Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных

Матвеева, Ирина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных"

На правах рукописи

МАТВЕЕВА

Ирина Николаевна

ПРОМЫШЛЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ MOHO- И КОМПЛЕКСНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖИВОТНЫХ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Щелково-2008 г.

003457893

На правах рукописи

МАТВЕЕВА

Ирина Николаевна

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Щелково-2008 г.

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исслсдовагсльский и технологический институт биологической промышленности (ВНИТИБП) РАСХН

Научный консультант:

доктор биологических наук Клюкина Валентина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Смоленский Владимир Иванович

доктор ветеринарных наук, профессор Мищенко Владимир Александрович

доктор биологических наук, профессор Цыбанов Содном Жамьянович

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН

Защита состоится "25" декабря 2008 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, ri/o Кашинцево, нос. Биокомбинат, ВНИТИБП; e-mail: vnitibp@mail.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ВНИТИБП) РАСХН.

Автореферат разослан "24" ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Д.Фролов

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из основных направлений промышленной биотехнологии является обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами. Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических препаратов, увеличение номенклатуры, совершенствование, улучшение качества и стандартизация диагностических тест-систем для практических лабораторий по-прежнему остается актуальной задачей.

Реализация идеи создания диагностических наборов требует решения сложных и разнообразных задач. Это, прежде всего, выделение и изучение структуры, физико-химических и иммунобиологических свойств антигенов вирусов и бактерий, детерминант или эпитопов, определяющих специфичность конкретного антигена, и определение их роли в формировании иммунитета. Получение высокоактивных специфических сывороток требует наличия очищенных антигенов, применение эффективных схем иммунизации, выбора адекватных животных-продуцентов, а также изучения возможности применения современных эффективных иммуностимуляторов.

Каждый диагностический набор содержит строго индивидуальный состав специфических и химических компонентов, применение которых по отработанной для данной инфекции методике, позволяет достигать желаемой цели исследования.

Многообразие симптомов проявления вирусных и бактериальных болезней, а часто их ассоциация, затрудняют постановку диагноза, поэтому этиологический диагноз должен основываться на результатах лабораторных исследований, включая серологический анализ.

В этой связи актуальным является совершенствование методов серологической диагностики вирусных и бактериальных инфекций и разработка технолог ии изготовления моно- и комплексных диагностических тест-систем.

Экспресс-анализ структуры заболеваний, определение этиологической роли каждого возбудителя в условиях ассоциативных форм инфекций и выработка мер борьбы с инфекционными болезнями, предполагает использование иммуноферментного анализа (ИФА) как экспресс-метода с применением комплексных диагностических тест-систем.

Обоснование выбора объектов исследования. К важнейшим задачам ветеринарной науки относится ликвидация опаснейшего заболевания животных и человека - бешенства. В настоящее время в Российской Федерации сложилась напряженная эпизоотическая ситуация с бешенством животных, имеющим социально-экономическое значение. Активные природные очаги бешенства зарегистрированы в различных регионах страны. Эпизоотии бешенства поддерживаются в основном за счет диких животных, однако в процесс активно вовлекаются бродячие собаки и кошки (Иванов B.C., 2003;Груздев К.Н., Недосеков В.В., 2001).

Основными средствами борьбы с бешенством являются эффективная иммунопрофилактика и своевременная диагностика. Достоверность диагностики бешенства находится в прямой зависимости от активности и специфичности антирабических иммуноглобулинов. В связи с этим актуальным представляется совершенствование технологии промышленного получения препаратов, входящих в диагностический набор.

Лептоспироз относится к числу распространенных природно-очаговых, зооантропонозных, опасных в социальном и экономическом отношениях болезней. Неоценимый вклад в изучение лептоспироза внесли отечественные ученые: Ананьин В.В.,1949;1951; Малахов Ю.А., 1971,1979,1992; Ежов Г.И., 1979,1983,1985; Белоусов В.И., 1984, Артюшин С.К., 1991. До настоящего времени общепринятым методом диагностики лептоспироза остается реакция микроагглютинаци (РМА).

Фундаментальные исследования по изучению нуклеиновых кислот лептоспир, а также работы по геносисгематике этих микроорганизмов

позволяют сделать вывод о возможности применения методов биотехнологии для решения проблем, связанных с диагностикой лептоспироза. За рубежом ведутся интенсивные исследования генома многочисленных сероваров лептоспир, анализируются возможности практического применения анализа ДНК и различных вариантов ДНК-ДНК гибридизации, позволяющие выявлять особенности ссроиаров на уровне хромосомной ДНК лептоспир (Le Febure R.B.,1987; Van Eys G., 1989; Pacciarini M.L.,1992, Mericn F. et al.,1992).

Молскулярно-биологические методы играют важную роль в изучении систематики патогенных лептоспир, поиска возможностей их дифференциации и идентификации на основании сравнения генотипов. Так, используя метод ДНК-ДНК гибридизации, возможно выявление специфических фрагментов генома возбудителя лептоспироза, на основании которых делается заключение о наличии или отсутствии лептоспир в исследуемом материале.

Респираторные болезни КРС регистрируются во многих регионах Российской Федерации и странах СНГ, причиняя большой экономический ущерб мясному и молочному скотоводству. По широте распространения, смертности, вынужденному убою и недополучению привесов они занимают ведущее место в структуре заболеваний молодняка. Среди вирусных агентов, вызывающих заболевания с симптомами поражения дыхательных путей у крупного рогатого скота (КРС), вирусы инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), парагриина-З (ПГ-3), рсснираторно-синцитиальной (PC) и аденовирусной (АВ) инфекции занимают особое место в связи с многообразием клинических проявлений и тяжестью течения болезней, вызываемых ими (Сюрин В.Н., 1978; Гуненков В.В., 1975; Крюков Н.Н., 1984; Мищенко В.А., 2001; Красочко П.А., 1997; Глотов А. Г., 2001; Кузнецова С.В.,1991; Юров К.П., 2001,2003; A. L.E. Lindberg, 2003).

ограниченных площадях, часто проявляются у молодняка в виде вирусно-бактериальных ассоциаций, имеют большое значение при проведении лечебно-профилактических мероприятий (Глотов А.Г.,2001).

С введением в практику ветеринарной вирусологии метода иммуноферментного анализа (ИФА) появилась возможность одновременной дифференциальной серологической диагностики респираторных заболеваний крупного рогатого скота. ИФА для диагностики бактериальных и вирусных инфекций пришел на смену трудоёмким, малопроизводительным и часто недостаточно чувствительным методам, основанным на феноменах агглютинации, преципитации, связывания комплемента.

Учитывая то, что диагностика многих моноинфекций решена на уровне практического применения наборов ИФА, и отсутствием наборов для серологического мониторинга вирусных респираторных заболеваний КРС, разработка комплексных тест-систем ИФА представляет' значительный научно-практический интерес у ветеринарных специалистов РФ.

Перечисленные выше нерешенные вопросы свидетельствуют об актуальности проведенных исследований.

Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы является совершенствование и разработка современных биотехнологических и иммунобиологических методов для промышленного производства компонентов моно- и комплексных диагностических тест-систем инфекционных болезней животных бактериальной и вирусной природы.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Усовершенствовать технологию получения антирабической, а также специфических антисывороток к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД- БС, PC, АВ и отрицательных-референс сывороток крови животных.

2. Клонировать ДНК L. interrogans серовара pomona в плазмидном векторе, создать клонотеку рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты генома L.

pomona. Получить банк препаратов нуклеиновых кислот лситоспир различных серогрупп.

3. Провести серию гибридизаций отдельных клонированных фрагментов ДНК с полученными препаратами нуклеиновых кислот лептоспир и выявить фрагмент ДНК L. interrogans ссровара pomona, пригодный для использования в качестве видоспецифичного гибридизационного зонда. Определить возможность применения клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блог-гибридизации.

4. Разработать технологию производства компонентов комплексной тест-системы иммуноферментного анализа для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и аденовирусной инфекции.

5. Разработать методику постановки, учета и критерии оценки результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и аденовирусной инфекций в биологических жидкостях организма животных.

6. Определить эффективность комплексной иммуноферментной тест-системы для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC, АД инфекции в сравнении с методами аналогичной направленности.

Научная новизна. Усовершенствованы и разработаны:

1. Технология получения высокоактивной и специфичной антирабической сыворотки, применяемой для изготовления ангирабических диагностических ФИТЦ-конъюгатов и референс-антирабической сыворотки для выявления специфических антител к вирусу бешенства в сыворотках вакцинированных животных методом иммуноферментного анализа.

2. Впервые разработана технология получения компонентов комплексной иммуноферментной тест-систсмы для определения уровня специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ инфекции в биологических жидкостях организма КРС; оптимизированы условия

исследования сывороток крови и молозива в одном разведении, показана высокая чувствительность и специфичность ИФА и установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью ИФА и РН, РНГА (заявки на изобретения: «Способ применения комплексной тест-системы иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления специфических антител к вирусным инфекциям в биологических жидкостях организма КРС» №2008126759; «Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферменгных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма КРС № 2008132390).

3. Разработаны методы получения очищенных и концентрированных вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ.

4. Впервые разработана технология получения специфических ангисыворогок к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД- БС, PC, АВ и отрицательных референс-сывороток крови КРС для иммуноферментной тест-системы методом аффинной хроматографии (заявки на изобретения: « Комплексная тсст-система иммуноферментного анализа (ИФА) для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям КРС» №2008126758; «Способ получения отрицательных референс-сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма КРС № 2008132387).

5. Впервые проведено молекулярное клонирование фрагментов ДНК L. interrogans серовара рошопа и на их основе создан банк нуклеотидных последовательностей генома лептоспир, получен ДНК-зонд, позволяющий идентифицировать и дифференцировать производственные штаммы лептоспир.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований использованы в производстве диагностических препаратов: «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных», ТУ 9388-003-00497963-97 и «Набор компонентов для диагностики бешенства в РДП», ТУ 9382-006-0497963-92.

-Технология получения антисыворотки к вирусу бешенства с применением полиоксидония включена в "Инструкцию по изготовлению и контролю глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных", "Инструкцию по изготовлению компонентов для диагностики бешенства животных в РДП", утвержденные 02.10.2007 г. директором ВНИТИБП и в "Инструкцию по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабичсских антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных", утверждена директором ВНИТИБП 2.02.2008 г.

-Технология получения протеина А золотистого стафилококка, конъюгированного с ферментами (нероксидазой), микроносителями, сорбентами вошла в "Инструкцию по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных", утверждена 22.01.2008 г. директором ВНИТИБП.

-"Методических рекомендаций по идентификации производственных штаммов лептоспир и дифференциации вида Leptospira interrogans от Leptospira biflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации", утверждены директором ВНИТИБП 17.09.1993 г. и используются во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) при паспортизации производственных штаммов лептоспир и изучении культур лептоспир, выделенных от сельскохозяйственных и диких животных.

-"Методических рекомендаций по определению уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных методом иммуноферментного анализа", рассмотренные и одобренные 21 04. 2008 года на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №5.

Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность по использованию комплексного набора ИФА не только для серологического мониторинга вирусных заболеваний КРС, но и для оптимизации противоэпизоотических мероприятий с целью установления этиологической структуры респираторных заболеваний КРС.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и Методической комиссии ВНИТИБП, в виде ежегодных отчетов по темам заданий Российской НТП. Материалы диссертации доложены:

-на 7-й Европейской и 9-й Всесоюзной конференциях по лептоспирозу в Москве, 1991 г.;

-на Научно-практической конференции: "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных", 1993 г.; -на Международной научно-ирактической конференции молодых ученых: "Научные основы производства ветеринарных биологических биопрепаратов", Щелково, 1991 г., 2002 г., 2005 г.;

-на Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г.: "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных", Москва, 2006 г.;

-на Международной научно-производственной конференции: "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных", посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва A.A., г. Воронеж, 2006 г.; -на Научно-практической конференции: "Актуальные проблемы молекулярной диагностики ветеринарной медицины и биологии", Феодосия, Крым, 2007 г.; -на Всероссийской научной конференции: "Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология", Киров, 2008 г.;

-на заседаниях секции "Ветеринарная биотехнология" Отделения ветеринарной медицины РАСХН, Щелково, 2007-2008 гг.

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 36 научных работ, в том числе 9 в рецензируемых изданиях, входящих в Перечень ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации материалов докторской диссертации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена наг^Ф.ТСтраницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована.-З.-^таблицами и .У??, .рисунками. Список литературы включаетисточников, в том числе.^ отечественных и^ЙЗарубежных.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту: 1 .Усовершенствованная технология получения высокоактивной антисыворотки к вирусу бешенства и применение ее при промышленном производстве диагностических антирабических ФИТЦ-коныогатов и реферснс-

антирабической сыворотки для иммуноферментной тест-системы определения антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных.

2. Результаты исследований по клонированию ДНК L. interrogans ссровара pomona в плазмидном векторе и применению клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лсптоспир в реакции блот-гибридизации.

3.Теоретическое и экспериментальное обоснование разработки «Иммунофсрмснтная тест-система для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ инфекций» и определение ее эффективности. Теоретический анализ, экспериментальные исследования и обобщение результатов, выполнены автором самостоятельно.

Автор выражает благодарность за участие в выполнении отдельных фрагментов диссертации сотрудникам ВНИТИБП: директору, академику РАСХН А.Я. Самуйленко, сотрудникам института В.И. Клюкиной, Д.П. Кузнецову, С.В. Кузнецовой, В.И. Белоусову, И.И. Кочиш, Т.Ю. Кочиш, С.Ю.Филиппову, В.А.Лукиной, Н.Н. Быковой, С.К.Арпошину (ВИЭВ).

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в 1991-2007 гг. в лаборатории молекулярной биологии и в отделе иммунологии ГНУ ВНИТИБП, в хозяйствах Московской, Брянской, Тверской областей в соответствии с планами НИР и ОКР ГНУ ВНИТИБП, отраслевых научных программ, в рамках Российской научно-технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации по проблеме 08: «Разработать новые и усовершенствовать существующие методы, средства, технику и технологии экспресс-диагностики, лечения и профилактики болезней животных, прогнозирования их возникновения и распространения, обеспечивающие сохранение ветеринарного благополучия, получение продуктов и сырья животного происхождения

высокого санитарного качества и охрану окружающей среды»; по заданию 08.06.01.08: "Получить компоненты набора для комплексной диагностики респираторных болезней животных (ИРТ, Г1Г-3, PC, ВД-БС и аденовирусной инфекции)", по заданию 06 "Разработка методов генетической инженерии для идентификации и дифференциации лсптоспир", № гос. регистрации 01.86.0 031246 и договору №3-К (Заказчик НПК Росагробиопром); по плану НИР ОКР на 2005-2008 гг. задания 08.06.01 «Разработать новые диагностические тест-системы и комплексные лечебно- профилактические препараты экономически значимых инфекционных заболеваний животных».

2.1. Материалы и методы

В работе использовали комплекс вирусологических, микробиологических, иммунологических, биотсхнологических и молекулярно-биологических методов. Вирусологические исследования проводили согласно стандарту МЭБ (QIE Manual, Manual of Standarts// Chapter 2.3.5.,2000; Chapter 2.Ю.6., 2004).

