Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование методов бактериологической и серологической диагностики сальмонеллезов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов бактериологической и серологической диагностики сальмонеллезов"

На правах рукописи

Золотарева Лилия Васильевна

Г

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ И СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ САЛЬМОНЕЛЛЕЮВ

03.00.07-микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь-1998

Работа выполнена в Кировском государственном медицинском институте Министерства здравоохранения РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор технических наук

А.И.Смирнова А.Г.Мешандин

Офицальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Э.С.Горовиц О. А.Тимашева

Ведущая организация - НИИ микробиологии МО РФ, г. Киров

Защита состоится

-1998г. в /У

- с*

часов на

заседании диссертационного совета К 200.46.01 Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан

/■Сг'. ССА- 1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

И.Б.Ившина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Широкое распространение сальмонеллезов во многих, в том числе высокоразвитых странах, и связанный с этим огромный экономический и социальный ущерб вызывают настоятельную необходимость всестороннего изучения данной проблемы (Сатаров С. с соавт., 1997; Schmid Н. et al., 1996; Yang С.Н. et al., Holtby J. et al.. 1997).

Несмотря на огромное количество научных исследований, проводимых во всем мире и посвященных сальмонеллезной инфекции, до последнего времени не решены многие кардинальные вопросы патогенеза и лабораторной диагностики.

Встречаясь в любом возрасте, сальмонеллез поражает, преимущественно, детей, особенно раннего возраста, у которых он часто протекает длительно, с развитием тяжелых форм, нередко заканчивается летальным исходом и осложняет эпидемиологическую ситуацию в детских стационарах (Учапкин В.Ф. с соавт., 1996; Милютина J1.H. с соавт.. 1997; Новок-шонов A.A. с соавт., 1997; Andersson V. et al., 1995).

Разнообразие клинической каргины сальмонеллеза, зачастую, вызывает трудности в постановке диагноза и своевременном проведении комплекса необходимых лечебных и противоэпидемических мероприятий. В связи с этим ведущее значение в диагностике сальмонеллезной инфекции отводится лабораторным методам исследования: бактериологическому и серологическому, в частности реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Однако эти методы имеют ряд существенных недостатков, значительно снижающих их эффективность. К ним относятся: низкая чувствительность, большая трудоемкость, длительность исследования, использование дорогостоящих диагностикумов и питательных сред, приготовленных на основе мясных, казеиновых, рыбных, растительных и других гидролизатов и экстрактов, получаемых из ценного пищевого сырья (Блинова Л.П. с соавт., 1994; Амерханова H.H. с соавт., 1995; Куликова И.Н. с соавт., 1996; Турьянов М.Х. с соавт., 1998).

Следует отметить, что к настоящему времени разработаны и предложены к внедрению в клиническую практику многочисленные методы, позволяющие выявлять противосальмонеллезные антитела в сыворотке крови и специфические антигены в различных биосубстратах больных (Doran J.L. et al., 1994; Jackson A.A. et al. 1995; Gast R.K. et al.. 1997; Wegener H.C. et al., 1997). Однако использование большинства из них ограничено из-за недостаточной специфичности и чувствительности, подтверждения диагноза только в поздние сроки заболевания или из-за сложности постановки, отсутствия стандартных коммерческих препаратов. реагентов, оборудования, или из-за больших экономических затрат. Кроме того, до сих пор продолжаются поиски непищевого сырья для приготовления микробиологических питательных сред.

Анализ данных специальной литературы и высказанные выше предпосылки позволили сформулировать цель и определить задачи работы.

Цель настоящей работы - разработка и апробация нового оригинального метода - реакции гидрозольной агглютинации для серодиагностики сальмонеллезов, а также усовершенствование бактериологической диагностики этой инфекции.

Конкретные задачи исследования:

1. Разработать гидрозольные антигенный и антительный диагно-стикумы для серодиагностики сальмонеллезной инфекции.

2. Дать сравнительную оценку эффективности реакции гидрозольной агглютинации и реакции пассивной тем агглютинации при выявлении сывороточных противосальмонеллезных антител.

3. Изучить возможность применения гидрозольного антительного диагностикума с целью обнаружения антигенов сальмонелл в исследуемом материале.

4. Оценить эффективность новых питательных сред, приготовленных на основе отходов пушного производства и предназначенных для выделения сальмонелл, по сравнению с контрольными средами.

Научная новизна работы.

