Филогенетический анализ изолятов реовируса кур и изучение биологических свойств изолята ARV04/02rus, выделенного на территории РФ

Зиняков, Николай Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Филогенетический анализ изолятов реовируса кур и изучение биологических свойств изолята ARV04/02rus, выделенного на территории РФ
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Филогенетический анализ изолятов реовируса кур и изучение биологических свойств изолята ARV04/02rus, выделенного на территории РФ"

На правах рукописи

005019286

Зиняков Николай Геннадьевич

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗОЛЯТОВ РЕОВИРУСА КУР И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТА АКУ04/02ги$, ВЫДЕЛЕННОГО НА ТЕРРИТОРИИ РФ

03.02.02 «Вирусология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир - 2012

005019286

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

доктор биологических наук, профессор, Дрыгин Владимир Викторович

Сухарев Олег Иванович

доктор ветеринарных наук, профессор, профессор кафедры ветеринарной патологии Российского университета дружбы народов (РУДН), г. Москва

Балышева Вера Ивановна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ведущий научный сотрудник Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии), г. Покров

Научный руководитель -Официальные оппоненты:

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»), г. Москва

Защита диссертации состоится 15 мая 2012 г. в «1200» часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГБУ «ВНИИЗЖ».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан «_» апреля 2012 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ»

доктор биологических наук ^ Пономарев

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Реовнрусная инфекция птиц — вирусное заболевание, характеризующееся поражением двигательного аппарата, развитием у птицы малабсорбционного синдрома. Возбудителем заболевания является реовирус птиц, принадлежащий к роду Ог/Аогатпи семейства 1{ео\'тс1ае.

Высоковирулентные штаммы реовируса кур (РК) вызывают поражение различных органов птицы, при этом гибель птиц при экспериментальном заражении в раннем возрасте может достигать 100% [14]. Экономический ущерб птицеводству, причиняемый реовирусом, не ограничивается прямыми потерями, значительные убытки могут быть вследствие снижения яйценоскости и прироста массы тела при хронически протекающем инфекционном процессе [11]. Необходимо отметить возможные осложнения и низкую эффективность вакцинации молодой птицы живыми вакцинами при скрытой инфекции [10].

Результаты исследований, проведенных в ФГБУ «ВНИИЗЖ», свидетельствуют о сохранении проблемы реовирусной инфекции на птицефабриках РФ [6]. Среди изолятов реовируса кур, выявленных на территории РФ, наблюдается значительное генетическое разнообразие, что требует усовершенствования существующих молекулярно-генетических методов выявления вирусного генома [1]. Использование современных методов молекулярной диагностики позволяет в кратчайшие сроки произвести идентификацию возбудителя, определить первичную структуру вариабельных участков вирусного генома для быстрой характеристики выявленных изолятов. Последующий анализ генома позволяет сделать предположение о возможных изменениях биологических свойств исследуемого изолята вследствие генетических изменений за счет инсерций, делеций, единичных замен, способных вызвать сдвиг рамки считывания. Однако качество и полнота филогенетического анализа зависят от наличия доступных баз данных для того или иного возбудителя, что определяет актуальность исследований структуры вирусного генома вновь выделяемых возбудителей. Поскольку маркеры

патогенности для РК не установлены, секвенирование полного генома вирулентных изолятов способствует решению проблемы выявления генетических детерминант вирулентности.

Степень разработанности проблемы. Отечественными исследователями изучены биологические свойства ряда штаммов реовируса кур, исследованы антигенные свойства выделенных изолятов, показана возможность применения метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) для выявления реовируса кур [1, 4, 5].

Цель и задачи исследования. Цель данных исследований заключалась в изучении генетического разнообразия популяции реовируса кур на территории РФ, детальном изучении генетических особенностей и биологических свойств изолята А11У04/02гш. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. С помощью разработанных ранее методов, провести исследования на наличие реовируса кур в пробах патологического материала, полученных из птицеводческих хозяйств.

2. Провести сравнительный и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участка гена БЗ изолятов РК, выявленных в РФ в период с 2007 по 2011гг.

3. Изучить патогенные свойства изолята АЯУ04/02ги$ для цыплят и куриных эмбрионов (КЭ).

4. Определить нуклеотидную последовательность геномных сегментов изолята АЯУ04/02гих.

5. Провести анализ нуклеотидных последовательностей геномных сегментов изолята АЯУ04/02гия.

Научная новизна исследования. Определены нуклеотидные последовательности участка гена БЗ 117 изолятов РК, выявленных на территории РФ и стран ближнего зарубежья в период с 2007 по 2011гг. Выявлены изоляты из генетических групп, не зарегистрированных ранее на территории РФ.

Показана патогенность изолята АЯУ04/02гиз для И-суточных куриных эмбрионов и 3-суточных цыплят.

Расшифрована и проанализирована нуклеотидная последовательность транслируемых участков геномных сегментов изолята РК АЯУ04/02гиз.

Практическая значимость исследования. В процессе научно-исследовательской работы по теме диссертации были разработаны методы для оценки антигенной активности вируссодержащего материала, предложен метод выявления реовируса кур на основе ОТ-ПЦР-РВ, проработаны технические моменты, связанные с исследованием вирусного генома методом секвенирования с применением коммерческих наборов и автоматизированных станций.

Соответствие содержания диссертации паспорту специальности 03.02.02 «Вирусология». В соответствии с формулой специальность 03.02.02 «Вирусология» представляет собой область науки, занимающуюся исследованием вирусов, их происхождения, состава, строения, генетики, морфологии, механизмов размножения, аспектов взаимоотношений с клеточными организмами, проблемами противовирусного иммунитета, патогенности вирусов, разработкой мер и средств предупреждения, диагностики и лечения вызываемых вирусами заболеваний. В диссертационной работе приведены исследования по разработке методов выявления реовируса кур и изучения вирусного генома. Представлены результаты анализа генетического разнообразия среди выявленных возбудителей, характеристика биологических и филогенетических свойств изолята реовируса кур АЯУ04/02ги.ч.

Результаты научного исследования соответствуют 3, 4, 6, 8, 9 пунктам паспорта специальности.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 20072011 гг., представлены на Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству в Марокко (Маракеш, 2009).

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в т.ч. 3 статьи в журналах, включенных в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена БЗ изолятов РК, выявленных в РФ в 2007-2011гг.

2. Результаты исследования патогенных свойств изолята РК АКУ04/02гия для КЭ, 3-суточных цыплят.

3. Результаты анализа геномных сегментов изолята А11У04/02ш5.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 147 страницах

компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, приложения. Список литературы включает 186, источников из которых 162 - иностранные. Работа содержит 13 таблиц и иллюстрирована 46 рисунками.

