Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Серологическая диагностика аденовирусного гепатита с тельцами - включениями гидроперикардита методом непрямого иммуноферментного анализа

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Серологическая диагностика аденовирусного гепатита с тельцами - включениями гидроперикардита методом непрямого иммуноферментного анализа"

На правах рукописи

БОРИСОВА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА АДЕНОВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С ТЕЛЬЦАМИ - ВКЮЧЕНИЯМИ ГИДРОПЕРИКАРДИТА МЕТОДОМ НЕПРЯМОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Работа выполнена в отделе вирусологии и опухолевых болезней птиц Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства» Российской академии

сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Джавадов Эдуард Джавадович,

доктор ветеринарных наук, профессор,

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Данко Юрий Юрьевич,

доктор ветеринарных наук, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», профессор кафедры эпизоотологии им. В.П.Урбана

Смоленский Владимир Иванович доктор биологических наук, профессор заместитель директора по государственному контролю и стандартизации, заведующий отделением биологических лекарственных средств для животных ФГБУ ВГНКИ

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко» Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита диссертации состоится «5 декабря» 2013 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан « 5 » ноября 2013 г., размещен на сайтах ВАК Минобрнауки РФ и http: // spbgavm.ru.

Ученый секретарь /)

диссертационного совета (/у??/? Белова Лариса Михайловна

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования. Надежное благополучие по инфекционным болезням является одним из непременных условий успешного ведения промышленного птицеводства.

Для крупных птицеводческих комплексов особую опасность представляют вирусные болезни, в том числе аденовирусный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит, из-за их недостаточной изученности, высокой контагиозности, большого разнообразия путей и факторов передачи инфекционного агента. Проблема вирусных болезней приобретает все возрастающую актуальность еще и по той причине, что некоторые инфекционные болезни стали протекать атипично, значительно возросла роль ассоциации различных агентов вирусной и бактериальной природы.

Аденовирусный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит (АДВГТ) (инфекционный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит, инфекционный гидроперикардит (ИГЛ) кур, болезнь Ангара, инклюзионный гепатит, гидроперикардиальный синдром) - высококонтагиозная вирусная широко распространенная болезнь цыплят, основными патологоанатомическими признаками которой являются: накопление транссудата в перикардиалыгой полости, гепатит и нефрозо-нефрит. АДВГГ регистрируется во многих странах мира, как у бройлеров, так и у несушек. Экспериментально доказано, что в возникновении болезни доминирующая роль принадлежит первой группе аденовирусов, 1 и 4-го серотипов [1].

Степень тяжести течения АДВГТ в природных условиях во многом зависит от влияния некоторых иммунодепрессивных агентов, таких как вирус инфекционной бурсальной болезни, болезни Марека и вирусной анемии цыплят и тогда болезнь протекает со сложной симптоматикой. В связи с этим основная роль в постановке правильного диагноза на ИГП принадлежит лабораторным методам.

Степень разработанности проблемы. Вопросам серологической диагностики АДВГГ птиц посвящены работы ряда авторов [1,3,4], однако разработанные ими

3

методы имеют недостатки. Предложенная [4] реакция диффузионной преципитации в агаровом геле с применением печеночного гомогената в качестве неочищенного антигена уступала по чувствительности ИФА.

Степень тяжести АДВГГ во многом зависит от влияния иммунодепрессивных агентов, таких как вирус болезни Гамборо, болезни Марека и инфекционной анемии цыплят и тогда болезнь протекает со сложной симптоматикой, вызывая серьезные экономические потери. В связи с этим необходимо разработать высокочувствительный и специфичный метод серологической диагностики.

Цель и задачи. Целью данной работы явилась разработка диагностической тест-системы для выявления антител к возбудителю АДВГГ в сыворотке крови кур на основе непрямого метода ИФА.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- получить высокоочищенный антиген возбудителя АДВГГ птиц для ИФА и специфическую гипериммунную сыворотку кур;

- определить оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия;

- установить величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции и разработать способ опосредованного расчета титров антител при тестировании проб в одном разведении;

- дать оценку чувствительности и специфичности разработанной тест-системы;

- изучить динамику формирования антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против АДВГГ;

- провести серологический мониторинг на АДВГГ птиц с применением разработанной тест-системы;

- разработать Методические положения по лабораторной диагностике АДВГТ птиц методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна. Разработана иммуноферментная тест-система для выявления специфических антител к возбудителю аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита при тестировании проб сыворотки крови кур в одном разведении. Отработан метод получения высокоочищенного антигена вируса АДВГГ птиц, определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия, а также установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, разработан способ опосредованного расчета титра антител при тестировании проб в одном разведении. Дана сравнительная оценка непрямого метода ИФА с реакцией диффузионной преципитации в агаровом геле при АДВГГ птиц. Установлена высокая чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител в сыворотке крови кур к возбудителю АДВГГ птиц.

Изучена динамика формирования антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против АДВГГ.

Теоретическая н практическая значимость работы. Практическая ценность разработанного диагностического набора для выявления антител к вирусу АДВГТ птиц подтверждается положительными результатами испытаний при проведении серологического контроля над распространением АДВГГ птиц, оценки эффективности иммунизации поголовья цыплят против данной болезни; ретроспективной диагностики АДВГТ птиц по приросту уровня специфических антител.

Разработаны ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии и утверждены академиком-секретарем А.М.Смирновым Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии методические положения «Лабораторная диагностика аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита птиц методом иммуноферментного анализа» от 02 июля 2013 г.

Методология и методы исследования

Вирус: В работе использовали возбудитель аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита кур, производственный штамм "Т 12" 4-го серотипа.

5

Инкубационные яйца фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия) , 50 штук; цыплята 28-суточиош возраста, полученные из хозяйства, благополучного по острым инфекционным болезням, 60 голов.

Растворы и реактивы: калий фосфорнокислый однозамещенный, ч.; калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, х.ч.; натрия хлорид, х.ч.; 0,05М фосфатно-цитратный буфер; 0,05М карбонат-бикарбонатный буфер и 0,01М фосфатно-солевой буфер; перекись водорода производства ОАО «Татхимфармпрепараты»; ортофенилендиамин фирмы «Sigma»; твин 20 (Р7949) фирмы «Sigma»; агар «Дифко».