Штаммы. При производстве диагностических препаратов

использовали фиксированный вирус бешенства штамм "Овечий" и штамм "CVS" (ВГНКИ, 1997); PC-вирус, штамм "Randall" (ВГНКИ); вирус ИРТ штамм "ТК -А (ВИЭВ) В2"; вирус диареи-болезни слизистых оболочек КРС штамм "Oregon C24V" ( сухая культуральная вакцина против ВД КРС производства Ставропольской биофабрики ТУ-10-19-503-87); вирус парагриппа-3 штамм "ЗКСМ" (ВГНКИ); вакцина инактивированная против аденовирусной инфекции КРС Bovine-10 серогип 1 ТУ 10-09.09-89.

Вакцинные, а также музейные культуры референтных штаммов патогенных лептоспир 23 серогруип и 3 штаммов двух серогрупп L. biflexa любезно предоставлены кафедрой микробиологии Университета Дружбы Народов им. Патриса Лумумбы и лабораторией лспгоспироза НИИ эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва).

Для культивирования St. aureus, использовали полевой изолят золотистого стафилококка, любезно предоставленный сотрудниками бактериологической лаборатории Центра Госсанэпиднадзора (г.Щелково). Штамм А-676 St. aureus получен из НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. J1.A. Тарасовича. Чистоту протеина А оценивали в 7% ПААГ на приборе фирмы "Reanal" по методике Davis J.В.(1979).

Инфекционность вируса. Инфекционную активность вирусов определяли путём титрования в чувствительных культурах клеток, выражая титр вируса в Ig ТЦД 50/смз, по общепринятому методу Reed и Mench (1938). Инфекционность PC-вируса определяли на 24-луночных панелях по ТЦД50/ с„3 на культуре клеток ПТ-80 по цитопатическому действию через 3-5 суток после заражения клеток и рассчитывали титр вируса по методу И.П. Ашмарина (1974). Инфекционную активность вируса бешенства определяли согласно «Методы лабораторной диагностики бешенства» и ГОСТ 26075-84. Определение титра инфекционное™ вируса ИРТ проводили в 96-луночных панелях по ТЦД50/СМЗ на культуре клеток ПТ-80 согласно «Методам лабораторной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота» (ГОСТ 25755 - 91). Гсмагглютинирующий титр вируса ПГ-3 крупного рогатого скота определяли в РТГА с эритроцитами мыши по методике H.H. Крюкова и соавт. (1982).

Культуры клеток и среды. Для репродукции и титрования вирусов использовали перевиваемые линии клеток МДВК, ПТ-80, Taurus-1 (Т-1), Тауэр; первично-трипсинизированные культуры клеток почки (ПЭК), лёгкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК), сердца (СЭК) эмбриона коровы. В качестве ростовых и поддерживающих сред применяли среды 199, ГЛАХ, производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, г. Москва.

Культивирование лептоспир проводили на твин-полисорбаг-альбуминовой среде согласно методике F. Rüssel, С. Rüssel (1986).

Антнтела и антигены. Исследовали пробы сывороток крови и молозива КРС, поступивших из хозяйств РФ, где наблюдались вспышки респираторных болезней крупного рогатого скота. Специфические антитела к антигенам вирусов ИРТ, PC и ПГ-3 выявляли в реакции нейтрализации (РН) на культурах клеток МДВК и ПТ-80 в 24-луночных планшетах с ЮОТЦДдасмэ соответствующего вируса. Антитела к вирусу рсспираторно-сиицигиальной инфекции определяли в РН на культуре клеток почки эмбриона коровы и в РНГА. Антитела к вирусу ПГ-3 выявляли, используя «Набор диагностикумов ПГ-3 КРС в реакции торможения гемагглютинации» ТУ 46-21-480-78. Антитела к вирусу аденовирусной инфекции определяли, используя « Набор сухих диагностикумов аденовирусной инфекции КРС» ТУ 46-21-939-79. Антитела к ВД-БС КРС определяли с использованием «Набора диагностикумов против ВД КРС» ТУ 46-21-529-79, «Набора для диагностики вирусной диареи-болезни слизистых КРС методом ИФА» ТУ 1007078-92. Перед постановкой РНГА и ИФА испытуемые пробы молозива прогревали в водяной бане при 56°С в течение 30 мин разводили ЗФР 1:1 и замораживали при -20°С. После оттаивания полученные пробы центрифугировали 10 мин. при 1500 об/мин, отбирали водную фракцию и использовали се для исследования.

Очистку и концентрирование вирусов ИРТ, ПГ-3, и PC проводили осаждением из вируссодержащих суспензий с использованием ПЭГ различной мол. массой, сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах, ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы.

Антигены вирусов для тест-системы ИФА получали обработкой вирусных препаратов ультразвуком при 22кГц импульсивно в течение 10 секунд на установке УЗДН-2Т или тритоном Х-100 в 1-2% концентрации. Фракционный состав и мол. массу антигенов вирусов для ИФА оценивали методом электрофореза по системе Laemmli U. К. (1970 г.) в блоке SDS-PAGE на оборудовании фирмы "LKB», Швеция. Маркерами мол. массы полипептидов служил набор маркеров фирмы «Pharmacia»,Швеция. Иммуноблотинг

проводили переносом белков вирусных препаратов, разделенных в SDS-PAGE, на нитроцеллюлозные мембраны (США,0,54мкм).

Антитела из гипериммунных сывороток выделяли методом аффинной хроматографии на BrCN-сефарозе 4В ("Фармация", Швеция) с иммобилизованными IgG КРС или протеином А в соответствии с рекомендациями фирмы. Препараты антигенов и антител концентрировали в 10100 раз методом ультрафильтрации на лабораторных ультрафильтрационных ячейках типа ФМО 2-200 (СКВ АП АН, Ленинград) с мембранами "Владипор" УАМ-150.

Сыворотки. В исследованиях применяли экспериментальные (п=450) и коммерческие иммунные сыворотки (п=43) к вирусам ИРТ, ПГ-3, PC, ВД-БС, АВИ, сыворотки КРС боенского происхождения (мясокомбинат им. А.И.Микояна, г.Москва) и из хозяйств РФ, неблагополучных по респираторным заболеваниям. В качестве контрольной положительной сыворотки для ИФА использовали специфические гипериммунные сыворотки, отрицательной -от клинически здоровых КРС, адсорбированных на сорбентах с иммобилизованными антигенами вирусов ИРТ, ПГ-3, PC, ВД-БС, АВИ. В качестве гетерологичных сывороток использовали сальмонеллезные, пастереллезные и хламидийные сыворотки КРС (п=Т7) из коммерческих диагностических наборов.

Антирабические сыворотки получали иммунизацией овец и собак инактивированным (бегга-пропиолактон 1:4000) вирусом бешенства, штаммы "Овечий" и "CVS" с применением полиэлектролита полиоксидония. Сыворотки от овец и собак получали на 7, 21,28, 35,42,49,56 и 60 дни от начала иммунизации и изучали динамику Накопления вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации (РН), комплементсвязывающих - в реакции связывания комплемента (РСК), преципитирующих антител- в реакции диффузной преципитации (РДП), согласно рекомендациям ВОЗ по бешенству (2004 г).Содсржание антител (ME/мл) в исследуемых сыворотках определяли

методом иммуноферментного анализа с использованием стандартного препарата ангирабичсского глобулина человека с содержанием вируснсйтрализующих антител 9 МЕ/мл (НПО "Вектор"). Антирабические сыворотки и препараты IgG исследовали в ИФА с использованием в качестве антигенов гликопротсина и нуклсокапсида вируса бешенства, очищенного тритоном Х-100 по методике, разработанной в отделе иммунологии ВНИТИБП (Рахманин П.В., 2007). Классовый спектр IgG антирабических сывороток овец определяли иммунодиффузией с использованием кроличьих антител к IgG, субклассам IgG 1 и IgG2 барана ("Sigma").

Количество Т- и В- лимфоцитов в периферической крови животных-продуцентов определяли методом розеткообразования (К.Фримель, 1987).

Выделение и очистка IgG КРС. IgG КРС выделяли из нормальной и гипериммунных антивирусных сывороток крови методом аффинной хроматографии на BrCN-Ссфарозе 4В с иммобилизованным протеином А. Общий белок определяли по методу Лоури (1958) и спектрофотомстрически на СФ-26 при длине волны 280нм.

Коныогат анги-IgG КРС антител получали меткой антивидовых антител ферментом пероксидазы из хрена перйодатным методом rio P. Nakane и А. Kawaoi (1974).

Непрямой иммуноферментный анализ. Выявление антител одновременно к 5 вирусным антигенам проводили стандартным вариантом непрямого твердофазного ИФА на 96- луночных микропланшетах по Engvall и др.(1976). В лунки вносили по 100 мкл очищенных антигенов вирусов, инкубировали 18 час при 4°С, удаляли избыток антигенов пятикратной промывкой ФСБТ и блокировали свободные участки пластика сывороткой лошади, в концентрации 5%. В отмытые лунки вносили исследуемые и контрольные сыворотки в разведении 1:50 в двух повторностях, инкубировали при 37°С в течение 1 часа, отмывали и вносили иммунопероксидазный анти-IgG КРС коныогат в разведении 1:10 000. Через час инкубации планшеты отмывали

и вносили 100 мкл субстратного раствора перекиси водорода с 3,3,5,5,-гетраметилбензидином (ТМБ,«МДЛ», Росссия). Инкубировали 20 мин при комнатной температуре и останавливали реакцию 0,1 M серной кислотой. Интенсивность окраски определяли на спектрофотометре с вертикальным лучом при 450 нм (ОП450). Эта же методика использовалась для анализа молозива КРС, после концентрирования молозивных иммуноглобулинов ПЭГ ММ 6000 Д 15% насыщения.

Наличие в исследуемых сыворотках и молозиве антител к вирусам определяли по коэффициенту связывания коньюгата (Кс„) антителами, величину которого вычисляли по формуле:

Ксв ico .

(ОП45„К+С,-ОП450К-СР) где:

on4S„ ис(|,, оп1!0 к- и опи,к+ - средние арифметические значения оптической плотности в лунках с испытуемой пробой, отрицательным и положительным конгролями соответственно. Сыворотки с Ксв > 20% считали положительными. Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы ИФА определяли по формулам (Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004):

Чувствительность = _a_x 100%; специфичность = _D_x 100% , A 1С D+B

где:"А"~ истинно положительные сыворотки, "В"- ложноположительные сыворотки,"С"- ложноотрицательные сыворотки,"D"- истинно отрицательные сыворотки.

Молекулярное клонирование ДНК L. рошопа осуществляли в илазмидном векторе pUC 19 (С. Yanish-Perron et al.,1985). При создании банка фрагментов ДНК L. pomona использовали методики молекулярного клонирования (Т. Маниатис и др., 1984). В качестве клетки-хозяина рекомбинантных плазмид использовали штамм Е. coli.JM109. Идентификацию рекомбинантных клонов

осуществляли в агаризоваиной среде LB, содержащей 1мМ селективного гистохимического красителя X-gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бстта-галактозид) и индуктора 1ас-промогора IPTG (7-изопропил-1-тио-бстта-Д-галактозид), а также 75 мкг ампициллина. Плазмидную ДНК выделяли кипячением (Holmes,Quigjcy, 1981 )и щелочным лизисом (Н.С. Bimboim и J.A.Doly,1979), элсктрофорстичсское разделение нуклеиновых кислот проводили в 0,8% геле (Л. А. Осгерман, 1981). Рестрикционный анализ бактериальной и плазмидной ДНК проводили в соответствии с рекомендациями Т.Маниатис и др.(1984), с использованием эндонуклеаз рестрикции (НПО "Фермент", Литва).

Включение радиоактивной метки в ДНК-зонды осуществляли методами ник-трансляции (P.V.J. Rigby et al., 1977) и рассеянной затравки (Feinberg,Vogelstein, 1984).Нерадиоактивное мечение (биотинилирование) ДНК-зондов осуществляли по методу В.А. Адаричева и соавт. (1987). Перенос ДНК на нейлоновую мембрану Hybond-N ("Amersham") осуществляли по Е. Southern (1975), с использованием для переноса 10 X SSC буфера. Предгибридизацию и гибридизацию ДНК осуществляли при 47°С в растворе, содержащем 30 % формамид, 2 X SSC, 5 X раствор Денхардта, 0,1 % SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося или при 65°С в растворе, содержащем 30 % формамид, 2 X SSC, 5 X раствор Денхардта, 0,2 % SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося.

Статистическая обработка результатов. При анализе и статистической обработке результатов использовали программу «Microsoft Excel», входящую в пакет программ «Microsoft Office, 2003». Достоверность результатов подтверждали путем статистической обработки и определения различий средних значений с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р< 0,05.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Усовершенствование технологии получении антирабической сыворотки для промышленного производства диагностических ФИТЦ-коньюгатов.

Основным тестом, рекомендованным Всемирной организацией здравоохранения для диагностики бешенства животных, является тест флюоресцирующих антител, который обеспечивает надежный результат в течение 2-3 часов в 95-99% случаев. Чувствительность теста зависит от качества флюоресцирующих коньюгатов, которые готовят на основе антител, выделенных из антирабических сывороток, получение которых требует многократного введения инактивированного вирусного материала.

С целью повышения активности антирабических сывороток для иммунизации овец и собак был испытан отечественный препарат полиэлектролит полиоксидоний, который вводили совместно с вирусом бешенства. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Иммунологическая реактивность животных, иммунизированных вирусом бешенства с адьюваитами

№ пп Материал для иммунизации Вид продуцента Обратные значения гифа специфических антител Активность сывороток /день иммунизации

РН РСК РДГ1 ИФА МЕ/мл

1 Вирус бешенства штамм «Овечий»+ адыовант Фрейнда овца 16 160 128 12800 24( 90 день)

2 Вирус бешенства штамм«СУ5»+ адыовант Фрейнда. собака 32 80 64 32000 12 (60 день)

3 Вирус бешенства штамм «Овечий» +ПОЛИОКСИДОНИЙ овца 64 640 512 64000 24 (60 день)

4 Вирус бешенства штамм «СУ5»+ полиоксидоний собака 64 160 64 16000 8(35 день)

Из таблицы видно, что максимальный титр вируснсйтрализующих антител в сыворотках овец, иммунизированных вирусом бешенства штамм "Овечий" с полиоксидонием, составил 1:64 в реакции нейтрализации на 30 день после иммунизации, комплементсвязывающих антител- в титре 1:640 - на 42 день, прсципитирующих - в титре 1:512 на 60 день после иммунизации. Активность антирабической сыворотки овец, полученной на 60 день от начала иммунизации, составила 24 МЕ/мл. Специфическая сыворотка собак, иммунизированных вирусом бешенства штамм "CVS" совместно с полиоксидонием, с максимальным титром вируснсйтрализующих антител 1:64 и активностью 8МЕ/мл, была получена на 35 день.

При изучении динамики антител, выявляемых в ИФА, на разных стадиях иммунизации установлено, что после 2-х циклов введения вируса в сыворотках крови овец и собаки титры антител к гликопротеину составили 1:8000-1: 16000, к белкам нуклеокапсида -1:2000-1:4000. После 4-го цикла тигры антител к нуклеокапсиду возросли и достигли максимума 1:12800 к 9-му циклу иммунизации.

После 2-х циклов иммунизации специфические антитела в сыворотке крови овец относились как к IgGj , так и IgG2 субизогипам, причем удельная активность последнего увеличивалась, и к 6 циклу антителам IgG2 соответствовал наибольший индекс нейтрализации и преципитации. Антитела к мозговым белкам были сосредоточены во фракции, содержащей IgGi, и в ходе очистки антирабических иммуноглобулинов легко удалялись, что является положительным моментом при производстве диагностических ФИТЦ-коньюгатов.

