Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гидрозольные препараты - бесприборные иммунохимические экспресс-диагностикумы

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Гидрозольные препараты - бесприборные иммунохимические экспресс-диагностикумы"

Куклина Светлана Анатольевна

ГИДРОЗОЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ - БЕСПРИБОРНЫЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ЭКСПРЕСС - ДИАГНОСТИКУМЫ.

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 7 И АР 2011

Москва - 2011

4840823

Работа выполнена на кафедре общей химии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Кировской государственной медицинской академии Министерства Здравоохранения и Социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор технических наук, Мешандин Алексей Гаврилович

профессор

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, Птичкина Наталья Михайловна

профессор

кандидат химических наук, Сорокоумова Галина Моисеевна

доцент

Ведущая организация: государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Удмуртский государственный университет, г. Ижевск

Защита состоится "лУ" 1011 г. в /^"^часов на

заседании

Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте МИТХТ им. М.В. Ломоносова www.mitht.ru

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат химических наук // Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Иммунохимические методы позволяют объективно и адекватно судить о правильности терапевтических либо иных методов лечения. В настоящее время существует более 200 различных диагностических методов и их модификаций, основанных на реакции антиген-антитело (Орлова О.Ю., 2005). К наиболее часто применяемым могут быть отнесены методы иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА). Для этих методов характерны высокая чувствительность и точность результатов, возможность их автоматизации. Вместе с тем, они отличаются значительной дороговизной, неэкспрессностью, использованием специальных и дорогих приборов, специальными условиями хранения

иммунохимических диагностикумов.

Всё вышесказанное делает методы иммуноферментного анализа (ИФА) и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), радиоиммунного анализа (РИА) пригодными, прежде всего как верифицирующие тесты, но не как скриннинговые. Для скриннинговых анализов необходимы препараты для экспресс - диагностики, которые должны иметь низкую себестоимость, стабильные и воспроизводимые иммунохимические свойства, время постановка реакции и считывания результатов не более 10 минут, не требовать использования дополнительных приборов. Кроме того, экспресс-диагностика должна давать возможность ставить реакции с малыми объемами препарата и биоматериала, взятого от пациента (10-20 мкл) (Мешандин А.Г.,1997).

В последнее время предложено решение данной задачи - использование в качестве диагностических препаратов гидрозолей. Гидрозольные препараты представляют собой водные коллоидные растворы ультрадисперсных частиц, на поверхности которых адсорбированы биоспецифические компоненты, в частности, антигены, либо комплементарные им антитела к различным нозологиям. Имеются данные о гидрозольных препаратах на основе неорганических объектов - это золь гексацианоферрата (II) железа (III), так называемая «берлинская лазурь» в качестве твёрдой фазы, предназначенного для определения туберкулёзных антител в сыворотке крови больных в постановке на стекле (Орлова О.Ю., 2005). Данные препараты могут служить основой для разработки большого количества бесприборных диагностических систем и могут использоваться там, где требуется выявить феномен взаимодействия антигена с антителом.

Однако ряд вопросов, связанных с оптимизацией свойств коллоидного раствора «берлинской лазури» таких, как содержание и тип модификатора, pH разводящего

раствора, величина ионной силы разводящего раствора, оптимальный способ постановки и визуализации реакции гидрозольной агглютинации, остаются до конца нерешенным. Так же возникают вопросы о возможности синтеза гидрозольных препаратов на основе других объектов: коллоидных растворов ультрадисперсных алмазов (УДА) детонационного синтеза (Долматов В.Ю., 2003), коллоидных растворов парафина, изучение их свойств.

Данная работа направлена на создание технологии получения устойчивых гидрозольных диагностических препаратов, основанных на реакции антиген-антитело, с последующей объективной визуализацией.

Техника постановки реакции гидрозольной агглютинации почти полностью совпадает с техникой постановки реакции пассивной гемагглютинации. В связи с этим стоимость анализов будет различаться лишь по стоимости применяемых диагностикумов. Так стоимость эритроцитарного диагностикума, необходимого для постановки одного анализа в реакциях пассивной гемагглютинации (РПГА), составляет 20 рублей, стоимость одного анализа методом иммуноферментного анализа (ИФА) - 30 рублей, тогда как стоимость гидрозольного диагностикума - 5 рублей. Время постановки реакции гидрозольной агглютинации составляет 5-10 минут, тогда как время проведения одного анализа от 3 часов (иммуноферментный анализ) до 1 суток (полимеразная цепная реакция)

Таким образом, основным предметом нашего исследования стали разработка и создание экспрессных иммунохимических коллоидных препаратов на основе ультрадисперсных частиц неорганической и органической природы.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре общей химии Кировской государственной медицинской академии Министерства Здравоохранения и Социального развития Российской Федерации.

Цель работы

1. Изучение особенностей синтеза и состава гидрозольных диагностикумов на основе ультрадисперсных частиц неорганической и органической природы, на поверхность которых сорбированы специфические белки - антигены - маркеры определенных заболеваний.

2. Получение и апробация диагностических препаратов на выявление маркеров таких заболеваний, как туберкулез, сифилис, птичий грипп.

Задачи исследования

1. Выбор типа твердофазного носителя для реакции гидрозольной агглютинации.

2. Установление типа и дозировки модификатора при хемосорбции биолиганда на коллоидные частицы гексацианоферрата (II) железа (III) («берлинской лазури»),

3. Выбор типа разводящего раствора с учетом pH и ионной силы при постановке реакции иммунохимической гидрозольной агглютинации.

4. Исследование объективного способа постановки и фиксации результатов иммуноанализа.

5. Получение и апробация диагностических препаратов на выявление маркеров таких заболеваний, как туберкулез, сифилис, птичий грипп.

Научная новизна работы

Впервые проведено комплексное исследование органического (парафин) и неорганического материала (ультрадисперсные алмазы) в качестве твердой фазы для последующего изготовления гидрозольных диагностических препаратов.

Установлено, что малодиссоциирующие соли d-переходных металлов являются лучшими модификаторами, обеспечивающими наиболее эффективное ковалентное связывание белка с неорганическим носителем - коллоидным раствором гексацианоферрата (II) железа (III) с целью создания стабильных конъюгатов с воспроизводимыми иммунохимическими свойствами.

Впервые оптимизирован состав разводящего раствора для реакции гидрозольной агглютинации для гидрозоля - гексацианоферрата (И) железа (III).

Впервые получены гидрозольные иммунохимические диагностикумы на выявление маркеров таких заболеваний, как сифилис и птичий грипп.

Научно-практическая значимость работы

Ранее на кафедре была разработана методика для получения гидрозольных препаратов на основе гексацианоферрата (II) железа (III), так называемой «берлинской лазури». Однако данные препараты имели недостаток: при попытках пассивной адсорбции биолиганда на гидрозоль гексацианоферрата (II) железа (III) не наблюдали адсорбции белка на поверхность твердой фазы. Это выражалось в том, что агглютинационный анализ не происходил во всем диапазоне разведений «+» и «-» сывороток с антителами, комплементарными определенным антигенам. Поэтому необходимо было осуществить комплекс работ по «пришивке» специфических антигенов - белков через определенный модификатор.

В ходе работы была установлена связь между дозировками химических модификаторов на поверхности ультрадисперсных частиц и свойствами получающихся

продуктов - иммунохимических гидрозолей, а также связь между рН и ионной силой разводящего раствора и агрегационной устойчивостью гидрозольных препаратов.

В данной работе были впервые исследованы другие носители (коллоидные растворы парафина и ультрадисперсных алмазов) в качестве твердой фазы для создания диагностических препаратов, производящих адсорбцию биолиганда без применения модификатора.

В ходе работы получены и в последующем апробированы в клинических условиях гидрозольные диагностикумы, предназначенные для выявления маркеров таких заболеваний, как туберкулез, сифилис, птичий грипп. Получены акты испытаний данных диагностикумов в организациях: НИИ гриппа РАМН (г. Санкт - Петербург), клинической лаборатории ФГУ ЛИУ- 12 УФСИН России по Кировской обл., ОАО НПП «АВИВАК» (г. Санкт - Петербург).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гидрозольные препараты могут быть получены не только на основе неорганических коллоидных растворов, но и коллоидных растворов ультрадисперсных алмазов (УДА), а также на основе органических веществ - коллоидного раствора парафина.

2. Для адсорбции биолигандов на поверхность золя гексацианоферрата (II) железа (III) необходим химический модификатор, оптимальными следует признать катионы тяжелых металлов: líg2 \ РЬ2+ в виде малодиссоциирующих солей в водном растворе.

3. Разводящим раствором, обеспечивающим высокое значение константы аффинитета и авидности реагирующих между собой антигена и антитела следует признать 1% КС1; 0,9 - 1% КС1 в растворе фосфатного буфера.

