Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Актуальные проблемы сибирской язвы: биология и индикация возбудителя, клиника, патоморфология и диагностика заболевания

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Актуальные проблемы сибирской язвы: биология и индикация возбудителя, клиника, патоморфология и диагностика заболевания"

На правах рукописи Для служебного пользования Экз.№011

АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ: БИОЛОГИЯ И ИНДИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ, КЛИНИКА, ПАТОМОРФОЛОГИЯ И ДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЯ

03.00.07 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Казань 2001 г.

Работа выполнена в лаборатории контроля и индикации возбудителей бактерийных инфекций Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института (г. Казань), Научно-исследовательском институте микробиологии МО РФ (г. Киров) и Центре военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ (г. Екатеринбург).

Научные консультанты: доктор ветеринарных наук, старший научный

сотрудник Садыков Н.С.

доктор медицинских наук, профессор Литусов Н.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный

сотрудник Ильясова Г.Х.

доктор медицинских наук, профессор Поздеев O.K. доктор ветеринарных наук, профессор Ешкова М.С.

Ведущая организация - Московская академия ветеринарной медицины и биотехнологии им К.И. Скрябина

Защита состоится «30» июля 2001 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте (г. Казань, Научный городок,2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института.

Автореферат разослан «иЙ?..» июня 2001 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Степанов В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время сибирская язва имеет довольно широкое распространение в большинстве стран мира и не является редкостью на территориях бывшего СССР. По далеко не полным данным, в мире ежегодно регистрируется 20...100 тысяч случаев заболевания человека сибирской язвой /Dirckx J.M., 1981; Velmirovic В., J 984/. Однако, по мнению специального комитета ВОЗ, фактическое число заболеваний людей сибирской язвой в мире в 2... 10 раз превышает официальные данные, так как во многих странах регистрация этой инфекции не является обязательной, а отдельные страны, в том числе СССР, не давали официальных сообщений об этом заболевании. Такая высокая заболеваемость людей сибирской язвой объясняется наличием огромного количества почвенных очагов возбудителя, неблагополучной эпизоотической обстановкой и отсутствием во многих странах надежных средств специфической профилактики сибирской язвы.

Несмотря на достаточную изученность проблемы сибирской язвы, до сих пор в мире наблюдаются масштабные эпидемии этой болезни среди люден и эпизоотии среди сельскохозяйственных животных /Turner М., 1980; Davies Г.С.А., 1982, 1983/. При этом сибирская язва продолжает характеризоваться высокой летальностью даже в условиях применения современных лекарственных препаратов, достаточно эффективных при других инфекциях.

Способность возбудителя сибирской язвы длительно сохраняться в почве (более 50 лет), размножаться и укореняться на многие годы привела к образованию стойких очагов почти на всей территории бывшего СССР (от нескольких десятков до сотен очагов в каждой области), что создает постоянную, реальную угрозу возникновения эпизоотии и эпидемий сибирской язвы /Черкасский Б.Л., 1983, 1997; Бургасов П.Н., Рожков Г.И., 1984; Гаврилов В.А., 1987; Ипатенко Н.Г. и др., 1987; Онищенко Г.Г. и др., 1999: Маринин Л.И. и др., 1999/.

После распада СССР и связанного с этим развала слаженной противоэпидемической системы нельзя считать стабильной на территориях СНГ эпизоотическую и эпидемическую ситуацию по сибирской язве, так как доказано, что в настоящее время продолжают происходить процессы трансформации активности существующих и формирование новых почвенных очагов сибирской язвы. Об этом свидетельствуют многочисленные вспышки сибирской язвы среди животных и людей, наблюдавшиеся в течение последних лет в ряде областей Российской Федерации, а также в Казахстане, Грузни и на других территориях бывшего СССР /Бакулов И.А. и др., 1998/.

Эпидемическую опасность в стране по сибирской язве в значительной степени определяют расширяющиеся в последние годы торговые контакты с зарубежными странами, так как установлено, что импортная продукция животного происхождения из многих стран Азии, Африки, Южной Америки и

Южной Европы весьма часто загрязнена спорами возбудителя сибирской язвы, причем штаммов, отличающихся по культурально - морфологическим н биохимическим признакам от классических штаммов, выделяемых на территории России и бывших республик СССР/Богомолов Ф.И., 1967, 1968; Иппо-литова Л.Л., 1968; Ипатепко Н.Г. и др., 1992/. В связи с этим нередки случаи заболевания сибирской язвой среди представителей отдельных профессиональных групп людей.

В комплексе эффективных профилактических мероприятий при сибирской язве значительное место занимают своевременная диагностика заболевания у животных и людей, а также специфическая индикация возбудителя в объектах внешней среды, предусматривающая этапы обнаружения, выделения и идентификации возбудителя. Вместе с тем, несмотря на многочисленные работы, до сих пор не определены критерии идентификации В. атЪгааз, и отсутствуют надежные средства и методы индикации возбудителя, а также диагностики заболевания сибирской язвой.

Для решения проблем эпизоотологии и эпидемиологии, диагностики, профилактики и лечения сибирской язвы, а также для разработки надежных средств и методов индикации ее возбудителя важное значение имеют знания о биологии сибиреязвенного микроба. К сожалению, в большинстве из многих сотен работ по сибирской язве объектом изучения служили единичные штаммы сибиреязвенного микроба, а описание их обычно проводилось по ограниченному набору тестов, что создавало ошибочное представление о единообразии штаммов в пределах вида В.агНЬгасЬ.

Из-за недостаточно представительной выборки штаммов для их описания нередко разные авторы делают противоречивые выводы о наличии или отсутствии того или иного признака у вида В-аШИгаав. Подобного рода информация об этом биологическом виде вредна для принятия научно - обоснованного решения о направлениях работ по разработке и внедрению в практику средств и методов, необходимых для эффективного осуществления противо-сибиреязвеиных мероприятий.

Чрезвычайно высокое эппзоотолого - эпидемиологическое значение имеет знание особенностей клиники и патоморфогенеза сибирской язвы в зависимости от входных ворот возбудителя инфекции, так как постановка правильного прижизненного диагноза этой инфекции у животных и людей затруднена из-за полиморфизма клинической картины заболевания и отсутствия патогномоничных симптомов, а также гибели большинства больных вскоре после появления первых признаков болезни. Обычно не диагностируемые по клиническим данным единичные и групповые случаи заболеваний получают правильную оценку лишь после латологоанатомического исследования трупа, которое играет основную роль в посмертной диагностике сибирской язвы, особенно ее внутренней (висцеральной) формы. После выяснения этиологии патологоанатом решает вопрос о форме заболевания и путях заражения, которые обычно устанавливаются по локализации патологоанатомических измене -

ний, что считается возможным при наличии демонстративных поражений какого - либо одного из внутренних органов. Сложнее обстоит дело в случаях, если одновременно поражено несколько органов или выявляемые изменения не отражены в клинико-анатомической классификации. В таких случаях без знания патогенеза и данных экспериментальных исследований почти невозможно правильное решение вопроса о форме заболевания сибирской язвой и путях заражения ее возбудителем. В связи с этим необходимо создать патогенетическую классификацию сибирской язвы, учитывающую последовательность возникновения основных патологоанатомических изменений, наблюдаемых во внутренних органах и тканях организма, в зависимости от входных ворот возбудителя инфекции.

Целью настоящей работы является теоретическое и экспериментальное изучение актуальных проблем таксономии, индикации и идентификации B.anthracis, клиники, патоморфогенеза и диагностики сибирской язвы для научно обоснованного выбора направлений дальнейших исследований по совершенствованию противосибиреязвенных мероприятий.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решить следующие задачи:

1. Изучить биологические свойства штаммов B.anthracis различного происхождения, оценить их таксономическую значимость для выбора критериев идентификации и внутривидового типирования штаммов данного возбудителя;

2. Разработать и апробировать схему и методы обнаружения и выделения B.anthracis из объектов внешней среды, а также его идентификации от близкородственных видов спорообразующих бацилл;

3. Изучить особенности клиники и патоморфологии сибирской язвы у животных и людей в зависимости от входных ворот возбудителя инфекции;

4. Обосновать перспективные направления теоретических и экспериментальных исследований по проблеме сибирской язвы для разработки жизненно важных иммунобиологических препаратов, необходимых для профилактики, лечения и диагностики заболевания и индикации его возбудителя.

Научная новизна работы заключается в том, что на основании новых данных о биологии возбудителя сибирской язвы разработана концепция о таксономии вида B.anthracis, предусматривающая подразделение его на 4 подвида (BAI, ВАП, ВАШ. BAIV), из них первый подвид (BAI) - на 4 типа (BAIa, BAIo, BAIb, BAIr). С учетом новой классификации сибиреязвенного микроба разработаны схемы специфической индикации и идентификации B.anthracis с применением методов определения такономически значимых признаков, характерных для штаммов всех 4-х подвидов возбудителя сибирской язвы.

Впервые применительно к возбудителю сибирской язвы показана возможность изучения на желточно-полимиксиновой дифференциально-диагностической среде лецитиназной активности по трем типам яично-желточ-

ной реакции - лецитиназной (J1P), преципитации (РП) и опалесценции (РО) с учетом морфологического типа колоний.

Показано, что для значительного количества штаммов B.anthracis, вне зависимости от принадлежности к тому или иному подвиду, характерно наличие лизогении. Установлено, что при лнзогенизации культур штаммов подвида BAI вновь выделенными бактериофагами возникают варианты сибиреязвенного микроба, по таксономическим признакам соответствующие штаммам подвидов ВАЛ и ВАШ.

По результатам моноантигенного анализа с использованием монорецеп-торных сывороток к 7 антигенам (Р, SD, ST, TL, VC, С и S) штаммы B.anthracis разделены на 50 антигенных типов.

Впервые установлено, что в качестве критериев идентификации B.anthracis от близкородственных бацилл возможно рассматривать следующие особенности ультраструктурной организации спор: наличие однослойного экзоспориума, микроворсинок длиной 0,03 мкм, 3...5 - слойной споровой оболочки, а также свободного от осмиофильных гранул пространства между эк-зоспориумом и споровой оболочкой.

Установлено, что высоковирулентные и вирулентные штаммы трех типов подвида BAI (типы BAIa, BAJ6, BAIb) однородны по токсино- и капсуло-образованию, плазм идиому спектру и имеют феноплазмидотип Сар'02 СарХ02Тох+/рХ01/рХ02+, а слабовирулентные штаммы этого подвида (тип BAIr), имеющие аналогичный феноплазмидотип, являются гетерогенными по составу микробной популяции (признак Сар+ выявлен у 10% и менее бактерий популяции, рХ024 - у 60...85%). Штаммы подвидов BAII, ВАШ и BAIV подразделены по феноплазмидотипу соответственно на 3,4 и 2 группы.

