Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование лабораторной диагностики сальмонеллезов групп A, B, C, D, E на основе иммунофлуоресцентного анализа

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шаронова, Елена Ивановна

Список основных сокращений

Введение

Глава 1.Основные методы выявления сальмонелл (обзор 11 данных литературы)

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Рабочая коллекция бактериальных культур

2.2. Антигены

2.3. Сыворотки

2.4. Диагностикумы

2.5. Флуоресцирующие конъюгаты

2.6. Экспериментальные животные

2.7. Серологические методы исследования

2.8. Иммунохимические и физико-химические методы

2.9. Стандартизация сальмонелл

2.10. Люминесцентная микроскопия

2.11. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Получение высокоактивных и специфичных 37 сывороток к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е

3.1. Приготовление комплексного антигена сальмонелл

3.2. Отработка оптимальной схемы иммунизации

Глава 4. Приготовление флуоресцирующих Fab-фрагментов 54 иммуноглобулинов

4.1. Оптимизация методики изоляции иммуноглобулиновой 54 фракции

4.2. Получение Fab-фрагментов иммуноглобулинов к 60 сальмонеллам групп А, В, С, D, Е

4.3. Приготовление флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е 4.4. Оценка диагностических возможностей флуоресци- 68 рующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов при индикации сальмонелл в материалах различного биологического происхождения

Глава 5. Перспективы использования флуоресцирующих Fab- 76 фрагментов иммуноглобулинов к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усовершенствование лабораторной диагностики сальмонеллезов групп A, B, C, D, E на основе иммунофлуоресцентного анализа"

Уровень заболеваемости сальмонеллезом не имеет тенденции к снижению, что в значительной степени актуализирует данную проблему [24, 134]. Для многих индустриально развитых стран сальмонеллез представляет серьезную проблему для практического здравоохранения и ветеринарной службы и остается одним из самых распространенных заболеваний, передающихся через пишу [155, 219].

В России заболеваемость сальмонеллезом в течение последних пяти лет сохраняет стабильность. Однако в отдельных регионах, в том числе в Пермской области, отмечен высокий уровень (83-104 на 100 тыс. населения) этой инфекции [86]. По данным Центра Госсанэпиднадзора в Пермской области, уровень заболеваемости сальмонеллезом за 20012002гг. превысил данный показатель по Российской Федерации на 74%. Наиболее подвержено заболеванию было детское население, особенно дети до первого года жизни.

1 - дети до года

2 - организованные дети 3-6 лет

3 - неорганизованные дети 3-6 лет

4 - школьники

5 - дети

6 - взрослые

Рис. 1. Уровень заболеваемости сальмонеллезом в разных возрастных группах на 100 тыс. населения в Пермской области в 2002 г.

По данным О.В. Бухарина [24], сальмонеллы являются биологически прогрессирующей группой микроорганизмов, в который и по сей день, идет интенсивное видообразование. В настоящее время выделено более 2500 сероваров от различных биологических видов. Высокая полиэтиологичность возбудителей данной инфекции, а также исключительная вариабельность клинического течения заболевания, многообразие клинических вариантов и схожесть клинического проявления с другими пищевыми токсикоинфекциями, значительно затрудняют диагностирование сальмонеллезов [126, 222].

В связи с этим особое значение приобретает разработка и усовершенствование экспрессных методов диагностики сальмонеллезов, в частности, методов, основанных на обнаружении клеток сальмонелл и их антигенов в материалах различного происхождения [35, 40, 94, 121, 196, 225].

Следует отметить, что арсенал таких методов достаточно разнообразен (метод импедансной микробиологии, хромато-масс-спектрометрический метод, полимеразная цепная реакция, радиоиммунологический анализ и др.), но широкое использование большинства из них затруднено из-за необходимости использования специального дорогостоящего оборудования и реагентов [87, 93, 164, 210, 207, 217]. Поэтому, в настоящее время, ведущее значение в подтверждении диагноза принадлежит бактериологическому методу индикации возбудителя. Однако, низкая чувствительность, продолжительность и трудоемкость данного метода, не удовлетворяют потребности практического здравоохранения, что обуславливает необходимость разработки новых более эффективных методов обнаружения сальмонелл [1,70].

Одним из наиболее доступных и высокочувствительных экспресс-методов индикации сальмонелл является прямой метод флуоресцирующих антител [120, 182]. Для реализации данного метода в практике применяются коммерческие флуоресцирующие иммуноглобулины к сальмонеллам групп А, В, D. Применение пМФА ограничено отсутствием коммерческих иммуноглобулинов к сальмонеллам групп С и Е, а также наведенной неспецифической флуоресценцией (ННФ), обусловленной эффекторными свойствами Fc-фрагментов интактных молекул флуоресцирующих иммуноглобулинов. Имеются сведения о том, что использование флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов для индикации других грамотрицательных бактерий способствует снижению ННФ и позволяет объективно и достоверно оценивать результаты пМФА [9, 52, 120].

Перечисленные выше предпосылки побудили нас к проведению настоящего исследования, целью которого явилась разработка поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е для усовершенствования диагностики сальмонеллезов на основе прямого иммунофлуоресцентного анализа.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать комплексный иммуноген Salmonella spp. с учетом биологических особенностей и серологической активности сальмонелл групп А, В, С, D, Е.

2. Подобрать оптимальные условия иммунизации, обеспечивающие получение специфических высокоактивных сывороток к сальмонеллам.

3. Разработать методику получения поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов на основе сывороток к Salmonella spp.

4. Оценить диагностическую значимость поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов для выявления сальмонелл групп А, В, С, D, Е в материалах различного биологического происхождения.

Научная новизна.

1. Разработаны критерии оценки качества антигенов сальмонелл групп А, В, С, D, Е и получен комплексный иммуноген Salmonella spp.

2. Рекомендована оптимальная схема иммунизации экспериментальных животных, обеспечивающая получение специфических высокоактивных сывороток к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е.

3. Модифицирован способ получения и оценена диагностическая значимость поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов для экспресс-индикации сальмонелл групп А, В, С, D, Е в материале различного биологического происхождения.

4. На основе иммунофлуоресцентного анализа с использованием поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов предложен способ выявления жизнеспособных и инактивированных клеток сальмонелл.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о способах повышения качества флуоресцирующих конъюгатов, предназначенных для экспресс-диагностики сальмонелл групп А, В, С, D, Е. Результаты исследования могут быть реализованы при конструировании специфических высокоактивных флуоресцирующих конъюгатов к другим представителям энтеробактерий.

Разработана технология приготовления поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов и положительно оценена их пригодность для обнаружения сальмонелла групп А, В, С, D, Е в образцах клинического материала и пищевых продуктов.

На основе полученных поливалентных флуоресцирующих Fabфрагментов иммуноглобулинов разработан оригинальный способ обнаружения жизнеспособных клеток сальмонелл групп А, В, С, D, Е (Приоритетная справка по заявке № 2003100475 от 8 февраля 2003 г на изобретение «Способ выявления жизнеспособных сальмонелл».)

Основные положения, выносимые на защиту

1. Высокоактивный комплексный антиген Salmonella spp., полученный на основе корпускулярных антигенов сальмонелл групп А, В, С, D, Е, пригоден в качестве иммуногена.

2. Иммунизация экспериментальных животных по разработанной схеме, предусматривающей внутримышечную и внутривенную аппликацию комплексного иммуногена Salmonella spp. и использование отдаленной реиммунизации, обеспечивает получение специфических высокоактивных антисывороток, пригодных для приготовления поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов.

3. Для получения поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов к сальмонеллам с сохранением их специфической активности на уровне исходных иммуноглобулинов целесообразно применение щадящего ферментолиза, предусматривающего снижение дозы папаина до 1 мг и восстанавливающего реагента цистеина до 0,1 мг.

4. Использование диагностического препарата, приготовленного на основе поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов, позволяет выявлять сальмонеллы групп А, В, С, D, Е и их антигены в материалах различного биологического происхождения.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Научно-практической конференции студентов и аспирантов Пермской сельскохозяйственной академии, 2000; Пленарном заседании Пермского общества

10 микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, 2001. Диссертационная работа апробирована на заседании Научно-технического совета ФГУП Минздрава РФ «Пермское НПО «Биомед».

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ и подана заявка на патент.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 10 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 241 литературный источника, из них 130 отечественных и 111 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шаронова, Елена Ивановна

ВЫВОДЫ

1. На основе корпускулярных антигенов сальмонелл групп А, В, С, D, Е разработан высокоактивный комплексный иммуноген Salmonella spp., сохраняющий иммуногенные свойства при воздействии формалина или термической обработки.

2. Впервые с использованием разработанной эффективной схемы гипериммунизации животных комплексным иммуногеном Salmonella spp. получены специфические высокоактивные антисыворотки, средняя величина титров которых в нМФА составляет 1:1280.

3. Установлено, что применение щадящего ферментолиза, предусматривающего снижение дозы папаина до 1 мг и восстанавливающего реагента цистеина до 0,1 мг, обеспечивает получение поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов с сохранением их специфической активности на уровне исходных иммуноглобулинов.

