Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание и внедрение в промышленное птицеводство системы комплексного серологического мониторинга инфекционных болезней на основе иммуноферментного анализа
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Создание и внедрение в промышленное птицеводство системы комплексного серологического мониторинга инфекционных болезней на основе иммуноферментного анализа"
На правах рукописи
МУДРАК НАТАЛЬЯ СТАНИСЛАВОВНА
СОЗДАНИЕ И ВНЕДРЕНИЕ В ПРОМЫШЛЕННОЕ ПТИЦЕВОДСТВО СИСТЕМЫ КОМПЛЕКСНОГО СЕРОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ НА ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
03.02.02 «Вирусология»
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
2 3 СЕН 2010
Владимир - 2010
004609092
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир
Научный консультант. Дрыгин Владимир Викторович,
доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты: Цыбанов Содном Жамьяновнч,
доктор биологических наук, профессор, ГНУ ВНИВВиМ, г.Покров, Владимирская область
Смоленский Владимир Иванович,
доктор биологических наук, профессор, ФГУ «ВГНКИ», г.Москва
Фомина Наталья Васильевна,
доктор биологических наук, профессор, МГАВМиБ, г.Москва
Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский технологический институт биологической промышленности» (ГНУ «ВНИТИБП»)
Защита состоится «28» сентября 2010 г. в 10— часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ») по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ») и на сайте ВАК: http://vak.ed.gov.ru/
Автореферат разослан » й/«./"?**^ 2010 г.
7/
Ученый секретарь ■ диссертационного совета, доктор биологических наук,
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В связи с интенсивным развитием промышленного птицеводства, возникновением новых и изменением уже известных инфекционных болезней птиц, против которых проводится профилактическая вакцинация, требуется разработка чувствительных, высокоспецифичных и поддающихся автоматизации методов оценки иммунного статуса птиц. Своевременный мониторинг инфекционных болезней птиц является неотъемлемой частью комплекса мероприятий, направленных на профилактику этих заболеваний, что предусматривает внедрение в практику диагностических исследований, отвечающих современному уровню развития науки.
Высокая эффективность мониторинга инфекционных заболеваний может быть достигнута только в том случае, когда методы диагностики доступны для региональных и производственных лабораторий и широко применяются в их практической работе. Несмотря на то, что традиционные иммунологические методы по-прежнему широко используются в ветеринарной практике, метод иммуноферментного анализа (ИФА) занимает ведущее место при проведении рутинных исследований. Преимущества ИФА как метода заключаются в скорости постановки, чувствительности, специфичности, безопасности, возможности автоматизации процесса. Коммерческие наборы для ИФА нашли широкое применение в национальных программах борьбы с инфекционными болезнями птиц во многих странах Западной Европы и Америки.
В течение последнего десятилетия в промышленном птицеводстве были предприняты попытки модернизации серологической диагностики с применением иммуноферментного анализа. Для увеличения количества тестируемых проб, уменьшения расхода реактивов и трудозатрат была проведена оценка различных методик определения в ИФА титров антител при исследовании проб сывороток крови птиц в одном разведении (Snyder D. В., 1984, 1985; Penzes Z., 1992).
Крупнейшие фирмы - производители иммуноферментных наборов для диагностики болезней птиц - IDEXX (США), Synbiotics (KPL, США), Guildhay (Великобритания), BioChek (Голландия) при постановке реакции в одном разведении для расчёта титра антител в сыворотке крови выбрали линейную зависимость логарифма титра (lg Т) от величины логарифма S/P- отношения (отношение оптической плотности испытуемой пробы к оптической плотности положительного контроля).
Применение измерительного оборудования, в частности, спектрофотометров для считывания значений оптической плотности в микропланшетном
формате, позволило разработать методологию тестирования большого количества проб сывороток одновременно против нескольких антигенов. Это, в свою очередь, привело к созданию и внедрению в ветеринарную практику специализированных компьютерных программ не только для перевода оптической плотности в числовое значение точного титра, но и для автоматической обработки, хранения и создания баз данных (Snyder D.B, 1984).
Наиболее актуальным для промышленного птицеводства является мониторинг особо опасных (список МЭБ) и экономически значимых болезней кур - ньюкаслской болезни (НБ), гриппа птиц (ГП), инфекционной бурсаль-ной болезни (ИББ), инфекционного бронхита кур (ИБК), синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76), реовирусной инфекции птиц (РВП), инфекционного энцефаломиелита птиц (ИЭП), респираторного микоплазмоза и мико-плазменного синовита, вызываемых Mycoplasma gallisepticum (МГ) и Mycoplasma synoviae (MC), которые определили перечень создаваемых отечественных диагностических тест-систем.
Гибель птицы при вспышках НБ и ГП, особенно молодой, может достигать 100%. По данным МЭБ, с июля 2008 по июль 2009 гг. официально зарегистрированы вспышки ньюкаслской болезни в 87 странах мира (OIE, www.oie.int), в том числе и в России. По данным Россельхознадзора, всего с 2005 по 2008 гг. в России было выявлено 179 очагов высокопатогенного гриппа H5N1 в 20 субъектах, суммарные потери от которого составили 2,8 млн. голов птицы.
С середины 70-х гг. ИББ и ИБК широко распространены практически во всех странах с развитым промышленным птицеводством. При вспышках ИББ заболевание охватывает практически все поголовье, летальность можег достигать 90% (Chette N., 1989), при этом переболевшие птицы приобретают восприимчивость к большинству инфекционных болезней вирусной и бактериальной этиологии (Rosenberger J., 1978). Экономические потери при ИБК складываются в основном из снижения яичной и мясной продуктивности, вынужденной выбраковки заболевшей птицы, высокой летальности молодняка до 30-дневного возраста. Ситуация осложняется регулярным появлением новых вариантов вируса ЙБК с низким уровнем родства к традиционным вакцинным штаммам (Bochkov Y. А. е.а.; 2006, Torregino С. е.а., 2008).
Рёовирус птиц вызывает развитие теносиновита, малабсорбционного синдрома, заболевания респираторного ii'кишечного трактов. Ежегодный ущерб, наносимый птицеводству в США от болезней скелета у домашних птиц, основными возбудителями которых являются в равной степени рёовирус и М.synoviae, составляет от 80 до 120 млн. долларов (Sullivan Т.V.,1994).
Экономический ущерб от болезней, вызываемых М. galliseplicum и М. synoviae, складывается из потерь, связанных с гибелью эмбрионов и цыплят, снижением массы тела птиц, уменьшением яйценоскости, оплодотворяемо-сти яиц, выводимости цыплят (Ley et al., 2003, Kleven S.H., 2003).
В крупных птицеводческих хозяйствах синдром снижения яйценоскости -76 приносит ущерб из-за снижения яичной продуктивности и качества товарного яйца (Eck J.H.,1982).
Инфекционный энцефаломиелит вызывает заболевание кур, которое охватывает практически все поголовье в промышленном птицеводстве как мясного, так и яичного направления, причем летальность может составлять 20-50% (Calnek B.W, 1997,1998).
Необходимость анализа результатов исследования значительного числа проб при массовом обследовании поголовья, а также хранения полученных данных делает актуальной задачу автоматизации учета результатов ИФА. Существующие программы компьютерной поддержки ИФА, как правило, разрабатываются фирмой-изготовителем диагностикумов и предназначены для работы только с наборами данной фирмы. Таким образом, возникла необходимость разработать универсальную компьютерную программу, в которой предусматривалась бы возможность работы с наборами для ИФА и спек-трофотометрами-ридерами разных производителей.
Применение в диагностических исследованиях наборов и реактивов зарубежного производства существенным образом отражается на стоимости анализов и делает отечественную ветеринарию зависимой от импортных поставок и состояния мирового рынка. В этом аспекте разработка отечественных высокочувствительных, надежных и относительно недорогих диагностикумов является важной задачей.
Объем проводимых мониторинговых исследований болезней птиц с каждым годом увеличивается и требует принципиально новых подходов к технологии тестирования. За рубежом в ведущих ветеринарных диагностических лабораториях, в частности референтных по особо опасным болезням, в последние годы активно внедряются новые методы постановки ИФА, включая основанные на технологии высокопроизводительного скрининга (Cheu М., 2001, McGiven J., 2007) с применением роботизированных устройств. Замена «ручных» технологий серологических исследований на автоматизированные позволяет достичь повышения воспроизводимости результатов, стандартизации процесса исследований и их автоматического поддержания на соответствующем уровне, повышения производительности и безопасности работы персонала.
Цели и задачи исследований. Основной целью наших исследований было создание системы комплексного серологического мониторинга на основе иммуноферментного анализа для выявления и количественной сценки специфических антител к возбудителям девяти наиболее экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76. РВП, ИЭП, МГ, МС) при исследовании проб сывороток крови в одном разведении и ее внедрение в промышленное птицеводство.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
- усовершенствовать методики очистки и концентрирования антигенов возбудителей НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС, используемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем;
- оптимизировать схемы иммунизации кур для получения специфических контрольных положительных сывороток;
- разработать иммуноферментные тест-системы для выявления и количественного определения уровня антител в сыворотках крови кур к возбудителям НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС при тестировании в одном разведении;
- определить чувствительность и специфичность при сравнительном анализе данных, полученных с помощью разработанных тест-систем на основе ИФА, базовых реакций и коммерческих иммуноферментных наборов зарубежных производителей, зарегистрированных на территории РФ;
- определить диагностическую значимость результатов, полученных с использованием разработанных тест-систем на основе ИФА, для изучения эпизоотической ситуации в птицехозяйствах и оценки иммунитета после применения живых и инактивированных вакцин;
- разработать научно-техническую документацию и регламенты для опытно-промышленного производства коммерческих наборов в двух вариантах: для визуальной детекции (на 40 проб) и инструментального учета (на 180 проб);
- разработать универсальную компьютерную программу регистрации, сбора, анализа и хранения результатов с учетом возможности использования наборов для диагностики болезней птиц отечественных и ведущих зарубежных фирм-производителей;
- разработать технологию производства коммерческих наборов с внедрением автоматизированных роботизированных устройств;
- провести оценку качества разработанных тест-систем в сравнительных испытаниях, проводимых международными референтными лабораториями МЭБ и ФАО;
- внедрить в работу ветеринарных лабораторий и птицефабрик комплексную систему серологической оценки иммунного статуса кур разного возраста, основанную на ИФА, с использованием комплекта стандартизированного оборудования и универсальной компьютерной программы обработки и хранения полученных результатов.
Научная новизна. Впервые разработаны' отечественные иммунофер-ментные тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям основных экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ и МС) при тестировании проб сывороток крови в одном разведении.
Впервые в России создана комплексная система серологического мониторинга в птицеводстве, основанная на методологии ИФА с применением отечественных диагностических наборов, сертифицированного оборудования, реагентов и компьютерной программы, которая обеспечивает получение надежных данных об иммунном статусе птицепоголовья.
Проведена сравнительная оценка чувствительности и специфичности реакций по результатам, полученным с помощью разработанных тест-систем на основе ИФА, базовых реакций (РДП, РТГА) и коммерческих наборов зарубежных производителей, зарегистрированных на территории РФ.
Определена диагностическая значимость результатов, полученных с применением разработанных тест-систем на основе ИФА при оценке трансо-вариального иммунитета, изучении динамики накопления антител после применения живых и инактивированных вакцин в промышленном птицеводстве.
Разработана и сертифицирована компьютерная программа регистрации, анализа и хранения результатов для работы с отечественными и зарубежными иммуноферментными коммерческими наборами ведущих фирм-производителей.
Утверждена научно-техническая документация и регламент для опытно-промышленного производства коммерческих наборов в двух вариантах: при визуальной детекции и инструментальном учете с применением программного обеспечения.
Качество лабораторных исследований с применением коммерческих наборов для ИФА на основе разработанных тест-систем подтверждено результа-
тами международных сравнительных испытаний, проведенных аккредитованной лабораторией (GD, Голландия) в 2006-2008 гг. при тестировании зашифрованных проб сывороток с разным уровнем антител к НБ, ГП, ИБК, ИББ, МГ и МС.
Научная новизна исследований подтверждена 3 патентами на наборы и свидетельством на компьютерную программу «СИНКО-ИФА», зарегистрированную в Российском агентстве по патентам и товарным знакам.
Практическая значимость. Методики, разработанные в ходе научно-исследовательских работ по теме диссертации, включены в два сборника: "Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом" (1998 г.) и "Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием серологических реакций" (2008 г.), утвержденные Россель-хознадзором в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.
Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные документы по изготовлению и контролю 16 наборов для ИФА. утвержденные Россельхознадзором.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 81 научная работа, в том числе 22 - в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ.
Апробация работы. Основные материалы исследований rio теме диссертации опубликованы, доложены и обсуждены: на конференциях, проводимых в ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 1995, 1997-2000, 2003, 2008); на международной конференции «Птицеводство - мировой и отечественный опыт», Москва, 2002; на Всероссийском совещании-семинаре директоров ветлабораторий - субъектов РФ «Совершенствование ветеринарной лабора-торно-диагностической работы в Российской Федерации», Брянск, 2004; международных ветеринарных конгрессах по птицеводству (Москва, 2005, 2006); на международных научных конференциях и конгрессах в Российской Федерации (Москва, 2001; Казань, 2005; Покров, 1999, 2000; Новосибирск, 2008), в Украине (Харьков, 2001-2003, 2006-2008; Крым, 2006-2008), Казахстане (Алматы, 2000), Республике Беларусь (Минск, 2000; Витебск, 2001), Марокко (Маракеш, 2009), Австрии (Вена, 2009), на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 1995-2009 гг.
Основные положения, выносимые на защиту:
- разработка иммуноферментных тест-систем для выявления и количественного определения антител к возбудителям девяти экономически значи-
мых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ и МС) при исследовании проб сывороток крови в одном разведении;
- результаты определения корреляционной зависимости при сравнении данных, полученных с использованием разработанных тест-систем, базовых тестов и коммерческих наборов зарубежного производства;
- программное обеспечение для учета, обработки и хранения результатов анализа «СИНКО-ИФА»;
- результаты исследований сывороток крови кур с применением разработанных наборов для ИФА при ретроспективной диагностике заболеваний и оценке поствакцинального иммунитета после применения живых и инак-тивированных вакцин в птицехозяйствах РФ в 1995-2008 гг.;
- результаты лабораторных исследований в международных сравнительных испытаниях, проведенных аккредитованной лабораторией (вБ, Голландия) в 2006-2008 гг.;
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 322 страницах, иллюстрирована 55 таблицами и 44 рисунками. Список цитируемой литературы включает 363 источника, из них 311 иностранных.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 1993-2009 гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (до 2003 г. Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных), г. Владимир.
Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании, проведении и анализе экспериментов. Имена соавторов, выполнявших отдельные этапы работы, указаны в соответствующих публикациях; автор выражает им глубокую и искреннюю благодарность.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы
2.1.1. Материалы
Штаммы вирусов и микоплазм:
- штамм вируса ИБК «Чапаевский», Н120 (серотип Массачусетс) из коллекции ФГУ «ВГНКИ»;
- вакцинный производственный штамм «БГ» вируса ИББ (ФГУ «ВГНКИ»);
- производственный штамм Ла-Сота вируса НБ (ФГУ «ВГНКИ»);
- штамм вируса ГП ЛМиск/Ыоу<шЫгзк/2/2005 Н5Ш(ФГУ «ВНИИЗЖ»);
- штамм В 8/78 вируса ССЯ-76, адаптированный к утиным эмбрионам (ФГУ «ВГНКИ»);
- вакцинный штамм SI 133 реовируса птиц (ФГУ «ВГНКИ»);
- штамм вируса ИЭП «Calnek 1143М» (ФГУ «ВГНКИ»);
- вакцинный штамм 6/85 МГ и штамм WVU1853 МС (ФГУ «ВГНКИ»).
Эмбрионы кур. Использовали куриные эмбрионы (КЭ), полученные от СПФ-кур (фирма Lohmann Tiehrzucht, Германия).
Культуры клеток. Использовали перевиваемую кулыуру клеток МДСК (НИИ гриппа, г. Санкт-Петербург) и первичную культуру фибробла-стов эмбрионов кур (ФЭК).
Сыворотки. Вирусспецифические сыворотки крови кур, используемые в качестве положительного контроля, получали путем иммунизации доноров очищенными инактивированными препаратами антигенов выбранных возбудителей.
В качестве исследуемых проб использовали сыворотки крови кур, экспериментально вакцинированных против возбудителей болезней кур или присланных из более 500 птицехозяйств РФ и других стран СНГ.
Пероксидазный конъюгат. В работе применяли антивидовой коммерческий конъюгат (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РФ), представляющий собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией животных-продуцентов IgG курицы, меченную пероксидазой, а также антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против IgG кур производства фирмы KPL (США).
Коммерческие диагностические наборы. Применяли коммерческие наборы для определения антител к возбудителям инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, РВП, ИЭП, МГ и МС) в ИФА фирмы Synbiotics (KPL, США), зарегистрированные на территории РФ.
Оборудование. Использовали стандартное лабораторное оборудование и автоматические станции модульного типа Freedom EVO-150 фирмы Тесап (Австрия) для роботизации отдельных стадий анализа и производства наборов.
Реактивы и растворы. Применяли реактивы отечественного и импортного производства марки «о.с.ч.», из которых готовили растворы, необходимые для очистки и концентрирования антигенов. Для постановки ИФА использовали следующие растворы: 0,05 М трис-HCl с 0,2 М NaCl рН 7,4-7,6; 0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6-9,5; испытуемые и контрольные сыворотки и антигены, конъгогаты антивидовых антител разводили в растворе 0,05 М трис-HCl с 0,2 М NaC!, 0,1% твин-20, для блокировки применяли раствор 0,05 М трис-HCl с 0,2 М NaCl, 0,1% твин-20 с 10% сыворотки крови лошадей; отмывку сорбента от несвязавшихся компонентов
проводили раствором 0,05 М трис-HCl с 0,2 M.NaCl и 0,1% твин 20 рН 7,47,6; в качестве субстрата пероксидазы использовали: 0,04% раствор ортофе-нилендиамина в фосфатно-цитратном буфере рН 4,9 с 0,04 % перекиси водорода; 2,2'-азино-ди[3-этил]бензтиазолинсульфоновую кислоту (АБТС) с перекисью водорода; для остановки реакции применяли 10% раствор серной кислоты , а также 5 % раствор додецилсульфата натрия (ДСН).
2.1.2. Методы
Получение антигенов вирусов и микоплазм. Проводили согласно методикам, описанным ранее (Бочков Ю.А. и соавт., 1997; Грибанов О.Г. и со-авт., 1997; Куприянов А.И. и соавт., 2000; Волкова И.А. и соавт., 2000; Цива-нюк М.А. и соавт., 2007).
Серологические и иммунохимические методы исследования. Активность гемагглютинирующих вирусов ГП, ССЯ-76 и НБ, а также антигенов М. galliseplicum и М. synoviae определяли в реакции гемагглютинации (РГА) в планшетах с использованием 1% суспензии эритроцитов кур. РТГА и РДП проводили в соответствии с Руководством по диагностическим тестам и вакцинам в отношении наземных животных (МЭБ, 2008).
Электрофорез проводили по Laemmli U.K. (1970) с некоторыми.модификациями.
Определение относительной специфичности и чувствительности. Относительную чувствительность и специфичность исследований подсчитывали по методу, предложенному Hayhow С. S. (1993).
Статистический анализ материалов. Для статистической обработки данных использовали компьютерную программу «Statistica» (USA,-StatSoft Inc., Release 6.0, 2001)
Компьютерный учёт результатов. Учёт результатов непрямого варианта ИФА, обработку, хранение и воспроизведение полученных данных проводили с использованием разработанной компьютерной программы «СИНКО-ИФА» (ФГУ «ВНИИЗЖ»).
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Усовершенствование методики очистки и концентрирования антигенов вирусов и микоплазм, применяемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем
В качестве исходного материала для получения антигенов вирусов и микоплазм использовали гомогенаты тканей, экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ) куриных эмбрионов, вируссодержащую культуральную жидкость. При этом осуществляли оптимизацию условий очистки и концентри-
рования с учетом особенностей морфологии, строения и физико-химических свойств возбудителя.
Вируссодержащие препараты после инактивации очищали от балластных белков путём низкоскоростного центрифугирования. Затем проводили очистку высокоскоростным центрифугированием через 20% раствор сахарозы или через линейный градиент СвО-сахароза.
При концентрировании антигенов вирусов ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП к инактивированной антигенсодержащей суспензии, после предварительной очистки хлороформом или фреоном 113 (для РВП), добавляли 7-7,5% поли-этиленгликоль (М 6000-8000), полученные осадки ресуспендировали в ФБР из расчета от 1/20 до 1/70 от исходного объема.
Полученную биомассу М. §аШ$ерйсит концентрировали центрифугированием при 8000 об/мин, для разрушения клеток применяли: ультразвук, лизирование материала с помощью карбонатно-бикарбонатного буфера (КББ), обработку ДНК-зой и РНК-зой, обработку ДСН. Наилучшие результаты были получены при обработке ДСН. Антигенсодержащее сырье М. яупо-у'шг дважды центрифугировали и клеточную массу суспендировали в ФБР с последующей обработкой ДСН.
После ресуспендирования осадков в ФБР получали препараты, содержащие антигены вирусов и микоплазм с концентрацией белка не менее 1 мг/см3. Для гемагглютинирующих вирусов активность препаратов в РГА составляла 7,0-9,0 в «сэндвич»-варианте ИФА - 1:6400-12800.
В процессе элекгронно-микроскопических исследований выявляли ви-рионы с характерной структурой. Данные электрофореза в 12,5% полиакри-ламидном геле свидетельствовали об отсутствии или минимальных количествах посторонних белков.
Полученные препараты антигенов и микоплазм сохраняли специфическую активность при иммобилизации на планшетах в течение длительного времени (не менее 12 месяцев). При проверке на активность и специфичность в непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками из наборов фирмы ЗупЫойсБ (КРЬ) были получены титры не менее 1:1600 для положительных и менее 1:200 для отрицательных контрольных сывороток со всеми препаратами антигенов и установлена строгая специфичность в отношении гетерологичных сывороток.
Очищенные и концентрированные препараты антигенов использовали для получения специфических контрольных сывороток, оптимизировав схемы иммунизации птицы с учетом особенностей биологии возбудителя.
2.2.2. Разработка тест-систем на основе непрямого варианта ИФА для определения антител к возбудителям болезней птиц
Для разрабатываемых тест-систем необходимо было установить оптимальные рабочие разведения сыворотки, коэффициенты уравнения линейной регрессии для количественной оценки, позитивно-негативный порог для качественной интерпретации данных, диапазон допустимых значений оптической плотности (ОП) контрольных сывороток.
2.2.2.1. Выбор рабочего разведения сыворотки
Задачей данного этапа исследований было нахождение величины разведения сыворотки, которая имеет наибольший коэффициент корреляции с экспериментально установленным значением титра. Были использованы пробы специфических сывороток с разным уровнем антител, для которых методом последовательных разведений определяли титр (наибольшее разведение, ОП которого равна удвоенному значению ОП отрицательного контроля).
Изучали взаимосвязь между экспериментально полученными значениями титров (Т), определенных методом последовательных разведений, и величинами Б/Р-отношений, установленных при исследовании сывороток крови кур в разведениях 1:100, 1:200, 1:400 и 1:800. Для каждого из указанных разведений между значениями ^Т и ^(Б/Р) определяли коэффициенты корреляции (г), а также коэффициенты (А и В) для уравнения модели связи вида 1§Т= А + В х ^(З/РЛ Полученные значения г, представленные в табл.1, показывали высокую степень корреляции между исследованными показателями 1§Т и 1§(3/Р)
Таблица 1
Коэффициенты корреляции* между логарифмами титров (1§ Т), установленных методом последовательных разведений, и логарифмами 8/Р-отношения** (1§ (Б/Р)) для заданных разведений сывороток крови кур
Наименование возбудителя Разведения
1:100 1:200 1:400 1:800
НБ ' н/и 0.9143 0.934 0.846
ИББ 0,83" 0,95 0,97 0,94
ИБК . 0,933 0,945-. 0,959 0,936
ССЯ-76 н/и- 0,794 0,896 0,857
РВП 0,89 0,94 0,954 0,935
ИЭП ' 0,?6 ■ ' 0,90- 0,94 0,93
МГ ■ 0,86, 0,93 ■ 0,94 н/и
мс . 0,94 0,95. 0,97 н/и
гп 0,92 0,94 0,97 н/и
*Все коэффициенты были получены в результате не менее 60 измерений и имели значимость о<0,01)
■ ОНжследуе.»ой .пробы ~ ОН 0П1рШ^пгльмого контроля
"Б/Р - отношение--------------------------------------------------------------
ОП паполгите-Льного контроля ~ ОГ1 отрицательного контроля
Для прогнозирования титра сыворотки по 8/Р-отношению были использованы регрессионные модели связи для всех испытанных разведений сывороток. В качестве примера на рис. I приведен график зависимости Т от ^ (Б/Р) и соответствующая регрессионная модель для разведения 1:400 в тест-системе для выявления антител к вирусу НБ.
ко*ЬфниненТ коррелгик»: Г - 93ЭР8
Рис. 1. График зависимости ^ Т антител к вирусу НБ, определённого методом последовательного разведения от ^ (Б/Р) в разведении сыворотки 1:400
Полученные модели связи, за исключением модели для разведения 1:100, были адекватны (/?<0,01), однако наименьшую остаточную дисперсию наблюдали в разведении 1:400 для всех антигенов. При достаточном уровне значимости (р < 0,05) коэффициентов корреляции и адекватности используемой модели связи возникала возможность прогнозировать титр, используя Б/Р-отношение единственного разведения сыворотки.
Уравнения для вычисления логарифмированного значения титра в разведении сыворотки 1:400 представлены в табл. 2.
Таблица 2
Уравнения для вычисления логарифмированного значения титра в разведении 1:400
НБ ЫТ= 1,514х 1й(Б/Р) +3,639
ГП ^Т = 1,46 х ^(в/Р) + 3,968
ИББ 1йТ= 1,714 х 1й(Э/Р) + 3,855
ИБК 1,473 х ^(Б/Р) + 3,838
ССЯ-76 1йТ = 2,367 х 1д(5/Р) + 4,162
МС ¡йТ= 1,375 х1Й(5/Р) +3,662
МГ 1,359 х^СЭ/РН 3,73
РЕО 1ЙТ= 1,232 х^(5/Р) + 3,583
ИЭП 1яТ= 1,1877 х^(8/Р) +3,723
2.2.2.2. Определение диапазона значений показателей оптической плотности для отрицательного и положительного контролен
Для получения корректных результатов реакции, при условии неизбежного варьирования величин оптической плотности (ОП), необходимо, чтобы оптические характеристики обеих контрольных сывороток были количественно определены в виде диапазонов допустимых значений. При этом для отрицательного контроля значима верхняя допустимая граница, а для положительного - обе границы. Выход за рамки допустимых значений ведет к получению в ИФА либо ложноположительных, либо ложноотрицательных результатов.
На планшетах с антигеном ИББ более чем в 50 повторностях исследовали вариации значений ОП отрицательной и положительной контрольных сывороток в разведениях 1:400. Полученные выборки значений ОП позволили рассчитать соответствующие средние величины и их статистические характеристики в виде дисперсий (ст) и 95,5% доверительных интервалов (2хс). Для отрицательного контроля в качестве максимально допустимой (пороговой) величины была принята верхняя граница доверительного интервала, которая составила 0,144. Было определено, что пороговые значения ОП положительного контроля находились в диапазоне от 0,518 до 0,838.
Установленные таким же образом пороговые значения ОП контрольных сывороток для разрабатываемых тест-систем представлены в табл. 3.
Таблица 3
Пороговые значения оптической плотности положительных и от-
рицательных контрольных сывороток
№ п/п Название воз- ОП отрицательного ОП положительного
будителя контроля контроля
1 НБ 0,150 0,439-0,850 .
2 ГП 0,160 0,400-0,900
3 ИББ 0.144 0,518- 0,838
4 ИБК 0,150. 0,450-0,850
5 ССЯ-76 0,150 0,455 - 0,900
6 ИЭП 0,140 0,450 - 0,900
7 РВП 0,142 0,412-1,020
8 мг 0,150 0,450- 1,050
9 мс 0,150 0,450- 1,000
2.2.2.3. Определение значений титров для разграничения отрицательной, сомнительной и специфической реакций
Для всех разрабатываемых тест-систем определяли максимальное значение Б/Р, соответствующее неспецифической реакции, и минимальное зна-
чение S/P для специфической реакции. Для этого, соблюдая ранее выработанные условия проведения анализа (рабочее разведение, допустимые значения ОП контрольных сывороток), тестировали с каждым антигеном не менее 30 проб сывороток крови, не содержащих специфических антител к выбранным возбудителям заболеваний, но имеющих определенный уровень неспецифической реакции, который в среднем превышал ОП отрицательного контроля.
Статистические характеристики среднего значения оптической плотности для неспецифической реакции вычисляли в виде дисперсии (сг), на основе которой определяли верхние границы 95% доверительных интервалов. В качестве примера приведены расчеты определения качественной характеристики результатов ИФА для НБ и ИБК. Были использованы результаты выявления специфических антител к вирусу НБ в 109 пробах сывороток крови кур параллельно в двух реакциях - ИФА и РТГА. Среднее значение титра антител для сомнительного результата оказалось равным 1:356 при доверительном интервале для Р=95% от 1:250 до 1:500. Для положительного результата средний титр специфических антител оказался равным 1:470 при доверительном интервале для Р=95% от 1:418 до 1:528. Таким образом, сыворотки с титром антител, равным или выше значения 1:500, считали с достаточной вероятностью положительными, сомнительный результат реакции характеризовали величиной интервала 1:250 - 1:500, меньше или равный 1:250 говорит об отсутствии специфических антител к вирусу НБ.
Для установления позитивно - негативного порога (ПНП) 33 заведомо отрицательных к вирусу ИБК сыворотки крови от СГ1Ф-цыплят исследовали методом последовательных разведений. Среднее значение оптической плотности нормальных сывороток, суммированное с утроенным значением стандартного отклонения, составило для разведения 1:100 - 0,3298, 1:200 - 0,244, 1:400 - 0,1818, 1:800 - 0,1628, 1:1600 - 0,1366, 1:3200 - 0,1225, 1:6400 -0,1174. Оптическая плотность, соответствующая минимальному положительному титру антител к вирусу ИБК, была равна 0,185. Определялось пороговое значение S/P = (0,185 - 0,106) / (0,703 - 0,106) = 0,1323, lg (S/P) = -0,8783. По формуле был найден наименьший положительный титр= 362. С учетом возможных погрешностей, допустимых в пределах одного разведения, где Т/2 < Т > Т х 2, выделялась сомнительная зона. Таким образом, титр антител до 361 считался отрицательным, 362 - 724 - сомнительным, от 725 и выше - положительным. Вычисленные таким образом значения титров представлены в табл.4.