На основании сравнительного изучения у человека и разных видов животных особенностей клиники и патоморфологии сибирской язвы разработана патогенетическая классификация этой сапрозоонозной особо опасной инфекции, учитывающая способ заражения и локализацию возбудителя инфекции, лишенная недостатков клинико-анатомической классификации, позволяющая определить место любому патоморфологическому изменению или сочетанно-му поражению нескольких внутренних органов и установить форму заболевания.

Новизна работы подтверждена одним изобретением (№165544 от 8.10.1981г.) и двумя патентами (№ 2115433 от 20.07.1988г., № 2161985 от 20.01.2001г.).

Теорет ическая значимость работы заключается в том, что результаты проведенных исследований явились основанием для определения новых направлений НИОКР по проблеме сибирской язвы.

Практическая значимость работы заключается в том, что новые данные о биологии и таксономии B.anthracis позволили разработать и внедрить в практику военно-медицинской службы, а также рекомендовать для практического использования в микробиологических лабораториях схем специфике-

ской индикации и идентификации сибиреязвенного микроба с применением методов определения основных таксономически значимых признаков, характерных для штаммов всех 4-х подвидов возбудителя сибирской язвы.

Аргументированность обоснования новых направлений НИОКР по проблеме сибирской язвы подтверждена практическими результатами при разработке и внедрении комбинированной сибиреязвенной вакцины (ВФС 42-329796) и противосибиреязвенного глобулина для медицинских целей (ВФС 423770-99), а также в организации производства сибиреязвенных вакцин, глобулина противосибиреязвенного для обеспечения потребностей военно-медицинской службы и здравоохранения России.

Теоретические и экспериментальные данные, которые обобщены в диссертации, получены в период с 1974 по 2001 гг. при выполнении плановых и инициативных тем НИР.

Результаты исследований представлены в 41 научной работе (научные отчеты, сборники докладов, монографии).

На защиту выносятся следующие основные научные положения и результаты:

1. По сочетанию основных признаков - культурально-морфоло-гических, вирулентности для лабораторных животных и способности в разных условиях образовывать капсулу, вид Bacillus anthracis подразделен на 4 таксономических подвида (BAI, BAU, ВАШ, BAIV), из них первый подвид (BAI) -на 4 типа (ВА 1а, ВАШ, BAIb, BAIr):

а) в соответствии с предложенной классификацией первый подвид (BAI) В.anthracis состоит из в ы с о ко в и р ул с нт н ы х (типы BAla, BAIb), вирулентных (тип ВА16) и слабовирулентных (тип BAIr) штаммов, образующих капсулу в макроорганизме и на бикарбонатном (сывороточном) агаре в атмосфере углекислого газа, формирующих на МПА в атмосфере воздуха шероховатые колонии (R, RO, RR, RRO), а на бикарбонатном агаре в атмосфере С.02 - колонии слизистой (S-форма) и/или полуслизнстой (OS-форма) консистенции;

б) второй подвид (BAII) B.antliracis представлен вирулентными и слабовирулентными штаммами, образующими капсулу' в макроорганизме и на питательных средах вне зависимости от наличия в них бикарбоната натрия (сыворотки) и концентрации углекислого газа в атмосфере, формирующими колонии слизистой (S) и/или полуслизистой (OS) консистенции как на МПА в атмосфере воздуха, так и на бикарбонатном (сывороточном) агаре в атмосфере С02. Отдельные штаммы подвида BAII характеризуются высокой вирулентностью в отношении интактных и иммунизированных вакциной СТИ-1 лабораторных животных:

в) штаммы третьего подвида (ВАШ) В.anthracis являются слабовирулентными и невнрулентными. образуют капсулу в макроорганизме и на МПА в атмосфере воздуха, формируют на обычном питательном агаре в атмосфере воздуха колонии слизистой (S) и/или полуслизистой (OS) консистенции, не способны размножаться на бикарбонатном (сывороточном) агаре в атмосфере

С02 или дают на этой среде скудный рост (менее 10 % микробной популяции) культуры в виде колоний шероховатой (R, RO) и гладкой (О) формы;

г) штаммы четвертого подвида (BAIV) B.anthracis являются невирулентными, не образуют капсулу ни при каких условиях, формируют на питательных средах, вне зависимости от наличия в них бикарбоната натрия, в атмосфере воздуха и С02 шероховатые колонии (R, RR, RO, RRO);

2. Разработанные схемы индикации и идентификации B.anthracis пригодны для обнаружения, выделения и идентификации штаммов всех 4-х подвидов возбудителя сибирской язвы;

3. Патоморфология внутренней (висцеральной) формы сибирской язвы у человека и различных видов высоко восприимчивых животных в основном сходна: независимо от способа заражения возбудителем и локализации входных ворот инфекции, обнаруживаемые на вскрытии во внутренних органах патологоанатомические изменения являются следствием генерализованной инфекции, однотипны и встречаются с одинаковой частотой. Исключение составляют специфические поражения тонкой кишки, наблюдаемые только при алиментарном заражении. При разных способах заражения наиболее демонстративные изменения выявляются в органах грудной клетки, тогда как патология органов брюшной полости менее представительна даже при энтеральном заражении;

4. Патологоанатомическая картина экспериментальной сибирской язвы у животных, обусловленная действием вирулентных и слабовирулентных штаммов подвида BAU B.anthracis, по характеру морфологических изменений однотипна с таковой у животных, погибших после заражения культурами высоковирулентного штамма подвида ВА1. Однако выраженность патологоана-томической картины у животных, погибших в одинаковые сроки наблюдения после заражения культурами штаммов подвидов BAI и ВАП, была разной: более вирулентным штаммам соответствовала более выраженная патологоанатомическая картина заболевания;

5. Разработанная патогенетическая классификация сибирской язвы, учитывающая способ заражения и локализацию возбудителя инфекции, лишена недостатков клинико-анатомической классификации (невозможность определения формы заболевания при поражении нескольких органов), позволяет определить место любому патоморфологическому изменению или сочетанному поражению нескольких внутренних органов и установить форму заболевания;

6. Основными направлениями дальнейших исследований по проблеме сибирской язвы являются:

а) изучение биологии и генетики вновь выделяемых из разных источников (животных, людей, почвы и т.п.) штаммов B.anthracis. оценка эпидемической и эпизоотической опасности штаммов, относящихся к разным подвидам возбудителя;

б) разработка новых и совершенствование существующих средств и методов специфической индикации В.атЬгас!^, лабораторной диагностики сибирской язвы, прежде всего внутренней (висцеральной) ее формы:

в) разработка и совершенствование технологий и организация производства сибиреязвенных диагностикумов, вакцинных препаратов, глобулина противосибнреязвеиного, высокоактивного видоспецифического диагностического сибиреязвенного бактериофага;

г) изучение лечебно - профилактической эффективности современных антибиотиков в комбинации со средствами иммунопрофилактики (вакцинами и глобулинами) и иммуномодуляторами при внутренней форме сибирской язвы;

д) совершенствование противосибиреязвенных мероприятий с учетом данных районирования территорий страны по степеиии опасности возникновения эпизоотических и эпидемических вспышек сибирской язвы.

Решение задач по указанным направлениям позволит проводить проти-восибиреязвенные мероприятия своевременно и эффективно, что чрезвычайно важно в экстремальных условиях.

Результаты исследований реализованы составлением следующих документов:

а) руководства "Схемы и методы бактериологической диагностики и экстренной профилактики опасных инфекционных заболеваний (чумы, сибирской язвы, сапа, мелиоидоза, бруцеллеза, туляремии, холеры)" (Утверждено начальников НИИМ МО РФ 28.1*2.1995г., Киров, Арх. НТВ НИИМ МО РФ, инв.№ 564 бр., 1995,435 е.):

б) "Сборника методик для работы с возбудителем сибирской язвы" (Утверждено начальником НИИМ МО РФ, Арх. НТБ НИИМ МО РФ, инв.№ 30249, 1988);

в) "Сборника методик для работы с возбудителем сибирской язвы" (Утверждено начальником ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ и директором ВНИВИ Минсельхозпрода РФ, апрель 2001г., Екатеринбург - Казань, Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, 2001);

г) предложений по совершенствованию средств и методов медицинской защиты от сибирской язвы в "Перспективные планы НИР" НИИ микробиологии МО РФ и ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ на 1981 ... 1985 гг., 1986 ... 1995 гг., 1966...2000 гг., 2001...2005 гг.;

д) учебно-методического пособия для проведения занятий по военной эпидемиологии и микробиологии для слушателей офицерских курсов и практических врачей "Лабораторная диагностика сибирской язвы у людей" (Утверждено начальником СВМИ 19.10.1999 г., Самара. 1999, 34 е.);

е) "Инструкции по приготовлению и поддержанию рабочей культуры тест - штамма 71/12 второй вакцины Ценковского" (Утверждена начальником ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ 21. 08.2000 г., Екатеринбург, Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. инв. № 416 ДСП, 2000,28 е.);

ж) "Методики ускоренной оценки эффективности антибактериальных препаратов на белых мышах, зараженных внутрибрюшинно споровой культурой сибиреязвенного тест - штамма 71/12 второй вакцины Ценковского" (Утверждена начальником ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, 21.08. 2000 г., г. Екатеринбург, Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, нив. № 417 ДСП, 2000, 8 е.);

з) регламентов производства РП № 739 - 98 "Глобулин противосибире-язвенный лошадиный жидкий" и изменений № 1 к регламенту производства РП № 740 - 98;

и) фармакопейной статьи ФС 42-3770-99 "Глобулин противосибиреяз-венный лошадиный жидкий" и "Инструкции по применению глобулина проти-восибиреязвенного лошадиного жидкого" (Утверждена в 1999 г);

к) предложений по специфической индикации В.апШгааэ в проект "Руководства по военной микробиологии" (М., 2000, 360 е., ДСП);

л) временной фармакопейной статьи ВФС 42-199ВС-92 и фармакопейной статьи ФС 42-3297-96 на "Вакцину сибиреязвенную комбинированную жидкую для подкожного применения";

м) экспериментально - производственного регламента ЭПР № 365-92 для получения вакцины сибиреязвенной комбинированной жидкой для подкожного применения и регламента производства РП № 980-00 для получения вакцины сибиреязвенной живой для подкожного и скарификационного применения сухой.

Материалы исследований использованы при составлении технических заданий на 37 тем НИР для НИИ микробиологии МО РФ, ЦВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ и ВНИВИ Мннсельхоза РФ.

Все исследования, результаты которых представлены в диссертации, выполнены лично автором, под его научным руководством или в соавторстве. Результаты теоретических и экспериментальных исследований, проведенных совместно с другими исполнителями, приводятся с согласия соавторов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 598 страницах машинописного текста н состоит из введения, аналитического обзора (2 главы), материалов и методов исследований (1 глава), результатов теоретических и экспериментальных исследований (5 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников (376 отечественных и 198 иностранных). Работа иллюстрирована 106 таблицами и 138 рисунками.

Автор выражает свою признательность руководству ВНИВИ Минсель-хоза РФ за предоставленную возможность обобщения результатов теоретических и экспериментальных исследований в виде докторской диссертации.