Апробация работы

Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно - практических конференциях: VI Московском международном салоне инноваций (Москва, 2006); II специализированной выставке «Наука. Инвестиции. Производство. Вятский левша» (Киров,2006); IV Всероссийской конференции «Бизнес - ангелов и инноваторов» (Саранск, 2006); IV Республиканской научно-практической конференции «Перспективные направления и новые технологии в здравоохранении» (Йошкар - Ола, 2006); Всероссийской научно - практической конференции с международным участием «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» (Ростов-на-Дону, 2006) - Диплом V степени; VII Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2007) - Приз

Международной федерации изобретательских организаций и Золотая медаль Министерства образования и науки РФ; Международной конференции «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (Киров, 2007); II Международной конференции «Международное сотрудничество и развитие биотехнологий в Кировской области» (Киров, 2008); VIII Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2008) - серебряная медаль Министерства образования и науки РФ; работа доложена на расширенном заседании кафедры общей химии Кировской ГМА.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из которых 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, трёх глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение исследований), выводов, списка литературы (102 источников) и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Работа изложена на 109 страницах, содержит 13 рисунков, 14 таблиц, 13 диаграмм. Список литературы включает 102 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили гидрозольные препараты. В качестве объектов для гидрозолей использовали:

1. раствор гексацианоферрата (И) железа (III), представляет собой гидрозоль с отрицательно заряженными гранулами, если потенциалобразующие ионы - [Fe(CN)6]4";

2. раствор ультрадисперсных алмазов (УДА), СКТБ «Технолог» (г. С.Петербург), представляет собой дисперсию ультрадисперсных алмазов в воде;

3. раствор парафина, синтезированный проф. Мешандиным А.Г. - дисперсия парафина в воде, полученная методом замены растворителя.

В качестве специфических биолигандов использовали:

1) комплексный туберкулезный антиген - диагностикум ППД производства С-Петербургского НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова. В состав комплексного антигена Ю.Я. Кассича входит полисахаридный комплекс, метиленовый экстракт туберкулезных микобактерий и водный экстракт легочной ткани здорового крупного рогатого скота.

2) генно-инженерный антиген №17 (Военно-медицинская академия г. Санкт -Петербург). В состав входит белок, полученный из генно-инженерных модификаций плазмидами Treponema Pallidium штамма G. Coli.

3) антигены вирусов гриппа, в том числе H5N1 (вируса птичьего гриппа), производства НИИ гриппа РАМН г. С.- Петербурга.

В качестве биологического материала - сыворотки от лиц с верифицированным диагнозом «туберкулез» и сыворотки от доноров, сыворотки от лиц с диагнозом «сифилис» и здоровых доноров, сыворотки от объектов, больных «птичьим гриппом» и здоровых доноров. С последними объектами осуществляли работу в НИИ гриппа РАМН.

В работе использовали стандартные методы химического анализа: рН - метрия; агглютинационный анализ и статистические методы обработки результатов (для выявления вида зависимости титра от концентрации применялся регрессионный анализ; при помощи метода распределения х2 (хи-квадрат) определили теоретическую частоту положительных результатов эксперимента при равномерном распределении).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Выбор типа твердофазного носителя для реакции гидрозольной агглютинации.

В ходе данного исследования были оптимизированы свойства гидрозольных препаратов на основе ультрадисперсных частиц органической и неорганической природы для проведения реакции гидрозольной агглютинации.

Согласно литературным источникам носители для иммунохимических тестов должны соответствовать определенным требованиям:

■ контрастируемая окраска;

■ большая адсорбционная способность;

■ доступность;

■ большая удельная поверхность;

■ нанометрические размеры;

■ способность образовывать устойчивые коньюгаты с белками - биолигандами;

■ время постановки реакции агглютинации должно быть наиболее минимальным.

Исходя из требований, предъявляемых к носителям для иммунохимических тестов, определяли, какая твердая фаза является лучшей в реакции гидрозольной агглютинации.

Для исследования были взяты коллоидные растворы гексацианоферрата (II) железа (III), ультрадисперсных алмазов (УДА), парафина. Они отличались друг от друга размером частиц, плотностью, удельной поверхностью и различной окраской. Изучаемые нами носители представлены в таблице 1.

Табл. 1. Твердофазные носители в качестве основы для гидрозольных диагностикумов.

Тип носителя, формула Размеры частиц, нм Агрегатив -ная устойчи -вость Время постановки Предельный титр Цвет

«Берлинская лазурь», Ре4[Ре(Оад3 80 - 200 устойчив 3-5 мин. 1:320 Синий

Ультрадисперсные алмазы (УДА), Сх 4- 10 неустойчив 10 - 12 час. 1:64 Серый

Парафин, СНз - (СНг)х - СНз 200-600 устойчив 25 - 30 мин. 1:80 Бесцветный

Для выбора оптимального соотношения биолиганда и гидрозолей ультрадисперсных алмазов, парафина, «берлинской лазури» брали 50, 100, 150 мкл антигена. Далее производилась адсорбция биолиганда на твердой фазе данных носителей. Постановка реакции гидрозольной агглютинации производилась на U - образном планшете. Раститровывалась сыворотка «+» и «-» в соотношение 1:20, 1:40, 1:64, 1:80, 1:160, 1:320 разводящим раствором. В работе использовали в качестве антигена - комплексный туберкулезный антиген ППД, в качестве биологического материала - сыворотки от лиц с верифицированным диагнозом «туберкулез» и здоровых доноров. Экспериментальные данные представлены на рисунках 1 и 2.

&

з

3

50 мш ](Х)мю1 150 мил Сося11жиаЕШ1гиге1никхБк»СТ13шрас1всра

Ш УДА Ш парафин

Рис. 1. Зависимость обратного титра от соотношения биолиганда и коллоидных растворов УДА и парафина

£ 2«

1 200 | 160

8 1^0

80 «

10 злея 50мю1 100 мы! Соотиошите аиштга и кптювдного расгнора

шШ «берлинская лазурь» Рис. 2. Зависимость обратного титра от соотношения биолиганда и коллоидного раствора «берлинской лазури»

Исходя из анализа экспериментальных данных, представленных в таблице 1 и рисунках 1 и 2, и требований, предъявляемых к носителям иммунохимических тестов, нами было сделано ряд выводов:

1. Ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза могут использоваться в реакциях типа пассивной гемагглютинации без модификатора, однако по скорости прохождения реакции они уступают коллоидному раствору гексацианоферрата (II) железа (III).

2. Коллоидный раствор парафина возможен к рассмотрению в последующем в качестве твердофазного носителя, так как соответствует требованиям и может применяться без модификатора. Но при этом уступает коллоидному раствору гексацианоферрата (II) железа (III) по следующим характеристикам: незначительно по скорости проведения реакции гидрозольной агглютинации, по окраске твердой фазы (парафин бесцветный). Окраска носителя необходима для визуализации результатов агглютинации.

3. По совокупности требований, предъявляемых экспрессным, бесприборным иммунохимическим диагностикумам был сделан выбор в пользу гидрозоля гексацианоферрата (II) железа (III). Приблизительная схема строения мицеллы гексацианоферрата (И) железа (III):

при избытке K4[Fe(CN)6] {m[Fe4[Fe(CN)6]3]n[Fe(CN)6]4"4(n -х)К+}4х"4хК+ zH20

Так как мицелла имеет отрицательный заряд, то невозможно было осуществить адсорбцию белка на поверхность твердой фазы. Это выражалось в том, что агглютинационный анализ не происходил во всем диапазоне разведений «+» и «-» сывороток с антителами, комплементарными определенным антигенам. Поэтому необходимо было осуществить адсорбцию биолиганда и твердой фазы через определенный модификатор, т.е. вещество, обеспечивающее заданные свойства гидрозолей.

II. Выбор типа и дозировки модификатора при хемосорбции биолиганда на основе гексацианоферрата (II) железа (III).

Так как для гидрозоля гексацианоферрата (II) железа (III) необходим модификатор для связывания твердой фазы и биолиганда в устойчивый конъюгат, то следующим этапом исследований было выявление типа и природы модификатора. Модификатор обеспечивал бы наиболее эффективное ковалентное связывание белка с неорганическим

носителем - коллоидным раствором гексацианоферрата (II) железа (III) с целью создания стабильных конъюгатов с воспроизводимыми иммунохимическими свойствами.

Растворы модификаторов для иммунохимической реакции должны соответствовать определенным требованиям:

• растворимые в воде;

• не подвергаться гидролизу;

• маленькое значение произведения растворимости соединений с атомом серы;

• возможность вступать в реакции нуклеофильного замещения или присоединения;

• доступность;

• образовывать с биолигандом и твердой фазой устойчивые конъюгаты.

В результате реакции нуклеофильного замещения молекул модификатора происходит присоединение биолиганда (белка) по Nit-rpynne (преимущественно по лизину) и по SH- группе (по цистеину) с неорганической твёрдой фазой, то есть проявляется эффект «якоря». В качестве модификатора ранее использовали раствор хлорида свинца (II) РЬСЬ, который соответствовал большинства требованиям, но обеспечивал устойчивость диагностикума в течение суток. То есть данный диагностикум приемлем в использовании «ex tempore», но невозможен для длительного хранения препаратов. Для улучшения стабильности диагностического препарата на основе гексацианоферрата (И) железа (III) необходимы были новые модификаторы. В качестве модификаторов, осуществляющих хемосорбцию белка, использовали препараты с концентрацией 1 %, представленные в таблице 2.

Эксперименты проводили с коллоидным раствором гексацианоферрата (II) железа (III), с туберкулезным антигеном с сыворотками от лиц с верифицированным диагнозом «туберкулез» и от здоровых доноров. Реакцию гидрозольной агглютинации осуществляли в U - образном планшете. Во вспомогательном планшете осуществляли разведение «положительной» и «отрицательной» сывороток в разводящем растворе в титрах 1:10. Растворы модификаторов и раствора гексацианоферрата (II) железа (III) брали в соотношениях 1:10, 1: 100, 1:1000. Далее сыворотки помещали в полистирольный планшет, после чего вносили равные аликвоты гидрозольного препарата с различным соотношением модификатора.