Получение вируса ИГП на цыплятах. Для постановки опытов использовали СПФ цыплят 15 - суточного возраста. Заражение проводили подкожно. Материалом для инфицирования служила 10% суспензия, приготовленная из печени павших цыплят с признаками АДВГГ, по общепринятой методике.

Инактивацию вируса проводили формальдегидом в конечной концентрации 0,1% при температуре +37°С и экспозиции 48 часов.

Очистку вируссодержащего материала проводили методом гельхромаггографии на макропористом стекле (МПС), обработанном поливинилпирролидоном (ПВП).

Постановка реакции диффузионной преципитации в агаровом геле. РДП в агаровом геле ставили по методу, предложенному Оухтерлони [2], с использованием 1% агара «Дифко».

Получение антивидового иммунопероксидазного конъюгата против IgG курицы. Конъюгат получали модифицированным методом периодатного окисления [5] при совместной работе с ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи», г. Москва.

Статистическая обработка данных. Использовали общепринятые методы оценки дисперсии, стандартного отклонения и доверительного интервала варьирующих переменных, устанавливали количественные показатели связи зависимых переменных в виде коэффициентов корреляции или коэффициентов регрессионных уравнений. Для соответствующих вычислений применяли компьютерную программу Microsoft Excel.

6

Положения, выносимые на защиту:

- тест-система, разработанная на основе непрямого метода ИФА для выявлен™ и оценки титров антител к вирусу АДВГГ в сыворотке крови кур при тестировании проб в одном разведении, включающая обоснования оптимальных концентраций компонентов и условий их взаимодействия, пороговых показателей реакции и способ опосредованного расчета титра антител;

- результаты сравнения разработанной тесг-системы и реакции диффузионной преципитации в агаровом геле;

- данные динамики выработки антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против АДВГГ;

- результаты серологического мониторинга на АДВГГ с применением разработанной тест-системы.

Степень достоверности и апробация результатов.

Научные положения, выводы и практические рекомендации, сформулированные в диссертационной работе научно-обоснованы, достоверны и вытекают из результатов собственных исследований. Исследования проведены на большом фактическом материале с использованием современных вирусологических, биохимических и серологических методов исследований.

По результатам научных исследований опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, и 4 статьи опубликованы в сборниках материалов конференций и конгрессов.

Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии и ОБП и Ученого совета ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2010-2013гг.), Международной научно-практической конференции молодых ученых «Аграрная наука XXI века. Актуальные исследования и перспективы (Санкт-Петербург-Пушкин, 2013); «Инновационные решения актуальных проблем в АПК»: материалы Всероссийской научно-практической

конференции молодых ученых и специалистов (Екатеринбург, 2013).

Диссертация изложена на 109 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение, основная часть, заключение, список сокращений, список литературы и приложения.

Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 9 рисунками. Список литературы включает 134 источников, из которых 87 зарубежных.

2. Основное содержание работы 2.1. Получение специфических компонентов для ИФА

2.1.1. Получение очищенного антигена вируса. Важнейшим условием непрямого метода ИФА является наличие высокоочищенных препаратов вируса. Активный антиген аденовируса кур получали из вируссодержашего материала (ВСМ) зараженных цыплят 15-суточного возраста. От цыплят с характерной патологоанатомической картиной болезни отбирали печень и готовили гомогенат печени на 0,01 М фосфатно-солевом буфере (рН 7,3-7,5) в соотношении 1:1. Материал трехкратно замораживали и оттаивали и центрифугировали при 1000g в течение 30 минут. Вирус АДВГГ, полученный из гомогената печени цыплят, имел активность в РДП 1:16-1:32. Инактивированный вирус очищали методом молекулярно-ситовой хроматографии на МПС с диаметром пор 1200 А (ангстрем) 0,01 М натрий-фосфатным буфером с содержанием 0,15 М хлорида натрия, рН 7,27,4, со скоростью элюции 1-2 см3/ см2 /мин. Объем наносимого вируссодержащего материала равнялся 0,8 см3. Вируссодержащие фракции объединяли и исследовали на содержание вирусного белка. Результаты исследований показали, что очистка ВСМ, используя МПС с диаметром пор 1200 А , 0,01 М ФБР, рН 7,3-7,5 и количество наносимого вирусного материала равное 0,8 см3, приводила к оптимальному разделению вирусного и примесного белка. По внешнему виду очищенный антиген аденовируса представлял собой прозрачную коричневатую жидкость, без хлопьев и осадка. Степень очистки вируса оценивали по белку. Очистка вируса составила 98,5%. Содержание белка в исследуемых пробах колебалось от 70 до 90 мг в 1,0 см3. Таким образом, полученный высокоочищениый антиген аденовируса использовали

для адсорбции на полистироловые планшеты и для получения специфической гипериммунной сыворотки крови кур.

2.1.2. Получение отрицательной и положительной сыворотки крови кур.

Отрицательную и специфическую гипериммуннуго сыворотку крови кур к аденовирусу получали на клинически здоровых цыплятах 20-суточного возраста, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней. Оптимальным методом получения гипериммунной сыворотки крови кур явилось трехкратное введение птице очищенного аденовируса по схеме: двукратное подкожное введение антигена в объеме 0,5 см3 с интервалом в 7 сут. Третья внутрибрюшинная иммунизация через 7 сут. в объеме 1,0 см3. Через 14 сут. после последней иммунизации цыплят тотально обескровливали. Активность полученной гипериммунной сыворотки в реакции диффузионной преципитации в агаром геле была 1:16-1:32. Отрицательная сыворотка крови цыплят не содержала антител к возбудителям вирусных болезней, в том числе и к возбудителю АДВГТ. Таким образом, нами была получена положительная высокоактивная специфическая сыворотка крови к аденовирусу и отрицательная сыворотка крови цыплят, которая была необходима для отрицательного контроля при постановке ИФА и получения антивидового иммунопероксидазного конъюгата.

2.2. Разработка иммунофермеитной тест-системы для выявления антител к аденовирусу в сыворотке крови кур

2.2.1. Определение оптимальных концентраций и условий взаимодействия

компонентов.