Личный вклад автора в выполнение работы. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно по месту работы в лаборатории диагностики болезней сельскохозяйственных животных ФГБУ «ВНИИЗЖ». Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ» канд. биол. наук Андрейчуку Д.Б., канд. биол. наук Колосову С.Н., канд. вет. наук Чвала И.А. за помощь в проведении отдельных этапов работы.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы

Для проведения экспериментов использовали:

- изолят А[1У04/02гия, выделенный в ФГБУ «ВНИИЗЖ» от кур с патологией суставов в 2002 г;

- культуру клеток куриных фибробластов (культура КФ);

- 11-суточные эмбрионы кур свободных от патогенных факторов СПФ-кур "ЬоЬтапп" (Германия);

- клинически здоровых цыплят, не имеющих антител к реовирусу птиц;

- синтетические олигонуклеотиды, синтезированные НПО «Синтол» (Россия).

- реактивы фирм «Promega» (США), «Fermentas» (Литва), «Invitrogen» (США), «Applied Biosystems» (США), «Биоком» (Россия).

2.2. Методы

Выделение нуклеиновой кислоты. Для выделения нуклеиновой кислоты из проб патологического материала использовали коммерческий набор с суспензионным силикатным сорбентом NucleoS+ («Биоком», Россия) согласно инструкции производителя.

Выбор праймеров для обратной транскрипции и ПЦР. Расчет праймеров выполняли с помощью программы Oligo (v.3.3). Оценку эффективности подобранных пар проводили экспериментально.

Реакция обратной транскринцпн. Смесь, содержащую 13 мкл выделенной нуклеиновой кислоты и 10 пмоль специфичных праймеров, денатурировали путем нагревания при 96°С в течение 1 мин с последующим резким охлаждением при 0°С и дальнейшей инкубацией в течение 15 мин на льду. После этого в смесь добавляли 5 мкл 5-кратного буфера для реверсии, 0,5 мкл 10 мМ р-ра дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1 ед. AMV-ревертазы («Promega»). Наслаивали по 20 мкл минерального масла. Амплификацию проводили на многоканальном амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) по программе: 53°С - ЗОмин.

Полимеразная ценная реакция. Амплификацию кДНК проводили с помощью метода гнездовой ПЦР, для этого в смесь с конечным объемом 25мкл добавляли буфер для Taq-полимеразы в объеме 5 мкл, 2,5 мкл 25 мМ MgCl2, 0,5 мкл 10 мМ р-ра дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1 мкл специфичных праймеров в концентрации 10 пмоль и 3 мкл синтезированной кДНК. Реакция включала первоначальную денатурацию 95°С - 2 мин и 40 циклов амплификации по программе: 95°С - 30 сек, 56°С - 30 сек, 72°С - (40-140)сек. С целью повышения специфичности реакции и получения материала для секвенирования

проводили дополнительную амплификацию, используя внутреннюю пару праймеров. Реакция включала 25 циклов по программе: 95°С - 30 сек, 56°С - 30 сек, 72°С - (30-90) сек.

Очистка продуктов ПЦР для секвенирования. Очистку продуктов реакции от остальных компонентов ПЦР-смеси проводили согласно ранее предложенному методу [3].

Реакция секвенирования. Секвенирование амплифицированных фрагментов генома изолятов реовируса осуществляли с использованием флюоресцентно-меченых терминирующих нуклеотидов на генетическом анализаторе 3130x1 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США) согласно инструкции изготовителя.

Анализ последовательностей ПЦР-ампликонов реовируса кур-Сравнительный анализ последовательностей базы данных GenBank и полученных ПЦР-ампликонов проводили с использованием пакета программ BioEdit (v.5.0.6., 2001г., v.6.0.6., 2004г.) с программами: "Clustal W" (выравнивание последовательностей), "Identity matrix" (вычисление процента сходства последовательностей). Для построения дендрограмм использовали пакет программ Mega (v.1.01, 1999-2001 г.г.) со встроенным алгоритмом анализа.

Определение инфекционной активности. Титрование вируса проводили на культуре клеток куриных фибробластов (КФ) методом последовательных 10-кратных разведений. Титром вируса считали наивысшее его разведение, вызывающее цитопатическое действие (ЦПД) в 50% культуры клеток КФ. Титр вируса выражали в lg ТЦД5о/мл и рассчитывали по методу Р. Кербера в модификации И.П. Ашмарина [2].

3. Результаты собственных исследований

3.1. Филогенетический анализ и группирование выявленных изолятов реовируса кур. С помощью реакции ОТ-ПЦР с выбранной системой праймеров на ген S3 в период с 2007 по 2011 гг. была исследована 351 проба патологического материала, поступившего из 62 птицеводческих хозяйств

различных регионов РФ, Украины и Республики Беларусь. Фрагменты вирусного генома были выявлены в 117 пробах, что составило 33% от общего числа. По результатам анализа случаев выявления реовируса кур показано преимущественное протекание ассоциированной реовирусной инфекции с другими патологическими агентами (88% от общего числа выявленных случаев). При ассоциированной инфекции максимальный возраст птицы, у которой были выявлены фрагменты реовирусного генома, составил 12 недель. В то же время было отмечено, что реовирус без ассоциированных агентов выявлен лишь у 12% от общего числа исследованных проб, при этом максимальный возраст птицы, от которой были отобраны пробы, составил 45 дней.

На основе доступной информации, представленной в ОепВапк, и вновь полученных данных по первичной последовательности участка гена БЗ все изоляты и штаммы РК были разделены на 11 генетических групп (рис.1).

При выделении генетических групп в качестве основного критерия использовали уровень нуклеотидных отличий равный 10%, предложенный ранее [9]. Мы посчитали целесообразным для анализа дендрограмм ввести термин генетической линии, который подразумевает совокупность генетических групп и отдельных изолятов, имеющих общее направление в развитии, которое выражается в накоплении сходных нуклеотидных и аминокислотных замен. Таким образом, 11 генетических групп, предложенных в результате анализа, можно объединить в 5 генетических линий. Первая генетическая линия состоит из трех групп: 1А, 1В, 1С (рис.1). Группа 1А представлена штаммами, выделенными на территории США, острова Тайвань и Японии (БПЗЗиБА, 176178 А, 1733178 А, 2408ША, бОШТшшап, 750505Тш\уап, Т6Та1шап, 919Тшшап, АЛУ С-98, АЯУ С-98, АЛУЛЗА/1/98, 0816Парап, АЯУ В-98). Специфические для группы аминокислотные замены отсутствуют. Уровень нуклеотидных отличий внутри группы не превышает 5%. Уровень отличий от представителей других групп варьирует от 9 до 19%. Принимая во внимание высокий уровень нуклеотидной идентичности среди представителей данной

группы со штаммом 81133, предлагается обозначение для данной группы «51133-подобные».