Табл. 2. Модификаторы для гидрозоля гексацианоферрата (И) железа (III)

Наименование Константа диссоц - ИИ Формула Предположительный механизм действия

Хлорид ртути (П) 2,6* 10"15 HgCl2 Prot - SH + Hg2+ —*■ Prot-S-Hg-S-Prot

Нитрат ртути (И) Хорошо растворим Hg(N03)2 Prot - SH + Hg2' —> Prot-S-Hg-S-Prot

Сульфат меди Хорошо растворим CuS04 Prot - SH + Cu2+ * Prot-S-Cu-S-Prot

Ацетат меди (II) Хорошо растворим (СНзСОО) 2Cu Prot-SH +Cu2+—► Prot-S-Cu-S-Prot

Хлорид хрома (III) Хорошо растворим СгСЬ Prot-SH + Cr3t —> Prot-S-Cr+1-S-Prot

Нитрат серебра (I) Хорошо растворим AgN03 Prot-SH + Ag1+ —> Prot-S-Ag

Глугардиаль -дегид ----------- НОС- (СН2)з- СОН °xx , > H2N-Prot-COOH + /C-(CH2tC4 -T777*-H H 2 'P -HOOC-Prot-N=Ы CH2)- CN H 3 H

Хлорид свинца (И) 1,6* 10"5 РЬС12 Prot-SH +Pb2+ Prot-S-Pb-S-Prot

Нитрат свинца (И) Хорошо растворим Pb(N03)2 roProt - SH + Pb2*»- Prot - S - Pb - S -Prot

Данные модификаторы обеспечивали следующие иммунохимические свойства полученных гидрозолей:

« 120 г

Hgci2 (C2H,02)2Cu

Рис. 3. Сравнение гидрозольных диагностикумов для детекции антител к возбудителю туберкулез с различными модификаторами.

1. С растворами хлорида хрома (III) и нитрата серебра (I) получали гидрозоли, нормально дифференцирующие «+» и «-» сыворотки. Коэффициент детерминации близок к 1, составляет 0,94 для нитрата серебра (I) и 0,98 для хлорида хрома (III). Согласно шкале Чеддока это соответствует весьма высокой степени достоверности. Однако при хранении эти препараты теряли агрегативную устойчивость в течение суток. Следовательно, эти препараты приемлемы в использовании «ex tempore», но невозможны для длительного хранения препаратов (рис. 3,4).

2. С растворами хлорида свинца, хлорида ртути (II) получали гидрозоли, нормально дифференцирующие «+» и «-» сыворотки. Коэффициент детерминации близок к 1, составляет 0,94 для хлорида свинца и 0,99 для хлорида ртути (II). Согласно шкале Чеддока это соответствует весьма высокой степени достоверности (рис. 5,6).

3. С растворами нитрата ртути, нитрата свинца, сульфата меди и ацетата меди получали гидрозоли, которые дифференцировали «+» и «-» сыворотки, но быстро коагулировали, и их невозможно было использовать для реакции агглютинации. Согласно шкале Чеддока это означает, что на долю вариации факторных признаков приходится меньшая часть по сравнению с остальными неучтенными в модели факторами, влияющими на изменение результативного показателя. Построенные при таких условиях регрессионные модели имеют низкое практическое значение.

4. С раствором глутардиальдегида получали гидрозоль, которые дифференцировал «+» и «-» сыворотки. Однако устойчив коллоидный раствор с данным модификатором был в течение 48 часов.

Исходя из анализа экспериментальных данных, коллоидные растворы гексацианоферрата (II) железа (III), модифицированные катионом Hg2+ в виде хлорида ртути, либо РЬ2+ в виде хлорида свинца являются лучшим вариантом, проявляющим свойства гидрозольных препаратов. Причем эти соли в водном растворе являются малодиссоциирующими соединениями.

Используя в качестве модификаторов соли тяжёлых металлов, механизм хемосорбции может быть объяснён следующим образом: катионы тяжелого металла входят в состав мицеллы, не нарушая гидратной оболочки и диффузного слоя мицеллы. Соль тяжёлого металла должна быть малодиссоциирующей, чтобы не происходило гидролиза. Это можно представить в виде схемы:

отрицательно заряженная гранула положительно заряженная гранула

Далее определяли оптимальную концентрацию модификатора. Объектом оптимизации являлся наиболее эффективный модификатор - раствор хлорида ртути (II) №С12) с туберкулезным антигеном. Были взяты следующие концентрации модификатора - 1,0%; 1,25%; 1,33%; 1,5%; 2,0%, 2,5%. В последнем случае наблюдали необратимую спонтанную коагуляцию исходного гидрозоля. Данные представлены на рисунке 4.

1,00 1,25 1,33 1,50 2,00 К опцентрация модиф икатора, %

Рис. 4. Зависимость влияния концентрации модификатора HgCb на иммунохимическую активность гидрозольного препарата для детекции антител к возбудителю туберкулез.

Из рисунка видно, что с ростом концентрации увеличивается обратный титр, но выше концентрации 2,0% происходило резкое ухудшение иммунохимических свойств препарата. Это можно объяснить денатурирующим действием на белок избытка ионов Hg2t, не связанных с поверхностью в мономолекулярный слой.

Наибольшая частота положительных результатов эксперимента получена при концентрации модификатора 2,00% и при обратном титре 1:320. III. Выбор разводящего раствора для реакции гидрозольной агглютинации.

Для раститровки сывороток использовали разводящий раствор. При постановке реакции агглютинации исключительно важно обеспечить высокое значение константы аффинитета и авидности реагирующих между собой антигена и антитела. В свою очередь аффинитет и авидность напрямую зависят от типа фазы, в которой происходит иммунохимическая реакция, то есть разводящего раствора. Следовательно, задача оптимизации разводящего раствора - определение его природы, значения pH, величины ионной силы, является необходимым элементом в создании иммунохимического препарата. Поэтому для улучшения иммунохимических свойств диагностикумов был осуществлен выбор и оптимизация состава разводящего с учетом его pH и ионной силы.

Для оценки эффективности была проведена реакция гидрозольной агглютинации на основе гидрозоля гексацианоферрата (II) железа (III) с модификатором HgCl2, генно-инженерным антигеном №17 и сывороток от лиц с диагнозом «сифилис» и здоровых доноров, туберкулезным антигеном - диагностикум ППД и сывороток от лиц с диагнозом «туберкулез» и здоровых доноров. Были опробованы разводящие растворы в количестве 4

объектов, влияющими на иммунохимические свойства диагностикумов. Были взяты растворы №С1 и КС1 с целью выяснения влияния ионной силы на свойства диагностикумов. С целью выяснения влияния значения рН использовали фосфатный буферный раствор (табл. 3).

Табл. 3. Разводящие растворы для иммунохимической реакции гидрозольной

агглютинации.

№ Тип раствора Добавка Иммунохимические качества Примечание

1 NaCl, раствор не показал четкой дифференцировки «+» и «-» сывороток коагуляция гидрозолей в системах с туберкулезным и сифилисным антигеном

2 NaCl, раствор Фосфатный буфер не показал четкой дифференцировки «+» и «-» сывороток происходила коагуляция гидрозолей в выше указанных системах

3 KCl, раствор обеспечивал дифференцировку «+» и «-» сывороток в системе с туберкулезным антигеном

__

4 KCl, раствор Фосфатный буфер обеспечивал наилучшую дифференцировку «+» и «-» сывороток в системе с туберкулезным антигеном

1. Раствор KCl без добавок обеспечивал дифференцировку «+» и «-» сывороток.

2. Раствор №С1 без добавок не показал четкой дифференцировки «+» и «-» сывороток (происходила коагуляция всех растворов) во всех вышеуказанных системах.

3. Раствор КС1 с добавлением 0,05 М фосфатного буферного раствора обеспечивал наилучшую дифференцировку «+» и «-» сывороток.

4. Раствор №С1 с добавлением 0,05 М фосфатного буферного раствора не показал четкой дифференцировки «+» и «-» сывороток (происходила коагуляция всех растворов) во всех вышеуказанных системах.

Было рассмотрено влияние ионной силы и К+ на иммунохимические свойства диагностикумов. Катион калия обладает слабо выраженными гидратационными свойствами и высокой проникающей способностью в водных системах, поэтому по результатам экспериментальных данных это во многом определяет специфику биологического действия катиона калия. При большем или меньшем значении ионной силы наблюдается тенденция к диссоциации иммунохимического комплекса и, следовательно, к уменьшению чувствительности и специфичности иммунохимического анализа. Добавление фосфатного буферного раствора (раствор, содержащий буферную

систему из moho и дифосфатных анионов) соответствует физиологическому значению рН в плазме крови человека и теплокровных существ (рН = 7,36).

Величина концентрации разводящего раствора КС1 с добавлением фосфатного буфера была изучена на 5 экспериментальных точках: 0,5%; 0,9%; 1,0%; 1,2%; 1,3% (рис. 5 и 6).

к rt

S я

: л ха

и •

ОД) ÖS0 Щ) 1Д) 1Д) Кзиирици раявсрах'цшцат %

К й

и а

е

3D-

3 О"

° 2 § 5

Sí

а юо

U !

0,50 0,90 1,00 1Д) 1,30 Какдаршищрапн^ххрвдшия, %

Рис. 5. Зависимость обратного титра от концентрации хлорида калия для детекции антител к сифилису

Рис. 6. Зависимость обратного титра от концентрации хлорида калия для детекции антител к туберкулезу

Таким образом, наибольшая частота положительных результатов эксперимента получена при концентрации раствора хлорида калия 1,00% и при обратном титре 1:400 и 1:320. Эффективным вариантом разводящего раствора является раствор KCl, приготовленный на фосфатном буфере (фосфатно - солевой буфер) с концентрацией 0,9% и 1,0%, что наглядно отображено на рисунках 5 и 6. При введении фосфатного буфера в качестве компонента разводящего раствора отмечается существенное увеличение чувствительности иммунохимической реакции, выраженное в увеличении обратного титра положительных сывороток. Данная тенденция однозначно прослеживается как на выявлении антител к Treponema Pallidum, так и антител к М. Tuberculosis. Данные результаты позволяют говорить о фосфатно - солевом буфере как об эффективном разводящем растворе иммунохимических реакций гидрозольной агглютинации. При этом необходимо отметить, что отрицательные сыворотки, изучаемые в настоящей работе, по обеим нозологиям не проявляли каких-либо тенденций агглютинации с изучаемыми гидрозольными препаратами.