На повышение активности Т- и В- системы иммунитета в процессе иммунизации указывает увеличение процентного содержания в крови розеткообразующих Т- и В-лимфоцитов. Применение полиоксидония способствовало увеличению как относительного числа Т-лимфоцитов в крови иммунизированных собак, образующих розетки 16,6+1,2% , В- лимфоцитов

16,4±1,1% против 11,8+0,9% и 13,07±0,1% в контроле, так и регистрировали достоверное повышение розеткообразующей способности В-лимфоцитов-24,4±0,4% против 18,5+0,1% в контроле. Применение полиоксидония позволило повысить активность иммунокомпетентных клеток и стимулировать антителообразование у животных-продуцентов. При этом повысилась специфическая активность антирабической сыворотки, сокращались сроки иммунизации с 90 до 60 дней, за счет исключения этапа подготовки животных к иммунизации и уменьшения расхода вирусного материала.

По усовершенствованной технологии в течение 3-х лет во ВНИТИБП были изготовлены и выпущены для практического применения наборы для диагностики бешенства в РДП и флюоресцирующий глобулин (Таблица 2).

Таблица 2

Объем выпуска диагностических наборов за 2006-2008 годы.

Наименование диагностических наборов 2006 г. 2007 г. 2008 г.

Набор для диагностики бешенства в РДП 402 443 117

Глобулин флюоресцирующий 71 598 654

2.2.2. Молекулярное клонирование ДНК L. interrogans серовара ротона для идентификации и дифференциации лептоспир.

Выделение и характеристика ДНК лептоспир. Препараты нуклеиновых кислот референтных штаммов сероваров pomona, tarassovi, polonica, djatzi, szwajizak. ballum, whitcombi, shermani, pyrogenes, canlcola, louisiana, panama, grippotyphosa, kabura, bratislava, copenhageni, patoc, antlamana, scmaranga, sejroc, celledoni, castellonis, hebdomadis, poi, ranarum, djasiman, lichuan, sarmin, autumnalis, а также производственных штаммов лептоспир и полевых изолятов серогруппы Pomona были получены для анализа специфичности рекомбинантных плазмид.

Получено 65 препаратов ДНК штаммов лептоспир с оптическими характеристиками ДНК для А 260/230-1,8 (контаминация полисахаридами) и

для А 260 / 280 - 1.9 (контаминация белками) и усредненной величиной гинерхромного эффекта -28 %, которые были использованы для проведения геносистсматических исследований.

Создание клонотеки ДНК L. interrogans серовара ротона. Источником хромосомной ДНК служил штамм ВГНКИ-6 серогруппы Pomona, который выделен от свиньи в 1966 г. в Московской области. Выбор штамма этой серогруппы обусловлен тем, что она является одной из наиболее распространенных серогрупп, представители которых поражают как сельскохозяйственных животных (особенно свиней), так и человека. Выделенные фрагменты ДНК штамма ВГНКИ-6 лигировали с плазмидой pUC 19, предварительно расщепленной рестриктазой EcoR I. и трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма JM 109. В результате молекулярного клонирования было отобрано 44 колонии рекомбинантного фенотипа.

Рестрнкциоинын анализ рекомбинантных плазмид. При изучении клонированной ДНК L. pomona в составе рекомбинантиых плазмид установлено, что плазмиды содержат по 1-3 фрагмента чужеродной ДНК, размеры которых варьируют от 0,4 до 3,6 тысяч пар нуклеотидов. При этом сумма клонированных фрагментов ДНК лептоспир достигла 88,9 т. п. и., что составляет 4 % бактериального генома.

При рестрикционном анализе рекомбинантиых клонов из некоторых плазмид выделялось 2 или 3 фрагмента чужеродной ДНК. Это объясняется тем, что клонированный фрагмент чужеродной ДНК содержит внутри себя сайты рестрикции EcoR I и в результате полного гидролиза препаратов ДНК, в местах узнавания происходит полное расщепление ДНК по этому сайту. Возможно, однако, что наличие этих сайтов обусловлено одновременным лигированием в одном векторе двух и более мелких фрагментов ДНК лептоспир.

Анализ рекомбинантиых плазмид в реакции ДНК-ДНК гибридизации. Принадлежность клонированных фрагментов к ДНК лептоспир была подтверждена в реакции дот - гибридизации с радиоактивно мечеными ДНК-

зондами, в качестве которых использовали тотальные ДНК штаммов : ВГНКИ-6 серогруппы Pomona, RP-29 серогруппы Tarassovi, Pinos серогруппы Canicola. Результаты дот-гибридизационного анализа подтвердили, что клонированные в плазмидном векторе pUC 19 фрагменты ДНК имеют лептоспирозную природу. Все 42 рекомбинантные плазмиды давали интенсивные положительные сигналы на радиоавтографе после гибридизации с меченой радиоактивным фосфором ДНК L. pomona штамма ВГНКИ-6.

Десять рекомбинантных плазмид имели комплементарные последовательности в геноме штамма Pinos серогруппы Canicola и лишь одна единственная рекомбинантная плазмида (pLp 41) гибридизовалась с тотальной ДНК штамма RP-29 серогруппы Tarassovi. Эти данные согласуются с результатами экспериментов Р. Yasuda et al. (1987), Р. Ramadass et al. (1992), в которых было показано, что по степени гомологии ДНК представители серогруппы Tarassovi генетически отдалены от представителей серогрупп Pomona и Canicola. Для дальнейших исследований из клонотеки отобрали рекомбинантные плазмиды pLp 23, pLp 37 и pLp 41.

По результатам дот-гибридизации установлено, что рекомбинантная плазмида pLp 23 гибридизовалась с ДНК штаммов ВГНКИ-6 и Pinos, pLp 37 показала положительный сигнал на радиоавтографе только с хромосомной ДНК L. pomona ВГНКИ-6, a pLp 41 - с ДНК L. pomona ВГНКИ-6 и RP -29.

Применение плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41 для идентификации референтных штаммов лептоспнр. Выделенные из рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37, pLp 41 шесть фрагментов-вставок ДНК L. pomona метили радиоактивным фосфором и использовали в качестве зондов в реакции слот-блот гибридизации. В эксперименте использовали препараты ДНК, выделенные из музейных культур референтных штаммов лептоспир.

Сравнение результатов слог-блот гибридизации тотальных ДНК различных штаммов лептоспир с ДНК-зондами из рекомбинантных плазмид pLp 23,pLp 37 и pLp 41 показало, что штаммы патогенных лептоспир отличаются друг от

друга по интенсивности сигналов радиоавтографии. Возможно, что различия в степени гибридизации с молекулярными зондами в штаммах патогенных лептоспир могут быть связаны с разной степенью гомологии лих зондов комплементарным им нуклеотидным последовательностям в ДНК штаммов L. interrogans. Однако различия могут быть обусловлены и разньш числом копий последовательности исследованных ДНК-зондов внутри генома лептоспир того или иного штамма. Одновременно было показано, что ни один из исследуемых ДНК-зондов не гибридизовался с ДНК сапрофитных штаммов лептоспир. Полученные данные позволяют утверждать, что ДНК-ДНК гибридизация с ДНК-зондом, приготовленным из рскомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37 или pLp41, позволит дифференцировать вид L. interrogans от вида L. biflexa.

При определении специфичности полученных рскомбинантных плазмид в реакции слот-блот гибридизации с референтными штаммами патогенных лептоспир было установлено, что одни фра! менты-вставки гибридизовались с более узкой, а другие - с более широкой группой бактериальных штаммов. Так, например, фрагмент - вставка ДНК L. pomona размером 1,56 т. п. н. из рекомбинантной плазмиды pLp 37 активно гибридизовалась со штаммами лептоспир следующих сероваров: pomona, panama, canicola, polonica, grippotyphosa, kabura, szwajizak, pyrogencs, louisiana, autumnalis, djasiman, copenhagcni, whitcombi, poi; исключение составили ballum, ranarum, sejroe, lichuan, sarmin, castellonis, tarassovi, shermani, cclledoni. Однако фрагменты-вегавки рекомбинантной плазмиды pLp 23 при радиоавтографии давали интенсивные положительные сигналы с препаратами ДНК немногих сероваров (для фрагмента размером 0,67 т. п. н. это серовары : polonica, kabura, sarmin, cynopteri, pyrogenes; для фрагмента 0,40 т.п.н. -polonica, cynopteri, kabura; а для фрагмента размером 0,75 г.п.н,- это серовары: grippotyphosa, cynopteri, panama, cclledoni, lichuan, sarmin, hebdomadis). Для фрагментов-вставок из рскомбинантных плазмид pLp 23 и pLp 37 слог - блот гибридизацией отмечено

одно общее свойство -отсутствие положительных гибридизационных сигналов с образцами ДНК лептоспир патогенного серовара tarassovi.

Таким образом, можно полагать, что хромосомные ДНК штамма Perepelicyn (из музейных коллекций кафедры микробиологии Университета Дружбы Народов им. Лумумбы и лаборатории лептоспироза НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) не несли комплементарных pLp 23 и pLp 37 последовательностей нуклеотидов.

Одновременно результаты исследований показали, что в хромосомных ДНК сероваров tarassovi, pomona, sejroe, kabura, grippotyphosa, panama, sarmin, szwajizak, bratislava, castellonis, louisiana, whitcombi, djatzi, cynopteri присутствуют области, гомологичные ДНК-зонду pLp 41.

Полученные нами результаты слот - блот гибридизаций не противоречат имеющимся данным (Terpstra V. J., Schoone G. j. et al., 1986,1987; Zaal J. et al., 1988). Проведенные опыты по идентификации патогенных лептоспир при использовании в качестве зондов геномной или клонированной ДНК лептоспир показали перекрестную гибридизацию между сероварами в жестких условиях дот-блот анализа.

Получение ДНК-зондов для идентификации полевых изо л mon и производственных штаммов лептоспир. Шесть фрагментов ДНК L. pomona из рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37, pLp 41 с препаратами ДНК штаммов лептоспир серогруппы Pomona были изолированы от сельскохозяйственных животных и человека на территории России. Одновременно изучали гибридизационную активность клонированных фрагментов по отношению к ДНК производственных штаммов лептоспир (Таблица 3). Установлено, что наименьшая гибридизационная активность с препаратами ДНК, характерна для фрагментов ДНК L. pomona размером 0,75 т.п.н., 0,67 т.п.н. и 0,40 т.п.н. из рекомбинантной плазмиды pLp 23.

Эти фрагменты ДНК рекомбинантной плазмиды pLp 23 в низкой степени гибридизовались с образцами ДНК изолягов лептоспир сероваров monjakov,

ротопа и производственных штаммов ВГНКИ-2, ВГНКИ-5, ВГНКИ-4. Однако высокое сродство к штаммам - изолятам лептоспир, серологически отнесенных к серовару тогс1ок, обнаруживали все три фрагмента-вставки Ь. ротопа рскомбинантной плазмиды pLp23.

Таблица 3

Характеристика производственных штаммов лептоспир

Штамм ссрова р Характеристика: вид животного, год и место выделения

КСарпинский ротона бычок,!951, Сталинградская обл.

2.Гиацинт ротопа бычок, 1946, Московская обл.

3.Иванченко mozdok человек, 1961 ,СОАССР

4. Т-8021 mozdok бычок, 1961, СО АССР

5. Моняков monjakov человек, 1937, Приморский край

6. Танк monjakov лошадь, 1954,Татарская АССР

7. Свинья 185 monjakov свинья, 1959,Калининградская обл.

К. ВГНКИ-1 grippolyphosa овца,1969, Калининградская обл.

9. ВГНКИ-2 ictcrohaemorrhagiae свинья, 1972, Московская обл.

10. ВГНКИ-3 canicola свинья, 1973,Московская обл.

И. ВГНКИ-4 tarassovi свинья, 1973,Московская обл.

12. ВГ'НКИ-5 balcanica бычок, 1974, Оренбургская обл.

13. ВГНКИ-6 pomona( monjakov) свинья,1966, Московская обл.

Исследования показали, что с ДНК - зондами pLp 37 и pLp 41 положительный эффект в реакции гибридизации проявляли все производственные штаммы лептоспир. Рекомбинантные плазмиды pLp 23 и pLp 37 в высокой степени гибридизовались с образцами ДНК производственных штаммов ВГНКИ-1, ВГНКИ-2, ВГНКИ-3, ВГНКИ-5,ВГНКИ-6, за исключением ВГНКИ-4.

Определение специфичности ДИК L. ротопа зондов на коллекции штаммов различных видов микроорганизмов.

Препараты ДНК различных культур микроорганизмов Е. coli, Leptospira

interrogans, Yersinia pseudotuberculosis, Bordetella bronchiscptica, Corynebacterium pyogenes, Corynebacterium rinale, Pasteurella multocida, Brucella abortus, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma luteus гибридизовали no стандартной методике с ДНК-зондами плазмид pLp 23 и pLp 41. Результаты эксперимента показали, что нуклеотидные последовательности ДНК L. ротопа рекомбинангных плазмид pLp 23 и pLp 41, не проявляли перекрестную

гибридизацию с ДНК- образцами указанных микроорганизмов. В местах нанесения препаратов ДНК сероваров патогенных лептоспир отмечали положительные сигналы гибридизации,

Дифференциация производственных штаммов лептоспир. Результаты блот-гибридизации Hind III фрагментов тотальной ДНК штаммов лептоспир с ДНК -зондами плазмид pLp 23, pLp 37, pLp 41 представлены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты дифференциации производственных штаммов лептоспир

№п п Штаммы лептоспир Размеры гибридизуюшихся Hind 111 фрагментов ДНК лептоспир с ДНК-зондом (т.п.к.)

pLp 23 Pl-P 37 pLp 41

1 ВГНКИ-1 4,9; 4,8; 4,7 5,0 5,1;4,7;4,5;2,8;1,4

2 ВГНКИ-2 3,6 4,7;4,0;2,9 4,5; 3,5

3 ВГНКИ-3 4,8; 3,6 4,6; 4,0; 2,9 5,0; 4,5

4 ВГНКИ-4 4,8; 3,6 4,8; 4,5; 4,0 5,1-2,9;2,4;2,0;|,7

5 ВГНКИ-5 4,8; 3,6 4,7;4,0;2,0 4,8;4,5;3,5

6 ВГИКИ-б 4,8; 4,8;4,7;2,9 4,8;3,5;2,6

7 MoskvaV 4,9; 4,6; 3,6 5,0;4,0 5,1;4,7;4,5;2,8;1,4

8 9 10 Каширский Pcrcpelicyn 493 Poland 4,8; 3,6 4,8; 3,6 4,8;4,7; 4,6 4,8;4,6;4,0;2,9 4,8;4,0 4,8 5,0;4,5 5,1-4,5-2,9;2,4;2,0;1,7 5,1;4,7;4,5;3,5;2,9

II Pomona 4,8; 3,6 4,8;4,6;4,0;2,9 5,0;4,5;3,5

С ДНК-зондом плазмиды рЬр 23 идентичные профили гибридизации характерны для штаммов ВГНКИ-3,ВГНКИ-4 и ВГНКИ-5, хотя все производственные и референтные штаммы давали чрезвычайно низкий гибридизационный сигнал. При гибридизации с ДНК-зондом плазмиды рЬр 37 не отмечено существенных различий у штаммов ВГНКИ-3, ВГНКИ-2, а для штамма ВГНКИ-1 интенсивная гибридизационная полоса наблюдалась в верхней части трека, при этом не было установлено дискретных полос. Поэтому можно предположить, что существуют отдельные места в геноме штамма ВГНКИ-1, где комплементарные ДНК-зонду плазмиды рЬр 37 нуклеотидные последовательности концентрируются в значительной степени. Из представленных данных следует, что плазмиды рЬр 23 и рЬр 37 не пригодны для дифференциации производственных штаммов лептоспир методом блот-гибридизации по Саузерну. Различия гибридизационных профилей ДНК

лсптоспир, рестрикцированных эндонуклсазой Hind Ш, оказались наиболее демонстративными, когда в качестве ДНК - зонда, использовали фрагмент -вставку размером 1,20 т.п.н. рекомбинантной нлазмиды pLp41.

