Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологические свойства реовируса типа I и разработка тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства реовируса типа I и разработка тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота"

005007151

;описи

МОСКВИЧЕВ ОЛЕГ ВАЛЕНТИНОВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕОВИРУСА ТИПА IИ РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ИФА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ РЕОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА.

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

1 2 ЯНВ 2012

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2012

005007151

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (г. Казань)

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Гаффаров Харнс Зарипович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Фаизов Тагир Хадиевич

доктор биологических наук, профессор Шарипова Маргарита Рашидовна

Ведущее учреждение: Федеральный центр охраны здоровья животных

(ФГБУ «ВНИИЗЖ»),

Защита состоится

I!

2012 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (420075, г.Казань, Научный городок-2, "ФЦТРБ-ВНИВИ").

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке "ФЦТРБ-ВНИВИ" (г. Казань)

Автореферат разослан "_" _ 2011 г. и размещен на

официальном сайте ФГБУ "ФЦГРБ-ВНИВИ" www.vnivi.ru и на официальном сайте ВАК РФ www.vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы

В структуре заболеваемости сельскохозяйственных животных наибольшее экономическое значение имеют респираторные, желудочно-кишечные болезни молодняка и патология органов воспроизводства маточного поголовья крупного рогатого скота (КРС), связанные с бесплодием, ранней эмбриональной смертностью и абортами, доминирующими возбудителями которых являются вирусы, относящиеся к различным таксономическим группам (Гаффаров Х.3.1983; Иванов A.B., Гаффаров Х.З., 2008).

В настоящее время создано цельное представление о патогенных потенциях многочисленных вирусов, выделяемых от большинства животных. Среди них, наряду с герпесвирусом типа I, вирусом вирусной диареи - болезни слизистых, респираторно-синтициальным вирусом, аденовирусами I и II подгрупп, привлекает внимание исследователей малоизученные в Российской Федерации реовирусы, относящиеся к роду Orthoreovirus семейству Reoviridae, геном которых состоит из 10 сегментов двухнитиевой РНК. Реовирусы типов I, II и Ш выделили от человека, КРС, лошадей, свиней, собак, кошек и мышей. У взрослых животных чаще всего реовирусная инфекция носит латентный и инаппарантный характер и сопровождается длительным вирусоносительством и вирусовыделением(Ьагщош, 1985; Lai, 2011).

Реовирусная инфекция крупного рогатого скота (КРС) впервые была зарегистрирована в США, а затем в Бельгии, ФРГ, Австрии, Швеции, Франции, Голландии, Алжире, Японии и других странах, в которых выявлен высокий процент серопозитивных животных. При этом доминирующим серотипом был признан реовирус типа I (Brubaker М.М., 1964; Wizigmann G., Reinhard G., 1971;

Moreno-Lopez I. 1979).

По данным Rosen L.(1962), Böckmann Ц1976) реовирусы способные обуславливать пневмоэнтериты у телят в первые 3 месяца жизни, проявляющиеся клинически диареей, ринитом, лихорадкой и пневмонией. Установлено также, что у взрослых животных реовирусная инфекция протекает латентно и сопровождается снижением удоев у молочных коров (Сюрин В.Н.,

Фомина Н.В., 1979).

Известно, что в естественных условиях у КРС реовирусная инфекция с яркими клиническими признаками проявляется не всегда и реовирусы, в основном, участвуют в формировании острых смешанных вирусных респираторно-кишечных инфекциях телят. По данным Wizigmann G. и

Reinhardt G.(1971) в ФРГ доказано участие реовирусов в патологии плода и новорожденных.

Из литературных источников известно, что лабораторная диагностика реовирусной инфекции КРС осуществляется путем выделения вируса в культуре клеток и полученные результаты должны быть подтверждены обнаружением прироста гемагглютининов (ГА) в период реконвалесценции по сравнению с сыворотками крови, взятыми в острой стадии болезни.

По данным зарубежных исследователей ретроспективный диагноз на реовирусную инфекцию устанавливают путем исследований парных сывороток, взятых с интервалом 3-4 недели путем исследований их в РТГА с антигеном реовируса типов I, II и Ш. При латентной инфекции в стаде процент животных имеющих антитела, колебался от 40 до 80% (Brubacker М.М.,1964; Wizigmann G., Reinhardt G.,1978; Moreno-Lopez J., 1979).

Однако до настоящего времени в РФ какие-либо исследования по изучению реовирусов в патологии КРС не проводились; многие аспекты этой болезни, -в частности, пути и источники передачи, вирусоносительство и вирусовыделение у естественно инфицированного КРС не изучены, неизвестны также широта и степень распространения реовирусной инфекции.

В этой связи решение таких вопросов, как особенности эпизоотологии болезни, постинфекционного иммунитета и задачи связанные с разработкой современных методов и средств лабораторной диагностики реовирусной инфекции КРС, как нам представляется, является актуальной проблемой ветеринарной науки и практики.

Совершенно очевидно, что современная диагностическая служба должна опираться на такие высокоспецифичные и чувствительные методы диагностики, которые позволяли бы получать воспроизводимые, достоверные и максимально качественные результаты в пределах метода, и должны быть признаны пригодными для проведения широкомасштабных исследований в условиях практических ветеринарных лабораторий. Этим требованиям в значительной степени отвечает твердофазный непрямой вариант иммуноферментного анализа.

В связи с вышеизложенным разработка иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовируса КРС является актуальной задачей.

1.2 Цель и задачи исследований

Целями данной работы явились разработка тест-системы ИФА, предназначенной для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета, а также ее апробация в сравнении с методами аналогичной

направленности. Для достижения поставленной цели необходимо было решить

следующие задачи:

- провести серологический мониторинг в отношении реовируснои

инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах РТ и в ряде регионов Среднего Поволжья;

- изучить биологические, физико-химические свойства штамма «Reo 1 Lang» - возбудителя реовирусной инфекции крупного рогатого скота;

- разработать технологию изготовления компонентов тест-системы ИФА, предназначенной для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител, и стандартизировать условия ее проведения;

- провести оценку активности, специфичности и воспроизводимости реовирусной иммуноферментной тест-системы путем тестирования сывороток крови различных возрастных групп крупного рогатого скота и сравнительного изучения степени корреляции результатов, полученных методом аналогичной

направленности (РТГА);

- определить диагностическую ценность иммуноферментной тест-системы, провести анализ и интерпретацию результатов испытания непрямого

твердофазного ИФА.

1.3 Научная новизна работы

По результатам серо-иммунологического мониторинга впервые представлены данные о распространении реовирусной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Татарстан, других республик и областей РФ.

Определены иммунобиологические свойства штамма «Reo I Lang» реовируса типа I и на этой основе обоснован выбор в качестве производственного, установлены параметры его культивирования, очистки и

концентрирования.