IV. Выбор носителя для визуализации результатов реакции гидрозольной агглютинации.

Регистрацию результатов осуществляли на пористых носителях: хроматографических колонках и фильтровальной бумаге, а также на стеклянной пластине.

Оценка результатов реакции агглютинации на основе гидрозоля гексацианоферрата (II) железа (III) с модификатором HgCb, туберкулезным антигеном и сывороток от лиц с диагнозом «туберкулез» и здоровых доноров.

Постановка реакции гидрозольной агглютинации на стекле предусматривает внесение образцов раститрованной сыворотки и гидрозоля на стекло и размазывание препарата тонким слоем. За счёт естественного испарения происходит концентрирование раствора, что неизбежно приводит к потере коллоидным раствором агрегативной устойчивости. При этом в «положительных» и «отрицательных» реакциях характер этой потери будет различным - внешний вид реакций в "плюсе"- точка в центре капли, в "минусе"- равномерное распределение раствора, как показано на рисунке 7.

А Б

Рис. 7. Реакция гидрозольной агглютинации на стекле: А - положительная сыворотка, Б - отрицательная сыворотка

Постановка реакции гидрозольной агглютинации в планшете предусматривает внесение образцов раститрованной сыворотки и гидрозоля в ячейки. Причем в лунках с «-» сывороткой не происходит агглютинации, а в лунках с «+» сывороткой наблюдается осадок - крупные агломераты. Данные представлены на рисунке 8.

* .» » «

А Б

Рис. 8. Реакция гидрозольной агглютинации в планшете: А - отрицательная сыворотка, Б - положительная сыворотка

Интерпретация на пористых носителях: при наличии достаточно высокого титра антител в сыворотке больного наблюдалась задержка в пропитывании гидрозолем порошка, заполняющего хроматографическую колонку, в виде короткого столбика синего цвета. При отсутствии антител — гидрозоль впитывается, что дает длинный синий столбик — отрицательный результат, как показано на рисунке 9.

Рис. 9. Реакция гидрозольной агглютинации в хроматографической колонке: А -отрицательная сыворотка, Б - положительная сыворотка

Результаты на фильтровальной бумаге: при положительной реакции — плотный, компактный комплекс с четкой границей, диаметром 2 — 4 мм; отрицательная реакция — распределение частиц реагирующих веществ без четкой границы в виде пятна синего цвета, как показано на рисунке 10.

Рис. 10. Визуализация результатов на фильтровальной бумаге: А - отрицательная сыворотка, Б - положительная сыворотка

Таким образом, из представленных результатов можно сформулировать вывод - для постановки реакции наиболее удобен вариант реакции на стекле и в планшете. Наиболее оптимальный способ визуализации реакции гидрозольной агглютинации на фильтровальной бумаге. Именно визуализация результатов на фильтровальной бумаге показывает четкую дифференциацию «+» и «-» сывороток, а также дает возможность длительного хранения результатов.

Получив экспериментальные данные, нами было принято решение об апробации результатов данных исследований в клинических условиях: в лаборатории Биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН г. Санкт - Петербург; клинической лаборатории больницы ФГУ ЛИУ-12 УФСИН России по Кировской обл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ ГИДРОЗОЛЕЙ В КЛИНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ

На сегодняшний день гидрозольные препараты апробированы в диагностике самых разнообразных нозологий - сифилиса, туберкулеза, птичьего гриппа. Имеются положительные заключения организаций: НИИ гриппа РАМН (г. Санкт - Петербург), клинической лаборатории ФГУ ЛИУ- 12 УФСИН России по Кировской обл. Данные представлены в таблице 4.

Табл. 4. Результаты испытаний гидрозолей в клинических условиях.

Тип гидрозоля, модификатора Ре4[Ре(СМ)б]з ;(НёС12) Fe4[Fe(CN)6]3;(HgCl2)

Тип антигена Н5Ш (вирус птичьего гриппа) ПДД (туберкулезный антиген)

База испытаний НИИ гриппа РАМН Клиническая лаборатория больницы ФГУ ЛИУ - 12

Обратный титр 1:80- 1:640 1:50-1:2000

Количество пациентов п — 6 п= 20

Чувствительность 100% 87,5%

Специфичность 11 = 2 - 100% п= 10 -100%

Время постановки 1-5 мин 3-5 мин

Результаты опытов свидетельствуют об «узнавании» гидрозолем с антигеном М. Tuberculosis и H5N1 положительных сывороток в титрах 1:50-1:2000. Следовательно, по представленным данным мы вправе в первом приближении говорить о чувствительности метода, сопоставимой с ИФА, и о его достаточной специфичности. По результатам испытания можно говорить о 100% специфичности метода и 90% чувствительности.

ВЫВОДЫ

1.В работе изучены диагностические препараты на основе гидрозольных растворов гексацианоферрата (III) железа, ультрадисперсных алмазов, парафина. Ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза могут использоваться в реакциях типа пассивной гемагглютинации в качестве твердой фазы, однако по скорости прохождения реакции они уступают коллоидному раствору гексацианоферрата (II) железа (III). Коллоидный раствор парафина возможен к рассмотрению в последующем в качестве твердофазного носителя. Наиболее лучшим вариантом является диагностикум на основе коллоидного раствора гексацианоферрата (II) железа (III).

2. Исследован состав компонентов гидрозольных диагностикумов. Доказано: наиболее лучшим модификатором является катион Hg2* в виде малодиссоциирующей соли HgCl2 в водном растворе. Оптимальным вариантом концентрации модификатора при

проведении реакции гидрозольной агглютинации оказалась - 2,0% на 1 мл. гидрозоля, обеспечивающая четкую дифференциацию «+» и «-» сывороток.

3.Определен состав разводящего раствора - раствор KCl с добавлением фосфатного буфера, обеспечивающий наилучшую дифференцировку «+» и «-» сывороток. Оптимальным вариантом при проведении иммунохимического анализа оказались концентрации 0,9% и 1,0% фосфатно-солевого буфера.

4. Более объективный способ постановки реакции гидрозольной агглютинации на стеклянной пластине и в планшете. Лучший способ визуализации реакции гидрозольной агглютинации на фильтровальной бумаге. Именно визуализация результатов на фильтровальной бумаге показывает четкую дифференциацию «+» и «-» сывороток, а также дает возможность длительного хранения результатов.

5. Благодаря оптимизации свойств компонентов гидрозольного препарата появляются такие необходимые качества, как высокая (более 90%) специфичность, длительность сроков хранения готовых гидрозольных препаратов, простота считывания результатов, возможность проведения реакции с малыми объемами биоматериала (сыворотка крови, слюна и т.д.), собственно препарата требуется для единичного анализа 25-50 мкл, биоматериала - еще меньше - 1-5 мкл.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куклина С.А., Мешандин А.Г. Гидрозольные препараты для экспресс-диагностики биомаркеров // Вестник новых медицинских технологий (периодический теоретический и научно-практический журнал, рекомендованный ВАК). Тула. - 2007. -№2. -т.XIV.-с. 135- 136.

2. Куклина С.А., Мешандин А.Г., Мальщукова A.A. Гидрозольные препараты, изготовленные по принципам нанотехнологии в качестве экспрессных бесприборных тестов для бесприборной диагностики инфекционных и соматических патологий // Вестник Российской военно-медицинской академии (научно - практическое издание, рекомендованное ВАК). С.- Петербург. - 2008, Т.23, №3, с. 488-490.

3. Куклина С.А., Мешандин А.Г., Попова C.B. Применение метода гидрозольной агглютинации в диагностике туберкулёзной инфекции // Российский Биомедицинский журнал (периодический теоретический и научно-практический журнал, рекомендованный ВАК) С,- Петербург. - 2009, Т. 10, с.478-491.

4. Куклина С.А., Мешандин А.Г., Малыцукова A.A. Способ диагностики инфекционных заболеваний // Информационный листок № 24-025-06. - Киров. - ЦНТИ. -2006. - с. 1-2.

5. Куклина С.А., Мешандин А.Г. Гидрозольные препараты как экспрессные бесприборные диагностикумы в медицине, ветеринарии и биотехнологии // Тезисы 2-й пром. выставки «Науки. Инвестиции. Производство. Вятский Левша». - Киров. - 2006. - с. 36-37.

6. Куклина С.А., Мешандин А.Г. Гидрозольные препараты для экспресс-диагностики биомаркеров // Материалы IV Республиканской научно-практической конференции «Перспективные направления и новые технологии в здравоохранении». -Йошкар - Ола. - 2006. - с. 68-69.

7. Куклина С.А., Мешандин А.Г., Малыцукова A.A. Оптимизация компонентов гидрозольных препаратов для экспрессной диагностики // Вятский медицинский вестник. Киров. - № 2. - 2006. - с.48 - 49.

8. Куклина С.А., Мешандин А.Г., Шугалей И.В., Тофтунова В.В. Ультрадисперсные алмазы в качестве гидрозолей для экспрессной иммунодиагностики // IX Вишняковские чтения «Вузовская наука - образованию и промышленности» материалы международной научной конференции / под ред. проф. В.Н.Скворцова. - Бокситогорск.-2006.-с. 201-202.