2.2.1.1. Определение сенсибилизирующих доз антигена вируса АДВГГ.

Оптимизацию параметров постановки реакции для выявления антител к аденовирусу болезни проводили по иммуноспецифическим и неспецифическим компонентам диагностической тест-системы. В ходе отработки условий получения активного твердофазного иммуно сорбента оценивали влияние концентрации антигена аденовируса, температуры и значения рН реакционной среды и продолжительность сорбции.

Выбор оптимальной концентрации антигена проводили в диапазоне от 1,0 до 10 мкг/см3 при продолжительности сорбции в течение 16-18 часов при 4°С в 0,01 М фосфатно-солевом буфере, рН=7,3-7,5 с разведением контрольных сывороток 1:400. Оптимальной сенсибилизирующей дозой антигена явилась концентрация 5-8 мкг/см3, при которой значения экстинкции достигали максимума. При этом кривая линия выходила на «плато», что свидетельствовало о насыщении поверхности лунок вирусным белком. Дальнейшее увеличение концентрации антигена (более 8,0 мкг/см3) не приводило к возрастанию емкости твердофазного иммунособрента. При концентрации белка менее 5,0 мкг/см3 имело место значительное снижение величины экстинкции и, как следствие, уменьшение чувствительности анализа. Кроме того, на последующих этапах ИФА это могло привести к повышению фонового сигнала вследствие неспецифической сорбции молекул конъюгата на свободных поверхностях полистирола.

2.2.1.2. Определение рН сорбирующего буфера. Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФА, является рН сорбирующей буферной системы. Известно, что для фиксации различных вирусных антигенов используются две системы: 0,01М фосфатно-солевой буфер с 0,15 М №С1 (ФСБ), рН 7,3-7,5 и 0,05 М натрий-карбонатный буфер, рН 9,5-9,7.

При выборе оптимального значения рН сорбирующей буферной системы планшеты для ИФА сенсибилизировали очищенным антигеном в 0,01М фосфатно-солевом буфере с 0,15 М ИаС1, рН 7,3-7,5 и 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5-9,7. Интенсивность реакции в указанном диапазоне варьировала. Она достигала максимума при рН 9,5-9,7 и превышала экстинкцию при рН 7,3-7,5. Полученные данные свидетельствуют о том, что при рН 9,5-9,7 адсорбция антигена на поверхности полистирола была выше, чем при рН 7,3-7,5. Однако, учитывая тот факт, что очистку вируса проводили на 0,01 М фосфатно-солевом буфере, рН 7,3-7,5, то и для адсорбции антигена аденовируса использовали данный буфер.

2.2.13. Определение времени и температуры сорбции антигена вируса. Влияние продолжительности инкубации и температуры на фиксацию антигена

изучали с использованием оптимальной концентрации очищенного вируса в фосфатно-солевом буфере, рН 7,3-7,5. Сенсибилизацию полистироловых планшет антигеном проводили при 4° и 37°С в течение 2 и 16 часов . Изучение кинетики сорбции показало, что при температурах 4°С полное насыщение поверхности твердой фазы антигеном происходило через 16 часов, тогда как при температуре 37°С время сорбции сокращалось до 2 часов. По-видимому, с увеличением температуры происходит увеличение коэффициента диффузии белка и время достижения равновесия уменьшается. Исходя из полученных данных нами был сделан вывод о том, что наиболее оптимальным режимом сенсибилизации полистироловых планшет антигеном вируса АДВГГ является инкубация при 4°С в условиях бытового холодильника в течение 16 часов.

Анализ результатов по оптимизации условий получения активного твердофазного иммуносорбента показал, что необходимо учитывать природу полимера, используемого в качестве твердой фазы. Известно, что полистирол характеризуется большей сорбционной емкостью по сравнению с другими носителями.

2.2.1.4. Определение времени и температуры инкубации сывороток с адсорбированным антигеном вируса. Существенную роль на данном этапе ИФА играет установление константы равновесия между иммобилизованным на поверхности полистирола антигеном и антителами и на последующем этапе между образовавшимся иммунным комплексом (антиген-антитело) и иммунопероксидазным конъюгатом. Определение оптимального режима инкубации сыворотки крови кур с адсорбированным на планшетах антигеном вируса проводили при температуре 37°С в течение 30, 45 и 60 минут. В таком же режиме проводили и инкубацию иммунопероксидазного конъюгата. Равновесие в системе при температуре 37°С наступает практически через 30 минут. Увеличение инкубации до 45 и 60 минут сопровождалось возрастанием величин экстинкции на 15 и 20% соответственно, однако при этом отмечался рост «фонового» окрашивания. Предусматривая стабильность и воспроизводимость результатов, при постановке

иммуноферментного анализа сыворотки крови птиц и иммунопероксидазный кокьюгат инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 30 минут.

2.2.1.5. Определение специфичности иммуноферментного анализа. В

твердофазных иммуноферментных анализах специфичность определяется минимальным «фоновым» сигналом, обусловленным неспецифическими взаимодействиями примесных (на этапе инкубации исследуемых проб сыворотки) и избыточных компонентов (на этапе инкубации конъюгата). Для устранения неспецифических взаимодействий, таких как «твердая фаза-белок» и «белок-белок», используются промывочные буферные системы, включающие неионный детергент (твин-20) и иммунологически инертные белки (бычий сывороточный альбумин). При выборе оптимального промывочного буфера использовали: ФСБ рН 7,3-7,5 с 0Д5М ШС1, ФСБ рН 7,3-7,5 с 0,15М КаС1 и 0,05% твин-20 и ФБР рН 7,2-7,4 с 0,5М №С1 с 0,1% твин-20. На основании результатов сравнительной оценки в настоящей диагностической тест-системе был использован 0,01 М натрий-фосфатный буфер, содержащий 0,5М ЫаС1 с 0,1% конечной концентрацией детергента твин-20, обеспечивающий специфичность иммуноферментного анализа.

2.2.2. Определение диагностического титра сыворотки в ИФА.