Искреннюю благодарность автор выражает научным консультантам работы доктору ветеринарных наук Садыкову Нариману Султановичу и доктору медицинских наук Литусову Николаю Васильевичу, оказавшим большую консультативную и практическую помощь при оформлении настоящей работы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Материалы и методы исследований

Для выполнения поставленных задач были использованы следующие материалы:

1). Штаммы B.anthracis, выделенные из различных источников (больных животных и людей, их трупов, кормов, пищевых продуктов, кожевенного сырья, почвы, сточных вод сырьеперерабатывающих предприятий) - всего 532 лабораторных штамма, около 300 свежевыделенных культур и около 500 кло-новых культур;

2). Штаммы близкородственных бацилл (B.cereus, B.thuringiensis, B.mycoides, B.megaterium, B.subtilis, B.pumilus и ряд неидентифицированных культур аэробных бацилл I морфологической группы рода Bacillus - всего 563 штамма);

3). Питательные основы и среды, изготовленные в специализированных подразделениях НИИ микробиологии МО РФ и Центра ВТП БЗ НИИМ МО РФ;

4). Реактивы и другие материалы, преимущественно отечественного производства;

5). Лабораторные и сельскохозяйственные животные: белые мыши (около 50 тыс. гол.), морские свинки ( около 5 тыс. гол.), белые крысы (около 2 тыс. гол.), кролики (около 1,5 тыс. гол.), обезьяны павианы гамадрилы, овцы, лошади, собаки, а также больные люди и контингент добровольцев (только для испытания вакцинных препаратов).

В работе использовали различные методы исследований: бактериологические, биохимические и серологические методы; физико-химические методы анализа; методы ПЦР - анализа; методы для исследования ультраструктур спор: платино-углеродных реплик, отгенения тяжелыми металлами и ультратонких срезов (препараты изучали с помощью электронных микроскопов просвечивающего (JEM -100В) и растрового (JSM-U3) типов при ускоряющем напряжении соответсвенно 80 и 25 кВ).

Методы исследования подробно изложены в «Сборнике. методик для работы с возбудителем сибирской язвы», составленным по результатам настоящей работы /Сборник..., 2001/.

2. Результаты исследований и их обсуждение

Результаты изучения культурально-морфологических свойств штаммов B.anthracis и близкородственных бацилл показали, что по характеру роста на питательных средах, способности к росту при температуре 45°С, капсулообра-зованига in vitro, подвижности клеток и способности изменять морфологию

клеток в тесте «жемчужного ожерелья» большинство штаммов сибиреязвенного микроба являются типичными представителями I, II и III типов B.anthracis в соответствии с общепринятой классификации по Thome С. В. /1960/.

Лишь отдельные штаммы близкородственных видов бацилл были схожими со штаммами III типа B.anthracis по характеру роста на питательных средах, способности к росту при 45°С, подвижности бактерий и тесту «жемчужного ожерелья». Особо значимыми являются данные об отдельных штаммах B.anthracis, отличающихся по культуральио-морфологическим свойствам от так называемых «типичных» штаммов, что подтверждается данными табл.1, где приведена подробная характеристика штаммов сибиреязвенного микроба различного происхождения по морфологическому типу колоний на МПА и бикарбонатном агаре. По морфологическому типу колоний в обычных условия культивирования 64,5% штаммов B.anthracis относятся к так называемым «типичным» штаммам, так как они на МПА в атмосфере воздуха растут в виде шероховатых колоний (R и RO формы). Важно подчеркнуть, что абсолютное большинство научных исследований в нашей стране и за рубежом, выполненных более чем за 100 - летнюю историю изучения возбудителя сибирской язвы, было направлено на разработку МИБП против этой инфекции, вызываемых штаммами с шероховатым морфологическим типом колоний.

Однако, как видно из этой же табл. 1, около 35% штаммов B.anthracis различного происхождения формируют в обычных условиях культивирования так называемые «атипичные» для этого микроба колонии гладкой, полуслизистой (OS) и слизистой (S) формы.

Отметим, что существующие на сегодняшний день схемы выделения и идентификации B.anthracis не предусматривают выделения от сибиреязвенных животных и людей и из объектов внешней среды культур с указанными морфологическими типами колоний.

На бикарбонатном или сывороточном агаре в атмосфере углекислого газа около 73% штаммов B.anthracis формировали полуслизистые или слизистые колонии, состоящие из капсульных бацилл, около 21% штаммов образовывали шероховатые колонии, состоящие из бескапсульных бактерий. В наших исследованиях 32 штамма (6%) из 532 изученных не были способны давать рост на бикарбонатном или сыворотном агаре в атмосфере углекислого газа. Следовательно, указанная среда, рекомендуемая многими авторами для идентификации B.anthracis, не позволяет выделять часть существующих в природе штаммов сибиреязвенного микроба. Зпш следует объяснить многочисленные случаи отрицательных результатов бактериологических исследований материалов, взятых для анализа от заведомо больных сибирской язвой животных и людей или их трупов.

Таблнца 1. - Характеристика штаммов В.агН|1гаа8 различного происхождения но морфологическому типу колоний на МПА и БА

Источники выделения штаммов Изучено штаммов Количество штаммов, имеющих в популяции более 80% морфологических типов колоний, %

MI (в атмосфе 1А ре воздуха) БА (в атмосфере С02) *

R, RO О OS S R, RO OS S

Люди 30 90,0 3,3 3,3 3,3 3,3 0 96,7

КРС 33 93,9 0 6,1 0 3.0 3,0 93,9

Лошади 37 86,4 0 10,8 2,7 16,2 0 83,8

MPC 34 94,1 0 5,9 0 0 5,9 94,1

Свиньи 22 40,9 4,6 40.9 13,6 31,8 22,7 31,8

Собаки 3 66,7 0 33,3 0 33,3 0 66,1

Мясо и мясопродукты 17 94,1 0 5,9 0 52,9 5,9 41,2

Искусственные комбикорма 20 80,0 0 15,0 5,0 30,0 10,0 60,0

Кожевенное сырье и сточные воды 11 90,9 0 9,1 0 0 0 100,0

Почва 82 83.0 2,4 12,2 2,4 32,9 13,4 51,2

Другие источники 243 41,1 2,1 19,8 37,0 21,8 12,8 54,3

Итого 532 64.5 и 15,4 18,4 20,9 10,0 63,2

Примечание: * На бикарбонатном агаре в атмосферере С02 не растут культуры 32 штаммов (6%), выделенных от свиней (3 штамма), из почвы (2 штамма) и других источников (27 штаммов).

В связи с вышеизложенным, нами предлагается новая классификация сибиреязвенного микроба по морфологическому типу колоний (табл. 2), предусматривающая подразделение B.anthracis на 4 подвида, а первого подвида, кроме того, па 4 типа:

подвид BAI - высоковирулентные, вирулентные и слабовирулентные штаммы, образующие капсулу в макроорганизме и на бикарбонатом агаре в атмосфере углекислого газа, формирующие на МПА в атмосфере воздуха шероховатые колонии, а на бикарбонатном агаре в атмосфере углекислого газа -слизистые и/или полуслизистые колонии;

подвид ВАМ - вирулентные и слабовирулентные штаммы, образующие капсулу в макроорганизме и на питательных средах вне зависимости от наличия в них бикарбоната и концентрации углекислого газа в атмосфере, формирующие слизистые и полуслизистые колонии как на МПА в атмосфере воздуха, так и на бикарбонатом агаре в атмосфере углекислого газа;

подвид ВАШ - слабовирулентные и невирулентные штаммы, образующие капсулу в макроорганизме и на обычном питательном агаре в атмосфере воздуха и не способные размножаться на бикарбонатном агаре в атмосфере углекислого газа или дающие на этой среде скудный рост культуры в виде колоний шероховатой формы;

подвид ВА1У - невирулентные штаммы, не образующие капсулу ни при каких условиях, образующие на МПА в атмосфере воздуха и на бикарбонатном агаре в атмосфере углекислого газа только колонии шероховатой формы.

Таблица 2. - Классификация В.атЬгааэ по морфологическому типу колоний х)

Подвид, тип Морфологический тип колоний Капсулообразование Вирулентность для белых мышей при в нутри брю шинном заражении, ЛД50, спор (клеток)

МПА (в атмосфере воздуха) БА (в атмосфере С02) ¡п УЙГО г сфе атмо-ре Ю \ЧУО

воздуха со2

1,1а II,КО 5 — + + 218(176+269)

1,16 Il.RO ОБ - + + 1484 (405+2563)

1,1в ИДО Б,ОБ — + + 312(279+356)

Мг ИДО Б,ОБ — ± + 656...6,2*103

И Б, ОБ 8,ОБ + -г + от 110... 1»10^ и>

III Б,ОБ нет роста или К и ЛО (рост менее 10% популяции) - + >6Ч03 ...< МО6

IV 11ДО Il.RO - - - 4*103... 6*106 и >

Примечание:х) знак "+" и "±" соответственно означают, что 90 % или более и 10 % или менее бактерий популяции исследуемых шшммов обладают капсулообразующей способностью, а знак "-" - полное отсутствие этого признака

Из данных табл. 3 следует, что по морфологическому типу колоний многие штаммы возбудителя, отнесенные нами к подвиду ВАШ, не соответствуют по основным таксономическим признакам ни одному типу по классифи-

кации Thome C.B. Более того, штаммы I типа по Thorne C.B., соответствующие подвиду BAI по нашей классификации, существенно отличаются друг от друга по капсулообразующей способности и по вирулентности, в связи с чем и возникла необходимость подразделения этой группы штаммов на 4 типа. Несмотря на то, что и другие подвиды B.anthracis могут быть подразделены в последующем па типы, предложенная классификации уже сегодня должна быть использована при разработке и совершенствовании средств и методов диагностики, лечения и профилактики сибирской язвы и специфической индикации ее возбудителя.

Таблица 3. - Распределение штаммов B.anthracis различного происхождения по морфологическому типу колоний

Источники выделения штаммов Изучено штаммов Количество штаммов с морфологическим типом колоний по классификации, %

Thorne C.B.. 1960 (типы) Васильева П.Г. и др., 2000 (подвиды)

I II III I II Ш IV

Люди 30 86,7 10,0 3,3 86.7 10,0 0 3,3

КРС 33 90,9 6,1 3,0 90,9 6Д 0 3,0

Лошади 37 70,3 13,5 16,2 70,3 13,5 0 16,2

MPC 34 94,1 5,9 0 94,1 5,9 0 0

Свиньи 22*' 9,1 45,5 31,8 9,1 45,5 13.6 31,8

Собаки 3 33,3 33,3 33,3 33.3 33,3 0 'у ч

Мясо и мясопродукты 17 41,2 5,9 52,9 41,2 5,9 0 52,9

Комбикорма искусственные 20 50,0 20.0 30,0 50,0 20,0 0 30,0

Кожевенное сырье и сточные воды 11 90,9 9,1 0 90,9 9,1 0 0

Почва 82*J 50,0 14.6 32,9 50,0 14,6 2.5 32,9

Другие источники 243*' 19,3 47,8 21,8 19,3 47,8 11.1 21,8

Итого 532*1 43,6 29.5 20,9 43,6 29,5 6,0 20,9

Примечание: *) - Не соответствует типу по Thorne C.B. /1960/ 32 (6%) штаммов, выделенных от свиней, из почвы и других источников.