0.02

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное методом Ш по нуклеотидным последовательностям участка гена 83 (645-857 п. н. последовательности штамма 81133 (и20642)) штаммов и толягов реовируса кур, представленных в СепВапк, а также выявленных на территории РФ (2007-2011)

I I - выявленные на территории РФ 2007-20! 1 - выделенные в других странах

Группа 1В представлена штаммами, выделенными на острове Тайвань (60ЮТа1\уап, 916Та1\уап, 918Та1\уап, 112/Т\\Тш\уап, 1017-1Та1шап) (рис.1). Специфические аминокислотные замены отсутствуют. Уровень отличий от представителей других групп варьирует от 9 до 21%.

Группа 1С представлена штаммами РаЬеу-Сгош1у, АЯУ/ОА/2/98 и тремя выявленными на территории РФ изолятами (А11У06/08ги5, АРУ06/09гив, АЯУ12а/09гиз). Аминокислоты УаГ«, и Аяр27- выявлены также у представителей группы ШС и не могут быть специфическими аминокислотными заменами данной группы. Отмечено, что до 2008 г. изолятов, генетически близких представителям 1С группы, зарегистрировано не было.

Вторая генетическая линия включает одну группу (рис.1), которая представлена изолятами, выявленными на территории РФ и Украины (ARV16a/07rus, ARV16b/07rus, ARV16c/07rus, ARV16d/07rus, ARV16e/07rus, ARV18/07rus, ARV19/07rus, ARV02/09rus, ARV04a/09rus, ARV08/09rus, ARV13/09rus, ARV15a/09ukr), а также изолятами, любезно предоставленными д-ром Tozzi J. (Институт зоопрофилактики, г.Брешия, Италия), условно обозначенные как 01/98ita, 02/98ita, 05/98ita. У всех представителей данной группы отмечена аминокислота Tre27«, однако в этой позиции треонин отмечен также у представителей группы IVA. Уровень отличий от представителей других групп варьирует от 10 до 22%. Отмечено, что до 2007 г. изолятов, генетически близких представителям II группы, на территории РФ зафиксировано не было. Малое число птицефабрик, а также значительное географическое удаление между птицефабриками, на которых были выявлены данные изоляты, свидетельствует о спорадическом заносе на территорию РФ представителей данной генетической группы.

Наиболее распространенной на территории РФ является третья генетическая линия, состоящая из трех групп: IIIA, HIB, IIIC. Характерной аминокислотной заменой данной линии является положительно заряженная аминокислота в позиции 230 (Arg или Hys). Для группы III А характерно наличие Arg230 и А1а229- У представителей группы HIB в положении 230 находится гистидин и аланин в положении 229, дополнительно можно отметить наличие Gly2is, Не22з> Phe22s- У представителей группы IIIC в позиции 230 находится аргинин, А1а229 является скорее исключением, однако характерно наличие Asp277 или Gln277.

Четвертая генетическая линия представлена 2 группами: IVA, IVB (рис.1). Основным отличием изолятов этой генетической линии является Рго229- При этом у группы IVA присутствуют Ser232 и Тге278, тогда как у группы IVB в этих позициях находятся Asp232 и Met2?s- У группы IVA также можно отметить Ser239.

Для пятой генетической группы (рис.1) затруднительно выделение обособленных генетических групп. Наиболее целесообразным будет разделение

на две группы: УА, УВ. Из характерных аминокислотных замен можно отметить А$р245> РЬе248, С1п277. При этом единственной аминокислотной заменой, не встречающейся у других генетических линий, является РЬе248, однако эта замена встречается не у всех представителей группы. Значительное число изолятов, компактно располагающихся на филогенетическом дереве, указывает на происхождение от общего ранее занесенного предка. В то же время наличие промежуточных форм между группами УА и УВ (изоляты АЛУ01/06гив, АЯУ03/07икг, АЯУ03/09п^) свидетельствует о существовании дополнительного локуса образования новых изолятов внутри генетической линии.

3.2. Генетический анализ близкородственных изолятов, выявленных в одном птицеводческом хозяйстве. Имевшие место случаи выявления близкородственных изолятов на одной птицефабрике в разные периоды были использованы для вычисления скорости накопления изменений нуклеотидной последовательности (с!) фрагмента гена 83.

с^Б^/Д^д, где

012 - процент отличий между нуклеотидными последовательностями в паре предок - потомок;

Д^д — временной интервал между выявлением двух родственных изолятов.

Так, для пары АЯУ04/00гих и А11У10а/07г1« показано, что скорость накопления изменений составила 2><10"3 замен на нуклеотид в год. Для пары А11У01/02ги5 и А11У05/07ш8 она оказалась равной 11 х 10"3 замен на нуклеотид в год. Однако подобные расчеты можно проводить при условии, что ранние изоляты являются предковой формой (или максимально к ней приближенной) для поздних изолятов. Наиболее достоверные данные по вычислению скорости накопления замен можно получить при анализе изолятов АЯУ03/99ги5 (ЕР068269), АЯУ09/99гия (ЕЕ068271), АЯУ08/01шя (ЕР068291), АКДПЗ/Шпк (ЕР068296), АЛУ01/05ш8 (ЕР068315), АКУОШбгив, выявленных на одной птицефабрике в течение 8 лет. Все представители этой группы отличаются от изолятов, выявленных в других регионах, что может свидетельствовать об

однократном заносе возбудителя и формировании изолированного очага инфекции. Для вычисления средней скорости накопления замен внутри данной группы с помощью программы Excel был произведен расчет коэффициента линейной регрессии, согласно которому скорость накопления замен составила 6,5х 10"3 замен на нуклеотид в год относительно последовательности изолята ARV03/99rus и 5,9х 10"3 замен на нуклеотид в год относительно последовательности изолята ARV09/99rus.

Принимая во внимание различия между последовательностями изолятов ARV03/99rus и ARV09/99rus (4.7%), можно предположить, что оба изолята 1999г. не являются предковой формой более поздних изолятов, а возможный занос возбудителя произошел раньше 1999г. В таком случае максимальная скорость накопления изменений в пределах этой обособленной группы по фрагменту гена S3 составит 6.0х 10"3 замен на нуклеотид в год.