Впервые для диагностики сальмонеллеза предложены гидрозольные антигенный и антительный диагностикумы. В реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА) определены диагностические титры и изучены частота обнаружения и величина титров противосальмонеллезных антител у больных острыми кишечными инфекциями. Проведено сравнительное изучение эффективности использования реакции гидрозольной агглютинации и реакции пассивной гемагглютинации при диагностике сальмонеллезной инфекции. Впервые показана возможность использования гидрозольного антительного диагностикума для выявления антигенов сальмонелл в исследуемом материале. Впервые для обнаружения сальмонелл предложены новые питательные среды, приготовленные на основе отходов пушного производства, и доказана эффективность их применения.

Практическое значение. На основании полученных результатов исследования показано, что простота и экспрессность постановки, экономичность, достаточная чувствительность и специфичность реакции гидрозольной агглютинации со специфическими антигенным и антительным диагностикумами позволяют рекомендовать ее для серодиагностики сальмонеллезов. Определены оптимальные сроки проведения серологического обследования больных сальмонеллезом в зависимости от их возраста. Предложенные питательные среды на новой оригинальной основе, не отличающиеся по физико-химическим характеристикам, ростовым

свойствам и высеваемости от контрольных, могут быть успешно использованы для выделения сальмонелл.

Внедрение в практику. Материалы исследований внедрены и используются в практической деятельности врачей городской инфекционной больницы г. Кирова, в учебном процессе на лечебном и педиатрическом факультетах Кировского государственного медицинского института.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Реакция гидрозольной агглютинации при выявлении в сыворотках крови противосальмонеллезных антител по своим основным характеристикам не уступает реакции пассивной гемагглютинации.

2. Реакция гидрозольной агглютинации с антительным диагности-кумом может быть использована для обнаружения антигенов сальмонелл в материале от больных острыми кишечными инфекциями.

3. Питательные среды, приготовленные на новой основе из отходов пушного производства, по своему химическому составу, ростовым свойствам и высеваемости в отношении сальмонелл соответствуют контрольным средам.

Апробация диссертационного материала. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях "Острые инфекционные заболевания" (Киров-Екатеринбург, 1993), "Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины" (Киров, 1997), "К 75-летию санитарно-эпидемиологической службы" (Киров, 1997), III Международном конгрессе "Иммунореабилигация и реабилитация в медицине" (Эйлат-Израиль, 1997), VIII съезде педиатров России (Москва, 1998), на заседании проблемной комиссии "Медико-биологических дисциплин" Кировского государственного медицинского института.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 таблицами и 3 рисунками: состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 2 глав собственных исследований, а также заключения с обсуждением полученных результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 221 наименование работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Под нашим наблюдением в период с 1996 по 1998 год находились 152 больных сальмонеллезом в возрасте от 3 мес. до 65 лет. Дети первого года жизни составляли 27%, 1-3 лет - 20,4%, 3-15 лет -18,4%, взрослые -34,2%. У 39 детей в возрасте от 3 мес. до 3 лет заболевание развилось в условиях соматических стационаров и было вызвано антибиотикорези-стентным вариантом сальмонеллы тифимуриум. У остальных больных заражение сальмонеллами энтеритидис и тифимуриум произошло во внебольничных условиях.

Диагноз устанавливали на основании тщательного изучения анамнеза, совокупности клинико-эпидемиологических данных, результатов бактериологического и серологических исследований.

При формировании клинического диагноза у взрослых применяли принципы классификации, предложенные сотрудниками Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии (Покровский В.И. с соавт., 1989), в соответствии с которыми выделяли клиническую форму, вариант и течение заболевания. По рекомендациям Н.И.Нисевич с соавт. (1990) у больных детей определяли тип, форму, тяжесть и течение заболевания. Все находившиеся под нашим наблюдением больные сальмонеллезом перенесли гастроинтестинальную форму. Желудочно-кишечная форма в зависимости от степени выраженности местных проявлений, интоксикационного и дегидратационного синдромов была у 33,5 % больных тяжелой, у 52,0% - среднетяжелой и у 14,5% - легкой. В большинстве случаев^,2%) больные поступили в стационар в первые два дня болезни, в 14,5% - на третий день и лишь 3,3% - на четвертый день и позднее.

Показатели обследованных из основной группы сравнивали с соответствующими показателями 87 больных острой дизентерией, 276 - острыми кишечными инфекциями (ОКИ) неустановленной этиологии и 140 здоровых. От 655 обследованных лиц было доставлено в лабораторию 1520 проб фекалий. При этом было проведено 3774 бактериологических исследований. В серологических реакциях исследованы 746 проб сывороток крови и 342 пробы селенитового бульона. В том числе от 152 больных сальмонеллезом, вызванным сальмонеллами тифимуриум и энтеритидис, было получено 437 проб фекалий и 243 пробы сывороток крови. У здоровых людей исследованы 140 проб фекалий и 140 проб сывороток крови.