Экспериментально доказана возможность получения штаммов II и III подвидов B.anthracis под влиянием бактериофагов с видоспецифическим и поливалентным спектром литической активности. При лизогенизации культур сибиреязвенного микроба бактериофагами возникают клоны с выраженной спонтанной фагопродукцией, индуцирующей у бактерий способность к продукции капсулыюй субстанции, необходимой им для защиты от литического действия фаговых частиц. Предполагается, что в естественных условиях обитания возбудителя (в макроорганизме, почве) различные неблагоприятные для микроба воздействия (контакт с антибактериальными препаратами, бактерио-цинами и бактериофагами почвенных микроорганизмов, действие УФЛ и т.п.) могут индуцировать у сибиреязвенных бактерий развитие профага в зрелый бактериофаг и, как следствие, появление клонов со свойствами штаммов второго и третьего подвидов B.anthracis.

Результаты изучения плазмидного спектра, токсино- и капсулооборазо-вания B.anthracis, обобщенные в таблицах 4 и 5, позволяют сделать вывод о том, что высоковнрулентные и вирулентные штаммы подвида BAI (типы BAIa, ВАШ, ВА1в) и их микробные популяции однородны по феноплазмидотипу Сар" 02Сар+С02Тох+ /рХОГ рХ02", а слабовирулентные штаммы этого подвида (тип ВА1г), имеющие аналогичный феноплазмидотип, являются гетерогенными по составу микробной популяции (признак Сар+ выявлен у 10% и менее бактерий популяции, рХ02 - у 60...85%). Штаммы подвида BAII подразделены по феноплазмидотипу иа 3 группы (Cap* 02 Сар+ С02 Тох" / pXOl+ рХ02+; Сар' 02 Сар" С02 Тох ' / рХО 1 " рХ02'; Сар+ 02 Сар+ С02 Тох " / pXOl" рХ02"), штаммы подвида ВАШ - на 4 группы (Сар* О; Сар" С02 Тох+ / рХОГ рХ02': Сар* 02 Сар "С02 Тох "/ pXOl " рХ02*; Сар' 02Сар " С02Тох+ /рХ01 " рХ02 "; Сар+ 02 Сар " С02 Тох "/ pXOl ' рХ02"), штаммы подвида BAIV - на 2 группы (Сар" 02 Сар" СО: Тох+ / pXOl' рХ02'; Сар" ОгСар" С02 Тох 7 рХОГ рХ02").

Показано, что для значительного количества штаммов B.anthracis, вне зависимости от принадлежности к тому или иному подвиду, характерно наличие лизогешш: BAIa и BAIV - у 25,0%, BAI6 и ВА1в - у 33,3%, ВАШ - у 100,0%, BAII - у 45,5% лабораторных и 100,0% "свежевыделенных" штаммов. Изучение электронно-микроскопического строения фаговых карпускул показало, что сибиреязвенные бактериофаги, выделенные из лизогенных культур (13 фагов) и почвы скотомогильников (9 фагов), относятся к IV и V морфологическим типам. Видоспецифический фаг ФПГ из лизогешюй культуры подвида BAII является представителем IV морфологического типа (октаэдр, диаметр головки - 50 нм, отросток длиной 200 нм и диаметром 7,5 нм) и, как видно из представленных в табл. 6 данных, обладает наибольшим спектром литической активности в отношении штаммов B.anthracis среди общеизвестных бактериофагов (гамма-MBA, К-ВИЭВ и др.). Остальные из 33-х вновь выделенных бактериофагов могут быть использованы для внутривидового фаго-типирования B.antracis.

Таблица 4. - Результаты изучения плазмидного спектра, токсино- и капсуло-образования у штаммов разных подвидов В.апгЬгаа^

Подвид, тип Изучено штаммов Количество штаммов с феноплазмидотипом, %

Тох+х Сар"" рХ01 + рХ02+

1а 62 100,0 100,0 100,0 100,0

16 12 100,0 100,0 100,0 100,0

1в 9 100,0 100,0 100,0 100,0

Ir 3 100,0 100,0 100,0 100,0

la, б, в, г 86 100,0 100,0 100,0 100,0

II 38хх 63,2 100,0 63,2 94,7

III 44х* 63,6 100,0 63,6 75,0

IV 24 79,2 0 79,2 0

Примечание:* - токсинообразование и каисулообразование у штаммов типа Ir и подвида III определяли in vitro и in vivo /см. Сборник ..., 2001/, у остальных штаммов - in vitro на среде СОПЭК /Еременко Е.И., 1997/; *х - у подвидов 11 и III соответственно 22 и 42 штамма получены под воздействием фага.

Таблица 5. - Распределение штаммов разных подвидов B.anthracis по феноплазмидотипу

Количество штаммов Группа по

1од-шд, Фенотип Плазмидотип изучено с феноплазмидотипом классификации

гип абсол. % Е.И.Еременко /1997/

1а Сар 02Сар"С02Тох+ рХ0ГрХ02" 62 62 100.0 1

16 Сар"02Сар~С02Тох+ рХ0ГрХ02" 12 12 100.0 1

Тв Cap'CbCap'COiTox1 рХОГрХ02+ 9 9 100.0 1

Ir Cap~02CapiC02Tox+ рХО 1' рХ02* 3 j 100.0 2

Cap+02Cap+C02Tox+ рХО 1+рХ02+ 38 24 63.1 -

II Сар"02Сар+С02Тох~ рХ0ГрХ02+ 38 12 31.6 -

Сар'ОгСар'СОзТох" рХО 1 "рХ02~ 38 2 5.3 —

Подвид, тип Фенотип Плазм идотип Количество штаммов Группа по классификации Е.И.Еременкс /1997/

изучено с феноплазми-дотипом

абсол. %

III Сар+02Сар~С02Тох+ рхогрхог* 44 28 63.6 -

Сар"02СарХ02Тох~ рХ01""рХ02+ 44 9 20.5 -

Сар~02СарХ02Тох+ рХ0ГрХ02~ 44 2 4.5 -

Сар+02СарС02Тох~ рХ01~рХ02" 44 5 11.4 -

IV Сар~02СарХ02Тох' рХ01+рХ02~ 24 19 79.2 6, 7, 8

СарХ2СарХ02Тох~ рХ0ГрХ02~ 24 5 20.8 -

Примечание: «±» - у штаммов типа 1г признак Сар+ выявлен in vitro у 10% и менее бактерий популяции, плазмида рХ02 - у 60...85%.

Изучение антигенной структуры 169 штаммов B.anthracis в РДП с использованием монорецепторных сывороток к 7 антигенам (Р, SD, ST, TL, VC, С и S) позволило разделить их на 50 антигенных типов. Характерным для подвидов BAI, BAII и ВАШ является наличие штаммов с выраженной антигенной оснащенностью: от 4 до 7 антигенов - у 91,3%, 93,8% и 92,0% штаммов соответственно подвидов BAI, ВАН и ВАШ. У подвида BA1V отсутствовали штаммы, имеющие 7 антигенов, у 46,2% выявлено от 4 до 6 антигенов, у 30,8% - от 1 до 3 антигенов, а у 23,0% штаммов не обнаружен ни один из изученных антигенов. Обращает внимание неоднородность штаммов подвида ВА I по антигенной оснащенности (40 антигенных типов), что свидетельствует о перспективности использования моноантигенного анализа для дополнительного подразделения типов этого подвида на более однородные таксономические группы.

Впервые установлено, что в качестве критериев идентификации B.anthracis от близкородственных бацилл (B.cereus, B.subtilis, B.pumilus и B.megaterium) возможно рассматривать следующие особенности ультраструк-турнон организации спор: начнчие однослойного экзоспориума, микроворсинок длиной 0,03 мкм, 3...5 слой ной споровой оболочки, а также свободного от осмиофильных гранул пространства между экзоспориумом и споровой оболочкой. Результаты сравнительного изучения ул¡лршлруктуры вегетативных клеток вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл подтверждают данные литературы, полученные на ограниченном количестве вакцинных и непатогенных штаммов, об отсутствии на поверхности клеток B.anthracis какого-либо жгутикового аппарата и наличии такового у всех штаммов близкородственных бацилл. Другими отличиями в ультраструктуре вегетативных клеток B.anthracis от сапрофитных бацилл являются особенности строения клеточной стенки: различная ее толщина (0,03...0,04 мкм -

у В.апШгас^, от 0,02 до 0,08 мкм - у разных штаммов близкородственных бацилл), многосложность, характерная для клеток В.виЫШз н В.ритПив, отсутствие микрофибриллярного материала на наружной поверхности клеточной стенки у штаммов В.сегеив.

Таблица 6. - Чувствительность штаммов разных подвидов B.anthracis к видоспецифическим бактериофагам

Подвид, тип Изучено штаммов Количество штаммов, чувствительных к бактериофагам

Гамма M В А К-ВИЭВ ФЮИ ВПГ

абсол. % абсол. % абсол. % абсол. %

1а 302 294 97,4 294 97,4 296 98,0 302 100,0

16 26 23 88,5 23 88,5 25 96,2 26 100,0

1в 61 57 93,4 57 93,4 59 96,7 61 100,0

1г 3 2 66,7 2 66,7 2 66,7 100,0

1а, б, в, г 392 376 95.9 376 95,9 382 97,4 392 100,0

II-OS, S 20 14 70,0 15 75,0 18 90,0 20 100,0

II — S 24 0 0 0 0 0 0 0 0

II 44 14 31,8 15 34,1 18 40,9 20 45,5

III - OS,S 22 16 72,7 17 77,3 19 86,4 22 100,0

III-s 37 0 0 0 0 0 0 0 0

III 59 16 27,1 17 28,8 19 32,2 22 37,3

IV 137 128 93,4 128 93,4 131 95,6 137 100,0

I,II,III, IV 632 534 84,5 536 84,8 550 87,0 573 90,7

Впервые применительно к возбудителю сибирской язвы показана возможность изучения на желточно-полимиксиновой дифференциально-диагностической среде лецигиназной активности по трем типам яично-желточной реакции - литической (JTP), преципитации (РП) и опалесценции (РО) с учетом морфологического типа колоний. Как видно из данных табл. 7, для подавляющего большинства (75 %) штаммов подвида BAI характерно сочетание признаков ЛР+РП+РО+ и ЛР+РП+РО\

Таблица 7. - Распределение штаммов разных подвидов В.апЛгааБ по сочетанию трех признаков лецитиназной активности

Подвид, тип Изучено штаммов Количество штаммов с фенотипом, %

ЛР' РП+ РО+ ЛР+ РП" РО+ ЛР' РП+ РО' ЛР' РП+ POf ЛРТ РП' РО' ЛР" РП" РО' ЛР" РП" РО* ЛР' РП' РО'

ВА I 176 30,1 44,9 5,1 3,4 6,8 7,4 0,6 1,7

ВА 1а 143 31,5 46,2 4,2 4,2 6,9 4,2 1,4 1,4

ВА 16 12 25,0 41,8 8,3 0 8,3 8,3 0 8,3

ВА 1в 18 27,8 44,4 11,1 0 5,6 11,1 0 0

BAIr 3 0 0 0 0 0 100,0 0 0

BAU 16 62,5 12,5 12,5 0 6,25 6,25 0 0

ВА III 4 25,0 50,0 0 0 25,0 0 0 0

ВА IV 13 23,1 7,7 7,7 15,4 0 15,4 0 30,7

Вид B.anthracis 209 32,1 41,1 5,7 3,7 6,6 6,6 0,9 3,3

Примечания: Лецитиназная активность определена на 5 %-ном. желточном агаре, содержащем 500 мкг/см3 полимиксина М, по трем типам яично-желточной реакции (ЛР- через 1...3 сут., РП -через 1...3 сут.. РО-через 3...5 сут.)