Таблица 4
Значения титров, соответствующие отрицательным, сомнительным и положительным результатам ИФА
(п >30)
№ Название воз- Отрицательный Сомнительный Положительный
п/п будителя результат результат ■ результат,от
1 НБ 0-250 251 -500 501 .
2 ГП 0-640 641 - 1280 1281
3 ИББ 0-245 245 - 380 380
4 ИБК 0-361 362-724 725
5 ССЯ-76 0-222 223-1182 1183
6 ИЭП 0-405 406-810 811
7 РВП 0-266 266 - 532 533
8 мг 0-416 417-833 834
9 MC 0-425 426 - 850 851
2.2.3. Установление корреляции между результатами, полученными с применением разработанных тест-систем, серологических тестов и коммерческих наборов на основе ИФА
Важнейшим показателем качества диагностических тест-систем являются результаты их применения для анализа проб сывороток крови при сравнении с лучшими импортными аналогами, т.е. с диагностическими тест-системами фирм, продукция которых имеет давнюю и устойчивую репутацию на мировом рынке. С этой целью мы сравнивали диагностические возможности разработанных тест-систем и коммерческих наборов фирмы Буп-Ьюйсб (КРЬ, США).
График зависимости между десятичным логарифмом титра, определенного с использованием разработанной тест- системы ИФА для НБ, и десятичным логарифмом титров, определенных с помощью коммерческого набора фирмы БупЬюйсБ (КРЬ), представлен на рис. 2. Коэффициент корреляции между значениями титров антител, определённых в обеих иммунофер-ментных тест-системах, составил 0.84.
На основе данных, полученных с использованием разработанной тест-системы ИФА и коммерческого набора КРЬ, были рассчитаны относительная чувствительность (04) и специфичность (ОС) по отношению к базовой реакции РТГА. Было исследовано 170 заведомо положительных и 76 отрицательных сывороток по результатам РТГА.
Ю.ИФА- 1.197 | + 59013 • 1/}_КР1. Коэффициент корреляции: г = 84041
Рис. 2. График зависимости значений титров (^Т), полученных с применением разработанного набора и набора КРЬ при исследовании сывороток крови кур, вакцинированных против НБ
Представленные в табл. 5. данные показывают, что разработанная тест-система ИФА не уступала по чувствительности и специфичности коммерческому набору ВупЫоисБ (КРЬ).
Таблица 5
Результаты ИФА для вычисления относительной чувствительности и специфичности для тест-системы НБ
Результаты ИФАА Результаты ИФАЬ
Качеств, хар-ка Тест-система положительные отрицательные
ВНИИЗЖ КРЬ ВНИИЗЖ КРЬ ВНИИЗЖ КРЬ
Положит. 156 153 151 148 5 5
Отрицат. 90 93 19 22 71 71
Всего: 246 246 170 170 76 76
Примечания: А - «сомнительные» титры ИФА (1:250-1:500) отнесены в группу отрицательных; Б - результаты ИФА по отношению к результатам РТГА. ОЧ (тест-система ВНИИЗЖ)=151/170хЮ0%=89%; ОС (тест-система ВНИИЗЖ)=71/76х100%=93%; ОЧ (тест-система КРЬ)=148/170><100%=87%; ОС (тест-система КРЬ)=71/76х100%=93%.
59 проб гетерологичных сывороток, референтных сывороток против ГП разных подтипов, сывороток после однократной вакцинации против подтипа Н5 были протестированы с применением набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц фирмы БупЫоНсв. Относительная чувствительность тест-системы с использованием антигена вируса ГП подтипа Н5Ш составила
100 %, относительная специфичность - 79 %. Диагностическая чувствительность составила 93 %, диагностическая специфичность - 95 %. Результаты, полученные с использованием разработанной тест- системы и коммерческого набора, совпадали по качественным характеристикам на 93 %.
Коэффициент корреляции 0.933 (р<0,05) характеризовал устойчивую взаимосвязь между тест-системой ИББ и набором Synbiotics.
Относительная чувствительность и относительная специфичность разработанной тест-системы РВП по отношению к набору фирмы Synbiotics составила: для сывороток крови от непривитой птицы: 95,4% и 94,7%; для сывороток крови вакцинированной против РВП кур - 98,3% и 94,1%, соответственно.
С применением тест-системы для выявления антител к вирусу ИБК и набора фирмы Synbiotics было протестировано 518 полевых сывороток. Корреляция между результатами составила 91%.
После параллельного тестирования с использованием двух наборов 310 проб полевых сывороток чувствительность по отношению к наборам фирмы Synbiotics составила для тест-систем M. gallisepticum - 98%, M. synoviae -96%; специфичность была 97% и 90%, соответственно.
В опытах было протестировано 400 полевых сывороток крови кур на наличие антител к вирусу ИЭП. Было установлено, что чувствительность разработанной тест-системы по отношению к набору фирмы Synbiotics составила 91%, а специфичность - 94%. Таким образом, корреляция между результатами составила 96%.
Статистический анализ результатов выявления антител к вирусу ССЯ-76 в ИФА и РТГА показал наличие парной корреляции (R=0,863), причем специфичность ИФА была 1,0 (30/30), и, соответственно, чувствительность 1,0 (80/80) или 0,9 (72/80) и 0,93 (102/110), в зависимости от того, были ли сомнительные результаты сгруппированы с положительными или с отрицательными результатами.
2.2.4. Разработка программного обеспечения «СИНКО-ИФА» для учета, обработки и хранения результатов ИФА в ветеринарии
Программа "СИНКО-ИФА" по болезням птиц представляет собой модульную программную систему, созданную на языке прокламирования Visual Basic версии 3.0. Программа позволяет считывать с ридера или вводить с клавиатуры данные по оптической плотности, указывать расположение испытуемых и контрольных проб на планшете, рассчитывать по формулам, предложенным разработчиком набора, значения титров или других показа-
телей, принятых для характеристики исследуемых материалов, сохранять как первичные (оптические плотности), так и обработанные (значения титров) данные.
В 2000 г., программа «СИНКО-ИФА» была зарегистрирована в Российском агентстве по патентам и товарным знакам, и получено соотвествующее свидетельство. Текущая рабочая версия 2.1С работает в операционной среде Windows ЗХ и Windows 9Х, позволяет непосредственно из программы подключаться к различным базам данных и сохраняет подключение к последней базе данных по желанию пользователя. Предусмотрен поиск в базе результатов теста по дате анализа, исполнителю, хозяйству, производителю наборов, болезням, возрасту птиц. По мере появления новых моделей спектрофото-метров-ридеров составляются коммуникационные модули для новых приборов. В настоящее время программа совместима с четырнадцатью моделями спектрофотометров-ридеров отечественного и зарубежного производства и предусматривает возможность работы с наборами зарубежных (IDEXX, Syn-biotics, Guildhay, BioChek) и отечественных (ФГУ «ВНИИЗЖ») производителей, в которых используется непрямой вариант постановки реакции при тестировании проб в одном рабочем разведении.
2.2.S. Практическое использование разработанных тест-сисгсм на основе непрямого варианта ИФА
В целях испытания разработанных тест-систем исследовали пробы сывороток крови кур, направленные для анализа в ФГУ «ВНИИЗЖ» из птицеводческих хозяйств России в период 1998-2008 гг. с сопроводительными документами, где были указаны сведения об эпизоотической обстановке в хозяйстве и о мероприятиях по специфической профилактике инфекционных болезней птиц. Наборы использовались для определения уровня гуморальных антител в экспериментальных условиях, при оценке иммунного статуса поголовья кур на птицефабриках, в частности, при контроле материнского иммунитета у цыплят в первые недели жизни, поствакциналыюго и постинфекционного иммунитета. За 1998-2008 гг. были исследованы пробы сывороток крови кур из более чем 500 птицехозяйств России и других стран СНГ.
2.2.5.1. Определение уровня трансовариального иммунитета у цыплят разных пород
Исследование уровня пассивного иммунитета при разных болезнях является важным для корректировки сроков первой вакцинации живой вакциной, особенно при ИББ. Тестировали сыворотки крови цыплят в возрасте от 1 до 20 дней, полученных от кур яичных и мясных пород, вакцинированных
против ИББ. Для каждой породы с интервалом в 1 день в 3-6 пробах сывороток определяли значения титров антител. Средний показатель титра сывороточных антител на первый день жизни цыплят мясной породы составил 1:3890, у цыплят яичной породы - 1:5702. На 20 день средние значения титров составили 1:80 у мясных пород и 1:356 у яичных. Были определены коэффициенты корреляции между значениями титров и возраста у цыплят мясных пород (г=0,928, р<0,01) и яичных пород (г=0,954, р<0,01). При известном значении исходного титра на основании регрессионного коэффициента, установленного для данной породы, уровень гуморального иммунитета у цыплят может быть достаточно надежно предсказан в период между 2-3 и 18-20 сутками. Падение уровня материнских антител против вируса ИБК наблюдали при анализе проб сывороток крови цыплят в возрасте 1,7,14,18,21 суток из выбранных птичников на четырех птицефабриках. В результате была выявлена общая закономерность в динамике снижения уровня антител к вирусу ИБК у цыплят в разные периоды жизни, который к 21 дню был ниже минимального положительного значения (Т< 1:700).
Результаты показали, что уровень трансовариального иммунитета варьирует в зависимости от породы цыплят, вакцин, применяемых для иммунизации несушек, графика вакцинации. Показатели материнского иммунитета имеют большое практическое значение, поскольку позволяют рационально планировать сроки вакцинации.
2.2.5.2. Изучение динамики уровня антител в разные сроки после иммунизации живыми и инактивированнымн вакцинами
Использование разработанных тест-систем для контроля гуморального иммунитета позволило наблюдать динамику роста иммунного ответа, судить об эффективности проведенной вакцинации.
Например, цыплят кросса "Родонит" в возрасте 22 дней, не имеющих антител к вирусу ИББ, прививали сухой вирусвакциной против ИББ из штамма "БГ" в дозе 1000 ЭИД50. В период с 6 по 12 день после иммунизации происходило резкое увеличение средней концентрации антител до 1:4800. Далее наблюдалось снижение интенсивности прироста иммунного ответа и тенденция к стабилизации средних значений титров. На 18 день средний титр составил 1:6252. Следует отметить, что динамика роста титров сопровождалась уменьшением величины вариации индивидуальных иммунных ответов в группах вакцинированной птицы (коэффициент вариации убывал от 37% с 6 дня до 10% в среднем для периода с 12 по 20 день).
Для однократной иммунизации вакциной против НБ шт. Ла-Сота с масляным адъювантом в дозе 0,5 см3 внутримышечно были сформированы
группы цыплят в нозрасте 50 дней, не имеющих специфических антител к вирусу НБ. Кровь отбирали на 7, 10, 14, 21, 24, 28, 31, 45 и 52 дни опыта. Для изучения корреляции между результатами выявления антител к вирусу НБ в ИФА и РТГА значения титров антител были переведены в десятичные логарифмы и подвергнуты регрессионному анализу.
4
3.5 3
_ 2.5
I 2
? 1.5 1
0.5 0
Рис. 3. Выявление антител к вирусу НБ в ИФА и РТГА после однократной иммунизации цыплят живой вакциной шт. Ла-Сота (положительные результаты: ИФА- 2,4 РТГА- 1,0
Как видно из данных, представленных на рис. 3, уровень антител на 7 сутки достигал в ИФА и РТГА положительных значений. Пик выработки антител наблюдался в ИФА на 21 сутки и на 14 сутки в РТГА. Титр антител на конец периода наблюдения (52 суток) составил в ИФА- 1:3471, в РТГА -около 3,0 1ц (10 1о£2), коэффициент корреляции между результатами тестов был 0,94.
При вакцинации птицы инактивированным препаратом наибольший титр специфических антител был выявлен в те же дни, что и при иммунизации цыплят живой вакциной. Титр антител в день завершения опыта (на 52 сутки) составил в ИФА 1:4071, в РТГА 9,37 1о§2. В результате проведённого контрольного заражения было установлено, что на 52 день опыта цыплята, привитые вакцинами, имели 100% защиту от инфекции.
Продолжительность иммунитета после двукратной прививки живой вакциной против ИБК изучали, используя группу птиц из одного птичника на птицефабрике в течение 248 дней. Птиц вакцинировали в суточном возрасте спреем и на 30 день - выпойкой. Сыворотки крови исследовали на 1, 7, 71, 99, 113 и 248 сутки. На 71 сутки цыплята имели уровень антител с Т = 1:6712, на 99 день титр антител был равен 1:10002. На 113 день наблюдали снижение уровня антител (Т = 1:7339), а на 248 день он достиг порогового значения титра (Т = 1:666).
Для иммунизации инактивированной вакциной против ГП использовали 60-суточяых цыплят без антител к вирусу гриппа птиц. Средние титры приведены по результатам исследования сывороток крови цыплят, иммунизированных вакцинами 17 серий. • .
Как представлено на рис. 4, уже на 13 день после вакцинации средний титр антител был положительным и составил 1:1818 ± 386. На 28 день после иммунизации средний титр был 1:5354 ± 405. В течение последующих месяцев наблюдали постепенное снижение уровня антител, и через 6 месяцев после иммунизации средний титр составил 1:2659 ± 436.
<
в S
ф о
а» а. и
4 5,10±1.37
Сутки после иммунизации ' Рис. 4. Выявление антител в ИФА и РТГА к вирусу гриппа у цыплят, привитых вакциной против ГП подтипа Н5!\1
В качестве подтверждающего теста использовали РТГА. При исследовании сывороток крови, полученных на 13 сутки после иммунизации, средний титр антител в РТГА к вирусу ГП подтипа Н5 составил 4,8 ± 1,54 log2. Максимальную величину среднего титра, равную 7,9 ± 1,76 log2 также наблюдали через 28 суток после вакцинации. Через 6 месяцев средний титр составлял 5,1 ± 1,37 log2. Результаты, полученные в РТГА и ИФА, коррелировали друг с другом. .
Для характеристики иммунного фона к М. gallisepticum и М. synoviae у невакцинированной птицы в ИФА были исследованы пробы сывороток крови кур, присланные в 1996-2003 гг. из 291 птицефабрики 56 областей РФ, относящихся к 7 регионам, а также из 26 предприятий Украины и Белоруссии. Были обработаны данные исследований в ИФА 31650 полевых сывороток крови кур на присутствие антител к М. gallisepticum и 22696 - М. synoviae. Часть этих сывороток была исследована одновременно на наличие антител к обоим возбудителям. Для исследования динамики изменения уровня
антител в течение жизни все поступающие пробы из разных птицехозяйств были разделены по возрастным группам: 1-5, 6-10, 11-20, 21-30,31-60, 61-90, 91-120, 121-150, 151-200, 201-300, 301-400, 401 и более дней. На основании полученных результатов были построены графики, которые подтвердили, что к трехнедельному возрасту у цыплят полностью исчезают материнские антитела к М gallisepticum и М. ъупом'ше, уровень которых в суточном возрасте был максимальным, до пятинедельного возраста антитела отсутствовали, затем начинался их постепенный прирост к 90 дням, при этом заболевание протекало зачастую субклинически. Однако любой стресс, ведущий к снижению иммунитета, может изменить ситуацию по данным заболеваниям.
Таким образом, определена диагностическая значимость результатов, полученных с применением разработанных тест-систем на основе ИФА при оценке трансовариального иммунитета, изучении динамики накопления антител после применения живых и инактивированных вакцин, оценке иммунного фона у птицепоголовья в промышленном птицеводстве.
2.2.6. Создание коммерческих наборов на основе разработанных тест-систем
Проведенные исследования по разработке и испытанию иммунофер-ментных тест-систем на основе непрямого варианта ИФА явились основанием для создания коммерческих наборов для выявления в ИФА антител к возбудителям инфекционных болезней птиц. Производство наборов для ИФА представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических и биологических процессов, включающих разнотипное оборудование и образующих единую технологическую линию (рис. 8).
2.2.6.1. Разработка технологии и организация производства коммерческих наборов и контроль качества с внедрением автоматизированных роботизированных устройств
В настоящее время в ФГУ «ВНИИЗЖ» выпускается свыше 20 наименований коммерческих наборов для серологической диагностики наиболее значимых для промышленного птицеводства болезней. Ключевым моментом при изготовлении наборов на основе непрямого варианта ИФА является подготовка сенсибилизированных антигенами планшетов, поскольку состояние иммобилизованных на планшетах антигенов непосредственно влияет на результативность теста.
Был проведен сравнительный анализ технических характеристик приборов и устройств ведущих фирм-производителей оборудования. Автоматизированный комплекс в виде раскапывающей рабочей станции вместе с дру-
гими периферическими устройствами фирмы Тесап (Австрия) интегрировали в технологический цикл производства коммерческих наборов ФГУ «ВНИИЗЖ» (рис.5). При этом для проведения и контроля различных этапов сенсибилизации планшетов было разработано программное обеспечение. Было проведено испытание точности внесения разных объемов растворов в лунки трех планшетов. Сравнение теоретической и реальной массы выбранных объемов показало, что их совпадение составило: для 15 мкл — 96,83 %, 50 мкл — 98,36 % и 100 мкл — 99,35 %., т.е. чем объем был меньше, тем ниже была точность их внесения в лунки. Коэффициент вариации между наконечниками был очень низким (0,29%), что подтверждало высокую точность модуля.
Рис. 5. Стадии основного технологического процесса при изготовлении диагностических наборов
В результате для приготовления планшетов серии наборов одного наименования (в среднем 100 наборов из 200 планшетов) требовалось, в общей сложности, в 3-4 раза меньше времени и трудозатрат по сравнению с «ручным» способом. Для проверки иммуноспецифических компонентов готовых
серий наборов на активность и специфичность с панелью контрольных сывороток использовали раскапывающую станцию Freedom EVO 150-8. Эксперименты показали, что роботизация отдельных стадий ИФА значительно увеличивает скорость, точность, качество и вопроизводимость результатов теста.
При внедрении роботов на стадии отбора проб, перемешивания, приготовления рабочего разведения, переноса на планшет с антигеном, отмывки, внесения других компонентов реакции производительность повышалась в 2 раза. . . . .
2.2.6.2. Цроведение оценки качества лабораторных исследований с использованием разработанных тест-систем в международных сравнительных испытаниях, организованных референтными лабораториями
Лаборатория R&D GD (Dutch Animal Health Service, Deventer, Нидерланды) официально аккредитована в соответствии с международными требованиями ILAC-G13:2007 для проведения международных сравнительных испытаний (МСИ) по болезням птиц.
Начиная с 2006 г. ФГУ «ВНИИЗЖ» (единственный в Российской Федерации) участвовал в испытаниях, проводимых GD лабораторией, по выявлению антител к возбудителям НБ, ГП, ИББ, ИБК, МГ, МС в зашифрованных пробах сывороток крови кур. Помимо основной задачи - оценки возможностей отечественных коммерческих иммуноферментных наборов при диагностике болезней птиц, определяются пути решения вопросов, связанных с улучшением их качества. В испытаниях принимали участие от 48 паборато-рий (в МСИ по ИБК) до 60 лабораторий (в МСИ по НБ) из более чем 30 стран Африки, Азии, Центральной Америки, Европы. Следует отметить, что практически все лаборатории, включая ФГУ «ВНИИЗЖ», правильно определяли статус сывороток от СПФ-кур во всех МСИ, показывая высокую специфичность используемых диагностических наборов. С применением коммерческих наборов, созданных на основе разработанных тест-систем, выявлялось от 75% (в МСИ по ИБК) до 87,5 % (в МСИ по МС) проб сывороток с разным уровнем специфических антител. В ходе международных сравнительных испытаний было выявлено, что в основном затруднения возникали при определении статуса сывороток крови, отобранных на ранних сроках (7 суток) после иммунизации живыми вакцинами. Судя по отчетам, присылаемым лабораторией-организатором, такие же проблемы, в большей или меньшей степени, испытывали участники, работавшие с наборами других производителей (IDEXX, Synbiotics, BioChek).
Таким образом, результаты проведенного внешнего контроля по оценке качества исследований показали, что наборы производства ФГУ «ВНИИЗЖ» дают достоверные результаты при проведении диагностических исследований.
2.2.7. Внедрение системы комплексной серологической диагностики болезней кур на основе ИФА в промышленное птицеводство
Перед нами стояла цель создать комплексную систему серологического мониторинга при определении иммунного статуса птицы и внедрить ее в лаборатории птицеводческих хозяйств. Для опытно-промышленного производства коммерческих наборов была подготовлена научно-техническая документация и регламенты. В настоящее время Россельхознадзором утверждены СТО и технический регламент на изготовление свыше 20 диагностических наборов, что позволило наладить их серийное производство.
В течение нескольких лет проводили тестирование существующих на рынке спектрофотометров-ридеров, отмывочных устройств, автоматических дозаторов и расходных материалов как отечественного, так и зарубежного производства, что позволило выбрать оптимальную конфигурацию формирования комплектов для постановки ИФА в условиях птицеводческих ветеринарных лабораторий.
В течение 14 лет (1995-2009 гг.) было укомплектовано оборудованием для ИФА свыше 100 диагностических лабораторий научно-исследовательских учреждений, диагностических центров, республиканских, краевых, областных ветеринарных лабораторий, а также птицефабрик России, Беларуси, Украины, Молдовы, Узбекистана, Грузии, Казахстана и Армении (рис.6).
Внедрение системы комплексной серологической диагностики на основе автоматизированного иммуноферментного анализа для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ, МС) позволяет птицеводческим предприятиям отслеживать эпизоотическую ситуацию по наиболее опасным болезням, оценивать напряженность поствакцинального иммунитета, оптимизировать схемы вакцинации, что в конечном счете дает возможность повысить сохранность птицепо-головья.
Рис. 6. Регионы России и стран СНГ, где установлены комплекты оборудования и программное обеспечение «СИНКО-ИФА»
3. ВЫВОДЫ
1. Создана система комплексного серологического мониторинга инфекционных болезней кур в промышленном птицеводстве с применением имму-ноферментных тест-систем и программного обеспечения для получения, обработки, учета и хранения данных.
2. Усовершенствованы методики очистки и концентрирования антигенов НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС, используемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем. Под контролем электронной микроскопии и электрофореза определены условия получения очищенных антигенов с концентрацией не менее 1-5 мг/см3.
3. Отработаны схемы иммунизации кур для получения контрольных положительных сывороток с активностью препаратов не менее 1:3200, определены допустимые значения оптических плотностей контрольных сывороток при постановке реакции в одном разведении, находящиеся в диапазоне 0,41,050 для положительных контролей и 0,04-0,160 Для отрицательных сывороток.
4. Разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления и количественного определения уровня специфических антител к возбудителям НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС в сыворотках крови кур при
их тестировании в одном разведении: определены оптимальные концентрации (для антигенов, конъюгата) и условия взаимодействия компонентов реакции; выбрано рабочее разведение тестируемых сывороток (1:400), установлены критерии качественной и количественной оценки результатов, выведены уравнения линейной регрессии и определены коэффициенты для формулы расчета числового значения титра по одному разведению испытуемых сывороток.
5. Проведен сравнительный анализ результатов, полученных при исследовании свыше 3000 проб сывороток с помощью разработанных тест-систем ИФА, базовой реакции РТГА и коммерческих наборов производства фирмы Synbiotics (KPL, США), зарегистрированных на территории РФ. Корреляция составила от 84% до 96 %, относительная чувствительность - от 89% до 98 % и относительная специфичность - от 79% до 94%.
6. За период с 1998 по 2008 гг. разработанные тест-системы проверены при исследовании проб сывороток крови кур из более чем 500 птицехозяйств РФ и других стран СНГ для оценки иммунного статуса поголовья при контроле трансовариального, поствакцинального иммунитета против возбудителей экономически значимых болезней кур в промышленном птицеводстве.
7. На основе разработанных иммуноферментных тест-систем для выявления и количественного определения уровня антител к возбудителям выбранных болезней птиц в сыворотках крови кур при их тестировании в одном разведении разработана и утверждена Россельхознадзором научно-техническая документация и регламенты для опытно-промышленного производства 16 наименований коммерческих наборов в двух вариантах: для визуальной детекции (на 40 проб) и инструментального учета (на 180 проб).
8. Создана и зарегистрирована в Российском агентстве по патентам и товарным знакам универсальная компьютерная программа «СИНКО-ИФА» для сбора, анализа и хранения результатов ИФА с учетом возможности работы с иммуноферментными наборами, разработанными в ФГУ «ВНИИЗЖ», и зарубежных фирм-производителей.
9. Разработана технология, организовано опытно-промышленное производство и оптимизирован контроль качества 16 коммерческих наборов с внедрением автоматизированных роботизированных устройств.
10. Проведена оценка качества лабораторных исследований с использованием разработанных тест-систем в 8 международных сравнительных испытаниях, проводимых аккредитованной референтной лабораторией (Голландия) и установлено, что статус зашифрованных проб определяется не менее чем в 75 %.
11. В ветеринарных лабораториях и на птицефабриках РФ внедрена комплексная система серологической диагностики, основанная на постоянном мониторинге иммунного статуса птицы разного возраста, с использованием наборов для ИФА, комплекта стандартизированного оборудования для постановки реакции и компьютерной программы для обработки и хранения полученных результатов анализа. В РФ и странах СНГ установлено и используется свыше 100 комплектов оборудования с универсальной компьютерной программой.
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Методики, разработанные в ходе научно-исследовательских работ по теме диссертации, включены в два сборника: "Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммунофермент-ным методом" (1998 г.) и "Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием серологических реакций" (2008 г.), утвержденные Россельхознадзором в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.
Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные документы по изготовлению и контролю 16 наборов для ИФА, утвержденные Россельхознадзором МСХ РФ: наборы для определения антител к вирусу ньюкаслской болезни иммуноферментным методом (СТО 00495527-00542006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0043-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом (СТО 00495527-0055-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0042-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом (СТО 00495527-0057-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0044-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к реовирусу птиц иммуноферментным методом (СТО" 00495527-0045-2006 от 21.11.2008) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-133-00495527-2005 от 15.02.2006); наборы для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости кур иммуноферментным методом (СТО 00495527-0056-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0041-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к вирусу инфекционного энцефаломиелита птиц иммуноферментным методом (СТО 00495527-0038-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-
117-00495527-2005 от 30.05.2006); наборы для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза (Mycoplasma gallisepticum) иммуно-ферментным методом (СТО 00495527-0109-2009 от 31.03.2009) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0111-2009 от 31.03.2009); набор для определения антител к Mycoplasma synoviae иммуно-ферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0034-2006 от 29.12.2006); набор для определения антител к вирусу гриппа птиц иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0086-2008 от 09.12.2008).
На базе ФГУ «ВНИИЗЖ» внедрена разработанная технология производства коммерческих наборов для ИФА в промышленном масштабе с применением автоматизированных роботизированных устройств. В течение 1997 - 2009 гг. было произведено около 21000 наборов для визуальной детекции и свыше 8000 наборов для исследований проб в одном разведении (СИНКО), которые использовались в региональных, областных ветеринарных лабораториях и на птицефабриках.
5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, указанных в перечне ВАК РФ
1. Мудрак Н.С., Дрыгин В.В. Создание иммуноферментных тест-систем для серологической диагностики в птицеводстве с применением компьютерной программы для учета, обработки и хранения результатов анализа // Ветеринарная патология. - 2006. -№ 4 (19).- С. 165-168.
2. Мудрак Н.С. Применение роботизированных автоматических устройств в производстве диагностикумов и при проведении ИФА // Российский ветеринарный журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». - 2008. - Сент. - С. 74-78.
3. Мудрак Н.С. Разработка и внедрение комплексной системы серологической диагностики болезней птиц в ИФА с компьютерным обеспечением // Российский ветеринарный журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». - 2008. - Сент. - С. 78-80.
4. Иммунитет у кур, привитых инактивированной ассоциированной вакциной / В.Н. Ирза, В.В. Борисов, А.В. Борисов, С.К. Старов, О.А. Борисова, Н.С. Мудрак, Н.П. Курлова, А.Б. Сарбасов, Г.И. Кожаева//Ветеринария. - 2002.-№ 4,-С. 21-23.
5. Серологический мониторинг птицехозяйств Российской Федерации по ареовирусной инфекции и синовиальному микоплазмозу / А.И. Куприя-
нов, И.А. Волкова, Н.С. Мудрак, В.В. Шкиря, В.Н. Ирза, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Аграрная Россия. - 2002. - № 2. - С. 20-24.
6. Комплексное использование серологических методов для обнаружения антител к вирусу гриппа птиц Н5 в сыворотках крови диких и домашних птиц / Н.Н. Луговская, М.А. Циванюк, С.В. Фролов, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, А.В. Борисов // Ветеринарная патология. - 2006. - №4 (19). - С. 58-62.
7. Формирование гуморального иммунитета к вирусу инфекционного энцефаломиелита у цыплят, вакцинированных живой вакциной из штамма «CALNEK 1143М» / А.Э. Меньшикова, А.Н. Колотилов, Н.В. Беляева, В.Н. Ирза, В.Н. Решетникова, Н.С. Мудрак // Ветеринарная патология. - 2006. -№4 (19).-С. 137-139.
8. Определение генотипа и степени патогенности изолята вируса инфекционного бронхита / О.Н. Чупина, Е.В. Овчинникова, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак, В.И. Диев, А.В. Борисов // Ветеринарная патология. - 2007. -№4(23).-С. 121-126.
9. Разработка конкурентного варианта ИФА для выявления антител к вирусу гриппа подтипа Н5 у различных видов птиц / М.А. Циванюк, Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, Е.В. Белик // Ветеринарная патология. - 2007. - №4 (23). - С. 126-132.
10. Непрямой вариант ИФА для выявления и количественного определения антител к вирусу гриппа птиц при тестировании проб в одном разведении / М.А. Циванюк, Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, Е.В. Белик И Ветеринарная патология. - 2007. - № 4 (23). - С. 132-137.
11. Оценка иммунобиологических свойств изолятов Mycoplasma gal-lisepticum с использованием трахеальных органных культур / И.А. Рунина, О.Н. Чупина, М.И. Сорокина, Д.Б. Андрейчук, А.В. Спрыгин, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, В.Н. Ирза // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4 (23). - С. 171-174.