Впервые в РФ Разработана «Тест-система ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета» (Заявка на изобретение РФ № 2011140364/20 от 04.10.11.). Оптимизированы условия ее проведения при исследовании сывороток крови животных взятых в одном разведении. Сравнительными исследованиями подтверждена чувствительность, специфичность и воспроизводимость иммуноферментной тест-системы и выявлена положительная корреляции ее результатов с данными, полученными с методом аналогичной направленности (РТГА).

Положительные результаты испытания иммуноферментной тест-системы подтверждены в производственных условиях.

1.4 Практическая значимость работы

Внедрение разработанной тест-системы ИФА в практику ветеринарных лабораторий РФ позволит решить проблему серологической диагностики реовирусной инфекции КРС и оценивать напряженность поствакцинального иммунитета.

Проведены лабораторные, межведомственные комиссионные и производственные испытания разработанной тест-системы с положительным результатом.

Материалы исследований по разработке и применению тест-системы ИФА вошли в научно-нормативные документы.

1.5 Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на: международно-практической конференции, посвященной 50-летию ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» «Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность» (Казань, 2010).

1.6 Публикации результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в т.ч. 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.7 Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 126 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы, состоящий из 170 источников, в том числе 122 иностранных авторов и приложение. Диссертация содержит 19 таблиц и иллюстрирована 6 рисунками.

1.8 Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Результаты обследования в РТГА сывороток крови крупного рогатого скота различных возрастных групп в отношении реовирусной инфекции в ряде хозяйств Среднего Поволжья, неблагополучных по респираторно-кишечным заболеваниям.

2. Характеристика биологических и физико-химических свойств штамма «Reo I Lang» - возбудителя реовирусной инфекции.

3. Технология изготовления специфических компонентов тест-системы ИФА для серологической диагностики и определения уровня поствакцинальных антител.

4. Оценка диагностической ценности иммуноферментной тест-системы, анализ и интерпретация результатов испытания набора.

5. Результаты иммуномониторинга с помощью «Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета» в молочных комплексах некоторых хозяйств Среднего Поволжья.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Материалы

Работа выполнялась в 2008-2011 гг. в лаборатории вирусологии "ФЦТРБ-ВНИВИ" (№ госрегистрации 01200202602) и в ряде сельскохозяйственных предприятий Республики Татарстан, неблагополучных по респираторным и желудочно-кишечным заболеваниям молодняка и различным формам патологии взрослого поголовья крупного рогатого скота.

Отдельные этапы работы были выполнены с участием с.н.с., к.в.н. Ефимовой М.А., н.с., к.б.н. Дуплевой Л.Ш., н.с., к.б.н. Яруллина А.И., которым выражаю искреннюю признательность.

2.1.1 Пробы сывороток крови

Серологическому исследованию было подвергнуто 1378 проб сывороток крови крупного рогатого скота из 35 сельскохозяйственных предприятий, находящихся на территороии Республики Татарстан и соседних регионов Среднего Поволжья, из них 29 - в Республике Татарстан, 2 - в Саратовской области, 3 - в Республике Башкортостан, неблагополучных по вирусным респираторно-кишечным заболеваниям. Анализ эпизоотической ситуации проводили согласно рекомендациям, разработанным И.А. Бакуловым с соавт. (1975) и С.И. Джупина (1991).

Серологические исследования 1378 проб сывороток крови КРС осуществляли с использованием РТГА и с помощью непрямого варианта ИФА.

2.1.2 Вирус. В работе применяли штамм «Reo I Lang» реовируса типа I.

2.1.3 Животные. В экспериментах использовали: три бычка шестимесячного возраста массой 130-170 кг; 10 новорожденных котята массой 90-200 г; 60 белых мышей массой 14-16 г; 30 мышат-сосунов (новорожденных мышат).

2.1.4 Культура клеток. Культивирование реовируса типа I (шт. «Reo I Lang») проводили на перевиваемой культуре клеток Vero и РК-15.

2.2 Методы

2.2.1 Определение гемагглютинирующей активности

Гемагглютинирующую активность реовируса типа I проводили в реакции гемагтлютинации (РГА), которую ставили согласно общепринятой методике.

2.2.2 Чувствительность к действию физико-химических факторов

реовируса типа I изучали воздействуя на него: эфиром, 1%-ным трипсином, прогреванием при 50°С в течение 1 часа и изменением рН в диапазоне 3,0-8,0.

Чувствительность вируса к эфиру определяли по методу Апс1ге\уе8 и Ногейпап (1949).

Действие трипсина на реовирус исследовали добавлением в поддерживающую среду трипсина до конечной концентрации 1% и выдерживали вирусную суспензию в течение 1 часа при +37±1°С.

Резистентность вируса к изменениям уровня рН определяли воздействием буферных растворов с разными показателями рН в течение 2 часов при +37±1°С.

2.2.3 Патогенность

Патогенность реовируса типа I изучали на естественно восприимчивых животных - новорожденных котятах и мышатах-сосунах. Заражение проводили интрацеребрально, перорально, внутрибрюшинно, интраплеврально и интраназально. Для заражения использовали вирусную суспензию с гемагглютинирующим титром 1:64-1:128.

2.2.4 Инактивация

Инактивация вирусной суспензии проводились 1,2-аминоэтилазиридином (димер) в различных концентрациях и времени экспозиции.

2.2.5 Разработка иммуноферментиой тест-системы

За основу взят стандартный вариант непрямого твердофазного ИФА.

Наиболее важными этапами нашей работы были:

получение и иммунохимическая характеристика основных иммунологических реагентов, входящих в тест-систему;

- оптимизация условия проведения тест-системы ИФА при исследовании сывороток крови в одном разведении;

- определение диагностической ценности тест-системы ИФА по таким важным критериям, как специфичность, чувствительность и воспроизводимость;

- сравнительная оценка эффективности предложенной тест-системы и метода аналогичной направленности.

2.2.6 Получение антигена

Антиген для проведения иммуноферментного анализа получали воздействием на вируссодержащие клетки ультразвуком и ультрацентрифугированием через слой 30%-ной сахарозы при 100000g при 4°С в течение 1часа

2.2.7 Получение контрольной сыворотки

Специфическую положительную сыворотку получали на теленке шестимесячного возраста, которому вводили возрастающую дозу очищенной кулыуральной суспензии реовируса типа I с интервалом 21 день.

2.2.8 Иммуноферментный анализ

(ИФА) проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для иммунологических реакций по общепринятой методике (Егоров А.М. с соавт., 1991). Результаты реакции учитывали по показаниям оптической плотности при длине волны 490 нм.

2.2.9 Интерпретация полученных результатов

Проводилась по методу, описанному Матвеевой И.Н. (2008) путем вычисления коэффициента связывания, отражающего содержание антител в испытуемой пробе по отношению к содержанию антител в положительном контроле.

Математически это выражается следующей формулой: Ксв „(ОШопИПд-ОПдопК-д,) х 100

(ОЩ^К+ср-ОГЦэоК-ср) , где:

ОП490 ИПср, средние арифметические значения оптической плотности ОП490 К-ср г в лунках с испытуемой пробой, отрицательным и ОП490 К+ср J положительным контролями соответственно.