Штаммы с аналогичным фенотипом одинаково часто встречались у типов BAIa, ВАШ и ВА1в. Фенотип ЛР~РП+РО+ был характерен для большинства (62,5%) из 16 изученных штаммов подвида BA1I, а фенотип ЛР+РГГРО+ - для двух из четырех изученных штаммов подвида ВАШ. Для 53,8 % из 13 изученных штаммов подвида BAIV характерно сочетание признаков ЛР'РП РО" и ЛР'РПТО".

Следует отметить, что все изученные штаммы близкородственных бацилл и типа ВА 1г, а также отдельные штаммы типов ВА la, ВА 16, ВА 1в и подвидов BAU и BAI V не отличались друг от друга по лецитиназной активности, имея одинаковый фенотип ЛР'РП+РО*.

Из данных табл. 8 следует, что высоковирулентные и вируленжые штаммы подвида BAI, формирующие на желточно-полимиксиновой среде колонии R, RO, RR и RRO-формы, через 18...24 ч инкубации посевов имеют преимущественный фенотип ЛР+РП" (81,1% BAIa, 75,0% BAI6. 77,8% BAIb), тогда как для слабовирулентных штаммов типа ВА1г и непатогенных штаммов IV подвида с аналогичной морфологией колоний характерен основной фенотип ЛР'РП' (в 100,0% и в 53,8% случаев, соответственно). Для 50,0% штаммов подвидов ВАН и ВА III с S и OS формой колоний в указанные сроки

также характерен фенотип ЛР+РП", а отрицательная реакция (ЛР'РГГ) - соответственно для 31,3% и 50,0% штаммов. Сочетание обоих признаков (ЛР'РГГ) на 1 сут выявляется только у штаммов подвида BAU (6,2%), фенотип ЛР'РГГ имеется у 5,5%, 12,5% и 15,4% штаммов типа ВА1в, подвидов ВАН и BAIV, соответственно.

Таблица 8. - Лецитиназная активность штаммов разных подвидов В.аШЬгапз по сочетанию ЛР и РП на 1.. .2 сут регистрации реакций

Подвид, Изуч ено Количество штаммов (%) в различных сочетаниях ЛР и РП на ... сут

тип штам ЛРТ РП+ ЛР* РП" ЛР" РП+ ЛР" РП"

MOB 1 2 1 2 1 2 1 2

BAI 176 0 4,5 79,0 75,6 0,6 1,7 20,4 18,2

BAIa 143 0 4,9 81,1 77,6 0 0,7 18,9 16,8

ВА 16 12 0 8,3 75,0 66,7 0 0 25,0 25,0

ВА 1в 18 0 0 77,8 77,8 5,5 11,1 16,7 11,1

ВА 1г 3 0 0 0 0 0 0 100,0 100,0

BA1I 16 6,2 25,0 50.0 43,7 12,5 6,3 31,3 25,0

ВА III 4 0 0 50,0 50,0 0 0 50.0 50.0

ВА IV 13 0 0 30,8 30,8 15,4 15,4 53,8 53,8

Вид B.anthracis 209 0,5 5,7 73,2 69,9 2,4 2,9 23,9 21,5

Анализ данных, представленных в табл. 9, свидетельствует о схожести всех 4-х подвидов B.anthracis, за исключением типа BAJr, по количеству штаммов с фенотипами Срг+ и Н1у+Срг+. Гемолитическая активность отсутствовала на 1 сут регистрации результатов у всех штаммов типа ВА1г и подвидов ВАШ и BA1V, но была выявлена у отдельных штаммов подвидов BAI и ВАН. На 2...4 сут гемолитическая активность обнаружена у подавляющего большинства штаммов B.anlhracis, т.е. позднее появление этого признака является характерным для штаммов всех 4-х подвидов сибиреязвенного микроба.

Из данных той же табл.9 следует, что большинство штаммов подвидов BAI (за исключением типа BAIr), BAU и BAIV имели одинаково выраженную способность к редукции метиленовой сини, тогда как штаммы типа BAIr и подвида ВАШ редуцирующей способностью не обладали. У последних отсутствовала также способность к продукции зеленого пигмента, в то время как у большинства (более "/,) штаммов типов BAIa и BAI6 и у меньшей части (V4...V3) изученных штаммов типа ВА1в, подвидов ВАН и BAIV данный признак выявляется постоянно.

Таблица 9 - Биохимические свойства штаммов разных подвидов B.anthracis

Иод-

Количество штаммов с фенотипом, %

вид, тип Fos+ (lcyr) Hlv+ (Icvt.) Cpr' (1сут.) ЗП+ Xly-f PM+ (2...4 сут.) Xly-f ЗП+ (2...4 сут.) Xiv+ Cpr + (2...4 сут.)

1 cyr. 2 сут. 4 сут.

BAI 2,8 2,5 80,1 96,8 86,1 86,8 67,9 82,6 67,3 82,4

BA Ia 0 1,6 83,5 97,6 89,6 91,1 73,2 87,4 72,4 87,2

BA I6 20,0 9,0 81,8 90,9 80,0 72,7 72,7 60,0 72,7 70,0

BAIb 0 6,6 66,6 93,3 72,7 71,4 33,3 63.6 33,3 66,7

BAIr 33.3 0 0 100,0 0 0 0 0 0 0

BAU 18,7 5,9 64,7 f; rJ 00 88,9 82,4 23,5 64,7 23,5 68,7

BA III 25.0 0 25.0 100,0 0 75,0 0 0 0 75,0

BA IV 30,8 0 46,1 84,6 61,5 87,3 23,1 61,6 23.1 61.5

Вид B.anthracis 6.4 1.6 75,3 94,7 82,7 86,4 59,5 77,4 59,0 79.6

Примечание: Роб" - фосфатазная активность, Х1у~ - гемолитическая активность, РМ1" - спо собность к редукции метнлеиовой сини, Срг' - протеолитическая ак тивность на 30 %-ном молочном агаре, ЗП+ - продукция зеленой: _пигмента на кровяном агаре_

Исследования показали, что большинство (93,6%) из общего количества изученных штаммов B.anthracis не обладает фосфатазной активностью (см. табл. 9). Тем не менее, тест на фосфатазу является, по нашим данным, недостаточно надежным критерием идентификации штаммов подвидов BAII, ВАШ и BA1V, типов ВАШ и BAIr, а так как по данному признаку они схожи с близкородственными микроорганизмами I морфологической группы рода Bacillus.

Принимая во внимание, что существующие общепринятые схемы и методы индикации B.anthracis недостаточно надежны и не пригодны для обнаружения, выделения и идентификации штаммов возбудителя подвидов BAU и ВАШ, а также с учетом полученных данных о биологии и таксономии сибиреязвенного микроба нами разработана новая схема специфической индикации B.anthracis (рис. I), разработана и внедрена в практику военно-медицинской службы и рекомендована для практического использования в лабораториях Госсанэпиднадзора России "Схема идентификации сибиреязвенного микроба" (рис. 2) с применением методов определения основных таксономически значимых признаков, характерных для штаммов всех 4-х подвидов возбудителя сибирской язвы.

I этап

Обнаружение возбудителя н/илн антигенов

Рис. 1.- Схема и методы специфической индикации В.ап111гас1$: этапы обнаружения и выделения возбудителя

Посев на скошенный

агар п выращивание

при температурах:

(36+1 )°С- (45+1) С -

типичный отсутствие

харакгер росга

роет культуры

Отбор КОЛОНИЙ ПС характеру роста и наличию J1P и Pi 1 на желточ но-пол ими к-синовом агаре

Фатолизабельность (чувствительность к видоспеш1фическим фагам)

Тест «жемчужное ожерелье» -положительный

Тест на фо«1)атазу - отрицательный

Тест на гемолиз - отрицательный

Тест на патогенноегь (биопроба) на белых мышах - положительный для вирулентных культур (или метод "слепых" пассажей)

Биопроба на кроликах i

Высев гемокультуры на питательный агар для получения чистой культуры

Изучение свойств культур внутривидового типирования

Тест на иммушменность

Микроскопия мазков, окрашенных по Грачу и Цнлю-Нильсену, и МФА -обнаружение типичных наточек и спор

РИГА

ПЦР

Посев в МПБ - типичный xanaicreD Docra культуо

Ï

Тест на подвижность клеток - отрицательный

Посев на полимиксипо-желточно-бикарбонагный агар - типичные но морфологии колонии культур ВА! н BA1I с фенотипом К'ЛРТЧТ, Ю1РТ1Г и/или К'ЛМЧГ

Микроскопия мазков, окрашенных по Ребигеру или Лсффлеру, и МФА - капсуло-образуюшис бактерии у вирулентных культур

Посев на среду ГКИ дня определения капсулообразукшнх бактреий

Примечание: К - капсулообразовшше, ЛР - литнческая реакция, РП - реакция преципитации

МФА - метод флуоресцирующих анпггел, ПЦР - цепная полнмеразная реакция, РИГА - реакция непрямой гемагглютинацин

Рис. 2 - Схема идентификации культур сибиреязвенного микроба

Важно подчеркнуть, что разработанная схема предусматривает идентификацию и типнрованне штаммов В. anthracis с так называемой «атипичной» морфологией колоний, в том числе для штаммов подвида BAII, обладающих, высокой вирулентностью для интактных и иммунизированных вакциной СТИ-1 морских свинок и кроликов.

Для оценки эпизоотологической и эпидемиологической опасности таких штаммов необходимо знать особенности клиники и патоморфогенеза сибирской язвы у животных и человека при заражении штаммами разных подвидов B.anthracis. Однако, как уже мы отмечали, до настоящего времени отсутствуют правильные представления о клинико-морфологнческих формах и патогенезе этого заболевания, в связи с чем нами были подробно изучены указанные вопросы.