9. Куклина С. А., Мешандин А.Г. Гидрозольные препараты как иммунохимические диагностикумы для определения качества воды // Материалы I Всероссийской молодежной научной конференции « Молодежь и наука Севера». - Сыктывкар.- 2008. - с. 204 - 205.

Ю.Куклина С.А., Мешандин А.Г., Орлова О.Ю. Гидрозольные диагностикумы для определения качества воды // Теоретическая и прикладная экология. Общественно -научный журнал. Киров. - 2009. - №2. - с. 21-24.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Куклина, Светлана Анатольевна

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И МОНИТОРИНГА ИНФЕКЦИОННЫХ И СОМАТИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЙ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ (обзор литературы)

1.1. Иммунохимические методы, их место в системе клинической лабораторной диагностики.

1.1.1 Прямые методы.

1.1.2 Методы пассивной агглютинации.

1.1.3 Индикаторные методы.

1.1.4 Реакции связывания комплемента.

1.2. Современные методы, близкие к иммунохимическим.

1.3. Практические приложения - примеры конкретного применения иммунохгшических методов.

1.4. Особенности ряда диагностических препаратов, применяемых в иммунохимическом анализе.

1.5. Гидрозольные препараты как экспрессные бесприборные диагностикумы.

1.5.1. Особенности адсорбции биолигандов на гидрозольные препараты.

1.5.2 Ионная адсорбция.

1.5.3 Хемосорбция в синтезе гидрозолей.

1.5.4. Возможное влияние среды на протекание иммунохимических реакций.

1.6. Выводы и постановка задач исследования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Материалы исследования.

2.2 Методы исследования.

2.3. Статистическая обработка полученных результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выбор типа и дозировки твердофазного носителя для реакции гидрозольной агглютинации.

3.1.1. Коллоидный раствор улътрадисперсных алмазов (УДА) в качестве твердой фазы.

3.1.2. Коллоидный раствор на основе органического материала (парафин) в качестве твердой фазы.

3.1.3. Коллоидный раствор гексацианоферрата (II) железа (III) в качестве твердой фазы.

3.2. Выбор типа и дозировки модификатора при хемосорбции биолиганда на основе раствора гексацианоферрата (II) железа(Ш).

3.3. Выбор и оптимизация состава разводящего раствора с учетом pH и ионной силы буфера при постановке реакции иммунохимической гидрозольной агглютинации.

3.4. Выбор носителя для визуализации результатов реакции гидрозольной агглютинации.

3.5. Экспериментальные данные по определению антител к вирусу H5N1 (вирус птичьего гриппа) в сыворотке крови.

3.6. Экспериментальные данные по определению антител к М.

Tuberculosis (туберкулез) в сыворотке крови.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ ГИДРОЗОЛЕЙ В КЛИНИЧЕСКИХ

УСЛОВИЯХ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гидрозольные препараты - бесприборные иммунохимические экспресс-диагностикумы"

Актуальность проблемы. Иммунохимические исследования являются важнейшим этапом в первичной диагностике различных инфекционных и соматических патологий. Идеология лабораторного анализа в медицине основана на понимании любого заболевания как реакции целого организма. Патологическое изменение функции какого-либо органа, ткани, группы клеток вызывает отклонение от нормальных показателей в работе других органов, тканей, систем. Наряду с неспецифическим, то есть свойственным для многих видов патологии проявлением отклонений, в большинстве случаев, наблюдаются особые, характерные лишь для данного заболевания, изменения внутренней среды организма. При инфекционных заболеваниях, а также соматических — это появление во внутренней среде организма возбудителя или его продуктов (токсины, антигены и т.д.) и иммунный ответ на возбудитель [17]. При развитии патологического состояния болезни в организме человека в его биологических жидкостях: крови, моче, слюне -появляются определенные маркеры - специфические вещества сложной, как правило, белковой природы. Эти специфические маркеры, ассоциированные с тем или иным заболеванием (например, антитела к ВИЧ, раковый эмбриональный антиген, НЬбА§ и т.д.), при помощи иммунохимических методов могут выявляться в количествах исчезающе малых: 1 нанограмм в миллилитре и менее, что соответствует очень ранним стадиям начала заболевания. Иммунохимические методы позволяют объективно и адекватно судить о правильности терапевтических либо иных методов лечения. Не менее важны эти методы и в ветеринарии, а также в работе самих биотехнологических производств для адекватного контроля качества выпускаемых препаратов.

В настоящее время во всём мире диагностика как собственно различных инфекционных и соматических патологий, так и мониторинг поствакцинального иммунитета осуществляется при помощи приборных иммунохимических методов (наряду с длительными по времени и ещё более затратными бактериологическими и вирусологическими методами). К наиболее часто применяемым могут быть отнесены методы иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА), иммуноблоттинг и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для этих методов характерны высокая чувствительность и точность результатов, возможность их автоматизации. Вместе с тем, они отличаются значительной дороговизной (1-3 доллара за 1 анализ ИФА, 2050 долларов за 1 анализ ПЦР), неэкспрессностью - время подготовки образцов, постановки и интерпретации результатов составляет в среднем от 3 часов (ИФА) до 1 суток (ПЦР, иммуноблоттинг).

Кроме того, эти методы возможно реализовать исключительно с использованием специальных и дорогих приборов, часто импортных. Наличие этого оборудования в составе специализированных лабораторий, особенно в райцентрах и сельской местности, проблематично и попросту экономически неоправданно. Более того, сами наборы реактивов для ИФА, РИА, иммуноблоттинга и ПЦР часто являются импортными, и это ставит Российскую Федерацию в опасное положение импортозависимости по проблеме, имеющей общефедеральное значение. Нельзя также сбрасывать со счетов «капризность» ферментных меток, необходимость специальных условий их хранения, малодоступных в сельской местности, опасность радиоактивных меток, необходимость соблюдения специальных мер по их условиям хранения и технике безопасности. В источниках по данному вопросу неоднократно также отмечались канцерогенность и токсичность компонентов этих наборов, что приводит к необходимости соблюдения ряда мер по специальной технике безопасности работающих [26, 27, 31, 48, 73, 83].

Всё вышесказанное подтверждает тот факт, что методы ИФА, РИА, иммуноблоттинг и ПЦР применяются, прежде всего, как верифицирующие тесты, но не как скриннинговые анализы. На транспортировку и постановку анализа ПЦР уходит примерно двое суток, что позволяет распространиться вирусу птичьего гриппа на домашнюю птицу и человека, вызывая последующее развитие полномасштабной эпидемии с катастрофическими последствиями.

На сегодняшний день необходимо внедрять в практическую деятельность врача новые экспрессные методы ранней диагностики. В распоряжении любого врача-клинициста должны быть диагностические препараты, позволяющие осуществить первичную диагностику (по принципу «да» - «нет») с последующим более полным исследованием в случае «да» конкретной патологии, соответствующей его специальности, то есть осуществлять скриннинговые исследования.

Препараты для экспресс - диагностики должны быть дешевыми, а постановка реакции и считывание результатов занимать не более 1-2 минут. Кроме того, экспресс-диагностика не должна требовать дополнительных приборов, должна давать возможность ставить реакции с малыми объемами препарата и биоматериала, взятого от больного (10-20 мкл) и иметь стабильные и воспроизводимые иммунохимические свойства, то есть выявлять маркеры того или иного заболевания в самом широком спектре биологических жидкостей (в моче, слюне, сыворотке крови и т.д.) в минимальных концентрациях.

Для установления первичного диагноза в поликлиническом лечебном заведении, для анализа образцов в лаборатории СЭС, для массового скрининга необходимы простые, но надежные и чувствительные методы, позволяющие проводить десятки и сотни анализов в сутки. В настоящее время иммунохимические методы далеки от сформулированных выше требований. Большинство из них требуют длительного времени и дорогостоящего оборудования, а стоимость одного анализа составляет в зависимости от метода от 3 до 10 долларов и более.

В последнее время предложено решение данной задачи -использование в качестве дйагностикумов гидрозольных препаратов. Гидрозольные препараты представляют собой коллоидные растворы на основе неорганических объектов, в частности, комплексного соединения — гексацианоферрата (И) железа (III), более известного под тривиальным названием «берлинская лазурь». Данный вид иммунологического анализа является полуколичественным, основан на методе гидрозольной агглютинации [40]. Антитела оценивается по предельным титрам (концентрациям), а антигены - путём постановки параллельной реакции с референсным препаратом. Реакция происходит в лунках планшета, куда закапывают разведённую гидрозоль и затем разведённый биоматериал. Результат считывается визуально. Общее время постановки 10-15 минут [47].

В настоящее время имеются данные о гидрозольных препаратах на основе неорганических объектов - это золь гексацианоферрата (II) железа (III), в качестве оптимальной твёрдой фазы, предназначенного для определения туберкулёзных антител в сыворотке крови больных в постановке на стекле [47], а также золь оксида железа (III) в качестве оптимальной твёрдой фазы, предназначенного для определения антител к вирусу сальмонеллеза в сыворотке крови больных [34]. Данные препараты могут служить основой для разработки большого количества бесприборных диагностических систем и могут использоваться там, где требуется выявить феномен взаимодействия антигена с антителом.

Однако ряд вопросов, связанных с оптимизацией свойств гидрозольных препаратов: содержание и тип модификатора, pH разводящего раствора, оптимальный способ постановки и визуализации результатов, остается до конца нерешенным. Также возникают вопросы о возможности синтеза гидрозольных препаратов на основе органических объектов, изучение их свойств и о новых способах фиксации результатов.