4. На основе полученных поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов разработан диагностический препарат, позволяющий успешно выявлять сальмонеллы групп А, В, С, D, Е и их антигены в материалах различного биологического происхождения.

5. Предложен оригинальный способ выявления жизнеспособных и инактивированных клеток сальмонелл с использованием полученных поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов.

Заключение

Проблема разработки и усовершенствования флуоресцирующих конъюгатов для экспресс-диагностики сальмонеллеза является актуальной и социально значимой задачей. Ее реализация сопряжена с решением ряда вопросов научно-теоретического и прикладного характера. С одной стороны, это обусловлено необходимостью решения вопросов получения высококачественного иммунологического сырья, которое во многом определяет качество флуоресцирующих препаратов, и оптимизации способов получения последних. С другой стороны - изучением функциональных свойств иммуноглобулинов к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е, получением и характеристикой флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов, перспективных для использования в качестве флуоресцирующих конъюгатов для экспрессного выявления возбудителя.

Прежде чем перейти к реализации поставленных вопросов, необходимо было провести анализ эпидемиологической структуры сальмонеллезов и определить доминирующие группы и виды сальмонелл, наиболее часто являющих причиной заболевания. При изучении литературных источников по данному вопросу установлено, что в этиологической структуре сальмонеллезов превалируют несколько видов сальмонелл, относящихся к группам В, С, D, Е - Salmonella typhimurium (В), S. enteritidis (D), S. panama (D), S. infantis (Ci), S. newport (C2), S. agona (B), S. derby (B), S. london (E). При этом на фоне доминирования этиологической частоты обнаружения S. enteritidis, заслуживает внимания факт увеличения заболеваний, вызванных сальмонеллами С и Е [59].

Из всего многообразия методов, предложенных для выявления сальмонелл, в практике наиболее широко используются метод, основанный на импедансных технологиях, бактериологический метод и метод флуоресцирующих антител с использованием коммерческих флуоресцирующих иммуноглобулинов.

Из указанных методов только МФА обладает достаточной серологической специфичностью и экспрессностью. Однако диагностические возможности коммерческих флуоресцирующих иммуноглобулинов ограничены выявлением возбудителей лишь трех групп сальмонелл (А, В, D). Кроме того, выявление сальмонелл в материалах различного биологического происхождения с использованием интактных молекул флуоресцирующих иммуноглобулинов, нередко затруднено вследствие наведенной неспецифической флуоресценции (ННФ), одной из причин которой являются эффекторные свойствами Fc-фрагментов целой молекулы иммуноглобулинов. Исходя из данных литературы, ННФ гетерологичных структур объекта исследования снижает достоверность МФА [10, 32]. Учитывая негативные проявления эффекторных функций у целых молекул иммуноглобулинов, представлялось целесообразным исследовать возможность получения флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е, изучить их специфические свойства и наметить перспективы их практического использования.

В работе по получению высокоактивных сывороток к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е первостепенное значение мы придавали качественным и количественным параметрам иммуногенного материала. В процессе изучения в PPLAr активности 21 серии корпускулярных антигенов, инактивированных различными способами, было установлено, что они специфичны, но обладают разной серологической активностью (от 1:4 до 1:1024). С целью достоверной и полной оценки активности антигенов была применена система сопряженных методов исследования РНГА-РНАт. В РНГА с иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и РНАт с антигенными эритроцитарными диагностикумами величина титров антигенов была сопоставимой (R=0,91).

В процессе экспериментов значительное внимание было уделено полноте очистки взвесей сальмонелл от агаровых примесей, которую проводили путем дифференциального центрифугирования, после чего взвеси стандартизовали по оптическому стандарту мутности. В дальнейших исследованиях показано, что между концентрацией сальмонелл и их специфической активностью существует относительная корреляционная зависимость. Исходя из этого, стандартизацию антигенов проводили по количеству сальмонелл в 1 мл и специфической активности. Таким образом, нами был введен стандартизационный тест для отбора иммуногенного материала - система сопряженных реакций РНГА - РНАт и концентрация сальмонелл в 1 мл. Критериями отбора антигенов для иммунизации являлись величина титра антител в РНГА и РНАт, соответствующая не менее 1:128, и концентрация сальмонелл соответствующая 1x109 клеток/мл.

Решение методического вопроса стандартизации антигенов позволило применить объективные критерии по составлению и выбору оптимальных рецептур антигенов, используемых для получения высококачественного иммунологического сырья. В исследованиях применены комплексные иммуногены Salmonella spp., приготовленные из формалинизированных антигенов (КАС-1) и антигенов, подвергнутых термообработке (КАС-2 и КАС-3).

Получение высокоактивных и специфичных сывороток является во многом индивидуальной и трудоемкой задачей, о чем свидетельствует многообразие предложенных способов аппликации иммуногенного материала и схем иммунизации животных [76, 60, 106]. В основе исследований по получению иммунных сывороток к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е была использована схема иммунизации кроликов, предложенная Р.Б. Гольдиным и соавт. [32] для получения высокоактивных флуоресцирующих конъюгатов к грамотрицательным микроорганизмам (риккетсиям и хламидиям). Схема включала два основополагающих принципа получения высококачественных иммунных сывороток - первичную иммунизацию и отдаленную реиммунизацию. Оригинальная схема предусматривала две внутримышечные инъекции с интервалом в 6 дней на первом этапе и 3 внутрибрюшинные инъекции с интервалом 3 дня на втором этапе, при этом оптимум интервала между этапами иммунизации регламентировался снижением титра антител до Vio - V20 от максимального уровня.

В процессе отработки схем иммунизации и оценки разных способов аппликации материала (внутривенное, внутримышечное, подкожное), оптимальные результаты были достигнуты при сочетании внутривенного и внутримышечного введения иммуногена кроликам. В результате проведенных исследований нами была модифицирована схема иммунизации, предложенная Р.Б. Гольдиным, применительно к другой группе грамотрицательных микроорганизмов - сальмонеллам. При изучении влияния разных способов инактивирования иммуногена на интенсивность антителообразования наиболее эффективной была признана рецептура, состоящая из комбинации сальмонелл групп А, В, С, D, Е, инактивированных термообработкой, специфическая активность которых в РНГА и РНАт составляла не менее, чем 1:128, и количеством сальмонелл 1x109 клеток/мл. Использование удвоенной дозы иммуногена (КАС-3) на стадии реиммунизации реализовалось лишь в незначительном повышении титра специфических антител.

Серологическое исследование 30 иммунных сывороток, полученных по модифицированной схеме, показало, что они обладали достаточной специфичностью и активностью. Так, в РНГА с комплексным сальмонеллезным антигенным эритроцитарным диагностикумом большинство из них имели титр от 1:840 до 1:4850, с антигенными эритроцитарными диагностикумами к Shigella sonnei и Shigella flexneri и псевдотуберкулезным антигенным эритроцитарным диагностикумом были получены отрицательные результаты.

По данным ряда авторов, минимальная величина титра сывороток в непрямом методе флуоресцирующих антител (нМФА) оценивается неоднозначно и соответствует от 1:400 до 1:640. Проведенные исследования подтвердили, что свойства сывороток, предназначенных для пМФА, определяются уровнем их иммунологической активности в нМФА. Исследование полученных сывороток в нМФА выявило менее высокую активность - 1:121-1:230. В дальнейших экспериментах было установлено, что конъюгаты, приготовленные из данных сывороток, имеют низкий красящий титр -1:2-1:4.

Иные результаты были получены при изучении сывороток, полученных на стадии реиммунизации. При изучении серологической активности таких сывороток была установлена их более высокая активность и в РИГА, и в нМФА. Так, при оценке сывороток в нМФА отмечался рост титров антител до 1:1280 - 1:2560. Красящий титр, приготовленных из этих сывороток конъюгатов, соответствовал 1:32-1:128. На основании полученных данных установлено, что для приготовления высокоактивных флуоресцирующих конъюгатов, пригодно иммунологическое сырье, взятое на этапе реиммунизации с активностью в нМФА не ниже 1:1280.

Высокий уровень антител регистрируемых в РГНА как в иммунных, так и реиммунных сыворотках (1:12800 - 1: 181000), позволил предположить, что наряду с 78-иммуноглобулинами в сыворотке присутствуют 198-иммуноглобулины. Изучение взаимосвязи фракционного состава и серологической активности было проведено методом гель-хроматографии на сефадексе G-200. Из сывороток были выделены три изолированные фракции: 7S- (IgG), 19S- (IgM), 4,5S-(альбумин). При серологическом анализе фракций в РНГА обнаружена активность во фракциях 19S- и 78-глобулинов в сопоставимых величинах, что подтвердило наши предположения.

Не исключено, что выявленная особенность антителообразования при использовании разработанной схемы иммунизации обусловлена антигенной структурой сальмонелл. Эти данные согласуются с результатами исследований Л.Б. Богоявленской [14] и Р.Б. Хаитова [119]. Полученные данные о присутствии 19S и 7S иммуноглобулинов были учтены нами при изоляции из сывороток фракции, несущей специфическую активность, но свободную от альбумина и а-глобулина.