12. Получение специфических антисывороток и антигенов вируса болезни Марека для иммуноферментного анализа / М.А. Волкова, М.И. Шуль-пин, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, Ш.К. Куляшбекова // Российский ветеринарный журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ "ВНИИЗЖ". - 2008. - Сент. - С. 69-72.
13. Случай выделения вируса гриппа А подтипа H4N6 в популяциях синантропных птиц в Российской Федерации / И.А. Чвала, А.В. Андриясов, Н.С. Мудрак, В.В. Борисов, В.В. Дрыгин, Л. Ю. Абрамова // Ветеринария. -2009.-№10.-С. 19-20
14. Особенности течения гриппа А у уток-крякв, вызванного A/chicken/Primorsky/85/08 H5N1 / И.А. Чвала, Л.О. Щербакова, М.И. Шуль-пин, Ю.Ю. Бабин, А.В. Варкентин, М.Ю. Щелканов, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов, В.В. Дрыгин, Л.Ю. Абрамова, Н.А. Власов // Ветеринария. - 2009. - № 10.-С. 25-26.
15. Detection of antibodies to avian infectious bronchitis virus by a recombinant nucleocapsid protein-based enzyme-linked immunosorbent assay / N.N. Lougovskaia, A.V. Scherbakov, A.S. Yakovleva, M.A. Tsyvanyuk, N.S. Mudrak, V.V. Drygin A.V. Borisov // J. Virology Methods. - 2006. - Vol. 135. - P. 292296.
16. Detection and estimation of avian infetious bronchitis virus antigen by a novel indirect liquid-phase blocking enzyme-linked immunosorbent assay using chicken and rabbit affinity purified immunoglobulins / N.N. Lougovskaia, A.A. Lougovskoi, Y.A. Bochkov, G.V. Batchenko, N. S. Mudrak, V.V. Drygin, A.V. Borisov, V.V. Borisov // Avian Pathology. - 2002. - Vol. 31, № 6. - P. 549-557.
17. Облучатель рециркулятор ОРУБ-01»КРОНТ» для обеззараживания воздуха в лабораториях ветеринарного профиля / А.В. Спрыгин, И.А. Руни-на, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин // Ветеринария. - 2006. - № 9. - С. 36-37.
18. Оценка иммунного ответа у цыплят, привитых мукозальными вакцинами против ньюкаслской болезни / М.А. Волкова, А.В. Ирза, И.А. Руни-на, С.В. Фролов, М.Е. Качалова, И.А. Чвала, Е.И. Чубукова, Н.С. Мудрак, В.В. Борисов, В.В. Дрыгин // Ветеринария. - 2009. - № 10. - С. 20-25.
19. Genetic diversity of Mycoplasma gallisepticum field isolates using partial sequencing of the pvpA gene fragment in Russia / A.V. Sprygin, D.B. Andrey-chuk, N.P. Elatkin, N.G. Zinyakov, S.N. Kolosov, N.S. Mudrak, V.N. Irza, V.V. Drygin, A.V. Borisov, N.A. Perevozchikova // Avian Diseases. - 2010. - Vol. 54. -P. 899-904. ' '
20. Development of a duplex real-time Tag-Man PCR assay with an internal control for the detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae in clinical samplex from commercial and backyard poultry / A.V. Sprygin, D.B. Andreychuk, A. N. Kolotilov, M.S. Volkov, I.A. Runina, N.S. Mudrak, A.V. Borisov, V.N. Irza, V.V. Drygin, N.A. Perevozchikova // Avian Pathology. - 2010. -Vol. 39, N2. -P. 99-109.
21. Выделение аденовирусов 1 группы методом перемежающихся пассажей / С.П. Лазарева, А.В. Ирза, М.И. Шульпин, Б.Л. Манин, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин// Ветеринарная патология. - 2007. -№4(23).-С. 158-162.
22. Непрямой блокирующий вариант иммуноферментного анализа для определения аденовирусов птиц 4 серотипа / М.А. Волкова, В.А. Лобанов,
Г.В. Батченко, Н.С. Мудрак, Д.С. Сурнев, В.В. Дрыгин, В.В. Борисов // Ветеринария. - 2003. - № 11. - С. 18-22.
Патенты и свидетельства
23. Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйце-носкости-76 кур: пат. 2167673 Российская Федерация: МПК7 А61К 39/00 / A.B. Борисов, В.Н. Кузнецов, A.A. Гусев, В.В. Дрыгин, Н.С. Мудрак, В.В. Борисов; заявитель и патентообладатель ФГУ «ВНИИЗЖ». - Заявл. 04.09.2000; опубл. 27.05.2001, Бюл. № 15.
24. Набор для определения антител к вирусу инфекционной бурсаль-ной болезни птиц: пат. 2192014 Российская Федерация: МПК7 G01N 33/545 /
A.B. Борисов, В.Н. Кузнецов, A.A. Гусев, В.В. Дрыгин, Н.С. Мудрак, Т.В. Оковытая; заявитель и патентообладатель ФГУ «ВНИИЗЖ». - Заявл. 05.02.2001; опубл. 27.10.2002, Бюл. № 30.
,25. Набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур: пат. 2189042 Российская Федерация: MnK7G01N 33/545 / A.B. Борисов,
B.Н. Кузнецов, A.A. Гусев, В.В. Дрыгин, Н.С. Мудрак, H.H. Луговская, C.B. Фролов; заявитель и патентообладатель ФГУ «ВНИИЗЖ». - Заявл. 02.03.2001; опубл. 10.09.2002, Бюл. № 25.
26. Программа для регистрации, обработки, хранения результатов им-муноферментного анализа в ветеринарии / A.A. Гусев, В.В. Дрыгин, Н.С. Мудрак, Ю.В. Зинковский, С.Н. Колосов. - Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2000611338.-М., 2000.
Публикации в других изданиях
27. Оптимизация условий постановки непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни / Т.В. Оковытая, К.Ю. Федосеев, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак, A.B. Борисов // Вирусные болезни с.-х. животных: тез.докл. Всерос. науч.-практ. конф.-Владимир, 1995.-С. 245.
28. Расчет титра сывороток по одному разведению при иммунофер-ментной диагностике инфекционного бронхита кур / H.H. Луговская, Н.С. Мудрак, A.B. Борисов, В.В. Дрыгин // Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. -Владимир, 1997.-С. 161.
29. Оптимизация условий постановки непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу инфекционного бронхита кур / H.H. Луговская, Н.С. Мудрак, A.B. Борисов, В.В. Дрыгин // Проблемы инфекц. патоло-
гии с.-х. животных: тез. докл. коиф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. - Владимир, 1997.-С. 160.
30. Оптимизация метода выделения и очистки вируса болезни Ньюкасла / О.Г. Грибанов, Н.С. Мудрак, И.Я. Курман, H.H. Дрягалин // Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. - Владимир, 1997. - С. 164.
31. Количественная оценка концентрации антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни в сыворотках крови кур по одному разведению в иммуноферментном тесте / Т.В. Оковытая, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, A.B. Борисов // Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. - Владимир, 1997. - С. 162-163.
32. Антигенные, иммуногенные и реактогенные свойства живой сухой вакцины против инфекционного бронхита кур / A.B. Борисов, A.A. Гусев, С.В. Фролов, Н.С. Мудрак, Т.В. Хлыбова, Т.В. Никитина // Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. - Владимир, 1997. - С. 147-148.
33. Сравнительная оценка ИФА и РЗГА в диагностике синдрома снижения яйценоскости / М.А. Волкова, О.А Борисова, Н.С. Мудрак, Т.И.Назарова, В.В. Борисов, В.В. Дрыгин // Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. -Владимир, 1997.-С. 158.
34. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур методом одного разведения / М.А. Волкова, Н.С. Мудрак, В.В.Борисов, В.В.Дрыгин // Современные аспекты ветеринарной патологии животных: материалы конф., посвящ. 40-летию ВНИИЗЖ. - Владимир, 1998. - С. 224-235.
35. Сравнительная оценка пассивного иммунитета против ИББ у цыплят, полученных от непривитых и вакцинированных кур / С.А. Гусев, Т.В. Оковытая, Н.С. Мудрак, A.B. Борисов, К.Ю. Федосеев, З.Я. Михалишина, М.В. Гирин, A.A. Гусев, В.В. Дрыгин // Современные аспекты ветеринарной патологии животных: материалы конф., посвящ. 40-летию ВНИИЗЖ. - Владимир, 1998. - С. 192-196.
36. Расчёт титра антител в сыворотках крови кур при тестировании в одном разведении для иммуноферментной диагностики ССЯ-76 / М.А. Волкова, Н.С. Мудрак, O.A. Борисова, В.В. Борисов, В.В; Дрыгин // Производство и контроль мед., ветеринарных препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ: тез. докл. конф., посвящ. 30-летию ПЗБ. - Вольгин-ский, 1999.-С. 83.
37. Изучение антигенной активности ассоциированной инактивиро-ванной вакцины против ССЯ-76, ИБ и ИББ у кур / O.A. Борисова, В.В. Борисов, Н.С. Мудрак, С.А. Гусев, A.B. Борисов, З.Я. Михалишина // Производство и контроль мед., ветеринарых препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ: тез.докл. конф., посвящ. 30-летию ПЗБ. - Вольгин-ский, 1999.-С. 53.
38. Получение антигена реовирусной инфекции птиц для постановки непрямого варианта ИФА / А.И. Куприянов, Д.Б. Андрейчук, Н.С. Мудрак, Г.М.Фалина, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Актуальные проблемы патологии с.-х. животных: материалы междунар. науч.-практ. конф. - Минск, 2000. - С. 131-132.
39. Разработка непрямого варианта ИФА для количественного определения антител к возбудителю ареовирусной инфекции в сыворотках крови кур методом одного разведения / А.И. Куприянов, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 173-179.
40. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур / H.H. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, C.B. Фролов, A.B. Борисов, В.В. Борисов // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 140-144.
41. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления и количественной оценки антител к вирусу ньюкаслской болезни методом одного разведения / Т.Б. Манин, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, В.В. Дрыгин, М.И. Маркина // Достижения молодых ученых - в ветеринарую практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 165-170.
42. Применение набора по определению антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении для контроля материнского иммунитета и поствакцинального иммунитета / H.H. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, A.B. Борисов И Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 150-155.
43. Набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур: специфичность, чувствительность, воспроизводимость результатов, стабильность антигена при хранении / H.H. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, A.B. Борисов // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 145-150.
44. Компьютерная программа «Иммуноферментный анализ» / Ю.В. Зинковский, С.Н. Колосов, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 197-198.
45. Выбор оптимальных условий очистки антигена возбудителя респираторного микоплазмоза птиц для непрямого варианта ИФА / И.А. Волкова, Н.С. Мудрак, М.В. Гирин, В.В. Дрыгин // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000.-С. 200-201.
46. Разработка диагностической тест-системы на основе непрямого варианта ИФА и ее применение для эпизоотологического мониторинга реови-русной инфекции птиц / А.И. Куприянов, Н.С. Мудрак, В.И. Шкиря, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: материалы Междунар. науч.-произв. конф. - Алматы, 2000. - С. 124-126.
47. Применение иммуноферментной тест-системы для выявления и оценки антител к вирусу ньюкаслской болезни для контроля напряженности поствакцинального иммунитета / Т.Б. Манин, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: материалы Междунар. науч.-произв. конф. - Алматы, 2000. - С. 144-146.
48. Контроль иммунного статуса поголовья кур на птицефабриках с применением иммуноферментного набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, А.В. Борисов // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: материалы Междунар. науч.-произв. конф. - Алматы, 2000. - С. 137-138.
49. Изучение основных характеристик иммуноферментного набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, С.В. Фролов, А.В. Борисов // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: материалы Междунар. науч.-произв. конф. - Алматы, 2000. - С. 141-142.
50. Определение напряженности иммунитета прйтив ньюкаслской болезни с помощью непрямого варианта ИФА и РТГА / Т.Б. Манин, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзот. и зооантропоноз. болезнями животных: Сб. статей Междунар. науч.-практ. конф. - Покров, 2000. - С. 170-172.
51. Сравнительная оценка РТГА и непрямого варианта ИФА при определении антител к Mycoplasma gallisepticum / И.А. Волкова, Н.С. Мудрак, М.В. Гирин, В.В. Дрыгин, А.В. Борисов // Совершенствование методов кон-
троля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов: тез. докл. -М., 2001.-С. 123-124.
52. Разработка тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для определения антител к Mycoplasma gallisepticum при тестировании сывороток в одном разведении / И.А. Волкова, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, М.В. Гирин, А.В. Борисов, В.Н. Ирза // Ученые записки Витебской гос. акад. ветеринарной медицины. - Витебск, 2001. - Т. 37, Ч. 2. - С. 23-24.
53. Применение коммерческих тест-систем на основе РТГА и ИФА для выявления антител и оценки поствакцинального иммунитета к вирусу нью-каслской болезни / Т.Б. Манин, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, Н.Н. Дрягалин, Г.И. Кожаева, Т.Л. Лядская, В.В. Дрыгин // Проблеми зоошженерн та ветеринарии медицини: зб. наук, праць «Ветеринарш науки». - Вип. 7(31). Материал] 5-го зЧзду паразитоценолопв в Украши. - Харюв, 2001. - С. 122125.
54. Разработка и применение тест-системы на основе непрямого имму-ноферментного анализа для определения антител к возбудителю инфекционного синовита в сыворотках крови кур методом одного разведения / И.А. Волкова, М.С. Волков, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, В.Н. Ирза // Актуальные проблемы инфекц. патологии животных: материалы Междунар. науч. конф., посвящ. 45- летию ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2003. - С. 260-265.
55. Изучение эпизоотической ситуации по Mycoplasma synoviae на птицефабриках Российской Федерации в 1999-2001 годах по данным серологического мониторинга с применением ИФА / И.А. Волкова, М.С. Волков, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, В.Н. Ирза // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекц. болезней животных: междунар. науч. конф. молодых ученых. - Владимир, 2004. - С. 265-268.
56. Разработка и применение тест-системы на основе непрямого имму-ноферментного анализа для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза кур в сыворотках крови птиц методом одного разведения / И.А. Волкова, М.В. Гирин, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, В.Н. Ирза // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекц. болезней животных: Междунар. науч. конф. молодых ученых. - Владимир, 2004. - С. 118-123.
57. Применение ИФА для диагностики инфекционных заболеваний в ветеринарии / В.В. Дрыгин, Н.С. Мудрак // Совершенствование ветеринарной лаб.-диагност. работы в Российской Федерации: материалы Всерос. совещания-семинара директоров ветеринарных лаб. субъектов РФ. - Брянск, 2004,-С. 96-97.
58. Разработка и применение тест-системы на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу инфекционного энцефаломиелита птиц в сыворотках крови кур методом одного разведения / А.Э. Меныцикова, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, В.Н. Ирза // Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионук-леотидов и возбудителей опасных инфекц. заболеваний: материалы Между-нар. симп. - Казань, 2005. - 4.2. - С. 224-228.
59. Использование рекомбинантного N-белка в непрямом варианте иммуноферментного анализа для обнаружения антител к вирусу инфекционного бронхита кур / H.H. Луговская, Н.С. Мудрак, A.B. Щербаков, A.C. Яковлева, М.Е. Качалова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 420-429.
60. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни кур с использованием рекомбинантного белка VP3 / И.А. Лебенко, H.H. Луговская, Н.С. Мудрак, A.B. Щербаков, Л.О. Щербакова, A.C. Яковлева, В.В. Дрыгин, A.B. Борисов // II Международный ветеринарный конгр. по птицеводству. - М., 2006. -С. 73-77.
61. Выявление антител к вирусу гриппа типа А в сыворотках крови диких и домашних птиц / М.А. Циванюк, H.H. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин // II Международный ветеринарный конгр. по птицеводству,- М., 2006. - С. 42-46.
62. Выявление антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни кур в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантного антигена VP3 / H.H. Луговская, И.А. Лебенко, A.B. Щербаков, Л.О. Щербакова, A.C. Яковлева, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, A.B. Борисов // Труды Федерального центра охраны и здоровья животных. - Владимир, 2006.-Т. 4.-С. 297-306.
63. Сравнительная оценка коммерческих тест-систем для диагностики гриппа птиц / H.H. Луговская, М.А. Циванюк, Н.С. Мудрак, В.Н. Ирза, В.В. Дрыгин, A.B. Борисов // Ветеринарна медицина: М1ЖВ1д. тем. наук. зб. -Харю в, 2006.-Вип. 87. - С.112-121.
64. Изучение напряженности поствакцинального иммунитета после применения инактивированной вакцины против гриппа типа А подтипа H5N1 / H.H. Луговская, М.А. Циванюк, C.B. Фролов, В.П. Мельников, Н.С. Мудрак, В.Н. Ирза, В.В. Дрыгин, A.B. Борисов, O.A. Борисова // Ветеринарна медицина: м1жвщ. тем. наук. зб. - Харюв, 2006. - Вип. 87. - С.109-112.
65. Молекулярно-бюлопчш характеристики Bipyciß ньюкаслско! хво-роби, що циркулюють у популящях диких водоплавних m axi в Украши / Д.В. Музика, В.В. Дрыгин, С.К. Старов, Н.С. Мудрак // Ветеринарна медицина: М1жв1д. тем. наук. зб. - Харюв, 2007. - Вип. 88. - С.1 45-149.
66. Получение культурального вируса гриппа птиц подтипа H5N1 и его использование в качестве антигена для серологических реакций / М.А. Цива-нюк, H.H. Луговская, Н.С. Мудрак, Т.Б. Манин, В.В. Дрыгин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 144-155.
67. Применение иммуноферментной тест-системы для выявления специфических IgA, IgM и IgG к вирусу ньюкаслской болезни птиц в секреторных жидкостях и и сыворотках крови кур / М.А.Волкова, A.B. Ирза, М.Е. Качалова, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, В.В. Борисов, С.К. Старов II Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. -С.176-185.
68. Совершенствование непрямого варианта ИФА для выявления антител к вирусу инфекционного бронхита кур / И.А. Лебенко, H.H. Луговская
A.B. Щербаков, A.C. Яковлева, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, A.B. Борисов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. -Т. 5. - С. 292-302.
69. Сравнение чувствительности РДП и ИФА при обнаружении антигена вируса инфекционного энцефаломиелита птиц и специфических антител к нему / А.Э. Меньшикова, В.Н. Ирза Н.В. Беляева, С.К. Чугрор.а, А.Н. Коло-тилов, Т.В. Оковытая, Г.В. Батченко, Н.С. Мудрак // Труди Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 361-366.
70. Оценка динамики формирования клеточного иммунитета после вакцинации кур инактивированной вакциной против ньюкаслской болезни / И. А. Рунина, Д. Б. Андрейчук, О.С. Осипова, М.А. Волкова, В.Ю. Сосипа-торова, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин // Ветеринарна медицина: М1жвщ. тем. наук. зб. - XapKÍB, 2008. - Вип. 91. - С.412-417.
71. Внедрение роботизированных устройств в технологию производства наборов и диагностические исследования в птицеводстве с применением ИФА и ПЦР / Н.С. Мудрак, Д.Б. Андрейчук, И.П. Пчелкина, A.B. Третьяков,
B.Ю. Сосипаторова, В.В. Дрыгин И Актуальные проблемы соврем, птицеводства: материалы 9-й Украинской конф. по птицеводству с междунар. участием. - Алушта, 2008. - С.133-143.
72. Изучение молекулярно-биологических свойств изолята ВГПА A/CK/Russia/Primorsky/0085/08: новые данные / Т.Б. Манин, И.А. Чвала, И.П.
Пчелкина, А.В. Андриясов, С.Н. Колосов, В.Н. Ирза, В.В. Дрыгин, С.К. Старое, Н.С. Мудрак // Проблемы совершенствования межгос. взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа: Междунар. науч.-практ. конф. - Новосибирск, 2008. - С. 121-123.
73.Внедрение автоматических станций для молекулярно-биологической диагностики гриппа птиц / А.В. Андриясов, Д. Б. Андрейчук, Н. С. Мудрак, Т.Б. Манин, В.Н. Ирза // Проблемы совершенствования меж-гсс. взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа: Междунар. науч.-практ. конф. - Новосибирск, 2008. - С. 108-110.
74. Phylogenetic analysis of М. gallisepticum isolates recovered from poultry farms of the Russian Federation / A. Sprygin, D. Andreychuk, I. Runina, N. Mudrak, V. Irza, V. Drygin // MEEGID IX Congress.- Irvine, USA, 2008. - P. 70-71.
75. Molecular variability of S3 and SI gene sequences of avian reovirus in the Russian Federation / N.G. Zinyakov, D. B. Andreychuk, N.I. Gerasimova, N.S. Mudrak, T.B. Manin, A.V. Borisov, V.V. Drygin // 16th World Vet. Poultry Assoc. Congr. Book and Abstr. - Marrakesh, Morocco, 2009.
76. Диагностика инфекционного бронхита кур. Ситуация в России (2007-2008 гг.) / Е.В. Овчинникова, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов, В.В. Дрыгин // V Междунар. ветеринарный конгр. по птицеводству. -М., 2009. - С. 66-70.
77. Разработка программного обеспечения для обработки, учета и хранения результатов ИФА при диагностике заболеваний разных видов животных / Ю.В. Зинковский, С.Н. Колосов, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2009. - Т. 7. -С.215-219.
78. Мудрак Н.С. / Новые технологии в диагностике инфекционных болезней птиц // Инфекционная патология животных: материалы Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 50-летию ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир, 2009. -С. 104-107.
79. Study of avian recombinant adenovirus CELO - induced immunity against subtype H5 and H7 avian influenza virus / M.I. Shulpin, L.O. Scher-bakova, M.A. Volkova, T.B. Manin, I.A. Chvala, N.S. Mudrak, M.M. Shmarov, B.S. Naroditskiy, V.V. Drygin // BirdFIu 2009: Avian Influenza and Human Health .- Oxford, UK, 2009. - P.25-26.
80. Multiplex real-time PCR with internal control for Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae detection in field samples'/ A. V. Sprygin, D. B. Andreychuk, I. A. Runina V.N. Irza, N.S. Mudrak, A.V. Borisov, V.V. Drygin //
16th World Vet. Poultry Assoc. Congr. Book and Afastr. - Marrakesh, Morocco, 2009.-P. 383.
81. Avian influenza diagnosis in the Russian Federation: achievements and perspectives / A.V. Andriyasov, I.A. Chvala, N.S. Mudrak, V.V. Drygin // Int. Symp. Sustainable Improvement of Animal Production and Health: Synopses. -Vienna, Austria, 2009. - P. 396-397.
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Мудрак, Наталья Станиславовна
1.ВВЕДЕНИЕ.
2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Общая характеристика (морфология и химический состав, клинические признаки, иммунитет) возбудителей инфекционных заболеваний кур: ныокаслской болезни. гриппа птиц. инфекционной бурсальной болезни. инфекционного бронхита кур. респираторного микоплазмоза и микоплазменного синовита. синдрома снижения яйценоскости. инфекционного энцефаломиелита.:. реовируса птиц.
2.2. Методы диагностики инфекционных заболеваний в птицеводстве
2.2.1. Методы индикации и идентификации возбудителей заболеваний в птицеводстве.
2.2.1.1. Выделение вирусов.
2.2.1.2 Идентификация с применением РГА, РТГА,
РН, ПЦР и электронной микроскопии.
2.2.2. Методы ретроспективной лабораторной диагностики.
2.2.2.1. Реакция нейтрализации.
2.2.2.2. Реакция диффузной преципитации.
2.2.2.3. Реакция торможения гемагглютинации.
2.3. Иммуноферментный анализ.
2.3.1. Общая характеристика: сущность метода, варианты постановки, анализ результатов.
2.3.2. Применение ИФА в диагностике инфекционных болезней в птицеводстве.
2.3.3. Обзор коммерческих наборов для серологической диагностики.
2.3.4. Новые технологии тестирования с применением ИФА.
2.3.5. Контроль качества исследований с использованием ИФА.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание и внедрение в промышленное птицеводство системы комплексного серологического мониторинга инфекционных болезней на основе иммуноферментного анализа"
Актуальность темы. В связи с интенсивным развитием промышленного птицеводства, возникновением новых и изменением уже известных инфекционных болезней птиц, против которых проводится профилактическая вакцинация, требуется разработка чувствительных, высокоспецифичных и поддающихся автоматизации методов оценки иммунного статуса птиц. Своевременный мониторинг инфекционных болезней птиц является неотъемлемой частью комплекса мероприятий, направленных на профилактику этих заболеваний, что предусматривает внедрение в практику диагностических исследований, отвечающих современному уровню развития науки.
Высокая эффективность мониторинга инфекционных заболеваний может быть достигнута только в том случае, когда методы диагностики доступны для региональных и производственных лабораторий и широко применяются в их практической работе. Несмотря на то, что традиционные иммунологические методы по-прежнему широко используются в ветеринарной практике, метод иммуноферментного анализа (ИФА) занял ведущее место при проведении рутинных исследований. Преимущества ИФА как метода заключаются в скорости постановки, чувствительности, специфичности, безопасности, возможность автоматизации процесса. Коммерческие наборы для ИФА нашли широкое применение в национальных программах борьбы с инфекционными болезнями птиц во многих странах Западной Европы и Америки.
В течение последнего десятилетия в промышленном птицеводстве были предприняты попытки модернизации серологической диагностики с применением иммуноферментного анализа. Для увеличения количества тестируемых проб и уменьшения расхода реактивов и трудозатрат была проведена оценка различных методик определения в ИФА титров антител при исследовании проб сывороток крови птиц в одном разведении. [307, 308,273].
Крупнейшие фирмы - производители иммуноферментных наборов для диагностики болезней птиц (IDEXX (США), Synbiotics (KPL,CII1A), Guildhay (Великобритания), Biochek (Голландия)) при постановке реакции в одном разведении для расчёта титра антител в сыворотке крови выбрали линейную зависимость логарифма титра (lg Т) от величины логарифма S/P отношения (отношение оптической плотности испытуемой пробы к оптической плотности положительного контроля).
Применение измерительного оборудования, в частности, спектрофотометров для считывания значений оптической плотности в микропланшетном формате, позволило разработать методологию тестирования большого количества проб сывороток одновременно против нескольких антигенов. Это, в свою очередь, привело к созданию и внедрению в ветеринарную практику специализированных компьютерных программ не только для перевода оптической плотности в числовое значение точного титра, но и для автоматической обработки, хранения и создания баз данных [307].
Наиболее актуальным для промышленного птицеводства является мониторинг болезней списка МЭБ (особо опасных) и экономически значимых болезней кур - ньюкаслской болезни (НБ), гриппа птиц (ГП), инфекционной бурсальной болезни (ИББ), инфекционного бронхита кур (ИБК), синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76), реовирусной инфекции птиц (РВП), инфекционного энцефаломиелита птиц (ИЭП), респираторного микоплазмоза и микоплазменного синовита, вызываемых Mycoplasma gallisepticum (МГ) и Mycoplasma synoviae (МС), которые определили перечень создаваемых отечественных диагностических тест-систем.
Гибель птиц при вспышках НБ и ГП, особенно молодой, может достигать 100%. По данным МЭБ, с июля 2008 по июль 2009 гг. официально зарегистрированы вспышки ньюкаслской болезни в 87 странах мира (OIE, www.oie.int), в том числе и в России. По данным Россельхознадзора, всего с 2005 по 2008 гг. в России было выявлено 179 очагов высокопатогенного гриппа H5N1 в 20 субъектах, суммарные потери от которого составили 2,8 млн. голов птицы.
С середины 70-х гг. ИББ и ИБК широко распространены практически во всех странах с развитым промышленным птицеводством. При вспышках ИББ заболевание охватывает практически все поголовье, летальность может достигать 90% [104], при этом переболевшие птицы приобретают восприимчивость к большинству инфекционных болезней вирусной и бактериальной этиологии [287]. Экономические потери при ИБК складываются в основном из снижения яичной и мясной продуктивности, вынужденной выбраковки заболевшей птицы, высокой летальности молодняка до 30-дневного возраста. Ситуация осложняется регулярным появлением новых вариантов вируса ИБК с низким уровнем родства к традиционным вакцинным штаммам [87, 326].
Реовирус птиц вызывает развитие теносиновита, малабсорбционного синдрома, заболевания респираторного и кишечного трактов. Ежегодный ущерб, наносимый птицеводству в США от болезней скелета у домашних птиц, основными возбудителями которых являются в равной степени реовирус и M. synoviae, составляют от 80 до 120 млн. долларов [88].
Экономический ущерб от болезней, вызываемых M. gallisepticum и M. synoviae, складывается из потерь, связанных с гибелью эмбрионов и цыплят, снижением массы тела птиц, уменьшением яйценоскости, оплодотворяемости яиц, выводимости цыплят [217, 204].
В крупных птицеводческих хозяйствах синдром снижения , яйценоскости -76 приносит ущерб из-за снижения яичной продуктивности и качества товарного яйца [130, 131].
Инфекционный энцефаломиелит вызывает заболевание кур, которое охватывает практически все поголовье в промышленном птицеводстве как мясного, так и яичного направления, причем летальность может составлять 20-50% [98, 99].
Необходимость анализа результатов исследования значительного числа проб при массовом обследовании поголовья, а также хранения полученных данных делает актуальной задачу автоматизации учета результатов ИФА. Существующие программы компьютерной поддержки ИФА, как правило, разрабатываются фирмой-изготовителем диагностикумов и предназначены для работы только с наборами данной фирмы. Таким образом, возникла необходимость разработать универсальную компьютерную программу, в которой предусматривалась бы возможность работы с наборами для ИФА и спектрофотометрами-ридерами разных производителей.
Применение в диагностических исследованиях наборов и реактивов зарубежного производства существенным образом отражается на стоимости анализов и делает отечественную ветеринарию зависимой от импортных поставок и состояния мирового рынка. В этом аспекте разработка отечественных высокочувствительных, надежных и относительно недорогих диагностикумов является важной задачей.
Объем проводимых мониторинговых исследований болезней птиц с каждым годом увеличивается и требует принципиально новых подходов к технологии тестирования. За рубежом в ведущих ветеринарных диагностических лабораториях, в частности референтных по особо опасным болезням, в последние годы активно внедряются новые методы постановки ИФА, включая основанные на технологии высокопроизводительного скрининга [105, 242] с применением роботизированных устройств. Замена «ручных» технологий серологических исследований на автоматизированные позволяет достичь повышения воспроизводимости результатов, стандартизации процесса исследований и их автоматического поддержания на соответствующем уровне, повышения производительности и безопасности работы персонала.