Изучение потери агрегативной устойчивости коллоидных растворов, нагруженных системой «антиген - антитело» являлось объектом наших исследований, причем эта потеря агрегативной устойчивости приводила к практическому результату - фактической постановке диагноза.

Данные факты и предопределяют актуальность проводимых нами научных исследований. Таким образом, основным предметом нашего исследования стали разработка и создание экспрессных иммунохимических коллоидных препаратов на основе ультрадисперсных частиц неорганической и органической природы.

Цель исследования.

1. Изучение особенностей синтеза и состава гидрозольных диагностикумов на основе ультрадисперсных частиц неорганической и органической природы, на поверхность которых сорбированы специфические белки - антигены.

2. Получение и апробация диагностических препаратов на выявление маркеров таких заболеваний, как туберкулез, сифилис, птичий грипп.

Задачи исследования.

1. Выбор типа твердофазного носителя для реакции гидрозольной агглютинации.

2. Установление типа и дозировки модификатора при хемосорбции биолиганда на коллоидные частицы гексацианоферрата (II) железа (III) («берлинской лазури»).

3. Выбор типа разводящего раствора с учетом pH и процентной концентрации раствора соли при постановке реакции иммунохимической гидрозольной агглютинации.

4. Исследование объективного способа постановки и фиксации результатов реакции гидрозольной агглютинации.

5. Получение и апробация диагностических препаратов на выявление маркеров таких заболеваний, как туберкулез, сифилис, птичий грипп.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное исследование органического (парафин) и неорганического материала (ультрадисперсные алмазы) в качестве твердой фазы для последующего изготовления гидрозольных диагностических препаратов.

Установлено, что малодиссоциирующие соли d-переходных металлов являются лучшими модификаторами, обеспечивающими наиболее эффективное ковалентное связывание белка с неорганическим носителем — коллоидным раствором гексацианоферрата (И) железа (III) с целью создания стабильных конъюгатов с воспроизводимыми иммунохимическими свойствами.

Впервые оптимизирован состав разводящего раствора для реакции гидрозольной агглютинации для гидрозоля - гексацианоферрата (И) железа (III). Впервые получены гидрозольные иммунохимические диагностикумы на выявление маркеров таких заболеваний, как сифилис и птичий грипп.

Положения, выносимые на защиту.

1. Гидрозольные препараты могут быть получены не только на основе неорганических коллоидных растворов, но и коллоидных растворов ультрадисперсных алмазов (УДА), а также на основе органического вещества - коллоидного раствора парафина.

2. Для адсорбции биолигандов на поверхность золя гексацианоферрата (II) железа (III) необходим химический модификатор, оптимальными следует признать катионы тяжелых металлов: Hg2+, Pb2+ в виде малодиссоциирующих солей в водном растворе.

3. Разводящим раствором, обеспечивающим высокое значение константы аффинитета и авидности реагирующих между собой антигена и антитела следует признать 0,9 - 1% раствор KCl, приготовленный на фосфатном буферном растворе.

Практическая значимость.

Ранее на кафедре общей химии была разработана методика для получения гидрозольных препаратов на основе гексацианоферрата (И) железа (III), так называемой «берлинской лазури». Однако данные препараты имели недостаток: при попытках пассивной адсорбции биолиганда на гидрозоль гексацианоферрата (II) железа (III) не наблюдали адсорбции белка на поверхность твердой фазы. Это выражалось в том, что агглютинационный анализ не происходил во всем диапазоне разведений «+» и «-» сывороток с антителами, комплементарными определенным антигенам. Поэтому необходимо было осуществить комплекс работ по «пришивке» специфических антигенов — белков через определенный модификатор.

В ходе работы была установлена связь между дозировками химических модификаторов на поверхности ультрадисперсных частиц и свойствами получающихся продуктов - иммунохимических гидрозолей, а также связь между pH разводящего раствора и агрегативной устойчивостью гидрозольных препаратов.

В данной работе были впервые исследованы новые носители (коллоидные растворы парафина и ультрадисперсных алмазов) в качестве твердой фазы для создания диагностических препаратов, производящих адсорбцию биолиганда без применения модификатора.

Реализация в практическом здравоохранении.

В ходе работы получены и в последующем апробированы в лабораторно - клинических условиях гидрозольные диагностикумы, предназначенные для выявления маркеров таких заболеваний, как туберкулез, сифилис, птичий грипп.

Испытания производились на базе клинической лаборатории больницы ФГУ ЛИУ — 12 УФСИН России по Кировской обл., на базе лаборатории Биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН г. Санкт -Петербурга, в лаборатории диагностического центра ОАО Hi 111 «АВИВАК» г. Санкт - Петербурга. Получены положительные акты испытаний данных диагностикумов в НИИ гриппа РАМН (г. Санкт — Петербург).

Гидрозоли были синтезированы ранее заведующим кафедрой общей химий Кировской ГМА Мешандиным АХ. по оригинальной запатентованной авторской методике.

Объем и структура диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Куклина, Светлана Анатольевна

ВЫВОДЫ

Таким образом, в ходе проведенных исследований были выявлены: тип и содержание модификатора, состав разводящего раствора, объективный способ постановки реакции гидрозольной агглютинации и визуализации результатов.

1. В работе изучены диагностические препараты на основе гидрозольных растворов гексацианоферрата (III) железа, ультрадисперсных алмазов, парафина для получения экспрессных иммунохимических диагностикумов. Ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза могут использоваться в реакциях типа пассивной гемагглютинации в качестве твердой фазы, однако по скорости прохождения реакции они уступают коллоидному раствору гексацианоферрата (II) железа (III). Коллоидный раствор парафина возможен к рассмотрению в последующем в качестве твердофазного носителя. Наилучшим вариантом является диагностикум на основе коллоидного раствора гексацианоферрата (II) железа (III).

2. Исследован состав компонентов гидрозольных диагностикумов. Доказано: наиболее лучшим модификатором является катион Hg в виде малодиссоциирующей соли HgCl2 в водном растворе. Оптимальным вариантом концентрации модификатора при проведении реакции гидрозольной агглютинации оказалась - 2,0% на 1 мл. гидрозоля, обеспечивающая четкую дифференциацию «+» и «-» сывороток.

3. Определен состав разводящего раствора - раствор KCl, приготовленный на фосфатном буферном растворе, обеспечивающий наилучшую дифференциацию «+» и «-» сывороток. Оптимальным вариантом при проведении иммунохимического анализа оказались концентрации 0,9% и 1,0% раствора KCl, приготовленного на фосфатном буферном растворе.

4. Наилучший способ визуализации полученных результатов на фильтровальной бумаге. Такая визуализация результатов на фильтровальной бумаге показывает четкую дифференциацию «+» и «-» сывороток, а также дает возможность длительного хранения результатов.

5. В результате получены акты испытаний гидрозольных препаратов в сторонних организациях исходя из методик и рекомендаций по синтезу и оптимальному применению гидрозолей в настоящей диссертационной работе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Диагностика туберкулёза в России в настоящее время становится всё более сложной проблемой. Это связано в первую очередь с нарушением системы выявления туберкулёза из-за недостаточного финансирования. В связи с этим необходимой является разработка новых более доступных и дешевых способов массового скрининга населения на туберкулёз.

2. Реакция гидрозольной агглютинации с антигенным туберкулёзным и сифилисным диагностикумом характеризуется экономичностью, простотой постановки, достаточной специфичностью и чувствительностью, что позволяет рекомендовать её для диагностики туберкулёза и сифилиса.

3. Известно, что техника постановки реакции гидрозольной агглютинации почти полностью совпадает с техникой постановки реакции пассивной гемагглютинации. В связи с этим стоимость анализов будет различаться лишь по стоимости применяемых диагностикумов. Так стоимость эритроцитарного диагностикума, необходимого для постановки одного анализа РПГА, составляла 20 рублей или 0,70 доллара США, тогда как стоимость гидрозольного антигенного диагностикума, полученного нами в экспериментальных условиях и необходимого для постановки одного анализа - 5 рублей или 0,17 доллара США. Стоимость одного анализа методом ИФА - 30 рублей. Серийный выпуск в промышленных условиях позволит сократить затраты на его производство и приведёт к еще большему экономическому эффекту.

4. Целенаправленный мониторинг иностранной прессы и интернет-ресурсов, посвященных данной теме, а также поиск в российских и зарубежных патентных базах данных, показал, что результаты работы в направлении разработки технологий диагностики птичьего гриппа и оценки поствакцинального иммунитета производятся лишь при помощи приборных методов типа ИФА, РИА, ИФЛА и ПЦР -диагностики. Экспрессные и бесприборные тесты на этот вид нозологии отсутствуют, хотя наличие проблемы и её крайняя важность источниками признаётся. Проблема эта является, на самом деле, особо важной и первостепенной именно для Российской Федерации, поскольку именно через её территорию проходят ежегодно огромные миграции перелётных стай диких пернатых, являющихся разносчиками вируса птичьего гриппа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куклина С.А. Способ диагностики инфекционных заболеваний / С.А. Куклина, А.Г Мешандин., A.A. Малыцукова // Информационный листок № 24-025-06. - Киров: ЦНТИ, 2006, - с. 1-4

2. Куклина С.А. Гидрозольные препараты как экспрессные бесприборные диагностикумы в медицине, ветеринарии и биотехнологии/ С.А.Куклина, А.Г. Мешандин // Тезисы 2-й пром. выставки «Науки. Инвестиции. Производство. Вятский Левша». -Киров, 2006. - с. 36 - 37