Исследования показали, что клиника внутренней (висцеральной) формы у человека и обезьян павианов гамадрилов в основном одинакова при алиментарном и аэрогенном способах их заражения. Несмотря на относительное многообразие клинических симптомов и их определенное непостоянство, при внутренней форме сибирской язвы у человека на первый план выступают симптомы интоксикации, т.е. выявляется клиника сепсиса. При этом наиболее часто в результате как алиментарного, так и ингаляционного заражения выявляются симптомы поражения органов дыхания, на основании чего, но без учета эпидемиологического анамнеза, нередко ставится ошибочный диагноз "легочная форма сибирской язвы", имея ввиду соответствующий ей механизм внедрения возбудителя в макроорганизм через органы дыхания.

Патоморфология внутренней (висцеральной) формы сибирской язвы у человека и различных видов высоковосприимчнвых животных в основном сходна, о чем свидетельствуют данные, представленные в табл. 10. Независимо от способа заражения возбудителем и локализации входных ворот инфекции, обнаруживаемые на вскрытии во внутренних органах патологоанатоми-ческие изменения являются следствием генерализованной инфекции, однотипны и встречаются с одинаковой частотой. Исключение составляют специфические поражения тонкой кишки, наблюдаемые только при алиментарном заражении, что наглядно проиллюстрировано рисунками 3...6. При разных способах заражения наиболее демонстративные изменения выявляются в органах грудной клетки, тогда как патология органов брюшной полости менее представительна даже при энтеральном заражении. По этой причине и отсутствием правильного представления о патогенезе сибирской язвы у человека следует объяснить нередко имеющие место в практике ошибочные диагнозы клиницистов и патоморфологов о первичной легочной форме заболевания даже в тех случаях, когда эпидемиологически точно установлен алиментарный механизм заражения возбудителем инфекции.

Таблица 10. - Морфологические изменения у павианов гамадрилов при разных способах заражения спорами В.апЛгааБ

Локализация Морфологические изменения Процент обнаруживаемых изменений у обезьян при разных способах заражения

изменений аэрозольный (п=91) энтеральный (п=17) подкожный (п=44)

Органы грудной клетки: легкие средостение кровоизлияния отек плеврит лимфаденит 26 37 37 98 24 18 6 65 16 23 9 57

медиастинит перикардит 45 20 29 6 18 4

Органы брюшной полости: тонкая кишка толстая кишка гиперемия слизистой эрозии и язвы инфильтраты и язвы 0 0 3 100 24 6 0 0 7

брыжейка лимфаденит 19 100 27

Полость черепа: головной мозг мягкая мозговая оболочка отек и набухание менингит 16 6 - 29 0

Подкожная клетчатка отек и инфильтрат 8 12 70

Подмышечная впадина лимфаденит 11 12 95

Патологоанатомическая картина экспериментальной сибирской язвы у животных, обусловленная действием вирулентных и слабовирулентных штаммов подвида ВАН B.anthracis, по характеру морфологических изменений однотипна с таковой у животных, погибших после заражения культурами высоковирулентного штамма подвида BAI. Однако выраженность патологоанатоми-ческой картины у животных, погибших в одинаковые сроки наблюдения после заражения культурами штаммов подвидов BAI и BAI1, была разной: более вирулентным штаммам соответствовала более выраженная патологоанатом иче-ская картина заболевания.

Рис.3. - Подвздошная кишка павиана гамадрила. Эрозии. Макропрепарат

Рис. 5. - Тонкая кишка павиана гамадрила. Язва. Макропрепарат.

Рис. 4. - Желудок морской свинки Множественные кровоизлияния в слизистой оболочке. Макропрепарат

Рис. 6. - Поражения тонкого кишечни-

ка при сибирской язве. Геморрагический энтерит. Макропрепарат.

На основании анализа данных литературы и результатов собственных исследований разработана патогенетическая классификация сибирской язвы (рис. 7), учитывающая способ заражения и локализацию возбудителя инфекции, лишенная недостатков клинико-анатомической классификации (невозможность определения формы заболевания при поражении нескольких органов), позволяющая определить место любому патоморфологическому изменению или сочетанному поражению нескольких внутренних органов и установить форму заболевания.

Результаты теоретических и экспериментальных исследований автора явились основанием для определения новых направлений НИОКР по проблеме сибирской язвы. Аргументированность их обоснования подтверждена практическими результатами при разработке и внедрении комбинированной сибиреязвенной вакцины (ВФС 42-3297-96; патент №> 2115433 от 20.07.1998г., приоритет от 28.08.1992г.) и противосибиреязвенного глобулина для медицинских целей (ВФС 42-3770-99; патент № 2161985 от 20.01.2001г.. приоритет от 11.09.1999г.).

Способ заражения

Покализация возбудителя инфекции

Формы

Контактный

Аэрогенный

Алиментарный

* т

-г

л.

-г

Кожа Легкие Небные миндалп- Желудок Рот Пищевод Тонкая кишка

1 г ч г 1 Г 1 Г 1 Г 1 г 1 Г

Кожная форма (глазная форма) Ингаляционная форма Тоизпл-лярная форма Гастрит Сибирская язва зева Озофагии Первичная кишечная форма

Генерализованная форма

Без локализованных поражении внутренних органов С преимущественным поражением органов дыхания (легочная форма) С преимущественным поражением толстой кишки (вторичная кишечная форма) С преимущественным поражением головного мозга и его оболочек (менингеальная форма) С преимущественным поражением печени

Примечания: 1.- наиболее постоянные входные ворота возбудителя инфекции;

2 .------ редкие места внедрения возбудителя в организм;

3. в скобках приведены аналоги клинико-анатомической классификации сибирской язвы или названия форм, встречающиеся в литеоатуре. в случае несовпадения терминологии.

Рис. 7. - Патогенетическая классификация сибирской язвы у людей

выводы

1.По сочетанию основных признаков - культурально-морфоло-гических, вирулентности для лабораторных животных и способности в разных условиях образовывать капсулу, вид Bacillus anthracis подразделен на 4 таксономических подвида (BAI, BAII, ВАШ, BA1V), из них первый подвид (ВА1) -на 4 типа (BAIa, ВАШ, ВА1в, ВА1г):

а) в соответствии с предложенной классификацией первый подвид (ВА1) B.anthracis состоит из высоковирулентных (типы BAIa, BAIb), вирулентных (тип ВАШ) и слабовирулентных (тип ВА1г) штаммов, образующих капсулу в макроорганизме и на бикарбонатном (сывороточном) агаре в атмосфере углекислого газа, формирующих на МПА в атмосфере воздуха шероховатые колонии (R, RO, RR, RRO), а на бикарбонатном агаре в атмосфере С02 - колонии слизистой (S-форма) и/или полуслизистой (OS-форма) консистенции;

б) второй подвид (ВА II) В. anthracis представлен вирулентными и слабовирулентными штаммами, образующими капсулу в макроорганнзме и на питательных средах вне зависимости от наличия в них бикарбоната натрия (сыворотки) и концентрации углекислого газа в атмосфере, формирующими колонии слизистой (S) и/или полуслизистой (OS) консистенции как на МПА в атмосфере воздуха, так и на бикарбонатном (сывороточном) агаре в атмосфере С02. Отдельные штаммы подвида В А II характеризуются высокой вирулентностью в отношении интактных и иммунизированных вакциной СТИ-1 лабораторных животных;

в) штаммы третьего подвида (ВАШ) B.anthracis являются слабовирулентными и невирулентными, образуют капсулу в макроорганизме и на МПА в атмосфере воздуха, формируют на обычном питательном агаре в атмосфере воздуха колонии слизистой (S) и/или полуслизистой (OS) консистенции, не способны размножаться на бикарбонатном (сывороточном) агаре в атмосфере С02 или дают на этой среде скудный рост (менее 1О % микробной популяции) культуры в виде колоний шероховатой (R, RO) и гладкой (О) формы;

г) штаммы четвертого подвида (BALV) являются невирулентными, не образуют капсулу ни при каких условиях, формируют на питательных средах, вне зависимости от наличия в них бикарбоната натрия, в атмосфере воздуха и С02 шероховатые колонии (R, RR, RO, RRO).

2. Экспериментально доказана возможность получения штаммов II и III подвидов B.anthracis под влиянием бактериофагов с видиснецифическим и поливалентным спектром литичесхой активности.

3. С учетом полученных данных о биологии и таксономии сибиреязвенного микроба разработана новая схема специфической индикации B.anthracis, разработана и внедрена в практику военно-медицинской службы и рекомендована для практического использования в лабораториях Госсанэпиднадзора России "Схема идентификации сибиреязвенного микроба" с применением ме-

тодов определения основных таксономически значимых признаков, характерных для штаммов всех 4-х подвидов возбудителя сибирской язвы.

4. Впервые применительно к возбудителю сибирской язвы показана возможность изучения на желточно-полимиксиновой дифференциально-диагностической среде леиитиназной активности по трем типам яично-желточной реакции - логической (J1P), преципитации (РП) и опалесценции (РО) с учетом морфологического типа колоний и обоснована пригодность этой среды для выделения из объектов внешней среды штаммов всех 4-х подвидов B.anthracis.

5. Показано, что для значительного количества штаммов B.anthracis, вне зависимости от принадлежности к тому или иному подвиду, характерно наличие лизогении: BAIa и BAIV - у 25,0%, ВАШ и ВА1в - у 33,3%, ВАШ - у 100,0%, BA1I - у 45,5% лабораторных и 100,0% "свежевыделенных" штаммов. Изучение электронно-микроскопического строения фаговых карпускул показало, что сибиреязвенные бактериофаги, выделенные из лизогенных культур (13 фагов) и почвы скотомогильников (9 фагов), относятся к IV и V морфологическим типам. Видоспецифический фаг ФПГ из лизогенной культуры подвида BAII, являющийся представителем IV морфологического типа (октаэдр, диаметр головки - 50 нм, отросток длиной 200 нм и диаметром 7,5 нм), обладает наибольшим спектром литической активности в отношении штаммов B.anthracis среди всех общеизвестных (Гамма-МВА, К-ВИЭВ и др.) и 33-х вновь выделенных бактериофагов.

6. Изучение антигенной структуры 169 штаммов B.anthracis в РДП с использованием монорецепторных сывороток к 7 антигенам (Р. SD, ST, TL, VC, С и S) позволило разделить их на 50 антигенных типов. Характерным для подвидов BAI, BAII н ВАШ является наличие штаммов с выраженной антигенной оснащенностью: от 4 до 7 антигенов - у 91,3%, 93,8% и 92,0% штаммов соответственно подвидов BAI, BAII и ВАШ. У подвида BA1V отсутствовали штаммы, имеющие 7 антигенов, у 46,2% выявлено от 4 до 6 антигенов, у 30,8% - от 1 до 3 антигенов, а у 23,0% штаммов не обнаружен ни один из изученных антигенов. Обращает внимание неоднородность штаммов подвида BAI по антигенной оснащенности (40 антигенных типов), что свидетельствует о перспективности использования моноантигенного анализа для дополнительного подразделения типов этого подвида на более однородные таксономические группы.