Из результатов проведенных исследований установлено, что производственные штаммы лсптоспир отличаются друг от друга числом и размером гибридизующихся фрагментов, а также интенсивностью сигнала радиоавтографии. При этом характерным является наличие пяти дискретных полос для штамма ВГНКИ-1 и интенсивного гибридизационного пятна по всему греку для штамма ВГНКИ-4, что, вероятно, указывает на разброс по геному данной клонированной последовательности. Результаты блот-гибридизации позволяют предполагать, что фрагмент - вставка рекомбинантной нлазмиды pLp 41 представлен в геноме ВГНКИ-4 большим числом копий, повторяющихся друг за другом. Таким образом, каждый производственный штамм характеризовался наличием как общих, гак и индивидуальных различающихся по молекулярной массе и специфичности отдельных фрагментов ДНК.

Блог-гибридизация Hind III фрагментов ДНК штаммов лсптоспир с ДНК-зондом плазмиды pLp 41 показала идентичные профили гибридизации для производственного штамма ВГНКИ-1 и референтного штамма Moskva V, а в случае гибридизации с ДНК-зондами плазмиды pLp 23 и pLp 37 профили имели выраженные отличия. Установлено, что блот - гибридизацией с ДНК-зондом pLp 41 не представляется возможным дифференцировать производственный штамм ВГНКИ-3 от референтного штамма Каширский. Однако, блот-гибридизация с ДНК-зондом плазмиды pLp 41 позволяла дифференцировать производственные штаммы ВГНКИ-4, ВГНКИ-5 и ВГНКИ-6 серогрунп Tarassovi, Scjroe и Pomona от референтных штаммов Pcrepelicyn, 493 Poland и Pomona.

2.2.3.Разработка технологии получения компонентов комплексной тест-системы иммуноферментного анализа для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и AB.

Основными иммунологическими компонентами комплексной тест-системы ИФА являются очищенные и концентрированные антигены вирусов, специфические антитела к вирусу ИРТ, ПГ-3, ВБ-БС, РС, АВ, отрицательная сыворотки и анти-^О-КРС конъюгат с пероксидазой. Получение и иммунохимическая характеристика компонентов являлись ключевым звеном нашей работы по технологической цепи и производству комплексной иммуноферментной тест-системы.

Промышленное культивирование клеток ПТ-80. Во ВНИТИБП разработаны высокоэффективные системы репродукции перевиваемых, первично-трипсинизированных клеток и вирусов в биореакторах в суспензии, псевдосуспензии и на микроносителях. Управляемое суспензионное культивирование клеток ПТ-80 проводили в биореакторе емкостью 25 л (ВНИТИБП, Иркутск НИИХИММАШ) в комплекте с микропроцессорными управляющими комплексами «Биоцикл» и индивидуальными модулями технологической обвязки и управления (ВНИТИБП и НПО «Промавтоматика»). На автоматизированных блочно-модульных установках нами оптимизированы режимы выращивания клеток линии ПТ-80 на микроносителях «Су1о(1ех-3», что позволило сравнить продуктивность клеточных культур в зависимости от различных систем культивирования (Таблица 5).

Таблица 5

Системы культивирования клеток животных

№ п/п Наименование систем Количество клеток к 1 мл питательной среды

1 Биорсактор с перемешиванием и протоком среды 5x10"

2 Эрлифтнмй биорсактор 5x10"

3 Биорсактор с биофильтром и протоком срсды 7x10"

4 Культивирование в микрокапсулах, микроносителях типа «Су10<3сх-3» 10'(перфузия)

5 Биорсактор с пористыми ячейками 10*(перфузия)

6 Биорсактор с полыми волокнами 10*( перфузия)

7 Мембранные биорсакторы (керамический модуль) 10'' (перфузия)

При отработке промышленной технологической схемы адсорбции клеток на микроносителе в биореакторе установлено, что оптимальной посевной концентрацией клеток ПТ-80 является 8-12кл на микроносителе. Распределение клеток на поверхности микроносителя в конце стадии адсорбции через 2,5-3 ч после добавления в биорсактор клеточной суспензии оказалось более равномерным при посевной концентрации 10-12 кл на микроносителе. При этом число прикрепившихся к микроносителю клеток составляло около 95%. Теоретически рассчитанный при такой посевной концентрации индекс пролиферации клеток ПТ-80 может достигать 6-8, максимальный индекс, полученный в наших опытах, составляет 4,2.

Очистка и концентрирование вирусов и получение антигенов для ИФА.

Вирус ИРТ 1СРС. Методологической основой исследований по получению очищенного вируса ИРТ служили ранее выполненные нами совместные работы с сотрудниками ВИНТИБП (Кузнецова С.В.,1991, Кузнецов Д.П.,2001, Гринь С.А.,2007, Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю.,2004). Исходным материалом при получении антигена для ИФА служила суспензия вируса ИРТ, выращенная в перевиваемой культуре клеток ПТ-80, с инфекционной активностью не ниже 107'пТЦД5о,смз-Обработка вируссодержащсй суспензии 7,5% ПЭГ с М.М. 6000 Д с последующим центрифугированием при 125 тыс. g в течение 1,5 часов в линейном (30-45%) градиенте плотности сахарозы позволила осуществить концентрирование вируса ИРТ в 10-200 раз с сохранением его морфологических и антигенных свойств. В линейном градиенте плотности сахарозы вирус располагался в компактной опалесцирующей зоне. Активность препарата вируса ИРТ в РН, по мере очистки и концентрирования, увеличивалась с 1:16 в исходной суспензии до 1:64 при 50 -кратном концентировании, в РИГА -с 1:8 до 1:56, в РСК - с 1:4 до 1:64 соответственно. После обработки очищенного и концентрированного вируса ИРТ ультразвуком на установке УЗДН-21 при 22 кГЦ импульсивно 10

раз, получали лизат вируса, который использовали в качестве антигена для ИФА.

PC-вирус. Получение препаратов очищенного и концентрированного PC-вируса штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, проводили совместно с Т.Ю.Кочиш, И.И Кочиш,(2004). Исходным материалом при получении антигена для ИФА служила суспензия вируса ИРТ, выращенная в перевиваемой культуре клеток ПТ-80, с инфекционной активностью не ниже 10 5,5 ТЦД5о/смз- Сравнительными опытами осаждения PC-вируса ПЭГ с ММ 3000, 6000 и 20 000 Д в концентрациях 5,0; 7,0 и 10,0% установлено преимущество ПЭГ ММ 6000Д в концентрации 7%, при котором очистка РС-вируса по белку составила 90%, потеря 6%.До 91% вируса осаждалось 40% раствором сульфатом аммония при концентрировании в 100 раз и очистке от балластных белков 67%. При концентрировании PC-вируса методом ультрафильтрации в 10 раз количество белка, в расчете на инфекционную дозу, увеличивается на 14%, потеря инфекционной активности вируса при этом составила 6% , а при концентрировании в 100 раз -на 42%, потеря инфекционной активности- 14%, Высокоскоростное центрифугирование при 90 Tbic.g в течение 5 часов позволяет без потерь осадить PC-вирус из вируссодержащей суспензии с чистотой по белку до 91%. Очистка PC -вируса в ступенчатом 15-55% градиенте сахарозы составила 97%. Инфекционная активность наблюдалась во фракции с плотностью 1,20 г/см3, соответствующий уровню 45% сахарозы, с выходом вируса до 92%. Максимумы активности очищенного вируса в ИФА и РСК совпадают с пиком инфекционной активности. Плавучая плотность вируса в градиенте Фиколла - 400 составила 1,19 г/см3, с наивысшим титром инфекционное™, комплемснтсвязывающсй активности и активности в ИФА.

Изучением поверхностных гликопротеинов PC-вируса штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, выявлено 9 белков, отщепляющихся 2% тритоном Х-100, с мол. массой от 28 до 180 кД, шесть из

которых, по данным иммуноблотинга, с мол. массой от 42 до 180 кД, индуцировали выработку анти-РС антител у кроликов. Приготовленный иммобилизацией белков PC-вируса на BrCN-Ссфарозу 4В антигенный иммуносорбент использовали для выделения анти-РСВ антител из сывороток естественно переболевших PC- инфекцией КРС. Специфические антитела к PC вирусу адсорбировали на BrCN-Ссфарозу 4В и получали ангитсльный иммуносорбент для выделения антигенов вируса PC из вируссодержащей суспензии. После обработки очищенного и концентрированного вируса PC ультразвуком на установке УЗДН-21 при 22 кГЦ импульсивно 10 раз, получали лизат вируса, который использовали в качестве антигена для ИФА.

Таким образом, в результате проведенных исследований, нами разработана технология одностадийной иммуноаффиннон очистки из вируссодсржащих суспензий антигенов PC-вируса для ИФА.

Вирус парагриппа-3. Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса ПГ-3 штамм "ЗКСМ" применяли методику, разработанную совместно с сотрудниками ВНИТИБП (Лукина В.А., 1989,Быкова H.H., 1989, Кузнецов Д.П, 2005,Кочиш И.И., 2005, Филиппов С.Ю., 2004). Вирус ПГ-3, выращенный на культуре клеток ПТ-80, с титром гемагглютинирующей активности 1:64 - 1:128 и инфекционностью 6,8 - 8,0 Ig ТЦД.-ю/смэ по всем показателям превосходил вирус, репродуцированный в монослое ЛЭК, ТЭК и ККЭ. В образцах перевиваемой культуры клеток ПТ-80, инфицированных дозой 1-2 ТЦД50/клетку, вирусные частицы с типичной для вируса парагриппа-3 морфологией обнаруживаются уже через 24 ч, достигая максимума к 72 ч культивирования. Анализ результатов электронно-микроскопических исследований и сопоставление их с вирусологическими данными, показывает, что высокие и стабильные показатели биологической активности вируса, репродуцированного в перевиваемой культуре ПТ-80, обусловлены прохождением вирионами полного цикла морфогенеза и образованием ультраструктур (пепломеров), ответственных за гемагглютинирующую,

инфекционную активность и ангителообразование. Следует отметить, что количество вирионов с пепломерами, являющимися морфологическими структурами, содержащими гемагглютинин и нейраминидазу, возрастает по мере снижения дозы заражения и увеличения сроков культивирования.

Наиболее эффективная очистка вируса ПГ-3 КРС 88 - 98% при потери вируса 37% получена при использовании ПЭГ с ММ 6000 Д. До 80% вируса ПГ-3 КРС осаждается 40% сульфатом аммония при концентрировании в 10 раз и очистке от балластных белков на 92%. При концентрировании ультрафильтрацией в 10-50 раз количество балластного белка в расчете на инфекционную дозу вируса снижается на 87%, с увеличением активности вируса ПГ-3 КРС в РГА с 1:64 до 1:516. Высокоскоростное центрифугирование обеспечивает эффективное осаждение вируса ПГ-3 КРС из вируссодержащей суспензии с очисткой 97,5 %. Очистка вируса ПГ-3 КРС в ступенчатом градиенте сахарозы от 15 до 55% с диапазоном изменения концентрации в 10%, показала, что пик инфекционной активности приходится на фракции с плотностью 1,20 г/см3, соответствующий уровню 45% сахарозы с выходом до 63,08% вируса. Одновременно происходит очистка вируса ПГ-3 КРС на 97,1%.

При определении плавучей плотности вируса ПГ-3 КРС в линейном 10 -40% градиенте Фиколл — 400 установлено, что вирус концентрировался в зонах 19% и 29% Фиколла-400 с плотностью 1,065 и 1,098 г/см3, в этих зонах отмечены наивысшие титры инфекционной, гемагглютинирующей активности вируса в ИФА.

Выявлено 8 структурных белков вируса ПГ-3 КРС штамма "ЗКСМ"с ММ от 14 до 180 кД, полученных обработкой очищенного вируса 1% тритоном Х-100, и индуцирующих выработку антител к вирусу ПГ-3 у кроликов. После обработки очищенного и концентрированного вируса ПГ-3 ультразвуком на установке УЗДН-21 получали лизат вируса, который использовали в качестве антигена для ИФА.

Препараты белков вируса ПГ-3 использовали для конструирования иммуносорбснта для аффинного выделения специфических антител из сывороток естественно переболевших животных и в качестве антигена для ИФА.

Вирус диареи-болезни слизистых. Исходным материалом для антигена в ИФА служила сухая культуральная вакцина против ВД-БС КРС. Препарат вируса ВД-БС с концентрацией белка 0,8-1,0 мг/см3 получали ультрацентрифугированием восстановленной суспензии ВД-БС при 125тыс. g в течение 1,5 часов в линейном 30-45% градиенте плотности сахарозы с последующей гель-хроматографией на сефадексе G-200 в трис-HCI буфере рН 8,6. После концентрирования материала первого хроматографического пика, активность вируса ВД-БС увеличилась в РИГА с 1:16 до 1:64, в ИФА с 1:1280 до 1: 64000. После обработки вируса ВД-БС ультразвуком получали антиген для ИФА.

Аденовирус. Наличие в составе аденовируса серотипа 1 гексона (белок вирусного каисида), содержащего группоспецифические антигенные детерминанты, позволяющего проводить идентификацию аденовирусов КРС, явилось основанием для получения антигена для комплексной иммуноферментной тест-системы (Белоусова Р.В., Лобова Т.П. 1990). Вирус АВИ, восстановленный из сухой культуральной инактивированной вакцины против АВИ КРС, очищенный от балластных веществ гельфильтрацией на сефадексе G-200, обрабатывали 2% тритоном Х-100. Препарат гексона выделяли из вирусной суспензии, обработанной тритоном, методом ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозс 52. Концентрированный элюат, с содержанием 1,4мг/см3 белка и активностью в ИФА с референс-диагностической сывороткой к АВ в титре 1: 12800, использовали в качестве антигена для ИФА.

Культивирование St. aureus и очистка протеина А. Протеин А широко используется в иммунохимии для выделения иммуноглобулинов G- изотипа из

сывороток различных видов животных аффинной хроматографией на BrCN-Сефарозе 4В в один этап. Для получения протеина А были отработаны оптимальные условия промышленного получения микробной массы золотистого стафилококка в биореакторе АК-210 при температуре 37"С, скорости перемешивания 100 об/мин. и рН 7,2 с аэрацией воздухом 1,4 л/мин.

Биологически активный протеин А получали из инактивированной и обработанной ультразвуком биомассы St. aureus, штамма А 676 и кульгуральной среды на аффинном сорбенте - IgG КРС, иммобилизованном на BrCN- Сефарозу 4В. Анализ чистоты выделенного протеина А в ПААГ показал наличие одной белковой фракции с ММ 42 кД. Хроматографически чистый протеин A St.aureus. конъюгировали с ферментом пероксидазы, микроносителями, сорбентами и использовали в биотехнологии компонентов диагностических тест-систем.

Получение специфических к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД- БС, PC, AB и отрицательной референс-сывороток КРС.