Цели и задачи исследований. Основной целью наших исследований было создание системы комплексного серологического мониторинга на основе иммуноферментного анализа для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям девяти наиболее экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ, МС) при исследовании проб сывороток крови в одном разведении и ее внедрение в промышленное птицеводство.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
-усовершенствовать методики очистки и концентрирования антигенов возбудителей НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС, используемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем;
-оптимизировать схемы иммунизации кур для получения специфических контрольных положительных сывороток;
-разработать иммуноферментные тест-системы для выявления и количественного определения уровня антител в сыворотках крови кур к возбудителям НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС при тестировании в одном разведении;
-определить чувствительность и специфичность при сравнительном анализе данных, полученных с помощью разработанных тест-систем на основе ИФА, базовых реакций и коммерческих иммуноферментных наборов зарубежных производителей, зарегистрированных на территории РФ;
-определить диагностическую значимость результатов, полученных с использованием разработанных тест-систем на основе ИФА, для изучения эпизоотической ситуации в птицехозяйствах и оценке иммунитета после применения живых и инактивированных вакцин;
-разработать научно-техническую документацию и регламенты для опытно-промышленного производства коммерческих наборов в двух вариантах: для визуальной детекции (на 40 проб) и инструментального учета (на 180 проб);
-разработать универсальную компьютерную программу регистрации, сбора, анализа и хранения результатов с учетом возможности использования наборов отечественных и зарубежных фирм-производителей;
-разработать технологию производства коммерческих наборов с внедрением автоматизированных роботизированных устройств;
-провести оценку качества разработанных тест-систем в сравнительных испытаниях, проводимых международными референтными лабораториями МЭБ и ФАО;
-внедрить в работу ветеринарных лабораторий и птицефабрик комплексную систему серологической оценки иммунного статуса кур разного возраста, основанную на ИФА, с использованием комплекта стандартизированного оборудования и универсальной компьютерной программы обработки и хранения полученных результатов.
Научная новизна. Впервые разработаны отечественные иммуноферментные тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям основных экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ и МС) при тестировании проб сывороток крови в одном разведении.
Впервые в России создана комплексная система серологического мониторинга в птицеводстве, основанная на методологии ИФА с применением отечественных диагностических наборов, сертифицированного оборудования, реагентов и компьютерной программы, которая обеспечивает получение надежных данных об иммунном статусе птицепоголовья.
Проведена сравнительная оценка чувствительности и специфичности реакций по результатам, полученным с помощью разработанных тест-систем на основе ИФА, базовых реакций (РДП, РТГА) и коммерческих наборов зарубежных производителей, зарегистрированных на территории РФ.
Определена диагностическая значимость результатов, полученных с применением разработанных тест-систем на основе ИФА при оценке трансовариального иммунитета, изучении динамики накопления антител после применения живых и инактивированных вакцин в промышленном птицеводстве.
Разработана и сертифицирована компьютерная программа регистрации, анализа и хранения результатов для работы с отечественными и зарубежными иммуноферментными коммерческими наборами ведущих фирм-производителей.
Утверждена научно-техническая документация и регламент для опытно-промышленного производства коммерческих наборов в двух вариантах: при визуальной детекции и инструментальном учете с применением программного обеспечения.
Качество лабораторных исследований с применением коммерческих наборов для ИФА на основе разработанных тест-систем подтверждено результатами международных сравнительных испытаний, проведенных аккредитованной лабораторией (СО, Голландия) в 2006-2008 гг. при тестировании зашифрованных проб сывороток с разным уровнем антител к НБ, ГП, ИБК, ИББ, МГ и МС.
Научная новизна исследований подтверждена 3 патентами на наборы и свидетельством на компьютерную программу «СИНКО-ИФА», зарегистрированную в Российском агенстве по патентам и товарным знакам.
Практическая значимость. Методики, разработанные в ходе научно-исследовательских работ по теме диссертации, включены в два сборника: "Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом" (1998 г.) и "Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием серологических реакций" (2008 г.), утвержденные Россельхознадзором в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.
Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные документы по изготовлению и контролю 16 наборов для ИФА, утвержденных
Россельхознадзором МСХ РФ: наборы для определения антител к вирусу ныокаслской болезни иммуноферментным методом (СТО 00495527-00542006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0043-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом (СТО 00495527-0055-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0042-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом (СТО 00495527-0057-2006 от 29.12.2006) и при тестировании в одном разведении (СТО 00495527-0044-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к реовирусу птиц иммуноферментным методом (СТО 00495527-0045-2006 от 21.11.2008) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-133-00495527-2005 от 15.02.2006); наборы для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости кур иммуноферментным методом (СТО 00495527-0056-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0041-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к вирусу инфекционного энцефаломиелита птиц иммуноферментным методом (СТО 00495527-00382006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-117-00495527-2005 от 30.05.2006); наборы для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза (Mycoplasma gallisepticum) иммуноферментным методом (СТО 00495527-0109-2009 от 31.03.2009) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0111-2009 от 31.03.2009); набор для определения антител к Mycoplasma synoviae иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0034-2006 от 29.12.2006); набор для определения антител к вирусу гриппа птиц иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0086-2008 от 09.12.2008).
На базе ФГУ «ВНИИЗЖ» внедрена разработанная технология производства коммерческих наборов для ИФА в промышленном масштабе с применением автоматизированных роботизированных устройств. В течение с 1997 по 2009 г.г. было произведено около 21000 наборов для визуальной детекции и свыше 8000 наборов для исследований проб в одном разведении (СИНКО), которые использовались в региональных, областных ветеринарных лабораториях и на птицефабриках.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 81 научная работа, в том числе 22 - в изданиях, рекомендованных в перечне ВАК РФ.
Апробация работы. Основные материалы исследований по теме диссертации опубликованы, доложены и обсуждены: на конференциях, проводимых в ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 1995, 1997-2000, 2003, 2008); на международной конференции «Птицеводство — мировой и отечественный опыт», Москва, 2002; на Всероссийском совещании-семинаре директоров ветлабораторий - субъектов РФ «Совершенствование ветеринарной лабораторно-диагностической работы в Российской Федерации», Брянск, 2004; международных ветеринарных конгрессах по птицеводству, Москва, 2005, 2006; на международных научных конференциях и конгрессах в Российской Федерации (Москва, 2001; Казань, 2005; Покров, 1999, 2000; Новосибирск, 2008), в Украине (Харьков, 2001-2003, 2006-2008; Крым, 20062008), Казахстане (Алматы, 2000), Республике Беларусь (Минск, 2000; Витебск, 2001), Марокко (Маракеш, 2009), Австрии (Вена, 2009), на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 1995-2009 гг.
Основные положения, выносимые на защиту:
-разработка иммуноферментных тест-систем для выявления и количественного определения антител к возбудителям девяти экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ и МС) при исследовании проб сывороток крови в одном разведении;
-результаты определения корреляционной зависимости при сравнении данных, полученных с использованием разработанных тест-систем, базовых тестов и коммерческих наборов зарубежного производства;
-программное обеспечение для учета, обработки и хранения результатов анализа «СИНКО-ИФА»;
-результаты исследований сывороток крови кур с применением разработанных наборов для ИФА при ретроспективной диагностике заболеваний и оценке поствакцинального иммунитета после применения живых и инактивированных вакцин в птицехозяйствах РФ в 1995-2008 гг.;
-результаты лабораторных исследований в международных сравнительных испытаниях, проведенных аккредитованной лабораторией (GD, Голландия) в 2006-2008 гг.;
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 322 страницах, иллюстрирована 55 таблицами и 41 рисунками. Список цитируемой литературы включает 363 источников, из них 311 иностранных.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 1993-2009 гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (до 2003 г. Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных, г. Владимир).
Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании, проведении и анализе экспериментов. Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность: научному консультанту д.б.н., профессору Дрыгину В.В., д.в.н., профессору A.B. Борисову, д.в.н., профессору В.В. Борисову, д.в.н. Ирзе В.Н., к.в.н. Старову В.В., д.б.н. Пономареву А.П., к.б.н. Волковой М.А., к.б.н. Руниной И.А., к.б.н. Луговской H.H., к.в.н. Манину Т.Б., к.б.н. Оковытой Т.В., к.б.н. Куприянову, к.б.н. Меньщиковой А.Э., к.б.н. Колосову С.Н., к.б.н. Циванюк М.А, Зинковскому Ю.В., Хитровой JI. Б. и всем сотрудникам ФГУ «ВНИИЗЖ», участвовавшим в проведении отдельных этапов работы и оказывавших консультативную помощь.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.2. Общая характеристика (морфология, структура, химический состав, клинические признаки, иммунитет) возбудителей инфекционных заболеваний кур
Общая характеристика вируса ныокаслской болезни
Ньюкаслская болезнь (НБ)- высококонтагиозное вирусное заболевание птиц, главным образом куриных, характеризующееся поражением органов дыхательного и пищеварительного трактов, центральной нервной системы. Первые вспышки ньюкаслской болезни были зарегистрированы в 1926 году на о.Ява (Индонезия) и в Англии (г.Ньюкасл), в настоящее время НБ широко распространена во многих странах Евразии, Африки и Америки [63, 64, 65, 293]. По данным Международного эпизоотического бюро только начиная с июня 2008 года по июнь 2009 были зарегистрированы вспышки в 87 странах мира [OIE, www.oie.intl, в том числе и в России.
В 60- ые годы эпизоотическая ситуация по ньюкаслской болезни в нашей стране характеризовалась увеличением количества неблагополучных пунктов с пиком заболеваемости в 1970-1971 гг. (более 400 вспышек). При этом заметно увеличилось количество хозяйств с бессимптомным течением НБ на привитом поголовье и проявлением чрезвычайно высоких титров специфических антител, снижением сохранности и продуктивности [36, 265].
Источником инфекции является больная птица. Резервуаром возбудителя служит домашняя птица других видов, а также дикие, синантропные и экзотические птицы [14,63]. Заражение происходит при контакте больной птицы со здоровой, а также опосредованно через воздух, воду, корм, перо, пух, одежду спецперсонала и т.п. [43].
Клинические признаки нъюкаслской болезни и патологоанатомические изменения. Ньюкаслская болезнь осложняется тем, что разнообразные изоляты и штаммы вируса могут индуцировать большое количество форм заболевания. Существует 5 форм болезни на основе клинических признаков у кур: висцеротропная велогенная, нейротропно-велогенная ньюкаслская болезнь, ньюкаслская болезнь, вызываемая мезогенными штаммами, лентогенными штаммами, которые обычно используются как живые вакцины и бессимптомная форма [239], главным образом, в виде кишечных инфекций без проявления болезни.
Как и клинические признаки, патологоанатомические изменения и их локализация по органам птиц, инфицированных ВНБ, зависят от штамма вируса, от хозяина и всех других факторов, которые могут воздействовать на тяжесть заболевания [53, 239].
Классификация и строение птичьих парамиксоеирусов. Вирус НБ (РМУ-1) относится к роду ЯиЬикупиз семейства Рагатухоутс1ае и по своему строению является классическим птичьим парамиксовирусом.Члены семейства Рагатухоут<Зае- РНК- содержащие вирусы со спиралевидной симметрией капсида с несегментированным одноцепочечным геномом негативной полярности. Они имеют оболочку, которая образуется из модифицированной клеточной мембраны по мере проникновения вируса через клеточную поверхность, после сбора капсида в цитоплазме [8].
Внешне вирус почти сферический, но часто встречается полиморфные формы. Размер сферических форм от 150 до 300 нм, нитевидных до 1000 нм. В двухслойной, содержащей липиды оболочке (толщина 10-15 нм), размещены 2 различные макромолекулы: гликопротеин гемагглютинин нейраминидазы (НИ) и гликопротеин слияния (Б) [255]. Гемагглютинин осуществляет прикрепление вириона к рецепторам клетки хозяина, содержащих нейраминовую (сиаловую) кислоту, а нейраминидаза разрушает рецепторы и тем самым помогает элюции вируса в процессе отпочковывания от клетки-хозяина. Б-белок осуществляет слияние с клеточной мембраной и несет ответственность за гемолиз и проникновение вируса в клетку [8,9]. Посттрансляционное расщепление белка предшественника БО на и Б2 осуществляется клеточными ферментами. Наличие дополнительных основных аминокислот на участке, кодирующем сайт разрезания белка Б, позволяет вирулентным штаммам вируса НБ пройти данное расщепление в присутствии широкого диапазона ферментов, тогда как для лентогенных изолятов требуются только трипсиноподобные протеазы [159]. Данное свойство широко используется для характеристики степени патогенности изолятов вируса ньюкаслской болезни [10, 11, 161, 162, 334].
Внутри вириона находится однонитевая, линейная, спиральная РНК диаметром 17-18 нм и длиной 1 мкм. Она содержит генетическую информацию для 6 структурных протеинов [196, 290, 359].
В окружающей среде вирус нестабилен, инактивация инфекционных свойств происходит при нагревании до 56-60°С (30-120 мин.); рН 3; при прямом попадании солнечных лучей (максимально 30 мин.); при применении альдегидов, поверхностно-активных веществ, полиаминов, соединений хлора, спиртов, фенолов, органических кислот, препаратов, расщепляющих кислород, йодоформа [45].
Иммунитет и специфическая профилактика. Способность ВНБ и других птичьих парамиксовирусов гемагглютинировать эритроциты связана с феноменом образования комплекса между НЫ протеином и рецепторами на поверхности эритроцитов. Эта особенность и специфическая ингибиция агглютинации антисыворотками имеет большое значение в диагностике заболевания.
В сыворотке крови птиц антитела появляются на 6-10 день после заражения, а их наивысший титр наблюдается на 3-4 неделю [43]. Естественно переболевшая или вакцинированная птица приобретает иммунитет, продолжительность которого зависит от возраста птицы, биологических свойств вируса и метода введения его в организм [43]. Так как титр антител, определенный в реакции нейтрализации (РН) сопоставим с титрами в РТГА, последняя реакция часто использовалась для оценки защитного ответа, особенно после вакцинаций [67]. Антитела, направленные против одного из двух функциональных поверхностных гликопротеидов- ЫМ и Б полипептидов, могут нейтрализовать вирус НБ, тем самым, вызывая защиту против инфекции [247, 294, 295, 296]. Несушки с антителами к вирусу НБ передают пассивный иммунитет цыплятам через яичный желток [63, 67]. Материнский иммунитет является защитным, и таким образом должен приниматься во внимание при разработке графика вакцинации цыплят.
Эпизоотическое благополучие птицеводческих хозяйств обеспечивается за счёт применения вакцин. В идеале, вакцинация против НБ должна приводить к иммунитету против заражения и размножения вируса. Реально, птица защищена от проявления клинических признаков болезни, но не от репликации вируса и его распространения [271, 272, 282, 283].
Живые вакцины против ВНБ делятся на две группы - лентогенные и мезогенные; последние по настоящему пригодны только для вторичной вакцинации птиц по причине своей высокой вирулентности. В первую группу относятся такие штаммы как Ла-Сота, Бор-74, Бор-82, Р, В1, У4, во вторую- Н, Мик^еБхуаг, Кошагоу, Лоакт. Главное преимущество живых вакцин в том, что они создают напряжённый иммунитет в сжатые сроки, а также применяются массовыми методами. Одним из самых широко распространённых способов вакцинации является выпойка [63, 269].
Преимуществами инактивированных вакцин являются: очень низкий уровень побочных реакций у вакцинированной птицы; возможность использования в ситуации, непригодной для применения живых вакцин, особенно при наличии коинфекций; возможность достижения очень высоких защитных титров антител на длительное время. На инактивированные масляно- эмульсионные вакцины не оказывает значительного влияния материнский иммунитет и они могут быть использованы на однодневных цыплятах и взрослой птице независимо от иммунного фона [67]. К недостаткам инактивированных вакцин можно отнести их дороговизну в производстве и трудоёмкость при применении. В Российской Федерации иг странах СНГ меры борьбы с НБ основаны на комплексном применении живых и инактивированных вакцин. При этом в последнее время наблюдается тенденция отказа от применения вакцинных препаратов по жёстким схемам и переход на корректировку сроков иммунизации в зависимости от результатов серологических исследований.
Общая характеристика вируса гриппа птиц
Грипп птиц (ГП) - заболевание, известное также под названием классическая чума птиц, вызывается вирусами, относящимися к семейству ОЛотухоушёае, типу А. Наиболее восприимчивыми к вирусу гриппа являются куры и индейки. Патогенность вирусов гриппа птиц в значительной степени варьирует в зависимости от подтипа, зависит от генетической принадлежности вируса и вида хозяина. Вирусы гриппа всех подтипов широко распространены среди диких водных птиц. [134, 135, 274, 313, 314, 342].
Высокопатогенный грипп птиц (ВПГП) подтипов Н5 и Н7 наносит громадный экономический ущерб промышленному птицеводству [41, 42]. Считается, что эти два подтипа вируса гриппа птиц представляют опасность, даже если их инфекция у домашней птицы протекает бессимптомно или в легкой форме. [60, 61, 230]. На протяжении последних десяти лет ситуация по гриппу птиц в мире значительно осложнилась. Значительные экономические потери имели место в промышленном птицеводстве различных стран. Так в 2005 г. потери в сельскохозяйственном секторе стран Азии оценивались приблизительно в 10 млрд. долларов. Впервые вспышки гриппа птиц H5N1 были зарегистрированы в России в июле 2005 г. в Новосибирской области. По данным Россельхознадзора с 2005 г. по 2008 г., было зарегистрировано 179 очагов заболевания гриппом птиц H5N1 в 20 субъектах Российской Федерации и суммарные потери в птицеводстве составили более 2,8 млн. птиц.
Вирусы гриппа типа А разделены на подтипы, основанные на антигенном родстве поверхностных гликопротеинов, гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). В настоящее время существует 16 НА подтипов (HIHI 6) и девять подтипов NA (N1-N9). Вирусы гриппа поражают различные виды птиц [59,113, 135, 235, 278, 298, 331,334], включая диких, домашних и декоративных и были выделены от представителей большинства семейств диких птиц во всем мире. По последним данным вирус был выделен от 105 видов диких птиц, относящихся к 26 семействам [298, 275, 339].
Механизм передачи вирусов гриппа от одной птицы к другой и способность вызывать инфекцию еще не достаточно хорошо изучены. В результате ряда экспериментов для оценки путей передачи вирусов НПГП и ВПГП среди домашней птицы было выяснено, что эти механизмы чрезвычайно сложны и зависят от штамма вируса, вида птицы, и экологических факторов [235, 264, 146, 335, 279, 349].
Морфология, структура, химический состав Популяция представлена главным образом сферическими структурами диаметром 80-120 нм (Болезни,2003). Однако нередко встречаются нитевидные формы с тем же диаметром и различной длиной [5]. Молекулярная масса вирионов составляет 270Т06-290-106 дальтон [5, 45]. Нуклеокапсид вириона - спирально организованный рибонуклеопротеид, состоящий из однонитчатой РНК в комплексе с белком и содержащий также минорные белковые компоненты (РВ1, РВ2 и РА). На поверхности вирусной частицы расположены шиловидные отростки (гемагглютинин и нейраминидаза), погруженные в двойной липидный слой. Между билипидной оболочкой и нуклеокапсидом расположен матриксный белок [5, 22].
Вирнонная РНК представлена 8 фрагментами [21, 22] с молекулярными массами от 3-Ю5 до МО6 дальтон, составляющими в сумме 4,9-106 дальтон [21, 22]. В общей сложности геном вируса гриппа содержит информацию для синтеза 10 белков [22, 28].
Гемагглютинин - один из двух поверхностных гликопротеидов вируса гриппа, составляющий 30-34% массы всех белков вириона. Посттрансляционное расщепление его на 2 фрагмента: НА1 (тяжелая цепь) и
•Э <7
НА2 (легкая цепь) с молекулярными массами 46-10 -47-10 и 28-10 -29-10 дальтон соответственно, осуществляется клеточными протеазами [46, 93]. Расщепление гемагглютинина необходимо для инициации инфекции [45]. Второй гликопротеид - нейраминидаза, является высокоспецифичным ферментом, расщепляющим гликозидную связь N-концевого остатка ацетилнейраминовой кислоты с остальной частью рецептора. Функционирование нейраминидазы необходимо для освобождения вирусных частиц из инфицированной клетки [26, 62, 164], предотвращения их агломерации и, возможно, для эффективного расщепления гемагглютинина [62].
Белки полимеразного комплекса: РВ1, РВ2 и РВА (молекулярная масса - от 84-10 до 96-10 дальтон) составляют 1,1-2,2% массы всех полипептидов вириона. Вероятно, белки РВ1 и РА вовлечены в синтез комплиментарной, а РВ2 - вирионной РНК [93]. о
Белок NP с молекулярной массой 55-10 дальтон [гп35], составляющей до 20% массы белков, является структурной основой рибонуклепротеида. Он участвует в репликации вируса [93].
До 35% массы всех белков вирусной частицы приходится на долю о матриксного белка М1. Его молекулярная масса - 28-10 дальтон [93]. Этот полипептид играет основную роль в поддержании структуры вириона. Неструктурные вирусспецифические белки NS1 и NS2 с молекулярными массами 11-103 и 25-Ю3 дальтон [124], вероятно, входят в состав репликативного комплекса и/или участвуют в регуляции белкового синтеза [124, 261]. Эти белки можно выявить в инфицированной клетке, a NS1 связан с включениями в цитоплазму [93]. Наибольшей чувствительностью для действия вируса обладают клетки органов дыхательной и пищеварительной систем. Впоследствии вирус может распространяться по всему организму и поражать поджелудочную железу, почки, сердце и мозг. В течение адсорбционной фазы НА связывается с гликопротеиновыми рецепторами, содержащими сиаловую кислоту на поверхности клетки. Гемагглютинин вируса постоянно видоизменяется, что позволяет ему связываться с различными типами сиаловой кислоты, продуцируемой клетками людей и птиц [218].
Вирусы низкопатогенного гриппа птиц (НПГП) кур и индюков подтипов Н5 и Н7, без принятия соответствующих мер по ликвидации инфекции, в конечном счете, меняли свои свойства и становились высокопатогенными (штат Пенсильвания, США, 1982-83; Мексика, 1994; Италия, 1999-2000). Изменение патогенности вируса связанно с приобретением дополнительных основных аминокислот на сайте разрезания гемагглютинина [299]. В лабораторных условиях после проведения 24 пассажей в цыплятах был получен вирус ВПГП из вируса НПГП подтипа Н5, выделенного от водоплавающей птицы. Установлено, что низкопатогенные вирусы гриппа птиц на сайте разрезания НАО имеют одну основную аминокислоту - аргинин, в то время как вирусы ВПГП имеют несколько основных аминокислот (аргинин и лизин), расположенных недалеко от сайта нарезания и способных расщепляться обычными протеазами [342].
Вирус гриппа может оставаться инфекционным в воде озера в течение 4 дней при 22°С и более 30 дней при 0°С. При температуре 55°С вирус ГП инактивируется за 1 ч, при 60°С - за 10 мин, при 65-75°С - за 2-5 мин. При низких температурах и в лиофилизирванном состоянии (при минус 30°С в запаянных ампулах в темном месте) сохраняется до 2-х лет.
Гемагглютинирующая и инфекционная активности вируса обычно сохраняются при минус 60°С несколько лет, а при 4°С — несколько недель. [45].
Антигенная вариабельность Вирусам гриппа свойственна необычайно высокая частота рекомбинаций (до 25—32% общего урожая смешанной популяции) и высокая пластичность, что выражается как в их способности к адаптации, так и к естественной изменчивости [274]. Изменения могут происходить двумя способами — дрейфом и шифтом. Антигенный дрейф приводит к незначительным антигенным изменениям в НА и/или ЫА. Антигенный шифт несет ответственность за основные антигенные изменения в НА и/или ЫА.При антигенном дрейфе происходят точечные мутации в генах, несущих информацию о белках НА и/или ЫА. Он ответственен за выбор новых вариантов в иммунной популяции. Антигенный дрейф ярче всего проявляется среди вирусов гриппа человека. Однако известно, что это возможно также и для штаммов птиц. [43].
Патогенез и патоморфологические изменения Вирусы Н5Ш могут проникать в организм хозяина аэрозольно через органы дыхательной системы или орально-фекальным путем через пищеварительный тракт [230]. Продолжительность инкубационного периода болезни обычно составляет от суток до трех недель [45]. Птицы, зараженные вирусом гриппа, показывают разнообразие клинических признаков, которые могут включать в себя изменения в функционировании дыхательной, пищеварительной, репродуктивной, или нервные систем. Пораженные вирусами гриппа птицы могут иметь один или комплекс клинических признаков. В некоторых случаях инфекции вирусами ВПГП, заболевание может быть настолько острым, что птицы находят мертвыми без каких-либо видимых клинических признаков. [20].
Эпизоотологические данные. Филогенетические исследования вирусов ГП, выделенных от домашних или диких птиц показали, что различное происхождение основано на географии, а не на времени появления или виде хозяина. Например, вирусы подтипа Н7 делятся на американские, евразийские, австралийские изоляты, а также вирусы лошадей подтипа Н7 [235]. Сходные данные были получены для вирусов ГП подтипа Н5 [264]. Частота, с которой вирусы НПГП или ВПГП появляются и распространяются среди домашней птицы, зависит от уровня биобезопасности и концентрации домашней птицы вблизи первичных вспышек. Хотя водоплавающая птица и другие дикие птицы в большинстве случаев, прямо или косвенно, ответственны за распространение гриппа среди домашней птицы, не исключены также и другие способы передачи.
Иммунитет, лечение и профилактика Так же как и вакцинация, заражение вирусами ГП стимулирует гуморальный иммунный ответ и приводит к выработке антител на системном и мукозальном уровнях [149, 269]. Интенсивность гуморального иммунного ответа варьирует в зависимости от вида птицы. Количество антител к вирусу ГП уменьшается у разных видов птиц в следующем порядке: куры, фазаны; индейки; перепела; утки.
Антитела против поверхностных белков являются нейтрализующими и протективными. Защита, прежде всего, связана с антителами к гемагглютинину. Однако антитела к нейраминидазе также снижают проявление клинических признаков и соответственно уровень смертности после заражения вирусами ВПГП, имеющими гомологичный ИА подтип. Продолжительность иммунитета вариабельна и зависит от многих факторов.
Хотя и считается, что вакцинация является наиболее эффективной профилактической мерой для контроля инфекции гриппа, развитые страны должны стремиться к уничтожению вспышек вируса ГП без использования вакцин. В настоящее время наибольшее распространение получили инактивированные вакцины. Как правило цельновирионную вакцину получают из инактивированной формальдегидом или (З-пропиолактоном аллантоисной жидкости зараженных вирусом гриппа куриных эмбрионов. Для получения субъединичной или сплит-вакцины очищенный вирус обрабатывают эфиром или детергентом. Иммунизацию инактивированными вакцинами проводят внутримышечно или подкожно. При разработке вакцин [134], использующих методы генной инженерии, учитывали, что патогенность вирусов гриппа в первую очередь определяется способностью разрезания гемагглютинина.
Живые гриппозные вакцины вызывают системный и местный мукозальный иммунный ответ, включающий в себя выработку секреторного иммуноглобулина A (IgA) в дыхательных путях, которые являются основным порталом для проникновения вируса в организм. Они также ответственны за выработку клеточного иммунитета, который осуществляет лучшую защиту по сравнению с инактивированными вакцинами. Живые аттенуированные вакцины осуществляют более широкую защиту против . вирусов, подвергшихся антигенному дрейфу. В настоящее время использование при пандемиях живых гриппозных вакцин ограничено возможностями производства. Недавно были разработаны аденовирусные векторные вакцины Н5 с низким уровнем репликации, имеющие хорошие гемагглютининспецифичный гуморальный и клеточный иммунные ответы, дающие протективный эффект при заражении гомологичным и антигенно отличным штаммами H5N1 у мышей и у цыплят [149, 173].
Без сомнения, при правильном использовании, в комплексе с другими мерами, такими как повышение биобезопасности, отказ от применения вакцин может быть мощным инструментом в уничтожении инфекции ГП. Существует опасность, что некачественная вакцинация может привести к уменьшению проявлений болезни, не затрагивая передачу, приводя к появлению эндемичных вирусов. В Мексике вирус ВПГП был уничтожен, но вирус НПГП H5N2 продолжал циркулировать, несмотря на использование более чем 3 миллиардов доз вакцины. Через 10 лет у вируса наблюдали значительные антигенные отличия от исходного и вакцинного штаммов вируса [214]. В Пакистане в 2004г. все еще выделяли вирусы ВПГП H7N3 генетически близкие к исходному вирусу ВПГП [98, 99, 262, 263].
Общие характеристика вируса инфекционной бурсальной болезни
Инфекционная бурсальная болезнь (инфекционный бурсит, болезнь Гамборо) - широко распространенное высококонтагиозное заболевание, поражающее цыплят в возрасте 2-22 недельного возраста [43, 311]. Инфекционное заболевание с признаками поражения фабрициевой сумки (клоакальной бурсы) и других органов впервые зарегистрированноу в 1957 г. в местечке Гамборо, штат Делавар, США, в дальнейшем было определено как "болезнь Гамборо" или "бурсальная болезнь" [43]. В начале 1960-х гг. инфекционная ' бурсальная болезнь (ИББ) регистрировалась во многих птицеводческих хозяйствах США и Англии. В 1972 г. для вируса ИББ было показано характерное свойство - способность вызывать у инфицированной птицы иммунодепрессию, что обусловило особое внимание к этой болезни [68]. К середине 1970-х гг. диагноз на ИББ был подтвержден в большинстве стран с развитым птицеводством, включая Австралию [211].
В связи с созданием достаточно эффективных препаратов специфической профилактики [156, 158, 167, 327]. к настоящему времени ИББ не проявляется в виде эпизоотии. Однако, во всех хозяйствах, где ранее был поставлен положительный диагноз на ИББ постоянно осуществляется вакцинация.
Возбудителем ИББ является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Birnaviridae роду Avibirnavirus, который не обладает внешней липопротеидной оболочкой, имеет икосаэдрический капсид диаметром около 50 нм, состоящим примерно из 132 белковых морфологических субъединиц [108, 122]. Геном вируса представлен двумя сегментами (А и В) двуцепочечной РНК, которая составляет 9-10% от веса вирусной частицы. Размеры сегментов - 3129 и 2795 пар нуклеотидов для А и В, соответственно [122].