Пробу считали отрицательной, если величина Ксв менее 16%. Если величина Ксв более 25% пробу считают положительной Выявленные результаты исследований сывороток в этом диапазоне (от >16% до <25%) следует считать сомнительными.

2.2.10 Комиссионные испытания

Проводились в условиях лаборатории вирусологии «ФЦТРБ-ВНИВИ» и вирусологического отдела Республиканской ветеринарной лаборатории РТ.

Статистическую обработку результатов исследований проводили методом вариационной статистики с применением критериев достоверности по Стьюденту с использованием программы "Microsoft Office Excel".

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Изучение биологических и физико-химических свойств реовируса типа

I - шт. «Reo I Lang»

Для изучения гемагглютинирующей активности вируса использовали 1%-ные суспензии эритроцитов: человека 0-группы, коровы, свиньи, барана, козы, собаки, кошки, морской свинки, кролика, петуха, крысы и белой мыши. Реакцию гемагглютинации ставили в микроварианте по общепринятой методике. Результаты исследований показали, что наибольшие титры

гемагтлютининов реовируса выявляются с эритроцитами человека 0-группы при комнатной температуре и с эритроцитами свиньи при температуре +4±1°С. Это определило дальнейшее их использование в опытах по выявлению уровня репродукции реовируса типа I в культуральной жидкости инфицированных клеток и в патологических материалах, а также в серологических исследованиях в РТГА.

3.1.1 Чувствительность к действию физико-химических факторов

С этой целью в опытах определяли чувствительность реовируса типа I к действию: формалина, эфира, 1%-го трипсина, прогревания в водяной при +50°С в течение 1 часа, действие pH в диапазоне от 3,0 до 8,0.

Помимо проявления ЦПД в опытах также оценивали действие вышеперечисленных факторов на инфекционный титр вируса и его гемагглютинирующую активность в РГА. Результаты исследований отражены в таблицах 1,2.

Таблица 1. Действие физико-химических факторов на инфекционную и гемагглютинирующую активность реовируса типа I шт. «Reo I Lang»

Контроль Опыт

Действующий Инфекционный Инфекционный

агент ГА титр титр ГА титр титр

(ТЦД50/мл) (ТЦДзо/мл)

Эфир 1:32 Ю5,5 1:32 ю4-25

1% Трипсин 1:32 104,75 1:32 104,7i

t +50°С 1 час 1:32 105,75 1:32 10v

Таблица 2. Изучение резистентности шт. «Reo I Lang» реовируса типа I к действию различных уровней pH__

Контроль Опыт

pH ГА титр Инфекционный титр (ТЦЩо/мл) ГА титр Инфекционный титр (ТЦДм/мл)

3,0 1:32 104'25 1:32 104,05

4,0 1:32 104,5 1:32 10^

5,0 1:32 ю4-5 1:32 ю4-25

6,0 1:32 ю5-4 1:32 10У5

7,0 1:32 ю5-25 1:32 10v»

8,0 1:32 104.75 1:32 105,и

Из таблиц 1 и 2 следует, что использованные физико-химические факторы не влияют на репликацию реовируса типа I и не снижают его инфекционной и гем агглютинирую щей активности.

3.1.2 Изучение патогенности штамма реовируса типа I - шт. «Reo I Lang».

В опыте по экспериментальному воспроизведению инфекции за зараженными животными наблюдали ежедневно и проводили термометрию, однако температура тела животных оставалась постоянно на физиологическом уровне. На 8 сутки после инокуляции вируса пало 6 мышат. При наружном осмотре было видно, что эпидермис шелушиться, мышата гипотрофичны. На вскрытии видны изменения в головном мозге в виде отечности и гиперемии мозговых оболочек, сердечная мышца была дряблой, отечной, кишечник утончен, гиперемирован, каловые массы несформированые и ахоличные. Остальные мышата погибли на 10-14 сутки после заражения с аналогичной картиной изменений в органах, также наблюдалось, что шерстный покров маслянистый, как будто мышат искупали в масле. Органы и ткани были отобраны, зафиксированы в 10%-ном растворе формалина и подвергались патоморфологическим исследованиям. Гистопрепараты окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали в световой и фазово-контрастной микроскопии. .

На 8 сутки после интрацеребрального заражения один котенок пал с признаками гипотрофии; было заметно его отставание в росте. Волосяной покров был взъерошен, область ануса испачкана каловыми массами желтого цвета. При вскрытии обнаруживали отечность мозговых оболочек, печень тигровой окраски, края её притуплены, селезенка увеличена в размерах, на слизистой кишечника наблюдали петехии. Патологический материал фиксировали по вышеописанному способу и затем проводили патоморфологические исследования.

Патогистологическая картина головного мозга мышат-сосунков выявила: набухание стенок оболочечных и мозговых артерий, концентричекую периваскулярную круглоклеточную инфильтрацию, криброзность мозговой ткани, венозное полнокровие, наличие в просветах еденичных сосудов -глобулярного и нитчатого фибрина. Нейронодистрофия с набуханием и гиперхромностью ядер. В сердце отмечался отек стромы, разволокнение эндокарда, в строме миокарда субэндокардиальной области выявлена круглоклеточная инфильтрация. Легкие гиперемированы, набухание и утолщение межальвеолярных перегородок, очаговый бронхоспазм. В просвете тонкой кишки - дистрофичные десквамированные энтероциты, резкий отек и набухание структур, круглоклеточная инфильтрация всех слоев, гиперемия.

При исследовании органов котят наиболее яркие изменения наблюдались в коже: распространенный паракератоз, отек дермы с повышенным цитозом из лимфоцитоподобных клеток, акантоз, вокруг волосяных фолликулов наблюдается наличие многочисленных гиперплазированных сальных желез. В печени просматривается вакуольная дистрофия гепатоцитов, гидропическая дистрофия гепатоцитов, неравномерное расширение перикапиллярных пространств. В селезенке регистрировали неравномерно выраженный аутолиз, полнокровие.

Таким образом нами установлено, что реовирусная инфекция вызванная реовирусом типа I может протекать с летальным исходом для некоторых видов животных, вызывая генерализованный процесс в организме. Хотя известно, что эта инфекция может проявляться практически бессимптомно или же протекать в очень мягкой форме. Однако следует отметить, что клинически экспериментальная реовирусная инфекция у мышат проявляется ярче, чем у котят.

3.2 Разработка тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета.

3.2.1 Сравнительная оценка различных методов концентрирования и очистки антигена реовируса типа I

В качестве исходного материала для изготовления антигена использовали кулыуральный реовирус типа I штамм «Reo I Lang» с гемагглютинирующим титром 1:32-1:128.

Для сравнения в ИФА нами были испытаны антигены реовируса полученные двумя разными способами. В первом случае, вирусную суспензию трехкратно замораживали-оттаивали, освобождались от разрушенных клеток, надосадок концентрировали ПЭГ-6000 и очищали через слой 20%-ной сахарозы при 50000gB течение 2 часов на ультрацентрифуге BeckmanL2.