3.3. Изучение патогенных свойств изолята реовируса кур ARV04/02rus для 11-суточных эмбрионов СПФ-кур. Экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ) с инфекционной активностью 5,0 lg ТЦД50/О,1мл инокулировали в аллантоисную полость экспериментальной группе 11-суточных эмбрионов СПФ-кур. По окончании эксперимента контрольные эмбрионы и живые эмбрионы опытных групп охлаждали при температуре +4°С в течение 12 ч.

Гибель всех эмбрионов опытной группы зарегистрирована в интервале 96 - 144 часов после заражения. В процессе вскрытия погибших КЭ наблюдали выраженную гиперемию кожи зараженных эмбрионов и общее отставание в росте, а также обильные кровоизлияния в затылочной области головы. С помощью ОТ-ПЦР вирусный геном был выявлен в пробах аллантоисной жидкости, хориоаллантоисной оболочки (ХАО) и в пробах внутренних органов, отобранных от КЭ экспериментальной группы. Титрование вируссодержащего материала на культуре клеток КФ показало, что наибольший титр инфекционной активности был отмечен в суспензии, приготовленной из ХАО, и был равен 7,25 lg ТЦД50/МЛ, инфекционный титр хориоаллантоисной жидкости

составил 5,25 ТЦД50/мл, минимальный был в суммарной суспензии внутренних органов - 3,75 ТЦД50/мл.

С целью установления влияния величины заражающей дозы на время гибели эмбрионов было проведено дополнительное экспериментальное заражение. В опыте было использовано 5 групп по 30 КЭ. Каждая группа была инфицирована ЭЭЖ с 10-кратным шагом разведения. Результаты эксперимента представлены в табл. 1.

При заражающей дозе 6-4 \g ТЦД50/МЛ гибель эмбрионов наступала через 5-6 суток. При заражающей дозе 3 1ц ТЦД50/мл полная гибель КЭ экспериментальной группы отодвигалась на 1-2 дня (7-8 суток после инфицирования). При заражении в дозе 2 ТЦЦ5о/мл была отмечена гибель лишь 5 КЭ из 30 в течение 6-7 суток после инфицирования.

Таблица 1

Результаты учета гибели эмбрионов СПФ-кур при использовании

различных заражающих доз изолята реовируса кур АЬ1У04/02г118

Группа Заражающая доза, ^ ТЦД50/мл Число погибших КЭ

1сут 2сут Зсут 4сут 5сут бсут 7сут 8сут

1 6,0 0 0 0 4 20 6 - -

2 5,0 0 0 0 3 15 12 - -

3 4,0 0 0 0 2 13 15 - -

4 3,0 0 0 0 0 2 10 17 1

5 2,0 0 0 0 0 0 2 3 0

«-» - полная гибель опытной группы.

3.4. Изучение патогенных свойств изолята АЯУ04/02гиз для 3-суточных цыплят. С целью изучения патогенного действия изолята АЯУ04/02ш8 для цыплят 3-суточного возраста, группа из 15 цыплят была инфицирована ЭЭЖ с инфекционной активностью 5,75 ^ ТЦД50/мл. Каждому цыпленку в экспериментальной группе перорально было введено 0,1 мл ЭЭЖ. В течение семи суток после заражения было отмечено легкое угнетение птиц. В течение третьих и четвертых суток эксперимента была отмечена гибель двух

цыплят. При вскрытии наблюдали обширные кровоизлияния в области скакательных суставов, увеличение почек. Изменений в респираторном и пищеварительном тракте обнаружено не было. Фрагменты вирусного генома были обнаружены у всех павших цыплят в отдельно исследованных пробах легких и трахеи, почек, скакательных суставов.

На седьмые сутки эксперимента были отобраны глоточные и клоакальные смывы. Результаты ПЦР-анализа взятых смывов показаны в табл. 2.

Таблица 2

Результаты выявления генома ЛЯУ в смывах

Группа Глоточный смыв Клоакальный смыв

Экспериментальная 7/13* 10/13

Контрольная 0/5 0/5

*- в числителе количество проб, в которых были выявлены фрагменты вирусного генома, в знаменателе общее количество исследованных проб.

Выявление фрагментов вирусного генома в клоакальных смывах подтверждает литературные данные о том, что большое количество возбудителя находится в кишечнике и впоследствии выделяется с пометом, обеспечивая тем самым горизонтальное распространение инфекции [15].

В материале, отобранном через 10 суток после заражения, фрагменты вирусного генома были выявлены в пробах легких, трахеи, почек, тканей скакательного сустава. Пробы легких и трахеи инфицированных цыплят были использованы для вирусовыделения, по результатам которого было установлено наличие активного вируса в органах дыхательной системы. Полученные результаты демонстрируют возможность бессимптомного вирусоносительства и отсутствие поражений в респираторном тракте при заражении цыплят изолятом АКУ04/02ш8.

Малый процент гибели цыплят в экспериментальной группе (12%) согласуется с литературными данными о том, что пероральный способ заражения с использованием штамма высоковирулентного для суточных цыплят не вызывает 100% гибели у цыплят в возрасте 3-4 суток [13].

3.5. Анализ генома изолята АКУ04/02ги$. Для секвенирования генов изолята А11У04/'02гия были использованы различные системы праймеров (рис.2), при этом зона перекрытия секвенированных фрагментов составляла не менее 100 п.н.

АЯЩ1_580Я 300 450 " "Ьоо г 750

/да/агит 1050 ' 1^00 1150

Атгг1_7бт

3!75Г?19ГА

АЮТ>1_1602Ш АКТО! 1621Ж

12ЙЯ

Ь2

АКУЭЗ 768Р

АКУ22_923Р

вз

Б4

М1

1Г"

ВБЗАКУ

АЯУ1З-<125 "Д

^753_900

АЯУ&ОбОТ"

3-?1127

АЮТЗ-г1127

зоо 400 йоо

'000 "00

1 шее АЯУМ1.

АЯУ54_И58Я АЯУ54_1164Я

АКУМ1 1834Я,

ПОР 1600 " Шо) 2000 •22Р0

АКУМ1_77Ш5

АЯУМ1 Ш5Р

ДПО 400 йПП 800 1 ПГ)0 1200 1400

'»""_2Щ2_2т.

М2

МЗ

АЯ.УМЗ_Д8Р

АЯУМ2_572Р

АЯУМ2_1317Р

АЛУМ^" 204ДЯ

_1Ж.

200 400 61

АЮЛ-|_787И

!0ТI 800 1000 ПОП 1400_1600

уП*609К АКУыТюгГ АЯ\Л.1 1373? 1732К

Ж._ш

А1ИЛ,1 22Е

АГОЧ 214ЙКЧ_ АЮЛ,1 229 Ж

Ш_2Ж.

АЯЧЦ2998Я 28011 I 3000

АК\Ц 3751К

_Щ.

