная ветеринарная защита крупного рогатого скота от инфекционных и инвазионных болезней. - М. - 2005. - С. 7-9.
5. Гаффаров Х.З. Моно- и смешанные инфекционные диареи новорожденных телят и поросят / Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, Е.А. Непоклонов и др. — Казань: Изд-во «Фэн», 2002. - 592 с.
6. Горковенко Н.Е. Острые кишечные расстройства новорожденных телят бактериальной этиологии / Н.Е. Горковенко, Ю.А. Макаров, A.M. Кузьменко, В.А. Серебряков // Труды ВИЭВ. - Т. 76. - М.: ВИЭВ, 2011. -С. 179-181.
7. Иванов A.B. Методические рекомендации по диагностике, профилактике и лечению желудочно-кишечных болезней новорожденных телят / A.B. Иванов, К.Х. Папуниди, М.Я. Тремасов, Х.Н. Макаев и др. // -Казань.-2011.-39 с.
8. Карайченцев В.Н. Диагностика инфекционного керато-конъюнктивита крупного рогатого скота, вызываемого Moraxella bovis / В.Н. Карайченцев // Актуальные проблемы эпизоотологии на современном этапе. - Матер, межд. научн.- практ. конф. - Санкт-Петербург. - 2004.
- С. 48-49.'
9. Лисицын В.В. Вакцинопрофилактика диареи новорожденных телят рбта-, коронавирусной этиологии / В.В. Лисицын, Т.Б. Никитина, В.В. Думова и др. // Российский ветеринарный журнал. - 2006. - № 3. -С. 1618.
10. Мищенко В.А. Меры борьбы с диареями новорожденных телят /
B.А. Мищенко, H.A. Яременко, Д.К. Павлов и др. // Ветеринария с.-х. животных. - 2008.-№3,-С. 1821.
11. Пирожков М.К. Диагностика, специфическая профилактика и лечение при бактериальных болезнях животных / М.К. Пирожков,
C.B. Ленев, Е.В. Викторова и др. // Ветеринария. - 2011. - № 1. - С. 24-28.
12. Пузанкова О.С. Коронавирусные инфекции свиней / О.С. Пузанкова, Т.З. Байбиков, С.А. Кукушкина // Практик. - 2006. - № 6. -С. 50-53.
13. Русалиев B.C. Бактериальные вакцины в свиноводстве / B.C. Русалиев, В.М. Гневашев, В.М. Прунтова // Ветеринария с.-х. животных.
— 2005. -№ 12.-С. 21-23.
14. Сергеев В.А. Вирусные гастроэнтериты свиней / В.А. Сергеев, Т.И. Алипер, Е.А. Непоклонов // Ветеринария с.х. животных. - 2006. — № 2. -С. 23-28.
15. Соколова Н.Л. Перспективы диагностики и специфической профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных животных / Н.Л. Соколова // Труды ВИЭВ. - Т. 75. - М.: ВИЭВ, 2010. - С. 112-114.
16. Тугаринов O.A. Колибактериоз (эшерихиоз) животных / O.A. Тугаринов, М.К. Пирожков, Ю.А. Малахов // Сб. науч. тр. - Т. 62. - М.: ВГНКИ, 2001.-С. 68-75.
17. Шахов А.Г. Этиологическая структура массовых желудочно-кишечных и респираторных болезней поросят в крупных специализированных хозяйствах / А.Г. Шахов, Ю.Н. Бригадиров, Л.Ю. Сашнина и др. // Практик. -2010. - № 1. - С. 42-45.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи, включенные в перечень научных изданий ВАК для опубликования результатов исследований 1. Романов Е.А. Эффективность ассоциированной вакцины против инфекционной диареи новорожденных телят / Е.А. Романов, Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов // Ветеринарный врач. - Казань. - 2000. -№ 1. - С.59-61.
2. Романов Е.А. Эффективность ассоциированной вакцины против диареи телят смешанной этиологии / Е.А. Романов, Х.З. Гаффаров, Е.Л. Матвеева, Г.Н. Спиридонов, И.Н. Залялов // Ветеринария. - М. — 2000. -№2. —С.18-20.
3. Гаффаров Х.З. Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят / Х.З. Гаффаров, М.А. Ефимова, Г.Н. Спиридонов, М.В. Шакиров // Ветеринарный врач. - Казань. - 2000. — № 3. - С. 31-37.
4. Спиридонов Г.Н. Ассоциированная вакцина против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят / Г.Н. Спиридонов, Х.З. Гаффаров, P.A. Салахутдинов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Т. 174. - Казань, 2003. - С.139-146.
