Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка средств экстренной защиты животных от сибирской язвы

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка средств экстренной защиты животных от сибирской язвы"

005009900

ПАНКОВ ЯКОВ ГЕННАДЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ЭКСТРЕННОЙ ЗАЩИТЫ ЖИВОТНЫХ ОТ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

06.0202 -«Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О 0ЕЗ Ш

005009900

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань)

Научный руководитель:

-доктор биологических наук, профессор Иванов Аркадий Васильевич

Официальные оппоненты:

-доктор медицинских наук, профессор Поздеев Оскар Кимович

-доктор ветеринарных наук, професоор Госманов Рауис Госманович

Ведущее учреждение: Федеральное государственное

бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир)

Защита диссертации состоится «______________________________________»_2012г. в 10 часов на за-

седании диссертационного совета Д - 220.012.01 при Федеральном центре токсикологической, радиационной и биологической безопасности (420075, г. Казань, Научный городок-2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ».

Автореферат разослан «___»__________2012 г. и размещен на официальном

сайте ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ www. vnivi. ru и на официальном сайте ВАК РФ www. vak2. ed. gov, ru

Учёный секретарь диссертационного совета, ? /?

кандидат ветеринарных наук 0^7оемтЯ17^ В.И. Степанов

Актуальность темы. Сибирская язва и в наши дни представляет реальную опасность как для сельскохозяйственных животных, так и для человека, что дшаует необходимость изучения взаимодействия микроба с макроорганизмом, а вероятность использования возбудителя сибирской язвы в качестве биологического оружия - целенаправленно укреплять и совершенствовать противобакгериологическую защиту животных (ГШ. Бургасов с соавг., 1970; КЛ. Шаховский, 1971). Основной путь заражения бациллами сибирской язвы - алиментарный, то есть возбудитель попадает в организм с кормом или водой. Источником инфекции являются, естественно, не только носители, но и больные животные, выделяющие в окружающую среду бациллы с фекалиями, мочой и слюной (Мишанин Ю.Ф., 2002).

Специфическая профилактика сибирской язвы животных в нашей стране в течение 45 лег осуществлялась с применением вакцины СТИ, что позволило значительно снизить количество вспышек болезни и в целом обеспечить достаточно устойчивое эпизоотическое благополучие хозяйств во многих регионах страны. Однако в начале 80-х годов было отмечено, что данная вакцина в определенной мере утратила свои иммуногенные свойства. Возникла необходимость создания новой, более эффективной вакцины против сибирской язвы. И.А. Бакуловым, В.А. Гавриловым и ВВ. Селиверстовым (1983) была создана вакцина на основе аттенуированного ппамма 55, которая обладала высокой иммуногенностью, слабой вирулешностыо и реакгогенносгыо. Данная вакцина успешно применяется в ветеринарной практике РФ и в настоящее время.

Известно, что традиционная вакцинация животных против сибирской язвы с применением живых вакцин сдерживает распространение инфекции, однако не способна полностью предотвратить инфицирование животных в первые дни после иммунизации. Следует отметить, что механизмы специфической невосприимчивости организма к сибирской язве сложны, и представлены комплексом фактором тканевой и гуморальной защиты. Так, И.А. Бакуловым и др. (1996) выявлено, что иммунитет вырабатывается в ответ на воздействие сибиреязвенного токсина, в состав которого входят протекгивный антиген, отечный и легальный факторы. По данным Н.Г. Ипатенко и В .А. Гаврилова (1990), протекгивный антиген обуславливает более интенсивную пролиферацию плазматических клеток, чем соматический полисахарид.

Для создания надёжных инактивированных вакцин используется широкий арсенал методов. Известно, что бакгериосгатический или бактерицидный эффект ионизирующего излучения использовался для лучевой стерилизации медикобиологических объектов. Хотя первые сообщения об этом были более чем 70 лет на-

зад, облучение микроорганизмов для приготовления безопасных антигенов, вирусов и микроорганизмов привлекло внимание исследователей сравнительно недавно. Так, А.В. Иванов и др. (1994; 2010), РХ Юсупов и др. (1994), изучали инактивирующее действие гамма-облучения на культуры штаммов В. abortus 82 и В. suis 86. Установлено, что гамма-облучение приводит к инакгавации бруцелл с сохранением их ангаген-ных и иммуногенных свойств. Результаты исследований Г.Х. Ильясовой и др. (2005), А.В. Иванова, РХ Юсупова, АН. Чернова (2010) показали, что инактивированный гамма-облучением возбудитель болезни Ауески безопасен, обладает выраженными аншгенными и иммуногенными свойствами. В свете изложенного разработка технологии изготовления инактивированного ионизирующим гамма-излучением экологически безопасного, антигенного вакцинного препарата против сибирской язвы, пригодного для обеспечения экстренной защиты животных от згой инфекции, является актуальной.

Цель и задачи исследований. Цепью исследований явилась разработка средств экстренной защиты животных от сибирской язвы, а также определения иммунологического сшуса у крупного рогатого скота, привитого моновакциной, в отдельных районах РТ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать режимы инактивации возбудителя сибирской язвы различными методами, в том числе гамма-лучами;

- изучить антигенные свойства инакшвированных препаратов, в том числе инактивированных гамма-лучами;

- испытать иммуногенную акгавностъ инактивированного сибиреязвенного иммуногена на лабораторных и сельскохозяйственных животных (овцы);

- разработать метод иммуноферменгного анализа для выявления специфиче-' ских антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы;

- установить возможность оценки иммунного статуса у животных к сибирской язве с использованием иммунохимического и серологических методов;

- провести ретроспективный анализ заболеваемости животных сибирской язвой на территории РТ.

Научная новизна работы. Впервые разработана технология получения рацио-вакцины для иммунопрофилактики сибирской язвы сельскохозяйственных животных.

Показано, что инактивирование вегетативной формы сибиреязвенного микроба гамма-лучами обеспечивает сохранение его антигенных и иммуногенных свойств, ко-

дигелем антракса уже в первые 3 суг после иммунизации. Усовершенствован ИФА на основе радиоинакгивированного антигена штамма 55, для определения в сыворотке крови специфических антител к возбудителю сибирской язвы у животных, иммунизированных против згой инфекции.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретически обоснована и практически подтверждена инактивация вегетативных форм сибиреязвенного микроба гамма-лучами, которая обеспечивает гибель возбудителя с одновременным сохранением его антигенных и иммуногенных свойств.

Обоснована возможность экстренной защиты лабораторных животных уже в первые 3 сут после иммунизации, которая сохранялась и в последующие сроки (до 6 мес - срок наблюдения). Изучен уровень специфических антител в сыворотке крови овец, иммунизированных гамма-ангигеном.

Подтверждена возможность получения и применения инактивированной сибиреязвенной иястшны для иммунопрофилактики сельскохозяйственных животных от сибирской язвы в экстренных условиях.

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

-разработка способа получения высокоиммуногенного радиоинактивированого варианта сибиреязвенной вакцины путем инактивации возбудителя гамма-лучами и изучение ее иммуногенной эффективности полученной на лабораторных животных (белых мышах, морских свинках, кроликах) и овцах;

- -схема применения инакгавированной вакцины для экстренной защита сельскохозяйственных животных от сибирской язвы;

-установление иммунного статуса крупного рогатого скота три сибирской язве с

пгпптпдгтянирм ИММуНОХИМИЧеСКОГО И СерОЛОГИЧеСКОГО МеГОДОВ (ИФА, РИГА).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены: на заседаниях ученого совета ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ» в виде ежегодных рабочих программ и отчетов о НИР (2009 - 2011 гг.) на Международных и Всероссийских научно-практических симпозиумах и конференциях (Казань 2009 - 2011гг.; Краснодар 2011г.).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 3 научные работы, 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 134 страницах компьютерного текста и состоят из следующих разделов: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована 17 таблицами. Список литературы включает 266 литературных источников, в том числе 109 зарубежных авторов.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Работа выполнена в 2008 - 2011 гг. в лаборатории по хранению и изучению штаммов возбудителей особо опасных болезней (музей штаммов) ФЦТРБ

- ВНИВИ (№ госрегистрации 01200202602).

В экспериментальных исследованиях были использованьп

Подопытные животные: 298 белых мышей, 60 кроликов породы «Шиншилла», 334 морских свинок, 530 крупного рогатого скота и 14 овец.