7. Установлена возможность идентификации B.anthracis от близкородственных бацилл (B.cereus, B.subtilis, B.pumilus и B.megaterium) по особенностям ультраструктурной организации спор: наличию однослойного экзоспо-эиума, мнкроворсинок длиной 0,03 мкм, 3...5 слойной споровой оболочки, а гакже свободного от осмиофильных гранул пространства между экзоспориу-чом и споровой оболочкой.

8. По результатам изучения плазмидного спектра, гоксино- и капсуло-эбразования установлено, что высоковирулентные и вирулентные штаммы

подвнда BAI (типы BAIa, ВАШ, BAIb) и их микробные популяции однородны по феноплазмидотипу Сар' 02 Сар+ СО? Тохг / рХОГ рХ02\ а слабовирулентные штаммы этого подвида (тип BAIr), имеющие аналогичный феноплазмидо-тип, являются гетерогенными по составу микробной популяции (признак Сар+ выявлен у 10 % и менее бактерий популяции, рХ02 - у 60...85%). Штаммы подвида BAI1 подразделены по феноплазмидотипу на 3 группы (Сар+ 02 Сар4 С02 Тох+ / pXOlf рХ02 ; Сар* 02 Сар' С02Тох " / рХОГ рХ02+; Сар" О, Сар' С02 Тох " / рХОГ рХ02"), штаммы подвида ВАШ - на 4 группы (Сар' 02 Сар" С02 Тох4 / рХОГ pX02f; Сар 02 Сар "СО, Тох " / pXOl " рХ02'; Сар' 02 Сар " С02 Тох' / рХО 1 " рХ02 "; Сар 02 Сар ' С02 Тох 7 рХО 1 ' рХ02"), штаммы подвида BAIV - на 2 группы (Cap" Ô2 Сар" С02 Тох+ 1 рХОГ рХ02"; Сар" 02Сар" С02 Тох "/ pXOl " рХ02").

9. Клиника внутренней (висцеральной) формы сибирской язвы у человека и обезьян павианов гамадрилов в основном одинакова при алиментарном и аэрогенном способах их заражения. Несмотря на относительное многообразие клинических симптомов и их определенное непостоянство, при внутренней форме сибирской язвы у человека на первый план выступают симптомы интоксикации, т.е. выявляется клиника сепсиса. При этом наиболее часто в результате как алиментарного, так и ингаляционного заражения выявляются симптомы поражения органов дыхания, на основании чего, но без учета эпидемиологического анамнеза, нередко ставится ошибочный диагноз "легочная форма сибирской язвы", имея ввиду соответствующий ей механизм внедрения возбудителя в макроорганизм через органы дыхания.

10. Патоморфология внутренней (висцеральной) формы сибирской язвы у человека и различных видов высоковосприимчивых животных в основном сходна: независимо от способа заражения возбудителем и локализации входных ворот инфекции, обнаруживаемые на вскрытии во внутренних органах патологоанатомические изменения являются следствием генерализованной инфекции, однотипны и встречаются с одинаковой частотой. Исключение составляют специфические поражения тонкой кишки, наблюдаемые только при алиментарном заражении. При разных способах заражения наиболее демонстративные изменения выявляются в органах грудной клетки, тогда как патология органов брюшной полости менее представительна даже при энтералыгам заражении. По этой причине и отсутствием правильного представления о патогенезе сибирской язвы у человека следует объяснить нередко имеющие место в практике ошибочные диагнозы клиницистов и патоморфологов о первичной легочной форме заболевания дяжс в тех случаях, код д,и эпидемиологи— чески точно установлен алиментарный механизм заражения возбудителем инфекции.

11. Патологоанатомическая картина экспериментальной сибирской язвы у животных, обусловленная действием вирулентных и слабовирулентных штаммов подвида BA1I B.anthracis, по характеру морфологических изменений однотипна с таковой у животных, погибших после заражения культурами вы-

соковирулентного штамма подвида BAI. Однако выраженность патологоана-томической картины у животных, погибших в одинаковые сроки наблюдения после заражения культурами штаммов подвидов BAI и ВАП, была разной: более вирулентным штаммам соответствовала более выраженная патологоанато-мическая картина заболевания.

12. На основании анализа данных литературы и результатов собственных исследований разработана патогенетическая классификация сибирской язвы, учитывающая способ заражения и локализацию возбудителя инфекции, лишенная недостатков клинико-анатомической классификации, позволяющая определить место любому патоморфологическому изменению или сочетанно-му поражению нескольких внутренних органов и установить форму заболевания.

13. Результаты теоретических и экспериментальных исследований автора явились основанием для определения новых направлений НИОКР по проблеме сибирской язвы. Аргументированность их обоснования подтверждена практическими результатами при разработке и внедрении комбинированной сибиреязвенной вакцины (ВФС 42-3297-96; патент № 2115433 от 20.07.1998г„ приоритет от 28.08.1992г.) и противосибиреязвенного глобулина для медицинских целей (ВФС 42-3770-99; патент № 2161985 от 20.01.2001г., приоритет от 1 1.09.1999г.).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Внести изменения и дополнения в действующие руководства и инструкции но работе с возбудителями опасных и особо опасных инфекционных заболеваний, учитывающие новые данные о биологии и таксономии B.anthracis и включающие разработанные в данной работе схемы и методы шдикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.

2. Разработать и утвердить "Методические указания по обнаружению , зыделеншо и идентификации возбудителя сибирской язвы" для практических габораторий ветеринарной службы и Госсанэпиднадзора России, предусмотрев ! них использование обоснованных в данной работе схем и методов индика-даи и идентификации B.anthracis.

3. В руководства по инфекционным болезням и патологической диагностике опасных и особо опасных инфекционных заболеваний человека внести вменения и дополнения, учитывающие новые данные о патоморфогенезе си-5ирской язвы и включающие разработанную в данной работе патогенетиче-жую классификацию этой инфекции.

-324. Разработать федеральную программу научно-исследовательских работ по проблеме сибирской язвы на 2002. ..2011 г.г., предусматривающую:

а) изучение биологии и генетики вновь выделяемых из разных источников (животных, людей, почвы и т.п.) штаммов В.апЙ1гас1$, оценку эпидемической и эпизоотической опасности штаммов, относящихся к разным подвидам возбудителя;

б) разработку новых и совершенствование существующих средств и методов специфической индикации В.апШгааз, лабораторную диагностику сибирской язвы, прежде всего внутренней (висцеральной) ее формы;

в) разработку и совершенствование технологий и организацию производства сибиреязвенных диагностикумов, вакцинных препаратов, глобулина противосибиреязвенного, высокоактивного видоспецифического диагностического сибиреязвенного бактериофага;

г) изучение лечебно - профилактической эффективности современных антибиотиков в комбинации со средствами иммунопрофилактики (вакцинами и глобулинами) и иммуномодуляторами при внутренней форме сибирской язвы;

д) совершенствование противоенбиреязвенных мероприятий с учетом данных районирования территорий страны по степени опасности возникновения эпизоотических и эпидемических вспышек сибирской язвы.

Для координации работ по данной программе создать соответствующую межведомственную проблемную комиссию.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Горланов A.A., Лебедь В.И., Иванов Ю.И., Васильев П.Г., Васильев Н.Т., Клименко С.Н. Изобретение на спецтему // Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР, А. с. № 165544, 8.10.1981

2. Кравец И.Д., Литусов Н.В., Васильев П.Г., Маслов A.B. Активность антибактериальных препаратов в отношении вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба в опытах in vitro // Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций: Тез. докл. Всесоюзн. конф. -М., 1991. - С. 330-331.

3. Васильев П.Г., Терентьев А.И. (Науч. руководители темы). Отчет о НИР: Создание участка по производству противосибиреязвенного иммуноглобулина и сибиреязвенного эритроцитарного иммуноглобулинового диагности-кума / НИИМ МО РФ, 1996. - 108 с - Арх. НИИМ МО РФ, инв. М> 30191.

4. Васильев П.Г., Садыков Н.С., Махмуткин В.А., Васильев А.П. Эпизо-отолого-эпидемиологическое районирование Приволжского, Волго-Вятского и Южно-Уральского регионов по степени риска возникновения случаев сибирской язвы // Материалы науч.-практ. конф., посвященной 100-летию образования противочумной службы России, 16-18 сентября 1997 г. - Рос. НИПЧИ "Микроб", - Саратов, 1997, т.1, - С.18-19.

-335. Елагин Г.Д., Васильев Н.Т., Дармов И.В., Дубровин М.Ю., Пятков З.А., Васильев П.Г., Сероглазое В.В. Изучение гуморального иммунитета экс-териментальных животных, привитых сибиреязвенными вакцинами, с исполь-¡ованнем тест-системы для определения антител к протективному антигену J.anthracis // Рос. НИПЧИ "Микроб". Саратов, 1998. В сб.: Проблемы особо )пасных инфекций, - С. 74-81.

6. Садовой Н.В., Кравец И.Д., Селиваненко Г.М., Харечко Г.С.. Садовая i.A., Васильев П.Г., Литусов Н.В., Елагин Г.Д., Супотницкий М.В. Вакцина ;ибиреязвенная комбинированная // Российское агентство по патентам и товарном знакам, патент № 2115433 от 20.07,98 г. (приоритет от 28.08.92 г.).

7. Васильев П.Г., Иванов 10.11, Садыков Н.С. Кожухов В.В., Зиганшин MIJ., Дербина Л.М., Сеиькнн A.B. Чувствительность штаммов Bacillus inthracis, выделенных из разных источников внешней среды, к видоспецифиче-:ким сибиреязвенным бактериофагам // Матер, юбилейной науч. конф., посвя-ценной 70-летшо НИИ микробиологии МО РФ: "Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария". !0 ноября - 1 декабря 1998 г. - Киров, 1998. - С. 64.

8. Васильев П.Г., Кожухов В.В., Строчков Ю.И., Сероглазов В.В., Ку->илко В.В. Изучение свойств длительно хранившихся культур сибиреязвенного ткцинного штамма // Там же. - С. 65.

9. Галиуллин А.К., Садыков Н.С., Ннзамов Р.Н., Васильев П.П, Салма-;ов K.M., Махмуткнн В.А., Гапимшин С.С. Обнаружение возбудителя сибир-:кой язвы в пробах, взятых в бывших очагах инфекции // Там же. - С. 71-72.

10. Кутаев Д.А., Пятков В.А., Елагин Т.Д., Васильев П.Г. Разработка |ритроцитарного диагностикума для обнаружения и идентификации возбуди-еля сибирской язвы // Там же. - С. 134-135.

11. Сенькин A.B., Васильев П.Г., Салмаков K.M., Садыков Н.С., Кожу-;ов В.В, Литусов Н.В., Махмуткнн В.А, Рассанов В.П., Степанов В.И., Маслов LB. Лецитиназная активность штаммов Bacillus anthracis, выделенных из раз-1ых источников внешней среды // Гам же. - С.216-217.