Во втором эксперименте вирус освобождали из клеток путем обработки вируссодержащей массы ультразвуком, от разрушенных частей клеток -низкоскоростным центрифугированием. Надосадок концентрировали ультрацентрифугированием при 50000g в течение 2 часов, затем очищали через слой 30%-ной сахарозы при 100000g при 4°С в течение 1часа.

Полученные антигены реовируса ресуспендировали в ФБР 1/100 от исходного объема, подвергали диализу и оценивали по гемагглютинирующей активности, определяемой в РГА, оптической плотности вирусного белка, а также в ИФА с положительными и отрицательными контрольными сыворотками. Результаты этих исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3. Сравнительный анализ эффективности методов очистки и концентрирования реовируса типа I (п=3; Р<0,05) _

Метод очистки и концентрирования Концентрация бежа, мг/см3 Активность в РГА, 1/п Коэффициент специфичности

Исходное вирусное сырье 0,04±0,01 32 1,63±0,13

ПЭГ+УЦФ 3,26±0,43 1024 4,47±0,43

УЗ+УЦФ 1,94±0,25 512 7,77±0,87

Анализ представленных данных свидетельствует, что при концентрировании реовируса полиэтиленгликолем и очистке через 20%-ный слой сахарозы удается получить антиген с более высоким содержанием вирусного белка и гемагглютинирующей активностью, однако наиболее специфичным оказался антиген, который предварительно обрабатывали ультразвуком, концентрировали и очищали через 30%-ный слой сахарозы. Коэффициент его специфичности при концентрации антигена 5мкг/см3составил 8,3.

Получение контрольной положительной сыворотки. С этой целью проводили гипериммунизацию бычка шести - месячного возраста возрастающей дозой очищенным концентрированным антигеном реовируса с интервалом 21 дней. Кровь для исследований брали перед каждым циклом иммунизации, достаточно высокий уровень антител в сыворотке крови иммунизированного теленка наблюдали на 21 сутки после четвертой иммунизации. Результаты исследований показали, что титр в ИФА в сыворотке крови иммунизированного теленка составлял 1:6400.

3.2.2 Стандартизация основных условий проведения исследований, разработанной тест-системой ИФА

Подбор концентрации антигена и рабочего разведения контролей. Оптимальную концентрацию антигена и рабочее разведение контрольных сывороток определяли титрованием, делая последовательные разведения компонентов по горизонтальным и вертикальным рядам одного планшета. Для этого анализировали результаты ИФА при содержании антигена реовируса типа I в концентрациях 3,5,10 и 15 мкг/см3 и титровании контрольных сывороток в интервале 1:100-1:1600. Результаты исследований показали, что максимальное значение коэффициента специфичности отмечается при адсорбции антигена реовируса в концентрации 5 мкг/см3 которое обеспечивает высокий уровень оптической плотности и достоверное различие результатов со специфической и контрольной сыворотками в рабочем разведении 1:400.

Оптимизация условий иммобилизации антигена. С целью изучения влияния температуры и времени экспозиции на сорбцию антигена в лунках планшета испытывали режимы иммобилизации в течение 12, 24, 48 часов при температуре 4°С и 1, 2, 3 часа - при 37°С. Процесс адсорбции антигена оценивали по интенсивности реакции с контрольными вирусспецифическими и негативными сыворотками в серийных разведениях. Определяли средние величины оптической плотности положительной и отрицательной контрольных сывороток и вычисляли коэффициент специфичности. В результате проведенных исследований установлено, что целесообразнее использовать режим иммобилизации антигена в течение 2 часов при температуре 37°С или 24 часа при температуре 4°С.

Подбор условий сорбции контрольных сывороток и конъюгата. С этой целью в иммобилизированные антигеном лунки планшета вносили контрольные сыворотки в разведении 1:400. Конъюгат использовали в рабочем разведении 1:5000. При подборе регламента постановки реакции, первоначально, испытывали 0,5-, 1-, 1,5-, 2-, 2,5-, 3-часовые экспозиции сывороток (при одинаковой экспозиции конъюгата), а затем наоборот. Результаты этих исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты подбора условий сорбции контролей и конъюгата

^ час Подбор экспозиции сыворотки при постоянном времени инкубации конъюгата, ОП490 Подбор экспозиции конъюгата при постоянном времени инкубации сыворотки, ОП490

+ - КС + - КС

0,5 0,52±0,02 0,10±0,01 5,2 0,45±0,04 0,10±0,01 4,5

1 0,77±0,03 0,12±0,00 6,4 0,98±0,02 0,11±0,01 8,9

1,5 0,90±0,02 0,12±0,01 7,5 1,05±0,10 0,17±0,01 6,5

2 1,ОНО,04 0,12±0,01 8,4 1,10±0,14 0,18±0,01 6,1

2,5 0,98±0,02 0,13±0,00 7,5 1,11±0,18 0,19±0,01 5,8

3 1,11±0,09 0,14±0,01 7,9 1,16±0,18 0,23±0,03 5,0

Обозначения: "+" - положительная сыворотка;"-" - отрицательная сыворотка,

КС - коэффициент специфичности.

Данные таблицы 4 свидетельствуют, что оптимальным временем экспозиции сывороток оказалась инкубация планшета в термостате в течение 2 часов, конъюгата -1 час.

Определение позитивно-негативного порога. Одним из важных аспектов при разработке непрямого варианта ИФА и интерпретации его результатов является обоснование пороговых значений >1/Р и титра, разграничивающих неспецифическую (отрицательную) и специфическую (положительную)

реакции. С этой целью были проведены исследования по определению закономерностей распределения значений ОП490 и коэффициента связывания (Ксв.) вирусотрицательных и положительных сывороток.

Для установления этих параметров в непрямом варианте ИФА определяли значения ОЩхИв проб сывороток крови крупного рогатого скота, не имеющих антител к антигену реовируса и 90 проб сывороток крови с различным уровнем специфических антител в PITA в разведениях 1:100,1:200, 1:400; 1:800, каждая сыворотка крови, взятая в определенном разведении, проверялась в трех параллельных лунках.

Для расчета позитивно-негативного порога (ПНП) находили среднее значение ОП490ДМ каждой испытуемой пробы. Среднее значение ОП исследованных сывороток, суммированное с утроенным значением

стандартного отклонения.

Относительное содержание вирусспецифических антител в положительных пробах определяли по: а) титру антител, т.е. по конечному разведению испытуемой пробы, превышающему ОП 490 отрицательного контроля в 2,1 раза и б) коэффициенту связывания (Ксв.) отражающему содержание антител в испытуемой пробе по отношению к содержанию антител в положительном контроле.

Результаты проведенных исследований показали, что при значении ОП490 положительного и отрицательного контролей 0,715-1,159 и 0,096-0,17 соответственно, величина ОП 490 всех заведомо отрицательных проб была в пределах 0,15-0,2, при этом значения Ксв. большинстве случаев (92,8%) не превышало 16. В заведомо положительных сыворотках крови (94,3%) значение ОП490 превышало 0,628, а значения Ксв составляли более 25.