Штаммы микроорганизмов: 2 штамма спорообразующих аэробных бацилл (В. сегеш шг. 2035, В. БиЬШц шг. 433); сибиреязвенные вакцинные штаммы В. ап&гааз шг. СШ, шт. 55; вируленгоый ипамм возбудителя В. апИлж^ «4-7».

Антигены: коммерческий сибиреязвенный аншген (СА), 4 экспериментальные серии антигенов сибиреязвенного микроба из вегетативных и споровых клеток (шг. 55) и 2 антигена из спорообразующих аэробных бацилл.

Антитела: сибиреязвенная преципигирующая сыворотка и противосибиреяз-венный глобулин биофабричного изготовления и 530 сывороток крови крупного рогатого скота и овец, антивидоюП глобулин, меченный пероксидазой.

Оборудование и реактивы: для инакгавации вегетативных форм сибиреязвенного микроба использовали гамма-установку «Исследователь» с источником излучения Со60; холодильники, термостаты, центрифуги, вод яные бани.

Моделирование сибиреязвенной инфекции осуществляли путём подкожного заражения ингакптых и иммунизированных сибиреязвенной вакциной кроликов капсульным штаммом возбудителя сибирской язвы «4-7» в дозе 1005(1000 спор).

Вегетативные и споровые формы сибиреязвенного и спорообразующих аэробных бацилл получали в соответствии с общепринятыми в микробиологии сибирской язвы методами (ГБ. Дунаев, СГ. Колесов, 1976).

Антигены из спор и вегетативных клеток сибиреязвенного микроба и спорообразующих аэробных бацилл получали методами термического экстрагирования (ИР. Мухаметшин, 2002) и методом гамма-облучения согласно режимам, разработанных нами.

Молекулярную массу полученных антигенов определяли методом электрофоретического разделения в ПААТ с использованием маркеров: бычьего сывороточного альбумина (67 кД), яичного альбумина (45 кД), цигохрома (12,3 кД) по методике, описанной СБ. Буеровой (2002). Содержание белка в полученных анптгенах определяли по Лоури, азота по Кьепьдалю, углеводов ашроновым методом. Серологическую активность антигенов определяли в РИГА по К. Мальбергу (1987). Чистоту, стерильность и безвредность антигенов проверяли в соответствии с общепринятыми в иммунологии методами.

Непрямой метод иммуноферментного анализа для определения иммунного фона у интакгных и прившых регламентированной при сибирской язве вакциной и экспериментальными образцами полученных антигенов, ИФА проводили по методу, описанному А. Уо11ег. (1977) учёт результатов реакции проводили по общепринятой методике. Исследований проводили совместно с д.биол.н. Юсуповой Г.Р.

В качестве тест-цпамма в ИФА использовали антиген радиоинактивированного вакцинного штамма В. апИтгааБ 55.

Культивирование вакцинного сибиреязвенного штамма 55 проводили на питательной среде, разработанной в лаборатории музей штаммов ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ», где в качестве питательной основы служил ГПЭМ (гпаролизат плаценгар-но-машчно-эмбриональный) - 60%, сыворотка крупного рогатого скота без консерванта - 20% и вода кипяченая - 20%. Концентрация вегетативных клеток в среде в конце культивирования (14-16 часов) составляла 250-300 млн/см3. Исследования проводили совместно с к.вег.н. Мустафиной ЭЛ.

Учитывая достаточное количество протекшвного антигена и других компонентов роста, к выращенной биомассе с цепью стабилизации и предотвращения дальнейшего спорообразования добавляли формалин (0,4 -1,0 % к общему объёму биомассы), который одновременно способствует переходу токсина в анатоксин, затем разливают в колбы (флаконы) ёмкостью 100 - 500 см3 и подвергали гамма-облучению. Перед проведением лучевой инактивации микроба изучали радиочувствительность используемого тест-штамма к ионизирующей радиации. Для этой цели брали образцы культуральной микробосодержащей суспензии в различных концентрациях * 10,100,200 и 300 млн. м.к. в 1 см3 культуральной жидкости. Для определения инактивирующей дозы ионизирующих излучений испытывали различные режимы облучения с возрастающей дозой гамма-лучей в диапазоне доз 2 - 35 кГр. Образцы микробосодержащего материала помещали в рабочую камеру гамма-установки, переводили материал в зону облучения и включали установку на различные экспозиции (5,10,16,18 часов) облучения, при которых доза гамма-лучей биологического объекта составляет, соответственно 2,5,10,20,25 кГр. Степень инактивации микробов определяли методом рассева на МПА в чашках и в МПБ при 37° С в течение 3 суток. За радиоинактивирующую дозу гамма-лучей принимали ту, которая вызывает гибель исходной микробной культуры за единицу времени, независимо от концентрации микроба в облученном материале. Данный этап исследований проводили под научно-методическим руководством зав! отд. радиобиологии проф. Конюхова ГБ. *

Для изучения эпизогоологической ситуации по сибирской язве и определения иммунного фона стада крупного рогатого скота в хозяйствах Мензелинского и Чистопольского районов РТ использовали метод эпизоотологаческих исследований по И.А. Бакулову (1974). При этом проводили сравнительно-географическое и сравнительно историческое описание, изучение эпизоотологаческих журналов и карг, статические материалы, собранные в хозяйствах, в ветеринарных учреждениях, статических органах и учреждениях гидрометеослужб.

Статистическую обработку полученного материала проводили общепринятыми методами вариационной статистики с помощью критерия Сгьюдента с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel 2000.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Получение антигенов сибиреязвенного микроба для использования их в качестве иммуногенов доя экстренной защиты животных от сибирской швы

Вегетативные клетки возбудителя сибирской язвы получали на МПА путем инкубирования посева в термостате при 37°С в течение 18-20 часов. Выросшие колонии смывали физиологическим раствором, центрифугировали 3 раза при 6 тыс. об/мин (по 20; 20; 30 минут). Из осадка вегетативных клеток готовили 1 млрд взвесь, добавив кварцевого стекла, растирали в фарфоровой ступке в течение 1 часа Всю взвесь смывали в чистую колбу и авггоклавировали в течение 1 ч при 2 атм. После автоклавирова-ния производ или повторное центрифугирование в течение 30 мин при 4-5 тыс. об/мин и затем в чистую стерильную посуду отсасывали надосадок. Супернатант хранили в холодильнике и использовали как антиген, из вегетативных клеток, полученный методом механического разрушения.

Для изгогошгения термоэкетрагированного варианта вегетативных форм сибиреязвенного микроба, выращенную на МПА путем инкубирования в термостате при 37°С, в течение 18-20 ч, культуру смывали физиологическим раствором и кишпипи в течение 1 часа После остывания взвесь центрифугировали 20 мин при 4 тыс об/мин. Затем разливали в 50 мл флаконы и еще раз прокипятили в течение 15-20 минут.

Для изготовления озвученного варианта вегетативных клеток сибиреязвенного микроба, выращенную по вышеописанному методу суспензию культуры с титром 1x10ю млс/мл подвергали физическому воздействию на аппарате УЗДН-2Т при интенсивности силы тока 220-230 вт/м2, частоты 44 кНч, 30 мАп в течение 30 минут. Перед разрушением в культуру добавляли 0,8 мл 40% формалина Полученную суспензию вегетативных клеток (ппамма 55) использовали в дальнейших опытах как озвученный антиген из вегетативных клеток. При изготовлении споровых антигенов из использованного в работе тест-штамма возбудителя (шт. 55) последний высевали на МПА и инкубировали в термостате при 37°С в течеше 5-7 суток. *

Для приготовления термоэкстрагированного варианта сибиреязвенного микроба, споровую культуру тест-штамма, споровую суспензию с тигром 1х Ю10 мх/мл подвергали кипячению в течение 2,5 - 3 ч, термоэкстракт центрифугировали при 6-7 тыс. об/мин в течение 30 мин и полученную суспензию использовали в качестве термоэкстрагированного варианта сибиреязвенного спорового антигена - иммуногена Для приготовления сибиреязвенного радиоантигена, суспензию спор, приготовленную по вышеописанной методике, подвергали воздействию гамма-лучей Со60.

Перед проведением рациоинакгивации сибиреязвенного терт-штамма (шт. 55), в соответствии с Правилами радиационной микробиологии, разработанными ИЭМ им.

Н.Ф. Гамалея АМН СССР, проводили определение радиорезистентносш спор и вегетативных клеток сибиреязвенного микроба

Для этого готовили суспензию спор по общепринятой методике. 7 - суточную споровую культуру смывали с МПА, прогревали при 60° С в течение 30 минут. Кон-

центрацию спор во взвеси определяли методом серийных разведений по вышеописанному методу. После суточной инкубации чашек в термостате при 37° С производили подсчет выросших колоний.