Принципиально важным моментом исследования явилось выделение специфически активного сырья из сыворотки без применения реагентов, вызывающих денатурацию иммуноглобулинов. В связи с этим для выделения антителосодержащей фракции были использованы щадящие методы, а именно метод выделения эуглобулиновой фракции и гель-хроматографии, солевой метод фракционирования сернокислым аммонием, которые отличаются методической простотой и необходимой эффективностью.

В процессе исследования доказана эффективность солевого фракционирования иммуноглобулинов. При отработке условий выделения антителосодержащей фракции иммуноглобулинов были испытаны различные концентрации сернокислого аммония в диапазоне от 28% до 50% насыщения и температурные режимы 4°С- 10°С и 20°С - 25°С, при различной временной экспозиции. Установлено, что наибольший эффект достигался при 34% концентрации сернокислого аммония и временной экспозиции в течение 30 минут при 20- 22°С, при которых наблюдалось 3-4х кратное увеличение удельной активности препарата.

Специфическую активность выделенных иммуноглобулинов оценивали в различных серологических тестах: РНГА с комплексным и групповыми сальмонеллезными антигенным эритроцитарным диагностикумами; в нМФА и РНАг. Показано, что выделенные иммуноглобулины специфически реагировали во всех указанных серологических реакциях в титрах сопоставимых с исходной сывороткой.

Значительный раздел нашей работы был связан с получением Fab-фрагментов иммуноглобулинов, изучением их функциональных свойств и приготовлением флуоресцирующих конъюгатов на их основе. В исследованиях по получению Fab-фрагментов нами были использованы основные принципы метода, предложенного Барбаном П.С. [10] для приготовления флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов к риккетсиям. При изучении возможности использования этого метода для получения Fab-фрагментов из иного иммунологического сырья -кроличьих иммуноглобулинов к сальмонеллам установлено, что папаин полностью расщепляет их до моновалентных фрагментов, что подтверждено данными иммуноэлектрофореза. Вместе с этим, при серологическом анализе полученных ферментатов в системе сопряженных серологических реакций зафиксировано снижение их специфической активности, что обусловило изменения методики ферментативного гидролиза.

В ходе отработки условий ферментолиза были испытаны различные дозы папаина, концентрации белка в субстрате и восстанавливающего реагента - цистеина, продолжительность ферментолиза иммуноглобулинов. В результате проведенных опытов был разработан оптимальный методический вариант протеолиза иммуноглобулинов папаином соответствующий концентрации белка 3%, цистеина - 0,1 мг на 10 мг белка, папаина 1мг на 100 мг белка и экспозиции в течение 16-18 ч. Иммунохимическое и физико-химическое изучение субстрата методами иммуноэлектрофореза и электрофореза в полиакриламидном геле показало отсутствие полных иммуноглобулинов и наличие фрагментов с суммарной молекулярной массой 55000 Да, что указывало на исчерпывающий характер ферментативного гидролиза.

В результате серологического тестирования ферментата в системе сопряженных серологических реакций показано наличие в РНАг специфической активности сопоставимой с активностью исходных иммуноглобулинов, что свидетельствовало о сохранении специфической активности в процессе гидролиза папаином. Отрицательные результаты, полученные при изучении ферментата в РНГА, свидетельствовали об отсутствие полных иммуноглобулинов. Данные, подтверждающие высокую активность ферментированных иммуноглобулинов, выделенных по разработанной методике, были получены также при оценке их в нМФА.

Таким образом, установлено, что разработанный метод щадящего ферментолиза, обеспечивает получение поливалентных Fab-фрагментов иммуноглобулинов с сохранением их специфической активности на уровне исходных иммуноглобулинов.

Следующим этапом наших исследований явилась метка приготовленных Fab-фрагментов иммуноглобулинов флуоресцентным красителем. При выполнении данного этапа исследования были апробированы два способа получения флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов. Один из них основан на получении ферментированных иммуноглобулинов с их последующей конъюгацией с флуоресцентным красителем и выделением флуоресцирующих Fab-фрагментов. В другом случае ферментативное расщепление иммуноглобулинов проводили после метки иммуноглобулинов флуорохромом. Отработка методики получения флуоресцирующих Fab-фрагментов была проведена на 30 реиммунных кроличьих сыворотках.

В ходе исследований было установлено, что лучшие результаты обеспечивал первый методический вариант. При этом зарегистрировано, что оптимальным способом приготовления моновалентных иммуноглобулинов является конъюгации ферментата с концентрацией белка 2-2,5% и ФИТЦ из расчета 2,5 мг красителя на 1000 мг белка в течение 16-18 ч при температурном режиме 4-8°С и рН 8,9.

Зафиксировано, что при фракционировании меченного ферментата на сефадексе G-100 наблюдалось разделение на 3 фракции. При их серологическом анализе было установлено, что вся специфическая активность сосредоточена во П-й фракции, тогда как 1-я и III-я фракции -оказались серологически "немыми". Сопоставление полученных данных с учетом серологического и иммунохимического анализов с известными данными литературы [57, 81, 194, 213, 214], позволили отождествить белки П-й, серологически активной фракции, с флуоресцирующими Fab-фрагментами.

Развернутая характеристика иммунофлуоресцентной активности флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов, была получена в результате их исследования в пМФА с корпускулярными антигенами энтеробактерий гетерологичных видов и сальмонеллами групп А, В, С, D, Е, приготовленных из штаммов, доминирующих на территории Пермской области и штаммов, циркулирующих на территории России. Установлено, что полученный препарат специфичен и обеспечивает индикацию сальмонелл указанных групп, в красящем титре 1:32-1:128.

На заключительном этапе были проведены исследования по стабилизации свойств полученного препарата методом лиофильного высушивания, обеспечивающее сохранение специфических свойств. Выявлено, что процесс лиофилизации не влиял на биохимические свойства и иммунофлуоресцентную активность препарата.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана и экспериментально обоснована методика приготовления флуоресцирующих Fab-фрагментов на основе иммуноглобулинов кролика, согласно которой, получено 11 серий сухого препарата.

Положительные результаты, полученные при лабораторной оценке полученного препарата, позволили перейти к следующему разделу работы, связанному с изучением вопросов практического применения флуоресцирующих Fab-фрагментов в клинической практике и ограниченном эпидемиологическом опыте. Эталонами сравнения служили коммерческие флуоресцирующие иммуноглобулины к сальмонеллам групп А, В, D и бактериологический анализ.

Диагностические возможности препарата были оценены при изучении материала, полученного от 390 больных ОКИ (фекалии и моча). При сравнительном исследовании образцов в пМФА с использованием разработанного препарата и коммерческих флуоресцирующих иммуноглобулинов в 25 пробах были обнаружены сальмонеллы, из них 19 проб подтверждены бактериологически с выделением S.enteritidis.

Высокая специфичность флуоресцирующих Fab-фрагментов была подтверждена при индикации сальмонелл в пищевых продуктах. Так, при исследовании 243 образцов пищевых продуктов положительный результат в пМФА с использованием обоих флуоресцирующих конъюгатов был зарегистрирован в семи случаях. Бактериологическим методом в четырех из них идентифицированы S. enteritidis (группа D) и S. isangi (группа С).

Анализ результатов собственных исследований обратил наше внимание на тот факт, что количество проб положительных в пМФА, всегда превышает таковые при бактериологическом методе. Указанное различие могло быть обосновано как низкой чувствительностью бактериологического анализа, так выявлением в исследуемых пробах помимо живого возбудителя и инактивированных сальмонелл [70, 122, 148].

Это побудило нас к модификации методики выявления сальмонелл и разработке метода, обеспечивающего обнаружение живых сальмонелл. Нами предложен способ выявление жизнеспособных клеток сальмонелл, основанный на сочетании методов подращивания сальмонелл, иммуносорбции и иммунофлуоресцентного анализа (на способ подана заявка на патент и получена приоритетная справка).

В экспериментах установлено, что в материалах, содержащих убитые антигены, количество микроорганизмов, выявляемое в модифицированном методе пМФА, остается практически одинаковым как в исходных пробах, так и в пробах со средой подращивания. Напротив, в пробах содержащих живой возбудитель, отмечали десятикратное и более увеличение количества сальмонелл в пробах со средой подращивания по сравнению с исходной пробой. Достоверность полученных результатов с живым возбудителем была подтверждена бактериологическим методом.

Вышеизложенные данные позволили сделать вывод о том, что с помощью предложенного способа можно проводить дифференциацию живых и инактивированных клеток сальмонелл.

На основании проведенных исследований исследования была разработана технология получения флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е. На препарат оформлена нормативно-техническая документация в виде экспериментально-производственного регламента, рассмотренного научно-техническим советом НПО «Биомед», Фармакопейная статья предприятия и Инструкции по применению препарата.