Структура вириона включает четыре полипептида: Vpl (94 кДа), который является РНК-зависимой РНК-полимеразой; основной структурный белок Ур2 (54 кДа), содержащий эпитопы для вируснейтрализующих антител; структурный белок УрЗ (30 кДа), несущий группо-специфические антигены, и Ур4 (29 кДа), который является вирусной протеазой. Кроме того, имеются сообщения о положительно заряженном минорном полипептиде Ур5 с неизвестной функцией [122, 259, 260]. о
Молекулярная масса вириона составляет 55x10 кДа, плавучая плотность полных вирионов в градиенте хлористого цезия - 1, 33 г/см [259]. Вирус ИББ достаточно термостабилен и не инактивируется при 60°С в течение 30 мин; при 25°С сохраняет активность в течение 21 дня; устойчив в диапазоне рН от 3 до 9; устойчив к хлороформу, не изменяет инфекционных свойств при воздействии 0,5% раствора формалина в течение 6 часов [43].
Для вируса ИББ установлены два серотипа (I и II), внутри которых идентифицировано определенное число субтиповых антигенных вариаций [183, 185]. Считается, что антигенные свойства вируса в основном определяются полипептидом УР2 [238].
Большинство природных изолятов, выделенных от цыплят, отнесено к серотипу I, изоляты выделенные от индеек, классифицированы как серотип II [186]. В ИФА и иммунофлуоресцентном тесте для серотипов вируса ИББ показано наличие общих антигенов [183, 186], которое, однако, не подтверждается, ни в реакции нейтрализации, ни в иммунологическом исследовании при перекрестном испытании на цыплятах [82].
Патогенез и клинические признаки болезни. Вероятно, что в естественных условиях инфекционная бурсальная болезнь, в основном, передается алиментарным путем. Мишенью вируса являются В-лимфоциты, на поверхности которых находятся иммуноглобулины класса М и макрофаги [227], поэтому, наиболее характерные патологические изменения происходят в фабрициевой сумке. В итоге происходит дистрофия фабрициевой сумки и потеря главной ее функции - воспроизводства иммунокомпетентных клеток. Некроз лимфоидных клеток, несколько меньшей степени, отмечен в селезенке, тимусе, гардеровой железе и др. органах [43].
Клинические признаки болезни проявляются через 2-3 дня после заражения. В инфицированном стаде наблюдают: угнетение птиц, отказ от корма, диарею, загрязнение и взъерошенность перьев, а затем, в более поздней стадии - нарушение координации движений. Больные птицы имеют пониженную температуру тела [227]. Типичная клиническая форма заболевания наблюдается у птиц в возрасте 3-6 недель. С увеличением возраста восприимчивость к заболеванию снижается [43].
Птицы, перенесшие инфекцию в субклинической форме, приобретают иммунодепрессию, которая выражается в снижении гуморального и клеточного иммунитета, что, в конечном счете, ведет к возрастанию заболеваемости птиц гепатитом кокцидиозом, болезнью Марека, геморрагической анемией и гангренозным дерматитом, инфекционным ларинготрахеитом, инфекционным бронхитом, сальмонеллезом и колибактериозом [288, 346].
Эпизоотология. Заболеванию подвержены куры всех пород. Однако ? отмечено, что птицы яйценоских пород более чувствительны к заражению, чем породы мясного направления. Например, цыплята кросса Белый леггорн переболевают особенно тяжело с высоким летальным исходом [250]. Болезнь проявляется внезапно, охватывая практически все восприимчивое поголовье. При клинической форме заболевания летальность может достигать 20-30% [227], а некоторые высоковирулентные штаммы вызывают и 90% отход птиц [104, 145, 311, 317].
Иммунитет и специфическая профилактика. Естественное заражение, переболевание или вакцинация, как живой, так и инактивированной вакциной обуславливает выработку у птиц активного иммунитета. Вирус ИББ обладает высокой антигенностью [43]: полипептид УР2 индуцирует вируснейтрализующие антитела, обеспечивающие эффективную защиту организма от инфекции вирулентного агента [187, 227].
Установлена трансовариальная передача материнских антител против вируса ИББ. Поэтому одним из наиболее рациональных подходов для защиты цыплят от заболевания в раннем возрасте является создание у молодняка высокого уровня пассивного иммунитета путем вакцинации кур-несушек. [92, 304, 312, 329, 243]. В настоящее время признано, что наиболее надежным направлением в ликвидации инфекционной бурсальной болезни является комплексное применение живых и инактивированных вакцин. Как правило, инактивированными вакцинами иммунизируют птиц в возрасте 110-120 дней, у которой уже присутствует определенный уровень гуморального иммунитета, приобретенного после применения живых вакцин [2, 43]. Инактивированная вакцина при внутримышечном введении позволяет получить у птиц родительского поголовья высокий и довольно однородный уровень антител с длительным сроком циркуляции [2,43]. Установлено, что при вакцинации родительского поголовья у 80-100% цыплят в сыворотках крови присутствуют материнские антитела, которые способны защитить их от естественного и экспериментального заражения [43].
Общие характеристика вируса инфекционного бронхита кур
Инфекционный бронхит кур (ИБК) - острое респираторное, высококонтагиозное заболевание, вызываемое вирусом, относящимся к семейству Coronaviridae, который включает два рода: Coronavirus и Torovirus [102, 180]. Род Coronavirus объединяет в себе вместе с вирусом ИБК также коронавирусы индеек и, по крайней мере, девяти видов млекопитающих.
Впервые «новая респираторная болезнь цыплят» была выявлена в США в штате Северная Дакота в 1930 году. Schalk & Hawn в 1931 году описали клинические проявления заболевания и дали ему название инфекционного бронхита. Заболевание получило широкое распространение во всем мире [111, 132]. В США, начиная с 50-х годов, в добавление к уже известному типу Массачусетс были идентифицированы еще несколько серотипов [153]. В Европе с 1940 года выделяли штаммы типа Массачусетс, а также штаммы других серотипов, отличных от североамериканских [224]. Получено несколько изолятов нефропатогенных штаммов вируса ИБК в Австралии [297]. На территории бывшего Советского Союза ИБК впервые был зарегистрирован в 1982 году у цыплят, завезенных из Венгрии, когда из легких павших птиц выделили антигенно родственный серотипу Массачусетс вирус. В дальнейшем ИБК распространился и на другие бройлерные фабрики страны [13].
Инфекционный бронхит кур является источником проблем в промышленном птицеводстве, так как вызывает падеж птицы, особенно молодняка, снижение яйценоскости кур-несушек и ухудшение качества яиц.
Наибольшая смертность наблюдается у цыплят 1-30-дневного возраста, обычно в пределах 10-35%. При циркуляции нефропатогенных штаммов падеж составляет 57-70% от общего поголовья птицы [43, 180].
У кур старше 6 месяцев ИБК может вызывать длительное снижение яйценоскости на 30-80%, которая со временем восстанавливается, но не достигает прежнего уровня [43]. Куры, перенесшие заболевание в возрасте менее двух недель, в период половой зрелости не могут нестись нормально и становятся "ложными несушками". Яйца больных кур имеют мягкую тонкую или грубую деформированную скорлупу.
Морфология. Структура. Химический состав Вирион ИБК представляет собой плеоморфную частицу, обычно округлой формы, приблизительно 120 нм. Вирус инфекционного бронхита содержит одноцепочечную РНК положительной полярности, которая кодирует три структурных белка. Пепломерный "S" гликопротеин локализуется на поверхности вириона и состоит из двух субъединиц S1 и S2 с молекулярным весом 92К и 84К, соответственно. Мембранный "М" гликопротеин с молекулярным весом в пределах от 23К до 36К частично находится на поверхности вириона. Нуклеокапсидный "N" белок, фосфорилированный нуклеопротеин, имеет молекулярный вес 52К и размещается внутри вириона, окружая молекулу РНК [102, 316].
Гликопротеин выполняет несколько различных биологических функций. Эпитопы на белках 82 и N в одинаковой степени консервативны и поэтому дают перекрестную реакцию антител, в то время как эпитопы на белке гораздо менее консервативны [102]. Показано, что антитела на белки 81, 82 и N появляются одновременно и детектируются в иммуноферментном анализе (ИФА) через две недели после введения живой вакцины вируса ИБК, что также совпадает с появлением вируснейтрализующих антител. Белок 82 имеет участок на 1\Г-конце аминокислотной последовательности, который, по данным ЬепБ^а 1.А. е1 а1. (1989), является иммунодоминантным районом [215]. Коронавирусы прикрепляются к рецепторам клеток-мишеней своими пепломерами. При репликации вирионы отпочковываются от мембран шероховатого эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, при этом белки клетки-хозяина исключаются из вирионов и заменяются вирусными гликопротеинами. Вирусные частицы скапливаются в местах, недосягаемых для иммунной системы животного, чем объясняется длительная персистенция вируса в организме, обладающем иммунитетом.
Большинство штаммов инактивируются при 5б°С в течение 15 минут, при 45°С - в течение 90 минут. Лиофилизованные вируссодержащие аллантоисные жидкости в запаянных под вакуумом ампулах не теряли инфекционности в течение 30 лет [102]. Все штаммы вируса ИБК относительно устойчивы к кислой среде до рН 3.0 и чувствительны к щелочной среде с рН 11.0.
Классификация шталтов Наиболее распространено классифицирование вирусов по серотипам. Главный антигенный домен, определяющий серотип вируса, находится на субъединице 81 [102, 84]. Штаммы вируса ИБК, имеющие ограниченное число аминокислотных замен в белке 81, при проведении реакции серонейтрализации могут быть отнесены к различным серотипам. Показано, что точечные мутации могут приводить к возникновению новых полевых вариантов вируса ИБК [190]. Однако основным механизмом возникновения вариантных штаммов вируса ИБК является рекомбинация [207]. Этому может способствовать применение для вакцинации более чем одного штамма вируса, или совместная репликация вакцинного вируса и полевого [118].
К настоящему времени уже идентифицировано свыше 30 серотипов, которые условно можно разделить на три группы: американские, европейские, австралийские. К американским относятся такие серотипы, как Massachusetts, Connecticut, Iowa 97 и Iowa 609, Gray, Holte, SE 17, Arkansas, California, Florida, варианты a, b, с, d, e, f, Delaware, PP14. Европейские серотипы - A (Mass), В (D207), С (D212), D (D3128), Е (D3896), UK7918/67, UK/82, UK/84, UK/86, 793/B. Австралийские серотипы - A (Vac-1), В (Ql/76), С (N1/62), D (N9/74), E (Ql/73), F (V2/71), G (Vl/71), H (N1/75), I (N2/75), J (N3/62), К (Tl/82), L (N1/88), M (Q3/88), N (N25/87), О (V18/91) [7].
Однако исследование только антигена не устанавливает иммунологического родства между штаммами. Изоляты вируса ИБК, идентифицированные вирусной нейтрализацией, как принадлежащие к разным серотипам, могли вызывать частичную или полную перекрестную защиту [117, 118]. При вакцинации штаммом HI20 наблюдали 30000-кратное снижение титров вируса штамма Т, использованного для контрольного заражения, хотя вируснейтрализующий тест in vitro не определил серологического родства между этими штаммами [119].
Патогенез и эпизоотология заболевания Штаммы вируса ИБК обладают ярко выраженным тканевым тропизмом. Спектр воздействия вируса на организм птиц очень широкий и не ограничивается респираторным трактом. Верхние дыхательные пути - основное место размножения вируса ИБК, за которым следует виремия (попадание вируса в кровь), и вирус получает широкое распространение в других тканях [102, 119]. Вирус является, в основном, эпителиотропным.
Клиническими проявлениями ИБК при поражении респираторного тракта являются одышка, кашель, трахеальные хрипы, носовые выделения
Смертность обычно низкая и вызывается асфиксией, обусловленной блокированием нижней трахеи или бронхов пробками слизи [119].У несушек снижение яйценоскости, изменения в скорлупе и ухудшение качества яиц могут сопровождаться слабыми респираторными симптомами, иногда респираторная клиника отсутствует. Некоторые штаммы вызывают только изменения в окраске скорлупы. У кур, инфицированных вирусом ИБК штамма М41, вирусный антиген обнаруживался в эпителии яичников между 6 и 9 днями после заражения. [102].
Нефропатогенные штаммы вызывают первоначально респираторные симптомы с признаками почечных повреждений (повышенное потребление воды и жидкий помет). Несколько штаммов вируса ИБК изолированы из железистого желудка, двенадцатиперстной кишки, тонкого кишечника [84].
Распространение инфекции может происходить как горизонтальным, так и вертикальным путем. Основным источником инфекции служат больные и переболевшие цыплята и куры, которые выделяют вирус во внешнюю среду или остаются носителями до 49-105 дней после переболевания. Степень устойчивости и восприимчивости кур к вирусу инфекционного бронхита зависит от возраста птицы, пола, иммунного статуса, питания, окружающей среды и др. [69, 111]. Показано, что наиболее выраженный синергизм обнаруживается при совместном протекании ИБК и сопутствующих инфекций таких, как микоплазмоз, болезнь Ньюкасла, инфекционный ларинготрахеит кур, инфекционный колибактериоз [43].
Иммунитет и специфическая профилактика При переболевании ИБК и иммунизации развивается общий и тканевый иммунитет с соответствующим клеточным и гуморальным ответом. У птиц обнаруживается хороший гуморальный ответ на вирус ИБК, который можно оценить в ИФА, в реакции торможения гемагглютинации [115] уже на 4 день после заражения или в реакции нейтрализации вируса.
Вирусспецифические антитела осуществляют защиту эпителия трахеи после заражения, и, вероятно, предотвращают распространение вируса из трахеи к другим чувствительным органам таким, как почки и яичники. [160]. Специфические к вирусу ИБК IgA и IgG обнаруживаются в трахеальных смывах инфицированных кур [117]. Переболевшая птица устойчива к заражению гомологичным вирусом в течение 5-6 месяцев [119].
Для специфической профилактики применяют живые и инактивированные вакцины, особенно эффективны эмульгированные вакцины из концентрированного вируса. Терюханов А.Б. и др. установили, что введение инактивированной вакцины в 3 и 16-недельном возрасте давало такой же эффект, как и прививка живыми вакцинами Н120 (120 пассажей на куриных эмбрионах) и Н52 (52 пассажа на куриных эмбрионах). Наиболее выраженный иммунный ответ у 100% цыплят получали при вакцинации в 3-недельном возрасте живой вакциной орально или интраназально из штамма Н120, а в 16-недельном возрасте - инактивированной эмульгированной вакциной [47].
Однако, несмотря на широкое использование вакцин против инфекционного бронхита, вспышки заболевания описывали неоднократно, и выделяли штаммы вируса ИБК у вакцинированного поголовья [153, 343, 188]. Многие из этих полевых изолятов по антигенным свойствам отличаются от вакцинных штаммов. В последнее время в ряде стран широкое распространение получают вирусы ИБК, относящиеся к разным генотипам. Так голландские варианты вируса ИБК (D1466, D274) становились доминирующими в 80-е годы, UK793B (4/91) - в начале 90-х, итальянские штаммы (IT-02) - в конце прошлого века и начале этого, а в последнее время в странах Европы широко распространился вирус, относящийся к генотипу QX [326].
Вирусы, относящиеся к генотипу QX, вызывают патологические изменения в почках и были выявлены как от невакцинированных птиц, так и от вакцинированных [222]. Показано, что штаммы QX были выявлены в РФ на Дальнем Востоке еще в 2001 г. [87], затем вирус был обнаружен и в европейской части РФ. За последний год было выявлено 5 изолятов, относящихся к генотипу QX в Ивановской, Ростовской, Ульяновской областях и Краснодарском крае.В настоящее время нет никакой информации о происхождении QX вируса ИБК, и способах его распространения. Выявление вируса в разных географических зонах может быть объяснено распространением вируса дикими птицами [223].
Общие характеристика возбудителей респираторного микоплазмоза и микоплазмозного синовита
Респираторный микоплазмоз — инфекционная контагиозная болезнь птиц, вызываемая Mycoplasma gallisepticum (МГ) и характеризующаяся развитием хронического респираторного синдрома у кур. Микоплазмозный синовит - инфекционная болезнь птиц, вызываемая микроорганизмами Mycoplasma synoviae (МС) и характеризующаяся, преимущественно, развитием патологических изменений суставов и сухожильных влагалищ [25, 133]. Возбудители респираторного микоплазмоза и микоплазмозного синовита кур и индеек принадлежат к группе плевропнемниоподобных организмов (PPLO) [127, 133, 165].
Структурная организация микоплазм достаточно проста. Их клетки ограничены трехслойной цитоплазматической мембраной толщиной 10 нм по своей структуре напоминающей мембрану клеток эукариот. В цитоплазме имеется нуклеоид, дифференциально распределенный в виде нитей ДНК, рибосомы и иногда внутрицитоплазматические мембранные структуры. Геном микоплазм представлен примерно 750 тыс. нуклеотидных пар. М. gallisepticum и M.synoviae являются факультативными аэробами и культивируются на искусственных питательных средах, содержащих факторы роста, такие как холестерин, липопротеин и аминокислоты — аргинин, аспарагин, цистеин метионин и другие [76, 354]. На плотных питательных средах (1,3 % агара) микоплазмы образуют колонии с плотным врастающим в агар центром и нежной поверхностной периферией, похожие на яичницу-глазунью. Размеры варьируют от 50 до 500 мкм.
Многие наблюдения свидетельствуют об ограниченном количестве ферментов в клетках микоплазм, обуславливающем низкую биохимическую активность.
Микоплазмы чувствительны к температурам выше 39° С, но при минус 25° С они остаются жизнеспособными до 3-х лет, при минус 70° С до 10 лет [352]. Отношение микоплазм к антибиотикам определяется отсутствием у них клеточной стенки; они устойчивы ко всем препаратам, действие которых связано с биосинтетическими процессами белков клеточной стенки [25, 194].
Антигенная структура микоплазм является сложной. Например для M.gallisepticum по разным данным выявлено от двух до восьми серологических типов, из которых наиболее распространены Sö (вид M.gallisepticum) с выраженными антигенными свойствами и слабопатогенный С (вид Mycoplasma gallinarum) с низкой антигенной активностью, между которыми возможны переходные формы (вид Mycoplasma iners) [25, 352, 353]. Причем белки и липопротеины с молекулярной массой 60-70 кДа считаются иммунодоминантными адгезинами и гемагглютининами.
Внешние, или периферические антигены, многие из которых имеют белковую природу, высокоиммуногенны [73, 151, 233, 336]. Эти антигены определяют специфику иммунологического ответа и обуславливают в наибольшей степени серологическую внутри- и межвидовую гетерогенность микоплазм, свидетельствующую о том, что эти микроорганизмы активно эволюционируют. Наиболее иммуногенны поверхностные антигены, содержащие углеводы в составе сложных мембранных комплексов — гликолипидов, липогликанов, содержащих полисахариды, ковалентно связанные с липидами, и гликопротеинов, которые включают в себя фукозамин, гексозамин, галактозамин и глюкозамин. [128, 233].
Все микоплазмы в той или иной степени способны вызывать гемолиз эритроцитов за счет гемолизина. У М. gallisepticum и М. synoviae гемолизины относятся к перекисям, в отличие от бактерий, гемолизины которых являются белками или липидами [289, 336]. Однако не все серотипы микоплазм обладают гемолитическими свойствами.
Патогенностъ Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae В зависимости от вирулентности штаммов микоплазм, входных ворот инфекции, а также от условий содержания и резистентности организма птиц, развивается или латентная инфекция, или явное заболевание с поражением различных отделов органов дыхания и суставов (микоплазмозный синовит). Воспалительно-дистрофические изменения, возникающие на ранних стадиях развития микоплазменной инфекции в респираторных тканях (на 7-10 день после заражения) и характеризующиеся развитием в различных отделах органов дыхания экссудативных процессов, создают благоприятные условия для развития вторичной микрофлоры [281].
Трансовариальная передача микоплазм, по-видимому, также является результатом бактериемии, развивающейся в организме кур-несушек, хотя в данном случае нельзя полностью исключить возможность передачи микоплазм со спермой петуха [25].
Вакцинация птиц, больных респираторным микоплазмозом, против псевдочумы, инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита и оспы живыми вирусвакцинами, особенно через органы дыхания, провоцирует более тяжелое клинико-морфологическое проявление этой болезни. Для птиц, больных инфекционным синовитом, таким стресс-фактором является живая вирусвакцина против реовируса птиц [88].
Патогенез и патоморфологические изменения По клинико-морфологическим проявлениям заболевания, вызываемые микоплазмами сходны с заболеваниями, вызванными другими микроорганизмами: хламидиями, вирусами, грибами и с некоторыми другими инфекционными заболеваниями, имеющими полиэтиологическую природу [88]. Инкубационный период при естественном и искусственном заражении колеблется от 4 до 22 дней. Провоцирующее влияние стресс-факторов, таких как секундарные вирусные инфекции, отравления недоброкачественными кормами, инвазии, приводит к клиническому проявлению болезни с признаками общих расстройств - вялостью, депрессией, отсутствием аппетита [25].
Восприимчивы все возрастные группы. Заболевание сопровождается снижением аппетита, яйценоскости и привесов. В 2-3 месячном возрасте у кур наблюдаются первые признаки болезни, проявляющиеся, прежде всего в расстройстве функций органов дыхания. Появляются одышка, кашель, трахеальные хрипы, дыхание с открытым клювом, однако, ведущим признаком респираторного микоплазмоза, по мнению ряда авторов, является наличие аэросаккулита [25].
Для микоплазмозов характерно медленное распространение в стаде и хроническое течение, зачастую со стертой клинической картиной. Смертность среди бройлеров доходит до 20-30 %, у взрослых кур она бывает низкой. Однако в случае смешаных инфекций тяжесть заболевания усиливается и смертность может достигать 80 %.
Эпизоотология. Респираторный микоплазмоз и инфекционный синовит широко распространены в птицеводческих хозяйствах различных стран мира [43, 143]. Этому способствует высокая концентрация поголовья на ограниченной территории, что связано с использованием промышленной технологии в птицеводческих предприятиях и специализации их по производству мяса, яиц и выращиванию племенного молодняка. В патологии «перенаселения» важное место принадлежит инфекционным болезням органов дыхания.
Источником возбудителя респираторного микоплазмоза являются больные птицы и микоплазмоносители [25]. В неблагополучных пунктах при отсутствии клинических признаков заболевания серологическим методом с различными антигенами, обнаруживают до 77-100% позитивно реагирующих птиц. В распространении болезни основное значение имеет трансовариальный способ передачи. Ряд исследователей сообщает о влиянии условий содержания на проявление и течение микоплазмозов, например указывается на то, что в птицеводческих помещениях промышленного типа птица полностью изолирована от естественных условий обитания, поэтому соблюдение условий микроклимата служит необходимым фактором профилактики респираторных болезней. [139].
Проявлению инфекционного процесса, кроме неблагоприятных условий содержания, способствуют транспортировка птиц, перемещение внутри хозяйства, применение живых противовирусных вакцин против инфекционного ларинготрахеита, болезни Ньюкасла, бронхита кур, пастереллеза и влияние других факторов, ослабляющих естественную резистентность организма [5,58]. В свою очередь микоплазмоносительство является одной из основных причин недостаточной иммунологической реактивности птиц в ответ на вакцинацию против различных заболеваний.
Иммунитет, лечение и профилактика Микоплазмы могут вызывать локальную инфекцию. Однако нередко наблюдается диссеминация возбудителя в организме, что приводит к генерализации процесса и способствует хроническому рецидивирующему течению инфекции с длительным персистированием возбудителя в организме [107]. В этой связи следует уделять особое внимание бессимптомным и стертым формам, а также учитывать, что клиническое благополучие, наступающее после активной специфической терапии, часто не сопровождается гибелью возбудителя, а способствует переходу острой формы в латентную, затрудняющую индикацию возбудителя.
При естественных и экспериментальных микоплазменных инфекциях протективный иммунитет складывается из местных защитных реакций,а также генерализованного клеточного и гуморального иммунного ответа [136, 177]. Что касается гуморального иммунитета, необходимо отметить, что его уровень в значительной степени определяет степень резистентности птиц к микоплазменным инфекциям. Так у бурсэктомированных птиц уровень специфических антител к М. gallisepticum и М. яупогу1ае значительно ниже, чем у птиц с фабрициевой сумкой, главным лимфоидным органом Вгуморального иммунитета, и устойчивость к инфекции находятся в прямой зависимости от количества сохраненной лимфоидной ткани [177]. Клеточный иммунитет также играет важную роль в протективном иммунитете при заболеваниях микоплазменной этиологии, что подтверждается данными реакции бласттрансформации лимфоцитов. Микоплазмы индуцируют синтез антител всех классов, динамика накопления которых отслеживается с помощью серологических реакций. Существующие меры борьбы включают антибиотикотерапию, вакцинопрофилактику, искоренение инфекции путем уничтожения серопозитивных птиц [23, 352].
Наибольший эффект достигается при применении сульфаниламидных препаратов. Эффективность профилактики тилозином для контроля микоплазмозов у птиц была установлена более десяти лет назад [194]. Также широко используются для этих целей тилан и байтрил.
Для специфической профилактики заболевания применяют живые и инактивированные вакцины (бактерины) [336]. Достаточно широкое распространение живых вакцин в настоящее время связано с одной стороны с их способностью поддержания иммунитета на относительно высоком уровне при условии совместного содержания разновозрастной птицы, с другой стороны с их относительно невысокой стоимостью. Во многих странах используют • бактерины, содержащие инактивированную Mycoplasma gallisepticum в составе водно-масляной эмульсии или сорбированную на гидроокиси алюминия (ГОА) [25, 136].
Преимущество бактеринов перед живыми вакцинами заключается в их безвредности, а также в невозможности реверсии возбудителя. Наличие у вакцинированных птиц антител к М. gallisepticum не оказывает негативного влияния на эффективность бактеринов. Вакцинация не предупреждает инфекции, но купирует клиническое проявление заболевания, позволяет почти наполовину сократить потери от снижения яйценоскости и понизить степень вертикальной передачи возбудителя [23, 204].
Общая характеристика вируса синдрома снижения яйценоскости
Синдром снижения яйценоскости-76 (Egg drop Syndrome-76, литьё яиц, аденовирусная болезнь птиц) - вирусная болезнь кур-несушек, характеризующаяся размягчением, отсутствием или депигментацией скорлупы яиц и сопровождается значительным снижением яйценоскости. Болезнь, получившая название "синдром снижения яйценоскости"-76 (ССЯ-76), впервые описана голландскими учеными J.H.Van Eck et al. [131], которые выделили вирус в 1976 году. J.B.McFerran [241] впервые выделил вирус в Северной Ирландии из слизистой оболочки носовой полости и гортани кур, у которых отмечалось снижение яйцекладки. Изолированный им штамм вируса ССЯ-76 в настоящее время известен как штамм 127. В различное время в ряде стран были выделены штаммы вируса ССЯ-76 BC-14-в Великобритании, В8/78 в Венгрии, Е77-в Италии, 3877- во Франции JPA -1в Японии и некоторые другие. Все полученные изоляты оказались серологически полностью идентичны первому выделенному штамму 127.
В начале восьмидесятых годов были выявлены случаи ССЯ-76 в нашей стране, что было подтверждено обнаружением в крови переболевших птиц антигемагглютининов к вирусу ССЯ-76 [35,315].
ССЯ-76 чрезвычайно широко распространён в странах с высокоразвитой технологией промышленного птицеводства. В крупных птицеводческих хозяйствах ССЯ-76 наносит весьма существенный экономический ущерб. Потери складываются из недополучения яиц от несушек во время пика яйцекладки, снижения товарного качества коммерческих яиц и яиц, полученных от племенных несушек. В отдельных случаях экономические потери от ССЯ-76 составляли до 50 яиц на одну несушку за продуктивный период. Количество яиц с дефектами скорлупы может достигать 38-40% [131].
Основным источником возбудителя инфекции при ССЯ-76 являются больные куры. В естественных условиях резервуар возбудителя болезнидомашние и дикие утки всех пород [362, 363]. Было установлено, что 65100% проб сыворотки крови гусей с разных ферм Венгрии содержали антитела к вирусу ССЯ-76 [362]. При ССЯ-76 отмечена как горизонтальная, так и вертикальная передача возбудителя. Горизонтальное распространение ограничено и осуществляется контактным путём. Скорость распространения инфекции при этом зависит от трёх факторов: инфекционности вируса, степени его экскреции из заражённого организма и плотности размещения птицы [241]. Помимо горизонтального основным путём передачи инфекции является вертикальный- через яйца, снесённые инфицированными птицами [49,131,362,363].
Основной характерный клинический признак инфекции в стаде-снижение яйценоскости до 15% и выше [277], иногда этот процент достигал 30. Пик яйцекладки может задерживаться до 4-5 недель, восстанавливаться через 4-6 недель, но первоначального уровня уже не достигает. Указанные признаки сохраняются в неблагополучном стаде 2-12 недель [338].
Классификация и структура аденовирусов птиц В течение нескольких последних лет ряд авторов разделяли аденовирусы птиц на три группы (1,2 и 3), на основании иммунологических различий между представителями этих групп. Первая группа включает аденовирусы кур (БАУ 1-12) и аденовирусы, выделенные от ряда других видов птиц. Группа 2 включает вирусы болезни мраморной селезёнки фазанов и гемморагического энтерита индюков. В группу 3 выделяют единственный серотип, представленный вирусом ЕБ8-76 [49, 170].
Морфология и химический состав вируса ССЯ-76. По морфологии и физико-химическим свойствам вирус ССЯ-76 во многом сходен с аденовирусами птиц [208, 277, 330]. Аденовирусы лишены липопротеиновой оболочки, имеют форму икосаэдра диаметром от 65 до 80 нм [49]. От каждой из вершин икосаэдра отходит структурный компонент, называемый "фибер", чья длина варьирует у различных серотипов аденовирусов [270]. Белковая оболочка (капсид) состоит из 252 субъединиц (капсомеров), 240 из которыхгексоны и 12- пентоны [170]. Вирус ССЯ-76 имеет 13 структурных полипептидов, по крайней мере 7 из них были аналогичны полипептидам куриного аденовируса типа 1 [325,357]. Геном вируса ССЯ-76, представленный линейной двухцепочечной молекулой ДНК, имеет длину 34000 пар нуклеотидов и молекулярную массу (24"10бД), что значительно меньше ДНК птичьих аденовирусов (БАУ-1, БАУ-3, РАУ-4), имеющих мол. массу (28'106Д) [325, 356]. Тропизм аденовируса в большей степени зависит от фибера, поскольку он является белком, взаимодействующим со специфическим клеточным рецептором [225]. Данные электронной микроскопии вирионов и субвирусных компонентов (при негативном контрастировании) также подтверждают, что вирус ССЯ-76 не типичен для аденовирусов птиц [131, 240] Репликация и сборка осуществляются в ядре (синтез полипептидных цепей происходит в цитоплазме), а вирионы освобождаются в результате разрушения клетки.