При проведении основных опытов по определению радиорезистентности, в чашки Петри диаметром 4 см наливали 1 мл взвеси спор определенной концентрации, заливали расплавленным и остуженным тришон-соевым агаром и тщательно перемешивали. После застывания агара чашки Петри упаковывали стопкой по 8 ипук, помещали в рабочую камеру гамма-установки «Исследователь» и облучали.

С целью получения радаоангагена из вегетативных клеток, содержащий как соматический, так и протиставний ангагены сибиреязвенного микроба, споровую культуру пгг. 55 высевали на спеціальную среду, которая является оптимальной как для получения достаточной бакмассы микроба, так и для синтеза протекгавного антигена 1

Для культивирования вакцинного сибиреязвенного штамма 55 мы использовали в качестве питательной основы гидролюат ПМ (плацентарно-маточный 30%), сыворотку крупного рогатого скота без консерванта (20%) в комплексе со средой 199 (30%) и раствором Хенкса (20%), тем самым, обеспечивая необходимые неорганические минеральные соли и добавки. Концентрация вегетативных клеток в конце культивирования (14 -16 часов) составляла 250 - 300 млн. млсУсм3.

Испытание посевной дозы, равной 100 тыс., 500 тыс., 1 млн., 3 млн, 6,9,12,15 и 18 млн. м.к. на 1 мл среды показало некоторое отличие выхода биомассы. Если при посеве 100,500 тыс. и 1 млн. мх. на 1 мл среды концентрация вегетативных клеток составляла от 130 до 150 млн, то в посевах от 3 до 15 млн. спор в 1 мл, содержание составляло от 200 до 300 млн. м.к. на 1 мл среды. При увеличении количества посевного материала (от 18 до 25 млн.) наблюдалась тенденция к снижению концентрации вегетативных клеток возбудителя.

Учитывая, что при получении инактивированной вакцины необходимо досга-■ точное количество протективного антигена, в связи с этим нами использовался посевной материал, содержащий 10-15 млн. м.к. возбудителя в 1 мл среды, pH среды 7,2 - 7,4 при 37°С, по циклу спора - вегетативная клетка Культуральную среду, содержащую 130-150 млн. вегетативных м.кУмл и протективный антиген, подвергали гамма-облучению в дозах от 20; 25; 30 и 35 кГр. Результаты радиошкробисшошческих исследований показали, что полная инактивация вегетативной сибиреязвенной культуры достигается при облучении в дозе 30 кГр.

С использованием отобранных экспериментальным путем режимов инактивации нами была изготовлена сибиреязвенная радиовакцина из шт. 55, которая была использована в дальнейших опытах как потенциальный иммуногенный препарат для профилактики сибирской язвы.

Полученные вышеописанными методами термо-, химио-, радио- и ультразвукоинактивированные варианты сибиреязвенного микроба были проверены на стериль-

9

нсклъ, безвредность, серологическую активность, содержания белка, углеводов и азота в соответствии с упомянутыми в методической части диссертации способами.

Количество белка в антигене определяли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 235 и 280 нм. ,

Результаты испытания вышеупомянутых биологических свойств полученных различными методами антигенов сибиреязвенного микроба показали, что они являются безвредными д ля лабораторных животных, наличия комаминантов не обнаружено. При изучении некоторых химических констант и серологической активности и антигенов обнаружено, что они в зависимости от способа получения, имеют некоторые различия по сравнению с исходным (шт. 55) шгаммом-продуценгом.

Содержание общего азота и белка в спорах почти в 2 раза превышает таковое вегетативных клеток, а содержание углеводов, наоборот, в аншгенах из Еегегагивных клеток почти в2-2^> раза больше, чем в споровых антигенах. Такое различие химических компонентов обуславливает и различие серологической активности полученных препаратов. Титры антигенов из споровых форм сибиреязвенного микроба в РП колеблется в пределах 23-2,6 logj, а из вегетативных клеток 2,7 - 2,9. Применение более чувствительной тест-системы (РИГА) позволяло выявлял, более высокую серологическую активность у полученных антигенов, когда титры споровых антигенов, в зависимости от способа получения, колебались в пределах от 4,6 - 7,1, а у вегетативных - от 5,3 - 5,6 loga соответственно.

Результаты сопоставленного анализа полученных данных позволили сделать вывод, что из испытанных методов получения антигенов сибиреязвенного микроба оптимальным является метод облучения культур гамма-лучами, поскольку тигры антигенов штамма как в РП, так и в РИГА оказались более высокими по сравнению с таковыми у остальных вариантов антигенов сибиреязвенного микроба

32 Разработка ИФА на основе противосибиреязвенной вакцины штамма 55 для определения в сыворотке крови специфических антител к возбудителю сибирской швы

С целью приготовления ашигена для ИФА был использован радиоинакгивиро-ванный аттенуированный вакцинный штамм 55 против сибирской язвы.

Биомассу получали путем высева штамма на питательной среде, разработанной в нашей лаборатории, где в качестве питательной основы служил ГПЭМ. Аншгеном в ИФА служила концентрированная в 100 раз радиоинакгавированная биомасса штамма 55. В качестве котпроля использовали гипериммунные и нормальные сыворотки кроликов и морских свинок.

Учет реакции ИФА проводили на вертикально сканирующем спектрофотометре Titertek multiskan (Швейцария). Непрямой вариант ИФА для выявления антител в сыворотке крови живошых включает многоэтапные процессы взаимодействия различных компонентов реакции. В специальных опытах устанавливали оптимальные

ю

условия постановки самой реакции: определяли основные параметры иммобилизации антигена и антител на полистирол; влияние pH буферного раствора, температурного фактора, времени инкубации и др. Следует особо отметить, что при разработке непрямого варианта ИФА для титрования специфических антител для сенсибилизации планшетов в качестве антигена впервые использовали аттенуированный шт. 55.

В опытах, в частности, изучали особенности взаимодействия специфической сыворотки, с иммобилизованным на поверхности полистирола антигеном шт. 55. Результаты исследований показали, что оптимальным сроком инкубации специфических антител с иммобилизованным антигеном является 2 ч при +37°С. При этом достигается максимальная чувствительность реакции (тигр ашигел в ИФА в гипериммушюй сыворотке составил 1:1000 при Ксп 1 = 2,44±0,014; Ксп 2 = 2Д7±0,015. В более короткий срок инкубации полного связывания антигена с сыворотками не происходило, а увеличение ее продолжительности не только удлиняло время постановки реакции, но и способствовало появлению фонового окрашивают.

Исключительно важным для проведения ИФА является определение кинетики связывания и концентрации аншввдового иммунопероксцдазнош конъюгата. В наших опытах максимальное значение коэффициента специфичности было констагаро-вано при взаимодействии конъюгата с иммунной сывороткой в течение 1 часа

В специальной серии опытов проводили исследования по сравнительной оценке эффективности разработанного нами метод а непрямого варианта ИФА и общепринятой реакции связывания комплемента (РСК) при обнаружении антител к возбудителю сибирской язвы в сыворотке крови вакцинированных животных. Постановку непрямого варианта иммуноферменгаого анализа осуществляли согласно разработанной нами Инструкции по применению набора препаратов для определения в ИФА специфических антител в сыворотке крови крупного рогатого скота, вакцинированного против сибирской язвы, а реакцию связывания комплемента ставили по О. Ргсауе! (1984). В опытах исследовали сыворотки к^ови 17 коров, иммунизированных прошв сибирской язвы вакциной из штамма 55. Для исследований кровь брали на 10,20 и 25 дни после вакцинации. Установлено, что через 10 дней после вакцинации количество положительных реакций в ИФА составляло 55,5%. Следует отметить, что на 25-й день после иммунизации антитела выявлялись с помощью обеих тест-систем. При этом тигры специфических антител, выявляемых методом ИФА, у всех животных были значительно выше по сравнению с уровнем комплеменгсвязывающих антител.