Оценивая проведенное исследование, следует указать, что они обосновывают перспективность разработки аналогичных препаратов и их практического использования для диагностики других таксономических групп семейства Enterobacteriaceae.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шаронова, Елена Ивановна, Пермь

1. Абдурахманов Л.Г., Ющук Н.Д., Шабалдин С.В., Абдурахманова Э.Г. Современные методы иммунологической диагностики брюшного тифа//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1990. - N. 11.-С. 95-100.

2. Аксенов Н.Ю., Гаровнинова Ю.С., Левина Г.А. и др. Использование полимеразной цепной реакции для изучения перехода клеток S. typhimurium в некультивируемое состояние//Молек. генетика. -1994. -N.2.-С. 17-21.

3. Андреева З.М., Шобухова Т.С. Использование теста ONPG для (3-галактозидазной активности бактерий рода Salmonella/УЖурн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1974. -N.6. - С. 19-22.

4. Андреева З.Н., Лавровская В.М., Богоявленская Л.Б., Соколова К.Я. и др. Система индикационная бумажная для идентификации энтеробактерий//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1983. -N.4. С. 20-23.

5. Арбузова В.А. Сальмонеллезы//В кн.: Частная эпидемиология. Л., 1977.-С. 17-33.

6. Ахмедов A.M. Сальмонеллезы молодняка. М.: Колос, 1983. - 240 с.

7. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. - 145 с.

8. Бабков В.В., Федорова З.Ф. Селекция колицинами S-форм некоторых представителей семейства Enterobakteriaceae//KnHHH4. лаб. диагностика. 1995. - N.2 - С. 40-41.

9. Барбан П.С. К вопросу о классификации наведенного свечения в иммунофлуоресценции//Тезисы докладов итоговой научной конференции ПНИИВС, Пермь 1984. - С. 15.

10. Барбан П.С. Fab-фрагменты антител как основа антимикробных иммуноглобулиновых препаратов: Автореф. дис. . докт. мед. наук. -Москва, 1980.-35 с.

11. Белая О.Ф., Опалейчук И.С., Гореллов A.JI. Сравнительная характеристика различных методов при диагностике брюшного тифа//Тезисы докладов VI Всерос. Съезда микробиол., эпидемиол. и паразитологов. 1991.-Т. 1.-С. 61.

12. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования М.: Медицина, 1982. -462 с.

13. Бобоева Б.Р., Молочаева И.С., Каримова Д.Х. Выделение сальмонелл из сточных вод инфекционных больниц//Журн. Здравоохранение Таджикистана. 1987. - N.6. - С. 28-30.

14. Богоявленская Л.Б. Изучение 7S- и 198-антител в диагностических сыворотках//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1967. -N. 11.-С. 142-147.

15. Богоявленская Л.Б., Андреева З.М., Ландсман Н.М. Некоторые принципы получения специфических неадсорбированных сальмонеллезных сывороток//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1969. -N. 12. - С. 104-109.

16. Бондарев Л.С., Жидких В.Н., Заплотная А.А., Солоникиди А.Н. Клиническая картина генерализованных форм сальмонеллеза //Терапевтический архив. 1996. - N.4. - С. 73-74.

17. Брильман Я.Е. Дополнительный тест для идентификации бактерий семейства Enterobakteriaceae и некоторых клинических представителей рода Vibrio//JIa6. диагностика 1995. - N.3. - С. 7-9.

18. Буаро М.И. Оценка современных серологических методов диагностики сальмонеллезов: Автореф. дис. . кан. мед. наук. -Москва, 1989.- 13 с.

19. Бузалева JI.C. Применение бентонитовых глин в качестве сред накопления для энтеробактерий//Клин. лабораторная диагностика. -2001. N.6. - С. 47-50.

20. Бурик В.В. Видовой состав, биохимические и адгезивные свойства сальмонелл Дальнего Востока//Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 26-28 марта 2002. Москва, 2002. - Т. 1. - С. 143-144.

21. Бутов Ю.С. Реакция иммунофлуоресценции в диагностике красной волчанки//Вестник дерматол. и венерол. 1982. - N. 7. - С. 30-36.

22. Бухарин О.В., Каган Ю.Д., Бурмистрова A.JI. Сальмонеллы и сальмонеллезы. Екатеринбург, 2000. - 256 с.

23. Быкова О.И., Алексеев В.В., Голосеев Ю.А. Выбор оптимальной техники иммунофлюоресцентного окрашивания с помощью микрофлюорометрии//Лаб. дело 1984. -N.9. - С. 562-564.

24. Вайсман И.В., Кудрявцев Ю.В., Хацуков К.Х. Некоторые эпидемиологические аспекты заболеваемости сальмонел-лезами//Материалы VIII съезда Всероссийского обществаэпидемиологов, микробиологов и паразитологов 26-28 марта 2002. -Москва, 2002. Т. 1.-С. 17-18.

25. Валиев А.Г. Комплексная серологическая диагностика сальмонеллезов: Методические рекомендации МЗ УзССР Ташкент, 1988.- 18 с.

26. Войтенкова Е.В., Стрелкова М.Р., Жукова Е.А., Хазенсон Л.Б. Использование реакции нейтрализации антител и коагглютинации в диагностике сальмонелл езов//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1992. - N.3. - С. 119-120.

27. Воробьева З.Г., Фокина Е.Г. Экспериментальные основы реакции латекс-агглютинации//Клин. лабораторная диагностика. 1992. - N.7. -С. 60-62.

28. Гинцбург A.JI. Гемодинамика инфекционных заболеваний//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1998. - N.3. - С. 86-95.

29. Григорович М.С., Золотарев Ю.В., Зайцева Г.А. Антигенная структура HLA-комплекса гистосовместимости при ротавирусной инфекции и сальмонеллезах у детей//Журн. эпидемиол. и инфекц. болезни 2001. -N.2.-C. 22-24.

30. ГореловА.Л., Левина Г.А., Прозоровский С.В. Выявление антигенемии у больных брюшным тифом в разные периоды течения инфекции//Журн. эпидемиол. и инфекц. болезни 1989. - N.12. - С. 33-35.

31. Доклад Комитета Экспертов ВОЗ. Борьба с сальмонеллезом: роль ветеринарии и пищевой гигиены. Женева, - 1991. - С. 66.

32. Душкин Е.А. Применение метода флуоресцирующих антител с эритроцитарным иммуносорбентом в клинических и эпидемиологических исследованиях при клещевом энцефалите: Автореф. дис. . кан. мед. наук. Пермь, 1998. - 24с.

33. Дьяков С.И Метод иммунофлюоресции в диагностике инфекционных заболеваний. М.: Медицина, 1964. - 184 с.

34. Заславский Б.А., Вакараш Н.А., Пономарева Г.И. Выделение сальмонелл в ассоциации с другими представителями энтеробактерий из воспалительных очагов необычайной локализации//Журн. здравоохранение. Кишинев - 1987. - N.6. - С. 28-30.

35. Золотарев Ю.В., Мешалдин А.Г., Золотарева Л.Б. Серологическая диагностика сальмонеллезов//Клин. лабораторная диагностика. 2001. -N.1.-C. 52-54.

36. Золотарева Л.В. Совершенствование методов бактериологической и серологической диагностики сальмонеллезов: Автореф. дис. кан. мед. наук. Пермь, 1998. - 18 с.

37. Золотарева Л.В., Мешалдин А.Г., Золотарев Ю.В., Семченкова О.В. Применение реакции гидрозольной агглютинации в диагностике сальмонеллезов/ТВопросы трансфуз. и клинич. мед. Материалы конференции молодых ученых. Киров, 1999. - С. 98.

38. Зубжицкий Ю.И. Метод люминесцентной микроскопии. JL: Медицина, 1964. - 152 с.

39. Зуева Л.Г. Применение РИГА и иммунофлуоресцентного метода для диагностики дизентерии Зонне//Журн. микробиол. 1970. - N.7. - С. 133-136.

40. Иванова С.П. Распознавание бактерий тифо-паратифозной группы при помощи флуоресцирующих антител//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1960. - N.l 1. - С. 25-29.

41. Каральник Б.В. Вопросы серологической диагностики//Сб. научн. трудов Казахского НИИ эпид. микроб, и инфекц. болезней. Алма-Ата, 1979.-156с.

42. Каральник Б.В., Ли В.Г., Денисов Г.И. Определение при помощи реакции пассивной гемагглютинации антигенов Salmonella typhimurium в выделениях детей, больных сальмонеллезом//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1988. -N.9. - С. 39-43.

43. Каральник Б.в., Денисова Т.Г., Абдурахманов Л.Ш. О серологической диагностике сальмонеллезов группы В//Клин. лабораторная диагностика. 1991. - N.7. - С. 52.

44. Каральник Б.В., Еркинбекова Б.К., Грушина Т.А. Ускоренная идентификация бактерий агглютинацией на стекле эритроцитов, сенсибилизированных антителами//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. -N. 3. - С. 74-77.

45. Карягина Е.И., Войтенкова Е.В., Смирнова Г.В. Использование иммунофлуоресцентного метода для ускоренного обнаружения сальмонелл в стационаре/Юстрые кишечные инфекции. 1982.-Вып.6. - С. 144-147.