Для определения диагностического титра в ИФА очищенный антиген аденовируса в стандартной концентрации сорбировали на поверхности лунок планшет 0,01М фосфатно-солевым буферным раствором, рН 7,3-7,5, в течение 16 часов при температуре 4°С. Затем, начиная с разведения 1:100, методом «шахматного» титрования, были раститрованы 20 проб сыворотки крови из птицеводческих хозяйств, благополучных по АДВГГ птиц, 2 гипериммунные сыворотки крови кур к возбудителю АДВГГ кур и 4 гетерологичных сыворотки крови кур к: метапневмовирусу, реовирусу, вирусам инфекционного бронхита и инфекционного энцефаломиелита кур (из ИФА наборов «Биочек»), а также 8 проб сыворотки крови цыплят из ОАО «Птицефабрика Ударник» Ленинградской области. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Определение диагностического титра в ИФА

№ проб сыворотки Сыворотка к вирусу: Титр в ИФА Интерпретация результатов

1-20 Сыворотка крови кур из благополучных по АДВГГ хозяйств 105 отр.

21 22 23 24 Метапневмовирусной инфекции Реовирусного теносиновита Инфекционного бронхита Инфекционного энцефаломиелита 108 115 132 108 отр отр. отр отр

25 26 Аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита 3269 1615 пол. пол.

27-34 Сыворотка крови кур из ОАО «Птицефабрика Ударник» 106-160 отр.

2.23. Способ опосредованного расчета титра антител 2.2.3.1. Определение коэффициентов линейной регрессии и допустимых значений оптической плотности контрольных сывороток. Для определения титра антител при тестировании сыворотки в одном разведении были использованы результаты спектрофотометрического учета ИФА, полученные путем измерения значений оптической плотности (ОП) контрольных и испытуемых проб сыворотки при длине волны 492 нм. Методом последовательных разведений были раститрованы 20 положительных проб сыворотки крови кур разной активности (в трех повторностях). Величину Б/Р для разведений сывороток 1:200, 1:400 и 1:800 рассчитывали по формуле:

ОП492Исслед.пробы- N

8/р= -

Р-К

По измеренным оптическим плотностям исследуемых проб (ОП492 исслед. пробы), положительной (Р) и отрицательной (14) контрольной сыворотки были

найдены коэффициенты линейной регрессии для Б/Р и ^ титров (Т). Результаты регрессионного анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2

Коэффициенты линейной регрессии и корреляции для исследуемых _разведений сыворотки_____

Разведение А В к

1:200 1,699784 3,511489 0,95983

1:400 1,374692 3,549019 0,96977

1:800 1,193248 3,586549 0,96569

А, В - коэффициенты линейной регрессии; Я - коэффициент корреляции.

Как показали результаты исследований, что наиболее высокое значение коэффициента корреляции было определено для разведения сыворотки 1:400, которое и было принято нами за рабочее разведение.

Уравнение линейной регрессии Т = 1,37 (Б/Р) + 3,55) для разведения сыворотки 1:400 было использовано для расчета числового значения титра (рисунок !)•

АДВГГ

>

I -2 -17 -1,4 -1.1 -0.8 -0,5 -0.2 0,1 0,4

Рисунок 1. График зависимости величин ^Т от ^ Я/Р для рабочего разведения

сыворотки

предсказанная линия аппроксимации данных для разведения 1:400. Полученное уравнение линейной регрессии будет достоверно для определенных значений оптической плотности (ОП) отрицательной и положительной контрольной сыворотки.

Определение диапазона допустимых значений ОП-показателей отрицательного и положительного контролей является обязательным для разрабатываемой тест-системы ИФА. Стандартизация контрольных показателей позволяет в итоге получать корректные результаты анализа. На различных планшетах, более чем в 40 повторностях исследовали вариации ОП-показателей, как отрицательного, так и положительного контролей в разведениях 1:400. Анализ полученных результатов показал, что допустимый диапазон оптических показателей отрицательного контроля составил от 0,105 до 0,185. Допустимые значения ОП-показателей положительного контроля были от 0,450 до 0,970.

2.2.3.2. Определение пороговых показателей реакции, разграничивающих специфическое и неспецифическое взаимодействие. Для определения пороговых S/P-показателей, разграничивающих неспецифическую (отрицательную), сомнительную и специфическую (положительную) реакции исследовали более 20 проб сыворотки крови кур, свободных от антител к возбудителю АДВГГ, но имеющих уровень неспецифической реакции, превышающий отрицательный контроль. Задачей исследований было установление максимального значения S/P для неспецифически реагирующих проб сыворотки и нахождение минимального значения S/P для специфически реагирующих проб сыворотки крови. В качестве пороговой величины для отрицательной реакции приняли S/P-показатель, который соответствовал нижней границе 95% доверительного интервала исследованной выборки значений ОП. S/P-показатель для отрицательной реакции составил 0,2. Пороговой величиной, соответствующей минимальной ожидаемой положительной реакции считали значение S/P, установленное для верхней границы 95% доверительного интервала. Величина S/P для положительной реакции составила 0,24. Промежуточные величины 0,21-0,23 соответствовали зоне «сомнительных» результатов.

2.2.4. Оценка чувствительности и специфичности тест-системы.

Оценку чувствительное™ и специфичности разработанной тест-системы проводили в сравнении с наборами производства ФГУ «ВНИИЗЖ» и «BioChek» и с результатами реакции диффузионной преципитации в агаровом геле. При

15

исследовании проб сыворотки крови кур с помощью наборов ВНИВИП, ВНИИЗЖ и ВюСЬек получен 100 % положительный совпадающий результат, что свидетельствует о высокой чувствительности и специфичности разработанного «Набора для выявления антител к возбудителю АДВГГ в сыворотке крови кур методом иммуноферментного анализа».

Данные параллельного тестирования 15 проб сыворотки крови кур различной активности в ИФА методом титрации и РДП (таблице 3) показали, что 10 проб, которые имели в РДП титр антител 1:4 и выше, их титр в ИФА был 1:400 и выше. Кроме того, 5 проб сыворотки крови кур отрицательные в РДП, не превышали титр антител 1:200 в ИФА, то есть результаты иммуноферментной реакции были отрицательными (Р<0,05). При сравнительной оценке уровня специфических антител к вирусу АДВГТ, полученных различными методами (РДП и ИФА) установлено, что результаты титрования сывороток в ИФА имеют высокий коэффициент корреляции (г = 1,0) с результатами РДП.