33 Изучение иммуногенных свойств полученных различными методами препаратов из противосибиреязвеннон вакцины штамма 55

33.1 Изучение иммуногенной активности препаратов на морских свинках и белых мышах

Для проведения опытов исиользовали 35 морских свинок живой массой (250* 45) г, которые были разделены на 7 групп по 5 животных в каждой. Животным 1-й

11

группы однократно подкожно вводили сибиреязвенную вакцину из шг. 55 в дозе 10000 спор, 2-й группы - ацетоново-эфирный экстракт из спор (3 мл), 3-й - тсрмоэкс-тракг спор (3 мл), 4-й - облученную гамма-лучами вегетативную культуру тест-шшша в дозе 3 мл, 5-й - термоэкстракт вегетативных клеток, 6-й озвученные УЗДН -вегетативные клетки и 7-й - подвергнутые механическому разрушению вегетативные клетки штамма 55 по 3 мл.

Результаты проведенных исследований показали, что после иммунизации морских свинок регламентированной при сибирской язве споровой вакциной из шт. 55, атигсша начали регистрироваться в РП на 14-й день после введения препарата и они достигли максимума к 28-м суг опыта (3,2 ± 0,1 log2). При использовании ИФА -тест-системы протавосибиреязвенные антитела в татре 2,8 ± 0,5 logs, были обнаружены уже на 10-й день после иммунизации, а максимальные титры (6,9 log^) -также на 28-й день опыта.

Ацетоново-эфирное, термоэксграгирование спор, термоэкстрагирование, озвучивание и механическое разрушение вегетативных клеток вакцины из штамма 55 не приводило к усилению клеток иммунокомпетеніной системы макрооргангама к выработке прогивосибиреязвенных атигел.

Исключение составляло применение радиовакцины го вегетативных клеток вакцинного штамма 55, после введения которой в сыворотке морских свинок уже на 7й день опыта регистрировали специфические антитела в РП в тигре 0,6 ±0,1 log?, которые постепенно нарастали и к 14-му дню татры их были в 1,1 раза выше, чем при применении регламентированной вакцины.

Наиболее выраженные различия в серологической активности сывороток, полученных от иммунизированных радиовакциной морских свинок, были обнаружены при применении испьпуемой ИФА - тест-системы. Уже на 3-й день после введения препарата были выявлены специфические ангагела в среднеарифметических татрах 12 ± 0,3. Тигры специфических' антител постепенно нарастали и к 7-м суг после введения радиовакцины они достигли значений 5,1 ±1,1 log2, а максимальные их значения выявлены на 21-е суг опыта (8,1 ± 1,5 1о&), тогда как при применении регламеніированной вакцины тигры этих значений достигали только к 28-м суг (6,9 ±13 log2), уступая радиовакцине в 1,5 раза по способности индуцировать выработку

Эти результаты были подтверждены в дальнейших исследованиях, на 288 белых мышах и 192 морских свинюх. Для иммунизации подопытных лабораторных животных использовали 7 вариантов вакцинного штамма 55, перечисленные выше, которые инъецировали в кожу бедра в дозах 1000 -10000 спор и по 2 - 3 мл суспензии вегетативных клеток. Через 3, 5, 7,10, 14 и 21 день после иммунизации животных заражали капсулированным вариантом B.antiiracis «4-7» в дозе по 10 тыс. спор.

Исследования показали, что применение варианта вакцины, изготовленной путем ацетоново-эфирного экстрагирования спор не оказывало удовлетворительного за-

щишого эффекта - число выживших мышей, зараженных на 10-й, 14-й и 21-й дни после иммунизации составляло 20,40 и 40% соответственно.

При применении вариантов вакцины, изготовленных на основе вегетативных клеток, были выявлены более высокие иммуногенные свойства испытанных вакцин. Так, если гермоэкстракт из вегетативных клеток из шт. 55 защищал белых мышей от смертельного заражения вирулентным штаммом возбудителя в 20% случаев, то озвучивание и механическое разрушение вегетативных клеток из шт. 55 приводило к значительному повышениию иммуногенносги: процент выживших после заражения у иммунизированных за 3 и 5 дней до заражения составил соответственно 20% за 7,10 дней-40% и за 14-21 день - 60% соответственно.

Наиболее высокую резистентность к смертельному заражению вирулентным штаммом возбудителя ашракса приобретали белые мыши, иммунизированые радиовакциной - облученными гамма-лучами вегетативных клеток из шт. 55. При этом установлено, «по уже на 3 - 5-й день после иммунизации число выживших животных после заражения составляло 60 - 80%, через 7,10,14 и 21 день -100% соответственно.

332 Установление оптимальной иммунизирующей дозы сибиредавсшюй радиовакцины на морских свинках

Установлено, что содержание белка в тативном препарате составляло 48,96 мг/мл, а в супернатанте 23,74 мг/мл. Следовательно, испьпуемый препарат в 1 мл содержал белковый антиген микробных клеток в количестве 25,22 мг/мл и белковый прогективный антиген 0,03 - 0,04 мг/мл. Поэтому при определении оптимальной иммунизирующей дозы (ИДм) мы в расчет брали количество микробных клеток (м.кУмл или мг/мл по белку микробных клеток).

Для -ппрации оптимальной иммунизирующей дозы (ИД») использовали 48 морских свинок, разделенных на 8 групп по 6 животных в каждой. Свинок 1-й группы иммунизировали подкожно испьпуемой вакцинои в дозе 1 мл (0,015 мг по белку), 2-й -

1,5 мл (0,022 мг), 3-й - 2 мл (0,030 мг), 4-й - 2,5 мл (0,037 мг), и 5-й - 3 мл (0,045 мг). Шестую группу животных не иммунизировали и она служила контролем. Через 14 дней после иммунизации всех животных заражали инкапсулированным штаммом возбудителя сибирской язвы «4-7» в дозе 4х104 спор, которая была оттитрована в предварительных опытах на животных-аналогах.

Установлено, что оптимальной иммунизирующей дозой испьпуемого препарата для морских свинок является 2,5 - 3,0 см3, содержащая (7,5 - 9,0) х 108 м.к. и антигенного белка - 0,037 - 0,045 мг. Снижение иммунизирующей дозы нижеуказанных значений приводит к ослаблению иммунизирующего эффекта, а повышение дозы даег такой же эффект. Расчет иммунизирующей дозы по Керберу показал, что средняя иммунизирующая доза (ИД») в расчете на 1 кг живой массы для радиовакцины составляет 0,034 ± 0,005 мг по белку и (7,5 ± 1,5 х 108 м.к/кг) инактивированных вегетативных микробных клеток.

З33 Иммунологическая перестройка организма морских свинок в ответ на введение сибиреязвенной радиовакцины Опьпы проводили на 30 морских свинках, которые были разделены на 3 группы по 10 животных в каждой. Животных 1-й и 2-й групп иммунизировали соответственно живой (вакцина из шт. 55) и инактивированной гамма-лучами радиовакциной в оптимальных иммунизирующих дозах. Третью группу животных не иммунизировали (контроль).

Напряженность иммунитета определяли прямым заражением морских свинок штаммом возбудителя сибирской язвы «4-7» в дозе 1000 спор через 3,5,7,14 и 21 дни после иммунизации.

Результаты клинико-гематологических исследований показали, что после введения живой вакцины из шт. 55 температура тела у морских свинок через 24 ч повысилась на 0,8°С, через 48 ч - на 1,0°С, через 72 ч - на 0,б°С и через 96 ч - на 0,3°С.

У морских свинок, иммунизированных испытуемой радиовакциной незначительное повышение температуры тела (на 0,2° С) отмечалось только в течение первых суток. Изменений общего состояния у привтых морских свинок не наблюдалось. Результаты исследований сывороток крови привтых вакциной из игг. 55 и радиовакциной морских свинок показали, что использованные биологические препараты вызывали однотипичные изменения в организме, однако при этом отмечены некоторые различия в выраженности этих изменений.

Бактерицидная активность сывороток крови в обеих привитых группах постепенно увеличивалась до 14-х сут, затем ее активность к 21-м сут недостоверно снижалась.