АЙН 173217

3090^АКТи!ЙЯ

тт

ЧДТ.1 3

АЯШ 38681 АКШ_38?Ж

J59R ^OR J420R

4МП

200 MI СТО 1 1 1000 1200 1400 I КОС 1800 2000 2200

J420R

oTI

I8F

2OT

^1976R 25Ж

2200 2400 I 2600_2800_3000 ~ 3200_MOO_3600_3800

3770R

ARVLL570R 200 400 I 600

IVL3JÍF ,3 34F ARVLfJF

2200 2400

ARVL3 103 IR 800 lOtO

IRVL?I:

ARVL3JlMR 1400_TH

ilioR 2000 2200

I L,

l_»ARVLr; L_^VL3 1779F ARVL3 1266F

ARVL3 270PR ^ I 2800

2600

.224 2F

UlSlTF

ARVL3.

3000_3^001

mfc

ARVL3 1P46R ,

ARVL3 2346R

3600

ARVL3 361

ARVL3_385¡

3^67

ARVL3J867R

Piic. 2. Схема расположения праймеров na геномных сегментах изолята peo вируса

С помощью ОТ-ПЦР с использованием различных систем праймеров были амплифицированы и секвенированы транслируемые участки нуклеотидной последовательности генов SI, S2, S3, S4, MI, М2, МЗ, Ll, L2, L3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал генетическую вариабельность от 16 до 47% в зависимости от геномного сегмента (табл. 3).

Таблица 3

Уровень нуклеотидных отличии геномных сегментов изолята ARV04/02rus от представленных в GenBank

Уровень отличий, % Сегмент, используемый для сравнительного анализа

S1 S2 S3 S4 М1 М2 МЗ L1 L2 L3

Минимальный 31 19 10 17 15 11 10 17 14 13

Максимальный 46 20 16 22 17 25 22 18 16 25

В результате филогенетического анализа было установлено, что ближайшими родственниками изолята АЯУ04/02гиз по гену являются изоляты, выделенные на территории Германии и Нидерландов. Было отмечено,

что все изоляты, использованные в работе [8] были патогенны для кур и вызывали как теносиновит, так и малабсорбционный синдром. Таким образом, наследование гена 51 от патогенных европейских штаммов может объяснить патогенные свойства данного изолята для цыплят и куриных эмбрионов.

В результате исследований было установлено, что сегменты БЗ и М2 были унаследованы от предковой формы генетически, близкой с низковирулентным американским штаммом 138. Подобный обмен генами может объяснить различие в вирулентных свойствах изолята АЯУ04/02ш8 для суточных и 3-суточных цыплят. Данное предположение основано на результатах работы, в которой отмечено, что вирусное потомство, унаследовавшее ген М2 от штамма 138, обладало крайне слабым цитотоксическим действием для культуры макрофагов [7]. При этом ранее была показана зависимость тяжелого протекания инфекционного процесса в случае иммуносупрессии, возникающей при реовирусной инфекции [12].

По генам МЗ, ЬЗ изолят АЯУ04/02гиз наиболее близок с изолятами, выделенными на территории о.Тайвань. Высокий уровень нуклеотидных отличий по отдельным геномным сегментам (52, Б4, М1, Ы) изолята АЮ/04/021т от известных штаммов позволяет предположить наличие неизученных генетических линий в популяции реовируса кур. Уровень отличий изолята АЯУ04/02гиз от известных штаммов по сегменту Б2 составил 19%, по сегменту Б4 - 17%, по сегменту М1 - 15%, по сегменту Ы - 17%. Таким образом, полученные результаты доказывают, что в формировании новых изолятов среди реовирусов кур реассортация геномных сегментов играет значительную роль. Механизм реассортации сегментов генома, по всей видимости, происходит в случайном порядке, и впоследствии под действием естественного отбора закрепляются наиболее удачные сочетания генов.

4. Выводы

1. В период с 2007 по 2011 гг. была исследована 351 проба патологического материала. Реовирус кур был выявлен в 117 пробах, что составило 33% от общего числа исследованных.

2. По результатам сравнительного и филогенетического анализа участка гена БЗ установлено, что изоляты, выявленные на территории РФ, и штаммы, представленные в ОепВапк, формируют 11 генетических групп с уровнем межгрупповых отличий от 10 до 21%. Среди выявленных изолятов 15 относятся к группам 1С и II, представители которых впервые выявлены на территории РФ. Определена скорость накопления нуклеотидных замен для сегмента БЗ, которая составила 6.0х 10"3 замен на нуклеотид в год.

3. Установлена низкая вирулентность изолята АКУ04/02гиз для 3-суточных цыплят при пероральном заражении. Результаты вирусовыделения свидетельствуют о возможности скрытого течения инфекционного процесса без патологоанатомических изменений органов дыхательной системы. Изолят АЯУ04/02гия вызывает гибель развивающихся КЭ.

4. Определена нуклеотидная последовательность транслируемых участков всех геномных сегментов. Суммарная длина исследованных последовательностей геномных сегментов составила 20 244 п.н., что составляет 86% полного размера вирусного генома.

5. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал генетическую вариабельность от 16 до 47% в зависимости от геномного сегмента. Установлено генетическое родство изолята АЯУ04/02ги5 по генам БЗ и М2 со штаммом 138.

6. Выявлены новые генетические линии по геномным сегментам 82, 84, М1, Ы среди реовирусов кур. Уровень отличий изолята АЯУ04/02ги.ч от известных штаммов по сегменту Б2 составил 19%, по сегменту 84 - 17%, по сегменту М1 — 15%, по сегменту Ы — 17%.

5. Практические предложения

Для использования в лабораторной практике при проведении научно-исследовательских работ по обнаружению и изучению специфических вирусных компонентов предлагаются одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методические указания:

«Методические указания по выявлению и количественному определению антигена реовируса птиц в непрямом жидкофазном блокирующем варианте иммуноферментного анализа» (утверждены 12. 12. 2008г.);

- «Методические указания по выявлению реовируса кур методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» (утверждены 08. 02. 2012г.);

- «Методические указания по определению последовательности ДНК с помощью реакции секвенирования на генетических анализаторах Applied Biosystems 3130 и 3130x1 при автоматизации пробоподготовки продуктов реакции секвенирования с использованием станции Freedom Evo-2 100Base» (утверждены 08. 02. 2012)

6. Список использованной литературы

1. Андрейчук Д.Б. Разработка молекулярно-биологических методов диагностики реовирусной инфекции кур и изучение изолятов, выявленных на территории Российской Федерации: дис. ... канд. биол. наук. - Владимир, 2005. -178с.

2. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях.- Л.:Медгиз, 1962. -180с.

3. Использование Аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) для очистки ДНК- фрагментов, плазмидной ДНК и РНК // Грибанов О.Г., Щербаков A.B., Перевозчикова H.A., Гусев A.A. -Биохимия,- 1996.- вып. 61(6). - С.1064-1070.

4. Коровина В.В. Изучение распространения и антигенных взаимоотношений штаммов реовируса теносиновита кур: дис. ... канд. вет. наук. -СПб., 2001.- 122с.

5. Сарбаева Н.В. Сравнительная характеристика вакцинного и эпизоотического штаммов реовируса теносиновита кур: автореф. дис. канд. биол. наук. - М., 1997. - 23 с.

6. Серологический мониторинг птицехозяйств Российской Федерации по авиреовирусной инфекции и синовиальному микоплазмозу / А.И. Куприянов, И.А. Волкова, В.В. Шкиря [и др.] // Аграрная Россия.- 2002,- №2,- С.20-24.

7. Avian reovirus major mu-class outer capsid protein influences efficiency of productive macrophage infection in a virus strain-specific manner / D. O'Hara, M. Patrick, D. Cepica, [et al.] // J. Virol. - 2001. - Vol.75, N.l 1. - P.5027-5035.

8. Classification of Dutch and German avian reoviruses by sequencing the a C protein / A. Kant, F. Balk, L. Born, [et al.] // Vet. Res. - 2003. - Vol.34. - P.203-212.

9. Molecular evolution of avian reovirus: evidence for genetic diversity and reassortment of the S-class genome segments and multiple cocirculating lineages / Hung J. Liu, Long H. Lee, Hsiao W. Hsu [et al.] // Virology. - 2003. - Vol.314. -P.336-349.

10. Moradian A., Thorsen J., Julian R.J. Single and combined infections of specific-pathogen-free chickens with infectious bursal disease virus and an intestinal isolate of reovirus //Avian Dis. -1990. - Vol.34, N1. - P.63-72.

11. Rosenberger J.K., Olson N.O. Viral arthritis // Diseases of Poultry. - 10th ed. / ed. B.W. Calnek. - Mousby-Wolfe, London, 1997. - P.711-720.

12. Suppressor macrophages mediate depressed lymphoproliferation in chickens infected with avian reovirus / T.L. Pertile, K. Karaca, M.M. Walser, J.M. Sharma // Vet. Immunol. Immunopathol. - 1996. -Vol.53. - P.129-145.

13. Takase K., Nishikawa H., Yamada S. Pathogenic characteristics of highly virulent avian reovirus, strain 58-132, isolated from a chicken with tenosynovitis // Jpn. J. Vet. Sci. - 1985. - Vol.47, N4. - P.567-574.

14. Van der Heide L., Kalbac M., Hall W.C. Infections tenosynovitis (viral arthritis): Influence of maternal antibodies on the development of tenosynovitis lesions after experimental infection by day-old chickens with tenosynovitis virus // Avian Dis. - 1976. - Vol.20, N4. - P.641-648.

15. Van der Heide L., Lutticken D., Horzinek M. Isolation of avian reovirus as a possible etiologic agent of osteoporosis ("brittle bone disease"; "femoral head necrosis") in broiler chickens //Avian Dis. - 1981. - Vol.25. - P.847-856.

7. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зиняков Н.Г., Андрейчук Д. Б., Дрыгин В. В. Анализ последовательности участка гена S3 изолятов реовируса кур, выявленных на птицефабриках РФ // Вопросы вирусологии . - 2010. - № 2. - С. 9-13.

2. Зиняков Н.Г., Чвала И.А. Изучение персистенции и тропизма изолята реовируса кур ARV04/02rus у цыплят // Ветеринария и кормление. - 2011. - №6. — С.21-22.

3. Митрофанова М.Н., Зиняков Н.Г. Изучение биологических свойств изолята 04/02 реовируса реовирусного теносиновита птиц // Ветеринария и кормление. -2011. -№6. - С. 36-37.

4. Molecular variability of S3 and SI gene sequences of avian reovirus in the Russian Federation / N.G. Zinyakov, D. B. Andreychuk, N.I. Gerasimova [et al.] // 16th World Vet. Poultry Assoc. Congr. Book and Abstr. - Marrakesh, Morocco 2009.

5. Выявление патогенных микоплазм и вирусов у кур с клиническими признаками респираторной инфекции и теносиновитом на птицефабриках России / А.В. Спрыгин, Е. Овчинникова, З.Б. Никонова, Н.Г. Зиняков [и др.] // БИО. - 2011. - №3 .-С. 19-20.

Подписано в печать 06.04.2012 Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 80 экз

Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья

животных»

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зиняков, Николай Геннадьевич, Владимир

61 12-3/943

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ»

на правах рукописи Зиняков Николай Геннадьевич

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗОЛЯТОВ РЕОВИРУСА КУР И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТА АКУ04/02гш, ВЫДЕЛЕННОГО НА ТЕРРИТОРИИ РФ

03.02.02 «Вирусология»

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -

доктор биологических наук, профессор

Дрыгин Владимир Викторович

ВЛАДИМИР -2012

Список использованных сокращений

а.о. аминокислотный остаток

дцРНК двухцепочечная РНК

ТС вирусный теносиновит

MAC малабсорбционный синдром

ИСВЧ инфекционная субвирусная частица

Б-ИФА непрямой жидкофазный блокирующий вариант

иммуноферментного анализа

кДНК ДНК-копия с РНК-матрицы

КЭ куриный эмбрион

мРНК матричная РНК

НТО нетранслируемая область

дНТФ дезоксинуклеозидтрифосфат

ОРС открытая рамка считывания

ОТ-ПЦР реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная

реакция

ОТ-ПЦР-РВ реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная

реакция в режиме реального времени

п. н. пара нуклеотидов

РК реовирус кур

СПФ-куры куры свободные от патогенных факторов

КККФ, КФ культура клеток куриных фибробластов

ТЦД50 50-и процентная тканевая цитопатическая доза

ХАО хориоаллантоисная оболочка

ЭЭЖ экстраэмбриональная жидкость

РДП реакция диффузной преципитации

ARV реовирус птиц (avian orthoreovirus)

MRV реовирус млекопитающих (mammalian orthoreovirus)

NJ Neighbor-Joining алгоритм анализа

STE трис-солевой буфер

ТВЕ трис-боратный буфер

Оглавление

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 7

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. История изучения заболевания 10