Штаммы вируса ССЯ-76 отличаются от других 12 серотипов аденовирусов кур гемагглютинирующей активностью. Все штаммы этого вируса агглютинируют эритроциты кур, гусей, индеек и уток [131, 240,357]. Гемагглютинирующая активность вируса ССЯ-76 зависит от системы репродукции. Наибольший титр гемагглютинина выявлен в вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости утиных эмбрионов (1:4000) и как правило, все штаммы этого вируса, будучи выращеными в культуре клеток, имеют более низкий титр гемагглютининов [131], а в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов он исчезает совсем или очень низок. Гемагглютинин вируса ССЯ-76 инактивируется трипсином, мочевиной и пиридином [325].
Иммунитет и специфическая профилактика Цыплята, выведенные от серопозитивных родителей, до 4-нед. возраста содержали материнские антитела, период полураспада которых составлял 3 дня. От таких цыплят, как правило, не удается изолировать вирус, и в ответ на заражение их вирусом ССЯ-76 у них не образуется активных антител. Однако антитела, пассивно передаваемые потомству, не полностью нейтрализуют вирус, передаваемый вертикально, и вирус в скрытой форме в организме цыплят проявляет себя как патогенный лишь в стрессовый период, связанный с началом яйцекладки [362, 363].
Эпизоотическое благополучие птицеводческих хозяйств, выращивающих птицу, восприимчивую к инфекции ССЯ-76, обеспечивается за счёт применения вакцин. Ещё в 1977 году \У.Вахепс1а1е [79] показал возможность вакцинопрофилактики этой инфекции с помощью инактивированной масляной вакцины, содержащей вирус ВС-14. В 1980 году А.2апе11а е1. а1.[357] разработали и успешно испытали бивалентную вакцину против ССЯ-76 и болезни Ньюкасла, затем была предложена комбинированную инактивированная эмульгированная вакцина против ньюкаслской болезни, синдрома снижения яйценоскости-76 и болезни Гамборо.
Вопрос об оптимальных сроках вакцинации птицы, по сообщению ряда исследователей [50, 51] в общем решается однозначно. Птицу лучше всего вакцинировать в 14-16 недельном возрасте или за 2-4 недели до начала яйцекладки, если ее перемещают к возможно инфицированной птице. Если же птицу перемещают к заведомо благополучной в отношении ССЯ-76 птице, то вакцинацию рекомендуется завершить до конца перемещения, так как препарат может не полностью проявить свои протективные свойства через 10 дней после вакцинации. В случае необходимости птицу рекомендуют ревакцинировать. Уровень антител определяют через 14-21 день после вакцинации. Пик титров наблюдали между 2 и 5 неделями [241]. Продолжительность иммунитета составляла один год [35, 48].
Общая характеристика вируса инфекционного энцефаломиелита птиц
Инфекционный энцефаломиелит птиц (ИЭП) или эпидемический тремор - широко распространенное контагиозное заболевание, характеризующееся острым течением с проявлением комплекса нервных признаков (атаксия, параличи, парезы конечностей, тремор головы и шеи) у цыплят раннего возраста, с последующим развитием слепоты вследствие образования катаракты у части переболевшего поголовья [18, 86, 332]. У птицы, инфицированной в более позднем возрасте, заболевание протекает бессимптомно, у взрослых кур может сопровождаться временным уменьшением яичной продуктивности и выводимости молодняка [18, 24, 86, 171]. Заболевание впервые обнаружила в США у двухнедельных цыплят породы Rhode - Island Red Элизабет Джоунс в 1930 году [96, 99], единственным симптомом у них был тремор. В настоящее время инфекционный энцефаломиелит птиц распространен практически на всех континентах земного шара, особенно в странах с развитым промышленным птицеводством [19, 321].
Возбудителем инфекционного энцефаломиелита птиц является однонитевой РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Picornoviridae, роду Enterovirus. Он не обладает липопротеидной оболочкой, но образует стабильные кристаллы. Рентгеноструктуктурный анализ таких кристаллов указывает на наличие у них икосаэдрической симметрии. Диаметр вирионов составляет 20-30 нм, капсид состоит из 60 капсомеров, суперкапсидная оболочка отсутствует [46, 205, 246]. Вирус устойчив к действию высоких температур, хлороформу, кислоте, трипсину, пепсину и ДНК-азе, а в лиофилизированном виде защищен от нагрева двухвалентными ионами магния, что противостоит действию тепла [46]. Вирус кислотоустойчив и сохраняет жизнеспособность при рН 3,0, поскольку на пути к своему местообитанию — кишечнику — должен пройти через кислую среду в желудке.
Геном представляет нефрагментированную однонитевую молекулу РНК с молекулярной массой (2,6-103) Д и содержит 7500±400 нуклеотидов. Структура вириона включает четыре вирусоспецифических белка: VP1, VP2, VP3, VP4, с молекулярной массой: 43000, 35000, 33000 и 14000 соответственно [178]. Все изоляты инфекционного энцефаломиелита птиц антигенно родственны. Тем не менее, существуют два патотипа вирусов: энтеротропный и нейротропный. Первый, представленный природными полевыми штаммами, патогенен для цыплят первых дней жизни, клинически проявляется признаками поражения центральной нервной системы (атаксия, тремор, парезы и параличи конечностей) [168]. Энтеротропный вирус патогенен и для кур продуктивного периода, вызывая у них снижение яйценоскости. Другая группа включает нейротропные штаммы, адаптированные к куриным эмбрионам, и вызывающие эмбриопатическое действие, проявляющееся изменениями в куриных эмбрионах (общее недоразвитие, атрофия и дистрофия мускулатуры конечностей) при интрацеребральном или парентеральном введении.
Эпизоотология и клинические признаки
Основной путь передачи возбудителя ИЭП - вертикальный, но существует также и раннее горизонтальное контактно-алиментарное заражение [18, 46]. Вирус передается потомству через яйцо до 2-3-х недель после заражения кур-несушек.
К вирусу восприимчивы цыплята до 6 - недельного возраста, но чаще болеют в возрасте от 6 до 20 дней. Клинические признаки болезни в естественных условиях проявляются в полной мере при достижении цыплятами 1-2 - недельного возраста. У больных постепенно возникают характерные признаки поражения центральной нервной системы (слабость, сонливость, тремор головы и шеи, нарушение координации движения, парезы, а затем и параличи). Цыплята погибают от истощения [иэп 321]. Вирус ИЭП размножается в центральной нервной системе (ЦНС) или в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), вызывая поражения клеток [6]. У больных к 6 дню после заражения вирус накапливается в головном мозге, поджелудочной железе, 12-перстной кишке, желудке, печени. У птицы, достигшей возраста 2-3 недели, наблюдается заметная возрастная устойчивость к развитию клинических признаков при действии инфекции. У взрослой птицы возможно временное снижение яйценоскости (5-10%), а нервные симптомы при этом могут и не проявляться [176].
В естественных условиях заболевание проявляется только среди цыплят 1-2 - недельного возраста. Смертность в среднем составляет 25%, но может достигать и 50% [98].
Илшунитет и специфическая профилактика
У птиц после естественного и экспериментального заражения образуются циркулирующие антитела, которые, помимо сыворотки крови, обнаруживаются и в желтке яиц [98]. В сокращении продолжительности инфекции основную роль играет гуморальный, а не клеточный иммунитет. Иммунные куры передают через яйцо материнские антитела [27], которые защищают цыплят в течение первых 6 недель жизни. На фоне этого пассивного иммунитета они могут заражаться инаппарантно, что вызывает у птицы образование активного иммунитета [98]. Инфицированная птица выделяет вирус с пометом; несушки передают вирус через яйцо в течение 2-3 недель после заражения. Эта эпизоотологическая особенность позволяет бороться с ИЭП с помощью специфической вакцинопрофилактики [96, 97]. В настоящее время перспективна систематическая вакцинация до яйцекладки, которая предохраняет от вспышек болезни и от передачи вируса потомству через яйцо [300, 302].
Живыми вакцинами из штамма «Calnek 1143» прививают поголовье будущих родителей и прародительских стад однократно в возрасте 10-14 недель методом выпаивания [99]. Кроме живых вакцин за рубежом используется инактивированная В-пропиолактоновая вакцина (штамм «Van Roekel»). Преимущество инактивированной вакцины заключается в том, что она не снижает яичной продуктивности, которая иногда встречается в случае вакцинации несушек живыми вакцинами, и исключает возможность вертикальной передачи вакцинного вируса. Однако применение таких препаратов целесообразно в тех случаях, когда возникает необходимость прививать птицу во время продуктивного периода. Показателем поствакцинального иммунитета является уровень вируснейтрализующих антител до вакцинации и через несколько недель после нее [99].
Общая характеристика реовируса птиц
Инфекционный агент реовирусной инфекции впервые был выделен Fahey J.E. и Crawley J.F. в 1954 году в Канаде от цыплят с хронической респираторной инфекцией, а затем он распространился во всех странах с развитой птицеводческой индустрией [285], где была описана болезнь, названная теносиновитом кур (ТСК). Теносиновит кур или артрит -контагиозное заболевание, характеризующееся хромотой, связанной с воспалением сухожилий и суставов конечностей [123, 245]. Заболеваемость ТСК может достигать 100%, в то время как смертность обычно не более 6% [201]. Острые реовирусные ТСК отмечают у цыплят до 12-ти недельного возраста и у взрослых кур старше 20-ти недельного возраста. Хронические ТСК сопровождают инфицированную птицу в течение всей жизни. ТСК поражает преимущественно бройлеров, реже - яичные породы кур [201, 285]. Это связано с предрасположенностью суставов у кур тяжелых пород к структурным изменениям. Малабсорбционный синдром имеет большое число других названий, указывающих на многообразие клинических признаков [318]. Болезнь протекает главным образом в двух формах: кишечной в 10-дневном возрасте у цыплят и респираторной - до 6-недельного возраста. Количество цыплят с отставанием в росте может доходить до 10-15%. Еще ни разу не удалось воспроизвести МАБ контрольным заражением кур выделенным реовирусом, а лишь комбинацией патогенных агентов вирусной и бактериальной природы [292]. По мнению некоторых авторов реовирус играет лишь роль "катализатора" в патологическом процессе [191, 285].
Реовирус наносит экономический ущерб птицеводству, связанный с нарушением формирования скелета у птицы, с уменьшением привеса на 1015%, ослаблением половой активности племенного стада, со снижением яйценоскости на 6-10%, с ухудшением категорийности тушек и увеличением смертности на 4-7%. Уровень заболеваемости различен, но обычно составляет 10% [318]. Часто инфекция протекает в скрытой форме и может быть подтверждена только серологическими методами или выделением вируса [285]. Реовирусы выделяют как у здоровой птицы, так и у птицы с незначительными отклонениями от нормального развития, такими как нарушение пигментации и структуры оперения - "вертолетная болезнь" [75]. По данным ряда авторов [166], РВП вызывает изменения размеров бурсы и селезенки, числа белых кровяных телец и фолликулярную атрофию в бурсе.
Источник РВП - больная и переболевшая птица [182]. Для реовируса птиц характерна горизонтальная и вертикальная передача [57]. Основной путь передачи возбудителя — алиментарный. В инфицированном стаде лишь незначительное количество цыплят получают вирус родителей, однако, роль вертикальной передачи вируса в распространении РВП значительна [182]. После инфицирования реовирусом куры-несушки начинают нести зараженные яйца уже через 19 дней. Трансовариально зараженные цыплята становятся "ядром" инфекции, заражая весь выводок. Резистентность птицы к РВП в первую очередь обусловлена ее возрастом. Возрастную резистентность обуславливает гуморальный и, в большей мере, клеточный иммунитеты. При ассоциированной инфекции реовирус птиц стимулирует инфекционную активность специфического агента вирусной анемии цыплят [244], Енпепа асегуиНпа и Енпепа тШэ [292], вируса ИББ [251] и др. Наиболее выраженные ТСК отмечают преимущественно при ассоциативном течении реовирусной инфекции и синовиального микоплазмоза. Более того, главными причинами артритов у кур считают микоплазмозы или стафилококковые инфекции, протекающие на фоне реовирусзависимой иммуносупресии [31].
Классификация. Реовирусы птиц выделены в отдельную группу в составе рода ОгШогеоу^Б семейства Леоушёае [125]. Количество серотипов реовирусов птиц окончательно не установлено. Серотипизация реовирусов птиц строилась на основе данных исследования в РДП, РСК, РН и иммуннофлуоресценции [56]. В настоящее время в мире выделено несколько сотен изолятов реовируса птиц, 85-90% из которых апатогенны. Большинство вакцинных штаммов входит в Американскую группу реовирусов птиц. Близкое генетическое родство штаммов 81133, 1733 и 2408 было подтверждено определением первичной структуры генома возбудителя РВП [347]. Доказана высокая вероятность образования реассортантов при смешанной инфекции, вызванной штаммами из разных серотипов [248]. Возможно, именно широкое распространение реассортантов обуславливает высокое серологическое родство реовирусов в регионах [37].
Морфология и структура вириона. Структурная организация вирионов реовирусов птиц является типичной для рода Огйюгеоукш [43, 248, 351].Вирионы реовирусов безоболочечные и состоят из двух капсидных слоев, образованных капсомерами и расположенных в форме икосаэдра [103]. Диаметр внешнего капсидного слоя, собранного из 92 белковых капсомеров, - 70-80 нм, внутреннего, содержащего вирусный геном, - около 50 нм. Двухнитевая РНК фрагментирована на 10 сегментов, Каждый сегмент имеет транслируемую область и нетранслируемые участки. Нетранслируемые последовательности сегментов занимают примерно 3-8% от общей длины генома и участвуют в сборке вирусных частиц и в регуляции процесса транскрипции. Реовирусы птиц и млекопитающих отличаются по структуре сегментов М и Б, а также по структуре и функции кодируемых ими белков [137, 266]. Белки реовирусов птиц делятся по величине на три класса: большие Х-, средние р,- и малые а-белки. Девять белков (АА, А.С, |хА, р,В/р,2В, стА, стВ, аС) являются структурными и два — неструктурными [175, 333, 349, 351]. Известно, что группоспецифическими антигенами являются белки АВ и стВ, а типоспецифическим - белок стС [248, 337, 350]. Более того, последние исследования антигенных свойств белка аС дают основание предположить, что в его состав входят и типоспецифический и группоспецифический домены [248].
В серологических реакциях было показано, что все известные 11 серотипов возбудителя РВП имеют общий антиген [248]. Эпитопы, вызывающие образование вируснейтрализующих антител, имеют белки АЛЗ, стВ и аС. Вирусспецифические антитела экспериментально получали на" другие белки [336]. Так, ТакеЬага К. е1. а1. изучили 13 моноклональных антител, полученных против реовируса птиц штамма 11сЫс1а [320]. Из них только три (МАЫ, МАЬ2 и МАЬЗ) нейтрализовали вирус, причем МАЫ и МАЬ2 нейтрализовали штаммы ИсЫёа, С8-108 и ТБ-142, а МАЬЗ - только штамм ИсЫёа. Эти результаты подтвердили существование у реовирусов птиц и группоспецифических и типоспецифических эпитопов.
Обычно антитела появляются в течение 7-14 дней [258, 285] с пиком накопления к 6 неделям после введения антигена. Нейтрализующие антитела против РВП выделяют на 7-10 дни после заражения цыплят [191, 245, 285], а преципитирующие - только через 2 недели с максимальным их накоплением в крови через 6 недель. Снижение уровня антител против реовируса птиц идет в зависимости от достигнутого титра, но значительно медленее, чем выработка.
Патогенностъ. При изучении и характеристике возбудителя РВП принято опираться на клинические признаки заболевания птицы, от которой изолят был выделен [156]. Неоднократно было показано, что практически все изоляты реовируса птиц способны вызывать поражения суставов у кур. Некоторые авторы [201] в своих иследованиях не обнаружили какой-либо связи между серотипом вируса и клиникой заболевания. Однако известно, что большинство реовирусов, выделенных из сухожилий цыплят с артритами, дают значительную перекрестную реакцию в серонейтрализации [191, 285], а большинство штаммов, выделенных у цыплят с МАБ, вообще принадлежат к одному серотипу [137].
Иммунитет и специфическая профилактика при реовирусной инфекции Клеточно-опосредованный иммунитет играет огромную роль в защите птицы от РВП. Pertile et. al. обнаружили в клеточном инфильтрате, полученном после заражения птицы реовирусом птиц из синовии, большое количество активных Т-лимфоцитов и плазматических клеток [276].
Несмотря на активный гуморальный иммунитет многие полевые изоляты реовируса птиц могут долгое время персистировать в организме взрослой птицы [191, 192]. Более того, на фоне высокого уровня антител инфекция способна протекать в хронической форме. Установлено, что материнские антитела защищают от контрольного заражения реовирусом и цыплят и куриные эмбрионы [191].
В мире основное направление в профилактике РВП занимает разработка и применение живых и инактивированных вакцин. В связи с тем, что наиболее чувствительны к заражению реовирусом цыплята в раннем возрасте, программы вакцинации направлены на создание иммунитета именно в этот период жизни птицы, что, в свою очередь, предположительно можно достичь за счет активной иммунизации цыплят и/или путем создания пассивного иммунитета через вакцинацию родительского стада. Для активной иммунизации цыплят предусматривается применение живых аттенуированных вакцин [172, 192].
Инактивированные вакцины против РВП обладают способностью стимулировать развитие высокого уровня вирусспецифических антител, но их применение возможно лишь на взрослой птице. Поэтому в последнее время практикуется комбинированное применение и живых и инактивированных вакцин против РВП.
Единой программы вакцинации против РВП не существует. В большинстве современные реовирусные вакцины имеют в основе вакцинный штамм S1133. Однако полевые наблюдения и лабораторные исследования по контрольному заражению показали, что степень защиты напрямую зависит от степени родства вакцинного и "полевого" штаммов [319]. Так, в последнее время особенно актуальны исследования возможности вакцинации птицы поливалентными вакцинами, а так же разработка схем иммунизации, применимых к конкретной ситуации в хозяйстве. Giamborne для изготовления живых вакцин рекомендуют использовать штаммы S1133 и UMI203, а для инактивированных - штаммы S1133, С08, 1733, 2408 и WVU [156]. Эти штаммы реовируса птиц в сочетании обладают широким спектром антигенных свойств.
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Мудрак, Наталья Станиславовна
5. ВЫВОДЫ
1. Создана система комплексного серологического мониторинга инфекционных болезней кур в промышленном птицеводстве с применением иммуноферментных тест-систем и программного обеспечения для получения, обработки, учета и хранения данных.
2. Усовершенствованы методики очистки и концентрирования антигенов НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС, используемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем. Под контролем электронной микроскопии и электрофореза определены условия получения л очищенных антигенов с концентрацией не менее 1-5 мг/см .
3. Отработаны схемы иммунизации кур для получения контрольных положительных сывороток с активностью препаратов не менее 1:3200, определены допустимые значения оптических плотностей контрольных сывороток при постановке реакции в одном разведении, находящиеся в диапазоне 0,4-1,050 для положительных контролей и 0,04-0,160 для отрицательных сывороток.
4. Разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления и количественного определения уровня специфических антител к возбудителям НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС в сыворотках крови кур при их тестировании в одном разведении: определены оптимальные концентрации (для антигенов, конъюгата) и условия взаимодействия компонентов реакции; выбрано рабочее разведение тестируемых сывороток (1:400), установлены критерии качественной и количественной оценки результатов, выведены уравнения линейной регрессии и определены коэффициенты для формулы расчета числового значения титра по одному разведению испытуемых сывороток.
5. Проведен сравнительный анализ результатов, полученных при исследовании свыше 3000 проб сывороток с помощью разработанных тест-систем ИФА, базовой реакции РТГА и коммерческих наборов производства фирмы ЗупЬюйсБ (КРЬ, США), зарегистрированных на территории РФ.
Корреляция составила от 84% до 96 %, относительная чувствительность — от 89% до 98 % и относительная специфичность — от 79% до 94%.
6. За период с 1998 по 2008 гг. разработанные тест-системы проверены при исследовании проб сывороток крови кур из более чем 500 птицехозяйств РФ и других стран СНГ для оценки иммунного статуса поголовья при контроле трансовариального, поствакцинального иммунитета против возбудителей экономически значимых болезней кур в промышленном птицеводстве.
7. На основе разработанных иммуноферментных тест-систем для выявления и количественного определения уровня антител к возбудителям выбранных болезней птиц в сыворотках крови кур при их тестировании в одном разведении разработана и утверждена Россельхознадзором научно-техническая документация и регламенты для опытно-промышленного производства 16 наименований коммерческих наборов в двух вариантах: для визуальной детекции (на 40 проб) и инструментального учета (на 180 проб).
8. Создана и зарегистрирована в Российском агентстве по патентам и товарным знакам универсальная компьютерная программа «СИНКО-ИФА» для сбора, анализа и хранения результатов ИФА с учетом возможности работы с иммуноферментными наборами, разработанными в ФГУ «ВНИИЗЖ», и зарубежных фирм-производителей.
9. Разработана технология, организовано опытно-промышленное производство и оптимизирован контроль качества 16 коммерческих наборов с внедрением автоматизированных роботизированных устройств.
10. Проведена оценка качества лабораторных исследований с использованием разработанных тест-систем в 8 международных сравнительных испытаниях, проводимых аккредитованной референтной лабораторией (Голландия) и установлено, что статус зашифрованных проб определяется не менее чем в 75 %.
11. В ветеринарных лабораториях и на птицефабриках РФ внедрена комплексная система серологической диагностики, основанная на постоянном мониторинге иммунного статуса птицы разного возраста, с использованием наборов для ИФА, комплекта стандартизированного оборудования для постановки реакции и компьютерной программы для обработки и хранения полученных результатов анализа. В РФ и странах СНГ установлено и используется свыше 100 комплектов оборудования с универсальной компьютерной программой.
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Методики, разработанные в ходе научно-исследовательских работ по теме диссертации, включены в два сборника: "Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом" (1998 г.) и "Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием серологических реакций" (2008 г.), утвержденные Россельхознадзором в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.
Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные документы по изготовлению и контролю 1 б наборов для ИФА, утвержденные Россельхознадзором МСХ РФ: наборы для определения антител к вирусу ньюкаслской болезни иммуноферментным методом (СТО 00495527-00542006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0043-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом (СТО 00495527-0055-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0042-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом (СТО 00495527-0057-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0044-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к реовирусу птиц иммуноферментным методом (СТО 00495527-0045-2006 от 21.11.2008) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-133-00495527-2005 от 15.02.2006); наборы для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости кур иммуноферментным методом (СТО 00495527-0056-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0041-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к вирусу инфекционного энцефаломиелита птиц иммуноферментным методом (СТО 00495527-0038-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-117-00495527-2005 от 30.05.2006); наборы для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза {Mycoplasma gallisepticum) иммуноферментным методом (СТО 004955270109-2009 от 31.03.2009) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0111-2009 от 31.03.2009); набор для определения антител к Mycoplasma synoviae иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0034-2006 от 29.12.2006); < набор для определения антител к вирусу гриппа птиц иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 004955270086-2008 от 09.12.2008).
На базе ФГУ «ВНИИЗЖ» внедрена разработанная технология производства коммерческих наборов для ИФА в промышленном масштабе с применением автоматизированных роботизированных устройств. В течение 1997 - 2009 гг. было произведено около 21000 наборов для визуальной детекции и свыше 8000 наборов для исследований проб в одном разведении (СИНКО), которые использовались в региональных, областных ветеринарных лабораториях и на птицефабриках.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Мудрак, Наталья Станиславовна, Владимир
1. Абдилазиз Ф., Герман В.В. Изучение в реакции диффузной преципитации в геле реовирусов, выделенных от кур и индеек // Комплекс противозоотехн. и спец. мероприятий по борьбе с болезнями птиц: Сб. науч. тр.-Л., 1990. С.64-68.
2. Алиев A.C. Специфическая профилактика инфекционного бурсита кур//Ветеринария.- 1991.- №3.- С. 36-40.
3. Антитела. Методы. /Под. ред. Д.Кэтти. -М.: Мир, 1991. 382с.
4. Бакулин В.А., Севостьянов Г.А., Миркина Л.М. Электронно-микроскопическое исследование при болезни Гамборо // Ветеринария. -1985.-Ш.-С. 38-39.
5. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц / под ред. Б.У. Кэлнека. М.: АКВАРИУМ БУК, 2003. - 1232 с.
6. Болотников И.А., Конопатов Ю.В. Практическая иммунология сельскохозяйственной птицы. СПб.: Наука, 1993.
7. Бочков Ю.А. Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России: Дис. канд. биол. наук. Владимир. - 1999 - 136 с.
8. Букринская А.Г., Жданов В.М. Молекулярные основы патогенности вирусов.- М.: Медицина, 1991.-256 с.
9. Вирусология / Под ред. Б.Филдса, Д. Найпа. М.: Мир, 1989. - Т.2. -496 С.
10. Грибанов О.Г., Старов С.К., Дрыгин В.В. и др. Изучение возможного использования полимеразной цепной реакции для штаммовой дифференциации вируса ньюкаслской болезни//Сб. науч. тр. ВГНКИ.-М.Д996.-Т.29.-С.63-69.
11. Грибанов О.Г., Старов С.К., Ломакин А.И. и др. Нуклеотидные последовательности гена PIN и фрагмента гена F штаммов Бор 77 и Бор 82 вируса ньюкаслской болезни//Мол. генетика, микробиол. и вирусол.-1999.-№3.-С.29-33.
12. Гринин A.C., Титов И.Н. Очистка, концентрирование и фракционирование. М.: Колос, 1971. - С.86-96.
13. Голод, Я.Р., Кожемяка, Н.В., Терюханов, А.Б. и др. Сравнительная оценка живых вакцин против инфекционного бронхита кур // Ветеринария. -1990.-№11.-С. 12-14.
14. Госманов, Р.Г. Ветеринарная вирусология / Р.Г. Госманов, Н.М. Колычев. -М.: Колос, 2006. 304с.
15. Доел Т.Р. Инактивация вирусов, продуцируемых в культурах клеток животных // Биотехнология клеток животных. М., 1989. -Т.2. - С.145-169.
16. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа.- М.:Высш. школа, 1991. -288с.
17. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т.Т.Нго, Г.Ленхоффа. -М.:Мир, 1988. -444 с.
18. Инфекционный энцефаломиелит птиц: Краткий справочник по болезням птиц. Ташкент, 1987. - С. 43-45.
19. Ирза В.Н., Лобанов В.А., Борисов A.B., и др. Серомониторинг инфекционного энцефаломиелита // Птицеводство. 2002. - № 1. - С. 26-27.
20. Ирза, В.Н. Эпизоотическая ситуация в мире и РФ по гриппу птиц H5N1 и меры борьбы с ним. / В.Н. Ирза // Грипп А птиц: проблемы и пути их решения Спб.- Ломоносов, 2006. - С. 18-22.
21. Каверин, Н.В. Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и проблема пандемий / Н.В. Каверин, Ю.А. Смирнов // Вопр. вирусологии. 2003. -№3. -С. 4- 12.
22. Кильбурн, Э. Д. Вирусы гриппа и грипп / Э. Д. Кильбурн. М.: Медицина, 1978. - 588 с.
23. Коваленко Я.Р., Шегидевич Э.А., Яблонская И.А. Методические рекомендации по выделению, культивированию и идентификации микоплазм, ахолеплазм и уреплазм. М, 1982. — 43 с.
24. Коровин Р.Н., Зеленский В.П., Грошева Г.А. Лабораторная диагностика болезней птиц: Справочник. -М.: Агропромиздат, 1989. С. 133-136.
25. Коромыслов Г. Ф., Месарош Я., Штипкович JI. и др. Микоплазмы в патологии животных. М.: Агропромиздат, 1987. - 256 с.
26. Макаров В.В. Основы инфекционной иммунологии. М.: Фолиант. 2000.
27. Макаров, В.В. Высокопатогенный грипп птиц / В.В. Макаров. — Ветеринария в птицеводстве, 2004, №2. С. 4 - 9.
28. Мисюк НС, Масгпыкин А.С., Кузнецов ГЛ. Корреляционно-регрессионный анализ. М.: Медицина, 1975. -192 с.
29. Насонов И.В. Диагностика и профилактика пневмовирусной и реовирусной инфекций в промышленных стадах птицы (обзор) / И.В. Насонов, Н.И. Костюк // Эпизоотол., иммунобиол., фармакол. и санитария. -2008.-№3.-С. 15-21.
30. Нваджей Б. Свойства реовирусов, изолированных при теносиновите птиц и смешанной инфекции с Mycoplasma synoviae: Автореф.дис. . канд.вет.наук. -М., 1991. 21с.
31. Нетесова И.Г., Ярославцева О.А., Антимонов А.В. и др. // Новости "Вектор-Бест". 2005. № 37. С. 4-6. 3
32. Нетесова И.Г., Ярославцева О.А.,Шустов А.В., Нетесов С.В. // Клин. Лаб. диагностика, 2005. №12. С48-51
33. Пчёлкина И.П., Колосов С.Н., Манин Т.Б., Чвала И.А.и др. Вирус ньюкаслской болезни, выявленный в популяциях диких и синантропных птиц на территории России в 2008 году // Вет. медицина: м1жвщ. тем. наук. зб. -Харюв, 2009. Вип. 92. - С. 417-422.
34. Рождественский И.К., Коровин Р.Н, Седунов Э.А. Синдром снижения яйценоскости-аденовирусная болезнь кур // Ветеринария. -1981. -№4. -С.70-71.
35. Родин Ю.В., Руденко Т.В., Смоленский В.И. и др. Оценка эпизоотологической ситуации и особенности специфической профилактики при ньюкаслской болезни//Вестн. ветеринарии.-1998.-№2.-С.66-75.
36. Сарбаева Н.В. Сравнительная характеристика вакцинного и эпизоотологического штаммов реовируса теносиновита кур: Дис. канд. биол. наук. -М., 1997.- 133с.
37. Сеймур П.Х. Иммуноферментный анализ антител // Иммуноферментный анализ. М.: Мир, 1988.- С. 193-205.