Ключевыми реагентами диагностических тест-систем являются референс-сыворотки, специфичность которых во многом предопределяет основные аналитические параметры ИФА. Получение антител строгой специфичности иммуносорбционным методом является наиболее универсальным, так как антитела могут быть получены к любой антигенной детерминанте. Специфические к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC, АВ сыворотки КРС и сыворотки, не содержащие антител к данным вирусам, получали иммуноаффинной хроматографией на ВгСЫ-Сефарозе 4В, с иммобилизованными антигенами вирусов.

Анализ специфичности противовирусных сывороток в ИФА показал, что очищенные методом аффинной хроматографии сыворотки, реагировали только с гомологичными антигенами ОП4500,870±0,021о.е. и не реагировали с антигенами вируса болезни Ауески, хламидий и пастерслл. Показатель

отрицательной сыворотки с антигенами вирусов ИРТ, ПГ-3,ВД-БС, рс, АВ и гетерологичными антигенами составил ОГЦ50 0,12010,030 о.е. Полученные положительные сыворотки, содержащие строго специфические для каждого вируса антитела, и отрицательная сыворотка, не содержащая антител к исследуемым вирусам, были использованы в качестве контрольных в иммуноферментной тест-системе.

Получение анти-^С коныогата КРС. Получение анти-^О КРС иммунопероксидазного коныогата проводили по усовершенствованной схеме: выделение [цО из нормальной сыворотки крови КРС аффинной хроматографией на протеин-А Сефарозе 4В в один этап; получение антивидовых сывороток на кроликах; выделение анти- КРС антител на протеин-А Сефарозе 4В; мечение антивидовых антител ферментом пероксидазы. Aнти-IgG пероксидазный коньюгат с рабочим разведением 1:10000, концентрацией по ПХ 200 мкг/см3 и ОП450 1,1650+0,013 в гомологичной системе, был использован в тсст-систсме для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ.

2.2.4. Постановка, учет и критерий оценки результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ.

Отработка оптимальных условий постановки иммуноферментной тссг-системы включала: определение сорбционной дозы вирусных антигенов, рабочих разведений контрольных и исследуемых сывороток и анти-^О коныогата КРС, которые подбирали методом "шахматного" титрования, с последовательными разведениями компонентов по горизонтальным и вертикальным рядам одной микропанели.

Выбор концентрации антигенов для ИФА для сенсибилизации планшетов проводили методом титрования при разведении контрольных сывороток 1:50 (Таблица 6).

Таблица 6

Зависимость результатов ИФА от концентрации антигенов вирусов

Концентрация антигенов (мкг/ см'1) ОП450 положительной /отрицательной сывороток с антигенами вирусов

ИРТ ПГ-3 ВД-БС PC AB

5 1,36/0,35 1,23/0,15 1,34/0,30 1,49/0,32 1,78/0.31

2,5 1,19/0,16 1,05/0,10 1,20/0,12 1,25/0,22 1,40/0,26

1,25 1,11/0,10 1,01/0,13 0,94/0,13 1,16/0,11 1,20/0,11

0,6 0,81/0,05 0,99/0,08 0,82/0,13 0,94/0,11 0,90/0,11

Оптимальной концентрацией антигена и рабочими разведениями контрольных сывороток в иммуноферментной тест-системе считали их конечные разведения, обеспечивающие в лунках с положительным контролем ОП450 > 1,0 o.e., а в лунках с отрицательным - <0,2 o.e. Из данных, приведенных в таблице 6, видно, что данным условиям отвечают следующие параметры реакции: концентрация антигена вирусов ИРТ и ВД-БС - 2,5 мкг/см3 , вируса ПГ-3 5 мкг/см3, вирусов PC и AB - 1,25 мкг/см3 соответственно, разведения контрольных сывороток -1:50. Оптимальным временем для адсорбции антигенов была 18 -часовая инкубация при +4°С. В этих же экспериментах для повышения чувствительности и специфичности тест-системы подбирали буфер для сорбции антигена и антител, блокирующий белок и время инкубации иммунологических реагентов на твердой фазе. Исследования проводили эмпирически в системе непрямого варианта твердофазного ИФА, сравнивая различные варианты буферных смесей, временные и температурные показатели. Для предотвращения неспецифической реакции проводили подбор блокирующего реагента, испытывая альбумин КРС (БСА), желатину, казеин, овальбумин, фатальную сыворотку крупного рогатого скота и сыворотку крови лошади. Во всех опытах в качестве субстратной смеси использовали раствор ТМБ, а в качестве раствора, останавливающего реакцию ■ 0,1 М H2SO4.

Реакцию оценивали по показателям ОП450 в лунках с положительной и отрицательной контрольными сыворотками крови КРС.

В результате проведенных исследований установлено, что оптимальными буферами являются фосфатно-солевой-твиновый буферный раствор (ФСБТ), фосфатно-солсвой (ФСБ) и бикарбонатно-карбонатный буферный раствор (БРК) для разведения антигенов и конъюгата. В качестве субстрата, блокирующего свободные участки пластика, был выбран ФСБТ, содержащий 5% сыворотки крови лошади. Этот же субстрат использовали для разведения испытуемых и контрольных проб сывороток. При соблюдении этих условий и использовании вирусных антигенов в оптимальных концентрациях, контрольных и исследуемых сывороток - 1:50, анги- 1цС конъюгата КРС - 1:10000 при 60-минутной инкубации на каждом этапе, нсспецифичсское взаимодействие компонентов полностью исключалось. *

Определение оптической плотности (ОП450) контрольных сывороток. Для получения достоверных результатов при тестировании исследуемых сывороток по одному разведению необходимо было определить величины оптической плотности (ОП450) положительной и отрицательной контрольных сывороток в иммуноферментной тест-системе. Результаты определения допустимых значений положительных и отрицательных контрольных сывороток в разведении 1:400 в 17 повгорностях в ИФА, представлены в таблице 7. т аблица 7

Допустимые значения ОП450 контрольных сывороток

Показатели Положительный контроль(Р) Отрицательный контроль (N) Разница между контролями (P-N)

Среднее значение стандартного отклонения ± б 1,!29± 0,18 0,122± 0,02 1,006± 0,135

Доверительный интервал 0,949- 1,309 0,102- 0,142 0,871- 1,141

Согласно представленным в таблице 7 данным, для положительных контрольных сывороток значения ОП450 должны составлять 0,949-1,309 o.e..

для отрицательной сыворотки - ОП45о 0,102 -0,142 o.e. Если значения оптической плотности контрольных сывороток выходят за рамки указанных значений, то результаты ИФА будут считаться сомнительными, и пробы должны быть исследованы повторно.

Определение критериев оценки результатов ИФА. Для этого были проведены исследования по определению закономерностей распределения значений ОП45о и коэффициента связывания (Ксв.) отрицательных и положительных сывороток, т.е. порогового значения ("cut off' или позитивно-негативный порог), разграничивающего положительную и отрицательную реакции ИФА. Установлено, что анализируемые сыворотки, имеющие Ксв. менее 20% с вероятностью 98%, не содержат специфических антител и могут быть отнесены к отрицательным сывороткам, а пробы со значением Ксв. равным или превышающим этот показатель - положительными. Таким образом, значение Ксв., позволяющее дискриминировать положительные и отрицательные сыворотки методом ИФА, составило 20%.

Контроль воспроизводимости результатов определения антител комплексной тест-системой ИФА.

Одним из важных критериев иммуноферментных гест-систем является воспроизводимость результатов определения, которая проверяется как в рамках одной микропанели (набора ИФА), так и между разными наборами ИФА одной серии и наборами разных серий. Мерой контроля воспроизводимости является значение коэффициента вариации (К.В.), который отражает зависимость между разбросом и среднеарифметическим значением результатов (Методическое руководство, Р.А.Тигранян, Н.Ф.Калита, А.С.Роганов, 1994).

Коэффициент вариации значений Ксв. при исследовании положительных проб (п=95) наборами разных серий не превышал 6,76%, а при исследовании отрицательных (n=l 1) - 4,76%, что соответствует рекомендуемым параметрам и не превышает 10%. Коэффициент корреляции результатов при исследовании положительных проб составил 0,9, отрицательных - 0,97.

2.2.5. Оценка эффективности иммуноферментнои тест-системы для выявления антнтел к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ в сравнении с методами аналогичной направленности.

Чувствительность и специфичность разработанной тсст-сисгемы для выявления антител к респираторным вирусам устанавливали в сравнении с методами аналогичной направленности: реакции нейтрализации и РИГА. В исследованиях использовали 302 сыворотки крови от животных различного иола и возраста, полученные из 15 хозяйств различных регионов РФ (Табл. 8).

Таблица 8

Сравнительная эффективность РН, РИГА и ИФА при исследовании сывороток

крови крупного рогатого скота

Результаты РН, РИГА, количество проб

Тсст-систсмы количество проб Положительных (пИ95) Отрицательных (п=117)

Результаты в ИФА: положительных 192 7

количество проб: отрицательных 3 ПО

Результаты, приведенные в таблице 8, свидетельствуют о том, что диагностическая чувствительность разработанной тест-системы составила 192:195х 100%=98,46%; диагностическая специфичность 110:117 х 100 % = 94,02%; совпадасмость результатов методов 302:312 х 100 % = 96,8%. Анализ полученных данных свидетельствует о положительной корреляции результатов (г=0,9, Р < 0,05), при совпадаемости результатов 96,8%. При исследовании сывороток крови, полученных от вакцинированных животных (п=36), установлена 100%-я совпадаемость результатов ИФА,РИГА и РН.

Исследование молозива коров на наличие антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ в комплексной тест-системе ИФА.

Поскольку пассивный лактогенный иммунитет является важнейшим механизмом в предотвращении инфекционных респираторных вирусных инфекций новорожденных телят, очевидно, что их эффективная вакцинация

составляет основу стратегического подхода в иммунопрофилактике. Поэтому, определение уровня специфических антител в секрете молочной железы вакцинированных коров имеет прогностическое значение в вопросе о формировании лактогенного иммунитета у новорожденных телят.

Исследовали пробы молозива, полученные от 51 вакцинированных коров из 3-х хозяйств РФ. Чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы определяли в сравнительном аспекте с РНГА, полученные результаты приведены в таблице 9.

Таблица 9

Сравнительная эффективность РНГА и ИФА при исследовании проб молозива коров

Тест-системы количество проб Результаты РНГА, количество проб проб

Положительных (п-48) Отрицательных (п=3)

Результаты ИФА% положительных 45 1

отрицательных 3 2

Анализ результатов исследований показал, что совпадаемость результатов ИФА и РНГА составила 92,16%, корреляция составила г = 0,82 при Р < 0,05. В результате проведенных исследований установлено, что уровень специфических антител в секретах молочной железы коров, также как и срок циркуляции материнских антител в организме телят могут служить дополнительными критериями оценки эффективности применяемых вакцинных препаратов.

2.2.6.Применение комплексной иммуноферментной тест-системы для серологического мониторинга респираторных болезней КРС.

Изучение особенностей распространения и протекания вирусных респираторных болезней весьма актуально и может быть использовано в практике при планировании и разработке комплекса оздоровительных и профилактических мероприятий. С помощью разработанной комплексной

нммунофсрмснтной тсст-систсмы одновременно к 5 вирусам были исследованы 232 сыворотки крови телят, телок, стельных и дойных коров из неблагополучных хозяйств.

Результаты серологического обследования показали, что в 88% исследованных проб были выявлены специфические антитела к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ. В 30% сывороток были выявлены антитела к вирусу ИРТ, в 27% -к ВД-БС. При серологическом обследовании животных 3 хозяйств РФ выявлены одновременно специфические антитела к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД-БС в 74,3% и РС и аденовирусной инфекции в 56,4% случаев. Полученные результаты свидетельствуют о сочетанием течении ИРТ, ПГ-3, РС и ВД-БС инфекций.

В 2-х хозяйствах, неблагополучных по рота- и коронавирусным инфекциям, у телят были выявлены антитела к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД-БС в 72,8% случаев. Полученные данные свидетельствуют о том, что в Племенных и товарных хозяйствах респираторные болезни у телят могут протекать в ассоциации с другими инфекциями. Исследование парных сывороток больных животных в ИФА показал прирост титров специфических антител к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, что свидетельствует об их этиологической роли в ассоциативном течении данных инфекций.

Таким образом, проведенные исследования показали, что разработанная нами иммуноферментная тест-система является эффективным инструментом при массовом обследовании животных.

6. ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована технология получения антирабической сыворотки при производстве диагностических ФИТЦ-антирабических коньюгатов. Применение полиэлектролита-полиоксидония в качестве адъюванта способствовало активации иммунокомпетентных клеток, стимулированию антителообразования, сокращению сроков иммунизации с 90 до 62 дней,

повышению специфической активности антирабической сыворотки и уменьшению расхода антигенного материала для иммунизации.

2. Создана клонотека рекомбинантных плазмид, содержащих 67 фрагментов бактериального генома лептоспир штамма ВГНКИ-6 Leptospira серогруппы Pomona. Получен банк 42 препаратов ДНК лептоспир референтных штаммов, 6-производственных, 7 штаммов серогруппы Pomona, изолированных от больных сельскохозяйственных животных и человека в различных регионах РФ.

3. Установлено, что рекомбинантная плазмида pLp 41 размером 3880 пар нуклеотидов, содержащая фрагмент ДНК L. interrogans серовара pomona может быть использована в качестве видоспецифического гибридизационного зонда. Показано, что плазмидный зонд гибридизуется только с ДНК лептоспир вида L. interrogans, и не гибридизуется с препаратами суммарных нуклеиновых кислот сапрофитных лептоспир, иерсиний, кишечной палочки, бруцелл, микоплазм и других бактерий.

4. Установлено в хромосомных ДНК сероваров tarassovi, sejroe, pomona, kabura, polonica, whitcombi, grippotyphosa, panama, castellonis, sarmin, szwajizak, bratislava, djatzi, louisiana, cynopteri присутствие области, гомологичной фрагменту ДНК L. pomona в составе рекомбинантной гшазмиды pLp 41. Показано, что ДНК-зонд pLp 41 позволяет выявлять образцы ДНК штаммов лептоспир основных серогрупп Pomona, Tarassovi, Sejroe, Grippotyphosa.

5. Показана возможность использования фрагмента ДНК L. pomona. рекомбинантной плазмиды pLp 41 в качестве ДНК-зонда для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации. Установлено, что в хромосоме производственных штаммов лептоспир присутствуют различные по молекулярной массе области, несущие участки ДНК, гомологичные фрагменту ДНК L. pomona, входящего в состав плазмиды pLp 41.

6. Определены молекулярно-генетические характеристики указанного фрагмента, обеспечивающие его идентификацию. При этом установлено, что клонированный фрагмент ДНК имеет размер 1 200 пар нуклеотидов, ограниченный сайтами рсстриктазы EcoR I, а также не содержит сайты следующих рестриктаз: Pst I, Sma I, Xba I и EcoR V. Плазмида содержит ген bla, детерминирующий синтез бетта-лактомазы, что обеспечивает устойчивость к ампициллину штамма Е. coli, несущего данную плазмиду. Плазмида мультикопийна и неконъюгативна.

7. Выявлено 8 структурных белков с мол. массой от 14 до 180 кД вируса ПГ-3 КРС, штамма "ЗКСМ", полученных обработкой вируссодсржащей суспензии тритоном Х-100, и индуцирующих выработку специфических к вирусу ПГ-3 антител в организме восприимчивых животных.