Следует отметить, что содержание иммунокомпетентных клеток у привитых радиовакциной животных было в 1,4 -1,9 раза больше, чем у привтых вакциной из шт. 55 животных, что свидетельствует о более усиленном аншгенном раздражении иммунокомпетентных органов. • •

В группе животных, привитых вакциной из шт. 55, уже на 3-й и 7-й дни после иммунизации количество макрофагов увеличилось в 1,02 раза, и постепенно нарастая в дальнейшем, на 14-й день оно превышало контроль в 1,06 раза При применении радиовакцины эти изменения были более выраженными, превышая контрольные значения в 1,17(3-йдень),-1,07(7-йдень),-1,04(14день)и 1,14 (21-й день) раза

Фагоцитарная активность макрофагов периферической крови ингактных морских свинок колебалась в пределах 44,1 - 45,4%, а уже через 3 дня после иммунизации их живой вакциной из шт. 55 она повысилась до 50,0 ± 1,1 %, а у животных, привитых радиовакциной она повысилась в 1,2 раза (Р < 0,05). Отмеченная тенденция повышения функциональной активности у привитых животных сохранялась в течение всего опыта, достигая максимума к 14-м сут, когда кратность увеличения этого показателя у привитых живой вакциной составляла в 1,2 раза, а радиовакциной - в 1,5 раза (Р < 0,05)

14

по сравнению с непрившыми животными. Повышенная активность фагоцитов у привитых животных регистрировалась и к 21-м сут, когд а ОФР у привитых живой вакциной превышала контроль на 6%, а у прившых радиовакциной - на 4,7% (Р > 0,05).

Для оценки иммуногенной активности испытуемого препарата проводили опьпы на 30 морских свинках, разделенных на 3 группы по 10 животных в каждой. Первую группу животных иммунизировали живой споровой вакциной из ют. 55 согласно Наставлению по применению препарата, вторую - убитой гамма-лучами радиовакциной из вегетативных клеток шт. 55, а третью - не иммунизировали и она служила контролем заражения. Через 3,7,14 и 21 сут после иммунизации привитых животных заражали подкожно вирулентным штаммом возбудителя сибирской язвы «4-7». Для установления причины смерти, от павших животных брали патматериал и высевали на соответствующие питательные среды, с последующей идентификацией возбудителя. Критерием эффективности испытуемой вакцины считали выживаемость привитых животных после легального заражения вирулетным штаммом возбудителя инфекции (таблица).

Таблица Устойчивость прившых радиовакциной морских свинок к заражению вирулентным штаммом возбудителя сибирской язвы «4-7»

Группа К-во жив-х Выживаемость зараженных животных, после і иммунизации, (сут)

3 7 14 21

голов п/в пз п/в аз п/в аз п/в пз

Вакцинированные ЦГГ.55 10 5/5 50 2/8 80 1/9 90 0/10 100

Вакцинированные радиовакциной 10 1/9 90 0/10 100 . 0/100 100 0/10 100

НевакцинироваНны е, . (контроль) 10 10/10 0 КУО 0 10/0 0 10/0 0

П - пало, В - выжило, ПЗ - процент защиты

Из материалов таблицы видно, что контрольные (не иммунизированные) животные пали после заражения вируленгаой инкапсулированной культурой возбудителя. Иммунизация животных сибиреязвенными вакцинами оказывала защитный эффект, предохраняя их от гибели 50% (вакциной шт. 55) и 90% (радиовакциной) животных уже через 3 дня после иммунизации. К 7-му дню после вакцинации животных устойчивость их к смертельному заражению возбудителем сибирской язвы повысилась до 80% (шт. 55) и 100% (радиовакцина). На 14-й день после иммунизации животных

устойчивость к смертельному заражению у привтых живой споровой вакциной составляла 90%, а у пргадатах радаоаакциной -100%.

33.4 Формирование противосибиреязвенного иммунитета у кроликов, прившых

радиовакциной

Опыты проводили на 60 кроликах, подобранных го принципу аналогов. В первой серии опытов, поставленных на 30 кроликах, животные были разделены на 3 группы по 10 в каждой. Животных первой группы иммунизировали живой споровой вакциной из шг. 55, второй - радиовакциной, третью группу животных не иммунизировали и она служила контролем.

Исследования показали, что введение обоих вакцинных препаратов оказывало стимулирующее действие на гематологические показатели прившых животных, од нако после введения радиовакцины последовало более выраженные изменения со стороны лейкоцитов и лимфоцитов периферической крови животных. Так, если у привитых живой споровой вакциной кроликов количество лейкоцитов на 3-й день было увеличено до 8,9 ± 0,7 млрд/л, то у прившых радиовакциной этот показатель составлял 9,8 ±

0,7 прсггав 8,5 ± 0,4 в котроле.

Отмеченная тендешщя увеличения лейкоцитов у прившых животных сохранялась на весь период наблюдения и к концу 21-х суг эти различия оказались достоверными, составляя 8,3 ± 0,9 млрд/л в контроле, 10,3 ±0,3 у прившых живой вакциной из шг.55 и 15,8 ±0,5 в группе животных, привитых рациовакциной (Р < 0.05).

Аналогичные же изменения наблюдались и в содержании лимфоцитов у иммунизированных животных. При этом изменения содержания лимфоцитов периферической крови иммунизированных кроликов носили не только количественный, но и качественный характер. Так, если в группе ингактных животных результаты цитохимического анализа при помощи метода Е-РОК показали, что содержание Т-клеток было на уровне 55,9 ± 4,6 - 56,1 ± 4,0%, а В-лимфбцтш -17,7 ± 1,5 -18,1 ± 1,9%, то в опытных группах отмечены значительные изменения их содержания в различные сроки после иммунизации. В первой группе содержание тимус зависимых лимфоцитов в периферической крови было несколько выше данных контрольной группы (Р > 0,05). Что касается бурса-зависимых лимфоцитов (В-клеток), то в начальные сроки после иммунизации (3-е сутки) в указанной группе отмечено достоверное их снижение, а в дальнейшем последовало постепенное их нарастание и к 21-м суг количество этих клеток превышало контроль в 1,4 раза(Р < 0,05).

Изменения содержания Т- и В-клеток периферической крови кроликов 2-й группы, прившых рациовакциной, имели более выраженный характер, имея достоверные различия с контролем уже в начальные сроки (3-е сутки) после иммунизации.

У кроликов, привитых живой споровой вакциной, на 7-е сутки после иммунизации последовало снижение соотношения субпопуляций лимфоцитов, которое продолжалось до конца наблюдений. В отличие от первых, у животных, привитых радио-

16

вакциной (2-я ipynra), уже в первые дни после иммунизации (3-е супси) последовало значительное увеличение субпопуляционного соогшошения лимфоцитов, когда ТВ составляло 5,1:1 против 3,1:1 в кошроле. Максимальное увеличение соотношения субпопуляции лимфощпов ю второй группе животных отмечено на 7-й день после иммунизации, когда оно превышало таковое в 2,09 раза. Отмеченная тенденция повышения субпопуляционного соотношения лимфоцитов периферической крови кроликов 2-й группы сохранялась до конца наблюдения, когда этот показатель к 21-м сут превышал контрольный уровень в 1,28 и уровень 1-й группы -в 2,9 р=™

Результат параллельных серологических исследований сывороток периферической крови иммунизированных вышеуказанными вариантами сибиреязвенных вакцинных препаратов в РП- и ИФА - тестах показали, что уровень преципитатов, регистрируемых в РП - тесте, был менее выраженным при иммунизации животных живой споровой вакциной из шт. 55. Так, через 3 сут титр преципигинов в РП - тесте составлял 0,5 ± 0,03 log?.

Титры антител в ИФА были значительно выше, чем таковые при применении РП-тесга. Так, если у привтых вакциной из шг.55 на 3-и сут после иммунизации ИФА

- титры составляли 1,3 ±0,1 logz, против 0,5 ± 0,03 РП-тесге, то на 7-е туг эти показатели составляли 2,8 ± 0,3log. (ИФА) против 1,0 ± 0,1 log, (РП), 5,3 ± 1,5 logs (ИФА) против 1,9 ± 0,5 log? (РП), 5,9 ±1,11о§2 (ИФА) против 23 ± 0,11о& (РП) соответственно.

В отдельной серии опытов проводили исследования по определению напряженности иммунитета на 30 кроликах, разделенных на 5 групп по 6 животных в каждой. Животных 1-й и 2-й группы иммунизировали регламентированной при этой инфекции живой споровой вакциной из шт. 55 в предусмотренных Наставлением по применению препарата в дозах по 100 тыс. спор. Животных 3-й и 4-й группы подкожно однократно иммунизировали радиовакциной в дозе по 5 мл. Кролики 5-й труппы не были иммунизированы, они служили контролем. Через 24 ч и 96 ч после ииртумии препаратов животных всех групп подкожно заражали вирулентным штаммом возбудителя сибирской язвы («4-7») в дозе LDioo (10000 спор). Исследования показали, что заражение кроликов иммунизированных живой споровой вакциной из шт. 55 через 24

ч после иммунизации оказывало 83,3% летального эффект - гибель животных наступала через 24,48 и 96 ч после заражения. Гибель зараженных кроликов контрольной группы была 100% и наступила в аналогичные сроки, что и животных 1-й группы.