38. Сергеев В.Д., Никитина Н.В., Мухамедшина А.Р. Иммуноферментный метод в диагностике болезни птиц // Основы профилактики болезней с/х птицы. -Л., 1989. -С.75-82.
39. Смирнов, A.M. Грипп птиц. Задачи ветеринарной науки / A.M. Смирнов // Ветеринария. — 2007. №2. - С. 3 — 6.
40. Стратегия и тактика борьбы с гриппом на различных этапах эпидемиологического процесса / С.С. Ямникова, О.Н. Виткова, М.В. Калмыков, H.A. Власов // Ветеринарная медицина 87: М1жвщомчий тематичний науковий зб1рник. Харюв, 2006. - С. 307- 312.
41. Сюрин В.Н., Самуйленко АЛ., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. М.: ВНИТИБП, 1998. - 928с.
42. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Соловьёв Б.В., Фомина Н.В. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных: Справочник.-М.:Агропромиздат, 1986.-3 51 с.
43. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология.-М.: Агропромиздат, 1991.-431 с.
44. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных.-М.: Агропромиздат, 1991.-23 7 с.
45. Терюханов А.Б., Мазурина М.Г., Лейкинд Е.А., Шпак, P.A. Профилактика инфекционного бронхита кур. // Ветеринария. 1990. - №6. С. 34-35.
46. Фомина Н.В., Осидзе С.Д., Хилько С.Н., Кирасова М.А. Иммуноферментный метод определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости -76 // Труды ВИЭВ. -1988. -№66. -С.37-41.
47. Фомина Н.В. Аденовирусная инфекция животных: В 2х т. -М.: Колос, 1995. -Т2. -193с.
48. Ястребова О.Н., Криницына Э.В., Лебедева Е.И., Бобко Д.И., Нетесова И.Г. Результаты внешней оценки качества лабораторных исследований по выявлению антител к вирусу гепатита С в десяти регионах России "Новости "Вектор-Бест" N2(40) 2006)
49. Abdelmoumen В. В., Roy R. S. An enzyme-linked immunosorbenc assay for detection of avian mycoplasmas in culture // Avian Dis. -1995. -V.39. -P.85—93.
50. Abdelmoumen В. В., Béjaoui A., Oussaeif L., Mlik В., Amouna F. A Recombinant Antigen-Based Elisa For The Simultaneous Differential Serodiagnosis Of Mycoplasma Gallisepticum, Mycoplasma Synoviae, And
51. Mycoplasma Meleagridis Infections Avian Diseases: 2007, Vol. 52, No. 2, P. 214-221.
52. Abdu P.A. Studies on the profile and relationship of maternal and vaccinal antibodies in the prevention of infectious bursal disease in chickens: M. Sc. Thesis, Ahmadu Bello University, Zaria, Nigeria, 1985.
53. Adair B.M., Burns K., McKillop E.R. Serological studies with reoviruses in chickens, turkeys and ducks // J. Comp. Pathol. 1987. - V.97. - P.495-501.
54. A1 Afaleq A.I., Jones R.C. Localisation of avian reovirus in the hock joints of chicks after entry through broken skin // Res. Vet. Sci. 1990. - V.48. - P.381-382.
55. A1 Afaleq A., Bradbury J. M, Jones R. C, Metwali A. M. Mixed infection of turkeys with Mycoplasma synoviae and reovirus: field and experimental observations // Avian Pathol. 1989 V.18 P. 441-453.
56. Alexander, D.J. A review of avian influenza in different bird species / D.J. Alexander // Vet. Microbiol. Spec. Issue. Animal Influenza Viruses: Symp. -Gent, Belgium, 1999. - 2000. - Vol. 74. - P. 3 - 13.
57. Alexander, D.J. Ecology of avian influenza in domestic birds / D.J. Alexander // Proceedings of the international symposium on emergence and control of zoonotic ortho- and paramixovirus diseases. — France, 2001 P. 25 - 34.
58. Alexander, D.J. Experimental assessment of the pathogenicity of eight avian influenza A viruses of H5 subtype for chickens, turkeys, ducks and quail / D.J. Alexander, G. Parsons, R.J. Manvell // Avian. Pathol. 1986. - Vol. 15. - P. 647662.
59. Alexander, D.J. Orthomyxovirus infections / D.J. Alexander // London: Elsevier Sci., 1993.-P. 287-316.
60. Alexander D.J. Newcastle disease and other paramyxoviridae infections//Diseases of Poultry.-Ames, Iowa, 1997.-P.541-569.
61. Alexander D.J. Newcastle disease//State Vet. J.-1995.-V5,№3.-P.21-24.
62. Alexander D.J. Newcastle disease and other paramyxoviridae infections//Rev.Sci.tech.Off.Int.Epiz.-2000.-V19,№2.-P.443-456.
63. Alexander D.J. Avian influenza diagnosis // Zoonoses and Public Health. -2008. - 55, № 1. - P. 16-23.
64. Allan W.H., Lancaster J.E., Toth B. Newcastle disease vaccines-their production and use//FAO. Anim. Prod, and Health. Series No.lO.-Rome: FAO, 1978.
65. Allan W.N., Faragher J.T., Cullen G.A. immunosuppression by the infectious bursal agent in chickens immunized against Newcastle disease // Vet. Rec-1972.-Vol.90.- P. 511-512.
66. Animas S.B., Otsuki K., Tsubokura M., Cook J.K.A. Comparison of the susceptibility of chicks of different ages to infection with nephrosis-nephritis causing strain of infectious bronchitis virus // J. Vet. Med. Sci. 1994. - V.56. — P.449-453.
67. Ansari A. A., Taylor R.F., Chang T.S. Application of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detecting Antibody to Mycoplasma gallisepticum Infections in Poultry // Avian Dis.- 1983.- V.27.- 1.- P.21-35.
68. Arun C.S. Serological tests for diagnostic of avian encephalomyelitis // Poultry Adviser. 1993. - V.26, № 3. - P. 45-49.
69. Ashraf S., Tang Y., Saif Y.M. /Development of differential RT-PCR assays and molecular characterization of the complete VP1 gene of five strains of very virulent infectious bursal disease virus // Avian Dis. 2007. - Vol. 51, № 4. - P. 935-941.
70. Athana A., Rosengarten R., Livinson S., e.a. Adherence of Mycoplasma gallisepticum involves variable surface-membrane proteins. // Infect. Immun. -1997.- V.65.-P. 2468-2471.
71. Azzaz H.A.D. The problems of reoviruses infection in chickens // Assiut Vet. Med. J. 1993. - V.28, №56. - P.310.
72. Barile M. F., Rotten S. Mycoplasmas in cell culture // Kahane J. Rapid diagnosis of mycoplasmos. N. Y.- 1993.- P. 155 - 189.
73. Barta V., Springer W.T., Millar D.L. A comparison of avian and mammalian cell cultures for the propagation of avian reovirus WVU 2937 // Avian Dis. 1984.- V.28. -P.216-223.
74. Baseggio, N., Glew M. D., Markham P. F. e. a. Size and genomic location of the pMGA multigene family of Mycoplasma gallisepticum / Microbiology. — 1996.- V.142. -P.1429-1435.
75. Baxendale W., Lutticken D., Hein R. Observation made with the egg drop sindrome 76 of chickens and the development of a vaccine against the disease // Proc. 16 World's Poultry Congress, Sept.-17-21. -Brasil, 1978.
76. Baxendale W. Nonvencion annal de la asociacion Nacional de espesialiatas on cicucias Avicolas // Recent, research on egg drop syndrome-76 (EDS-76). -1980. -P. 206-211.
77. Beard C.W., Wilkes W.C. A comparison of Newcastle disease hemagglutination-inhibition test result from diagnostic laboratories in Southeastern Unated States//Avian Dis.-1985.-V29,№5.-P.1048-1056.
78. Becht H., Muller H., Muller H.K. Comparative studies on structural and antigenic properties of two serotypes of infectious bursal disease virus // J. gen. Virol.- 1988.-Vol.69.-P. 631-640.
79. Benn N., Turlais, F., Clark, V. et al. An automated metric system to measure and improve the success of laboratory automatoin implementation. JALA, 2006, 11, 1, 16—22.
80. Bhattachaqee P.S., Jones R.C. Susceptibility of organ cultures from chicken tissues for strains of infectious bronchitis isolated from the intestine // Avian Pathol. 1997. - V.26. - P.553-563.
81. Bencina D., Kleven S.H., Elfaki M.G. e.a. Variable expression of epitopes on surface of Mycoplasma gallisepticum demonstrated with monoclonal antibodies // Avian Pathol.- 1994 V.23 - P.19-36.
82. Bicford A.A., Castro A.E. Avian encephalomyelitis // Veterinary Diagnostic Virology.-St. Louis, USA, 1992. - P. 21-23.
83. Bochkov, Y.A., Batchenko, G.V., Shcherbakova, L.O., Borisov, A.V. Drygin, V.V. (2006). Molecular epizootiology of avian infectiousbronchitis in Russia. Avian Pathology, 35, 379393.
84. Bradbury, J. M. Avian mycoplasma infections: prototype of mixed infections with mycoplasmas, bacteria and viruses. Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur).- 1984-V.-135.-P. 83-89.
85. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V.72. - P. 248-254.
86. Braunius, W.W. Respiratory problems in reovirus infection in broiler chicks / W.W. Braunius // Tijdschr. Diergeneeskd. 1992. - Vol. 117. - P. 390-391.
87. Brown J., Resurrección R.S., Dickson T.G., Home A. The relationship of egg yolk and serum antibody. I. Infectious bursal disease virus // Avian Dis.-1989.- Vol. 33.- №4.- P. 654-656.
88. Brown E.G. Influenza virus genetics./ E.G. Brown virus // Biomed.Pharmacother.-2000.-Vol.54.- P. 196-209
89. Cadman H. F., Kelly P. J. A serosurvey using enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies against poultry pathogens in ostriches (Struthio camelus) from Zimbabwe // Avian Dis. 1994. - V.38. - P. 621-625.
90. Cadman H., Kelly P., Angelis N. e.a. Comparision of enzyme- linked immunosorbent assay and haemagglutination inhibition test for the detection ofantibodies against Newcastle disease virus in ostriches//Avian Pathol.-1997.-V.26.-P.357-363.
91. Calnek B.W., Luginbuhl R. Avian encephalomyelitis // Diseases of Poultry. — Ames. Iowa, USA. - 1991. - P. 520-531.
92. Calnek B. W. Avian encephalomyelitis. // Virus Infections of-Birds-Amsterdam, 1993. - P. 469-478.
93. Calnek B.W., Luginbuhl R.E., Helmboldt C.F. Avian encephalomyelitis // Diseases of Poultry. Ames Iowa State University Press. USA, 1997. - P. 571581.
94. Calnek B. W. Control of avian encephalomyelitis: A historical account // Avian Dis. 1998. - V.42. - P. 632-647.
95. Cassell G.H., Brown M. B. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antimycoplasmal antibody // Methods in Mycoplasmology / Razin S. , Tully J.G. eds. Academic Press, N. Y. USA; London, UK. 1983.- V. 1. -P.457-469.
96. Cattoli G., Terregino C. New perspectives in avian influenza diagnosis // Zoonoses and Public Health. 2008. - 55, № 1. - p. 24 - 28.
97. Cavanagh D., Naqi S.A. Infectious Bronchitis. // Disease Poultry, Ames, Iowa State University Press, 1997. P.511-526.
98. Chanhan R.S., Rao V.D.P. Avian reovirus infection a threat to poultry // Poultry Adviser. - 1992. - V.25,№8. - P.29-34
99. Chettle N.J., Stuart J.C., Wyeth P.J. Outbreak of virulent Infectious bursal disease in East Anglia //Vet. Rec. -1989. -Vol. 125. P. 271-272.
100. Cheu M., Myers L. Increasing productivity through a combination of automation and robotics: a case study of assay services. JALA, 2001, 6, 48—51.
101. ChoiB.J., Jin S.M., ShinS.H. et al. Development of flexible biorobot platform for integrated clinical test. JALA, 2008, 13, 2, 90—96.
102. Cole B. C. Mycoplasma interaction with the immune system: implication for disease pathology // ASM News.- 1996.- V.62.- P.471 475.
103. Comps M., Mori J., Poisson F., Bonami J.R. Biophysical and biochemical properties of the RBV, and unusual birnavirus pathogenic for rotifers // J. gen. Virol.-1991.-Vol. 72.-P. 1229-1236.
104. Cowen B.S., Braune M.O. The propagation of avian viruses in a continuous cell- line (QT35) of Japanese quail origin // Avian Dis. -1988. V. 32. - P.282-297.
105. Crowther J.R. ELISA. Theory and practice. // Methods in Molecular Biology. Totowa, New Jersey, 1995.- P. 64, 161 -176.
106. Cubillos A., Ulloa J., Cubillos V., Cook J.K.A. Characterisation of strains of infectious bronchitis virus isolated in Chile // Avian Pathol. 1991. - V.20. -P.85-99.
107. Czifra G., Sundquist B., Tuboly T. Stipkovitts L. Evaluation a monoclonal blocking enzyme-linked immunosorbent assay for the detection Mycoplasma gallisepticum-specific antibodies // Avian Dis. 1993. - V. 37. - P.680-688.
108. Defra. Epidemiology report on avian influenza in a quarantine premises in Essex. 2005.
109. Development of an antigen-capture ELISA for detection of H7 subtype avian influenza from experimentally infected chickens / S. Velumani, Q. Du, B. J Fenner et al. // J. of Virol. Methods. 2008. - Vol.147. - P. 219 - 225.
110. De Wit J .J., Mekkes D.R., Koumenhoven B., Verheijden J.H.M. Sensitivity and specificity of serological tests for infectious bronchitis virus antibodies in broilers // Avian Pathol.- 1997. V.26. - P.398-402.
111. Dhinakar Raj G.,. Jones R.C. Local antibody production in the oviduct and gut of hens infected with an enterotropic strain of infectious bronchitis virus // Vet. Immunol.Immunopathol. 1996. - V.53. -P.147-161.
112. Dhinakar R.G., Jones R.C. An in vitro comparison of the virulence of seven strains of infectious bronchitis virus using tracheal and oviduct organ cultures // Avian Pathol. 1996. - V.25. - P.649-662.
113. Dhinakar R.G., Jones R.C. Infectious bronchitis virus: immunopathogenesis of infection in the chicken // Avian Pathol. 1998. - Y.26. - 677-706.
114. Different neutralization efficiency of neutralizing monoclonal antibodies against avian influenza H5N1 virus to virus strains from different hosts / H. Huang, H. Dan, Y. Zhou et al. // Molecular Immunology. 2007. - Vol. 44. - P. 10521055.
115. Dimech W. Automation of an absorbed enzyme immunoassay for the detection of Mycobacterium paratuberculosis antibodies for an eradication program. Vet Microbiol, 2000, 77, 3—4, 351—355.
116. Dobos P., Hill B.J., Hallet R., e.a. Biophysical and biochemical characterization of five animal viruses with bisegmented double-stranded RNA genomes // J.Virol.- 1979,-Vol.32.- P.593-605.
117. Dobson K.N., Glisson J.R. Economic impact of a documented case of reovinis infection in broiler breeders // Avian Dis. -1992. —V.36. — P.788-791.
118. Donatelli I., Campitelli L., Di Trani L. et al. Characterisation of H5N2 influenza viruses from Italian poultry // J. Gen. Virol. 2001. -Vol. 82 - P. 623630.
119. Duncan R. Extensive sequence divergence and phylogenetic relationships between the fusogenic and nonfusogenic orthoreoviruses: a species proposal // Virology. 1999. - V.260. - P.316-328.
120. Dunne J.F., MaeckerH.T. Automation of cytokine flow cytometry assays. JALA, 2004, 9, 1, 5—9.
121. Dybvig K. Molecular biology of mycoplasmas // Annu. Rev. Microbiol.-1996.- V.50.- P.25 57.
122. Dybvig K. Mycoplasmal genetics. // Annu. Rev. Microbiol.- 1990.- V.44.-P.81 104.
123. Dvorakova D., Kozusnik Z., Dvorak R., Bohm R. Diagnosis of avian encephalomyelitis virus // Vet. Med. Praha. 1983. - V. 28, - № 5. - P. 309316.
124. Eck J.H.H. Involvment of spleen components of nature fowl in the primary and secondary humoral antibody response following experimental EDS-76 virus infection//Vet. Q. -1986. -Vol 8. -P. 105-122.
125. Eck J.H.H. Serological examination and egg production of progeny of fovl experimentally infected with egg drop syndrome 76 virus // Vet. Q. -1982. -Vol 4. -P. 117-124.
126. Elankumaran S., Balachandran C., Chandran N.D.J, e.a. Serological evidence for a 793/B related avian infectious bronchitis virus in India // Vet. Rec. — 1999 V.144. — P.299-300.
127. Eleven, S.H. Mycoplasma synoviae infection / S.H. Eleven // Diseases of Poultry / ed. B.W. Calnek 10th ed. Ames, IA: Iowa State Univer. Press.- 1997. -P. 220-225.
128. Ellis T.M, Leung C.Y.H.C., Chow M.K.W. Vaccination of chickens against H5N1 avian influenza in the face of an outbreak interrupts virus transmission // Avian Pathol. 2004. - Vol. 33. - P. 405- 412.
129. Ellis T.M., Bousfield R.B., Bissett L.A. et al. Investigation of outbreaks of highly pathogenic H5N1 avian influenza in waterfowl and wild birds in Hong Kong in late 2002 // Avian. Pathol. -2004. Vol. 33. - P. 492-505.
130. Ellison J. S., Olson L. D. Immunity and vaccine development // Maniloff J., Elhaney P. N., Finch L. R., Baseman J. B. (ed). Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. / American Society for Microbiology. Washington D. C. -1992.- P.491 -504.
131. Enriquez C. E., Wilcox G. E. Caracteristicas generales de reovirus mamiferos y aviares. Estudio recapitulativo // Vet. Mexico. 1989. - V.20, №4. -P.427-434.
132. Engvall E., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G //Immunochemistry. -1990. -Vol. 8. -P. 871-874.
133. Evans R. P., Hafez Y.S. Evaluation of a Mycoplasma gallisepticum strain exhibiting reduced virulence for prevention and control of poultry mycoplasmosis // Avian Dis.-1992.-V.36.- P. 197-201.
134. Fahey K.J., Crooks J.K., Fraser R. Assessment by ELISA of passively acquired protection against infectious bursai disease virus in chickens // Aust. Vet. J.- 1987.-Vol. 64, №7.- P. 203-207.
135. Fan H. H., Kleven S. H., Jackwood M. W., Application of polymerase chain reaction with arbitrary primers to strain identification of Mycoplasma gallisepticum II Avian Dis. -1995 a. V. 39. - P. 729-735.
136. Fan H. H., Kleven S. H., Jackwood M. W. Studies of intraspecies heterogeneity of Mycoplasma synoviae, M. meleagridis, M. iozwe with arbitrarily primed polvmerase chain reaction // Avian Dis.- 1995 b. V.39. - P. 766-777.
137. Feberwee A.; de Vries T.S.; Wil J., Landman M. Seroprevalence of Mycoplasma synoviae in Dutch commercial poultry farms Avian Pathology, Vol. 37, Issue 6 , 2008 , P 629 633
138. Feberwee A., D.R. Mekkes, J.J de Wit e.a. Comparison of culture, PCR, and different serologic tests for detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae infections //Avian Dis. 2005. - Vol. 49, N 2. - P. 260-268.
139. Fernandes M. J. B., Simoni I. C., Vogel M. G., Harakava R. e.a Molecular Characterization of Brazilian Infectious Bursal Disease Virus Isolated from 1997 to 2005 Avian Dis.-2009,- V. 53, No. 3, P. 449-^54
140. Fodor. Rescue of influenza A virus from recombinant DNA / Fodor // J. Virol. 1999. - Vol. 73. - P. 9679-9682.
141. Folitse R., Halvorson D.A., Sivanandan V. A dot immunoblotting assay (Dot Blot ELISA) for early detection of Newcastle disease antibodies in chicken//Avian Dis.-1998.-V.42.-P.14-19.
142. GalletC., Pegon Y., Neel T. Qualification of robotic laboratory equipment. JALA, 2005, 10, 1,48—53.
143. Gao, W. Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization / W. Gao // J. Virol. 2006. - Vol. 80 -P. 1959- 1964.
144. Garcia Z., Bankowski R.A. Comparison of tissue culture virus-neutralisation tests and enzyme-linked immunosorbent assay for measurement antibodies to infectious bronchitis//Avian Disease. 1980.-V.25.-P. 121-130.
145. Garcia M., Mohamed G. E., Kleven S.H. Analysis of the variability in expression of Mycoplasma gallisepticum surface antigens. // Vet. microbiol.-1994.-V.42, N 2.- P.147-158.
146. Garcia M., Ikuta A.N., Levisohn S., Kleven S.H. Evaluation and comparison of various PCR methods for detection of Mycoplasma gallisepticum infection in chickens / // Avian Dis. - 2005. - Vol. 49, N 1. - P. 125-132.
147. Gelb J.J., Wolff J.B., Moran C.A. Variant serotypes of infectious bronchitis virus isolated from commercial layer and broiler chickens // Avian Diseases. -1991. V.35. — P.82-87.
148. Giamborne J.J., Solano W. Serologic comparison of avian reovirus isolates using virus neutralisation and an enzime-linked immunosorbent assay // Avian Dis. 1988. - V.32. - P.678-680.
149. Giambrone J.J. Variety of clinical sings, lesions make reoviruses compex challenge // Poultry Digest. 1990. - V. 49,№9. - P. 15-18.
150. Giambrone J.J. Efficacy of live vaccines against serologic subtypes of infectious bursal disease virus // Avian Dis. -1990. Vol. 34. - P. 7-11.
151. Gough, R.E. & Alexander, D.J. Comparison of serological tests for the measurement of primary immune response to avian infectious bronchitis virus vaccines // Veterinary Microbiology. 1977. - V.2. - P.289-301.
152. Gribanov O.G., Kolosov S.N., Lomakin A.I. e.a. Optimisation of conditions of differentiation of Newcastle disease virus with the of reverse transcriptase//XIth Int. Congr. World Vet. Poultry Ass.: Abstr.-Budapest,1997.-P.264.
153. Gribanov O.G., Starov S.K., Smolenscy V.I. e.a. The study of Russianthstrains of Newcastle disease virus//10 Europ. Poulty Conf.: Abstr.-Israel,1998.-P.78.
154. GuH., DengY. Dilution effect inmultichannel liquid-handling system equipped with fixed tips: problems and solutions for bioanalitical sample preparation. JALA, 2007, 12, 6, 355—362.
155. Gubareva, L.V. Molecular mechanisms of influenza virus resistance to neuraminidase inhibitors / L.V. Gubareva // Virus Res. 2004. - Vol. 103. - P. 199-203.
156. Gundersen D. E., Lee I. M., Davis R. E. Phylogeny of mycoplasma like organisms: a basis for their classification // J. Bacterid.- 1994.-V.176.- P. 5244 -5254.
157. Guneratne J. R. M., Jones R. C., Georgion K. Some observation on the isolation and cultivation of avian reoviruses // Avian Pathol.-1988.-V.ll.-P.453-462.
158. Haddad E.E., Whitfili C.E., Avakian A.P., e.a. Efficacy of a novel infectious bursal disease virus immune complex vaccine in broiler chickens // Avian Dis. 1997. - Vol. 41, №4. - P. 882- 891.
159. Hariraglu R., Alcigir G. Avian encephalomyelitis in chickens // Vet. Fak. Pergisi University. Ancara, - 1990. f
160. Hayhow C. S. Development of antigen capture ELISA for detection of Enterovirus in commercial turkeys // Avian Diseases. 1993. - V.37. - P.375-379.
161. Hess M., Cuzange A., Ruigrok R.W.H. et.al. The avian adenovirus penton: Two fibers and one base // J. Mol. Biol. -1995. -Vol. 252. -P. 379-385.
162. Heushele W.P. Avian encephalomyelitis // Diagnost. Vird. Pract. Guide. St. Louis,-USA, 1992.
163. Herdt P. de, Ducatelle R., Uyttebrock E. Reovirus serology in broiler parents and their progeny and its correlation with performance // Avian Dis. 1999. - V.43. - P.271-278.
164. Hoelscher, M.A. Development of adenoviral-vector-based pandemic influenza vaccine against antigenically distinct human H5N1 strains in mice / M.A. Hoelscher // Lancet. 2006. - Vol. 367. - P. 475^181.
165. Horvath E., Czifra G., Nagy E. e.a. Potency test of inactivated Newcastle disease vaccines by monoclonal antibody blocking ELISA//Vaccine.-1999.-V.6, №17.-P.23-24.
166. Hsu C.J., Wang C. Y., Lee L.H., Shih W.L. e.a. Development and characterization of monoclonal antibodies against avian reovirus cC protein and their application in detection of avian reovirus isolates Avian Path. -2006.- V. 35, Issue 4 , pages 320 326
167. Huang D.D., Nugent M.A., Rosenberger J.K., Schnizer T.J. Association of avian reovirus M and S genes with viral behavior in vivo. 2. Viral pathogeniciti // Avian Dis. -1987. -V.31. P.446-454.
168. Howard C. J., Taylor G. Humoral and cell mediated immunity // Razin S. Barile (ed). The Mycoplasmas, Mycoplasma pathogenicity Inc. Orlando, Academic Press Fla.- 1985.- V.4 P.259 292.
169. Hughes P.^Stanway J. G. The 2A proteins of three diverse picornaviruses are related to each other and to the H-revl07 family of proteins involved in the control of cell proliferation // J. Gen. Virol. 2000. - V.81. - P. 201-207.
170. Ignjatovic J., Ashton F. Detection and differentiation of avian infectious bronchitis viruses using a monoclonal antibody-based ELISA // Avian Pathol. — 1996. — V.25. — P.721-736.
171. Ignjatovic J., Sapats S. Avian infectious bronchitis virus // Review Scientific and Technical World Organisation for Animal Health. 2000. - V.19, N 2. -P.493-508.
172. Islam M.R., Jones R.C. An enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibody titre agaist avian reovirus using a single dilution of serum // Avian Pathol. -1988. -Vol. 17. -P. 411-425.
173. Islam, M.R., Jones R.C., Kelly D.F., Al-Afaleq A. Studies on the development of autoantibodies in chickens following experimental reovirus infection // Avian Pathol. 1990. - V.19,№2. - P.409-416.
174. Ismail N., Saif Y.M. Differentiation between antibodies to serotypes 1 and 2 infectious bursal disease viruses in chiken sera // Avian Dis. 1990. - Vol. 34. - P. 1002-1004.
175. Jackwood D.J., Jackwood R.J. Infectious bursal disease viruses: Molecular differentiation of antigenic subtypes among serotype 1 virus // Avian Dis. 1994. -Vol. 38. -P. 531-537.
176. Jackwood D.J., Saif YM., Huches J.H. Characteristics and serologic studies of two serotypes of infectious bursal disease virus in turkeys // Avian Dis. 1982. -Vol.26. -P. 871-882.
177. Jaclcwood D.J., Sommer S.E., Odor E. Correlation of enzyme-linked immunosorbent assay titers with protection against infectious bursal disease virus // Avian Dis. 1999. - Vol. 43, №2.- P. 189-197.
178. Jia W., Karaca K., Parrish C.R., Naqi S.A. A novel variant of avian infectious bronchitis virus resulting from recombination from three different strains //Arch. Virol. 1995.-V. 140.-P.259-271.
179. Jones R.C. Avian reovirus infections // Rev. Sci. Techn. O.J.E. 2000. -V.19,№2. - P.614-625.
180. Jones R.C., Nwajei B.N.C. Reovirus-induced tenosynovitis: persistence of homologous challenge virus in broiler chicks after vaccination of parents // Res. Vet. Sci.-1985.-V. 39.-P. 39-41.
181. Jones B.V. The preparation of chicken tracheal organ cultures for virus isolation, propagation and titration / B.V. Jones, R.M. Hennion // Methods Mol. Biol. 2008. - Vol. 454. - P. 103-107.
182. Kahane I., Adoni A. (ed) Rapid diagnosis of mycoplasmas N. Y.: Plenum Press, 1993.
183. Kaleta E.F., Heffels-Redmann U. (eds.). Proceedings of the CEC Workshop on Avian Paramyxoviruses, Rauischhoizhausen, Germany, 1992.
184. Karaca K, Naqi S.A. A monoclonal antibody blocking ELISA to detect serotypespecific infectious bronchitis virus antibodies // Vet. Microbiol. 1993. -V.34. - P.249-257.
185. Kardi V.,Szegletes E., Forgach K., e.a. Use of ELISA methods for determination of IBD (Gumboro) virus antigen and antibody // 11-th Int. Congr. World Vet. Poultry Assoc.: Abstr.- Budapest, Hungry, 1997.- P.269.
186. Katz D., Shi W., Wildes M., Hilliard J.K. Automation of serological diagnosis for Herpes B Virus Infections Using Robot-Assisted Integrated Workstations. JALA, 2002, 7, 6, 108—113.
187. Kempf, I. Comparison of serological tests for detection of Mycoplasma gallisepticum antibodies in eggs and chicks hatched from experimentally infected hens /1. Kempf, F. Gesbert, M. Guittet // Res. Vet. Sci. 1997. - Vol. 63, N 3. - P. 211-213.
188. Kibenge F.S.B., Dhillon A.S. A comparison of pathogenecity of four avian reoviruses in chickens // Avian Dis. 1987. - V.31. - P.39-42.
189. King D.J., Seal B. Biological and molecular characterization of Newcastle disease virus (NDV) field isolates with comparisons to reference NDV strains//Avian Dis.-1998.-V.42.-P.507-516.
190. King, D.J. Evalution of different methods of inactivation of Newcastle disease virus and avian influenza virus in egg fluids and serum / D.J. King // Avian Dis. 1991. - Vol. 35, N 3 . - P. 505-514.
191. Kleven S.H. Mycoplasmas in the Etiology of Multifactorial Respiratory Disease // Poultry Sci- 1998.- V.77.- N 8.- P. 1146-1149.
192. Knowles P., Knowles N. J., Mockett A. P. Avian encephalomyelitis virus is a picornavirus and is most closely related to hepatitis A virus // J. Gen. Virol. -1999.-V.80.-P. 653-662.