Таблица 3

Результаты сравнительного изучения серологических реакций

Исследуемые № п/п Активность сывороток Коэффициент

сыворотки крови кур РДП ИФА корреляции, г

1 2 3 4 1:4 1:16 1:8 1:4 1:16 1:32 1:8 1:4 1:16 1:32 1:400 1:1600 1:800 1:400

Положительные сыворотки 5 6 7 1:1600 1:3200 1:800 1,0

8 1:400

9 10 1:1600 1:3200

Отрицательные 11-15 отр. 1:100-1:200

сыворотки

Таким образом, сравнительный анализ результатов тестирования проб сыворотки крови кур в ИФА и РДП подтверждает высокую чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы.

2.2.5. Практическое применение разработанной иммуноферментной

тест — системы

2.2.5.1. Изучение динамики формирования антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против АДВГГ. Опыты ставили на цыплятах 28-суточного возраста, полученных из хозяйства, благополучного по острым инфекционным болезням. Перед вакцинацией сыворотка крови цыплят была исследована на отсутствие антител к аденовирусу. Цыплят разделили на две подопытные группы, по 15 голов в каждой, и одну контрольную группу в количестве 5 голов. Вакцины вводили цыплятам подкожно в область нижней трети шеи, в объеме 0,5 см3, однократно. Цыплят контрольной группы не прививали. В течение 60 сут. после вакцинации, начиная с 7-ых сут. и далее, через каждую неделю, от всех цыплят брали кровь и получали сыворотки для серологического исследования. Наличие специфических антител к вирусу АДВГГ определяли методом ИФА с использованием разработанной диагностической тест-системы.

Результаты сравнительного изучения антигенной активности инактивированной сорбированной и эмульгированной форм вакцины против АДВГГ, приведенные в таблице 4, показали, что оба образца инактивированной вакцины были антигенно активны на протяжении всего периода исследований.

Инактивированная эмульгированная вакцина обладала более выраженной антигенной активностью и индуцировала в организме вакцинированной птицы образование более высокого уровня специфических антител к возбудителю АДВГГ, по сравнению с сорбированной вакциной. Установлено, что на 30 сут. после вакцинации средний титр антител у птиц, привитых инактивированной эмульгированной вакциной, составил 1351±73, а у цыплят, вакцинированных инактивированной сорбированной вакциной среднее значение титра антител, состав ило 920±61.

Таблица 4

Динамика формирования антител у вакцинированных цыплят против АДВГГ инакгивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцин (п=8)

Наименования групп Титры антител в ИФА, М ± ш Р <

Сроки после вакцинации, сут.

7 14 21 30 35 60

Цыплята, вакцинированные ГОА - 0,2% вакциной 312 ± 19 617±38 727158 920+61 795±55 669А46 0,05

Цыплята, вакцинированные эмульгированной вакциной 592±36 790±43 967±57 1351±73 1406±75 1587±63 0,05

Примечание: титры антител в обратных величинах.

Таким образом, результаты тестирования проб сыворотки в ИФА при сравнительном изучении антигенной активности инакгивированной сорбированной и эмульгированной форм вакцины против АДВГГ показали высокую чувствительность и специфичность разработанной тест-системы для выявления антител к аденовирусу в пробах сыворотки крови цыплят в одном разведении.

2.2.5.2. Серологический мониторинг на АДВГГ в птицехозяйствах. В процессе ретроспективной диагностики на АДВГГ кур было исследовано 264 пробы сыворотки крови птиц разных возрастных групп яичных и мясных кроссов, доставленных из 3 птицеводческих хозяйств. Данные, приведенные в таблице 5, показывают, что птица на птицефабрике «Псковская» и в ОАО «Птицефабрика Ударник» серонегативна. В сыворотке крови разновозрастной птицы в ОАО « Птицефабрика Пермская» обнаружены специфические антитела к аденовирусу и процент положительно реагирующей птицы зависит от возраста, что указывает на циркуляцию возбудителя в хозяйстве.

Таблица 5

Результаты серологических исследований сыворотки крови на наличие антител к аденовирусу птиц в ИФА (п= 23)

Наименование хозяйства Титры антител в ИФА, М ± т

Возраст птицы (сут.)

1 20 35 80 150 190 253 394

П/ф «Псковская» 120±6 141±9 181±18 153±18 187±11 199±15 177±12 165±11

ОАО «П/ф Ударник» 138±7 127±9 145±8 158±8 193±22 171±16 163±13 181±14

ОАО «П/ф Пермская» н.и. н.и. н.и. н.и. 1946±223 100% 2473±232 100% 2467±253 100% 129Ш72 98%

Примечание: титры антител в обратных величинах; н.и. - не исследовали.

Таким образом, комплекс проведенных исследовательских работ позволил разработать иммуноферментную тест-систему для выявления и количественного определения антител к возбудителю АДВГТ в сыворотке крови птиц методом последовательных разведений и методом одного разведения.

Результаты практического применения иммуноферментной тест-системы свидетельствуют о том, что данный экспресс-метод является высокочувствительным и специфичным для серологического контроля над распространением АДВГТ птиц, оценки эффективности иммунизации поголовья против данной болезни и ретроспективной диагностики АДВГГ птиц по приросту уровня специфических антител.

3. Выводы

Разработан метод очистки возбудителя аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита кур штамма Т-12, репродуцированного в организме СПФ- цыплят 15 - суточного возраста, позволяющий получить препарат, очищенный от балластных белков на 98,5- 99%.

Показана возможность одноэтапной препаративной очистки вируса из гомогената печени больных СПФ цыплят с помощью молекулярно-ситовой хроматографии на МПС.

На основе очищенного высокоактивного антигена аденовируса птиц получены иммуноспецифические компоненты для выявления антител к возбудителю АДВГГ в сыворотке крови кур методом иммуноферментного анализа.

Разработана тест-система на основе непрямого метода ИФА для выявления и оценки титров антител к возбудителю АДВГГ птиц в сыворотке крови кур при тестировании проб в одном разведении. Определены оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции. Установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, предложено уравнение опосредованного вычисления титра антител при тестировании проб в одном разведении.