При изучении зависимости значения Ксв. от титра вирусспецифических антител в положительных пробах была установлена положительная корреляция между двумя показателями (г= 0,72, Р< 0,05).

Таким образом, величина ПНП для Ксв., являющаяся критерием дифференциации положительных и отрицательных проб и при котором минимально количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов, находится в диапазоне <16-<25. В дальнейшем все пробы, значение Ксв. для которых было меньше ПНП, считали отрицательными, а пробы со значением Ксв. равным или превышающем этот показатель -положительными.

Основными показателями качества иммуноферментной тест-системы является чувствительность и специфичность. Чувствительность и специфичность тест-системы определяли на основании корелляции результатов исследований сывороток крови в РТГА и ИФА Чувствительность

разработанной тест-системы по отношению к РТГА составила 111:115x100%=96,5%; диагностическая специфичность 68:73x100%= 93,1%; совпадаемость результатов двух методов 179:188x100%= 95,2%.

Проведение иммуноферментного анализа, учет и интерпретация результатов. Иммуноферментный анализ проводят в непрямом твердофазном варианте с использованием компонентов, входящих в тест-систему ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител.

При исследовании в одном разведении исследуемые и контрольные сыворотки используют в разведении 1:400 фосфатно-буферным раствором с тайном.

В лунки Е12-Р12 вносят по 0,1 см3 контрольной положительной сыворотки в рабочем разведении 1:400.

В лунки 012-Н12 вносят по 0,1 см3 контрольной отрицательной сыворотки в рабочем разведении 1:400.

В остальные лунки планшета вносят по 0,1 см 3 исследуемой пробы сыворотки в разведении 1:400 (по две лунки на каждый образец сыворотки) по следующей схеме:

Испытуемые сыворотки

Контрольные сыворотки

8 9 10 11 12

Л0©ООООООООО о

в©@ооООООООО о с@©ооООООООО о

»©еооооооооо о Е@©000000000 © *©оооооооооо © ьеоооооооооо © «©оооооооооо ©

При исследовании в 4-х разведениях исследуемые и контрольные сыворотки используют в разведении 1:800.

Предварительно во все лунки планшета вносят по 0,1см3 фосфатно-буферного раствора с твином.

В лунку А11 вносят по 0,1 см3 контрольной положительной сыворотки в рабочем разведении 1:800.

В лунку А12 вносят по 0,1 см3 контрольной отрицательной сыворотки в рабочем разведении 1:800.

В остальные лунки вертикального ряда планшета (А1-А10) вносят по 0,1 см3 исследуемой сыворотки в разведении 1:800 и проводят последовательные двукратные разведения в четырех лунках по схеме:

Испытуемые сыворотки

8 9 10

Контрольные сыворотки

11 12

А0©ООООООО©© ©

©©ооооооо©© © с©©0000000©©© "©©ООООООО©© ©

Е©©ооаэооо©© ©

"©ОООООООО©©©

ь©оооооооо©© ©

"ООООООООО©© ©

- Закрывают планшет крышкой и инкубируют 2ч при температуре 37°С.

- Планшет 3 раза промывают фосфатно-буферным раствором с твином (по 0,15 см3), раствор удаляют встряхиванием.

-В каждую лунку добавляют по 0,1 см3 рабочего раствора конъюгата. -Планшет закрывают крышкой и инкубируют 1 ч при 37°С. -Планшет 3 раза промывают буфером фосфатно-буферным раствором с твином.

-Вносят в каждую лунку по ОД см3 рабочего хромоген-субстратного раствора.

- Планшет инкубируют в темноте 5-15 мин при комнатной температуре. -Останавливают реакцию добавлением 0,1 см3 стоп-реагента (1М Н2804).

-После остановки реакции оптическую плотность субстратной смеси измеряют на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 490 нм (ОП490).

Учет и интерпретация результатов.

При спектрофотометрическом учете результатов исследований сывороток крови в одном разведении производят следующие расчеты:

- Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП490) для проб К+ (ОП49оК+ф);

- Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП490) для проб К- (ОП49оК-ср);

- Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП490) для каждой испытуемой пробы (ИП) (ОПдадИПср);

- Вычисляют коэффициент связывания (Ксв) конъюгата сывороточными антителами.

Пробу считали отрицательной, если величина Ксв менее 16%.

Если величина Ксв более 25% пробу считают положительной.

Выявленные результаты исследований сывороток в этом диапазоне (от <16% до >25%) считают сомнительными, и анализ следует повторить.

При учете результатов исследований сывороток крови в четырех разведениях производят расчет коэффициента специфичности, который равен отношению оптической плотности продукта реакции в лунках с контрольной положительной (ОП490К+) или исследуемой сывороткой (ОП490 ИП) к оптической плотности контрольной отрицательной сыворотки (ОП490 К-). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности не ниже 2,1 и отрицательной, если ниже 2,1.

Выявление динамики роста специфических антител в парных пробах сывороток, при исследовании образцов в четырех разведениях, позволяет диагностировать реовирусную инфекцию у исследованного поголовья.

3.3 Оценка эпизоотической ситуации по реовирусной инфекции типа I крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Татарстан и некоторых регионов Среднего Поволжья.

С целью установления уровня специфических антител к реовирусу типа I типа в 2008 - 2011 гг. нами было исследовано 1378 образцов полевых сывороток крови от крупного рогатого скота разных половозрастных групп. Пробы были получены из 35 хозяйств Республики Татарстан (РТ), Республики Башкортостан (РБ) и Саратовской области. Сыворотки были тестированы одновременно в РТГА и ИФА. Результаты отражены в таблице 5.

Таблица 5. Показатели исследований сывороток крови крупного рогатого скота с антигеном реовируса типа I.__

Название региона Кол-во проб Реовирус КРС

PITA ИФА

Кол-во % Кол-во %

Арский район РТ 90 21 23,3 43 47,7

Атнинский район РТ 180 60 33,3 77 42,7

Балтасинский район РТ 215 52 24,1 78 36,2

Кайбицкий район РТ 140 35 25,0 54 38,5

Нурлатский район РТ 13 3 23,1 3 23,0

Новошешминский район РТ 61 22 36,1 25 40,9

Камскоустьинский район РТ 56 24 42,8 35 62,5

Рыбнослободский район РТ 26 4 15,3 4 15,3

Апастовский район РТ 385 172 44,6 232 60,2

Верхнеуслонский район РТ 52 10 19,2 14 26,9

Тетюшский район РТ 15 4 26,6 7 46,6

Мамадышский район РТ 20 0 0 3 15,0

Саратовская область РФ 71 9 12,6 15 21,1

Республика Башкортостан 54 44 81,4 49 80,7

ИТОГО 1378 460 33,4 638 46,2

Проведенный нами впервые в РФ серомониторинг в отношении реовирусной инфекции отчетливо демонстрирует, что из 1378 проб сывороток крови крупного рогатого скота специфические антитела к реовирусу типа I выявляются в РТГА у 460 (33,4%), а в ИФА у 638 (46,2%) животных. Следовательно, установлена серопозитивность значительного количества животных к антигену реовируса типа I как в РТГА, так и в ИФА. Полученные результаты указывают на факты циркуляции этого возбудителя среди обследованного поголовья скота.