46. Корн М.Я. Методика люминесцентной микроскопии//В кн.: Метод иммунофлюоресценции в диагностике инфекционных заболеваний -М., 1962.-С. 12-18.

47. Корнилова И.И., Маркова Е.А., Шаханина К.Л. Метод флуоресцирующих антител в распознавании сальмонеллезов//Сов. мед. 1974.-N.10.-С. 110-114.

48. Кошанова Н.И., Буштина Н.Г., Матвеева А.В. Использование люминесцентных сывороток для обнаружения брюшнотифозных бактерий в крови. Труды ВДУВ. М., 1964. - N.68. - С. 77.

49. Кротова М.Л. Совершенствование серологической диагностики сальмонеллезов с помощью иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации: Автореф. дис. . кан. мед. наук. Пермь, 2001. -21 с.

50. Кульберг А.Я. Молекулярные основы функций иммуноглобулинов// Успехи современной биологии. 1973.- Вып. 1 - С. 110-131.

51. Лазарева Е.Б., Залогуева Г.В., Никифорова Л.Н., Меньшиков Д.Д. Сравнительная оценка двух тест-систем для идентификацииэнтеробактерий//Клин. лабораторная диагностика. 1994. - N.1. -С. 50-52.

52. Левина Е.Н., Гольдин Р.Б., Носков Ф.С. Метод люминесцирующих антител//В кн.: Люминесцирующие антитела. М., 1972. - С. 19-30.

53. Литвин В.Ю., Пушкарева В.И., Солохина Л.В. и др. Эколого-генетические механизмы перехода Salmonella Typhimurium в покоящемся состоянии в окружающей среде//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2001.-N.6. С. 32-36.

54. Лифатова И.И., Михайлов И.Ф., Покровский В.И., Венгеров Ю.Я. Идентификация N. meningitides в ликворе больных менингококковой инфекцией методом флуоресцирующих антител//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1972. - N.l 1. - С. 51-54.

55. Литинский Ю.И., Герок Г.И., Годованный Б.А. Экспериментальное изучение чувствительности реакции энзим меченных антител и реакции коагглютинации при обнаружении антигенов шигелл и сальмонелл в моче//Лабораторное дело 1985. - N. 7. - С. 434-436.

56. Литинский Ю. И., Герок Г.И., Головинова М.А. Оценка эффективности элективно-дифференциальных сред и их сочетание для выделения шигелл и сальмонелл//Лаб. дело 1988. -N.10. - С. 66-69.

57. Мальцева Г.Г. Получение Fab-фрагментов иммуноглобулинов кролика и использование их для приготовления оспенных диагностических препаратов: Автореф. дис. . кан. мед. наук. -Томск, 1985.-30 с.

58. Меклер Л.Б., Чибисова В.А., Фризюк С.Г., Наумова В.К. простой метод анализа флуоресцеин-белковых конъюгатов//Вопросы вирусологии. 1964. -N. 5. - С. 631-634.

59. Милютина Л.Н. К вопросу о диагностике современного сальмонеллеза у детей//Международный симпозиум «Пищевые зоонозы — сальмонеллезы, кампилобактерии, иерсиниоз, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики. М., 1995. - С. 4344.

60. Милютина Л.Н., Скопинская С.Н., Ярков С.П. Липосомальный иммуноанализ в диагностике сальмонеллезов у детей//Эпидемиолог. и инфекционные болезни. 1996. № 3. - С. 48-50.

61. Миролюбова Л.В., Двуречинская Г.С. Применение люминесцентно-серологического метода с целью диагностики брюшного тифа и паратифов//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1962 -N.10.-С. 3-7.

62. Мирский В.Я. ИФРМА как метод серологической диагностики сальмонеллезов: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Челябинск, 1981. -20с.

63. Миртазаев О.М., Кантемиров М.Р., Журавлев Н.Б., Норов Г.Х. Эпидемиологическая характеристика заболеваемости сальмонел-лезами в Узбекистане//Журн. эпидемиол. и инфекц. болезни 1997. -N.3. - С. 21-22.

64. Михайлов И.Ф. Флюоресцирующие антитела и методы их применения. -М.: Медицина, 1968. -185 с.

65. Михайлов И.Ф., Дьяков С.И. Люминесцентная микроскопия. — М.: Медгиз, 1961.- 223 с.

66. Михайлов С.П. Клинико-патогенетическое значение антилизоцимной активности возбудителя при сальмонеллезной инфек-ции//В кн.: Персистенция микроорганизмов. Куйбышев, 1987. - С. 50-57.

67. Мухамедов И.Б., Бабаходжаев С.Н., Мухитдинов И.М. Сравнительные лабораторные методы диагностики сальмонеллеза у детей раннего возраста//Актуальные вопросы кишечных инфекций: Тезисы докладов научн. практ. конференции. Ташкент, 1990. - С 39-40.

68. Нациашвили Э.Я., Жгенти Э.Н. Прямая и непрямая модификация метода флуоресцирующих антител при индикации энтеробактерий кишечных палочек в пробах внешней среды//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1970. -N.2. - С. 136-137.

69. Незлин Р.С. Строение и биосинтез антител. М.: Наука. 1972. - 312 с.

70. Никитин В.М., Георгица Ф.И., Нахаба В.А. Новые ускоренные методы индикации патогенных микробов. Кишинев, 1984. - 84 с.

71. Никитин В.М., Георгица Ф.И., Плугару С В. Ускоренные методы диагностики инфекционных болезней. Кишинев, 1987. - 106 с.

72. Носков Ф.С., Болдасов В.К., Гольдин Р.Б., Ермакова Н.В., Волкова J1.A. Контрастный способ иммунофлуоресцентного выявления аденовирусов в культуре клеток почки свиньи//Вопросы вирусологии 1965.-N.5.-С. 613-618.

73. Новгородская С.Д. Сероэпидемиологическая диагностика сальмонеллезов: Автореф. дис. . кан. мед. наук. -Н-Новгород, 1992. -16 с.

74. Онищенко Г.Г. О состоянии инфекционной заболеваемости в РФ в 2001 году и принимаемых мерах по ее стабилизации//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001.- N.5. - С. 3-7.

75. Осипов Г.Н., Демина A.M. Хромато-масс-спектрометрическая индикация микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах// Вестник РАМН 1996. - Т. 13. - N. 2 - С. 15-27.

76. Пак С.Г., Турьянов М.Х., Пальцев М.А. Сальмонеллез. М.: Медицина, 1988.-С. 150-167.

77. Пантюхина А. Н., Барбан П.С. Сравнительное изучение иммуноглобулинов к риккетсиям Провачека, ферментированных различными методами//В кн.: Лечебные сывороточные препараты -М., 1976.-С. 111-117.

78. Плахотя JI.П. Выживаемость сальмонелл в условиях эксперимента/ЛГигиена и санитария. 1984. - N.6. - С. 75-77.

79. Погорельская Л.В. Брюшной тиф и бактерионосительство (клинико-иммунологическое исследование): Автореф. дис. . док. мед. наук. -Москва, 1987.- 18 с.

80. Подунова Л.Г., Криволапова Н.С. Сорокина Р.С. и др. Ускоренный метод обнаружения и идентификации микроорганизмов при исследовании пищевых продуктов и продовольственного сырья// Эпидемиология и инфекционные болезни. 1996. - N.1. - С. 56-57.

81. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология М.: ГЭОГАР Медицина, 1999. - С. 363-378.

82. Покровский и др. Энтеробактерии. М.: Медицина, 1985. - 314 с.

83. Покровский В.И., Черкасский Б.Л. Сальмонеллезы. Методические рекомендации. М.: Медицина, 1995. - 221с.

84. Рощин Ю.М. Метод иммуноиндикации сальмонелл с помощью целлюлозно-кокковых антительных диагностикумов//Журн. здравоохранение. Кишинев - 1986. -N.2. - С. 10-14.

85. Руновская Т.П. Опыт использования ЭВМ для идентификации энтеробактерий//Клин. лабораторная диагностика. 1994. - N.4. -С. 37.

86. Савицкая К.И., Богоявленская Л.Б., Шаханина К.Л, Ракинская М.Н. Получение люминесцирующих антител к О-антигенам сальмонелл (из неадсорбированных сывороток)//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1973. - N.4. - С. 75-81.

87. Савицкая К.И., Черненькая Т.В. Использование микротест-систем для идентификации свежевыделенных клинических изолятов//Клин. лабораторная диагностика. 1996. - N.5. - С. 29-34.

88. Саторов С., Суворов А.Н. Идентификация сальмонелл методом экспресс-полимеразной цепной реакции//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - N.1. - С. 63-67.

89. Сергевнин В.И. Современные тенденции в эпидемиологии сальмонеллезной инфекции и научно-методические основы эпизоотолого- эпидемиологического надзора: Автореф. дис. . док. мед. наук. Омск, 1995. - 41 с.

90. Сергевнин В.И., Печугина Е.В., Поздеева Н.Д., Морилова М.С клинико-эпидемиологические маркеры S. enteritidisZ/Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993 - N.6. - С. 49-50.