При сравнительной оценке различных методов определения титров антител к возбудителю АДВГГ установлено, что их значения в ИФА и РДП показывают прямую корреляцию, г= 1,0.

Предложенная иммуноферментная тест-система может быть рекомендована для оценки эффективности иммунизации против АДВГГ и мониторинговых исследований птицехозяйств на эпизоотическое благополучие в отношении АДВГТ.

Практические предложения

Разработаны ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии и утверждены академиком-секретарем А.М.Смирновым Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии методические положения «Лабораторная диагностика аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита птиц методом иммуноферментного анализа» 02 июля 2013 г., предназначенные для ветеринарных врачей региональных, областных, зональных и специализированных лабораторий и научно-исследовательских учреждений ветеринарного и биологического профиля.

Материалы, изложенные в диссертационной работе, используются в учебном процессе на курсах повышения квалификации ветеринарных врачей, работающих в промышленном птицеводстве.

4. Список используемой литературы

1. Бакулнн, В.А., Дубовой А.С. Серологическая диагностика аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита кур// V между нар. вет. конгресс по птицеводству. - М., 2009. - С. 58-60.

2. Вирусные болезни животных: учеб. пособие //' Сюрин В.Н. М.: ВНИТИБП, 1998.-С. 17-20.

3. Akhtar S. Hydropericardium syndrome in broiler chicken in Pakistan // World Poult. Sci. J.- 1994,-Vol.50-P. 177- 182.

4. Cheema A.H., Afzal M., Ahmad J. An adenovirus infection of poultry in Pakistan// Rev. Sci Tech. Off. Int. Epiz. -1989/-Vol.8. - P.789- 795.

5. Nakane, P.K., Farr A.G. Immunohistochemistry with enzyme labeled antibodies: a brief review // J. of Immunological Methods.-1981.- № 47,- P. 129-144.

5. Список опубликованных работ по теме диссертации Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ:

1. Джавадов, Э.Д. Никитина Н.В., Борисова М.С. Разработка ИФА-диагностикума для определения антител к вирусу инфекционного гидроперикардита кур // Ветеринарная практика. 2013. -№1(60). - С. 27-30.

2. Борисова, М.С. Никитина Н.В. Антигенные свойства инактивированной сорбированной и эмульгированной вакцины против инфекционного гидроперикардита кур // Ветеринарная практика. 2013. - №2(61). - С.11-12. Статьи, опубликованные в сборниках материаюв конференций:

3. Борисова М.С. Получение антигена вируса инфекционного гидроперикардита птиц для иммуноферментного анализа // Перспективы развития агропромышленного комплекса России в условиях членства в ВТО: матер, междунар. конгр. - СПб, 2013.-С.224.

4. Никитина Н.В., Трефилов Б.Б., Борисова М.С. Изучение антигенности инактивированной сорбированной и эмульгированной форм вакцины против инфекционного гидроперикардита кур // Перспективы развития агропромышленного комплекса России в условиях членства в ВТО: матер, междунар. конгр. — СПб, 2013.-С.225 .

5. Никитина Н.В., Борисова М.С. Оценка эффективности вакцинации против инфекционного гидроперикардита кур методом иммунофементного анализа // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Инновационные решения актуальных проблем в АПК». -Екатеринбург, 2013,- С. 22-26.

6. Никитина Н.В., Трефилов Б.Б., Борисова М.С. Оценка чувствительности и специфичности иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу инфекционного гидроперикардита кур// Матер, науч-практ. конф.: «Современные подходы к решению актуальных ветеринарно-санитарных и зоотехнических проблем в птицеводстве». - СПб., 2013. - С.33-36.

Тиражирование и брошюровка выполнены в учреждении «Университетские телекоммуникации» 197101, Санкт-Петербург, Саблинская ул., 14 Тел. (812) 233 46 69. Объем 1,0 у.п.л. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Борисова, Мария Сергеевна, Санкт-Петербург

Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадемии)

04201 452048 На правах рукописи

БОРИСОВА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА У

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА АДЕНОВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С ТЕЛЬЦАМИ - ВКЛЮЧЕНИЯМИ ГИДРОПЕРИКАРДИТА МЕТОДОМ НЕПРЯМОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор, член- корреспондент Россельхозакадемии Джавадов Эдуард Джавадович

Санкт-Петербург -2013

Оглавление стр.

1. Введение.......................................................................................4

2.Основная часть...............................................................................13

2.1. Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарии..................13

2.2. Аденовирусный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит

птиц..........................................................................................23

2.2.1. Распространение и ущерб, причиняемый этой болезнью....................23

2.2.2. Характеристика возбудителя семейства Ас1епоушс1ае..............................25

2.2.3. Эпизоотологические данные болезни............................................26

2.2.4. Клинические признаки и патологоанатомические изменения у птиц при аденовирусном гепатите с тельцами-включениями гидроперикардите птиц..29 2.2.5.Диагностика аденовирусного гепатита с тельцами-включениями

гидроперикардита

птиц...............................................................................................34

2.2.6. Профилактика и меры борьбы с болезнью........................................39

2.3. Собственные исследования.............................................................41

2.3.1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного анализа...................................................................................41

2.3.1.1. Получение очищенного антигена вируса....................................41

2.3.1.2. Получение отрицательной и положительной сыворотки крови

кур..................................................................................................43

2.3.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к аденовирусу в сыворотках крови кур.................................44

2.3.2.1. Определение оптимальных концентраций и условий взаимодействия

компонентов......................................................................................44

2.3.2.2. Определение диагностического титра сыворотки в иммуноферментном анализе..............................................................................................53

2.3.2.3. Способ опосредованного расчета титра антител..............................56

2.3.2.3.1. Определение коэффициентов линейной регрессии и

допустимых значений оптической плотности контрольных

сывороток...............................................................................56

2.3.2.3.2.0пределение пороговых показателей реакции, разграничивающих специфическое и неспецифическое

взаимодействие........................................................................59

2.3.2.4. Оценка чувствительности и специфичности тест-системы..............60

2.3.3. Практическое применение разработанной иммуноферментной

тест -системы.........................................................................64

2.3.3.1. Изучение динамики формирования антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против аденовирусного гепатита с

тельцами-включениями гидроперикардита................................................64

2.3.3.2. Серологический мониторинг на аденовирусный гепатит с тельцами - включениями гидроперикардит птиц в

птицехозяйствах.....................................................................66

3.Заключение.....................................................................................69

3.1 .Обсуждение результатов

исследований......................................................................................69

3.2.Вывод ы........................................................................................78

3.3. Практические предложения...............................................................79

Список сокращений................................................................................80

Список литературы..............................................................................82

Приложение............................................................................................95

1. Введение

Актуальность темы исследования. Надежное благополучие по инфекционным болезням является одним из непременных условий успешного ведения промышленного птицеводства.