1.2. Характеристика реовирусов птиц 10

1.2.1. Устойчивость к физико-химическим воздействиям 10

1.2.2. Морфология возбудителя и белковая структура вириона 11

1.2.3. Структура генома ортореовирусов 13

1.3. Репродукция вируса 17

1.3.1. Проникновение и раздевание 17

1.3.2. Экспрессия генов и синтез вирусных белков 18 1.3.3 Сборка вирионов и выход из клетки 21

1.3.4. Влияние на клеточную пролиферацию 23

1.3.5. Влияние реовируса кур на клеточный метаболизм 24

1.4. Патогенные свойства реовирусов птиц 25

1.4.1. Круг хозяев и возможные пути заражения 25

1.4.2. Патотипы реовируса кур 25 1 4.3. Зависимость патологоанатомических признаков болезни от

возраста птицы и сопутствующих инфекций

1.5. Диагностика заболевания 29

1.6. Серологическая классификация штаммов 30

1.7. Вакцинопрофилактика 32

1.8. Заключение по обзору литературы 32

2. Собственные исследования 35

2.1. Материалы 35

2.1.2. Оборудование 42

2.1.3. Специальные компьютерные программы 42

2.2. Методы 43

2.2.1. Выбор праймеров 43

2.2.2. Выделение нуклеиновой кислоты 43

2.2.3. Синтез кДНК и постановка ПЦР

2.2.4. Реакция секвенирования и очистка продуктов ПЦР для секвенирования

2.2.5. Анализ последовательностей ПЦР-ампликонов реовируса кур.

2.2.6. Постановка ОТ-ПЦР-РВ

2.2.7. Определение аналитической чувствительности ОТ-ПЦР-РВ

2.2.8. Экспериментальное заражение 3-суточных цыплят изолятом АРМ)4/02ги5

2.2.9. Заражение 11-суточных эмбрионов СПФ-кур изолятом реовируса кур АКХ/04/02гиБ

2.2.10. Работа с культурой клеток по изучению цитопатического действия изолята АРМ)4/02гиз на культуре клеток

2.2.11. Определение инфекционной активности

2.2.12. Определение активности антигена реовируса кур в непрямом жидкофазном блокирующем варианте ИФА

2.2.13. Определение рабочего разведения блокирующих антител, антивидового конъюгата

2.2.14. Определение рабочего разведения антигена

3. Результаты собственных исследований и их обсуждение

3.1. Исследование проб патологического материала

3.2. Анализ изолятов реовируса кур, выявленных при исследовании патологического материала

3.2.1. Анализ последовательностей гена БЗ близкородственных изолятов, выявленных в одном птицеводческом хозяйстве

3.2.2. Анализ последовательностей гена БЗ различных изолятов, выявленных в одном птицеводческом хозяйстве

3.2.3. Филогенетический анализ и группирование выявленных изолятов РК

3.3. Исследование возможности применения метода ОТ-ПЦР-РВ для выявления реовируса кур

3.4. Разработка непрямого жидкофазного блокирующего

46 46 46

63 66

варианта ИФА для выявления антигена реовируса кур

3.5. Изучение биологических свойств изолята РК А1Ч\/04/02ги5

3.5.1. Изучение цитопатического действия изолята АКХ/04/02гиз 3.5.2 Изучение особенностей репродукции изолята РК

АК\/04/02гиз в 10-суточных эмбрионах СПФ-кур 3.5.3. Изучение персистенции и тропизма изолята РК А1Ч\/04/02ги5 у цыплят

3.6. Секвенирование геномных сегментов изолята АРУ04/02гив 3.6.1 Анализ базы данных вепВапк

3.6.2. Выбор праймеров

3.7. Сравнительный и филогенетический анализ геномных

6 7 9

Заключение Выводы

Практические предложения Список литературы Приложения

68 68

76 76 79

фрагментов изолята РК А1Ч\/04/02ги5

3.7.1. Анализ последовательности гена Э1 81

3.7.2. Анализ поеледовател ьности гена Э2 85

3.7.3. Анализ последовательности гена БЗ 86

3.7.4. Анализ последовательности гена Б4 87

3.7.5. Анализ последовательности гена М1 88

3.7.6. Анализ последовательности гена М2 89

3.7.7. Анализ последовательности гена МЗ 90

3.7.8. Анализ последовательности гена 1_1 91

3.7.9. Анализ последовательности гена 1_2 93

3.7.10. Анализ последовательности гена [_3 94

98 102

103

104 121

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Реовирусная инфекция птиц - вирусное заболевание, характеризующееся поражением двигательного аппарата, развитием у птицы мал абсорбционного синдрома. Возбудителем заболевания является реовирус птиц, принадлежащий к роду Orthoreovirus семейства Reoviridae.

Высоковирулентные штаммы реовируса кур (РК) вызывают поражение различных органов птицы, при этом гибель птиц при экспериментальном заражении в раннем возрасте может достигать 100% [92, 138, 171]. Экономический ущерб птицеводству, причиняемый реовирусом, не ограничивается прямыми потерями, значительные убытки могут быть вследствие снижения яйценоскости и прироста массы тела при хронически протекающем инфекционном процессе [139]. Необходимо отметить возможные осложнения и низкую эффективность вакцинации молодой птицы живыми вакцинами при скрытой инфекции [115].

Результаты исследований, проведенных в ФГБУ «ВНИИЗЖ», свидетельствуют о сохранении проблемы реовирусной инфекции на птицефабриках РФ [13, 19, 24]. Среди изолятов реовируса кур, выявленных на территории РФ, наблюдается значительное генетическое разнообразие, что требует усовершенствования существующих молекулярно-генетических методов выявления вирусного генома [3]. Использование современных методов молекулярной диагностики позволяет в кратчайшие сроки произвести идентификацию возбудителя, определить первичную структуру вариабельных участков вирусного генома для быстрой характеристики выявленных изолятов. Последующий анализ генома позволяет сделать предположение о возможных изменениях биологических свойств исследуемого изолята вследствие генетических изменений за счет инсерций, делеций, единичных замен, способных вызвать сдвиг рамки считывания. Однако качество и полнота филогенетического анализа зависят от наличия доступных баз данных для того или иного возбудителя, что определяет актуальность исследований структуры вирусного генома вновь выделяемых возбудителей. Поскольку маркеры патогенности для РК

не установлены, секвенирование полного генома вирулентных изолятов способствует решению проблемы выявления генетических детерминант вирулентности.

Цель и задачи исследования. Цель данных исследований заключалась в изучении генетического разнообразия популяции реовируса кур на территории РФ, детальном изучении генетических особенностей и биологических свойств изолята АРМ)4/02ги5. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

2. Провести сравнительный и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участка гена вЗ изолятов РК, выявленных в РФ в период с 2007 по 2011гг.