4 ВЫВОДЫ

1. В 2008-2011 гг. в 35 хозяйствах трех регионов, впервые в РФ проведен сероиммуномониторинг в' отношении реовирусной инфекции крупного рогатого скота. Показано, что из 1378 проб сывороток крови специфические антитела к антигену реовируса типа I выявляются в РТГА у 33,4%, а в ИФА - у 46,2% животных. Эти данные свидетельствуют о фактах циркуляции реовируса типа I среди значительного количества обследованного поголовья.

2. Установлено, что по биологическим и физико-химическим свойствам штамм «Reo I Lang» реовируса типа I соответствует критериям характеристики семейства Reoviridae, роду Orthoreovirus и определен в качестве производственного при разработке иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота.

3. Показана целесообразность применения 1,2-аминоэтилазаиридина в конечной концентрации 0,05% при 37°С в течение 24 часов для инактивации реовируса типа I, используемого в тест-системе ИФА в качестве специфического антигена. При этом достигается полная инактивация реовируса с сохранением его гемагглютинирующей активности.

4. Изыскана оптимальная схема гипериммунизации крупного рогатого скота концентрированным и очищенным антигеном реовируса типа I, позволяющая получать контрольную положительную сыворотку с высокой типоспецифической активностью в ИФА 1:3200-1:6400.

5. Впервые в РФ разработана «Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета» (Заявка на изобретение РФ №2011140364/20 от 04.10.11.). Стандартизированы условия проведения ИФА: концентрация антигена - 5-10 мкг/см3, разведения контрольных сывороток 1:400 и оптимальные экспозиции их по времени и температуре, обеспечивающие в лунках с положительной контрольной сывороткой ОП490 не менее 0,7, а с отрицательной не - более 0,2.

6. Определен критерий дифференциации положительных и отрицательных результатов исследования сывороток крови в одном разведении (позитивно-негативный порог), полученных иммуноферментной тест-системой путем вычисления коэффициента связывания конъюгата сывороточными антителами, который находится в диапазоне <16->25%.

7. Научно-обоснованы принципы серологической диагностики реовирусной инфекции КРС: выявление иммуноферментной тест-системой динамики роста специфических антител в парных пробах сывороток крови, при тестировании образцов в четырех разведениях, позволяет устанавливать реовирусную инфекцию у исследованного поголовья. Обнаружение

положительных проб сывороток крови в одном разведении, при эпизоотологическом обследовании животных ранее невакцинированных против реовирусной инфекции крупного рогатого скота, свидетельствует о циркуляции возбудителя болезни среди поголовья скота.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

При дифференциальной диагностике смешанных респираторно-кишечных инфекций телят реовирусы необходимо рассматривать как один из потенциальных возбудителей данной формы патологии.

Материалы исследований по разработке и применению иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета вошли в следующие нормативные документы:

- Методические рекомендации по определению уровня антител к реовирусу крупного рогатого скота в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), утвержденные директором Центра;

- Инструкция по применению «Иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета» утвержденная директором Центра и согласованная с начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ.

- Проект технических условий на «Иммуноферментную тест-систему для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета».

6 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гаффаров Х.З. Диагностика и специфическая профилактика респираторно-кишечных болезней у телят / Х.З. Гаффаров // Ветеринария. -1983. - №4. - С.73-76.

2. Иванов A.B. Этиопатогенез респираторно-генитальных инфекций крупного рогатого скота, проблемы и перспективы их диагностики, профилактики и борьбы с ними / A.B. Иванов, Х.З. Гаффаров И Ветеринарный врач.- 2008. - №4. - С.2-7.

3. Сюрин В.Н. Частная ветеринарная вирусология/ В.Н. Сюрин, Н.В.Фомина.- М: Колос, 1979,-158-164 с

4. Brubaker М.М. Human blood group influence on reovirus hemagglutinatination titres. / M.M Brubaker, B.West, Ellis // Proc. soc. exp. boil.-1964.- 115.-P. 1118-1120.

5. Böckmann J. Serologische erhebungen über die Verbreitung von reovirusinfektionen im österreichischen mastkälberstrapel. / J. Böckmann // Wien, tierärztl. mschr.- 1976 - 63,- P. 358-360.

6. Lai C. Reovirus is released apically from polarized endothelial cells / C. Lai, K. Kim, T.S. Dermody // American society for virology symposia: 30th annyal meeting.-2011.- P. 116.

7. Langoni H. Experimentelle Infektion von isoliert gehaltenen, kolostrum-frei aufgezogenen Kalbern mit Reo- oder Rotavirus allein sowie in Kombination: dis...doct. Medic. Veter. /H. Langoni //Hannover. - 1985. -P 133.

8. Moreno-Lopez J. A serosurvey of viruses during outbreaks of acute respiratory and/or enteritic disease in Swedish cattle. / J. Moreno-Lopez // Zbl.vet.med Reihe B-1979.-26.-8.-P.634-640.

9. Rosen L. Reoviruses in animals other than man. / L. Rosen // Ann. N.Y. acad. sei.- 1962,- 101.-P. 461-465.

10. Wizigmann G. Untersuchungen über Reovirus-Infektionen beim Rind in der Bundesrepublik Deutschlan / G. Wizigmann, G. Reinhardt // Zbl. vet. med.- 1971.18 - P.564.

7 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Москвичев О.В. Серомониторинг реовирусной инфекции крупного рогатого скота в ряде хозяйств Республики Татарстан / О.В. Москвичев, Х.З. Гаффаров // Ветеринарный врач,- 2010.-6.- С. 26-29.

2. Москвичев О.В. Патоморфология реовирусной типа I инфекции у лабораторных животных. / О.В. Москвичев, М.А. Ефимова, Х.З. Гаффаров // Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность России: материалы международной научно-практической конференции. - Казань, 2010.- С. 429-433.

3. Москвичев О.В. Получение антигена реовируса типа I для тест-системы ИФА с целью выявления специфических антител в сыворотке крови крупного рогатого скота. / О.В. Москвичев, Х.З. Гаффаров // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2008.-Т. 206.- С. 152-155.

4. Гаффаров Х.З. Иммуноферментный анализ в диагностике реовирусной инфекции крупного рогатого скота. / Х.З. Гаффаров; М.А. Ефимова; О.В. Москвичев // Ветеринарный врач.- 2011.-5.-С.14-16.

Формат 60x84 1/16. Печ.л. 1,25 Тираж 100 экз. Заказ № 754

Отпечатано в авторской редакции с оригинал-макета заказчика Типография ЧЗШаРппГ 420073, г. Казань, ул. А. Кутуя, д. 88 (843) 295-14-48

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Москвичев, Олег Валентинович, Казань

61 12-3/364

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕОВИРУСА ТИПА I И РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ИФА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ РЕОВИРУСИОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА.