В бактериологических исследованиях была изучена возможность применения мясо-костного фарша тушек пушных зверей (лисиц, норок, песцов), являющихся отходом пушного производства, в качестве основы микробиологических питательных сред. На основе гидролизата мясокостного фарша тушек пушных зверей было приготовлено и изучено 1 ]

серий новых питательных сред, которые сравнивались с соответствующими сухими питательными средами, выпускаемыми в промышленных условиях.

Проверка качества питательных сред (опытных и контрольных) проводилась в соответствии с "Методическими рекомендациями по контролю качества некоторых наиболее важных питательных сред, применяемых при бактериологическом исследовании по поводу острых кишечных инфекций", составленными совместно лабораторией кишечных инфекций Ленинградского института Эпидемиологии и Микробиологии им.Пастера (Л., 1979) и бактериологической лабораторией Кировской областной санэпидстанции (1979), и "Методическими указаниями по применению физико-химических методов контроля питательных сред"(М., 1977).

Бактериологическое обследование и взятие проб для серологическо-кого анализа проводили в динамике: при поступлении больных в стационар (1-3 день болезни), в период разгара заболевания и перед выпиской из стационара.

Бактериологическое исследование включало прямой параллельный посев испражнений на опытные и контрольные среды Эндо и Плоскирева и обогатительную среду - селенитовый бульон. У всех выделенных штаммов сальмонелл изучены культурально-морфологические свойства, определены серовариант, антибиотикочувствительность и фаголизабельность.

Для экспрессности выявления антигенов сальмонелл в среде обогащения (селенитовом бульоне) использовали реакцию гидрозольной агглютинации с антительным диагностикумом, постановку которой проводили аналогично постановке реакции агглютинации на стекле (Биргер М.О., 1982).

Для титрования сывороток крови на О-антитела к сальмонеллам группы В и Д использованы: а) реакция пассивной гемагглютинации: б) реакция гидрозольной агглютинации с антигенным диагностикумом.

Все материалы обработаны статистически. При оценке степени достоверности средних данных использовали I - критерий Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения диагностической ценности разработанной нами серологической реакции была проведена сравнительная оценка эффективности реакции гидрозолыюй агглютинации с антигенным гидрозольным диагностикумом и реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитар-ным диагностикумом. С помощью обоих методов была изучена частота обнаружения сывороточных противосальмонеллезных антител, а также их уровень у 140 здоровых людей, 152 больных сальмонеллезом, 87 боль-

ных дизентерией и 276 больных ОКИ неустановленной этиологии в возрасте от 3 месяцев до 60 лет.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что у части здоровых людей в сыворотке крови обнаруживались в небольших титрах про-тивосальмонеллезные антитела. При этом в РГЗА, в сравнении с РПГА, они выявлялись, в среднем, в 1,5 раза (43,6+4.2% и 28,5±3„8% соответственно), а у детей в возрасте до 1 года - достоверно в 2 раза (25,0+3,8% и 12,5±4,1% соответственно) чаще. Было установлено также, что в разных возрастных группах определялись специфические антитела к различным серотипам сальмонелл. Так, у детей раннего возраста обнаруживались специфические антитела к сальмонелле тифимуриум в 3 раза чаще, а у взрослых - в 6,5 раз (Р<,001) реже, чем к сальмонелле энтеритидис. В большинстве серопозитивных проб (75%) уровни сывороточных противо-сальмонеллезных антител колебались от 1:5 до 1:10 и лишь в единичных случаях (7,1%) достигали 1:40. Полученные результаты, по-видимому, обусловлены тем, что в анамнезе обследованных нами детей раннего возраста часто имелись указания на перенесенный ранее сальмонеллез, вызванный сальмонеллой тифимуриум, а среди взрослых - сальмонеллез, вызванный сальмонеллой энтеритидис. Аналогичные данные были получены и Л.Н. Милютиной (1993).