12. Сероглазов В.В., Кожухов В.В., Строчков Ю.И., Анисимова Т.И., Засильев П.Г. Изменчивость сибиреязвенного микроба и актуальные проблемы :онтроля качества эталонных штаммов // Там же. - С. 219-220.

13. Кожухов В.В., Юдников В.А, Масленников С.Н., Шевцов А.Н., Ва-ильев П.Г. Сохраняемость основных свойств сухой формы комбинированной ¡акцины при разных температурных режимах хранения // Там же. - С. 302.

14. Комиссаров A.B., Белова Е.В., Жучихин Ю.С., Нестеров Ю.Е., Ле-ценко A.A., Логвинов С.В., Васильев П.Г., Комоско Г.В., Зиганшин Р.Ш. Влия-гие переменных температур на сохранение целевых свойств глобулина [ротивосибиреязвенного лошадиного жидкого // Там же. - С. 302-303.

-3415. Пименов Е.В., Кожухов В.В., Васильев Н.Т., Васильев П.Г., Масленников С.Н., Шевцов А.Н., Анисимова Т.И. Совершенствование технологии и модернизация аппаратурно-технологической линии производства сухих сибиреязвенных вакцин 1! Там же. - С. 325-326.

16. Пименов Е.В., Комиссаров A.B., Луб М.Ю., Васильев П.Г., Жучихин Ю.С., Комоско Г.В., Климов В.И., Шведов В.В. Освоение и усовершенствование технологии производства глобулина противосибнреязвенного лошадиного жидкого для медицинских целей И Там же. - С. 326-327.

17. Садыков Н.С., Васильев П.Г.(Науч. руководители темы). Отчет о НИР: Эпизоотолого-эпидемическое районирование Приволжского Военного округа по степени риска возникновения случаев сибирской язвы. / НИИМ МО РФ, ВНИВИ Минсельхозпрода РФ, ВМФ при СГМУ, 1998. - 156 с. - Арх. ННИМ МО РФ, инв. № 30357.

18. Васильев П.Г., Иванов Ю.И., Сенькин A.B., Кожухов В.В., Строчков Ю.И., Зиганшин Р.Ш., Дербина Л.М. Типирование штаммов B.anthracis и близкородственных бацилл с помощью умеренных бактериофагов / Матер, юбилейной науч. конф., посвященной 50-летию ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ: "Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария", 15 июля 1999 г. - Екатеринбург, 1999. - С. 35-36.

19. Садыков Н.С., Васильев II.Г., Мустафина Э.Н., Васильева Е.П., Сал-маков K.M., Юсупов Р.Х., Низамов Р.Н. Сравнительное морфометрическое изучение спор B.anthracis и близкородственных бацилл / Там же. - С. 219-220.

20. Васильев П.Г., Литусов Н.В., Сенькин A.B., Кожухов В.В., Рассанов В.П., Маслов A.B., Строчков Ю.И. Липолитическая активность штаммов B.anthracis, выделенных из разных источников внешней среды /' Там же. - С. 3334.

21. Васильев П.Г.. Яровиков П.А., Маношкина H.H., Рассанов В.П., Ры-лов A.B., Сенькин A.B., Касков A.B. Оценка противосибнреязвенного иммунитета с применением кожно-аллершческой пробы с антраксином у люден с различной кратностью иммунизации живой сухой вакциной СТИ-1 / Там же. - С. 31-32.

22. Васильев П.Г., Кравец И.Д., Елагин Г.Д., Сенькин A.B. Антигенная структура штаммов B.anthracis, выделенных из разных источников внешней среды / Там же. - С. 32-33,

23. Садыков Н.С., Васильев П.Г., Мустафина Э.Н., Низамов Р.Н., Сал-маков K.M., Васильева Е.П. Особенности течения сибиреязвенной инфекции у овец / Там же. - С. 221.

24. Садыков Н.С., Васильев П.Г., Юсупов Р.Х., Низамов Р.Н., Титов В.В., Салмаков K.M., Мустафина Э.М., Васильева Е.П. Патогистологическая картина сибирской язвы у крупного рогатого скота / Там же. - С. 222.

-3525. Комиссаров A.B., Жучихин Ю.С., Васильев П.Г., Луб М.Ю., Неста->ов Ю.Е., Швецова Г.Ю., Богачева В.В., Белова Е.В. Изучение физико-химических и иммунобиологических свойств противосибиреязвенного глобу-[ина в процессе длительного хранения / Там же. - С. 96-97.

26. Комиссаров A.B., Жучихин Ю.С., Васильев П.Г., Климов В.И., Луб Л.Ю., Нестеров Ю.Е., Лещенко A.A., Богачева В.В., Белова Е.В. Сравннтель-юе изучение качества препаратов противосибиреязвенного глобулина, Полуниных при создании производства в НИИ микробиологии МО РФ и выпус-:аемых ранее в Тбилисском НИИ вакцин и сывороток / Там же. - С, 95-96.

27. Маслов A.B., Кожухов В.В., Васильев П.Г., Строчков Ю.И. Изучение войств длительно хранившихся культур возбудителя сибирской язвы / Там же. С. 143-144.

28. Комиссаров A.B., Пименов Е.В., Комоско Г.В., Васильев П.Г., Луб /1.Ю., Лещенко A.A., Жучихин Ю.С. Полуфабрикат глобулина противосибире-звенного лошадиного // Российское агентство по патентам и товарным знакам, [атент № 2161985 от 20.01.2001г. (приоритет от 11.08.99 г., per. № 99117037).

29. Васильев П.Г., Маринин Л.И., Зиганшнн P.IL1., Лнтусов Н.В., Сень-:ин A.B., Степанов A.B., Шевцов А.Н., Маслов A.B. Спектр литической актив-юсти видоспецифического сибиреязвенного бактериофага / Проблемы медицинской и экологической биотехнологии. В сб.: Тезисы докладов юбилейной аучной конференции, посвященной 25-летию ГНЦ ПМ, 14... 15 декабря 1999 г. Оболенск, 1999. - С. 33.

30. Васильев П.Г., Маринин Л.И., Маслов A.B., Степанов A.B., Оборин 5.А., Зиганшин Р.Ш., Шевцов А.Н., Сенькнн A.B. Метод "слепых" пассажей на :елых мышах для выделения возбудителя сибирской язвы из объектов внешней реды / В сб.: Тезисы докладов юбилейной научной конференции, посвящен-юй 25-летию ГНЦ ПМ: "Проблемы медицинской и экологической биотехноло-ии". 14...15 декабря 1999 г. - Оболенск, 1999. - С. 73.

31. Комиссаров A.B., Жучихин Ю.С., Васильев П.Г., Белова Е.В., Бога-ева В.В., Савченко О.В. Некоторые аспекты мембранных технологий в про-[ышленном производстве глобулина противосибиреязвенного лошадиного сидкого / Там же. - С. 73.

32. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т.. Литусов Н.В., Харечко А.Т., Василь-в П.Г.. Садовой Н.В., Кожухов В.В. Сибирская язва: актуальные аспекты мик-обиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики // 1, ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 448 е., 59 табл. и 17 илл.

33. Литусов Н.В.. Садовой Н.В., Цыдендамбаев Ц.Ц., Васильев П.Г. и р. Отчет о НИР: Создание аппаратурно-технологической линии, отработка ехнологий и освоение производства сибиреязвенных вакцин на производст-енных площадях 1ДВТП БЗ НИИМ МО РФ. / ЦВТГ1 БЗ НИИМ МО РФ, 2000, фх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, инв. № научного отчета 447 ДСП, 96 с.

-3634. Сенькин A.B., Васильев П.Г., Литусов Н.В., Строчков Ю.И., Забокрицкий А.Н., Ясовиев И.Д., Кожухов В.В., Мустафина Э.Н., Маслов A.B., Рас-санов В.П. Лсцитшшная активность штаммов Bacillus anthracis, относящихся к разным подвидам / Материалы научной межучрежденческой конференции, посвященной 25-летию со дня создания отдела генетики бактерий НИИ микробиологии МО РФ: "Проблемы генетики, генной инженерии и генодиагностики опасных и особо опасных инфекций", 19...20 декабря 2000 г. - Киров, 2000, Арх. НИИМ МО РФ, Инв № 1219 ДСП, с. 62-63.

35. Сенькин A.B., Васильев П.Г., Литусов Н.В., Строчков Ю.И., Сады-ков U.C., Ясовиев И.Д., Мустафина Э.Н., Махмугкин В.А., Забокрицкий А.Н., Кожухов В.В., Рассанов В.П., Маслов A.B. Таксономическая значимость леци-тиназной активности на этапах выделения и идентификации культур Bacillus anthracis / Там же, с. 60-61.

36. Васильев П.Г.. Литусов Н. В., Васильев Н.Т., Щербаков В.Н., Забокрицкий А.Н., Починок С.Х., Оборин В.А. Патологоанатомическая картина сибирской язвы у морских свинок, погибших после заражения спорами штаммов подвида II Bacillus anthracis. / Там же, с. 77-78.

37. Васильев П.Г., Сенькин A.B., Строчков Ю.И., Литусов Н.В., Сады-ков Н.С., Низамов Р.Н., Забокрицкий А.Н., Ясовиев И.Д., Мустафина Э.Н. Классификация штаммов Bacillus anthracis различного происхождения по морфологическому типу колоний / Там же, с. 63-64.

38. Васильев П.Г., Литусов Н.В., Сенькин A.B., Строчков Ю.И., Забокрицкий А.Н., Садыков Н.С. Современное состояние проблемы таксономии Bacillus anthracis / Там же, с. 26-29.

39. Галиуллин А.К., Литусов Н.В., Юсупов Р.Х., Васильев П.Г., Глуш-кова О.В., Васильев А.П., Черкашина Н.В., Васильев А.Н., Махмуткин В.А. Чувствительность штаммов разных подвидов Bacillus anthracis к антибиотикам пеиициллинового ряда / ^Актуальные вопросы современной медицины".

В сб. тез. и статей 34-й итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института, посвященного 300-летию военного образования России (8.02.2001г.). Самара, 2001, С. 240-241.

40. Галиуллин А.К., Литусов Н.В., Юсупов Р.Х., Васильев П.Г., Глуш-кова О.В., Васильев А.П., Черкашина Н.В., Васильев А.Н., Махмуткин В.А. Чувствительность штаммов разных подвидов Bacillus anthracis к антибиотикам аминогликозидного ряда / Там же, С. 242-243.

41. Галиуллин А.К., Васильев А.П., Литусов Н.В., Юсупов Р.Х., Билев А.Е., Васильев А.Н., Махмуткин В.А., Васильев П.Г. Чувствительность анти-биотикоустойчивых штаммов Bacillus anthracis к бактериоцинам близкородственных видов бацилл / Там же. С. 244-245.