Иммунизация животных убитой гамма-лучами радиовакциной оказывала значительный защитный эффект - из 6 привтых указанной вакциной животных после заражения через 24 ч после вакцинации выжило 3.

Наибольший защитный эффект был достигнут через 96 ч после введения радиовакцины, когда из 6 иммунизированных животных после заражения выжили 5 привитых животных (83,3%-ный защитный эффект).

Таким образом, радиовакцина, полученная путем облучения вегетативных клеток шт. 55 обладала более высокими антигенными и иммуногенными свойствами по

17

сравнению с живой споровой вакциной из нгг. 55, в первые 1-3 сут после введения препаратов.

3.3.5 Определение иммуногенной активности радиовакцины на овцах

Для оценки иммуногенной активности радиовакцины проводили опьггы на 12 овцах, живой массой 35-40 кг, породы «Прекос», разделенных на 4 группы по 3 животных в каждой. Первую группу животных иммунизировали подкожно инактивированной радиовакциной в дозе по 5 мл., вторую группу аналогично первой, в дозе по 10 мл., третью группу животных иммунизировали подкожно коммерческой сибиреязвенной вакциной из шт. 55 согласно инструкции в дозе по 0,5 мл., а четвертая группа животных служила контролем - не иммунизированные.

Результаты исследований сывороток крови иммунизированных вышеуказанными вариантами сибиреязвенных вакцинных препаратов в РИГА и ИФА - тестах показали, что оба препарата (вакцина из шт. 55 и радиовакцина) обладали антигенной активностью, индуцируя синтез противосибиреязвенных антител.

Однако, в процессе исследований, были отмечены существенные отличия в синтезе противосибиреязвенных антител. Так, если через 3 сут после иммунизации подопытных животных коммерческой сибиреязвенной вакциной из шт. 55 отмечали весьма низкие титры антител (в РИГА 1/2- 1/4;вИФА1/16 -1/32), то у подопытных животных, иммунизированных радиовакциной выявлено индуцирование антител, титры которых колебались в РИГА от 1/8 до 1/32; в ИФА от 1/128 до 1/520. Результаты исследований сывороток крови подопытных животных через 7 сут после иммунизации вышеуказанными вакцинными препаратами наглядно показывают о нарастании титра антител. Так, если у подопытных животных, иммунизированных коммерческой сибиреязвенной вакциной из шт. 55, тигры в РИГА колебались в пределах 1/8 -1/16; в ИФА -1/32 - 1/64, то у животных, иммунизированных радиовакциной, они колебались в пределах в РИГА 1/128 - 1/256; в ИФА- 1/128 - 1/1024. Такая же закономерность была отмечена и на 15 сут после иммунизации подопытных животных. Титры антител у животных 3 группы составляли в РИГА в пределах 1/32 - 1/64; в ИФА -1/320 - 1/512, в то время у подопытных животных 1 и 2 групп колебались в пределах: в РИГА - 1/32 - 1/512, в ИФА -1/128-1/1024.

Результаты сопоставительного анализа исследований сывороток крови овец в РИГА и ИФА позволили сделать вывод о том, что обе использованные вакцины обладали достаточно высокой иммуногенной активностью, однако применение инактивированной гамма-лучами сибиреязвенной вакцины обеспечивало более ускоренное образование специфических антител в ранние сроки по сравнению с коммерческой сибиреязвенной вакциной из шт. 55.

: 18

■ >

33.6 Изучение эпизоотической сіпуаціш по сибирской шве па террпторші Республики Татарстан и иммунологический мониторинг в отдельных районах РТ

В результате эпиэоотшошческого анализа путем применения совокупности соответствующих приемов и методов для изучения характера, условий и динамики сибиреязвенного эпизоотического процесса, происходящего на территории РТ за ] 00летний период (1910-2010 гг.). Нами бьио установлено, что за этот период зарегистрировано 1925 сгационарно-нсблагапалу'пгьк пунктов. В качестве модели нами были приведены мониторинговые исследования в Мензслинском и Чистопольском районах РТ, где было выявлено соответственно 109 и 89 неблагополучных пунктов за исследуемый период.

Нами было проведено взягае крови у 315 крупного рогатого скота в 7 хозяйствах Мензелинского района и у 215 голов из 5 хозяйств Чистопольского района РТ. Животные за 1 -1,5 мес до взятая крови были вакцинированы протш сибирской язвы.

Исследования показали об эффективности вакцинопрофилакгики против сибирской язвы в указанных хозяйствах. Это подтверждается тем, что практически во всех исследованных пробах сыворотки крови выявляются специфические антитела с помощью РНГА и ИФА в тиграх, обеспечивающих защиту животных в случае внедрения в их организм возбудителя сибирской язвы. При этом расчёты убедительно показали, что метод иммуноферментного анализа чувствителен в 10 более раз по сравнению с РНГА.

Таким образом, иммунохимическая и серологическая тест-системы могут с успехом использоваться в качестве средств при иммунологическом мониторинге для определения эффективности вакцинопрофилакгики при сибирской язве.

Однако следует отметить, что при исследовании в 12 пробах крови специфические антитела выявлялись в низких титрах.

' 4 Выводы

1. Разработана технология приготовления сибиреязвенной радиовакцины путем гаммаюблучения вегетативных клеток вакцинного штамма В. аШЪтасв 55 в дозе 4,5 кГр в течение 5 ч, иммунопрофилактический препарат, представляет собой суспензию радиоинакгивированных вегетативных клеток вакцинного штамма В. апйгасй 55, содержащую 0,4% раствора формальдегида.

2. Для экстренной профилактики сибирской язвы препарат рекомендуется применять однократно подкожно в дозе 7,5x108 м.кУкг в объёмах от 3 мл (для мелких) до 5 мл (для крупных животных), который обеспечивает ускоренное (в первые 3-7 суток) формирование резистентности животных к экспериментальному заражению легальными дозами вирулентного штамма возбудителя антракса

3. Иммунологическая перестройка организма в ответ на введение препарата, сопровождалась ускоренным синтезом (в 1-3 сут после иммунизации) противосибиреяз-венных антител, увеличением содержания Т- и В-лимфоцигов и бласпрансформи-рующей активности последних под воздействием радиоантигена, что нашло отражение на интегральном показателе ангаантраксной защиты - повышение выживаемости животных, зараженных летальными дозами спор вирулентного ппамма возбудителя сибирской язвы.

4. Высокая иммуногенная эффективность разработанного комплексного антигена, по-ввдимому, объясняется тем, что в его состав входят соматические и протек-тивные антигены, аминокислоты, анатоксин, которые обеспечивают ускоренную защиту от возбудителя сибирской язвы при его попадании в организм.

5. Усовершенствован непрямой метод иммуноферментного анализа на основе применения радиоинактвированных вегетативных клеток В. апйпаиз 55, обеспечивающий выявление посганфекционных и поствакцинальных антител при проведении иммуномониторинга сибирской язвы, а также для оценки (контроля) эффективности вакцинопрофилакгики указанной инфекции.

6. Проведен эпизоотолого-имму! юлогический мониторинг сибирской язвы в хозяйствах отдельных районов Республики Татарстан. Установлено, что иммунофер-меганый анализ сывороток крови животных с использованием разработанного нами ИФА на основе радиоантигена вегетативных клеток В. апйгаш 55 позволяет определять иммунный фон животных и, по степени напряженности иммунитета, проводить необходимые прогивосибиреязвенные мероприятия.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты проведённых исследований позволили рекомендовать применение «Средств экстренной защиты животных от сибирской язвы» в качестве лечебно-профилакгическоЬ) препарата при антраксе путем однократной подкожной иммунизации животных в дозе 7,5x108 м.к/кг (в объёме 3-5 см3 мелким и крупным животным соответственно).

На основании результатов исследований разработаны следующие нормативнотехнические докуменш:

- Методические рекомендации по изготовлению и кошролю средства экстренной защиты животных от сибирской язвы (утв. директором ФГБУ “ФЦТРБ-ВНИВИ” 14.032011).

- Наставление по применению средства экстренной защита животных от сибирской язвы (утв. директором ФГБУ “ФЦТРБ-ВНИВИ” 14.032011).

- Инструкция по применению набора препаратов для определения в ИФА специфических антител в сыворотке крови крупного рогатого скота, вакцинированных против сибирской язвы (утв. директором ФГБУ “ФЦТРБ-ВНИВИ” 24.08.2011).