При изучении встречаемости противосальмонеялезных антител и их титров у 87 больных с бактериологически подтвержденным шигеллезом было установлено, что у них, в сравнении со здоровыми, на 25-30% чаще выявлялись положительные результаты. При этом антитела, реагирующие с сальмонеллезными диагностикумами, в РГЗА обнаруживались в 1,5 раза чаще, чем в РПГА. Частота обнаружения антител в РГЗА была наименьшей (38,1%) у детей в возрасте до 1 года, а у взрослых она достигала 70 %. Незначительно возрастали и титры противосальмонеллезных антител. При этом максимальный титр антител в РПГА у детей раннего возраста достигал в единичных случаях величины 1:40, а у детей старшего возраста и взрослых 1:80, в РГЗА - 1:20 и 1:40 соответственно.

Увеличение, в сравнении со здоровыми, частоты серопозитивных результатов и титров противосальмонеллезных антител у больных острой дизентерией, вероятно, связано с наличием у них в небольшом количестве перекрестно реагирующих антител, что совпадает с данными М.И. Буаро (1989). По результатам обследования здоровых и больных дизентерией нами были установлены условно-диагностические титры в РПГА для детей раннего возраста - 1:80, для детей старшего возраста и взрослых -1:160 (в РГЗА - 1:40 и 1:80 соответственно).

Проведенные серологические исследования у 276 больных ОКИ неустановленной этиологии показали, что применение РГЗА, в сравнении с РПГА, позволило повысить результативность серодиагностики в этой группе, в среднем, в 2,6 раза (Р<0,001) (у детей раннего возраста - даже в 3-5 раз) и расшифровать диагноз у них в 13,4% случаев (таблица 1).

Таблица 1. Сравнительная частота выявления антител в диагностических титрах к сальмонеллам у больных ОКИ неустановленной этиологии при использовании различных серологических реакций

Возраст Кол-во проб Частота выявления антител при использовании сравниваемых методов(%) Р

РПГА РГЗА

3 мес. - 1год 57 3,5±2,4 17,5±5.0 <0.05

1 - 3 года 54 5,5±3,1 18,5+5.3 <0,05

3-15 лет 85 5,9±2,5 9,4±3,2 >0,05

Взрослые 80 5,0±2,4 11,3±3,5 >0,05

Всего 276 5,1±1.3 13,4±2,0 <0,001

Таблица 2. Сравнительная частота выявления диагностических титров противосальмонеллезных антител у больных с бактериологически подтвержденным сальмонеллезом при использовании РПГА и РГЗА

Возраст Кол-во проб Частота выявления диагностических титров антител при использовании сравниваемых методов (%) Р

РПГА РГЗА

3 мес. - 1год 59 42,4±5,8 66,1 ±6,2 <0,01

1 - 3 года 48 56,2±7,1 85,4±5,1 <0,001

3-15 лет 64 65.6±5.9 90,6±3.6 <0,001

Взрослые 72 80,5±4.6 93,1 ±3.0 <0.05

Всего 243 ! 62.6-3.1 84.0±2.4 <0.001

Определение частоты встречаемости специфических антител у 152 больных с бактериологически подтвержденным сальмонеллезом показало, что в РПГА диагностические титры противосальмонеллезных антител определялись, в среднем, у 2/3 обследованных. Аналогичный показатель при использовании РГЗА был в 1,3 раза (Р<0,001) выше.

Как видно из таблицы 2, частота обнаружения специфических антител в параллельно проводимых исследованиях в РПГА и РГЗА зависела от возраста больных.

При этом у взрослых больных были выявлены наиболее высокие показатели, которые превышали частоту обнаружения антител у детей в возрасте от 3-х до 15 лет в 1,2 раза (Р<0,05), от 1года до 3-х лет - в 1,4 раза (Р<0,01), от 3-х месяцев до 1 года - в 1,9 раза (Р<0,001). Наиболее выраженные достоверные отличия между показателями, полученными в РПГА и РГЗА, отмечались у детей в возрасте от 3-х месяцев до 1 года и от 1 года до 3-х лет (в 1,5 и 1,6 раза соответственно).

Средняя частота обнаружения диагностических титров противосальмонеллезных антител составила в РПГА 62,6%, увеличиваясь у взрослых до 80,5% и уменьшаясь до 42,4% у детей в возрасте до 1 года; в РГЗА она была достоверно выше и превышала 80%, увеличиваясь у взрослых до 93,1% и снижаясь до 66,1% у детей в возрасте до 1 года. Вышеперечисленные данные свидетельствуют о том, что РГЗА обладает достаточной специфичностью и чувствительностью. Аналогичные результаты по чувствительности РПГА при сальмонеллезе получены и другими авторами (Войтенковой Е.В., 1988; Буаро М.И., 1989; Милютиной JI.H., 1993; Васильевым B.C. с соавт., 1994; Szych J.,1993; Sharma М. et al., 1997).