06.02.02. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

На правах рукописи

Москвичев Олег Валентинович

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Гаффаров Х.З.

Казань - 2012

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - AT - антиген-антитело БОЕ - бляшкообразующие единицы

ВНК - перевиваемая культура клеток почки золотистого хомячка

ГА - гемагглютинин

ЕД - единица действия

ИП - исследуемая проба

ИФА - иммуноферментный анализ

КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер

КРС - крупный рогатый скот

Ксв - коэффициент связывания

Ken - коэффициент специфичности

ЛЭК - перевиваемая культура легких эмбриона коровы

МД - мегадальтон

MDBK-перевиваемая культура клеток почки теленка

OHE - «oily hair effect» - синдром маслянистости шерсти

ОП49о - оптическая плотность

ПНП - позитивно-негативный порог

РБ - Республика Башкортостан

РГА - реакция гемагглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РТ - Республика Татарстан

РФ - Российская Федерация

TR - перевиваемая культура клеток трахеи эмбриона коровы

УФ - ультрафиолет

ФБР - фосфатно- буферный раствор

ЦПД - цитопатическое действие

шт. - штамм

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ............................................................5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................11

1.1. Исторические аспекты изучения реовирусов и их классификация................................................................................................................................11

1.2. Характеристика реовирусов..............................................................................................17

1.3. Реовирусная инфекция кошек..........................................................................................30

1.3.1. Реовирусная инфекция собак............................................................................................32

1.3.2. Реовирусная инфекция лошадей....................................................................................32

1.3.3. Реовирусная инфекция свиней............................................................................................32

1.3.4. Реовирусная инфекция крупного рогатого скота..........................................33

1.4. Заключение по обзору литературы................................................................................38

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................................................40

2.1 Материалы исследований......................................................................................................40

2.2. Методы исследований................................................................................................................42

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ................................55

3.1. Выявление антигемагглютининов к антигену реовируса типа I в сыворотке крови различных возрастных групп крупного рогатого скота в ряде хозяйств Среднего Поволжья............................................................................................................................................55

3.2. Изучение биологических и физико-химических свойств штамма «Reo I Lang» реовируса типа I....................................................................................57

3.2.1. Гемагглютинирующая активность вируса с эритроцитами разных видов животных..............................................................................................................................57

3.2.2. Устойчивость реовируса к физико-химическим воздействиям....................................................................................................................................58

3.2.3 Изучение патогенности штамма«Яео I Lang» реовируса типа I для

новорожденных белых мышей и котят......................................................................60

3.3. Подбор чувствительных культур клеток для репродукции реовируса типа I (шт. «Reo I Lang»)........................................ 64

3.3.1. Инактивация вирусного сырья............................................. 67

3.3.2. Концентрирование и очистка реовируса типа 1...................... 68

3.4. Разработка технологии изготовления основных иммунокомпонентов тест-системы ИФА предназначенной для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител.......................................................................... 70

3.4.1. Стандартизация основных условий проведения исследований,

разработанной тест-системы ИФА....................................... 71

3.5. Испытания диагностических характеристик тест-системы ИФА (специфичность, чувствительность и воспроизводимость).......... 76

3.6 Проведение иммуноферментного анализа, учет и интерпретация

результатов..................................................................... 78

3.7. Комиссионные испытания «Тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител»......................................................................... 82

3.8. Оценка эпизоотической ситуации по реовирусной инфекции среди поголовья крупного рогатого скота на основе результатов серомониторинга осуществленного в хозяйствах Республики Татарстан и в ряде регионов Среднего Поволжья

................................................................................... 86

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ................ 89

ВЫВОДЫ....................................................................... 101

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ...................................... 103

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................. 104

ПРИЛОЖЕНИЯ............................................................... 121

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В структуре заболеваемости сельскохозяйственных животных наибольшее экономическое значение имеют респираторные, желудочно-кишечные болезни молодняка и патология органов воспроизводства маточного поголовья крупного рогатого скота (КРС), связанные с бесплодием, ранней эмбриональной смертностью и абортами, доминирующими возбудителями которых являются вирусы, относящиеся к различным таксономическим группам (Гаффаров Х.З. 1983; Иванов A.B., Гаффаров Х.З., 2008).

В настоящее время создано цельное представление о патогенных потенциях многочисленных вирусов, выделяемых от большинства животных. Среди них, наряду с герпесвирусом типа I, вирусом вирусной диареи -болезни слизистых, респираторно-синтициальным вирусом, аденовирусами I и II подгрупп, привлекает внимание исследователей малоизученные в Российской Федерации реовирусы, относящиеся к роду Orthoreovirus семейству Reoviridae. Реовирусы типов I, II и III выделили от человека, КРС, лошадей, свиней, собак, кошек и мышей. У взрослых животных чаще всего реовирусная инфекция носит латентный и инаппарантный характер и сопровождается длительным вирусоносительством и

вирусовыделением(8аЫп,1959; Hong, 1970; Lazarowich, 1977).

Реовирусная инфекция крупного рогатого скота (КРС) впервые была зарегистрирована в США, а затем в Бельгии, ФРГ, Австрии, Швеции, Франции, Голландии, Алжире, Японии и других странах, в которых выявлен высокий процент серопозитивных животных. При этом доминирующим серотипом был признан реовирус типа I (Sabin A.B., 1954; Brubaker М.М., 1964; Vincent, J.; Soph, A.; Pascal, R., 1970;Wizigmann G., Reinhard G., 1971; Moreno-Lopez I. 1979).

По данным Rosen L.( 1962),Backmann J.(1976) реовирусы способные обуславливать пневмоэнтериты у телят в первые 3 месяца жизни, проявляющиеся клинически диареей, ринитом, лихорадкой и пневмонией.

Установлено также, что у взрослых животных реовирусная инфекция протекает латентно и сопровождается снижением удоев у молочных коров (Сюрин В.Н., Фомина Н.В., 1979).

Известно, что в естественных условиях у КРС реовирусная инфекция с яркими клиническими признаками проявляется не всегда и реовирусы, в основном, участвуют в формировании острых смешанных вирусных респираторно-кишечных инфекциях телят (Гуненков В.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н., 1975). По данным Wizigmann G. и Reinhardt G.(1971) в ФРГ доказано участие реовирусов в патологии плода и новорожденных.

Из литературных источников известно, что лабораторная диагностика реовирусной инфекции КРС осуществляется путем выделения вируса в культуре клеток и полученные результаты должны быть подтверждены обнаружением прироста гемагглютининов (ГА) в период реконвалесценции по сравнению с сыворотками крови, взятыми в острой стадии болезни.