5. Спиридонов Г.Н. Результаты экспериментального и производственного испытания ассоциированной вакцина против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят / Г.Н. Спиридонов, Х.З. Гаффаров, Е.А. Романов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Т. 174.-Казань, 2003.-С. 146-153.
6. Вапебная Л.В. Иммунобиологические свойства возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / Л.В. Вапебная, Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, Л.Ш. Дуплева, P.A. Салахутдинов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Т. 39. - Казань, 2003. - С. 178-183.
7. Иванов A.B. Этиология и патогенез инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / A.B. Иванов, Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, Л.В. Валебная, Л.Ш. Дуплева // Ветеринарный врач.
- Казань. - 2005. - № 4. - С. 22-27.
8. Литвинов О.Б. Новое решение проблемы защиты новорожденных телят и поросят от инфекционной диареи смешанной этиологии / О.Б. Литвинов, Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов // Ветеринарный врач.
- Казань. - 2005. - № 3. - С. 29-35.
9. Гаффаров, Х.З. Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота / Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, Л.В. Валебная, Г.Н. Спиридонов, Л.Ш. Дуплева, М.А. Ефимова // Ветеринария. — М. — 2007. -№ 12. — С.21-24.
10. Спиридонов Г.Н. Желудочно-кишечные заболевания новорожденных телят в условиях промышленных комплексов и разработка лечебно-профилактических мероприятий / Г.Н. Спиридонов // Ветеринарный врач. - Казань. - 2007. - № 3. - С. 26-29.
11. Гаффаров Х.З. Ассоциированная вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов,
Г.Н. Спиридонов, Л.Ш. Дуплева, Л.В. Валебная, М.А. Ефимова // Ветеринария. - М. - 2008. - № 5. - С. 18-22.
12. Спиридонов Г.Н. Результаты исследований по разработке вакцины против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят / Г.Н. Спиридонов // Ветеринарный врач. - Казань. -2010,-№2.-С. 40-43.
13. Махмутов А.Ф. Эффективность полиспецифической гипериммунной сыворотки при смешанных вирусно-бактериальных гастроэнтеритах новорожденных поросят / А.Ф. Махмутов, Г.Н. Спиридонов, Х.Н. Макаев // Ветеринария и кормление. - М. - 2010. - № 6. - С. 56-57.
14. Нургалиева А.Р. Получение биомассы бактерий Moraxella bovis в жидкой питательной среде / А.Р. Нургалиева, Г.Н. Спиридонов, Х.Н. Макаев, Л.В. Валебная // Ветеринария и кормление. - М. - 2010. - № 6.
- С. 54.
15. Саттарова Н.В. Разработка набора реагентов для определения специфических антител к бактериям Moraxella bovis иммуноферментным методом / Н.В. Саттарова, Г.Н. Спиридонов, Л.В. Валебная // Ветеринария и кормление. - М. - 2010. - № 6. - С. 55-56.
16. Махмутов А.Ф. Мониторинг инфекционных желудочно-кишечных заболеваний новорожденных поросят в регионах Среднего Поволжья и Предуралья / А.Ф. Махмутов, Г.Н. Спиридонов, Р.Н. Аглямов II Ветеринарный врач. - Казань.-2011.-№ 5-С. 25 - 28.
17. Махмутов А.Ф. Экономическая эффективность применения полиспецифической гипериммунной сыворотки при инфекционных диареях новорожденных поросят / А.Ф. Махмутов, А.И. Акмуллин, Г.Н. Спиридонов // Ученые записки Казанской государственной - академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2012.-Т. 209. -С. 207-211.
18. Спиридонов А .Г. Специфическая профилактика анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят /А.Г. Спиридонов, Х.Н. Макаев, Г.Н. Спиридонов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. -Казань, 2012. - Т. 209. - С. 284-289.
Патенты РФ на изобретения
1. Патент Российской Федерации. Ассоциированная вакцина против рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных поросят / Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, Ф.Ш. Хабибуллин, И.И. Латыпов, P.A. Салахутдинов; заявитель и патентообладатель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности».
- № 2137499; опубл. 20.09.99, Бюл. №26.
2. Патент Российской Федерации. Штамм бактерий Moraxella bovis «Г97-ВНИВИ», используемый для изготовления диагностикумов и вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, Ф.Ш. Хабибуллин, Л.В. Валебная;
заявитель и патентообладатель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». -№ 2145353; опубл. 10.02.2000, Бюл. №4.
3. Патент Российской Федерации. Ассоциированная вакцина против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят / Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, A.B. Иванов, Е.А. Романов, Ф.Ш. Хабибуллин; заявитель и патентообладатель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». -№ 2145236; опубл. 10.02.2000, Бюл. №4.