При сопоставлении показателей среднегеометрических титров противосальмонеллезных антител, выявленных в РПГА и РГЗА, оказалось, что у больных дизентерией и кишечными инфекциями неустановленной этиологии имелась тенденция к увеличению этих показателей в сравнении со здоровыми (Р>0,05). Выявленное некоторое повышение средних геометрических титров у больных, по-видимому, обусловлено появлением у них в небольшом количестве перекрестно реагирующих антител. В то же время средние геометрические титры противосальмонеллезных антител у больных сальмонеллезом превышали аналогичные показатели в РПГА у здоровых и больных ОКИ несальмонеллезной этиологии соответственно в 5,4-4,1 раза ( в РГЗА - 6,3 и 4,9). При этом в РГЗА наиболее выраженные отличия, в 7 раз (Р<0,001), были у взрослых и детей старшего возраста, а наименьшие, в 4,7 раза (Р<0,001), у детей до 1 года.

Динамика величин среднегеометрических титров в течение заболевания также зависела от возраста больных ( рисунок 1). У детей в возрасте до 1 года максимальный уровень титров специфических антител был в 6,3 раз (Р<0,001) выше, чем у здоровых, и отмечался лишь на 4-й неделе заболевания. В дальнейшем наблюдалось постепенное снижение величин среднегеометрических титров. Динамика этого показателя у детей в

ю

0 1 2 3 4 5

Рисунок 1. Динамика среднегеометрических титров сывороточных антител в РГЗА у больных сальмонеллезом.

Условные обозначения:

Возрастные группы: - - Змее. - 1 год

- — - -1-3 года

- - - ■ - 3 - 15 лет

- - — - взрослые

Дни болезни: 1 - от 5 до 7 дней 2-от8 до 14

3 - от 22 до 28

4 - 29 и позднее

| ~ - величина титров у

здоровых

возрасте от 1 года до 3 лет соответствовала динамике у детей до 1 года, но максимальный титр у них выявлялся в конце 3 недели, превышая аналогичный показатель у здоровых в 6,5 раз (Р<0,001).

У больных старше 3 лет, как и у взрослых, динамика среднегеометрических титров была однотипной, но, в отличие от детей в возрасте до 3 лет, максимальный уровень их выявлялся уже на 2-й неделе заболевания и был в 7,5 раз (Р<0,001) выше сравниваемого показателя в группе здоровых и в 2 раза (Р<0,001) - в группе детей раннего возраста, больных сальмонеллезом. При этом показатели среднегеометрических титров в РГЗА были достоверно (в 1,2-1,5 раза) выше, чем в РПГА.

В последнее время многими исследователями доказана целесообразность применения методов экспрессной диагностики сальмонеллезов,

основанных на выявлении антигенов сальмонелл в различных биосубстратах (Черкасов В.Л. с соавт., 1993; Смирнов A.M. с соавт., 1995; Зем-скова Л.Н.. 1996; Mukheijee et al.. 1993; Jesudason M.V. et al., 1994; Pandya M. et al., 1995; Wegener H.C. et al., 1997). Однако до сих пор ведутся поиски более простых, чувствительных и специфичных, приемлемых для практического здравоохранения методов индикации антигенов сальмонелл.

Нами была апробирована РГЗА с антительным диагностикумом с целью выявления специфических антигенов в среде обогащения (селенитовом бульоне) через сутки после посева исследуемых фекалий. У здоровых людей антигены сальмонелл не были обнаружены. В то же время у больных с бактериологически подтвержденным сальмонеллезом антигены сальмонелл были выявлены в 96% случаев. Кроме того, с помощью РГЗА с антительным диагностикумом удалось повысить выяв-ляемость сальмонеллеза среди больных ОКИ с отрицательными результатами бактериологического исследования, обнаружив у 11 из 95 обследованных антигены сальмонелл. Используя в дальнейшем серологические методы исследования, удалось подтвердить диагноз сальмонеллеза у 10 из 11 больных ОКИ неустановленной этиологии, у которых в нативном материале были обнаружены антигены.

Учитывая тот факт, что постановка РГЗА с антигенным диагностикумом почти совпадает с техникой постановки РИГА, то стоимость анализов будет различаться лишь по цене применяемых диагностикумов. Расчёты показали, что экономический эффект использования гидрозольного антигенного диагностикума при постановке одного исследования составляет 3 доллара США. Если учитывать тот факт, что за 1 календарный год в бактериологической лаборатории Кировской городской инфекционной больницы проводится 1050-1100 серологических исследований на сальмонеллез, то при замене РПГА на РГЗА экономический эффект только по одной инфекционной больнице составит более 3000 долларов США.