Для крупных птицеводческих комплексов особую опасность представляют вирусные болезни, в том числе аденовирусный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит, из-за их недостаточной изученности, высокой контагиозности, большого разнообразия путей и факторов передачи инфекционного агента. Проблема вирусных болезней приобретает все возрастающую актуальность еще и по той причине, что некоторые инфекционные болезни стали протекать атипично, значительно возросла роль ассоциации различных агентов вирусной и бактериальной природы.

Аденовирусный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит (АДВГГ) (инфекционный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит, инфекционный гидроперикардит (ИГП) кур, болезнь Ангара, инклюзионный гепатит, гидроперикардиальный синдром) - высококонтагиозная вирусная широко распространенная болезнь цыплят, основными патологоанатомическими признаками которой являются накопление транссудата в перикардиальной полости, гепатит и нефрозо-нефрит. АДВГГ регистрируется во многих странах мира, как у бройлеров, так и у несушек. Экспериментально доказано, что в возникновении болезни доминирующая роль принадлежит первой группе аденовирусов, 1 и 4-го серотипов [11].

Степень тяжести течения АДВГГ в природных условиях во многом зависит от влияния некоторых иммунодепрессивных агентов, таких как вирус инфекционной бурсальной болезни, болезни Марека и вирусной анемии цыплят и тогда болезнь протекает со сложной симптоматикой. В связи с этим основная роль в постановке правильного диагноза на ИГП принадлежит лабораторным методам.

Степень разработанности темы исследования. Вопросам серологической диагностики АДВГГ птиц посвящены работы ряда авторов, однако разработанные ими методы имеют недостатки [11,55,68]. Разработанная реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) и иммунной адсорбции обладали низкой чувствительностью, и специфичность вышеуказанных тестов нуждалась в дальнейшем усовершенствовании [55]. Предложенная реакция диффузионной преципитации в агаровом геле с применением печеночного гомогената в качестве неочищенного антигена уступала по чувствительности ИФА.

Учитывая ассоциированное течение АДВГГ в условиях птицеводческих хозяйств необходимо разработать высокочувствительный и специфичный метод серологической диагностики.

Цель и задачи. Целью данной работы явилась разработка диагностической тест-системы для выявления антител к возбудителю АДВГГ в сыворотке крови кур на основе непрямого метода ИФА.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- получить высокоочищенныи антиген возбудителя АДВГГ птиц для ИФА и специфическую гипериммунную сыворотку кур;

- определить оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия;

- установить величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции и разработать способ опосредованного расчета титров антител при тестировании проб в одном разведении;

- дать оценку чувствительности и специфичности разработанной тест-системы;

- изучить динамику формирования антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против АДВГГ;

- провести серологический мониторинг на АДВГГ птиц с применением разработанной тест-системы;

- разработать Методические положения по лабораторной диагностике АДВГГ птиц методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна. Разработана иммуноферментная тест-система для выявления специфических антител к возбудителю аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита при тестировании проб сыворотки крови кур в одном разведении. Отработан метод получения высокоочищенного антигена вируса АДВГГ птиц, определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия, а также установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, разработан способ опосредованного расчета титра антител при тестировании проб в одном разведении. Дана сравнительная оценка непрямого метода ИФА с реакцией диффузионной преципитации в агаровом геле при АДВГГ птиц. Установлена высокая чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител в сыворотке крови кур к возбудителю АДВГГ птиц.

Изучена динамика формирования антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против АДВГГ.

Теоретическая и практическая значимость работы. Практическая ценность разработанного диагностического набора для выявления антител к вирусу АДВГГ птиц подтверждается положительными результатами испытаний при проведении серологического контроля над распространением АДВГГ птиц, оценки эффективности иммунизации поголовья цыплят против данной болезни; ретроспективной диагностики АДВГГ птиц по приросту уровня специфических антител.

Разработаны ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии и утверждены академиком-секретарем А.М.Смирновым Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии методические положения «Лабораторная диагностика

аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита птиц методом иммуноферментного анализа» от 02 июля 2013 г. Методология и методы исследования

Вирус. В работе использовали вирус аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита кур, производственный штамм "Т 12" 4-го серотипа.

Штамм хранили при температуре минус

20°С в нативном виде. Освежение штамма проводили на 15-суточных СПФ-цыплятах через каждые три месяца хранения.

Сыворотки, тестируемые в непрямом варианте ИФА. Исследовали образцы сыворотки крови кур не контаминированные бактериальной и грибковой флорой.

Диагностикум: набор для определения антител к аденовирусу птиц 4 серотипа группы 1 (синдром гидроперикардита) иммуноферментным методом, производства ФГУ «ВНИИЗЖ»;

Инкубационные яйца и цыплята: яйца СПФ кур фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия) , 50 штук; цыплята, инкубированные из СПФ-яиц фирмы «Lohmann Tierzucht» в ГНУ ВНИВИП, 50 голов; цыплята 28-суточного возраста, полученные из хозяйства, благополучного по острым инфекционным болезням, 60 голов.