3. Изучить патогенные свойства изолята АК\/04/02ги5 для цыплят и куриных эмбрионов (КЭ).

4. Определить нуклеотидную последовательность геномных сегментов изолята АК\/04/02ги5.

5. Провести анализ нуклеотидных последовательностей геномных сегментов изолята АРМ)4/02ш5.

Научная новизна исследования. Определены нуклеотидные последовательности участка гена ЭЗ 117 изолятов РК, выявленных на территории РФ и стран ближнего зарубежья в период с 2007 по 2011гг. Выявлены изоляты из генетических групп, не зарегистрированных ранее на территории РФ.

Показана патогенность изолята АРМ)4/02гиз для 11-суточных куриных эмбрионов и 3-суточных цыплят.

Расшифрована и проанализирована нуклеотидная последовательность транслируемых участков геномных сегментов изолята РК АКУ04/02гиз.

Результаты научного исследования соответствуют 3, 4, 6, 8, 9 пунктам паспорта специальности.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2007-2011 гг., представлены на Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству в Марокко (Маракеш, 2009).

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в т.ч. 3 статьи в журналах, включенных в

Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Результаты исследования патогенных свойств изолята РК АРММ/02гиз для КЭ, 3-суточных цыплят.

3. Результаты анализа геномных сегментов изолята АК\/04/02ш8.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 147 страницах

1. Обзор литературы

1.1. История изучения заболевания

Возбудитель реовирусного теносиновита относится к сем. Reoviridae, роду Orthoreovirus. Впервые реовирус птиц был выделен в 1954г. Fahey и Crawley из респираторного тракта цыплят с хронической респираторной болезнью [66]. Кроме поражения респираторного тракта, реовирус вызывал также некроз печени и одновременное воспаление сухожилий и синовиальных оболочек суставов. Позднее в 1969. Olson J. описал случаи естественного переболевания цыплят синовитом, от которых впоследствии был выделен агент, не имеющий родства с Mycoplasma synoviae и Mycoplasma gallisepticum [98]. В 1972г. Walker D. идентифицировал его как реовирус [175]. Впервые термин реовирус в 1959г. был предложен Sabin A.B., выделившим в отдельную группу вирусы, ранее классифицированные как ЕСНО-10 [140]. Поскольку эти возбудители, обычно выделяемые из дыхательных путей и пищеварительного тракта, не были связаны ни с одним из известных заболеваний, он назвал их реовирусами. Буквы "г", "е", "о" служили для того, чтобы подчеркнуть источник, из которого вирус выделен (respiratory, enteritic), и неопределенное отношение к какому-либо конкретному нозологическому заболеванию (orphan — сирота) [169]. В 1980г. вирусный артрит был переименован в вирусный теносиновит (тендосиновит), так как этот термин точнее отражает патоморфологические изменения тканей при заболевании [168]. В России изоляты реовирусов птиц впервые были выделены от индеек в начале 70-х гг В.В.Германом, который осуществил идентификацию возбудителя и изучил его свойства [5, 6, 7, 8].

1.2. Характеристика реовирусов птиц

1.2.1. Устойчивость к физико-химическим воздействиям

Структура капсида обеспечивает устойчивость вирионов реовирусов к физико-химическим факторам. Так, при комнатной температуре реовирусы птиц сохраняют инфекционную способность до 5 месяцев, в перьях птиц -до 10 дней, в воде - до 10 недель, однако полностью инактивируются в течение 30 минут при температуре 65°С [5, 23, 44]. Отсутствие в составе

вириона липидных включений обеспечивает устойчивость реовирусов к обработке эфиром, органическими растворителями, детергентами и галогенированными углеводородами [20, 74, 152].

Относительно устойчивости реовирусов к уровню рН существуют различные мнения: указывается на способность реовирусов сохранять инфекционность в интервале рН от 3 до 11 [22, 59, 91].

По отношению к действию трипсина все штаммы реовируса птиц классифицируются как чувствительные и резистентные [61, 62, 91, 93]. 1.2.2. Морфология возбудителя и белковая структура вириона Установлено, что вирионы реовируса птиц обладают двухслойным капсидом и не имеют липидной оболочки. Оба слоя состоят исключительно из белковых молекул. Капсид обладает икосаэдрической симметрией. Внутренний слой носит название кор-частица или репликативная кор-частица, поскольку обеспечивает первоначальную репликацию геномных сегментов при проникновении в клетку. Эти частицы последовательно образуются при протеолизе белков внешнего капсида во время проникновения вириона в клетку (рис. 1).

ф,р,а1.п е.нт етенкн •мемши^ы

Рис. 1. Изменение структуры капсида вириона реовирусов во время протеолиза (по Nibert, M.L., et al., 1995) [121]

Р1- ось симметрии 5-ого порядка; Р2 и РЗ- оси симметрии 6-ого порядка.

При изучении особенностей репликационного цикла реовируса были выявлены все производные вириона (ИСВ- и кор-частицы) [116]. Была показана возможность их искусственного получения при мягком протеолизе вируса химотрипсином in vitro [123].

Размер вириона по данным криоэлектронной микроскопии составляет 85 нм, по данным электронной микроскопии с негативной окраской 73 нм. Размер внутренней кор-частицы по результатам криоэлектронной микроскопии и электронной микроскопии с негативной окраской составил 60 и 51 нм соответственно. По результатам криоэлектронной микроскопии установлена идентичность в топологическом расположении структурных белков реовирусов птиц и реовирусов млекопитающих (рис. 1) [153].

Рис. 2. Пространственная организация вириона ортореовнрусов млекопитающих и птиц, установленная по результатам криоэлектронной микроскопии (по Zhang X., et al., 2005) [153]

Вирусные белки делятся на 4 класса в зависимости от величины: «крупные» - Л-класс, «средние» - р -класс, «малые» - сг -класс и

«сверхмалые» - р-класс. Также существует деление на структурные и неструктурны протеины. Количественный состав белков, формирующих полноценный вирион, приведен в табл. 1.

Таблица 1

Характеристика белков ортореовирусов млекопитающих и птиц

№ Белок Кодирующий Мол. Кол-во Локализация в

сегмент масса копии вирионе

А1ЧУ АРУ МКУ (кДа) АРУ на вирион

1 ЛА Л1 1_1 13 147 120 Внутренний капсид

2 ЛВ ЛЗ 1_2 1_1 120 12 Внутренний капсид

3 ЛС Л2 1_3 12 130 60 Интегрирован в оба капсида

4 М А М2 М1 М1 79 24 Внутренний капсид

5 мв М1 М2 М2 72 600 Внешний капсид

6 М N8 р

Информация о работе