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов, А.В. Опасность возникновения сибирской язвы и основы её профилактики / А.В. Иванов, Н.С. Садыков, Э.Н. Мустафина, Я.Г. Панков, Е.В. Панкова, Т.Р. Мустафин // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана Казань - 2011. - Т.207. -С.211 -215;

2. Панков, Я.Г. Характеристика инактивированной противосибиреязвенной вакцины и испытание её на лабораторных животных / Я.Г. Панков, А.В. Иванов, Н.С. Садыков, Э.Н. Мустафина // Ветеринарный врач. - Казань.- 2011. - №3. - С.14-16;

3. Панков, Я.Г. Разработка нового поколения противосибиреязвенных вакцин / Я.Г. Панков, А.В. Иванов, Н.С. Садыков, Э.Н. Мустафина / Матер, междун. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы совр. ветер.», посвягц. 65-летию ветер, науки Кубани// Краснодар - 2011. - 4.2. - С.115-117.

Подписано в печать 31.01.12 г. Печать ризографическая Форм. бум. 60x80 1/)6.Печ. л. 1,32. Тираж 100. Заказ№ЗЮ1/1. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.)

420101, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Панков, Яков Геннадьевич, Казань

61 12-3/604

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСЖОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ»

На правах рукописи

ПАНКОВ ЯКОВ ГЕННАДЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ЭКСТРЕННОЙ ЗАЩИТЫ ЖИВОТНЫХ ОТ

СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор А.В. Иванов

Казань-2012

СПИСОК СОКРАЩЕННЫХ ТЕРМИНОВ

ИФА иммуноферментйый анализ

РП реакция преципитации

К.Р.С. крупный рогатый скот

ЛФ летальный фактор

РВ радиоинактивированная вакцина

нтд нормативно-техническая документация

СА соматический антиген

ПА протективный антиген

РТ Республика Татарстан

ГПЭМ гидролизат плацентарно - эмбрионально - маточный

РСК реакция связывания комплемента

РИГА реакция непрямой гемагглютинации

С.-Х. сельскохозяйственный

ТУ технические условия

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР полимеразная цепная реакция

МПА мясо-пептонный агар

МПБ мясо-пептонный бульон

ФБР фосфатно-буферный раствор

СФ спектрофотометр

ФЧ фагоцитарное число

ФИ фагоцитарный индекс

ФА фагоцитарная активность

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

2.1. Классификация и биология возбудителя

сибирской язвы 11

2.2. Современные особенности эпизоотологии сибирской язвы и экологии возбудителя 19

2.3. Иммунопрофилактика сибирской язвы и методы оценки иммунного статуса у животных 25

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 33 3.1. Материалы и методы 33

3.1.1. Материалы 33

3.1.2. Методы 34

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 38

4.1. Получение антигенов сибиреязвенного микроба для использования их в качестве иммуногенов для экстренной защиты животных от сибирской язвы 3 8

4.2. Разработка ИФА на основе противосибиреязвенной вакцины пггамма 55 для определения в сыворотке крови специфических антител к возбудителю сибирской язвы 47

4.3. Изучение иммуногенных свойств полученных различными методами препаратов из противосибиреязвенной вакцины штамма 55 52

4.3.1. Изучение иммуногенной активности препаратов, полученных различными методами обработки сибиреязвенного микроба, на морских свинках и белых мышах 52

4.3.2. Установление оптимальной иммунизирующей дозы сибиреязвенной радиовакцины на морских свинках 59

4.3.3. Иммунологическая перестройка организма морских свинок в ответ на введение сибиреязвенной радиовакцины 61

4.3.4. Формирование противосибиреязвенного иммунитета у привитых радиовакциной кроликов 73

4.3.5. Оценка иммуногенных свойств радиовакцины

на кроликах 78

4.3.6. Определение иммуногенной активности радиовакцины

на овцах 81

4.4. Изучение эпизоотической ситуации по сибирской язве на территории Республики Татарстан и иммунологический мониторинг в отдельных районах Республики 84

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 91

6. ВЫВОДЫ 101

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 103

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 104

9. ПРИЛОЖЕНИЯ 131

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сибирская язва и в наши дни представляет реальную опасность, как для сельскохозяйственных животных, так и для человека, что диктует необходимость изучения взаимодействия микроба с макроорганизмом, а вероятность использования возбудителя сибирской язвы в качестве биологического оружия -целенаправленно укреплять и совершенствовать проти вобактериологическую защиту животных (П.Н. Бургасов с соавт., 1970; К.П. Шаховский, 1971). Несмотря на профилактические мероприятия, проводимые ветеринарной и медицинскими службами, последствия напряженной эпизоотической ситуации прошлого и сейчас проявляются в виде спорадических, а иногда и групповых случаев заболевания сибирской язвой животных и людей.

Поэтому, несмотря на достигнутые успехи в борьбе с сибирской язвой, вопрос дальнейшего усовершенствования мер борьбы с этим зоонозом остается актуальной задачей ветеринарной науки.

Основу профилактики сибирской язвы составляют: массовая иммунизация восприимчивых животных и своевременная диагностика болезни. Для создания активного искусственного иммунитета к возбудителю сибирской язвы используют вакцины.

Специфическая профилактика сибирской язвы животных в нашей стране в течение 45 лет осуществлялась с применением вакцины СТИ, что позволило значительно снизить количество вспышек болезни и в целом обеспечить достаточно устойчивое эпизоотическое благополучие хозяйств во многих регионах страны. Однако в начале 80-х годов было отмечено, что данная вакцина в определенной мере утратила свои иммуногенные свойства. Возникла необходимость создания новой, более эффективной вакцины против сибирской язвы, И.А. Бакуловым, В.А. Гавриловым и В.В. Селиверстовым (1983) была создана вакцина на основе аттенуированного штамма 55, которая обладала высокой иммуногенностъю, слабой вирулентностью и реактогенностью. Данная вакцина успешно применяется в ветеринарной практике РФ и в наши дни. Известно, что традиционная вакцинация

животных против сибирской язвы с применением живых вакцин, сдерживает распространения инфекции, однако не способна полностью предотвратить инфицирования животных в первые дни после иммунизации. Следует отметить, что механизмы специфической неюсприимчивости организма к сибирской язве сложны, и представлены комплексом факторов тканевой и гуморальной защиты. Так, И.А. Бакуловым и др. (1996) выявлено, что иммунитет вырабатывается в ответ на воздействие сибиреязвенного токсина, в состав которого входят протективный антиген, отечный и летальный факторы. Протективный антиген, поступая в организм животного, вызывает раздражение лимфоидных и ретикулярных элементов лимфатических узлов и селезенки. В организме происходит глубокая иммунная перестройка. По данным Н.Г. Ипатенко и В.А. Гаврилова (1990), протективный антиген обуславливает более интенсивную пролиферацию плазматических клеток, чем соматический полисахарид.

Касаясь вопроса об окончательной идентификации В. anthracis, Р. Tumbu! 1 (1998) считает, что на ранних стадиях истории бактериологии определение В. anthracis представлялось простым, так как его было легко выделить и идентифицировать в случае классической сибирской язвы. Однако, как указывает автор, названия, относящиеся к 40-м годам, такие как В. antiacoides, В. anthracis В. similis и В. pseudoanthracis, показывают, что у наших предшественников были проблемы с идентификацией, так как изоляты, сходные с В. anthracis in vitro, не вызывали сибирскую язву у лабораторных животных. По всей вероятности, эти изоляты относились к В. cereus. Близкое родстю между В. anthracis, В. cereus, В. thuringiensis и В. mycoides было полностью распознано, когда была составлена первая эффективная система классификации для видов Bacillus (Smith H., 1962). Позднее это близкое родство было подтверждено изучением ДНК, более совершенных методов ДНК-ДНК гибридизации было установлено, что В. anthracis и В. cereus обладают идентичными 16S рРНК последовательностями и только двумя отличиями в их 23S рРНК последовательностях (Грипжевич Н.М., Фаизов Т.Х., 1998).

Микробные ассоциации, включаясь в нормальный биоценоз, создают «микробный пейзаж» (H.A. Радчук, 1991; М.С. Шакиров 2009). Особого внимания

заслуживает один из типов взаимоотношений - антагонизм у микробов. Изучение этого явления представляет обширную область исследований, как для выяснения его биологической сущности, так и целью практического использования в медицине и в ветеринарии.