Оборудование, используемое в иммунологических тестах:

- механические дозаторы с объемом от 0,5 до 1000 мкл и 1- 8- канальные;

- полистироловые планшеты производства Nunc, США;

- иммуноферментный анализатор «Униплан». Растворы и реактивы:

- калий фосфорнокислый одозамещенный, ч., ГОСТ 4198;

- калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, х. ч, ГОСТ 2493;

- натрия хлорид (NaCI), х.ч., ГОСТ 4233;

- фосфатно-цитратный буфер производства ООО «Биолот»;

- перекись водорода производства ОАО «Татхимфармпрепараты»;

- ортофеиилендиамии (ОФД) производства фирмы Sigma;

- гвин 20 (Р7949) производства фирмы Sigma;

- агар «Дифко»;

микробиологические среды: мясопептонный бульон (МПБ),

мясопептонный агар (МПА), мясопептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом (среда Китта-Тароцци), агар Сабуро, производства ГНУ ВНИВИП.

Приготовление вируссодержащего материала для заражения. У павших или вынужденно убитых цыплят с характерной патологоанатомической картиной болезни отбирали печень и готовили суспензию на фосфатно-солевом буфере (рН 7,2-7,4) в соотношении 1:10. Суспензию трехкратно замораживали и оттаивали и центрифугировали при 1000g в течение 30 минут. Супернатант исследовали в РДП с положительной сывороткой к вирусу АДВГГ. При получении положительной реакции из него готовили 10% суспензию на физиологическом растворе хлорида натрия с добавлением антибиотиков (пенициллина 1000 ЕД/см3 и стрептомицина 1000 мкг/ см ), выдерживали ее 2 часа при комнатной температуре и проверяли на стерильность в соответствии с ГОСТ 28085-89 "Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности". При отсутствии роста микрофлоры материал использовали для постановки экспериментов.

Получение вируса ИГП на цыплятах. Для постановки опытов использовали СПФ цыплят 15 - суточного возраста. Заражение проводили подкожно. Материалом для инфицирования служила 10% суспензия, приготовленная из печени павших цыплят с признаками АДВГГ.

Подопытных цыплят содержали в изолированном боксе.

Получение антигена. Вируссодержащим материалом для получения антигена служила печень цыплят, экспериментально зараженных вирусом АДВГГ. Для наиболее полной экстракции вируса гомогенат печени больных цыплят дополнительно обрабатывали ультразвуком.

Инактивацию вируса проводили формальдегидом в конечной концентрации 0,1% при температуре +37°С и экспозиции 48 часов.

Очистку вируссодержащего материала проводили методом гельхроматографии на макропористом стекле (МПС), обработанном поливинилпирролидоном (ПВП) [40]. Макропористое стекло размером пор 1200 А активировали концентрированной соляной кислотой (НС1) в соотношении 1:2 и выдерживали при температуре 20-22°С 1-2 суток, периодически встряхивая. После этого кислоту сливали, и МПС однократно промывали дистиллированной водой, затем его заливали равным объемом смеси Комаровского (6% раствор Н202 в 6 М растворе НС1 в соотношении 1:1). Смесь с МПС нагревали на водяной бане при 56°С в течение 2 часов в вытяжном шкафу. Обработанное МПС промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции и под вакуумом удаляли воздух из пор. Затем заливали двумя объемами 4% раствора ПВП в дистиллированной воде и перемешивали на качалке в течение 4-5 часов. Раствор сливали, а МПС отмывали от несвязавшегося ПВП дистиллированной водой до исчезновения желтой окраски. Колонку размером 80><2см заполняли модифицированным МПС и уравновешивали 0,01М фосфатно-солевым буферным раствором (ФБР), рН 7,37,5. После стабилизации колонки над поверхностью МПС оставляли слой буфера в 1 мм. После этого на МПС наслаивали вируссодержащую жидкость. Элюцию вируса осуществляли 0,01 М ФБР, рН 7,3-7,5 с использованием перистальтического насоса, прибора РЭППС-1М (регистратор измерений электропроводимости и процента поглощения света) элюатом при жидкостной хроматографии при длине волны 280 нм, со скоростью 0,7-1,0 см3/мин и собирали его отдельной фракцией. Выход очищенного вируса регистрировался на ленте самописца в своеобразном пике, затем большим пиком выделялись примесные белки.

Постановка реакции диффузионной преципитации в агаровом геле. РДП

в агаровом геле ставили по методу, предложенному Оухтерлони, с использованием 1% агара «Дифко» [45].

Получение антивидового иммунопероксидазного конъюгата против IgG курицы. Конъюгат получали модифицированным методом периодатного окисления, основанным па образовании ковалентной аминосвязи между аминогруппами иммуноглобулина G и альдегидными группами пероксидазы, и ее последующем восстановлением до C-N-связи с помощью боргидрида натрия при совместной работе с ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» [114] .

Иммуноанализ антител. Для сенсибилизации поверхности лунок полистироловых планшет использовали очищенный антиген аденовируса кур в оптимальной концентрации, разведенный 0,01 M ФБР, рН 7,3-7,5. Иммобилизацию антигена на поверхности лунок полистироловых планшет осуществляли в течение 16-18 часов при температуре 4-8°С. Несвязавшийся с поверхностью полистирола антиген, отмывали трехкратно в объеме 0,2 см3 0,01 M натрий-фосфатным буфером, содержащим 0,5М раствор хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией твина-20 (ФБРТ), рН 7,0-7,4. В процессе постановки ИФА исследуемые и контрольные сыворотки, конъюгат инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 минут. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин в концентрации 5 мг на 12 см3 фосфатно-цитратного буфера, рН=4,9-5,0. Реакцию останавливали 10% раствором серной кислоты и считывали оптическую плотность (ОП) на иммуноферментном анализаторе «Униплан» при длине волны 492 нм.

Статистическая обработка данных. Использовали общепринятые методы оценки дисперсии, стандартного отклонения и доверительного интервала варьирующих переменных, устанавливали количественные показатели связи зависимых переменных в виде коэффициентов корреляции или коэффициентов регрессионных уравнений. Для соответствующих вычислений применяли компьютерную программу Microsoft Excel.

Положения, выносимые на защиту:

- тест-система, разработанная на основе непрямого метода ИФА для выявления и оценки титров антител к вирусу АДВГГ в сыворотке крови кур при тестировании проб в одном разведении, включающая обоснования оптимальных концентраций компонентов и условий их взаимодействия, пороговых показателей реакции и способ опосредованног