8. Выделены и охарактеризованы 9 структурных белков с мол. массой от 28 до 180 кД PC-вируса штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК., 6 из которых с мол. массой от 42 до 180 кД индуцируют выработку специфических к вирусу РСВ антител в организме восприимчивых животных.

9. Разработан одноэтапный метод аффинной очистки специфических антител из антисывороток и антигенов PC-вируса и ПГ-3 из вируссодержащйх суспензий на анти-РС IgG BrCN-Сефарозе 4В и анти-ПГ-3 IgG BrCN-Сефарозе 4В при промышленном производстве компонентов тест-системы ИФА.

Ю.Определены оптимальные условия промышленного культивирования и инактивации штамма Staphylococcus aureus, получения хроматографически чистого и биологически активного протеина А для конструирования иммуносорбентов.

11. Разработана комплексная иммуноферментная тест-система для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС,АВ и оптимизированы условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота в разведении 1:50. Установлен коэффициент

связывания (Ксв.) равный 20%, позволяющий дифференцировать положительные и отрицательные сыворотки в ИФА.

12. Чувствительность разработанной тест-системы по отношению к РН,РНГА составила 98,46%, специфичность- 94,02%, совпадаемость результатов-96,8%, коэффициент корреляции-0,9 при Р<0,05. При исследовании молозива иммунных коров совпадаемость результатов ИФА и РИГА составила 92,16%, при г = 0,82, Р< 0,05. Показана эффективность комплексной иммуноферментной тест-системы в качестве скринирующего экспресс-метода при массовом серологическом обследовании крупного рогатого скота.

Практические предложения.

На основании проведенных исследований предлагаются для практики:

1. Рекомбинантная плазмида pLp 41 в качестве источника молекулярного зонда для идентификации патогенных лептоспир и дифференциации производственных штаммов лептоспир.

2. Разработаны:

"Инструкция по изготовлению и контролю компонентов для диагностики бешенства животных в РДП", утверждена 21.02.2006г. директором ВНИТИБП.

"Инструкция по изготовлению и контролю глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных", утверждена 02.10.2007г. директором ВНИТИБП.

Изменения в ТУ 9388-003-00497963-97 «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных", утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ 12.04.2004 г.

"Методические рекомендации по идентификации производственных штаммов и дифференциации Leptospira interrogans от Leptospira biflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации", утверждены директором ВНИТИБП от 17.09.93, протокол N2;

«Методические рекомендации по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-З (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (PC), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА)", рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года на секции "Ветеринарная

биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №1, утвержденные 18.03.2007 г. академиком РАСХН A.M. Смирновым.

«Методические рекомендации по определению уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных животных методом иммуноферментпого анализа (ИФА)", рассмотренные и одобренные 21. 04.2008г. на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол К«5.

Технологический регламент на производство набора компонентов для определения уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (PC), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА)", утвержден 21.07. 2007г. директором ВНИТИБП.

Технологический регламент на производство набора компонентов для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных животных методом иммуноферментного анализа (ИФА), утвержден 21.07. 2007г. директором ВНИТИБП.

5. СПИСОК РАЬОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тюрина И.Н., Артюшин С.К., Белоусов В.И., Быкова H.H. ДНК-зонд для идентификации и дифференциации лептоспир// Ветеринария.-1993.-№8.-С.53.

2.Матвеева И.Н.Комплсксная тест-система ИФА для дифференциальной диагностики респираторных болезней крупного рогатого скота //Ветеринария и кормление.- 2006. №3.-С.14-15.

3. Матвеева И.Н. Комплексная тест-система ИФА для серологического мониторинга заболеваний крупного рогатого скота// Ветеринария и кормление.-2006. №5,- С. 26-27.

4. Матвеева И.Н. Иммуноферментный анализ в диагностике вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС) крупного рогатого скота Ветеринария.-2007. №6 .-С.54-57.

5. Матвеева И.Н. ИФА для определения уровня антител к вирусу ВД-БС//Ветеринарня.-2008.№ 4 .-С. 54-56.

6. Матвеева И.Н. Получение антигена рсспирагорно-синцитиального вируса крупного рогатого скота для использования в ИФА // Ветеринария.-2007.№ 11.-С. 49-51.

7. Матвеева И.Н. Оздоровления стад от массовых респираторных заболеваний //Ветеринария.-2008.-№ 12 .-С 18-20.

8. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кузнецова C.B., Филиппов С.Ю., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю. Тест-система ИФА для определения антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота //Ветеринария и кормление.-2006. №6-С.28-29.

9. Матвеева И.Н. Разработка компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антител к вирусу диареи-болезни слизистых оболочек в сыворотке крови, молоке крупного рогатого скота.// Ветеринария и кормление.- 2007. № 2- С.24-25.

Другие публикации

1. Быкова H.H., Белоусов В.И., Лукина В.А., Самуйленко А.Я., Тюрина И.Н. // Сравнительная оценка методов определения вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота при разработке тест-системы ИФА. // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов/Тез.докладов IV Всесоюз. конф.-М.- 23-25 апреля 1991.-С.112.

2. Тюрина И.Н., Быкова H.H., Лукина В.А., Белоусов В.И., Самуйленко А.Я. Сравнительная оценка методов очистки вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота при разработке диагностического ИФА-набора. Актуал.вопр.вет.вирусологии. -Владимир, 1990.-С. 63-64.

3. Белоусов В.И., Тюрина И.Н. Дифференциация штаммов ВГНКИ-1 и Moskva-5 возбудителя лептоспироза серогруппы Grippotyphosa на субсеровариантном уровне с помощью ДНК-зондов в реакции блот-гибридизации. - Науч.основы технологии пром. пр-ва вет. биол. препаратов. -Щелково, 1996.-С. 132.

4. Белоусов В.И., Тюрина И.Н. Использование твин-альбуминовой питательной среды при производстве вакцины против лептоспироза животных. - Науч.основы технологии пром. пр-ва вет. биол. препаратов. -Щелково, 1996,-С. 116-117.

5. Филиппов С.Ю., Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П. Изучение репродукции вируса ПГ-3 крупного рогатого скота в нервично-трипсинизированной культуре клеток почки теленка // Сб. докладов междунар. конф. молодых ученых "Научные основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов", Щелково- 5-6 декабря 2002. - С. 36.

6. Филиппов С.Ю., Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П.Очистка и концентрирование вируса ПГ-3 крупного рогатого скота// Сб. докладов междунар. конф. молодых ученых "Научные основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов", Щелково- 5-6 декабря 2002 - С. 39.

7. Матвеева H.H., Кузнецова C.B., Лунин В.Г., Воронина О.Л., Кузнецов Д.П. Репродукция вируса диареи в культуре клеток ПЭК.//С6. докладов междунар. конф. молодых ученых "Научные основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов", Щелково- 5-6 декабря 2002 - С. 42.

8. Матвеева И.Н., Кузнецова C.B., Лунин В.Г., Воронина О.Л., Кузнецов Д.П. Очистка вируса диареи крупного рогатого скота.//Сб. докладов междунар.

конф. молодых ученых "Научные основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов", Щелково- 5-6 декабря 2002 - С. 45.

9. Меныиенин В.В., Яковлев Т.Е., Самуйленко А.Я., Шкварук Т.Я., Быкова H.H., Тюрина И.Н. // Получение антнвидового конъюгага анти-IgG утки, меченого ферментом пероксидазой, для использования в иммуноферментном анализе (ИФА)./ Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов /Тез. докладов IV Всссоюз. конф.-М.-23-25 апреля 1991.-С.141.

10. Матвеева И.Н., Гринь С.А., Кузнецов Д.П., Мальгин Ю.А., Мальгина Т.А. Получение биологически активного протеина А из золотистого стафилококка //Материалы междунар.научно-нрактич.конференции, посвященной 35-летию института 26-27 мая 2005 г. "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов"- Щелково.-С. 423.

11. Матвеева И.Н., Гринь С.А., Кузнецов Д.П., Мальгин Ю.А., Мальгина Т.А. Выделение биологически активного протеина А для использования в биологических исследованиях //Материалы междунар.научно-пракгич.конференции, посвященной 35-летию института 26-27 мая 2005 г."Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов ".- Щелково.-С.421.

12. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Гринь С.А. Промышленный способ получения биологически активного протеина А //Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г. "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных".-Москва "ИзографЪ" .-С.275.

13. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А. Изучение репродукции рссиираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота// Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г. "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных".-Москва "ИзографЪ".-2006,- С.277.

14. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кузнецова C.B., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А. Разработка тест-системы для детекции антител к респираторно-синци шальному вирусу крупного рогатого скота в ИФА //Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г. "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных".-Москва "ИзографЪ" .-2006.-С.279.

15. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А. Очистка и концентрирование респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота //Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17

мая 2006 г. "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных".-Москва "ИзографЪ".-2006.-С.282.

16. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П., Кузнецова C.B., Гринь С.А. Разработка тест-системы для детекции антител к вирусу парагриппа-З крупного рогатого скота в ИФА //Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г. "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных",-Москва "ИзографЪ" .-2006.-С.284.

17. Матвеева И.Н., Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Филиппов С.Ю., Кузнецов Д.П. Очистка и концентрирование респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота// Материалы Междунар научно- производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва A.A., 22-23 июня 2006 года, "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных" Воронеж, "Научная книга".-2006 г.- С. 327-330.

18. Матвеева И.Н., Кузнецов Д.П. Промышленный способ получения биологически активного протеина А// Материалы Междунар. научно-производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва A.A., 22-23 июня 2006 года, "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных".- Воронеж, "Научная книга".-2006 г.- С. 330.-332.

19. Матвеева И.Н., Кузнецова C.B., Филиппов С.Ю., Кузнецов Д.П. Разработка тест-системы для детекции антител к вирусу диареи крупного рогатого скота в ИФА // Материалы Междунар. научно- производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва A.A., 22-23 июня 2006 года, "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных",- Воронеж, "Научная книга".-2006 г.- С. 333-337.

20. Матвеева И.Н., Кузнецов C.B., Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Филиппов С.Ю., Кузнецов Д.П. Разработка тест-системы для детекции антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в ИФА // Материалы Междунар. научно- производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва A.A., 22-23 июня 2006 года, "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных",-Воронеж, "Научная книга".-2006 г.- С. 337-342.

21. Матвеева И.Н., Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Филиппов С.Ю., Кузнецов Д.П. Изучение репродукции респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота // Материалы Междунар. научно- производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва A.A., 22-23 июня 2006 года, "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных",- Воронеж, "Научная книга".-2006 г.- С. 342-345.

22. Матвеева И.Н. Результаты серологического мониторинга вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах//Матсриалы Междунар. научно- практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова,15

декабря 2006 года, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ".- Щслково.-С.86-87.

23. Матвеева И.Н., Филиппов С.Ю. Оценка эффективности иммуноферментной тест-систсмы для выявления антител к вирусу диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота//Магсриалы Междунар. научно- практической конференции, посвященной 80-лстию со дня рождения И. А. Хорькова,15 декабря 2006 года, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ".- Щслково.-С.88-93.

24. Матвеева И.Н., Кузнецов C.B., Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Филиппов С.Ю., Кузнецов Д.П. Набор реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в ИФА // Материалы Междунар. научно- практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова, 15 декабря 2006 года, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ".- Щслково.-С.97-100.

25. Матвеева И.Н. Биологические микрочипы -это диагностика будущего// Материалы Междунар. научно- практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова, 15 декабря 2006 года, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ".- Щелково.-С. 126128.

26. Кочиш И.И., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Филиппов С.Ю., Чулков А.К., Кржыжановская Е.В. Разработка тест-системы ИФА для диагностики респираторно-синцитиальной инфекции Ветеринарная медицина Научно-практическая конференция "Актуальные проблемы молекулярной диагностики ветеринарной медицины и биологии" 2225 мая 2007 г - Феодосия, Крым. Выпуск, 88.-С.116-119.

27. Кочиш И.И., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Филиппов С.Ю., Чулков А.К., Кржыжановская Е.В. Тест-система ИФА для диагностики парагриппа-3 Ветеринарная медицина Научно-практическая конференция "Актуальные проблемы молекулярной диагностики ветеринарной медицины и биологии" 22-25 мая 2007 г. - Феодосия, Крым, выпуск 88,-С. 120-122.

28. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Еремец В.И., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Клюкина В.И., Люлькова Л.С., Кузнецов Д.П., Кузнецова C.B., Павленко B.C., Ломакина Т.А., Лихашерстова C.B. Современные биологические процессы и иммунобиологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов.//Матсриалы Междунар. научно- практической конференции, 20-21 декабря 2007 года, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ".- Щелково.-С.6-10.

29. Матвеева И.Н., Сивков Г.В., Гринь С.А., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю. Изучение репродукции вируса аденовирусной инфекции крупного рогатого скота Материалы Междунар. научно- практической конференции, 20-21 декабря 2007 года, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ".- Щелково.-С. 126-129.

30. Матвеева И.H., Сивков Г.В., Гринь С.А., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю. Чулков А.К., Кржижановская Е.В. Концентрирование и очистка вируса аденовирусной инфекции крупного рогатого скота //Материалы Мсждунар. научно- практической конференции, 20-21 декабря 2007 года, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов",- Щелково.-С.129-132.

31. Матвеева И.Н., Сивков Г.В., Гринь С.А., Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю. Чулков А.К., Кржижановская Е.В. Разработка компонентов тест-системы ИФА для определения уровня антител к возбудителю аденовирусной инфекции крупного рогатого скота //Материалы Междунар. научно- практической конференции, 20-21 декабря 2007 года, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ".- Щелково.-С. 132-137.

32. Кочиш И.И., Кочиш Т.Ю., Гринь С.А., Матвеева И.Н., Кржижановская Е.В. Чулков А.К. Разработка тест-системы ИФА для изучения иммунологической активности вакцин против пастереллеза животных определения //Материалы Междунар. научно- практической конференции, 20-21 декабря 2007 года, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ".- Щелково.-С.234-23 8.

33. Матвеева И.Н. Разработка тест-системы иммуноферментного анализа для выявления специфических антител к вирусу аденовирусной инфекции крупного рогатого скота по одному разведению сыворотки.// Материалы Всероссийской научной конференции, 20-21 ноября 2008 года, "Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология",- 2008.-Киров.-С.22-24.

34. Матвеева И.Н., Еремец Н.К. Усовершенствование методов получения специфических антител при производстве биологических препаратов.// Материалы Всероссийской научной конференции, 20-21 ноября 2008 года, "Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология",- Киров.-С. 26-27.

35. Тюрина И.Н., Артюшин С.К., Белоусов В.И., Быкова H.H. Идентификация и дифференциация производственных штаммов лситоспир методом ДНК-ДНК гибридизации// Профилактика и меры борьбы с инфекц. заболеваниями животных: -Тез. докл. научно-практ. конф. 21-22 апреля 1993 г.-М., 1993.-С.62-63.

36. Artushin S., Belousov V., Bikova N., Turina I. Development of DNK-hybridization probe for identification of Leptospira interrogans serovar pomona//VII European and IX USSR leptospirosis research conference Moskou, February 20-22.-M., 1991.-P.53.

37. Тюрина И.Н., Артюшин С.К., Белоусов В.И., Быкова H.H. // Молекулярное клонирование ДНК Leptospira Pomona// Науч. основы технологии пром. пр-ва вет. биол. препаратов: Тез. Докл. всесоюз. науч. конф. 23-25 апреля 1991 г.-М„ 1991.-С. 106.