91. Скала JI.3., Нехорошева А.Г., Поликарпова С.В. Сравнительное изучение эффективности коммерческих микротест-систем для идентификации микроорганизмов различных групп в клинической микробиологии/УКлин. лабораторная диагностика. 1996. - N.5. -С. 35-38.

92. Смирнов В.В., Чаплинский В .Я. Андреева З.М., Богоявленская Л.Б. Научные основы производства диагностических препаратов Киев: Наукова думка. - 1980. - 234 с.

93. Смирнов A.M., Подлевский А.Ф. Микробиологические основы инфекционных заболеваний. -М.: Медицина, 1979. С. 34-43.

94. Смирнова Г.В. Сравнительная оценка трех методов выявления сальмонелл группы В в эксперименте/Юстрые кишечные инфекции. -Вып. 9. 1985. - С. 46.

95. Солодовников Ю.П., Зайцев Б.Е., Тибекин А.Т. Лыткина И.Н. Вспышки кишечных инфекций в Москве в последние годы//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001- N.5. - С. 113-115.

96. Станкевич Jl.А. Выявление дизентерийных бактерий Зонне люминесцентно-серологическим методом//Лаб. дело 1970. - N.11. -С. 686-687.

97. Ш.Степанова Л.К., Сергеева Н.С., Мельник Е.Г., Андреева В.А., Денисова Т.П. Изучение антигенной структуры сальмонелл методом иммунофореза//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1975. -N. 10.-С. 88-93.

98. Тарханова И.А., Гневковская Т.В., Белецкая Л.В., Носкова И.В. Исследование зависимости между цитофильными свойствами иммуноглобулинов столбнячного антитоксина кролика и его способностью нейтрализовать токсин//Журн. микробиол. 1976. -N. 8. -С. 99-103.

99. Тебекин А.Б., Белоусова М.В., Петров Е.Ю., Карпов А.П. Ускоренная идентификация сальмонелл серогруппы В во внешней среде/Юстрые кишечные инфекции. 1983.- Вып.7.- С. 127-129.

100. Тендентник Ю.Я, Белая О.Ф., Буаро М.И. Ускоренная диагностика сальмонеллеза определением антигенов в биосубстратах больных с помощью реакции коагглютинации//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1990. - N.6. - С. 30-34.

101. Тендентник Ю.Я., Дягтерева Л.В., Алаева В.М. и др. Латексные антительные тесты для диагностики сальмонеллезов и брюшного тифа//Клин. инфекции: Сб. научн. Трудов. -М., 1993. С. 91-100.

102. Тендентник Ю.Я., Мали И. Применение синтетических О-антигенов для разработки серологических методов диагностики сальмонеллезов//В кн: Микробиологические аспекты иммунобиотех-нологии: Совершенствование, проблемы, перспективы. М., 1992. -С. 62-72.

103. Угрюмов С.А., Ерещенко В.В., Лузина Е.В. Оценка системы мультимикротестов для биохимической идентификацииэнтеробактерий (ММТ El) в контролируемом эпидемиологическом опыте. Сообщение 1//Клин. лабораторная диагностика. 1994. - N.4. -С. 35-36.

104. Федоров Ю.И. Динамика образования 19S- и 7S- антител у овцематок при вакцинации их против сальмонеллеза/УБюллетень ВИЭВ. Вып. 62.- 1986.-С. 61-63.

105. Хаитов Р.Б. Клиническая иммунология. — М.: 2002. С. 623.

106. Халитова В.И., Семенюк С.С. Диагностика сальмонеллеза у детей иммунофлуоресцентным метод ом//В кн: Ускоренные методы диагностики инфекционных болезней.- Кишинев. 1987. - С. 25-26.

107. Хотющенко Т.И. Использование метода телевизионного микрометрического анализа для повышения эффективности методов серодиагностики и иммунодиагностики: Автореф. дис. . кан. мед. наук. Саратов. - 1996. - 17 с.

108. Храпунова М.А. Внутрибольничная вспышка сальмонеллеза, вызванного S.haifa/УЖурн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1999. -N.5. С. 58-60.

109. Черкасов B.JL, Лиенко А.Б., Белая О.Ф. и др. Скрининговое выявление антигенов некоторых энтеробактерий в биологических жидкостях с хроническими заболеваниями кишечника//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993. - N.5. - С. 78-82.

110. Шаханина К.Л. Приготовление флуоресцирующих антител//В кн.: Иммунохимический анализ. М.: Медицина, 1968. - С. 202-220.

111. Шаханина К.Л. Современные методы приготовления различных люминесцирующих сывороток//В кн.: Иммунохимический анализ. -М.: Медицина, 1968. С. 133-139.

112. Шаханина И.Л., Болотовская Т.П., Осипова Л.А. Инфекционная патология в России: эпидемиологическая и экономическаязначимость//Эпидемиология и инфекционные болезни. 1996. - N.1. -С. 15-20.

113. Шахлин Е.В., Трунилина Р.А. Сальмонеллезная инфекция в хирургических отделениях городской больницы//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-2001.-N.5.-C. 118-119.

114. Шубин Ф.Н. Предэпидемическая диагностика и профилактика госпитального сальмонеллеза//Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 26-28 марта 2002. Москва, 2002. - Т. 1. - С. 283-284.

115. Шувалова Е.П., Полоцкий В.Ю. Значение иммунофлуоресцентных и цитологических показателей в диагностике и прогнозированию течения дизентерии//Терапевтический архив. 1989. - Т.61. - N.11. -С. 69-72.

116. Янкина Н.Ф., Семенова Г.Б. Получение моноспецифических сальмонеллезных анти-О-4 антител методом аффинной хроматографии и их использование в иммуноферментных реакциях//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1987. -N.8. -С. 79-82.

117. Ackman D.M., Drabkin P., Birkhead G., Cieslak R. Reptile-associated salmonellosis in New York State//Pediatr. Infect. Dis. J. 1995. - V.14. -N.l 1 - P. 955-959.

118. Alexander W., Potter J. Rhadomineconjugated papain as a counter stain in fluorescence microscopy//Immunology 1963. - V.6 - N.5 - P. 450-452.

119. Amavisit P., Browning G.F., Lightfoot D., Church S. Rapid PCR detection of Salmonella in horse faecal samples//Vet Microbiol, 2001, V. 79(1). -P. 63-74.

120. Anguno F.J., Swerdlow D.L. Salmonella Enteritidis in the United States. //J. Am. Vet. Med. Assoc.- 1998. V.213. - P. 1729-1731.

121. Athie C.G., Guizar C.B., Aleantara A.V. et al. Twenty-five years of experience in the surgical treatment of perforation of the ileum caused by salmonella typhi at the General Hospital of Mexico City//Surgery. 1998.- V.123.-P. 632-636.

122. Barrow PA. Serological diagnosis of Salmonella serotype enteritidis infections in poultry by ELISA and other tests//Int. J. Food Microbiol. -1994.- V.21(l-2). P. 55-68.

123. Barell P.A. Isolations of Salmonella from human, food and environmental Sources in the Manchester aren: 1976-1980//J.Hygiene. 1982. - V. 88 -P. 403-411.

124. Барнард Д.Д.Р., Уильяме Д.Л., Пейтон А. К., Шах П.П. Флуоресцентный иммуноанализ с современным разрешением//В кн.: Новые методы иммуноанализа. М.: Мир, 1991. - С. 150-167.

125. Bhutta Z.A. Therapeutic of typhoidal Salmonellosis in childhood: the Karachi experience//Ann.-Trop. Pediatr. 1996. - V.16. -N.4 - P. 299-306.

126. Bender J.B., Sreevatsan S., Robinson R.A. et al. Animal by producte contaminated with Salmonella in the diets of lactating dairy cowa//J. Dairy. Sci. 1997. - V 90 - N.l 1. - P. 3084-3087.

127. Bennett AR., Greenwood D., Tennant C., Banks J.G., Betts R.P. Rapid and definitive detection of Salmonella in foods by PCR//Lett. Appl. Microbiol. 1998. - V. 26(6). - P. 437-441.

128. Bishai W.R., Sears C.L. Food poisoning syndromes//Castroenterol.Clin. North. Am. 1993. - V.22 - N.3 - P. 579-606.

129. Brigmon R.L., Zam S.G., Wilson H.R., Detection of Salmonella enteritidis in eggs and chicken with enzyme-linked immunosorbent assay//Poult. Sci.- 1995.-V.74.-P. 1232-1236.

130. Брода П. Плазмиды. M.: Мир, 1982. - 220 с.

131. Bullock R.D., Frodsham D. Rapid impedance detection of Salmonellas in confectionery using modified LICNR broth//J. Appl. Bacteriol. 1988. -V. 66.-P. 385-391.

132. Burnham B.R., Atcheley D.H. et al. Prevalence of fecal shedding of salmonella organisms among captive green iguanas and potential public health implications//:. Am. Vet. Med. Assoc. 1998. - V.213 -P. 48-50.

133. Burtscher C., Fall P.A., Wilderer P.A., Wuertz S. Detection of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in suspended organic waste by nucleic acid extraction and PCR//Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65(5). -P. 2235-2237.