193. Kothlow S., Hauslaigner R., Kaspers B., Grund C. Evaluation of Newcastle disease virus immunoassays for waterfowl using a monoclonal antibody specific for the duck immunoglobulin light chain Avian Path., -2008.-V. 37, Issue 3 , pages 323 328
194. Kottier S.A., Cavanagh D., Britton P. Experimental evidence of recombination in coronavirus infectious bronchitis virus // Virology. — 1995. — V.213. P.569-580.
195. Kumar R., Mohanty G.C., Verma K.C. Epizootiological studies on egg drop syndrome in poultry // Indian J. Anim. Sci. -1992. -Vol. 62. -P. 497-501.
196. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680685.
197. Lamichhane CM., Kirkegaard L, Collins W. ELISA provides better detection of antibodies to infectious bursal disease virus (IBDV) // 11-th Int. Congr. World Vet. Poultry Assoc: Abstr.- Budapest, Hungry, 1997.- P. 41.
198. Laser H.N., Shane S.M. Infectious bursal disease // World Poultry Sci. J. -1994. -Vol. 50.-P. 133-166.
199. Lau L.T. Detection of animal viruses using nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) / L.T. Lau, Y.W. Fung, A.C.Yu // Dev. Biol. 2006. -Vol. 126.-P. 7-15.
200. Lauerman L. H. Mycoplasma PCR Assays / L. H. Lauerman // Nucleic Acid Amplification Assays for Diagnosis of Animal Diseases /Am. Assoc. Vet. Lab. Diagn.- Auburn, AL, 1998. P. 41-52.
201. Lee C.W. Effect of vaccine use in the evolution of Mexican lineage H5N2 avian influenza virus / C.W. Lee, D.A. Senne, D.L. Suarez // J. Virol. 2004. -Vol. 78 ,№ 15.-P. 8372-8381.
202. Lenstra J.A., Kustera J.G., Koch G. Antigenicity of the peplomer protein of infectious bronchitis virus // Mol. Immunol. 1989. - V.26. - №1. - P.7-15.
203. Levisohn S., Kleven S.N. Avian mycoplasmosis (Mycoplasma gallisepticum) // Rev. Sci. Tech. Off. Jnt. Epiz.- 2000.- V. 19.- N 2.- P.425-442.
204. Li K.S. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia / K.S. Li // Nature. 2004. - Vol. 430. - P. 209213.
205. Liu H.J., Giambrone J.J. In situ detection on reovirus in formalin-fixed, paraffin embedded chicken tissues using a digoxigenin-labelled cDNA probe // Avian Dis.- 1997. V.41,№2. - P.447-451.
206. Liu H.J., Giamborne J.J., Wu Y.H. e. a. The use of monoclonal antibody probes for the detection of avian reovirus antigens//J. Virol. Methods. 2000. -V.86. - P.115-119.
207. Liu H.J., Giambrone J.J., Nielsen B.L. Molecular characterization of avian reoviruses using nested PCR and nucleotide sequensing analysis//J. Virol. Methods. 1997. - V.65,№2. - P.159-167.
208. Liu S, Chen J, Han Z, Zhang Q, Shao Y, Kong X, Tong G. Infectious bronchitis virus: SI gene characteristics of vaccines used in China and efficacy of vaccination against heterologous strains from China. Avian Pathol. 2006 Oct;35(5):394-9.
209. Liu S., Chen J., Kong X., Shao Y., Han Z., Feng L., Cai X., Gu S., Liu M., Isolation of avian infectious bronchitis coronavirus from domestic peafowl (Pavo cristatus) and teal {Anas), J. Gen. Virol. (2005) 86:719- 725.
210. Lohr J.E. Differentiation of IBV strains // Proc. 1st Int. Sym. on Infectious Bronchitis. 1988. - P. 199-207.
211. Louis N., Fender P., Barge A. et al. Cell binding domain of adenovirus serotype 2 fiber // J.Virol. -1994. -Vol. 68. -P. 4104-4106.
212. Lozano L.F., Hammami S., Castro A.E., Osburn B. Comparison of electron microscopy and polyacrylamide gel electrophoresis in the diagnosis of avian reovirus and rotavirus infections // Avian Dis. 1992. - V.36. - P. 183-188.
213. Lukert P.D.,SaifY.M. Infectious bursal disease // Diseases of Poultry. 10th edn. Ames, Iowa, 1997. - P. 721-738.
214. Ma S.H., Tan J.M., Wu Z., Tal X.G. Detection of the antibody of avian egg drop syndrome-76 by using the competition enzyme linked immunosorbent assay // J. of Shanghai Agricult. Colleg. -1991. -Vol. 9, N.4. -P. 285-289.
215. Maas R.A., Oei H.L., Venema-Kemper S. e.a. Dose-response effect of inactivated Newcastle disease vaccine: Influence of serologic assay, time after vaccination, and type of chickens//Avian Dis.- 1999.-V.43.-P.670-677.
216. Mackenzie, D. The bird flu threat / D. Mackenzie // New Scientist. 2006.
217. Makkay A.M., Krell P.J., Nagy E. Antibody detection-based differential ELISA for NDV-infected or vaccinated chickens versus NDV HN-subunit vaccinated chickens//Vet. Microbiol.- 1999.-V.66,№3.-P.209-212.
218. Manual of standards for diagnostic tests and vaccines / Office International des Epizooties, World Organisation for Animal Health. Paris, 2008. - 723 p.
219. Markham P. F., Glew M. D., Brandon M. R., D. Walker I. D., Whithear K. G. Characterization of a major hemagglutinin protein from Mycoplasma gallisepticum//Infect. Immun.-1992.-V.60.-P.3 885-3 891.
220. May J. D., Branton S. L., Pruett S. B., Ainsworth A. J. Differentiation of two strains of Mycoplasma gallisepticum with monoclonal antibodies and flow cytometry // Avian Dis. -1994. -V.38. -P.542-547.
221. McClaren M.L., Lillywhite J.E., Andrew C.S. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Practical aspects of standartization and quality control //Med. Lab. Sci.- 1981.- Vol. 38.-P. 245-251.
222. McFaney K.J., Erny K., Crooks J. A conformational immunogen on VP2 of infectious bursai disease virus that induces virus-neutralizing antibodies that passively protect chickens //J. gen. Virol.-1989.-Vol.70, №6.- P. 1473-1481.
223. McFerran J.B., McCracken R.M. Newcastle disease//Newcastle Disease.-Boston, 1988.-P.161-183.
224. McFerran J.B., McNulty M. S., Curran W.L. Diagnosis of avian viral disease by electron microscopy // Am. J. Vet. Res. -1978. -V. 39. -P. 505-508.
225. McFerran, J.B. Egg drop syndrome // Iova State University. Disease of poultry. USA, 1997. -P. 552-563.
226. McNeilly F., Smyth J.A., Adair B.M. Synergism between chicken anemia virus (CAV) and avian reovirus following dual infection of 1-day-old chicks by a natural route // Avian Dis. 1995. - V.39, N3. - P.532-537.
227. McNulty M.S. Reovirus // Virus infections in birds. Amsterdam e.a., 1993. - V.4. - P.181-193.
228. McNulty M.S., Connor T.J. Biological characterisation of AE virus and enterovirus-like virus // Avian Pathol. 1990. - V. 19, - № 1. - P. 75-87.
229. Meulemans G., Gonze M., Carlier M.C. Protective effects of NH and F glycoprotein-specific monoclonal anribodies on experimental Newcastle disease//Avian Pathol.-1986.-V. 15,№4.-P.761 -768.
230. Meanger J., Wickramasinghe R., Enriquez C. E. Type specific antigenicity of avian reoviruses // Avian Pathol. 1995. - V.24. - P.121-134
231. Medema, J.K. Safety assessment of Madin Darby canine kidney cells as vaccine substrate / J.K. Medema // Dev. Biol. 2006. - Vol. 123. - P. 243-250.
232. Meroz M. An epidemioligical survey of Gumboro disease // Refu. Vet. -1990. -Vol. 23. -P. 235-237.
233. Miradian A., Thorsen J., Julian R.J. Single and combined infections of specific-pathogen-free chickens with infectious bursal disease virus and an intestinal isolate of reovirus // Avian Dis. 1990. - V.34. - P.63-72.
234. Mockett A.P.A., Darbyshire J.H. Comparative studies with an enzyme linked immunosorbent assay for antibodies to avian infectious bronchitis virus // Avian Pathol. 1981. - V. 10. - P. 1 -10.
235. Mohamed K. H., Saif Y.M., Shawky S. Comparison between antigen-capture ELISA and conventional methods used for titration of infectious bursai disease viruses // Avian Dis. 1996. - Vol. 40.- P. 562-566.
236. Morrison T.G. Structure and function of a paramyxovirus fusion protein / T.G. Morrison // Biochim. Biophys. Acta. 2003. - Vol. 1614, N 1. - P. 73-84.
237. Morsy M.A., Panangala V. S., Gresham M. M. Identification of Mycoplasma gallisepticum by use of monoclonal antibody in a rapid slide agglutination test // Am. J. Vet. Res. -1991. -V.52. -P. 1602-1605.
238. Moving V., Czifra G., Renstrom L. A monoclonal antibody blocking ELISA for the detection of IBV antibodies in fowl // Adv. Exp. Med. Biol 1998. - V.440. - P.495-499.
239. Mukiibi-Muka G., Jones R.C. Local and systemic IgA and IgG responses of chicks to avian reoviruses: effects of age of chick, route of infection and virus strain // Avian Pathol. 1999. - V.28. - P.54-60.
240. Muller H., Been H. Biosynthesis of virus-specific proteins in cells infected with infectious bursai disease virus and their significance as structural elements for infectious virus and incomplete particles // J. Virol.- 1982.- Vol.44.- P.384-392.
241. Mundt E., Beyer J., Muller H. Identification of a novel viral protein in infectious bursal disease virus-infected cells //J. gen. Virol.-1995.- Vol.76.- P.437-443.
242. Munster V., Wallensten A., Bestebroer T.M.et al. Characterization of novel influenza a virus hemagglutinin subtype (H5) obtained from black-headed gulls // J. of Virol. 2005.-Vol. 79.-P. 2814-2822.
243. Naeem, K. The avian influenza H7N3 outbreak in South Central Asia / K. Naeem // Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens, GA, USA. U.S. Animal Health Association, Kennet Square, 1998. - P. 31-35. •
244. Naeem K. Use of strategic vaccination for the control of avian influenza in Pakistan / K. Naeem, N. Siddique // Proc. OIE/FAO Int. Conf. on Avian Influenza. Basel etc.: Karger, 2006. - P. 145-150. - (Develop. Biol.Vol. 124).
245. Nakatani H., Nakamura K., Yamamoto Y. et al.Epidemiology, pathology and immunohistochemistry of layer hens naturally affected with H5N1 highly pathogenic avian influenza in Japan // Avian Dis. 2005. - Vol. 49, № 3. - P. 436 -441.
246. Newcastle disease//B.O.I.E.-2000.-V.112,№l-3.
247. Ni Y., Raming R.F., Kemp M.C. Identification of proteins encoded by avian reoviruses and evidence for post-translational modification // Virology. 1993. -V.193. - P.466-469.
248. Nicholas R.A., Ream A.J., Thornton D.H. Replication of avian encephalomyelitis virus in chick embryo neuroglial cell cultures // Arch. Virol. -1987. V.96. - P. 283-287.
249. Nicholas R.A., Reed N.E., Wood G.W., e.a. Detection of antibodies against infectious bursal disease virus: a comparison of three serological methods // Res. ,Vet. Sci.- 1985.- Vol. 38, №2.- P.189-192.
250. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals /OIE. -6nd éd.-Paris, 2008.-Vol.1 Chap. 2.3.4. -P. 465-481.
251. Pallister J.A., Sheppard M. Comparison by restriction enzyme analisis of three fowl adenoviruses of varying pathogenicity // Vet. Microbiol. -1995. -Vol. 48. -P. 155-163.
252. Parede L., Young P.L. The pathogenesis of velogenic Newcastle disease virus infection of chickens of different ages and different levels of immunity//Avian Dis.-1990.-V.34.-P.803-808.
253. Parry S.H., Aitken I.D. Local immunity in the respiratory tract of the chicken. 2 The secretory immune response to Newcastle disease virus and the role of IgA//Vet. Microbiol.-1977.-V.2.-P. 143-165.
254. Penzes Z., Meszaros I. Comparison of different computational methods for measuring antibodies to avian Infectious bronchitis virus in single serum dilution I I Acta Vet. Hun. 1992. -V.40. -P.311-321.
255. Perez D.R. Land-based birds as potential disseminators of avian/mammalian reassortant influenza A viruses / D.R. Perez, R.J. Webby, R.G. Webster // Avian Dis. 2003. - Vol. 47 - P. 1114-1117.
256. Perkins L.E.L., Swayne D.E. Comparative susceptibility of selected avian and mammalian species to a Hong Kong-origin H5N1 high-pathogenicity avian influenza virus // Avian Dis. 2003. - Vol. 47. - P. 956-967.
257. Pertile T.L., Walser M.M., Sharma J.M., Shivers J.L. Immunohistochemical detection of lymphocyte subpopulations in the tarsal joints of chickens with experimental viral arthritis // Vet. Pathol. 1996. - V.33, №3. - P.303-310.
258. Piela T.H., Yates V.G., Chand P.W. Use of egg yolk to determine antibody levels in chickens inoculated with a haemagglutinating duck adenovirus (adenovirus 127-like) // Avian Diseases. -1985. -Vol. 29. -P. 457-464.
259. Pringle C.R. Virus Taxonomy- 1999//Arch Virol.-1999.-V.144,№2.-P.421-429.
260. Quantification of the effect of transmission of avian influenza (H7N7) in chickens / J.A. van der Goot, G. Koch, M.C.M. de Jong, M. van Boven // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005.-Vol. 102.-P. 18141-18146.
261. Raj G., Thangvrlu A., Govindarajan R. Precipitation reaction with Newcastle disease virus//Trop. Anim. Health Prod.-1995.-V.27,№2.-P.71-75.
262. Razin S., Yogev D., and Naot Y. Molecular Biology and Pathogenicitity of Mycoplasmas // Microboilogy and Molecular Biology Reviews.- 1998.-V 62, N 4.-P.1094-1156.
263. Reynolds D.L., Maraqa A.D. Protective immunity against Newcastle disease. The role of antibodies specific to Newcastle disease virus polypeptides//Avian Dis.-2000.-V.44.-P. 138-144.
264. Reynolds D.L., Maraqa A.D. Protective immunity against Newcastle disease. The role of cell-mediated immunity//Avian Dis.-2000.-V.44.-P.145-154.
265. Rosenberger J. K., Olson N.O. Viral arthritis // Diseases of Poultry. 10th ed. -Ames, Iowa, 1997.-P.711-720.
266. Rosenberger J. K., Sterner F.J., Botts S. e. a. In vitro and in vivo characterization of avian reoviruses. I. Pathogenicity and antigenic relatedness of several avian reovirus isolates // Avian Dis. 1989. - V. 33. - P.535-544.
267. Rosenberger J.K., Gelb J. Response to several avian respiratory viruses as affected by infectious bursal disease virus // Avian Dis. 1978. - Vol. 22. - P. 95105.
268. Rosenberger J.K., Saif Y.M., Jackwood D.J. Infectious bursal disease // A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens / Published by the American Association of Avian Pathologists, 1998.- P. 215-218.
269. Rosengarten R., Wise K. S. Phenolypic switching in mycoplasmas. Phase variation of diverse surface lipoproteins // Science.-1990.-V.247.-P.315-318.
270. Rott R. Molecular aspects of Newcastle disease virus patogenicity// Proc. Workshop on Avian Paramyxoviruses.-Rauischholzhausen, 1992.-P. 139-144.
271. Roy P. Venugopalan A.T. Dot-enzime linked immunosorbent assay for demonstration of Newcastle disease virus infection//Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis.- 1999.-V.22,№l .-P.27-31.
272. Ruff M.D., Resenberger J.K. Interaction of reoviruses and coccidia in poultry // Proceedings and abstracts. 1984. - P.537-539.
273. Russels W.C., Adrian T., Bartha A. Classification and Nomenclature of viruses sixth report of the International Committee on "Taxonomy of viruses" // Virus Taxonomy-Wien, NewYork, 1995.-P. 128-133.
274. Russell P.H. Monoclonal antibodies in research, diagnosis and epizootiology ofNewcastle disease//Newcastle Disease.-Boston, 1988.-P.131-146.
275. Russell P.H., Ezeifeka G.O. The Hitchner B1 strain ofNewcastle disease virus induces high levels IgA, lgG and lgM in newly hatched chicks//Vaccine.-1995.-V.113.-P.61-66.
276. Russell P.H., Koch G. Local antibody forming cell responses to the Hitchner B1 and Ulster strains ofNewcastle disease virus//Vet Immunol Immunopathol.-1993 .-V.37.-P. 165-180.
277. Sapats S.I., Ashton F., Wright P.J., Ignjatovic J. Sequence analysis of the SI glycoprotein of infectious bronchitis viruses identification of a novel genotypic group in Australia // J. Gen. Virol. - 1996. - V.77. - P.413-418.
278. Senne D.A., Suarez D.L., Stallnecht D.E.et al. Ecology and epidemiology of avian influenza in North and South America // Proc. OIE/FAO Int. Conf. on Avian Influenza. Basel: Karger, 2006. - P. 37-44. - (Develop. Biol.Vol. 124).
279. Shafren D. R., Tannock G. A., Groves P. J. Antibody responses to avian encephalomyelitis virus vaccines when administered by different routes // Austral. Vet. J. 1992. - V.69. - P. 272-275.
280. Shafren D.R., Tannock G.A., Roberts T.K. Development and application of an ELISA technique for the detection of antibody to avian encephalomyelitis viruses // Rec. Vet. Sci. 1989. - V. 46, № 1. - P. 95-99.
281. Shafren D.R., Tannock G.A. Development and application of an improved-infectivity assay for the standardization of avian encephalomyelitis vaccines //
282. Vaccine. 1990. - V. 8, №3. - P. 283-285.
283. Shappouri M.R.S., Kane M., Letarte M. e.a. Cloning, sequensing and expression of the SI gene of avian reovirus // J. Gen. Virol. 1995. - V.76,№6. -P.1515-1520.
284. Silim A., Venne D. Comparison of egg-yolk and serum antibody titres to four avian viruses by enzyme-linked immunosorbent assay using paried field samples // Avian Dis. 1989. - V.33,№4. - P.643-648.
285. Snyder D.G., Marguardt W.W., Mallinson E.T., Russel E. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. 1. Measurement of Antibody Activity Titer Against Newcastle Disease Virus in a Single Serum Dilution // Avian Diseases. -1983. -Vol. 27. -P. 161-170.
286. Snyder D.B.,Marquardt W.W., Mallinson E.T., e.a. Rapid serological profiling by enzyme-linked immunosorbent assay. 4. Association of infectious bursal disease serology with broiler flock performance // Avian Dis.- 1986.- Vol. 30.- P. 139-148.
287. Snyder D.B., Marguardt W.W. Laboratory manual for isolation and identification of avian pathogens // American Assotiation of avian pathologists. -1989. -P. 161-170.
288. Snyder D.B. Changes in the field status of infectious bursal disease virus // Avian Pathol. 1990. - Vol. 19. - P. 419-423.
289. Solano W., Giambrone J.J., Williams J.C., e.a. Effect of maternal antibody on timing of initial vaccination of young white leghorn chickens against infectious bursal disease virus // Avian Dis.-1986.- Vol. 30, №4.- P. 662-671.
290. Stallknecht, D.E. Ecology and epidemiology of avian influenza viruses in wild bird populations / D.E. Stallknecht // Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza / Animal Health Association. — Athens, GA, USA, 1998,- P. 61-69.
291. Stegny B.T., Nalivaiko L.I., Shomin A.A., Yu I. Studing of epizootic situation on egg-drop-syndrome (EDS-76) in Ukraine // 11th International Congress of the World Veterinary Poultry Association: Abstr. -Budapest, Hungary, 1997.-P. 248.
292. Stern D.F., Burgess L., Sefton B.M. Structural analysis of virion proteins of avian Coronavirus infectious bronchitis virus // J. Virol. 1982. - V.42. - P.208-219.
293. Stoute S.T., Jaclcwood D.J., Sommer-Wagner S.E. The diagnosis of very virulent infectious bursal disease in California pullets // Avian Dis. 2009. - Vol. 53, №2.-P. 321-326.
294. Sterner F. J., Rosenberger J.K., Margolin A., Ruff M.D. In vitro and in vivo characterization of avian reoviruses. 2. Clinical evaluation of chickens infected with two avian reovirus pathotypes // Avian Dis. 1989. - V. 33. - P.545-554.
295. Takase K., Nishikawa H., Matsuo K., Yamamoto M. Immunological studies on highly virulent avian reovirus, strain 58-132 // J. Japan Vet. Med. Assoc. 1989. - V.42. -P.108-111.
296. Takehara K., Kimura Y., Tanaka Y., Yoshimura M. Preparation and characterization of monoclonal antibodies against an avian reovirus // Avian Dis. -1987. V.31,№4. - P.730-734.
297. Tannock G. A, Shafren D.R. Avian encephalomyelitis. A review // Avian Pathol. 1994. - V.23. - P. 603-620.
298. Tham K.M., Young L.W., Moon CD. Detection of infectious bursal disease virus by reyers transcription-polymerase chain reaction amplification of the virus segment A gene//J. Virol. Meth. -1995. -Vol. 53. P. 201-212.
299. Thayer S.G., Villegas P., Fletcher O.J. Comparison of two commercial enzyme-linked immunosorbent assays and conventional methods for avian serology//Avian Dis.-1987.-Vol. 31.-P. 120-124.
300. Thomas C. B., Sharp P. T. Detection of antigenic variation among strains of Mycoplasma gallisepticum by enzyme-linked immunosorbent inhibition assay (ELI SI A) and Western blot analysis // Avian Dis.-1988.-V.32.-P.748-756.
301. Todd. D.,McNulty M.S. Biochemical studies on a virus associated with egg drop syndrome-1976 // J. Gener Virol. -1978. -Vol. 40. -P. 63-75.
302. Tsukamoto K., Matsumura T., Mase M., Imai K. A highly sensitive, broad-spectrum infectivity asay for Infectious bursal disease virus // Avian Dis. 1995. -Vol. 39, №3.-P. 575-586.
303. Tsukamoto K., Obata /-/., Hihara H. Improved preparation of ELISA antigen of infectious bursal disease virus // Avian Dis. 1990 - Vol. 34, №1 - P. 209-213.
304. Tsukamoto K., Tanimura N., Kakita S., e.a. Efficacy of three live vaccines against highly virulent infectious bursal disease virus in chickens with or without maternal antibodies // Avian Dis. 1995. - Vol. 39, №2. - P. 218-247.
305. Van den Berg T. Highly pathogenic H5N1 influenza virus in smuggled Thai eagles, Belgium / T. van den Berg, B. Lambrecht, S. Van Borm // Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol. 11, № 5. - P. 702 - 705.
306. Van Veen L., Dwars M., Fabri T. Ataxia and paralysis in meat chickens, as a result of an infection with avian encephalomyelitis virus in the breeding flock // Tijdschr. Diergeneeskd. 1998. - V.l, 123, № 11. - P. 344-348.
307. Varela R., Javier Benavente. Protein coding assigment of avian reovirus strain SI 133 //J. Virol. 1994. - V.68,№10. - P.6775-6777.
308. Villegares P. Avian virus disease. Laboratory Manual//College of Veterinary Medicine, Athens, Georgia, 1995.-P.89.
309. Westbury H.A. Transmissibility of two avian influenza A viruses (H7N7) between chicks / H.A. Westbury, A.J. Turner, C. Amon // Avian Pathol 1981-Vol. 10- P. 481-487.
310. Whithear K.G., Walker I.D. Physical mapping of a repertoire of homologous haemagglutinin genes in Mycoplasma galliseplicum // IOM Letters.- 1992.-V. 2.-P. 262.
311. Wickramasinghe R., Meanger J., Enriquez C.E., Wilcox G. Avian reovirus proteins associated with neutralization of virus infectivity // Virology. 1993. -V.194. - P.688-696.
312. Wigand R., Adrian T. Classification and epidemiology of adenoviruses // Adenovirus DNA. -Boston, 1986. -P. 409-441.
313. Wild ducks are the reservoir for only a limited number of influenza A subtypes / G.B. Sharp, Y. Kawaoka, S.M. Wright et al. // Epidemiol. Infect. — 1993.- Vol. 110.- P. 161-176.
314. Williams R., Boshoff Ch.H., Verwoerd D. e.a., Detection of antibodies to Newcastle disease virus in ostriches by an indirect ELISA//Avian Dis.-1997.-V.41 ,№4.-P.864-869.
315. Wilson R.A., Perrotta J., Eckroade R.J. An ELISA that measures protective antibody levels to Newcastle disease virus in chicken//Avian Dis.-1984.-V.28,№4-P.1079-1085.
316. World Health Organization Global Influenza Program Surveillance Network Evolution of H5N1 avian influenza viruses in Asia / Emerg. Infect. Dis. 2005. — Vol. 11.-P. 1515-1521.
317. Wood M.K., Ladman B.S., Preskenis L.A., Pope C.R., Bautista D.A. and J. Gelb, Massachusetts Live Vaccination Protects Against a Novel Infectious Bronchitis Virus SI Genotype DMV/5642/06 Avian Dis.-2008.- V. 53, 1,P. 119123.
318. Wu J.T.Y., Wong L.S.Y., Bowlby E.E. An automated high-throughput screening enzyme linked immunoassay for Johne's disease antibodies in bovine serum JALA, 2006, 10, 323—330.
319. Wyeth P.J. Effect of infectious bursal disease on the response of chickens to S. typhimurium and E. coli infections //Vet. Rec. -1975. Vol. 96. - P. 238-243.
320. Xie Z., Fadl A.A., Girshick T. e.a. Amplification of avian reovirus using the reverse transcriptase polymerase chain reaction // Avian Dis. - 1997. - V.41. -P.654-660.
321. Xua J., Zhangb Z., Yina Y, Cuib S., Xua S. e.a. Development of reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of infectious bursal disease virus Journal of Virol. Meth., 162 (2009) P. 267-271
322. Yawei N. I., Ramig R. F., Kemp M. C. Identification of protein encoded by avian reoviruses and evidens for posttranslational modification // Virology. 1993.- V.193. P.466-469.
323. Yin H.S., Shieh H.K., Lee L.H. Characterisation of the double-stranded RNA genome segment S3 of avian reovirus//J. Virol. Methods. 1997. - V.68. -P.93-101.
324. Yoder H.W. A historical account of the diagnosis and characterization of strains of Mycoplasma gallisepticum // Avian Dis.-1986.-V.30.-P.510-518.
325. Yogev D., Levisohn S., Razin S. Genetic and antigenic relatedness between Mycoplasma galliepticum and Mycoplasma synoviae // Vet. Microbiol.-1989.-V.19.-P.75-84.
326. Yale J. Cultivation and identification of mycoplasmas //J. Biol, and Med. -1983 .1 -V.56, N 5. P.819.
327. Zajac J., Novotna L. Evaluation of the results of ELISA in the quantitative determination of antibodies against bursitis in poultry // Vet. Med. (Praha).-1992,-Vol.36, №12,- P.737-743.
328. Zakharchuk A.N., Kruglyak. V.A., Akopian T.A. et al. Physical mapping and homology studies of egg drop syndrome (EDS-76) adenovirus DNA // Arch. Virol. -1993. -Vol. 128. -P. 171-176.
329. Zanella. A., Di Donato A., Nigrelli A., Poli G. Egg drop syndrome (EDS -76). Etiopathogenesis, epidemiology, immunology and control of the disease // Clin. Veter. -1980. -Vol. 103,N. 7. -P. 459-469.
330. Zellen G.K., Thorsen S. Standardization and application of enzyme-linked immunosorbent assay for infectious bronchitis // Avian Disease. 1986. - V.30. — P.695-698.
331. Zeydanli M.M., Redmann T/, Kaleta E.F., Alexander D.J. Isolierung und Charakterisierung von Paramyxoviren aus Puten//Seminar über Isolierung und Characterisiezurung von aviären Paramyxoviren.-Gießen, 1989.-S.26-33.
332. Zhang L., Laycock J.D., Miller K.J. Quantitative small molecule bioanalysis usingchip-based nano ESI-MS/MS. JALA, 2004, 9, 3, 109—116.
333. Zobisch H., Gaede W., Kretzschmar C. Development and testing of an indirect ELISA for the detection of antibodies against avian encephalomyelitis // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr.- 1994. Bd. Mar 107, № 3. - S 85-90.
334. Zsak L., Kisary G. Some biological and physico-chemical properties of egg drop syndrome (EDS) avian adenovirus strain B8/78 // Arch Virol. -1981. -Vol. 68. -P. 21; 1-19.
335. Zsak L., Szekely A., Kisary J. Experimental infection of joung and laying geese with egg drop syndrome 76 adenovirus strain B8/78 // Avian Pathol. -1982. -Vol. 11.-P. 555-562.1. НЛ ИЗОБРЕТЕНИЕ2192014у. "-----
336. Российским агентством по патентам и товарным знакам на основании Патентного закона Российской Федерации, введенного в действие 14 октября 1992 года, выданнастоящий патент на изобретение•У--:.;.-.-»-,-.-., члл^.ЧЪ.»'^-.''-'*.-: •• • , ■ ■
337. НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ1. Пате! ггообдадател ь(ли):
338. Федеральное государственное у1рефдение ^Всероссийский нау1но исследовательский институт Защиты фивотпыхпо заявке № 2001103506, дата поступления: 05.02.2001■
339. Приоритет, от 05.02.2001 |||р1тор(ы) изобретения:1. Шсн. на обороте' ■ ■ ■ ' •
340. Патент действует на всей территории Российской Федерации в течение 20 лет с 5 февраля 2001 г. при условии своевременной уплаты пошлины заподдержание патента в силе. • .•: : . •. • •
341. Зарегистрирован в Государственном реестре Г изобретений Российской ФедерациилКИНИмл^Н Нг г. Москва, 27 октября 2002 г.ч :
-
Мудрак, Наталья Станиславовна
-
доктора биологических наук
-
Владимир, 2010
-
ВАК 03.02.02
- Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных
- Разработка тест-системы для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа
- Применение бетулина для повышения поствакцинального иммунитета против ньюкаслской болезни и инфекционного бронхита кур у цыплят-бройлеров
- Создание комплексной системы профилактики бактериальных болезней птиц в хозяйствах промышленного типа
- Серологическая диагностика аденовирусного гепатита с тельцами - включениями гидроперикардита методом непрямого иммуноферментного анализа