4. Патент Российской Федерации. Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, корона-, герпесвирусов и Е. coli (А20,К99) для локальной защиты и иммунотерапии смешанных форм диареи новорожденных телят / Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, М.А. Ефимова, В.В. Гусев; заявитель и патентообладатель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - № 2145504; опубл. 20.02.2000, Бюл. №5.
5. Патент Российской Федерации. Ассоциированная вакцина для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1 / Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, А.З. Равилов, P.A. Салахутдинов, Л.Ш. Дуплева, М.А. Ефимова; заявитель и патентообладатель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - № 2264227; опубл. 20.11.2005, Бюл. №32.
6. Патент Российской Федерации. Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят / A.B. Иванов, Г.Н. Спиридонов, A.A. Иванов, А.Ф. Махмутов, Х.Н. Макаев, А.Г. Спиридонов; заявитель и патентообладатель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - № 2456998; опубл. 27.07.2012, Бюл. №21.
7. Патент Российской Федерации. Штамм бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № -ДЕП», используемый для изготовления диагностикумов и вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / A.B. Иванов, Г.Н. Спиридонов, A.A. Иванов, Л.В. Валебная, Ю.В. Юсупова, А.Г. Спиридонов, А.Р. Нургалиева, Х.Н. Макаев; заявитель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - № 2521651; опубл. 10.07.2014, Бюл. № 19.
Основные статьи, опубликованные в журналах, материалах и сборниках конференций
1. Спиридонов Г.Н. Этиологическая структура колибактериозов телят и поросят в ТАССР и совершенствование мер борьбы / Г.Н. Спиридонов,
Х.З. Гаффаров, Е.И. Попов // Матер. 3-ей Всесоюз. конф. по эпизоотологии.
- Новосибирск. - 1991. - С.274-275.
2. Гаффаров Х.З. Ассоциированная вакцина для специфической профилактики рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят / ХЛ. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, М.З. Абдеева, P.A. Тазетдинова // Науч. 'основы технологии промыш. производства ветеринарных биологических препаратов.Матер. 5-ой Всеросс. конф.
- Щелково. - 1996. - С. 104.
3. Спиридонов Г.Н. Смешанные вирусо-бактериальные энтериты новорожденных поросят и закономерности их проявления. / Г.Н. Спиридонов, Р.К. Рафиков, Е.В. Пожидаева // Матер, научн.-произв. конф. по проблемам ветеринарии и животноводства. — Казань. — 1995.
- С. 63.
4. Гаффаров Х.З. Клинико-эпизоотологические особенности инфекционных диарей новорожденных телят и основные принципы их профилактики и лечения / Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, Ф.В. Елисеева, М.А. Ефимова и др. // Труды первого съезда вет. врачей РТ. - Казань. - 1995. -С. 163-167.
5. Спиридонов Г.Н. Смешанные вирусо-бактериальные энтериты новорожденных поросят и их специфическая профилактика / Г.Н. Спиридонов, Х.З. Гаффаров, Р.К. Рафиков, Е.В. Пожидаева // Труды первого съезда вет. врачей РТ. - Казань. - 1995. - С.269-272.
6. Гаффаров Х.З. Ассоциированная вакцина для специфической профилактики рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят / Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, М.З. Абдеева, P.A. Тазетдинова // Науч. основы технологии промышл. производства ветеринарных биологических препаратов. — Матер. 5-ой Всеросс. конф.
- Щелково. - 1996. - С. 104.
7. Гаффаров Х.З. Комплексная система специфической профилактики и иммунотерапии рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят / Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, М.З. Абдеева, М.А. Ефимова и др. // Проблемы инфекционных болезней молодняка с.-х. животных. - Матер. Всеросс. науч. конф. - Москва. - 1996. - С. 19-21.
8. Гаффаров Х.З. Эпизоотологические и этиологические аспекты инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / Х.З. Гаффаров, Д.Н. Миннахметов, Г.Н. Спиридонов и др. // Матер, межд. науч. конф., посвящ. 125-летию КГАВМ. - Казань. - 1998. - С. 29-31.
9. Спиридонов Г.Н. Иммунопрофилактика ротавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных поросят. / Г.Н. Спиридонов, И.И. Латыпов, Х.З. Гаффаров // Матер, межд. науч. конф., посвящ. 125-летию КГАВМ. - Казань. - 1998. - С. 81.