3. Куклина С.А. Гидрозольные препараты для экспресс-диагностики биомаркеров/ С.А.Куклина, А.Г. Мешандин // Материалы IV Республиканской научно-практической конференции «Перспективные направления и новые технологии в здравоохранении». - Йошкар - Ола, 2006. - с. 68 - 69

4. Куклина С.А. Оптимизация компонентов гидрозольных препаратов для экспрессной диагностики/ С.А.Куклина А.Г. Мешандин // Вятский медицинский вестник. Киров, № 3, 2006. - с. 30 - 34

5. Куклина С.А. Ультрадисперсные алмазы в качестве гидрозолей для экспрессной иммунодиагностики / С.А.Куклина, А.Г. Мешандин, И.В.Шугал ей, В.В. Тофтунова // IX Вишняковские чтения «Вузовская наука - образованию и промышленности» материалы международной научной конференции / под ред. проф. В.Н.Скворцова. - Бокситогорск, 2006. - с. 201 - 202

6. Куклина С.А. Гидрозольные препараты как иммунохимические диагностикумы для определения качества воды / С.А.Куклина, А.Г. Мешандин // Материалы I Всероссийской молодежной научной конференции « Молодежь и наука Севера». - Сыктывкар, 2008. с. 204 - 205

7. Куклина С.А. Гидрозольные препараты для экспресс-диагностики биомаркеров / С.А.Куклина, А.Г. Мешандин // Вестник новых медицинских технологий (периодический теоретический и научно-практический журнал, рекомендованный ВАК). Тула. - 2007, T. XIV, №2, с. 135 - 136

8. Куклина С.А. Гидрозольные препараты, изготовленные по принципам нанотехнологии в качестве экспрессных бесприборных тестов для бесприборной диагностики инфекционных и соматических патологий / С.А.Куклина, А.Г. Мешандин, A.A. Малыцукова // Вестник Российской военно-медицинской академии (научно - практическое издание. Журнал включен в Реферативный журнал и Базы данных ВИНИТИ). С.- Петербург. - 2008, Т.23, №3, с. 488 - 490

9. Куклина С.А. Гидрозольные препараты как иммунохимические диагностикумы для определения качества воды / С.А.Куклина, А.Г. Мешандин, О.Ю. Орлова // Теоретическая и прикладная экология. Общественно - научный журнал. Киров. - 2009, №2, с. 21

10. Куклина С.А., Мешандин А.Г., Попова C.B. Применение метода гидрозольной агглютинации в диагностике туберкулёзной инфекции // Российский Биомедицинский журнал (периодический теоретический и научно-практический журнал, рекомендованный ВАК) С.- Петербург. - 2009, Т. 10, с.478-491.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Куклина, Светлана Анатольевна, Киров

1. Адсорбционные свойства ультрадисперсных углеродных материалов / Г.М.Губаревич, Н.М.Костюкова, И.С.Ларионова, Л.И.Полева // Доклад 5 Всесоюзного совещания по детонации. Красноярск. 1991.- Т. 1. - с. 112-И 6.

2. Амброзиус X., Фибих Г. Иммунологические методы / под ред. Г.Фримеля, пер. с нем. А.П.Тарасова.- М.: Медицина, 1987.- 472 с.

3. Амброзиус X. Иммунология: Справочник / под ред. Г. Бундау; пер.с нем.- 2-е изд. Киев.: Наукова думка, 1981.- 480 с.

4. Ахметов A.C. Радиоиммунологический анализ в клинической практике / Журнал Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И.Менделеева. -1982.- Т. 27. №4. М.: Химия,- с.76-80.

5. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медицина, 1962. - 80 с.

6. Березин И.В. Иммобилизованные ферменты: Современное состояние и перспективы / В.К. Антонов, С.Д.Варфоломеев, Л.И.Воробъёва. М.: МГУ, Т.1. -1976.- 296 с.

7. Беленький Е.Ф., Рискин И.Ф. Химия и технология пигментов / под ред. Л.Ф. Корсунского.- 4-е изд., Л.: Химия, 1974.- 656 с.

8. Вербо, В.Н. Иммуноферментный анализ // Труды Лен. НИИ им. Пастера Л. - 1989. - с. 3-28.

9. Влияние состава поверхности на свойства алмазных поликристаллов / Н.В.Новиков, В.Г Алешин и др. // ДАН СССР. 1988. -Т.300.-№5.-с. 1122-1126.

10. Воюцкий С.С. Курс коллоидной химии / 2-е. изд.,- М.: Химия. -1975. -512 с.

11. И. Гаврилова Е.М., Гомогенный иммуноферментный анализ -новое направление иммунохимии // Журн. Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. -1982.- Т.27. № 4. М.: Химия. с. 90-96.

12. Гнутова P.B. Серология и иммунохимия вирусов растений. М., Наука, 1993, - с.102-104.

13. Гурвич А.Е., Кузовлева O.E. Получение белково-целлюлозных компонентов (иммуносорбентов) в виде суспензий, способных присоединять большие количества антител./ Журн. Биохимия. 1961.Т. 26. №5. М.: изд. Академии наук СССР. - с.934-942.

14. Дзантиев Б.Б., Егоров А.Н. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа / журн. Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И. Менделеева,- 1982.- Т.27. № 4. М.: Химия, - с.82-89.

15. Долматов В.Ю. Ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза. Получение, свойства, применение. С-Пб.: Изд-во СПбГПУ. -2003.-254 с.

16. Думанский А. В. Учение о коллоидах / 3-е изд., М. JI. Госхимиздат. - 1948. - 416 с.

17. Думпес Ю. Я. Диагностические экспресс-тесты на твердофазных носителях для медицинских биохимических анализов // Рига.: Медицина.- 1986. 198 с.

18. Егоров A.M., Диков М.М. Структура и механизм действия антител // Журн. Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. 1982.-Т.24. №4. М.: Химия. - с.21-28.

19. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / Ф.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова,- М. Высшая школа. -1991.-271с.

20. Жуков И.И. Коллоидная химия, ч. 1. JL - изд. ЛГУ им. A.A. Жданова. - 1949.-324 с.

21. Заикина H.A. и др. Иммунобиотехнология. Учебное пособие / Н.А.Заикина, В.А.Галынкин, A.B. Гарабаджиу СПб: Изд-во «Менделеев», 2005.- 155 с.

22. Иванов A.M. Оптимизация серологической диагностики сифилиса: дис. д-ра мед. наук: 14.00.11, 03.00.07. С-Пб. - 2005.-216 с.

23. Иммунология. Методы исследований / под ред. И. Лефковитса; пер. с англ. А.И. Маца.-М.: Мир. 1983.-348 с.

24. Иммунохимический анализ / под ред. действ, чл. АМН СССР проф. Л.А. Зильбера. М.: Медицина. 1968.- 300 с.

25. Иммуноферментный анализ / под ред. Т.Т.Нго и Г.Ленхоффа, пер. с англ. C.B. Калугера М.: Мир. - 1988.-444 с.

26. Иммунохимия в клинической лабораторной практике / под ред. А.М.Уорда, Дж.Т.Уичера. пер.с англ. A.M. Авербаха.- М.: Медицина. -1981.- с.59-69.

27. Карякин Ю.В. Ангелов И.И. Чистые химические вещества / 4-е изд. М.: Химия. 1974.-409 с.

28. Коллинз У .П. Новые методы иммуноанализа / М.Тертон, Д.Балангхем, под ред. У.П. Коллинза, пер. с англ. М.: Мир, 1991.-с.151-154.

29. Кройт Г.Р. Наука о коллоидах / Под ред. Г. Р. Кройта, пер. с англ. И.А. Плетневой. Т. 1.- М., изд. иностр. лит. 1955.- 538 с.

30. Маскет М. Физические основы технологии добычи нефти.- М.-И. 2004. - 608 с.

31. Мешандин А.Г. и др. Серологическая диагностика сальмонеллезов / А.Г.Мешандин, Ю.В.Золотарев Л.В.Золотарева // Клиническая лабораторная диагностика. М.: Медицина. - 2001.- № 1,-с. 52-53.

32. Мешандин А.Г, Ванеева Л.И. Проблемы потери активности сорбированных лигандов в гетерогенном иммуноферментном анализе / Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1994,- №4.-М.: С-инфо.- с. 52-55.

33. Мешандин А.Г. Возможность применения гидрозольных препаратов в практике гематологии и трансфузиологии //Актуальные вопросы трансфузионной и клинической медицины. Материалы науч. конф. Киров.- 1997. - с.56-57.

34. Мешандин А.Г., Матвеев А.Г. О возможности бесприборной экспресс диагностики инфекционных заболеваний // Труды VI Всерос. Съезда микробиологов, эпидемиологов, паразитологов — Н. Новгород.-1991. Т.2. -с.226 .

35. Мешандин А.Г., Матвеев А.Г. Латексные тест-системы- основа для создания бесприборных диагностикумов // Труды раб. совещ. Состояние диагностики бактериальных инфекций. Оболенск. 1989.-с.143.

36. Мешандин А.Г., Малыцукова A.A. Постановка реакции гидролизной агглютинации по тестированию вирусных нозологий нанетканом материале // Вятский медицинский вестник. 2003. - №3. -с.87-90.

37. Мешандин А.Г. Гидрозольные препараты в диагностике различных инфекционных и соматических патологий / Паллиативная медицина и реабилитация. 1997. - №1.- М.: фонд Паллиативная медицина и реабилитация больных. - с.21-23.

38. Мешандин А.Г. Физико-химические аспекты сорбционных процессов при синтезе биолигандов: дис. д-ра тех. наук: 03.00.23.- М., -1994.-216.С.

39. Некрасов В.В. Руководство к малому практикуму по органической химии. М.: Госхимиздат, 1954. - 295 с.