Широко представленные в настоящее время питательные среды для выделения сальмонелл, приготовленные на основе мясных, казеиновых, рыбных, растительных и других гидролизатов и экстрактов, изготовляемых из ценного и дефицитного сырья, не всегда биологически эффективны и экономически выгодны (Родригес К. с соавт., 1993; Блинкова Л.П. с соавт., 1994). В связи с этим остаются актуальными исследования, направленные на поиск отходов промышленности (субпродукты, жмыхи или другие отходы производства), позволяющих снизить стоимость питательных сред и высвободить большие количества сырья, используемого на пищевые цели (Журбенко Р.С. с соавт., 1993; Санцевич Н.И. с соавт., 1994; Маслов С.А. с соавт., 1994; Критская И.В. с соавт., 1995).

Учитывая вышесказанное, нами были проведены исследования по комплексной оценке возмож*ности использования отходов пушного про-

п

изводства в виде мясо-костного фарша тушек пушных зверей (лисиц, норок, песцов) в качестве основы при приготовлении микробиологических питательных сред, применяемых для выделения сальмонелл.

Для изучения качества новых питательных сред исследовано 3 серии агаровой основы, приготовленной из панкреатического гидролизата мясо-костного фарша тушек пушных зверей. В качестве контроля использовалась агаровая питательная основа, приготовленная из панкреатического гидролизата мяса крупного рогатого скота.

Сравниваемые питательные среды почти не отличались друг от друга по основным показателям, характеризующим их качество, в частности, по содержанию общего азота и аминного азота (в опытной питательной основе - 1030 мг% и 660 мг% соответственно, в контрольной - 1100 мг% и 690 мг%).

При анализе аминокислотного состава было установлено, что сравниваемые гидролизаты незначительно отличались по содержанию аминокислот, лишь концентрация аспарагиновой и глутаминовой аминокислот, а также тирозина в контрольных исследованиях была в 2-4 раза выше, чем в опытных.

Сопоставляя показатели содержания регуляторных факторов клеточного роста (пептидов) в опытных и контрольных гидролизатах, мы не обнаружили в них существенных отличий по пептидному спектру (таблица 3).

Таблица 3. Пептидный состав ферментативных гидролизатов мяса крупного рогатого скота и мясо-костного фарша тушек пушных зверей

№ фракции Молекулярная Содержание пептидов по фракциям в

масса (дальтон) гидролизатах (%)

из говяжьей вы- из мясо-костного

резки фарша тушек пуш-

ных зверей

1. 43 ¿±1,8 56,1±1,9

2. >2000 1,4+0,5 1,5±0,3

3. 0,5±0,2 0,8+0,3

4. 11,2±0,6 3,4+0,8

5. 11,3±1,0 9,4+1,2

6. 500-1600 13,4±1,1 15,5±0,9

7. 17,8+1,4 12,2±1,3

8. 80-300 1.2±0,3 1,1±0,2

сумма низкомолекулярных

пептидов фракции 5-7 42.5±1.2 37.1+1,3

Исключение составили фракции 1 и 4, в первой из которых содержание пептидов было в опытных пробах выше, чем в контрольных (в 1,3 раза), а в четвертой, наоборот, ниже (в 3.3 раза). Аналогичные результаты были получены и при изучении содержания ионов металлов, а также углеводного и жирнокислотного составов.

Следовательно, сопоставление химического состава сравниваемых питательных основ не выявило достоверных различий между ними по большинству параметров.

Следующим этапом нашей работы было изучение качества (8 серий) опытных сред Эндо и Плоскирева, приготовленных из новой питательной основы по общепринятым технологическим методикам. В качестве контрольных использовали коммерческие среды, приготовленные по прописям на этикетках. По составляющим компонентам, кроме питательной основы, опытные и контрольные среды не отличались между собой. Опыты ставили с патогенными и непатогенными микробами кишечной группы, при этом использовали полученные из ГИСК им. Л.А.Тарасевича музейные тест-штаммы сальмонеллы энтеритидис (269), сальмонеллы тифи-муриум (47), эшерихии коли (АТСС 25922).

В результате проведенных исследований по проверке качества опытных сред Эндо и Плоскирева было установлено, что через 16-20 часов термостатирования (при температуре 37°С) на чашках с высевами из одного и того же разведения вырастало близкое количество колоний возбудителя. Между числами колоний по посевам из разных разведений сохранялись правильные десятикратные соотношения.