134. Chaicumpa W., Ruangkunaporn Y., Burr D., Chongsa-Nguan M., Echeverria P. Diagnosis of typhoid fever by detection of Salmonella typhi antigen in urine//J. Clin. Microbiol. 1992. - V. 30(9). - P. 2513-2515.

135. Che Y.H., Li Y., Slavik M., Paul D. Rapid detection of Salmonella typhimurium in chicken carcass wash water using an immunoelectrochemical method//J. Food. Prot. 2000. - V. 63(8). -P. 1043-1048.

136. Ching-lee M.R., Katz A.R., Sasaki D.M. et al. Salmonella egg survey in Hawaii: evi dence for routine bacterial Surveillance//Am. J. Public. Health. -1991.-V.81.-P. 764-766.

137. Cloak O.M., Duffy G., Sheridan J.J., McDowell D.A. Development of a surface adhesion immunofluorescent technique for the rapid detection of Salmonella spp. from meat and poultry//J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 86(4). - P. 583-590.

138. Cocolin L., Manzano M., Cantoni C. Use of polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis to directly detect and identify Salmonella typhimurium in food//J. Appl. Microbiol. 1998. -V. 85(4). - P. 673-677.

139. Cohen M.L., Potter M., Polland K., et al. Turtle-associated salmonellosis in the United States, effect of public health action, 1970 to 1976//J. Amer. Med. Ass. (JAMA). 1980. - V.243. - P. 1247-1249.

140. Cohen M.L., Tauxe R.V. Drug-resistant Salmonella in the United States: an epidemiologie perspective//Science. 1986. - V. 234. - P. 964-969.

141. Cook K.A., Dobbs Т.Е., Hlady W.G. et. Al. Outbreak of Salmonella Serotype Hartford infections associated with unpasteurized juice//J. of Food Safety. 1997. - V.17. - P. 273-281.

142. Coons A., Creech H., Jones R. Immunological properties antibody containing a fluorescent group//Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1941. -V. 47. -N.2.-P. 200-202.

143. Coons A., Kaplan M., Localization of antigen in tissue cells 2. Improvements in a method for the detection of antigen by meats of fluorescent antibody//J. Exp. Med. 1950. - V.91. - N. 1 - P. 1 -3.

144. D'Aoust J.Y. Salmonella and the international food trade//Int. J. Food Microbiol. 1994.-V.24-N. 1-2-P. 11-31.

145. D' Aogust J.Y., Sewell M. Detection of Salmonella by the Enzyme Immunoassey (EIA) Technigue//J. of Food Sci. 1986. - V.51. - P. 484507.

146. Davies R.H., Bedford S., Shankster S. Enhanced culture techniques for the detection of Salmonella//Vet. Rec. 2001. - V. 148(17). - P. 539-40.

147. Desmidt M., Haesebrouck F., Ducatelle R. Comparison of the Salmonella-Tek ELISA to culture methods for detection of Salmonella enteritidis in litter and cloacal swabs of poultry//Zentralbl Veterinarmed. 1994. - V. 41(7-8).-P. 523-528.

148. Детерман Г. Гель-хроматография. M. - 1988. - 135 с.

149. Donaghy J.A., Madden R.H. Detection of Salmonella in animal protein by Rappaport-Vassiliadis broth using indirect impediometry//Int. J. Food Microbiol. 1993. - V. 17(4). - P. 281-288.

150. Donaghy J.A., Madden R.H., Impedance detection of Salmonella in processed animal protein and meat//Int. J. Food Microbiol. 1992. - V. 16(3). -P. 265-269.

151. Duffy G., Kilbride В., Sheridan J.J., Blair I.S., McDowell D.A. A membrane-immunofluorescent-viability staining technique for the detection of Salmonella spp. from fresh and processed meat samples//Appl. Microbiol. 2000. - V. 89(4). - P. 587- 594.

152. Edelman R., Levine M.M. Summary of international workshap on typhoid fever//Rev. Intect. Dis. 1986. - V.8. - P. 329-349.

153. Elder R.O., Duhamel G.E., Mathiesen M.R. Multiplex polymerase chain reaction for simyltaneous detection of Lawsonia intracellularis//J. Vet. Diagn. Invest. 1997. -V. 9. -N.3. - P. 281-286.

154. Emsweiler-Rose В., Gehle W.D., Johnson R.W. et al. An enzyme immunoassey technigue for the detection of Salmonellae meat and poultry products//! of Food Sci. 1984. - V.49. - P. 1010-1020.

155. Eoster M.S., Gibson D.M. Rapid and automated detection of Salmonellae by electrical measurement//!. Hyg. Camb. 1985. - V. 94. - P. 245-262.

156. Fitts R. Development of DNA-DNA hybridization test for the presence of Salmonellae in foods//J. Technol. 1997. - V.39. - P. 95.

157. Flowers R.S., Klatt M.J., Robison В J., Mattingly J. A. Evaluation of abbreviated enzyme immunoassay method for detection of Salmonella in low-moisture foods//J. Assoc. Off Anal. Chem. 1988. - V. 71(2). - P. 341343.

158. Flowers R.S., Klatt M.J., Keelan S.L., Swaminathan B. Fluorescent enzyme immunoassay for rapid screening of Salmonella in foods: collaborative//! Assoc. Off Anal. Chem. 1989. - V. 72(2). - P. 318-325.

159. Flowers R.S., Klatt M.J. Immunodiffusion screening method for detection of motile Salmonella in foods: collaborative study//J. Assoc Off Anal. Chem. 1989. - V. 72(2). - P. 303-11.

160. Flowers R.S., Klatt M.J., Keelan S.L. Visual immunoassay for detection of Salmonella in foods: collaborative study//! Assoc Off Anal. Chem. 1988.- V. 71(5).-P. 973-980.

161. Fonsece К J., Dubey L.M. Salmonella Montevideo sepsis from a pet snake//Pediatr. Infect. Dis. J. 1994. - V.13. - P. 550.

162. Forsum U. Agglutination and immunofluorescance studies of surface antigens of S. aureus//Acta. Pat. Microbiol. Scand. 1972. - V. 8. -P. 314320.

163. Futschik K., Pfutzner H., Doblander A., Asperger H. Automatikal registration of microorganism growth by a new impedance method//Abstr. Int. Mut. Chrem. Eng. and Biotechnol. 1988. -V. 88. - P. 3.

164. Gibson D.M. Some modification to the media for rapid automated detection of Salmonellas by conductance measurement//.!. Appl. Bacteriol.- 1987. -V. 63.-P. 299-304.

165. Goldwasser R., Shepard C. Fluorescent antibody methods in the differentiation of marine and epidemic typhus sera; specifity chages resulting from provions//J. Immun. 1995. - V. 82. - N.4. - P. 373-380.

166. Gooding C.M., Choudary P.V. Comparison of different primers for rapid detection of Salmonella using the polymerase chain reaction//Mol. Cell. Probes. 1999. - V. 13(5). - P. 341-347.

167. Gouws P.A., Visser M., Bruzel V.S. A polymerase chain reaction procedure for the detection of Salmonella spp//J. Food Prot. 1998. - V. 61(8).-P. 1039-1042.

168. Hahn G., Bransch B. Universal immuno-stick test for direct rapid identification of microbial antigens within 5 minute. Preliminary report//! Med. Microbiol. 1988. - V.267. -N. 4 - P. 519-527.

169. Hanzaki O., Morino Y., Kanazava Y. et al. Application of arbitrarily primed polymerase chain reaction analysis to epidemiological study ofsalmonella enterica serovar enteritidis//Kansenshogku Zasshi. 1997. -V.71.-N.8-P. 745-750.

170. Harris J.T., Fedorka-Cray P.J. Cray J.T. Prevalence of Salmonella organisms im Swine feed//J. Am. Vet. Med. Assoc. 1997. - V.210 - N.3 -P. 382.

171. Hedberg C.W., David M.J., White K.E. et al. Role of egg consumption in sporadic Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium infections in Minnesota//.!. Infect. Dis. 1993. - V.167. - P. 107-111.

172. Helmuth R., Stephan R., Bunge C. Epidemiology of virulence-associated plasmids and outer membrane proteins within seven common Salmonella serotypes//Infect. Immun. 1995.-V.48. - P. 175-182.

173. Hennessy T.W., Hedberg C.W., Slutsker 1 et al. A national outbreak of Salmonella enteritidis infections from ice cream//N. Engl. J. Med. 1996. -V. 334-P. 1281-1286.

174. Hoorfar J., Feld N.C., Schirmer A.L., Bitsch V., Lind P. Serodiagnosis of Salmonella dublin infection in Danish dairy herds using O-antigen based enzyme-linked immunosorbent assay//Can. J. Vet. Res. 1994. - V. 58(4). - P. 268-74.

175. Hoorfar J., Wedderkopp A. Enzyme-linked immunosorbent assay for screening of milk samples for Salmonella typhimurium in dairy herds//Am. J. Vet. Res. 1995. - V. 56(12). - P. 1549-1554.