10. Спиридонов Г.Н. Экстренная профилактика и иммунотерапия смешанных форм инфекциолнной диареи новорожденных телят / Г.Н. Спиридонов, М.А. Ефимова, Ф.Ш. Хабибуллин, Х.З. Гаффаров и др. //
Матер, межд. науч. конф., посвящ. 125-летию КГАВМ. - Казань. - 1998. - С. 82-83.
11. Спиридонов Г.Н. Ассоциированная вакцина против рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных поросят / Г.Н. Спиридонов, Х.З. Гаффаров, И.И. Латыпов // Актуальные проблемы животноводства и ветеринарии. - Матер. Респуб. научн.-произв. конф.
- Казань. - 1999. - С. 47-48.
12. Спиридонов Г.Н. Иммуногенная активность ассоциированной вакцины против рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных поросят / Г.Н. Спиридонов, Х.З. Гаффаров // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. - Матер. Всеросс. научн.-практ. конф. - Щелково. - 2000. - С. 74-75.
13. Спиридонов Г.Н. Изучение антигенной и иммуногенной активности вакцины против рота-, коронавирусной (ТГС) и эшерихиозной диареи новорожденных поросят / Г.Н. Спиридонов // Методы повышения продуктивных и защитных функций организма животных в Республике Башкортостан. - Матер, регион, научн.-произв. конф. - Уфа. - 2000. - С. 210211.
14. Гаффаров Х.З. Специфическая иммунотерапия и профилактика смешанных форм инфекционной диареи новорожденных телят / Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, Е.А. Романов, М.А. Ефимова // Методы повышения продуктивных и защитных функций организма животных в Республике Башкортостан. - Матер, регион, научн.-произв. конф. - Уфа. -2000.-С. 92.
15. Спиридонов Г.Н. Разработка полиспецифической гипериммунной сыворотки против диареи новорожденных телят / Г.Н. Спиридонов, Х.З. Гаффаров, М.А. Ефимова // Современные проблемы животноводства.
- Матер, междун. конф., посвящ. 70-летию образования зооинже-нерного факультета. - Казань. - 2000. - С. 126-127.
16. Спиридонов Г.Н. Оценка иммуногенности вакцины против рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных поросят / Г.Н. Спиридонов, Х.З. Гаффаров // Современные проблемы животноводства.
- Матер, межд. конф., посвящ. 70-летию образования зооинженерного факультета. - Казань. - 2000. — С. 127-128.
17. Спиридонов Г.Н. Разработка ассоциированной вакцины против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят / Г.Н. Спиридонов, Х.З. Гаффаров, Е.А. Романов // Современные проблемы животноводства. - Матер, межд. конф., посвящ. 70-летию образования зооинженерного факультета. - Казань. - 2000. - С. 129-130.
18. Гаффаров Х.З. Система лечебно-профилактических мероприятий при смешанной инфекционной диареи новорожденных телят и поросят / Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, М.А. Ефимова // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. - Матер, межд. научн.-практ. конф.-Воронеж.-2002.-С. 187-188.
19. Гаффаров Х.З. Эффективность применения ассоциированной вакцины и полиспецифической гипериммунной сыворотки в качестве средств для пассивной профилактики и иммунотерапии инфекционных диарей новорожденных телят и поросят / Х.З.Гаффаров, Г.Н.Спиридонов, М.А. Ефимова, P.A. Сапахутдинов // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных. — Матер, межд. конф., посвящ. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. - 2003. - С. 427-432.
20. Гаффаров Х.З. Смешанные инфекционные диареи новорожденных поросят и их специфическая профилактика / Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, P.A. Сапахутдинов, А.Г. Кузнецов // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. - Матер, межд. научн.-прак. конф. - Щелково. - 2003. - С. 122-124.
21. Гаффаров Х.З. Биологические свойства бактерий Moraxella bovis — возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / Х.З.Гаффаров, Г.Н.Спиридонов, Л.В.Валебная, Л.Ш.Дуплева // Актуальные проблемы эпизоотологии на современном этапе. - Матер, межд. научн.-производ. конф. - С.-Петербург. - 2004. - С. 24-25.
22. Гаффаров Х.З. Ассоциированная вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / Х.З.Гаффаров, Л.Ш. Дуплева, Г.Н.Спиридонов и др. // Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее. — Матер, межд. научн.-производ. конф., посвящ. 80-летию ФГУП «Щелковский биокомбинат». - Щелково. - 2004. - С. 210-216.
23. Гаффаров Х.З. Решение проблемы защиты новорожденных телят и поросят от инфекционной диареи смешанной этиологии / Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, Г.Н. Спиридонов, М.А. Ефимова // Труды ГНУ «Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства РАСХН». - Ч. II. - Казань. - 2006. - С. 223-229.