Сопоставляя полученные результаты определения ростовых свойств опытных и контрольных питательных сред Эндо и Плоскирева, мы не выявили различия между сальмонеллами энтеритидис и тифимуриум. В то же время во всех разведениях микробов количество колоний кишечной палочки как на опытных, так и на контрольных средах было достоверно меньше, чем количество сальмонелл.

Кроме ростовых свойств новой питательной среды Плоскирева, также необходимо было изучить и ее ингибирующую активность в отношении непатогенных микроорганизмов кишечной группы. Для сравнения была использована среда Эндо, необладающая ингибирующими свойствами.

При определении ингибирующих свойств питательной среды Плоскирева в отношении тест-штаммов сальмонелл энтеритидис и тифимуриум нами было обнаружено, что при посевных дозах 500, 50, 5 м.т./мкл опытная среда Плоскирева в 1,2 раза больше задерживала рост сальмонелл энтеритидис и тифимуриум, чем опытная среда Эндо, а контрольная - в 1,1раза. Было установлено также, что во всех разведениях (Ю-5, Ю-6, Ю-7) микроорганизмов ингибирующая активность сред Плоскирева была более выражена (Р < 0,001) в отношении эшерихии коли, чем в отношении сальмонелл.

Исходя из полученных результатов, можно утверждать, что как контрольная, так и опытная среды Плоскирева, в сравнении со средами Эндо (опытной и контрольной), обладают умеренно выраженными ингиби-рующими свойствами в отношении сальмонелл и значительно выраженными - в отношении эшерихии коли.

При оценке качества сред Эндо и Плоскирева (опытных и контрольных) определяли также скорость формирования на них колоний и изучали культурально-морфологические признаки микроорганизмов, выросших на этих питательных средах.

Колонии различных штаммов сальмонелл на опытных и контрольных средах формировались за одинаковый промежуток времени (16 -20 часов) и не отличались между собой по культурально-морфологическим признакам. Однако на опытной среде Плоскирева диаметр колоний сальмонелл был в 1,5 раза больше, чем диаметр колоний эшерихии коли, при этом разница была достоверной. В то же время на контрольной среде Плоскирева размеры колоний тест-штаммов сальмонелл и эшерихии коли не имели достоверных различий. Как на опытной, так и контрольной средах Эндо диаметр колоний сальмонелл был в 1,22,1 раза больше, чем диаметр колоний эшерихии коли, хотя достоверных отличий не наблюдалось. Кроме того, диаметр колоний эшерихии коли на опытных и контрольных средах Плоскирева и Эндо достоверно не различался между собой.

Полученные данные по предварительной проверке качества опытных питательных сред Эндо и Плоскирева послужили основанием для использования их при проведении бактериологических исследований материала, полученного от больных (450 проб) острыми кишечными инфекциями. Все выделенные от больных штаммы сальмонелл характеризовались типичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствами, а серологическими исследованиями был установлен определенный серовариант (сальмонеллы энтеритидис и сальмонеллы тифимуриум). Высеваемость сальмонелл как на опытных, так и контрольных средах Плоскирева составила 8%. При этом 41,2% выделенных возбудителей составили сальмонеллы тифимуриум. При использовании как опытных, так и контрольных сред Плоскирева количество выделенных штаммов сальмонелл тифимуриум и энтеритидис было одинаковым. Высеваемость сальмонелл на опытных и контрольных средах Эндо была несколько ниже, по сравнению со средами Плоскирева, и составила 7,5%, хотя при этом достоверной разницы выявлено не было. Количество выделенных сальмонелл тифимуриум и энтеритидис при посевах как на опытные, так и на контрольные среды Эндо было одинаковым.

Нам представлялось целесообразным оценить также возможность использования мясо-пептонного агара, приготовленного на основе ферментативного гидролизата мясо-костного фарша тушек пушных зверей, для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам с

помощью метода стандартных бумажных дисков. Для этого были проведены исследования с тест-штаммом сальмонеллы энтеритидис (269), чувствительность которой определялась к широко распространенным антибиотикам (гентамицин, тетрациклин, ампициллин). Для контроля в этом опыте использовали мясо-пептонный агар, приготовленный на основе ферментативного гидролизата мяса крупного рогатого скота.

Исходя из полученных результатов исследований, было установлено, что опытная питательная среда не уступала по результативности контрольной. На фоне ровного "газона" культуры четко вьщелялись зоны ингибиции роста микроорганизма, при этом была выявлена адекватная чувствительность к антибиотикам тест-штамма сальмонеллы энтеритидис (269). Следовательно, опытная питательная среда может быть рекомендована для использования с целью определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом стандартных бумажных дисков.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые гидрозольные диагностикумы для серодиагностики сальмонеллезной инфекции, в которых в качестве носителя антигенов и антител используется оксид железа.