По данным зарубежных исследователей ретроспективный диагноз на реовирусную инфекцию устанавливают путем исследований парных сывороток, взятых с интервалом 3-4 недели путем исследований их в РТГА с антигеном реовируса типов I, II и III. При латентной инфекции в стаде процент животных имеющих антитела, колебался от 40 до 80% (Brubacker М.М.,1964; Wizigmann G., Reinhardt G.,1978; Moreno-Lopez J., 1979).

Однако до настоящего времени в РФ какие-либо исследования по изучению реовирусов в патологии КРС не проводились; многие аспекты этой болезни, в частности, пути и источники передачи, вирусоносительство и вирусовыделение у естественно инфицированного КРС не изучены, неизвестны также широта и степень распространения реовирусной инфекции.

В этой связи решение таких вопросов, как особенности эпизоотологии болезни, постинфекционного иммунитета и задачи связанные с разработкой современных методов и средств лабораторной диагностики реовирусной инфекции КРС, как нам представляется, является актуальной проблемой ветеринарной науки и практики.

Совершенно очевидно, что современная диагностическая служба должна опираться на такие высокоспецифичные и чувствительные методы диагностики которые позволяли бы получать воспроизводимые, достоверные и максимально качественные результаты в пределах метода, и должны быть признанные пригодными для проведения широкомасштабных исследований в условиях практических ветеринарных лабораторий. Этим требованиям в значительной степени отвечает твердофазный непрямой вариант иммуноферментного анализа.

В связи с вышеизложенным разработка иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовируса КРС является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Целями данной работы явились разработка тест-системы ИФА, предназначенной для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета, а также ее апробация в сравнении с методами аналогичной направленности. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести серологический мониторинг в отношении реовирусной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах РТ и в ряде регионов Среднего Поволжья;

- изучить биологические, физико-химические свойства штамма «Reo I Lang» - возбудителя реовирусной инфекции крупного рогатого скота;

- разработать технологию изготовления компонентов тест-системы ИФА, предназначенной для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител, и стандартизировать условия ее проведения;

- провести оценку активности, специфичности и воспроизводимости реовирусной иммуноферментной тест-системы путем тестирования сывороток крови различных возрастных групп крупного рогатого скота и

сравнительного изучения степени корреляции результатов, полученных методом аналогичной направленности (РТГА);

- определить диагностическую ценность иммуноферментной тест-системы, провести анализ и интерпретацию результатов испытания непрямого твердофазного ИФА.

Научная новизна исследований. По результатам серо-иммунологического мониторинга впервые представлены данные о распространении реовирусной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Татарстан, других республик и областей РФ.

Определены иммунобиологические свойства штамма «Reo I Lang» реовируса типа I и на этой основе обоснован выбор в качестве производственного, установлены параметры его культивирования, очистки и концентрирования.

Впервые в РФ разработана «Тест-система ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета». Оптимизированы условия ее проведения при исследовании сывороток крови животных, взятых в одном разведении. Сравнительными исследованиями подтверждена чувствительность, специфичность и воспроизводимость иммуноферментной тест-системы и выявлена положительная корреляции ее результатов с данными полученными методом аналогичной направленности (РТГА).

Положительные результаты испытания иммуноферментной тест-системы подтверждены в производственных условиях.

Практическая значимость исследований.

Внедрение разработанной тест-системы ИФА в практику ветеринарных лабораторий РФ позволит решить проблему серологической диагностики реовирусной инфекции КРС и оценки напряженности поствакцинального иммунитета.

Материалы исследований по разработке и применению тест-системы ИФА вошли в научно-нормативные документы.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: международно-практической конференции, посвященной 50-летию ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» «Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность» (Казань, 2010).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в т.ч. 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Результаты обследования в РТГА сывороток крови крупного рогатого скота различных возрастных групп в отношении реовирусной инфекции в ряде хозяйств Среднего Поволжья, неблагополучных по респираторно-кишечным заболеваниям.

2.Характеристика биологических и физико-химических свойств штамма «Reo I Lang» - возбудителя реовирусной инфекции крупного рогатого скота.

3. Технология изготовления специфических компонентов тест-системы ИФА для серологической диагностики и определения уровня поствакцинальных антител.

4. Оценка диагностической ценности иммуноферментной тест-системы, анализ и интерпретация результатов испытания разработанной тест-системы.

5. Результаты иммуномониторинга с помощью «Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета» в скотоводческих комплексах ряда хозяйств Среднего Поволжья.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение

результатов исследований, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы, состоящий из 169 источников, в том числе 121 иностранных авторов и приложение. Диссертация содержит 19 таблиц и иллюстрирована 6 рисунками.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Исторические аспекты изучения реовирусов и их классификация.

Вирусы, принадлежащие к группе реовирусов, были выделены из кала детей в начале 50-х гг., но свое название получили лишь в 1959г. В 1953 г. Stanley описал вирус, выделенный из кала детей, который они назвали вирусом гепатоэнцефаломиелита. Сходный изолят вируса был получен через 4 года в Голландии также из кала детей (Van Tongeren Н.А.Е., 1957). Ни в одном случае не было выявлено связи вируса с каким-либо заболеванием. Другие изоляты были получены из кала здоровых детей и детей больных диареей, а также членов семьи со стеаторейным энтеритом. Один из выделенных вирусов стал прототипом группы ECHO-10 (Sabin A.B., 1954). Эти вирусы отнесли к группе ECHO-10, поскольку их выделили из кишечника; они не были связаны ни с каким заболеванием, и хорошо размножались в культуре клеток почек обезьян, приводя к выраженному цитопатическому эффекту (ЦПЭ). Первоначально считали, что полученые изоляты непатогенны для новорожденных мышей (Sabin A.B., 1959); это послужило основным критерием отличия вирусов группы ECHO от других энтеровирусов.

Однако скоро стало ясно, что вирусы группы ECHO-10 отличаются от других энтеровирусов некоторыми важными свойствами, среди них - размер вирионов, патогенность для животных, особенности ЦПЭ и способность к гемагглютинации. Фильтрование вирусов ECHO-10 через мембранные фильтры показало, что они в 5 раз крупнее других энтеровирусов, полиовируса, вируса Коксаки (Sabin A.B., 1957). Некоторые штаммы патогенны для новорожденных мышей и вызывали поражение центральной нервной системы, печени и сердца (Sabin A.B., 1959). Они способны к заражению первичных культур клеток, не чувствительных к другим энтеровирусам.

В 1959 году Сэбин предложил выделить ECHO-10 в отдельную группу. Поскольку эти вирусы, обычно выделяемые из дыхательных путей и пищеварительного тракта, не были связаны ни с одним из известных заболеваний, он назвал их реовирусами (reo - начальные буквы слов respiratory - enteric - orphans) (Both et al., 1975). В начале 70-х гг. были выделены орбивирусы и отнесены к сем. Reoviridae, а в конце 70-х гг. -ротавирусы из-за того, что они содержат двухцепочечный РНК-геном (Arnott et al.,1967). К реовирусам относят также три группы вирусов с сегментированным РНК-геномом, инфекционные для насекомых и растений (циповирусы, фитовирусы, фидживирусы) (Bellamy, 1967).