Отпечатано в ООО "Мещера" М.О., г. Щелково, ул.Свирская, д.8а зак. №992 тир. 110 экз.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Матвеева, Ирина Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бешенство животных.

1.1.1. Сравнительная оценка методов диагностики бешенства животных.

1.1.2. Методы прямого обнаружения антигена вируса бешенства.

1.1.3. Методы выделения вируса бешенства.

1.1.4. Сравнительная оценка диагностической пригодности тестов.

1.2. Лабораторная диагностика лептоспироза.

1.2.1. Краткая характеристика основных методов диагностики.

1.2.2. Рестрикционный анализ как таксономический метод.

1.2.3. ДНК-ДНК гибридизация в диагностике лептоспироза.

1.3. Респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота.

1.3.1. Введение.

1.3.2. Диагностика инфекционного ринотрахеита КРС.

1.3.2.1. Традиционные методы диагностики инфекционного ринотрахеита.;.

1.3.2.2. Иммуноферментный метод для диагностики инфекционного ринотрахеита.

1.3.2.3. Диагностика ИРТ с помощью гибридизации ДНК и полимеразной цепной реакции.

1.3.3. Диагностика вирусной диареи-болезни слизистых.

1.3.3.1. Общие положения в диагностике инфекции.

1.3.3.2. Иммуноферментный анализ в диагностике вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС).

1.3.4. Лабораторная диагностика PC инфекции.

1.3.5. Лабораторная диагностика парагриппа-3.

1.3.5.1. Серодиагностика и ретроспективная диагностика.

1.3.5.2. Сравнение методов серодиагностики парагриппа-3.

1.3.6. Диагностика аденовирусной инфекции.

1.3.6.1. Серологическая идентификация.

1.3.6.2. Серодиагностика и ретроспективная диагностика.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1.1.Штамм ы.

2.1.2.Инфекционность вируса.

2.1.3.Культуры клеток и среды.

2.1.4.Антитела и антигены.:.

2.1.5.Сыворотк и.

2.1.6.Выделение и очистка Ig G.

2.1.7.Непрямой иммуноферментный анализ.

2.1.8.Чувствительность и специфичность разработанной тест-системыИФА.12

2.1.9.Молекулярное клонирование ДНК L. рошопа.

2.1.10.Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 .Усовершенствование технологии получения антирабической сыворотки для промышленного производства диагностических

ФИТЦ-коньюгатов.

• 3.2. Молекулярное клонирование ДНК L.interrogans серовара рошопа ^ для идентификации и дифференциации лептоспир.

3.2.1. Выделение и характеристика ДНК лептоспир.

3.2.2. Создание клонотеки ДНК L. interrogans серовара рошопа. i 3.2.3. Получение фрагментов ДНК L. interrogans серовара рошопа.

3.2.4. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид.

3.2.5. Анализ рекомбинантных плазмид в реакции ДНК-ДНК гибридизации.

3.2.6. Применение рекомбинантных плазмид для идентификации и дифференциации лептоспир.

3.2.6.1. Применение плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41 для идентификации референтных штаммов лептоспир.

3.2.6.2. Получение ДНК-зондов для идентификации полевых изолятови производственных штаммов лептоспир.

3.2.6.3. Определение специфичности ДНК L.pomona на коллекции штаммов различных видов микроорганизмов.

3.2.6.4. Дифференциация производственных штаммов лептоспир.

3.3. Разработка технологии получения компонентов комплексной тест-системы иммуноферментного анализа для выявления антител-к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-З, ВД-БС, PC и АВ.

3.3.1. Промышленное культивирование клеток ПТ-80.

3.3.2. Очистка и концентрирование вирусов и получение антигенов для ИФА.

3.3.2.1. Вирус парагриппа-3.

3.3.2.1.1. Репродукция вируса парагриппа-3, штамм «ЗКСМ».

3.3.2.1.2. Очистка и концентрирование вируса ПГ-З.

3.3.2.1.3. Получение антигена для иммуноферментного анализа

ПГ-ЗКРС.

3.3.2.1.4. Изучение белков вируса ПГ-З из вируссодержащих суспензий.

3.3.2.2. Получение аденовирусных антигенов для ИФА.

3.3.2.3. PC-вирус.

3.3.2.3.1. Репродукция PC-вируса, штамм «Randall».

3.3.2.3.2. Очистка и концентрирование PC-вируса.

3.3.2.4.Вирус ИРТ.

3.3.2.4.1. Репродукция вирусаИРТКРС.

3.3.2.4.2. Очистка и концентрирование вируса ИРТ КРС.

3.3.2.5. Вирусная диарея-болезнь слизистых.

3.3.2.5.1.Очистка и концентрирование ВД-БС.

3.3.3. Культивирование St. aureus и очистка протеина А.

3.3.4. Выделение иммуноглобулина класса G из сыворотки крови

3.3.5. Получение анти-IgG КРС гипериммунной сыворотки.

3.3.6. Выделение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС)

3.3.7. Мечение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС) ферментом пероксидазой из хрена.

3.3.8. Получение специфических к вирусам ИРТ, ПГ-3,ВД-БС, PC,

АВ и отрицательной референс сывороток КРС.

3.3.8.1. Получение специфических к вирусам сывороток крови.

3.3.8.2. Получение отрицательной референс-сыворотки крови.

3.3.9. Постановка, учет и критерий оценки результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к . антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ.

3.3.9.1. Оптимизация условий постановки комплексной иммуноферментной тест-систем.

3.3.9.2. Определение рабочего разведения сывороток.

3.3.9.3. Определение оптической плотности (ОП450) контрольных сывороток.

3.3.9.4. Определение критериев оценки результатов ИФА.

3.3.10. Контроль воспроизводимости результатов определения антител комплексной тест-системой ИФА.

3.3.11. Оценка эффективности иммуноферментной тест-системы для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и

АВ в сравнении с методами аналогичной направленности.

3.3.12. Исследование молозива коров на наличие антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ в комплексной тест-системе ИФА.

3.3.13. Применение комплексной иммуноферментной тест-системы для серологического мониторинга респираторных болезней КРС.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных"

Реализация идеи создания диагностических наборов требует решения сложных и разнообразных задач. Это, прежде всего, выделение и изучение структуры, физико-химических и иммунобиологических свойств антигенов вирусов и бактерий, детерминант или эпитопов, определяющих специфичность конкретного антигена, и определение их роли в формировании иммунитета. Получение высокоактивных специфических сывороток требует наличия очищенных антигенов, применение эффективных схем иммунизации, выбора адекватных животных-продуцентов, а также изучения возможности применения современных г эффективных иммуностимуляторов.

Многообразие симптомов проявления вирусных и бактериальных болезней, а часто их ассоциация, затрудняют постановку диагноза, поэтому

1 (

1 этиологический диагноз должен основываться на результатах лабораторных исследований, включая серологический анализ (142).

В этой связи актуальным является совершенствование методов серологической диагностики вирусных и бактериальных инфекций и разработка технологии изготовления моно- и комплексных диагностических тест-систем.

Лептоспироз относится к числу распространенных природно-очаговых, зооантропонозных, опасных в социальном и экономическом отношениях болезней. Неоценимый вклад в изучение лептоспироза внесли отечественные ученые: Ананьин В.В.,1949;1951; Малахов Ю.А., 1971,1979,1992; Ежов Г.И., 1979,1983,1985; Белоусов В.И., 1984, Артюшин G.K., 1991. До настоящего времени общепринятым методом- диагностики лептоспироза остается реакция микроагглютинаци (РМА).

Фундаментальные исследования по изучению нуклеиновых кислот лептоспир, а также работы по геносистематике этих микроорганизмов позволяют сделать вывод о возможности применения методов биотехнологии для решения проблем, связанных с диагностикой лептоспироза. За рубежом ведутся интенсивные исследования генома многочисленных сероваров лептоспир, анализируются возможности практического применения анализа ДНК и различных вариантов ДНК-ДНК гибридизации, позволяющие выявлять особенности сероваров на уровне хромосомной ДНК лептоспир (Le Febure R.B.,1987; Van Eys G., 1989; Pacciarini M.L.,1992; Merien F. et al.,1992).

Молекулярно-биологические методы играют важную роль в изучении систематики патогенных лептоспир, поиска возможностей их дифференциации и идентификации на основании сравнения генотипов: Так, используя метод ДНК-ДНК гибридизации, возможно выявление специфических фрагментов генома возбудителя лептоспироза, на основании которых делается заключение о наличии или отсутствии лептоспир в исследуемом материале.

Респираторные болезни КРС регистрируются во многих ^регионах Российской* Федерации и странах СНГ, причиняя большой экономический ущерб ^мясному и молочному скотоводству. По широте распространения, смертности, вынужденному убою и недополучению привесов они занимают ведущее место в, структуре заболеваний молодняка. Среди вирусных агентов, вызывающих заболевания с симптомами поражения дыхательных путей у крупного рогатого скота (КРС), вирусы инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной (PC) и аденовирусной-(АВ) инфекции занимают особое место в связи с многообразием клинических проявлений и тяжестью течения болезней, вызываемых ими (Сюрин В.Н., 1978; Гуненков В.В., 1975; Крюков Н.Н., 1984; Мищенко В.А.,

2001; Красочко ПЛ., 1997; Глотов А. Г., 2001; Кузнецова С.В.,1991; Юров К.П., 2001,2003; A. L.E. Lindberg, 2003).

В связи с этим, разработка и внедрение высокочувствительных и специфичных методов серологического мониторинга респираторных заболеваний КРС, которые при большой концентрации животных на ограниченных площадях, часто проявляются у молодняка в виде вирусно-бактериальных ассоциаций, имеют большое значение при проведении лечебно-профилактических мероприятий (Глотов А.Г.,2001).

Учитывая то, что диагностика многих моноинфекций решена на уровне практического применения наборов ИФА, и отсутствием наборов для серологического мониторинга вирусных респираторных заболеваний КРС, разработка комплексных тест-систем ИФА представляет значительный научно-практический интерес у ветеринарных специалистов РФ.

Перечисленные выше нерешенные вопросы свидетельствуют об актуальности проведенных исследований.

Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы является совершенствование и разработка современных биотехнологических и иммунобиологических методов для- промышленного производства компонентов моно- и комплексных диагностических тест-систем инфекционных болезней животных бактериальной и вирусной природы.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

2. Клонировать ДНК L. interrogans серовара pomona в плазмидном векторе, создать клонотеку рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты генома L. pomona. Получить банк препаратов нуклеиновых кислот лептоспир различных серогрупп.

3. Провести серию гибридизаций отдельных клонированных фрагментов ДНК с полученными препаратами нуклеиновых кислот лептоспир и выявить фрагмент ДНК L. interrogans серовара pomona, пригодный для использования- в качестве видоспецифичного гибридизационного зонда. Определить возможность применения клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации.

6. Определить эффективность комплексной иммуноферментной тест-системы для выявления-антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC, АВ инфекции в сравнении с методами аналогичной направленности.

Научная новизна. Усовершенствованы и разработаны: 1. Технология получения высокоактивной и специфичной антирабической сыворотки, применяемой для изготовления антирабических диагностических ФИТЦ-конъюгатов и референс-антирабической сыворотки для выявления специфических антител к вирусу бешенства в сыворотках вакцинированных животных методом иммуноферментного анализа.

2. Впервые разработана технология получения компонентов комплексной иммуноферментной тест-системы для определения уровня специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ инфекции в биологических жидкостях организма КРС; оптимизированы условия исследования »сывороток крови и молозива в одном разведении, показана высокая чувствительность и специфичность ИФА и установлена положительная корреляция (результатов, полученных с помощью ИФА и РН, РНГА (заявки на изобретения: «Способ применения комплексной тест- системы иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления специфических антител к вирусным инфекциям в биологических жидкостях организма КРС» №2008126759; «Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма КРС» № 2008132390).

3. Разработаны методы получения очищенных и концентрированных вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ.

4. Впервые разработана технология получения специфических антисывороток к вирусам ИРТ, ИГ-3, ВД-БС, РС, АВ и отрицательных референс-сывороток крови КРС для иммуноферментной тест-системы методом аффинной хроматографии (заявки на изобретения: « Комплексная тест-система иммуноферментного анализа (ИФА) для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям КРС» №2008126758; «Способ получения отрицательных референс-сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма КРС» №2008132387).

5. Впервые проведено молекулярное клонирование фрагментов ДНК L. interrogans серовара pomona и на их основе создан банк нуклеотидных последовательностей генома лептоспир, получен ДНК-зонд, позволяющий идентифицировать и дифференцировать производственные штаммы лептоспир.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Результаты исследований использованы в производстве диагностических препаратов: «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных», ТУ 9388-003-00497963-97 и «Набор компонентов для диагностики бешенства в РДП», ТУ 9382-006-0497963-92.

-Технология получения антисыворотки к вирусу бешенства с применением полиоксидония включена в "Инструкцию по изготовлению и контролю глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных", "Инструкцию по изготовлению компонентов для диагностики бешенства животных в РДП", утвержденные 02.10.2007 г. директором ВНИТИБГ1 и в "Инструкцию- по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных", утверждена директором ВНИТИБП 2.02.2008 г.

-Технология получения протеина А золотистого стафилококка, конъюгированного с ферментами (пероксидазой), микроносителями, сорбентами вошла в "Инструкцию по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных", утверждена 22.01.2008 г. директором ВНИТИБП.

Результаты исследований использованы при составлении: - "Методических рекомендаций по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (PC), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа", рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №1. -"Методических рекомендаций по идентификации производственных штаммов лептоспир и дифференциации вида Leptospira interrogans от Leptospira biflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации", утверждены директором ВНИТИБП 17.09.1993 г. и используются во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) при паспортизации производственных штаммов лептоспир и изучении культур лептоспир, выделенных от сельскохозяйственных и диких животных. -"Методических рекомендаций по определению уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных методом иммуноферментного анализа", рассмотренные и одобренные 21 04. 2008 года на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №5.

Коллектив ВНИТИБП был награжден за разработку «Комплексной тест-системы ИФА для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям КРС» Дипломом с медалью на 6-й Международной специализированной выставке «Лаборатория» (2008 г.).

-на 7-й Европейской и 9-й Всесоюзной конференциях по лептоспирозу в Москве, 1991 г.;

-на Научно-практической конференции: "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных", 1993 г.; -на Международной научно-практической конференции молодых ученых: "Научные основы производства ветеринарных биологических биопрепаратов", Щелково, 1991 г., 2002 г., 2005 г.;

-на Всероссийской научной конференции: "Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология", Киров, 2008 г.;

-на заседаниях секции "Ветеринарная биотехнология" Отделения ветеринарной медицины РАСХН, Щелково, 2007-2008 гг.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1 .Усовершенствованная технология получения высокоактивной антисыворотки к вирусу бешенства и применение ее при промышленном производстве диагностических антирабических ФИТЦ-коньюгатов и референс-антирабической сыворотки для иммуноферментной тест-системы определения антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных.

2. Результаты исследований по клонированию ДНК L. interrogans серовара pomona в плазмидном векторе и применению клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации.

3.Теоретическое и экспериментальное обоснование разработки «Иммуноферментная тест-система для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ инфекций» и определение ее эффективности.

Теоретический анализ, экспериментальные исследования и обобщение результатов, выполнены автором самостоятельно.