2. Реакция гидрозольной агглютинации с антигенным сальмонеллез-ным диагностикумом характеризуется экономичностью, простотой постановки, достаточной специфичностью и чувствительностью, что позволяет рекомендовать ее для серологической диагностики сальмонеллезов.

3. В результате проведенного обследования 152 больных сальмонел-лезом прослежена динамика накопления специфических антител в РПГА и РГЗА и определены оптимальные сроки проведения серодиагностики в зависимости от возраста пациентов.

4. Разработанная реакция гидрозольной агглютинации с антительным диагностикумом может быть использована для обнаружения антигенов сальмонелл в среде обогащения (селенитовом бульоне) через сутки после посева в нее исследуемого материала.

5. Предложенная для культивирования сальмонелл новая оригинальная питательная основа с использованием панкреатического гидролизата фарша тушек пушных зверей по своему химическому составу незначительно отличается от панкреатического гидролизата мяса крупного рогатого скота.

6. Питательные среды Эндо и Плоскирева, приготовленные на новой основе, по высеваемости, ростовым свойствам микроорганизмов и их культурально-морфологическим признакам практически не отличаются от традиционных сред и могут использоваться для бактериологической диагностики сальмонеллезов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Серологическое обследование с целью диагностики сальмонеллеза у взрослых и детей старшего возраста рекомендуется проводить на второй, у детей раннего возраста - в конце третьей и на четвертой неделях заболевания.

2. Реакцию гидрозольной агглютинации с антигенным диагностику-мом можно использовать в серологической диагностике сальмонеллезов.

3. В диагностике сальмонеллеза реакцию гидрозольной агглютинации с антительным диагностикумом целесообразно применять при исследовании предварительно обогащенных проб исследуемого материала, взятого от больных ОКИ.

4. В качестве основы питательных сред, применяемых для выделения и изучения сальмонелл, можно использовать панкреатический гидролизат мясо-костного фарша тушек пушных зверей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Григорович М.С., Золотарева Л.В., Золотарев Ю.В. Клиническая характеристика в сопоставлении с показателями местного иммунитета у детей, больных ротавирусной и ротавирусно-сальмонеллезной инфекцией // Материалы научной конференции "Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины. "Киров, 1997.-С. 200-202.

2. Левчук А.Б., Золотарева Л.В., Золотарев Ю.В. Изучение спектра антибиотикочувствительности клинических изолятов штаммов Salmonella enteritidis и Salmonella îyphimurium II Материалы научной конференции " Актуальные вопросы трансфузионной и клинической медицины". - Киров, 1997. - С. 213-215.

3. Григорович М.С., Золотарев Ю.В., Бондаренко А.Л., Калужских Т.Н., Егорова Т.В., Чемоданов A.C., Аббасова C.B., Рассохина Е.Л., Чудинова Т.А., Золотарева Л.В. Кгшнико-иммунологические особенности ротавирусной и ротавирусно-сальмонеллезной кишечной инфекции у детей // Тезисы III - го международного конгресса "Иммунореабилитация и реабилитация в медицине",- Эйлат, Израиль, 1997.-С. 43.

4. Золотарев Ю.В., Золотарева Л.В. Клинико-микробиологическая характеристика вне- и внутрибольничного сальмонеллеза у детей раннего возраста // Материалы научно-практической конференции "Региональные аспекты гигиены, эпидемиологии и здоровья населения",- Киров, 1997.-С. 95-97.

5. Золотарева Л.В.. Мешандин А.Г., Золотарев Ю.В. Совершенствование методов серологической диагностики сальмонеллезов

// Материалы научно-практической конференции "Региональные аспекты гигиены, эпидемиологии и здоровья населения". - Киров, 1997. -С. 81-83.

6. Золотарева Л.В., Мешанднн А. Г.. Золотарев Ю.В. Использование гидрозольных препаратов в качестве диагностикумов для выявления специфических антител к сальмонеллам // Материалы VIII съезда педиатров России.-М..1998. - С. 141.

7 Золотарева Л.В., Мешанднн А.Г., Золотарев Ю.В., Выявление специфических антигенов у детей, больных сальмонеллезом // Материалы VIII съезда педиатров России.-М.,1998. - С. 140.

Отпечатано РИО КГМИ. Тираж 115 экз.