176. Jesudason M.V., Sridharan G., Mukundan S. John T.J. Vi-specific latex agglutination for early and rapid detection of salmonella Serotype typhi in blood cultures/ZDiagn. Microbiol. Infect. Dis. 1994. - V.12. -N.2 - P. 75-78.

177. Kalhan R., Kaur I., Singh R.P. Gupta HC Rapid diagnosis of typhoid fever//Indian J. Pediatr. 1998. - V. 65(4). - P. 561-564.

178. Кетти Д. Антитела. M.: Мир, 1991. - Т. 1. - С. 42.

179. Кетти Д. Антитела. М.: Мир, 1991. - Т. 2. - С.273-289.

180. Keusch G.T. Salmonellosis//In.: Isselbacher K.J., Braunwald E. et al., eds. Harrison's Internal Medicine, 13 th Ed. New York.: McGraw-hill. 1994. -P. 671-676.

181. Kongmuang U., Lung J.M., Lindberg A.A. Comparison of three stool processing methods detection of Salmonella serogroupe В, С and D by PCR//J. Clin. Microbiol. 1994. - V.32. - N. 12 - P. 3072-1074.

182. Kumar A., Nath G., Bhatia B.D. et al. An outbreak of multidrug resistant Salmonella typhimurium in a nursery//Indian Pediatr.- 1995. V.32. - N.8 -P. 881-885.

183. Li X., Boudjellab N., Zhao X. Combined PCR and slot blot assay for detection of Salmonella and Listeria monocytogenes//Int. J. Food Microbiol. 2000. - V. 56(2-3). - P. 167-177.

184. Mac Faddin J.F. Biochemical tests for identification of medical bacteria. 2d ed. Baltimore: Williams & Wilkins Co. - 1981. - 527 c.

185. Maitza S.K., Schotz M.C., Yoshikawa T.T., Guze L.B. Defermination of lipid A and endotoxin in serum by mass-spectroscopy//Proc. Natl. Acad. Sci. 1978. - V. 75.-P. 39-93.

186. Mead P.S., Slutsker L., Dietz V. Food-related-illness and death in the United States//J. Emerg. Infect Dis. 1999. - V.5. - P. 607-625.

187. Merlin J., Hoar В., Anguno F.J. Iguanas and Salmonella Marina infection in children: a reflection of increasing incidence of reptile-associated salmonellosis in United States//! Med. Microbiol. 1995. - V.43. - N. 3 -P. 185-188.

188. Милстейн Ц. Моноклональные антителa//B кн.: Молекулы и клетки. -М., 1982. Вып. 7. - С. 24-40.

189. Metzler J., Nachamkin I. Evaluation of a latex agglutination test for the detection of Salmonella and Shigella spp. by using broth enrichment//J. Clin. Microbiol. 1988. - V. 26(12). - P. 2501-2504.

190. Mishu В., Kochler J., Lee L.A. et al. Outbreak of Salmonella enteritidis infections in the United States, 1985-1991//J. Infect. Dis. 1994. - V.169. -P. 547-552.

191. Mukherjee C., Malik A., Khan H.I. Rapid diagnosis of fever by co-agglutination in an Indian Hospital//! Med. Microbiol. 1993. - V.39. -N. 1 - P. 71-74.

192. Ogden D. Salmonellae detection by a modified lysine conductance medium//Lett. Appl. Microbiol. 1990. - V.l 1. - P. 69-72.

193. Pandya M., Pillai P., Deb M. Rapid diagnosis of typhoid fever by detection of Barber protein and Vi antigen of Salmonella Serotype typhi//! Med. Microbiol. 1995. - V.43. - N. 3 - P. 185-188.

194. Parish M.E., Narciso J.A., Friedrich L.M. Survival of Salmonella in orange juise//! of Food Safety. 1997. - V.17. - P. 273-281.

195. Pless P., Futschik K., Schopf E. Rapid Detection of Salmonellae by Means of a New Impedance-Spitting Method//J. of Food Protection. 1994. -V.57.-N.5.-P. 369-376.

196. Porter R.R. The hydrolysis of Rabbit y-globulin and Antibodies with Crystalline papain//Biochem. J. 1959. - V. 73. - P. - 119-126.

197. Porter R. The Structure and combining specificity of antibodies//British biochemistry past and present. L. N.Y. - 1970. - P.89-98.

198. Quinn C., Ward J., Griffin M., Yearsley D., Egan J. A comparison of conventional culture and three rapid methods for the detection of Salmonella in poultry feeds and environmental samples//Lett. Appl. Microbiol. 1995. - V. 20(2). - P. 89-91.

199. Rahman H. Dot-ELISA for detection of Salmonella enterotoxin//Indian J. Med. Res. 1999. - V. 11. - P. 47-49.

200. Rao P.S., Prasad S.V., Arunkumar G., Shivananda P.G. Salmonella typhi VI antigen co-agglutination test for the rapid diagnosis of typhoid fever//Indian J. Med. Sci. 1999. - V. 53(1). - P. 7-9.

201. Ройт Ф., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000. - С. 97-112.

202. Ryan M.J., Wall P.G., Adak G.K. et al. Outbreaks of infections intestinal disease in residential institutions in England and Wales 1990-1994//J.Infect. — 1997. V.34 -N.l - P. 49-54.

203. Sharma M., Datta U. Low sensitivity of countor-current Immunoelectrophoresis for typhoid fever//J. Med. Microbiol. 1997. - V.46. - N. 12-P. 1039-1042.

204. Schmid H., Burnens A. P., Baumgartner A., Oberreich J. Risk factors sporadic salmonellosis in Switzerland//Eur. J Clin. Microbiol. Infect. Dis. -1996.-V. 15 №. 9.-P. 725-32.

205. Smith P.J., Boardman A., Shutt P.C. Detection Salmonellas in animal feeds by electrical conductance//! Appl. Bacteriol. 1989. - V 67. - P. 575-588.

206. St. Geme J.W., Hodes H.L., Marey S.M. Consensus: management of Salmonella infection in the first year of life//Pediatr. Infect. Dis. J. 1988. -V.7.-P. 615-621.

207. Sukolov Т., Sarosombath S., Songsivilai S. Fusion protein of Salmonellae Typhi flagellin as antigen for diagnosis of typhoid fever//Asian Рас. J. Allergy Immunol. 1994. - V. 12. - N.l - P. 21-25.

208. Tacket C.O., Dominguez L.B., Fisher H.J., Cohen M.L. An outbreak of multipledrug-resistant Salmonella enteritidis from ran milk//J. Amer. Med. Ass. 1985. - V.253. N.4. - P. 2058-2060.

209. Torok T.J., Tauxe R.V., Wise R.P. et al. A large community outbreak of salmonellosis caused by international contamination of restaurant salad bars//J. Amer. Med. Ass. 1997. - V.278. - N.4. - P. 389-395.

210. Wagner M. Fluoreszirende Antikorper und ihre Anwendung in der Mikrobiologie Jena Veb. Ceuslar Fischer. - 1967. - 395 S.

211. Ward I.R., Threlfall E.J, Rowe B. Multiple drug resistance in Salmonellae in England and Wales: A comparison between 1981 and 1988//J. Clin. Pathol. 1990. - V. 43. - P. 563-566.

212. Wegener H.C., Baggesen D.l. Comparison of conventional culture methods and two commercial enzyme immunoassays for detection ofsalmonella in porcine fecal samples and cercal contents//J. Vet. Diagn. Invest. 1997. - V9. - N.4. - P. 352-356.

213. Weller Т., Coons A. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster propagated in vitro//Pros. Soc. Exp. Biol. Med. 1954. -V.86.-N. 4.-P. 789-794.

214. Wan J., King K., Craven H., McAuley C., Tan S.E., Coventry M.J. Probeliatrade mark PCR system for rapid detection of Salmonella in milk powder and ricotta cheese//Lett. Appl. Microbiol. 2000. - V. 30(4). - P. 267-271.

215. Wawerla M., Stolle A., Schalch В., Eisgruber H. Impedance microbiology: applications in food hygiene//J. Food Prot. 1999. - Vol. 62(12). - P. 1488-1496.

216. Weston P., Poole A. Antibodies to enzymes and their uses, with specific reference to cathepsin D and other lysosomal enzymes//In: Lisosomes in Biology and Pathology. -1973. V.3 - P. 425-464.

217. Van Bened C., Keene W.E., Strang R.A. et al. Multinational outbreak of Salmonella enterica serotyphe Newport infections due to contaminated alfalfa sprouts//J. Amer. Med. Ass. (JAMA). 1999. - V.281. - P. 158-161.

218. Verliac F. Les Salmonellas De L-enfant//Concours Med. 1978. - V.100. -N. 46.-P. 7669-7683.118

219. Von Lichtenberg F. Infectious Disease/Лп: Cotran R.S. Robbins Pathologies Basis of Disease, 4 th Ed. Philadelphia: WB Saunders Company. 1989. - P. 353-355.

220. Van Bened C., Keene W.E., Strang R.A. et al. Multinational outbreak of Salmonella enterica serotyphe Newport infections due to contaminated alfalfa sprouts//J. Amer. Med. Ass. 1999. - V.281. - P. 158-161.