В любом случае, поскольку сибирская язва и ряд других возбудителей инфекционных заболеваний относятся к почвенным инфекциям, то очень важно учитывать абиотические и биотические факторы природной среды. (Н.Ж. Жанузаков, 1970; А.М. Берлянг, 2000; Р.Б. Хайдапова, В.Ц. Цыдыгов, 2005; А.К. Галиуллин, 2008; Р.Н. Бадмажапова, 2008).

Для создания надёжных инактивированных вакцин используется широкий арсенал методов. Известно, что бактериостатический или бактерицидный эффект ионизирующего излучения использовался для лучевой стерилизации медико-биологических объектов. Хотя первые сообщения об этом были более чем 70 лет назад, облучение микроорганизмов для приготовления безопасных антигенов, вирусов и микроорганизмов привлекло внимание исследователей сравнительно недавно. Так, A.B. Иванов и др. (1994), Р.Х. Юсупов и др. (1994), A.B. Иванов, М.А. Косарев (2010) изучали инактивирующее действие гамма-облучения на культуры штаммов B.abortus 82 и В. suis 86. Установлено, что гамма-облучение приводит к инактивации бруцелл с сохранением их антигенных и иммуногенных свойств. При этом иммуногенные свойства наиболее выражены у культур бруцелл, подверженных гамма-облучению в дозе 30 кГр. В их опытах культура штамма 82 - гамма защищала от заражения 83,3 % животных, как и живая вакцина из штамма 82. Результаты исследований Г.Х. Ильясовой и др. (2005), A.B. Иванова, Р.Х. Юсупова, А.Н. Чернова (2010) показали, что инактивированный гамма-облучением возбудитель болезни Ауески безопасен, обладает выраженными антигенными и иммуногенными свойствами и индуцирует выработку антител у белых крыс и кроликов в высоких титрах (до 1:1280) при введении им инактивированного антигена. Авторы делают вывод о том, что метод инактивации возбудителей с применением гамма-лучей перспективен для создания безопасных инактивированных вакцин. В свете изложенного разработка технологии изготовления инактивированного

ионизирующим гамма-излучением экологически безопасного, иммуногеннош вакцинного препарата против сибирской язвы, пригодного для обеспечения экстренной защиты животных от этой инфекции, является актуальной.

Цель и задачи исследований. Целью исследований явилась разработка средств экстренной защиты животных от сибирской язвы, а также определения иммунологического статуса у крупного рогатого скота, привитых моновакциной, в отдельных районах РТ.

Дня достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать режимы инактивации возбудителя сибирской язвы различными методами, в том числе гамма-лучами;

- изучить антигенные свойства инактивированных препаратов, в том числе инакти вированных гамма-лучами;

- испытать иммуногенную активность инактивированного сибиреязвенного иммуногена на лабораторных и сельскохозяйственных животных (овцы);

- разработать метод иммуноферменгного анализа для выявления специфических антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы;

- установить возможность оценки иммунного статуса у животных к сибирской язве с использованием иммунохимического и серологических методов;

- провести ретроспективный анализ заболеваемости животных сибирской язвой на территории РТ.

Научная новизна работы. Впервые разработана технология получения радиовакцины для иммунопрофилактики сибирской язвы сельскохозяйственных животных. Показано, что инактивирование вегетативной формы сибиреязвенного микроба гамма-лучами обеспечивает сохранение его антигенных и иммуногенных свойств, который обеспечивает защиту подопытных животных от смертельного заражения возбудителем антракса уже в первые 3 суток после иммунизации. Усовершенствован ИФА на основе радиоинактивированного антигена штамма 55

для определения в сыворотке крови специфических антител к возбудителю сибирской язвы у животных, иммунизированных против этой инфекции.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретически обоснована и практически подтверждена инактивация вегетативных форм сибиреязвенного микроба

гамма-лучами, которая обеспечивает гибель возбудителя с одновременным сохранением его антигенных и иммуногенных свойств.

Обоснована возможность экстренной защиты лабораторных животных уже в первые 3 суток после иммунизации, которая сохранялась и в последующие сроки (до 6 мес. срок наблюдения). Изучен уровень специфических антител в сыворотке крови овец, иммунизрированных гамма-антигеном.

Подтверждена возможность получения и применения инактивированной сибиреязвенной вакцины в экстренных условиях для иммунопрофилактики сельскохозяйственных животных от сибирской язвы.

Практическая значимость работы определяется тем, что в результате исследований разработаны (в сооавторстве) следующие нормативно-технические документы:

- Методические рекомендации по изготовлению и контролю средства экстренной защиты животных от сибирской язвы (утв. директором ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" 14.03.2011).

- Наставление по применению средства экстренной защиты животных от сибирской язвы (утв. директором ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" 14.03.2011).

- Инструкция по применению набора препаратов для определения в ИФА специфических антител в сыворотке крови крупного рогатого скота, вакцинированных против сибирской язвы (утв. директором ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" 24.08.2011).

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

-разработка способа получения высокоиммуногенного

радиоинактивированного варианта сибиреязвенной вакцины путем инактивации

возбудителя гамма-лучами для использования в качестве вакцины для экстренной защиты сельскохозяйственных животных от сибирской язвы;

- результаты изучения иммуногенной эффективности полученых гамма-инактивированной противосибиреязвенной вакцины на лабораторных животных (белых мышах, морских свинках, кроликах) и овцах;

- схема применения инактивированной вакцины для экстренной защиты сельскохозяйственных животных от сибирской язвы;

- установления иммунного статуса стада крупного рогатого скота при сибирской язве с использованием иммунохимическош и серологического методов (ИФА, РНГА).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета ФГЪУ «ФЩРБ-ВНИВИ» в виде ежегодных рабочих программ и отчётов о НИР (2009 - 2011гг.), на Международных и Всероссийских научно-практических симпозиумах и конференциях (Казань 2009 -2011гг.; Краснодар 2011г.).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 3 научные работы, 2 из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 143 страницах компьютерного текста и состоят из следующих разделов: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована 17 таблицами. Список литературы включает 269 литературных источника, в том числе 109 зарубежных авторов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Классификация и биология возбудителя сибирской язвы

Сибирская язва - одна из остропротекакмцих, опасных болезней животных и человека. Согласно современным принципам классификации, возбудитель сибирской язвы имеет следующее таксономическое определение: вид В. anthracis принадлежит роду Bacillus, семейству Bacillaceae, порядку Eubacterialis, классу Eubacteriae бесхлорофилльных низших организмов растительного царства Prothophyta (J. Bergey 1974).

В. anthracis имеет ряд сходных морфологических и кулыуральных черт с близкородственными непатогенными спорообразующими аэробными бациллами: Вас. cereus, Вас. pseudoanthracis, Вас. anthracoides, Вас. megaterium, Вас. mesentericus, Вас. mycoides и Вас. thuringensis (MB. Рево, 1939; Э.Н. Шляхов, 1957, 1960; В.А. Полховский, 1968; Н.Г. Ипатенко, 1984 и др.).

Изучение ультраструктуры вегетативных и споровых форм бацилл патогенных и сапрофитных видов подтвердило многие черты этого сходства (Г.В. Дунаев, 1971; F. Fitz-James,1968). Некоторые различия, установленные при сравнительном электронно-микроскопическом анализе В. anthracis и Вас. cereus, можно отнести к количественным, но не качественным показателям (толщина клеточной стенки у В. anthracis - 36 - 46 нм и у сапрофита - 20 - 25 нм; большая интенсивность развития внутри цитоплазматических мембранных структур у паразита, вследствие инвагинационного роста цитоплазматической мембраны).

Одним из общебиологических законов эволюционного развития биологических видов является объяснение сходства организмов их родством, а различие - приспособлением к разной среде (Х.Х. Абдуллин, 1976; Б.Л. Черкасский, 1983; G. Nessetal., 1968).

На основе приспособительной эволюции в лабораторных условиях при длительном культивировании вирулентных штаммов с добавлением в питательные среды различных индукторов были получены сибиреязвенные вакцинные штаммы. С точки зрения эволюционных преобразований эти адаптивно-преобразованные виды

микробов сохранили только элементы остаточной вирулентности, поскольку в новых условиях они перестали нуждаться в функциональном проявлении патогенности. Подобные эволюционные преобразования происходят и в природе. При подходящих почвенных и климатогеографических условиях, наличии восприимчивых животных сибиреязвенный микроб сохраняет присущие ему свойства, может даже происходить ус