40. Орлова О.Ю. Мешандин А.Г. Гидрозоли: принципиально новый класс диагностических препаратов для выявления и мониторинга инфекционных и соматических патологий // Вятский медицинский вестник. -1999.-№1.- Киров.: КГМА.- с. 37-42.

41. Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Возможность применения гидрозольных препаратов в лабораторной практике./Клиническая лабораторная диагностика. 2000.- №10.- М.: Медицина.- с.5.

42. Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Применение нового метода гидрозольной агглютинации для оценки поствакцинального противодифтерийного иммунитета / Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. Материалы II международной конференции. СПб. - 1998.-с. 193.

43. Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Сопоставление различных видов твердых фаз при синтезе гидрозольных иммунохимическихдиагностикумов / Вятский медицинский вестник. 2000.-№ 3.- Киров.: КГМА. - с. 53-58.

44. Орлова О.Ю. Исследование конъюгатов белков и нерастворимых соединений d-элементов в бесприборном иммунохимическом анализе: дис. канд. хим. наук.- С-Пб.- 2005.- 102 с.

45. Падюков JI.H., Харитоненков И.Г. Иммунодиагностика инфекций / Руководство: "Иммунология инфекционного процесса", М.: Медицина. 1994.- с. 63-68.

46. Пасынский А. Г., Коллоидная химия / под ред. акад. В.А.Каргина. 3-е изд., М.: Высшая школа. 1968. - 232с.

47. Пастер Е.У. Практикум по иммунологии / Учебное пос. для вузов-Киев.: Выща школа. 1989.-302 с.

48. Su №883053 Al, ЕР 1839560 Физико- химические аспекты сорбционных процессов при синтезе твердофазных биолигандов / Мешандин А.Г. (заявитель и патентообладатель Мешандин А.Г.). №883053. заявл. 30.12.88; // Изобретения (Заявки и патенты). - 1989.

49. Песков Н.П. Курс коллоидной химии. М., - JL: Госхимиздат. -1940. - 76с.

50. Писаренко А.Г. Курс коллоидной химии / 3-е изд. М.: Высшая школа. - 1969.- 249 с.

51. Полетаева О.А., Мешандин А.Г. Иммуноагглютинационный диагностикум на основе моноклональных антител для скрининга эпителиального опухолевого маркера в цельной крови онкологических больных / Журн. Биотехнология. 1995.- №3-4.- М. - с. 46-47.

52. Получение алмазов из взрывчатых веществ / А.И.Лямкин, Е.А.Петров, А.П.Ершов и др. // ДАН СССР. 1988. - Т. 302. - с. 611-613.

53. Попечителев Е.А., Старцева О.Н. Методы иммунохимических исследований. СПб. : СГбГЭТУ. - 1993.-е. 32-35.

54. Практическая иммунология / Под ред. П.Н. Бургасова и И.С. Безденежных. М.: Медицина. - 1969. - 414 с.

55. Привалов П.JI. //Биофизика. 1968 Т. 13., №1., с. 163-177

56. Равич- Щербо М.И. Физическая и коллоидная химия /2-е изд., М.: Высшая школа. 1968.- с. 150-153.

57. Ребиндер П. А. Избранные труды: Поверхностные явления в дисперсных системах / Коллоидная химия, М.: Наука. 1968.- 239 с.

58. Реми Г. Курс неорганической химии / Пер. с нем. к.х.н. А.И.Григорьева. Т. 2. - М.: Мир. - 1974.- 888 с.

59. Роберте Д.Д., Касерио М. Основы органической химии / Пер. с англ. Ю.Г.Бунделя. 2-е изд. М.: Мир. - 1978.- Т.2. - 775 с.

60. Руководство по иммунологии / Под. ред. О.Е.Вязова и Ш.Х.Ходжаева. М.: Медицина,- 1973. -316 с.

61. Сорокина З.А. Состояние калия, натрия и воды в цитоплазме клеток. Киев. 1978. С.214с

62. Сошникова Л.А., Тамашевич В.Н. Многомерный статистический анализ. М.: Юнита-Дана, 1999. С. 350.

63. Степанов Б.Н. Введение в химию и технологию органических красителей / 3-е изд. М.: Химия. - 1984.- 589 с.

64. Строев Е.А. Биологическая химия, М.: Высшая школа. 1986 .500 с.

65. Теплова H.H. Рабдомиолиз у хирургических больных в клинике неотложных состояний: дис. канд. мед. наук: 14.00.37. Пермь. -2000.- 137.с.

66. Фримель Г. , Брок И. Основы иммунологии /пер. с нем. А.П. Тарасова; под ред. А.И. Маца. М.: Мир. - 1986. - 254 с.

67. Харитоненков И.Г., Христова M.JI. Использование иммуноферментных методов в вирусологии / Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 1985.- №.6 .- с. 3-15

68. Хитров B.C., Алехин P.M. Справочник по ветеринарным биологическим препаратам. М.: Высшая школа. — 1973. — 315 с.

69. Чард Т. Радиоиммунологические методы / пер. с нем. М.С. Морозовой; под ред. JI. М. Варшавского. М.: Мир. - 1981.- 246 с.

70. Шелудко А. Д. Коллоидная химия / пер. с болг. В.М. Мулл ера -М.: Мир. 1984.-319 с.

71. Эллин Р.Д., Макензи Р. Иммунологические аспекты инфекционных заболеваний / под ред, Д.Дика; пер. с англ. А.С. Анта, М.: Медицина, 1982.- 574 с.

72. Adarwai А.То the question of retichal immunosozbent// Experimentia.-1971.-Vol.27.-P.514-515.79. .W.P.Collins ed J.Wiley & Sons Alternative Immunoassays , //Chichester-New York-Brisbane-Toronto-Singapore, 1985.

73. Aizawa M. Immunosensors //Philos. Trans. Royal soc. London., B. Biol. Science.-1987.-Vol.316.-P.-121 -133.

74. Clark R., Engvall E. Enzyme linked immunosorbent assay// (ELISA).Teoreoretical and praktical aspects. Enzyme-Immunoassay (E.T.Maggioed.). Boca Raton, Florida.- 1981.-P.- 167-179.

75. H. R. Kruyt Colloid science .// N. Y.-a. o., 1949.-Vol.-l-2.-P.-52.

76. Crosignani P.G., Nakamusa R.M., A method of sodium phase radioimmunoassay untilizing polypropylene dises. // J. Clin. Endocrinof and Metabol.- 1970.- Vol .-30 .- P. 153-160.

77. Gallo D. Uses of immunofluorescence in diagnostic virology. // Amer. J. Med. Technol.- 1983. Vol.- 49. -P, 157-161.

78. Edswall J.T. Methods of crosslinking. //J. Am. Chem. Soc. 1954.-Vol.-.76.-P.3131-3138.

79. Freundlich H., Kapillarchemie. / / Lpz., 1930.-B. 1 .-P.-32.

80. Guenes Z. Factors, that can influsence of reactions antigen-antibody. //J.Biochem Physiol.-1960.-Vol. .3 8 .-P.-123 5-1243.

81. Ichikawa E, Imagawa M. Enzyme inking of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay and immunologicol staining. // J. Immunoassay -1983. -Vol.- 4.-P.- 1399 -1401.

82. Magnusson Karl-Eric, Bartonek Eva. // Immunol. Invest.,.-1987.- №3.- P.-227-240.

83. Goldring O. L. Detergent solubilised antigens in enzyme immunoassay with particular reference to enzyme-linked immunosorbent assey (ELISA) systems.//Immunoassay Technol.- Vol.- 2. Berlin; New York.-1986.- P.189-213.

84. Sever John L. Future perspectives in virology diagnosis, treatment and immunoprophylaxix.// S. Afr. Med. J. 1986.- 70, Suppl.-P. 10-16.

85. Hazen Beth W., Hazen Kevin C. Modification and application of a simple, surface hydrophobicity detection method to immune cells.// J. Immunol. Meth, 1988, 107, №2.-P.- 157-163.

86. Letonen O. Antibody connection in immunoassays//J.Immunol.Meth.-1980.-Vol.-34.-P.-61-70.

87. Olownikow A Diazocrossliking in immunology .//Immunochemistry.-1967.-Vol.-4-P.-77-80.

88. Parsons G. N. Antibodi-coated plastie tubes in radioimmunoassay.// MethEnzymol .-1981.-Vol.-73.- P.-196.

89. Phillips A. P., Martin K. L. Direct and indirect immunofluorescence analysis of bacterial populations by flow cytometry. //J. Immunol.

90. Meth., 1987, № 2, P.-219-228.

91. Pacry R. P., Love C., Detection of rubella antibody using an optical immunosenser.//J. Virol. Meth-1990.-Vol.27.-P.39-48.

92. Stewart- Tull Duncan E.S., Parant Monique. Immunopotentiators in vaccines: a drem to to a reality .//Ann. Immunol. Hung.- 1986,26.-№1.-P.197.223.

93. Newark N. J. Immunomedics inc receives patent on antidody-linking technology.//Appl. Genet. News.- 1987,8.- №1.P.- 8.

94. Stollar B. D., Rashtehian A. Immunochemikal approaches to gene probe assay // Annual. Biochem.-1987.-Vol.-161.-P.- 387-394.

95. Timpl R., Furthmayr H. //Ysolation of pure anti — collagen antibodies using a specific lmmunoadsorbent technigue, L.Ymmunitatsforsch, 1967.- P.-134, 391-396.

96. Werner Georges H. Synthetic immunostimulants(excluding sulur-containing compounds).//Comp. Immunol., Microbiol., and Infect. Dieseases.-1986,9.-№ 2-3.-P.- 131-136.