24. Спиридонов Г.Н. Этиология и профилактика желудочно-кишечных болезней новорожденных телят. / Г.Н. Спиридонов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных. - Труды межд-научн.-производ. конф., посвящ. 50-летию ВНИИВВиМ. - Т. 2. -Покров. - 2008. - С. 185-187.
25. Спиридонов Г.Н. Инфекционный кератоконьюнктивит крупного рогатого скота / Г.Н. Спиридонов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных. - Труды межд. научн.-производ. конф., посвящ. 50-летию ВНИИВВиМ. - Т. 2. - Покров. - 2008. - С. 195-197.
26. Спиридонов Г.Н. Инфекционные болезни новорожденных телят и их иммунопрофилактика в современных условиях / Г.Н. Спиридонов // Матер. межд. конф., посвященной 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии. — Самара. — 2009. - С. 434-438.
27. Спиридонов Г.Н. Иммунопрофилактика смешанных форм инфекционной диареи новорожденных поросят. / Г.Н. Спиридонов //
Науково-техшчний бюллетень Украшська академ1я аграрних наук MiHicrepcTBO arpapHoi полггнки Украши. - JlbBiB. - 2009. - Випуск 10. - № 3, С. 183-187.
28. Саттарова Н.В. Диагностика инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота методом ИФА / Н.В. Саттарова, J1.B. Валебная, Г.Н. Спиридонов // Науково-техшчний бюллетень Украшська академ1я аграрних наук Мйистерство arpapHoi полггики Украши. - Льв1в. - 2009. -Випуск 10. -№3. -С.179-182.
29. Спиридонов Г.Н. Гипериммунная лечебно-профилактическая сыворотка против рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят / Г.Н. Спиридонов, А.Ф. Махмутов, Х.Н. Макаев // Современные проблемы интенсификации производства свинины в странах СНГ. - Сб. науч. трудов XVII межд. научн.-практ. конф. по свиноводству. - Ульяновск. - 2010. -С. 361-365.
30. Иванов A.B. Методические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / A.B. Иванов, Г.Н. Спиридонов, Х.З. Гаффаров, Х.Н. Макаев и др. // -Казань.-2010,- 15 с.
31. Махмутов А.Ф. Специфическая профилактика и лечение смешанных вирусно-бактериальных гастроэнтеритов новорожденных поросят /А.Ф. Махмутов., Г.Н. Спиридонов, Х.Н. Макаев // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири. - Матер, научн.-практ. конф. - Краснообск,- 2010. - С.127-131.
32. Спиридонов Г.Н. Вакцинопрофилактика смешанных вирусно-бактериальных форм диареи поросят / Г.Н. Спиридонов // Обеспечение продовольственной безопасности России. Если не мы, то кто. - Матер, межд. научн.-практ. конф. - Курск. - 2010. — С. 272-275.
33. Махмутов А.Ф. Проблемы желудочно-кишечных заболеваний новорожденных поросят и пути их решения / А.Ф. Махмутов, Г.Н. Спиридонов // Лекарственные препараты для животных (разработка, производство, эффективность и качество). - Матер, межд. научн. конф. - М. -2011.-С. 63-65.
34. Спиридонов Г.Н. Лечение и профилактика смешанных форм инфекционной диареи новорожденных поросят / Г.Н. Спиридонов, А.Ф. Махмутов // Ветеринарна медицина. - Межвщомчий тематичний науковий 36ipHHK. - № 95. - Хармв, - 2011. - С. 265-267.
35. Spiridonov A. Coronaviral calf diarrhea in Volga and Ural regions of Russia: etiologi, prevention, and treatment / A. Spiridonov, G. Spiridonov, A. Makhmutov, M. Efimova, A. Ivanov, E. Shuralev, and A. Ivanov II Co-organized by CNB - CSIS and fundación ramón arecer: XIIIth international nidovirus symposium. - Salamanca, 2014. - P. 127-128.
Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань,ул. Журналистов, 2А, оф.022
Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 20.08.2014 г Печ.л. 2,8 ЗаказМ К-7425. Тираж 100 зкз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.
-
Спиридонов, Геннадий Николаевич
-
доктора биологических наук
-
Казань, 2014
-
ВАК 06.02.02
- Инфекционные диареи новорожденных телят в условиях Дагестана
- Усовершенствование технологии изготовления вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита и изучение ее антигенных и иммуногенных свойств
- Биологическая характеристика бактерий Moraxella bovis и клинико-эпизоотологические особенности инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота
- Разработка тест-системы для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа
- Фармако-токсикологическая оценка препарата "Ильметин" и изучение его эффективности при диспепсии новорожденных телят