Автор выражает благодарность за участие в выполнении отдельных фрагментов диссертации сотрудникам ВНИТИБП: директору, академику РАСХН А .Я. Самуйленко, сотрудникам института В.И. Клюкиной, Д.П. Кузнецову, С.В. Кузнецовой, В.И. Белоусову, И.И. Кочиш, Т.Ю. Кочиш, С.Ю. Филиппову, В.А. Лукиной, Н.Н. Быковой, С.К. Артюшину (ВИЭВ).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Матвеева, Ирина Николаевна

5. ВЫВОДЫ

2. Создана клонотека рекомбинантных плазмид, содержащих 67 фрагментов бактериального генома'лептоспир штамма ВГНКИ-6 Leptospira серогруппы Pomona. Получен банк 42 препаратов ДНК лептоспир референтных штаммов, 6-производственных, 7 штаммов серогруппы

Pomona, изолированных от больных сельскохозяйственных животных и человека в различных регионах РФ.

4. Установлено в хромосомных ДНК сероваров tarassovi, sejroe, pomona, kabura, polonica, whitcombi, grippotyphosa, panama, castellonis, sarmin, szwajizak, bratislava, djatzi, louisiana, cynopteri присутствие области, гомологичной фрагменту ДНК L. pomona в составе рекомбинантной плазмиды pLp 41. Показано, что ДНК-зонд pLp 41 позволяет выявлять образцы ДНК штаммов лептоспир основных серогрупп Pomona, Tarassovi, Sejroe, Grippotyphosa.

6. Определены молекулярно-генетические характеристики указанного фрагмента, обеспечивающие его идентификацию. При этом установлено, что клонированный фрагмент ДНК имеет размер 1 200 пар нуклеотидов, ограниченный сайтами рестриктазы EcoR I, а также не содержит сайты следующих рестриктаз: Pst I, Sma I, Xba I и EcoR V. Плазмида содержит ген Ыа, детерминирующий синтез бетта-лактомазы, что обеспечивает устойчивость к ампициллину штамма Е. coli, несущего данную плазмиду. Плазмида мультикопийна и неконъюгативна.

7. Выявлено 8 структурных белков с мол. массой от 14 до 180 кД вируса ПГ-3 КРС, штамма "ЗКСМ", полученных обработкой вируссодержащей суспензии тритоном Х-100, и индуцирующих выработку специфических к вирусу ПГ-3 антител в организме восприимчивых животных.

8. Выделены и охарактеризованы 9 структурных белков с мол. массой от 28 до 180 кД PC-вируса штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК., 6 из которых с мол. массой от 42 до 180 кД индуцируют выработку специфических к вирусу PCB антител в организме восприимчивых животных.

9. Разработан одноэтапный метод аффинной очистки специфических антител из антисывороток и антигенов PC-вируса и ПГ-3 из вируссодержащих суспензий на анти-РС IgG BrCN-Сефарозе 4В и анти-ПГ-3 IgG BrCN-Сефарозе 4В при промышленном производстве компонентов тест-системы ИФА.

10. Определены оптимальные условия промышленного культивирования и инактивации штамма Staphylococcus aureus, получения хроматографически чистого и биологически активного протеина А для конструирования иммуносорбентов.

11. Разработана комплексная иммуноферментная тест-система для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC, АВ и оптимизированы условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота в разведении 1:50. Установлен коэффициент связывания (Ксв.) равный 20%, позволяющий дифференцировать положительные и отрицательные сыворотки в ИФА.

12. Чувствительность разработанной тест-системы по отношению к РН, РИГА составила 98,46%, специфичность- 94,02%, совпадаемость результатов-96,8%, коэффициент корреляции - 0,9 при Р<0,05. При исследовании молозива иммунных коров совпадаемость результатов ИФА и РИГА составила 92,16%, при г = 0,82, Р< 0,05. Показана эффективность комплексной иммуноферментной тест-системы в качестве скринирующего экспресс-метода при массовом серологическом обследовании крупного рогатого скота.

6. Практические предложения.

На основании проведенных исследований предлагаются для практики:

2. Разработаны:

Инструкция по изготовлению и контролю компонентов для диагностики бешенства животных в РДП", утверждена 21.02.2006г. директором ВНИТИБП.

Инструкция по изготовлению и контролю глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных", утверждена 02.10.2007г. директором ВНИТИБП.

Методические рекомендации по идентификации производственных штаммов и дифференциации Leptospira interrogans от Leptospira biflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации", утверждены директором ВНИТИБП от 17.09.93, протокол N2;

Методические рекомендации по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (PC), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА)", рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №1, утвержденные 18.03.2007 г. академиком РАСХН A.M. Смирновым.

Методические рекомендации по определению уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)", рассмотренные и одобренные 21. 04.2008г. на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №5.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Матвеева, Ирина Николаевна, Щелково

1. Аберкромби Д., Алленмарк С., Дин П., Джонсон У. Аффинная хроматография.- М., Мир.-1988.-288С.

2. Авилов B.C., Салажов Е.Л., Лебедев А.И. Условия получения диагностических сывороток к вирусам инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и диареи крупного рогатого скота //Бюл. ВИЭВ. 1979. Т. 36. -С. 6-9.

3. Авилов B.C., Мникова Л.А., Сологуб В.К., Коромыслов Г.Ф., Дзантиев Б.Б., Сорокина Н.В., Егоров A.M. Иммуноферментный анализ // Ветеринария,- 1981. №8.- С.33-35.

4. Адамушкин В.Е., Светлышев С.Д., Петрова И.А. // Методы очистки и концентрирования вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота// Проблемы вирусол., молекул, биологии и гистологии с/х жив., Сб. научн.тр., М., МВА,1983,18-20.

5. Акатов А.К. Белок А золотистого стафилококка // ЖМЭИ.-1977.-№5.-С.5-10.

6. Амиров А.Х. Иммуноферментный анализ в диагностике вирусной диареи крупного рогатого скота: Автореф. дис. . канд. вет. наук. Смоленск, 2004. -20 С.

7. Амирбеков М, Юров К.П., Караваев Ю.Д., Степанова С.Н., Махмадшоев А. Опыт профилактики парагриппа-3 и хламидиоза ягнят. // Ветеринария.- 1992.№1. -С.34-36.

8. Артюшин С.К. Изучение генетического родства лептоспир: Автореф. Дис.канд. биол. наук.-М. 1990.-15 с.

9. Астаханова Л.Н., Брайнингер М.Г. Методы получения стандартных диагностических сывороток к респираторно-синцитиальному вирусу // Лаб. дело.-1975.-№12.- С.730-732.

10. Астаханова Л.Н., Брайнингер М.Г. О методах иммунизации пригодных для серийного приготовления диагностических сывороток к РС-вирусу. //Вопр. Этиологии, эпидемиологии, патогенеза и диагностики вирусных заболеваний: Сб./Свердловск, 1976. С.3-9.

11. Атамась В. А., Лаврова И.Г. // Изучение хламидиоза и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.// Современные аспекты профилактики инфекц. болезней молодняка с 32-34.

12. Афонюшкин В.Н. Разработка и применение ДНК-зонда для выявления геномной РНК вируса вирусной диареи крупного рогатого скота: Автореф. дис. . канд. биол. наук. 2002.-20 с.

13. Афонюшкин В.Н., Юрик С.А., Семенихин В.И. Исследование клинически здоровых животных, серопозитивных к вирусу ВД-БС //Ветеринария. 2004. №1.- С. 12-13.

14. Ашмарин И.П., Воробьев В.В.// Статистические методы в микробиологических исследованиях, 1962, Медгиз, Л.

15. Баженов К.С. Распространение вирусов парагриппа-3 и респираторно-синцитиальной инфекции среди телят на откорме в осенне-зимний период. //Бюлл. ВИЭВ. -1983.- Вып.50.- С. 6-8.

16. Бейли Дж. Методы химии белков М., Мир.-1965.-284 с.

17. Бейлли Н. Статистические методы в вирусологии. // М.: Медицина.-1962-С.29-31.

18. Белова Н.Б. Оценка эффективности ассоциированной вакцины против рота-корона-ВД-БС вирусов крупного рогатого скота// Ветеринария.-2005.-№4.-С. 18-20.

19. Бектемиров Т.А. Лонская Н.И., КастрикинаЛ.Н., Агафонова Л.В., Бардина Е.Е.Состояние и перспективы специфической профилактики гриппа и других ОРЗ // Вопросы вирусологии. 1987. №-4.- 393с.

20. Белоусова Р.В., Ларионова Н.И. Белоусова Р.В., Литвинов О.Б., Колесникова Л.М., Резова Т.Н. Березин В.Э., Зайдес В.М., Исаева Е.С. и др. Иммуногенные свойства отдельных гликопротеинов парамиксо-вируса.// Вопросы вирусологии.-1985. №2.- С. 166-174.

21. Белоусова Р.В., Третьякова И.В., Лобова Т.П., Исакова В.Р. Иммуноферментная диагностика аденовирусной инфекции крупного рогатого скота // Вестник сельскохозяйственной науки. 1990,№3(402).-С.135-138.

22. Белоусова Р.В., Третьякова И.В., Лобова Т.П., Исакова В.Р. Иммуноферментный метод диагностики аденовирусной инфекции КРС // Достижения науки и техники АПК.- 1990.№1.- С. 25-27.

23. Березин В.Э., Воркунова Г.К., Мацеевич Г.Р., Зайдес В.М., // Применение метода иммунного («вестерн») блотинга для изучения вирусных антигенов и выявления антител к вирусным белкам.// Вопросы вирусологии.-1987. №3.- С.317-323.

24. Биология вирусов животных:Учебник /Отв. редактор В.И. Агола, Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Мисис С., Сэмбрук Дж.,Уайт Д. -М.: Мир, 1977.-Т.1 и 2. -621с.

25. Биотехнология: Учебник /Отв. редактор Воронин Е.С. Санкт-Перербург: ГИОРД, 2005.-792с.

26. Бобкова А.Ф., Чирков С.Н.// Применение иммуноферментного анализа для диагностики вирусных заболеваний растений (Обзор)// С/х биологи. 1983.№5.- С.32-36.

27. БогаровА.Ф.// Вирусы группы герпеса.-М.-1979.

28. Бойко A.A., Хорьков И.А. Перспективы использования антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, в ветеринарии и животноводстве //Вест. с.-х. науки. 1987. - № 9. - С. 96-100.

29. Бойко A.A., Хорьков И.А. Перспективы использования антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, в ветеринарии и животноводстве //Вест. с.-х. науки. 1987. - № 9. - С. 96-100.

30. Борисович Ю.Ф., Кириллов Л.В. Инфекционные болезни животных: Справочник; Под ред. Д.Ф. Осидзе.-М.: Агропромиздат, 1987.-С.77-78.

31. Боронкова Н.М. Сравнительное изучение методов идентификации риновирусов и диагностики вирусных инфекций: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М.: 1972.- С.23.

32. Бостанджиева Р., Текерлеков М., Хараламбиев Х.Е. Доказване на респираторно-синцитиальната вирусна инфекция по телятата через реакция за свырзване на комплемента. //Вет. Мед. Науки.- София. 1984. -XXI.- № 9. С.45-50.

33. Бостанджиева Р., Митов Б., Хараламбиев Х.Е. Иммунофлуоресцентное доказательство респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у телят. //Вет. Мед. Науки. София, 1985. -XXII. -№ 9. С.20-26.

34. Бостанджиева Р. Чувствительност на клетъчните культури към говяждия респираторно-синцитиален вирус. //Вет. Мед. Науки. София, 1986. -XXII. -№ 2. С. 12-18

35. Бостанджиева Р. Культивирование и диагностика респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота: Автореф. дис. . канд. биол. наук. София, 1987.- 27с.

36. Бреслер С.Е. Физико-химическое обоснование принципа получения вирусных вакцин с помощью адсорбционной хроматографии //Труды института им. Пастера, J1. 1976. - Т. 47. - С. 13-19.

37. Бродянский Ю.М. Реакция связывания комплемента. // В кн.: Иммунологическая диагностика вирусных инфекций (под ред. Перадзе Т.В., Халонена П.) М.: Медицина - 1985 - С.77-97.

38. Бусыгин К.Ф. Флуоресцирующий антирабический глобулин из сыворотки крови баранов// Болезни животных.-1986.-С.89-91.

39. Букринская А.Г. Вирусология. М.: Медицина, 1986. -336 с.,271-274с.

40. Букринская А.Г., Зайдес В.М. Молекулярная вирусология парамиксовирусов. М.: Медицина, 1978. - 184 с.

41. Бурцева И.А. Идентификация вирусов по гемагглютинирующим свойствам. // Сельское хозяйство Республики Саха (Якутия), Новосибирск. 1993 (1994)-С.136-138.

42. Бусол В.А., Чечеткина Н.П., Стеценко В.И., Нестерова Л.И. Ретроспективный анализ инфекционного ринотрахеита пустулезного вульвовагинита (баланопостита) крупного рогатого скота на Украине //

43. Материалы Междунар. науч. Конф. «Общ. Эпизоотология : иммунол.,экол. и методол. пробл.».-Харьков, 1995.- С. 480-484.

44. Бучнев К.Н., Квасов И. Д., Турсункулов Ш.Ж. Вируснейтрализующая и преципитирующая активность сывороток крови лошадей, привитых рабическими вирус-антигенами//Вестник с/х науки Казахстана.- 1985. №2.-С.72-75.

45. Бюллетень ВОЗ. Руководство по стандартизации диагностических препаратов, 2000г. 227 с.

46. Быкова H.H. Разработка иммуноферментного анализа для индикации антигенов вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота и антител к нему: Дис. . к.б. н. Щелково, 1989.- 148 с.

47. Быкова H.H., Лукина В.А., БойкоА.А. // Сравнительная оценка иммуноглобулинов, меченых пероксидазой (иммуноферментных конъюгатов).// Передовой науч.-производст. Опыт в биологической промышленности.-1985.-№9.- С.8-11.

48. Василиади А.Г., Сергеева И.В.,Хаустов В.И.// Возможность индикации вакцинного штамма в носовых смывах телят методом точечной молекулярной гибридизации // Актуал. вопр. инфекц. и инваз. болезней животных.-М,- 1993.- С.75-77.

49. Васильев A.B., Непоклонова И.В. Иммуноферментный метод в диагностике вирусных инфекций // Ветеринария. 1982.№ 8. - С. 63-65.

50. Васильев A.B., Осидзе Н.Г., Сюрин В.Н. РИГА в серодиагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота // Ветеринария. 1988.№10. - С.32-34.

51. Васильев A.B., Музычин С.И. Акбаева Л.М., СтрогановаИ.Я., БариноваЛ.И. Получение специфической сыворотки к вирусу инфекционного ринотрахеита на телятах.// Проблемы вирусологии, молекул. Биологии и гистол. с/х животных.-1983.- 11-12.

52. Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизованные ферменты / Под ред. И.В.Березина и К.Мартенека. М. МГУ, 1982. -384 с.

53. Вирусология: Учебник / Под. ред. Б. Филдса, Д. Найпа. М.: Мир, 1989. —Т.2. С.41-42.,473-480.

54. Вишняков И.Ф., Цыбанова Л.Я. // Ветеринария. 1983. № 9. - 68С.

55. Влияние простетической группы пероксидазы из хрена на стабильность фермента /И.В.Березин, Н.Н.Угарова, Б.М.Керпюнголъц, Л.Ю.Бровко //Биохимия. 1975. - Т. 40, вып. 2. - С. 297-301.

56. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. -М.: Медицина, 1971.201-205.

Информация о работе

Матвеева, Ирина Николаевна
доктора биологических наук
Щелково, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы